CN108424905A - 一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球及其制备方法和应用；本发明基于GO@Fe3O4和4arm‑PEG‑NH2通过共价结合的方式制备得到GO@Fe3O4@4arm‑PEG‑NH2，然后将一定量的GO@Fe3O4@4‑arm‑PEG‑NH2溶解在柠檬酸盐缓冲液中，再将戊二醛加入到上述溶液中，活化反应一定时间；将所得产物用柠檬酸盐缓冲液洗涤后真空干燥，得到本发明所需要的材料；本发明所得材料具有超顺磁性，应用于固定化纤维素酶的固载量提高到575 mg/g，得到的固定化酶具有耐高温、贮藏能力强、可重复利用性高的优势。

Description

一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球及其制备方法和应用；具体涉及一种纳米材料GO@Fe3O4@4arm-PEG-NH2的制备方法和固定化纤维素酶的应用。
背景技术
纤维素是最丰富的可再生和可生物降解的大分子聚合物，其已被广泛应用到各个行业中。自然界里的纤维年产量预计为1011–1012吨，虽然有如此多的纤维素来源，但是人们对于这种生物质资源的利用不是很高，在许多发展中国家大约都是以燃烧的形式用来煮饭或是取暖，这极大的浪费资源又破坏了环境。纤维素酶作为复合酶可以协同地降解纤维素，因而它被广泛地应用在食品工业、造纸工业以及生物能源中，其中利用纤维素酶水解木质纤维等纤维素原料是非常关键的一步。但是游离纤维素酶在实际的应用中却受到不少的限制，如低水平的纤维素酶生产技术、高额的生产费用和低的生物活性。而固定化酶比自由酶有着更高的稳定性和复用性，因此可以大大降低纤维素酶在实际应用中的费用消耗。
近年，纳米材料已被广泛的应用于固定化酶的载体，如磁性纳米颗粒、碳纳米管、纳米纤维和纳米硅等，根据载体在水中的溶解性，纤维素酶固定化载体分为可溶性载体,不可溶性载体和可溶性-不可溶性载体3大类。利用可溶性载体固定纤维素酶，存在回收麻烦这一致命缺陷；对于不可溶性的载体，如纳米颗粒，具有分散性好的优势，但纳米颗粒固定化酶尺寸过小，不易回收；通过溶液pH值、温度、离子强度等可逆地改变其溶解性的可溶性-不可溶性载体，存在固定效率低下与固定过程繁琐等缺点，以及在反复沉淀-溶解过程中就存在酶脱落严重这一现象。酶的固定化方式主要包括吸附固定化法、共价结合固定化法、包埋固定化法和交联固定化法，吸附固定化法的吸附作用较弱，固定化的酶可能在高离子浓度、强pH等溶液体系环境中泄露出去；共价结合形成的固定化酶非常牢固，但共价固定化的操作复杂，而且容易引起酶化学结构的改变，导致性能及应用的改变；酶的包埋是通过交联或凝胶化等方法将酶限制于某种载体中，酶分子既可以物理包埋于载体中也可以共价结合于载体中，但是包埋法不适于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。
发明内容
本发明的目的在于克服目前游离的纤维素酶固定化量较低，合成的固定化酶活性较差等不足之处，从而合成多臂磁性氧化石墨烯复合微球固定化纤维素酶。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供一种新型的多臂磁性氧化石墨烯复合微球，所述微球是基于GO@Fe3O4和4arm-PEG-NH2通过共价结合的方式得到，具有超顺磁性，为复合树枝状聚合物。
本发明还提供一种新型多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，具体步骤如下：
（1）氧化石墨烯（GO）的制备：
准确称取一定量的石墨粉和一定量的硝酸钠放入到100 mL的烧杯中，向其中缓慢加入一定体积的硫酸溶液（12mol/L），并将烧杯放置在冰浴中搅拌15 min。将一定量的高锰酸钾缓慢加入到上述溶液中，然后将悬浮液转移到一定温度的水浴中，磁力搅拌90 min，所得棕色糊状物用去离子水稀释后再搅拌10 min，最后加入一定量的双氧水，反应溶液变为金黄色，反应结束。静置24 h后倒去上清液，将剩余沉淀物用抽滤法实现分离，得到的产物先用5%盐酸进行多次洗涤，直到用氯化钡检测不出有白色的沉淀出现，然后用去离子水洗至中性。将洗涤后的产物超声2 h，将离心所得沉淀物放入到真空烘箱干燥。即得到片状氧化石墨烯。
其中，所述石墨粉加入量为0.1-0.9 g；硝酸钠加入量为0.1-0.9 g；
所述硫酸加入量为17-29 ml；加入的高锰酸钾为2.0-6.0 g；加入的双氧水为 4-8 mL；
所述磁力搅拌的水浴温度为20-60 ℃；
（2） GO的羧基化：
称取一定量的GO 加入到100 ml的烧杯中，接着加入一定体积的氢氧化钠（0.05 mol/L），最后用超声分散的方法进行剥离，持续一定时间，得到GO胶体。再称取过量的氯乙酸（0.5-0.6 g）加到上述胶体中超声2 h，离心所得沉淀用去离子水洗涤多次至中性，即得到分散均匀的羧基化氧化石墨烯溶液，离心15 min后，将所得沉淀放入真空烘箱干燥，得到羧基化氧化石墨烯产品。
其中，所述GO加入量为450-550 mg；
所述氢氧化钠加入量为150-250 ml；
所述超声分散进行剥离的时间为0.2-0.8 h；
（3）磁性氧化石墨烯（GO@Fe3O4）的制备：
称取羧基化氧化石墨烯0.2 g均匀分散于去离子水中，接着分别称取一定量的FeCl3·6H2O和一定量的FeSO4·7H2O加入到上述溶液中，在超声功率为140 W的条件下，超声10min后将混合溶液逐渐加热至一定温度，然后将一定量的3.5 mol/L的氨水加入到上述溶液中，反应一定时间后，用磁铁将产物进行回收，用去离子水洗涤产物至中性，然后真空干燥。
其中，所述FeCl3·6H2O加入量为0.366-0.566 g， FeSO4·7H2O加入量为0.380-0.58g；
所述氨水加入量为15-20 ml；
所述超声后将混合溶液加热至55-75℃；
所述反应时间为30-90min。
（4）多臂磁性氧化石墨烯（GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2）的制备：
将一定量的1 mg/mL GO@Fe3O4 与一定量的5 mg/mL 四臂聚乙二醇胺混合后在25 ℃的水浴中超声3 h（在第5 min时第一次加入一定量的EDC)，超声结束后第二次加入一定量的EDC ，机械搅拌一定时间后得黑色反应产物，然后用去离子水多次洗涤产物至其中没有白色沉淀，最后将产物放入真空干燥箱（45 ℃）干燥。
其中，所述GO@Fe3O4加入量为5-15 ml，四臂聚乙二醇胺加入量为1-3 ml；
所述第一次EDC加入量为1-3 mg，第二次EDC加入量为1.6-3.6 mg；
所述机械搅拌时间为10-14h。
根据上述方法制备的酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2进一步的制备固定化纤维素酶：
将一定量的GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2溶解在一定体积的柠檬酸盐缓冲液中，然后将一定量的戊二醛25%（v/v）加入到上述溶液中，在温度为50 ℃的条件下活化一定时间。将所得产物用含有0.1 M NaCl的柠檬酸盐缓冲液（pH=5.5）洗涤7次后真空干燥，得到酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2@戊二醛。
其中，所述GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2 加入量为2-4 mg，戊二醛加入量为1-3 ml；
所述柠檬酸盐缓冲液加入量为5-15ml；
所述活化时间为4-8h。
准确称取所得酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2@戊二醛4 mg并加入到含有2 mg纤维素酶的柠檬酸缓冲液（pH=5.5）中，并用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，接着将上述混合体系置于30 ℃恒温震荡箱中震荡30 min后取出，磁性分离固定化纤维素酶，将剩余液倒出，然后再用柠檬酸缓冲液清洗数次，得到最终的固定化纤维素酶产物。
本发明另一目的是将上述合成的新型的多臂磁性氧化石墨烯复合微球固定纤维素酶用于纤维素材料的降解。
与先有技术相比较，本发明具有如下优点：
（1）本发明首次合成了多臂磁性氧化石墨烯复合微球GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2，通过FT-IR、VSM、XRD、TEM、TGA、XPS这6种手段对其形貌、结构以及磁性特性进行了研究，验证了两种不同臂长的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面的材料正确合成。GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2和GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2两种不同臂长的微球磁性分别达到了22.5和15.8 emu/g，具有超顺磁性。
（2）将GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2和
GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2两种不同臂长的微球作为纤维素酶固定化载体。对固定化的条件进行优化后，无论是分子量5 K还是分子量10 K，优化条件都是在加酶量为4 mg，温度为40 ℃，时间为2.5 h。最终，固定化纤维素酶的固载量429和575 mg/g，这超过目前报告的载体对纤维素酶的装载量。
（3）本发明研究了固定化纤维素酶的最适的催化温度、最适pH、pH的稳定性、热稳定性、贮藏稳定性以及复用性，跟同等条件下的游离纤维素酶做了相应的对比，得出结论如下：通过固定化，纤维素酶在各方面的稳定性均有明显的提高。
在pH3时，GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2和
GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2固定化的纤维素酶相对酶活高达76%和80%，这远高于自由纤维素酶20%的活性，体现了良好的pH适应性；70℃条件下，游离纤维素酶在2h的时候活性降低到初始活性的一半，而两种固定化酶的活性保持在了70%以上的水平，展现了较好的耐高温性；GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2和GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2固定化的纤维素酶在贮藏了28天之后活性分别保留了47%和50%，而自由纤维素酶活性几乎为零，显示了可观的贮藏能力；经过7次循环使用之后，GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2和GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2固定化的纤维素酶的活性分别为初始活性的40%和45%，反映了较好的重复利用能力。
（4）本发明将固定化纤维素酶应用到纤维素降解实验中，在固定化纤维素的酶量在2mg时，能水解滤纸和微晶纤维素产生的葡萄糖的量高达2mmol，这远远高于同样条件下自由纤维素酶水解产生的葡萄糖量。
（5）通过超声辅助共沉淀法制得的磁性氧化石墨烯（GO@Fe3O4）融合了石墨烯（GO）和磁性材料（Fe3O4）特殊的物理、化学特性。GO有较高的电导率、大的比表面积、良好的生物适应性，同时因为其表面存在大量的羧基、环氧基团、羟基等功能基团而使得GO能被其他的多功能的聚合物所修饰。GO所具有的这些特性能为酶的固定化提供大量的活化位点和空间。同时，利用Fe3O4的复用性可以达到降低生物催化剂消耗的目的。考虑到GO在水溶液中容易发生聚集而降低表面的结合位点，导致形成不理想的酶装载量。而氨基四臂聚乙二醇氨（4arm-PEG-NH2）拥有如下的优点：a. 结构具有规律、稳定、高度相似的特点；b. 分子量分布是单分散性的；c. 表面的功能基团含量高；d. 低的溶液黏度和熔体黏度；e. 良好的生物适应性和表面功能化易操作。因此将GO@Fe3O4和4arm-PEG-NH2通过共价结合，进而赋予GO@Fe3O4载体以良好的溶解性、生物适应性和稳定性。本发明通过两种氨基四臂聚乙二醇氨（4arm-PEG-NH2 (MW 5000 和10000)）和GO@Fe3O4之间的结合，提升了酶的装载能力以及活性。
附图说明
图1为 GO（a）、GO@Fe3O4（b）、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2（c）和GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2（d）的红外谱图。
图2为 GO@Fe3O4（A）、 GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2（B）、 GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2（C）的磁滞回线。
图3为 GO（a）、GO@Fe3O4（b）、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2（c）、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2 （d）的X射线衍射图。
图4为 GO(a)、GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(d)的透射电镜图。
图5为 GO(a)、GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(d)的热重分析图。
图6为 GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2（a），GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2（b）的元素分析图。
图7为加酶量对固定化酶的比活力和固载量的影响结果图。
图8为温度对固定化酶的比活力和固载量的影响结果图。
图9为时间对固定化酶的比活力和固载量的影响结果图。
图10为游离酶和固定化酶的最适温度考察结果图。
图11为游离酶和固定化酶的最适pH考察结果图。
图12为游离酶和固定化酶米氏常数方程图。
图13为游离酶和固定化酶的pH稳定性考察结果图。
图14为游离酶和固定化酶的热稳定性考察结果图。
图15为固定化素酶的操作稳定性考察结果图。
图16为游离酶和固定化酶的贮藏稳定性考察结果图。
图17为游离酶和固定化酶的用量对滤纸、微晶纤维素水解的影响结果图。
图18为时间对游离酶和固定化酶水解的影响结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备及酶的固定化
（1）氧化石墨烯（GO）的制备：
准确称取0.1g的石墨粉和0.1g硝酸钠放入到100 mL的烧杯中，向其中缓慢加入17 ml的硫酸溶液（12mol/L），并将烧杯放置在冰浴中搅拌15 min。将2.0 g的高锰酸钾缓慢加入到上述溶液中，然后将悬浮液转移到温度为20℃水浴中，磁力搅拌90 min，所得棕色糊状物用去离子水稀释后再搅拌10 min，最后加入4mL的双氧水，反应溶液变为金黄色，反应结束。静置24 h后倒去上清液，将剩余沉淀物用抽滤法实现分离，得到的产物先用5%盐酸进行多次洗涤，直到用氯化钡检测不出有白色的沉淀出现，然后用去离子水洗至中性。将洗涤后的产物超声2 h，将离心所得沉淀物放入到真空烘箱干燥。即得到片状氧化石墨烯。
（2）GO的羧基化：
称取450mg的GO 加入到100 ml的烧杯中，接着加入150ml的氢氧化钠（0.05 mol/L），最后用超声分散的方法进行剥离，持续0.2 h，得到GO胶体。再称取过量的氯乙酸（0.5-0.6 g）加到上述胶体中超声2 h，离心所得沉淀用去离子水洗涤多次至中性，即得到分散均匀的羧基化氧化石墨烯溶液，离心15 min后，将所得沉淀放入真空烘箱干燥，得到羧基化氧化石墨烯产品。
（3）GO@Fe3O4的制备：
称取羧基化氧化石墨烯0.2 g均匀分散于去离子水中，接着分别称0.366g的 FeCl3·6H2O和0.380g FeSO4·7H2O加入到上述溶液中，在超声功率为140 W的条件下，超声10min后将混合溶液逐渐加热至55 ℃，然后将15 ml 3.5 mol/L的氨水加入到上述溶液中，反应30min后，用磁铁将产物进行回收，用去离子水洗涤产物至中性，然后真空干燥。
（4）多臂磁性氧化石墨烯复合微球GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2的制备：
将5 ml 1 mg/mL GO@Fe3O4 与1 ml 5 mg/mL 四臂聚乙二醇胺混合后在25 ℃的水浴中超声3 h（在第5 min时第一次加入1 mg EDC)，超声结束后第二次加入1.6 mg EDC ，机械搅拌10 h后得黑色反应产物，然后用去离子水多次洗涤产物至其中没有白色沉淀，最后将产物放入真空干燥箱（45 ℃）干燥。
为考察不同臂长四臂聚乙二醇胺对最终所得材料性能的影响，在该步骤中选择加入不同分子量的四臂聚乙二醇胺5K-4-arm-PEG-NH2和10K-4-arm-PEG-NH2原料。
（5）固定化酶的制备
将2 mg GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2溶解在5ml的柠檬酸盐缓冲液中，然后将1 ml 的戊二醛25 %（v/v）加入到上述溶液中，在温度为50 ℃的条件下活化4 h。将所得产物用含有0.1M NaCl的柠檬酸盐缓冲液（pH=5.5）洗涤7次后真空干燥。
准确称取所得酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2@戊二醛4 mg并加入到含有2 mg纤维素酶的柠檬酸缓冲液（pH=5.5）中，并用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，接着将上述混合体系置于30 ℃恒温震荡箱中震荡30 min后取出，磁性分离固定化纤维素酶，将剩余液倒出，然后再用柠檬酸缓冲液清洗数次，得到最终的固定化纤维素酶产物。
实施例2：多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备及酶的固定化
（1）氧化石墨烯（GO）的制备：
准确称取0.9 g的石墨粉和0.9 g硝酸钠放入到100 mL的烧杯中，向其中缓慢加入29ml的硫酸溶液（12 mol/L），并将烧杯放置在冰浴中搅拌15 min。将6.0 g的高锰酸钾缓慢加入到上述溶液中，然后将悬浮液转移到温度为60 ℃水浴中，磁力搅拌90 min，所得棕色糊状物用去离子水稀释后再搅拌10 min，最后加入8 mL的双氧水，反应溶液变为金黄色，反应结束。静置24 h后倒去上清液，将剩余沉淀物用抽滤法实现分离，得到的产物先用5%盐酸进行多次洗涤，直到用氯化钡检测不出有白色的沉淀出现，然后用去离子水洗至中性。将洗涤后的产物超声2 h，将离心所得沉淀物放入到真空烘箱干燥。即得到片状氧化石墨烯。
（2）GO的羧基化：
称取550 mg的GO 加入到100 ml的烧杯中，接着加入250 ml的氢氧化钠（0.05 mol/L），最后用超声分散的方法进行剥离，持续0.8 h，得到GO胶体。再称取过量的氯乙酸（0.5-0.6g）加到上述胶体中超声2 h，离心所得沉淀用去离子水洗涤多次至中性，即得到分散均匀的羧基化氧化石墨烯溶液，离心15 min后，将所得沉淀放入真空烘箱干燥，得到羧基化氧化石墨烯产品。
（3）GO@Fe3O4的制备：
称取羧基化氧化石墨烯0.2 g均匀分散于去离子水中，接着分别称0.566 g的 FeCl3·6H2O和0.580 g FeSO4·7H2O加入到上述溶液中，在超声功率为140 W的条件下，超声10min后将混合溶液逐渐加热至75 ℃，然后将25 ml 3.5 mol/L的氨水加入到上述溶液中，反应90 min后，用磁铁将产物进行回收，用去离子水洗涤产物至中性，然后真空干燥。
（4）GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2的制备：
将15 ml 1 mg/mL GO@Fe3O4 与3 ml 5 mg/mL 四臂聚乙二醇胺混合后在25 ℃的水浴中超声3 h（在第5 min时第一次加入3 mg EDC)，超声结束后第二次加入3.6 mg EDC ，机械搅拌14 h后得黑色反应产物，然后用去离子水多次洗涤产物至其中没有白色沉淀，最后将产物放入真空干燥箱（45 ℃）干燥。
为考察不同臂长四臂聚乙二醇胺对最终所得材料性能的影响，在该步骤中选择加入不同分子量的四臂聚乙二醇胺5K-4-arm-PEG-NH2和10K-4-arm-PEG-NH2原料。
（5）固定化酶的制备
将4 mg GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2溶解在15 ml的柠檬酸盐缓冲液中，然后将3 ml 的戊二醛25%（v/v）加入到上述溶液中，在温度为50 ℃的条件下活化8 h。将所得产物用含有0.1M NaCl的柠檬酸盐缓冲液（pH=5.5）洗涤7次后真空干燥。
准确称取所得酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2@戊二醛4 mg并加入到含有2 mg纤维素酶的柠檬酸缓冲液（pH=5.5）中，并用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，接着将上述混合体系置于30 ℃恒温震荡箱中震荡30 min后取出，磁性分离固定化纤维素酶，将剩余液倒出，然后再用柠檬酸缓冲液清洗数次，得到最终的固定化纤维素酶产物。
实施例3：多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备及酶的固定化
（1）氧化石墨烯（GO）的制备：
准确称取0.5 g石墨粉和0.5g硝酸钠放入到100 mL的烧杯中，向其中缓慢加入23 mL的硫酸溶液（12mol/L），并将烧杯放置在冰浴中搅拌15 min。准确称取4.0 g高锰酸钾缓慢加入到上述溶液中，然后将悬浮液转移到40 ℃水浴中，磁力搅拌90 min，所得棕色糊状物用50 mL的去离子水稀释后再搅拌10 min，最后加入6 mL双氧水，反应溶液变为金黄色，反应结束。静置24 h后倒去上清液，将剩余沉淀物用抽滤法实现分离，得到的产物先用5%盐酸进行多次洗涤，直到用氯化钡检测不出有白色的沉淀出现，然后用去离子水洗至中性。将洗涤后的产物超声2 h，将离心所得沉淀物放入到真空烘箱干燥。即得到片状氧化石墨烯。
（2）GO的羧基化：
准确称取500 mg GO加入到100 ml的烧杯中，接着加入200 ml的氢氧化钠和去离子水，最后用超声分散的方法进行剥离，持续时间0.5 h，得到GO胶体。再称取过量的氯乙酸（0.5-0.6 g）加到上述胶体中超声2 h，离心所得沉淀用去离子水洗涤多次至中性，即得到分散均匀的羧基化氧化石墨烯溶液，离心15 min后，将所得沉淀放入真空烘箱干燥，得到羧基化氧化石墨烯产品。
（3）GO@Fe3O4的制备：
称取羧基化氧化石墨烯0.2 g均匀分散于去离子水中，接着分别称取0.466 g FeCl3·6H2O和0.480 g FeSO4·7H2O加入到上述溶液中，在超声功率为140 W的条件下，超声10 min后将混合溶液逐渐加热至60 ℃，然后将20 mL 3.5 mol/L的氨水加入到上述溶液中，反应60 min后，用磁铁将产物进行回收，用去离子水洗涤产物至中性，然后真空干燥。
（4）GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2的制备：
将10 mL 1 mg/mL GO@Fe3O4与2 mL 5 mg/mL 四臂聚乙二醇胺混合后在25 ℃的水浴中超声3 h（在第5 min时第一次加入2 mg EDC)，超声结束后第二次加入EDC 2.6 mg，机械搅拌12 h后得黑色反应产物，然后用去离子水多次洗涤产物至其中没有白色沉淀，最后将产物放入真空干燥箱（45 ℃）干燥。
为考察不同臂长四臂聚乙二醇胺对最终所得材料性能的影响，在该步骤中选择加入不同分子量的四臂聚乙二醇胺5K-4-arm-PEG-NH2和10K-4-arm-PEG-NH2原料。
（5）固定化酶的制备
将3 mg 上述所得GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2溶解在10 mL柠檬酸盐缓冲液中，然后将2mL 戊二醛25%（v/v）加入到上述溶液中，在温度为50 ℃的条件下活化6 h。将所得产物用含有0.1 M NaCl的柠檬酸盐缓冲液（pH=5.5）洗涤7次后真空干燥。
准确称取所得酶固定化载体材料GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2@戊二醛4 mg并加入到含有2 mg纤维素酶的柠檬酸缓冲液（pH=5.5）中，并用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，接着将上述混合体系置于30 ℃恒温震荡箱中震荡30 min后取出，磁性分离固定化纤维素酶，将剩余液倒出，然后再用柠檬酸缓冲液清洗数次，得到最终的固定化纤维素酶产物。
本实施例合成的磁性复合微球的FT-IR光谱图、VSM图、XRD图、TEM图、TGA图、XPS图如下：
图1为GO(a)、GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(d)的红外谱图；从图1的红外图谱中可以看出，3432 cm-1和1253 cm-1处吸收峰是O-H的伸缩振动峰，2932 cm-1处对应的是官能团C-H伸缩振动峰，1736 cm-1处对应的是位于GO边缘的接基官能团C=O的伸缩振动峰，1081 cm-1处分别对应的是醚官能团与氧化石墨烯的层间环氧基团所引起的的伸缩振动。
图1中图b比图a的红外谱图在534 cm-1处多出伸缩振动峰，这说明了四氧化三铁纳米粒子被修饰在氧化石墨烯表面，基于聚合物的分子量不同不会引起红外谱图的变化，所以图1中c和d的红外谱图一样。图1中c对比b红外谱图发现，在650 cm-1和1180cm-1处多出两个伸缩振动峰，650 cm-1处对应的是氨基振动峰，而1180 c m-1处是官能团C-N的伸缩振动峰，从这两个衍射峰判断四臂聚乙二醇胺被修饰在氧化石墨烯表面。
图2为GO@Fe3O4（A）、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(B)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(C)的VSM图；图2中可以分辨出，这两种材料的磁性强度已能达到磁分离要求，同时这三种样品的磁滞回归线都过原点，说明样品的矫顽力为零，即有超顺磁性。
图3为GO(a)、 GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2 (c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2 (d)的X射线衍射图；从曲线b中可以看到在2θ=30.42°、35.42°、43.08°、53.66°、57.02°和62.52°分别出现了尤为突出的衍射峰，这与标准卡片中（JC-PDS NO.65-3107） (220), (311), (400), (422), (440),(511)相对应，说明了共沉淀法生成了较为纯正的Fe3O4；曲线a只出现一个较强衍射峰外，对照发现证明了氧化石墨稀的生成，对于曲线c和d，相比曲线b来说，峰的大小明显变小，这是由于复合聚合物以后使得原先的峰变弱，同时曲线d的衍射峰比曲线c衍射峰的更弱，这是由于聚合物分子量大小引起的。
图4为GO(a)、GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(d)的透射电镜图；图中可以看出，氧化石墨稀有明显的片层结构，并且其表面出现一定的褶皱，这些都体现其柔铺性；图4b中可以看到Fe3O4纳米粒子分散氧化石墨烯表面，同时由于其相互间的作用，产生了团聚现象；一方面氧化石墨稀表面的褶皱可以防止氧化石墨稀的团聚，另一方面又可以为磁性粒子的附着提供位点。图4c和图4d是得到的复合树枝状聚合物，从图中可以看到有明显的阴影，这是由于磁性氧化石墨烯表面上覆盖了一层聚合物，表明本实验设计的磁性石墨烯无机-有机复合材料的成功合成。
图5为GO(a)、GO@Fe3O4(b)、GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2 (c)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(d)的热重分析图；由图5可以看出氧化石墨烯的失重可分为两个阶段，第一个阶段是40℃-150℃，这其中的原因是样品中吸附在氧化石墨表面与自由水、不稳定含氧官能团以及层间的结合水释放CO，CO2水分子的形式挥发致使的，大约失重26%，第二个阶段是从150℃到600℃，主要是由于氧化石墨烯的结构当中比较稳定含氧官能团受到热量分解导致的，大约失重15%，在600℃-800℃大约失重47%，是氧化石墨烯的碳骨架引起的。四氧化三铁纳米粒子修饰的氧化石墨烯热重曲线可以看到，40℃-150℃大约失重5%，主要是表面自由水和不稳定含氧官能团引起的，150℃-600℃大约失重15%，主要是表面稳定的含氧官能团以及氧化石墨烯碳骨架引起的。从磁性氧化石墨烯复合分子量5 K热重曲线看出，从40℃到150℃，大约失重4%，表面自由水和不稳定含氧官能团引起的，150℃-300℃大约失重10%，主要是被修饰在表面的四臂聚乙二醇胺。300℃-800℃大约失重12%，主要是氧化石墨烯碳骨架以及表面稳定含氧官能团。从磁性氧化石墨烯复合分子量10 K热重曲线看出，从40℃到150℃，大约失重6%，表面自由水和不稳定含氧官能团引起的，150℃-300℃大约失重13%，主要是被修饰在表面的四臂聚乙二醇胺。300℃-800℃大约失重13%，主要是氧化石墨烯碳骨架以及表面稳定含氧官能团。
图6为GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2(a)、GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2(b)的元素分析图；通过XPS谱图，对制备的磁性氧化石墨烯复合聚合物的组成及化合价态进行进一步的分析。GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2与GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2谱图中氧元素相比，所制得GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2峰强度明显降低，这是由于制备过程中聚合物分子量大小的影响，与此同时，谱图也清楚地证实了纳米复合物中Fe和N元素的存在。
实施例4：纤维素酶固定化过程条件优化
（1）酶的使用量对固定化酶的影响
如图7所示。随着酶的用量增加，纤维素酶的装载量在刚开始是不断增加的状态，接着达到饱和，由于一定量的载体上所带的活性基团的数量是固定的，当纤维素酶的加入量未达到与载体完全结合之前，固载量会随着给酶量的增加而增大，而固定化纤维素酶的比活力是先升高后下降，这是由于载体的共价结合位点已经趋于饱和，若继续增加给酶量，此时大量的酶分子被固定在载体上，使得酶分子之间的空间变的越来越小，容易使酶分子相互重叠，导致酶的活性中间结构发生变化引起酶活力的下降。大量的酶分子被固定在载体上，这导致酶分子之间的距离变得更短，结果会导致结构发生改变以及酶的活性降低。从图7中又可以发现分子量5 K固载量比分子量10 K的要小并且固载在上面的纤维素酶的比活力也比在相同条件下比活力低，这是因为由于分子量5 K的四臂聚乙二醇胺的臂长比10 K的要短，这就会引起空间位阻效应，使得5 K固定化酶的结合位点比10 K的要少，又因为结合位点少，使得固定化酶的活力就降低。结果发现，酶的最适加入量是在3-5mg，优选加酶量在4mg的条件下分子量5 K和10 K固载量和比活力实现最优值分别为425mg/g, 550 mg/g,93.1 U/mg, 91 U/mg。
（2）温度对固定化酶的影响
如图8所示，可以看出随着温度不断地升高，酶的固载量也在不断地增加，而固定化酶的比活力是先升高后降低，这也从侧面说明温度能够使制备的载体与更多的蛋白质结合，但是随着温度的升高，达到一定温度时，蛋白质就会失去活性。同时从图上可以看出分子量5 K的固载量要比10 K的要少，同时固定化纤维素酶的比活力也低，导致的原因是分子量5K的四臂聚乙二醇胺的臂长比10 K的要短，引起空间位阻效应，使得5 K固定化酶的结合位点比10 K的要少，同时分子量10 K要比5 K的分子量高，因此它的耐热性比5 K的要好，综合这两方面因素，在相同条件下分子量10 K来固定化纤维素酶的活力要比5 K的好。结果发现，固定化温度在30-50℃范围内条件下，优选在40 ℃条件下，分子量5 K和10 K固载量和比活力实现最优值分别为416 mg/g, 550 mg/g, 93.6 U/mg, 91.8 U/mg。
（3）时间对固定化酶的影响
随着固定化时间的不断增加，可以看到固定化酶的比活力和蛋白载量也在增加。在固定化2.5 h后，蛋白载量的增加幅度减小，趋于平缓。由此推断固定化时间对固定酶的比活力以及蛋白固载量有较大的影响。从图9可以看出，固定化酶的时间太短，酶分子与载体不能进行充分的固定化反应，固定在载体上的酶分子少，导致固定化酶活力低；如果固定化酶的时间过长，载体经过戊二醛活化后产生的与酶结合的位点趋于饱和，并且载体上酶分子由于过于密集，酶分子活力的发挥收到影响，使比活力下降。而同时对比分子量5 K和10 K发现，分子量5 K固定化纤维素酶的活力要比10 K少，这是由于空间位阻效应，使得5 K固定化酶的结合位点比10 K的要少，使得固定化酶的相对活力降低。结果发现，固定化时间在2-3h范围内条件下，优选在2.5 h条件下，分子量5 K和10 K固载量和比活力实现最优值分别为429 mg/g, 575 mg/g, 91.2 U/mg, 93.5 U/mg。
实施例5：固定化纤维素酶的酶学性能
（1）游离酶、固定酶的最适反应温度
如图10所示，游离酶的催化反应最适温度为40 ℃，固定化酶的为50 ℃, 说明固定化酶催化最适温度升高了。并且不论是分子量5 K还是分子量是10 K的来固定化纤维素酶都有这种现象。温度对酶促反应影响可以分为二个方面：第一个是酶分子间与柔性载体形成的共价键不仅在固定化酶的过程中维持了酶分子构象，降低其受外界环境的影响；第二个是随着温度不断的升高，酶蛋白就会发生变性，但是超过一定范围，酶促反应速度就会下降。综合这几个方面的结果，当载体上面复合纤维素酶以后，其固定化酶的刚性就会增加，为了充分发挥底物分子与其活性基团相结合，就必须要提高温度，这样才能增加固定化酶的柔性，所以固定化酶的最适反应温度范围比游离酶的高。
（2）游离酶、固定酶的最适反应pH
本实验以每组酶活力最高时的值为作图如11所示。可以看出，游离纤维素酶最适pH大约为5，固定化纤维素酶的最适pH为4。这可能是独特的GO属性，包括高比表面积，机械硬度，和更多的结合位点。此外，与游离酶相比，在较宽的pH范围内的固定化纤维素酶的pH耐受性是由于酶的结构是由共价键固定增加。在酸性溶液中的H+离子，可以吸引以及消耗带负电荷的官能团，通过共价键的酶的活性增强，固定化酶在酸性溶液中的稳定是强于碱性溶液。
（3）游离酶、固定酶的米氏常数
由图12可知道游离酶和固定化酶的米氏常数方程，其中：
游离纤维素酶的米氏方程：
y=0.1327x+0.2421, R2=0.999
固定化纤维素酶（GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2）方程：
y=0.3032x+0.0997，R2=0.999
固定化纤维素酶（GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2）方程：
y=0.2159x+0.1331，R2=0.999
从上面的方程可以计算出最大反应速率以及米氏常数。结果如表1所示：
表1. 游离酶和固定化酶的米氏常数表
从表1中可以看到，游离纤维素酶的Km值最小，下面依次是固定化纤维素酶（GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2）、固定化纤维素酶（GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2）。这其中说明当酶被固定在载体上，酶的分子自由度小于游离酶的，导致底物与固定化酶亲和力随着降低，也就是Km值增加。而对于分子量不同来说，GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2比GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2的分子量小，这会导致5 K分子量聚合物空间结构的堆叠，使得与酶接触的概率减小，也就是与底物的亲和力降低。所以5 K分子量的Km大。
（4）游离酶、固定酶的pH稳定性
游离纤维素酶和固定化纤维素酶的pH稳定性从图13看出，在pH=3时的候GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2固定化酶的相对活力为76%，GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2固定化酶的相对活力为80%，都比游离酶的相对活力20%要高，同时在pH=7的时GO@Fe3O4@5K-4-arm-PEG-NH2固定化酶的相对活力为49%，GO@Fe3O4@10K-4-arm-PEG-NH2固定化酶的相对活力为55%,都比游离酶的相对活力25%要高，这就表明了，当游离酶被固定在载体上以后，纤维素酶的耐受性比较好，pH耐受范围变宽了。并且发现分子量5 K的固定化酶比分子量10 K的固定化酶在相同条件下，固定化酶的相对活力要低，这可能是由于分子量的增加，同时其的pH耐受性也随着不断地增加。
（5）游离酶、固定酶的热稳定性
如图14所示的，在这个实验中，分别比较了游离纤维素酶和两种固定化纤维素酶在70℃时的热稳定性，从图中可以看出，固定化酶的热稳定性明显比游离酶的稳定性要高，主要原因是在加热的条件下，游离酶会变性，同时就会造成酶的失活。而通过共价键结合的方式,则使固定化上的酶分子受到了载体上的颗粒的保护。在120 min时游离酶的活性基本上降低到原来活性的一半，而这个时候固定化酶在3h以内，不论是分子量5 K的还是分子量10K的都能保持较高的活性，固定化酶的热稳定性明显增强，并且分子量10 K的要比分子量5K的稳定性要好，这其中的原因是一方面是由于分子量大所固载的酶蛋白就比较多，所以对于热作用的时候，分子量大的所受到的影响就相对来说较小。
（6）固定化酶的操作稳定性
在这组实验当中，通过测定固定化纤维素酶多次重复利用后酶活的变化，考察了分子量5 K的树枝状聚合物固定化纤维素酶和分子量10K的树枝状聚合物固定化纤维素酶的重复使用稳定性，从图15可以看出，两种方法得到的固定化纤维素酶，在经过多次重复利用后固定化酶的酶活变化趋势大体一致，但同时在操作稳定性上有一定的差别。重复利用7次后，分子量10 K固定化纤维素酶的活力基本降到原来活力的45%，而分子量5 K的则将降到原来的40%，这是因为分量越多，载体上面与酶分子结合位点越多，所以分子量10 K的载体固载量就叫多，酶的活力同时也越高，另一方面，由于是树枝状聚合物，分子量越小，它的臂长就越短，这会发生空间位阻效应，使得结合位点就较少，因此酶活就较低。综合起来看，发现固定化酶比游离酶可以多次使用，并且它的操作稳定性比较好，所以在工业生产用到固定化酶可以节约成本。
（7）游离酶、固定酶贮藏稳定性
在这组实验中，比较了游离纤维素酶和两种固定化纤维素酶的贮存稳定性。由图16可以看出，游离纤维素酶的活力在14天以后降到原来活力的50%，而分子量10 K固定化纤维素酶在14天以后，酶的活力降至为原来的70%，分子量5 K的则降为原来的65%。等到将近一个月的时候，游离纤维素酶的活力则基本没有了，而此时的分子量10K固定化纤维素酶的活力降为原来的50%，子量5 K的则降为原来的47%。从上述可知，在室温条件下游离纤维素酶很容易失活，而固定化纤维素酶在相同条件下则能长时间保持较高的活力。同时发现，两种固定化纤维素酶的酶活力，前期的下降速度比较快，而到了后期就相对比较稳定，降低的速度大大减缓。
实施例6：固定化纤维素酶用于降解滤纸、微晶纤维
（1）固定化酶用量与葡萄糖产量的关系
从图17中可以看出，不论是微晶纤维素还是滤纸，固定化酶的水解效果都优于游离酶的。这充分体现了固定化酶的优势。从图中可以看到，当固定化酶以及游离酶的用量在较低的时候，固定化酶和游离酶水解的葡萄糖量增加的幅度比较大，但是当用酶量在较高范围的时候，固定化酶和游离酶水解葡萄糖量增加的幅度比较小。主要是由于当固定化纤酶的量过大时，就会明显的抑制产物，葡萄糖生成的量就会受到影响，这主要是因为纤维素和酶的结合位点趋于饱和。另外还有其他原因，例如：由于固定化时间过长，固定化酶和游离酶会发生变性，产物的不断积累等。另一方面，用聚合物分子量10 K来固定化纤维素酶做应用实验得到的葡萄糖量要比聚合物分子量5 K的高，主要是因为10 K的固载量高，酶活力就相对比较高，催化活性更好。而对于微晶纤维素和滤纸来说，固定化酶水解微晶纤维素的葡萄糖量滤纸要多，主要是因为微晶纤维素比滤纸的纤维素含量高。
（2）时间与固定化纤维素酶水解葡萄糖产量的关系
从图18中可以看出，在前2 h，不论是微晶纤维素还是滤纸，固定化酶和游离酶水解的葡萄糖量都是在增加的幅度比较大，但是在2 h以后，固定化酶和游离酶水解的葡萄糖量都是在增加的幅度比较小。主要原因是可以分为两点。第一点是：随着酶解反应的不断进行，产物也在不断地增加，根据中间产物理论，就会抑制反应的进行。第二点就是在反应的前2h，酶水解得是纤滤纸和微晶纤维素的无定形区。因此水解速度较快，相应的葡萄糖浓度增加也较快。在这之后，固定化酶水解反应发生在在结晶区，所以水解的速度就会比较慢，导致葡萄糖的浓度增加的也比较慢。当然随着时间的不断增加，固定化酶会有部分失活会导致固定化酶水解的速度变慢。同时我们发现固定化酶水解微晶纤维素的葡萄糖量滤纸要多，这也印证了上面提到的因为滤纸的其他杂物含量比微晶纤维素多。另一方面发现用聚合物分子量10 K来固定化纤维素酶做应用实验得到的葡萄糖量要比聚合物分子量5 K的高，主要是因为10 K的固载量高，酶活力就相对比较高，催化活性更好；两种固定化酶水解催化效果都优于游离酶。

Claims (10)

1.一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球，其特征在于，所述微球是基于GO@Fe3O4和4arm-PEG-NH2通过共价结合的方式得到，具有超顺磁性，为复合树枝状聚合物结构。
2.权利要求1所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备氧化石墨烯；
（2）氧化石墨烯进行羧基化处理；
（3）制备磁性氧化石墨烯；
（4）制备多臂磁性氧化石墨烯GO@Fe3O4@4-arm-PEG-NH2：
将一定量的磁性氧化石墨烯与四臂聚乙二醇胺混合后在水浴中超声，在超声开始后的第5 min时第一次加入一定量的EDC，超声结束后第二次加入一定量的EDC ，机械搅拌一定时间后得黑色反应产物，然后用去离子水多次洗涤产物至其中没有白色沉淀，最后将产物放入真空干燥箱干燥。
3. 根据权利要求2所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的磁性氧化石墨烯加入量为5-15 mL，四臂聚乙二醇胺加入量为1-3 mL；所述磁性氧化石墨烯的浓度为1 mg/mL ；所述的四臂聚乙二醇胺的浓度为5 mg/mL 。
4.根据权利要求2所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述超声的条件为25 ℃的水浴中超声3 h。
5.根据权利要求2所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述第一次EDC加入量为1-3 mg，第二次EDC加入量为1.6-3.6 mg。
6.根据权利要求2所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述机械搅拌时间为10-14h。
7.权利要求1所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球在酶的固定化中的应用。
8.根据权利要求8 所述的应用，其特征在于，所述多臂磁性氧化石墨烯复合微球在酶的固定化过程中，所述的多臂磁性氧化石墨烯复合微球和酶的质量比为1-2:1。
9.一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球固定化纤维素酶，其特征在于，所述固定化纤维素酶是基于权利要求1所述的一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球制备得到的。
10.权利要求9所述的固定化纤维素酶用于纤维素材料的降解。
CN201810126114.9A 2018-02-08 2018-02-08 一种多臂磁性氧化石墨烯复合微球及其制备方法和应用 Pending CN108424905A (zh)

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