CN113155825A - 一种生物分子及抑制剂类分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本公开属于分析检测技术领域，具体提供一种生物分子及抑制剂类分子的检测方法。所述生物分子浓度的检测方法，包括如下步骤：将待测物与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端，不同量的目标检测物引起水凝胶的水解程度不同，因此水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在pH试纸条上产生不同距离得移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。解决现有技术中常用的生物分子检测方法具有操作步骤繁琐，需要培训专业人员操作相关设备，检测时间长、效率低，造成资源浪费和成本增加，同时存在基质等环境背景因素进而影响检测灵敏度的问题。
Description
技术领域
本公开属于分析检测技术领域，具体提供一种生物分子及抑制剂类分子的检测方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
一些生物分子作为标志物可以被客观测量并作为评价指标来评判正常生物过程、病理过程或预后反应，也是生物体受到损害或发生病变时的重要预警指标。为此，实验人员在探究病理或其它生物学研究时，常常需要进行生物分子测试。
目前常用的检测方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫法和电化学分析法等。但发明人发现，通常这些方法选择性和特异性均较高，但是具有操作步骤繁琐，需要培训专业人员操作相关设备，检测时间长、效率低，造成资源浪费和成本增加，同时存在基质等环境背景因素进而影响检测灵敏度。
发明内容
针对现有技术中常用的生物分子检测方法具有操作步骤繁琐，需要培训专业人员操作相关设备，检测时间长、效率低，造成资源浪费和成本增加，同时存在基质等环境背景因素进而影响检测灵敏度的问题。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种生物分子的检测方法，包括如下步骤：将待测物与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端，不同量的目标检测物引起水凝胶的水解程度不同，因此水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在pH试纸条上产生不同距离的移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种抑制剂类分子的测试方法，将目标分子、抑制剂分子与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端；
目标分子引起水凝胶水解，因此水凝胶分解释放出的水，会在pH试纸条上产生一定距离的移动，通过测量移动距离的长短实现对目标检测物的检测；
抑制剂分子抑制目标分子发挥作用，减少水凝胶的水解，混合溶液也会在pH试纸条上产生一定距离的移动，测量移动距离实现对抑制剂类分子抑制能力的测试。
上述技术方案中的一个或一些技术方案具有如下优点或有益效果：
1)本公开涉及的检测原理简单，目标检测物诱导水凝胶分解释放水，通过释放的水在指示性试纸条上移动距离来检测目标物。所用材料成本低廉、操作简单便捷、检测快速并且结果可长时间保存、可以避免背景因素的干扰和非特异性吸收等优点。
2)本公开对检测装置需求简单，只需一部具有拍照功能的智能手机或一把测量直尺就可完成图像数据记录与定性分析，避免了传统检测需要实验室大型仪器等缺点，可实现户外检测或居家自检，具有良好的经济价值和社会效益，值得推广应用。
3)本公开提供了一种基于凝胶水解程度检测生物分子的新方法，即不同量的目标检测物引起水凝胶的水解程度不同，此时因水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在指示性试纸条上产生不同距离得移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。该方法适应于多种目标待测物，具体的，只要能够使水凝胶发生水解的待测物均可，检测范围广。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开所涉及的检测装置的结构及原理示意图；其中：1.检测用水凝胶液滴；2.疏水性基底板，3.pH试纸条；4.支撑棒；5.水移动距离；6.目标检测物。
图2为实施例1中明胶使用浓度优化结果图；
图3为实施例1中检测血清中胰蛋白酶的结果图；
图4为实施例4中抑肽酶检测结果图。
具体实施方式
下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本公开的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本公开的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。
针对现有技术中常用的生物分子检测方法具有操作步骤繁琐，需要培训专业人员操作相关设备，检测时间长、效率低，造成资源浪费和成本增加，同时存在基质等环境背景因素进而影响检测灵敏度的问题。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种生物分子的检测方法，包括如下步骤：将待测物与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端，不同量的目标检测物引起水凝胶的水解程度不同，因此水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在pH试纸条上产生不同距离的移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。
本公开所述的生物分子的检测方法的检测原理在于：当检测物存在时，水凝胶水解程度与检测物的量成正相关，检测物浓度越高，水凝胶水解程度越大，释放的水量越大，则在指示性试纸条上移动距离越长或出现水印的地方所占比例更高。当不存在检测物时，水凝胶溶液不发生水解，并转变成凝胶状态，此时指示性试纸条上不会出现水移动的痕迹。
水凝胶作为一种具有三维聚合物网状结构的弹性材料，能够吸收并保留大量的水，具有良好的生物相容性，被广泛应用到药物递送、生物组织工程、柔性传感器和软体驱动等领域。
利用水凝目标胶高含水量的特点，本公开开发了基于凝胶水解程度检测生物分子的新方法，主要是利用检测物诱导水凝胶分解释放水，通过释放的水在指示性试纸条上移动距离来检测目标物。该方法具有简单易操作、成本低廉、检测快速并且结果可长时间保存、可以避免背景因素的干扰和非特异性吸附等优点。
优选的，所述水凝胶与待测物有如下性质：水凝胶随待测物的浓度变化，分解能力增强；应当理解的是，只要使水凝胶发生水解转变成凝胶状态的待测物，均可用于本公开所述的方法。
优选的，所述水凝胶为明胶类水凝胶体系、透明质酸类水凝胶体系、DNA类水凝胶体系；
优选的，所述水凝胶为明胶类水凝胶体系，待测物为血清中胰蛋白酶；
优选的，所述水凝胶为透明质酸类水凝胶体系，待测物为透明质酸酶；
优选的，所述水凝胶为DNA类水凝胶体系，待测物为DNA剪切酶、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)；
上述几种组合经过试验验证后，在待测试纸上随浓度变化明显，区分度高，适用于本公开所述方法的浓度检测。
进一步优选的，所述水凝胶为磷酸活化后的明胶，待测物为血清中胰蛋白酶；
进一步优选的，磷酸在明胶中的比例为1-5wt％，进一步优选为5wt％。经试验发现，5wt％磷酸盐缓冲溶液使液滴在5分钟后的可以变成凝胶，灵敏度较高，可以完成快速检测的需求。
优选的，所述指示性试纸条为pH试纸条，聚酯膜类试纸条、碳纤维素膜类试纸条、玻璃纤维类试纸条等中的一种，优选为pH试纸条；
进一步优选的，所述pH试纸条为常用广范试纸条，pH范围为1-14。
优选的，所述生物分子浓度的检测方法在疏水性基板上进行，先将混合溶液滴在疏水性基板上，一段时间后，再将指示性试纸条一端置于液滴上表面；
优选的，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板等中的一种；
优选的，所述一段时间为1-30分钟，进一步优选为5分钟。
优选的，还包括水凝胶浓度的优化过程，包括如下步骤：使用磷酸盐缓冲溶液配置不同质量浓度的水凝胶溶液，分别将其滴加到疏水性基底板上，观察液滴在一段时间后的是否可以变成凝胶，此时选择液滴变成凝胶状态时对应的水凝胶浓度作为最适浓度，用于下一步检测；
优选的，所述一段时间为1-30分钟，进一步优选为5分钟；
或，还包括疏水性基底板清洗过程，包括如下步骤：使用乙醇和去离子水的混合溶液超声清洗多次；
优选的，乙醇和去离子水的体积比为1:1.5-2.5，进一步优选为1:2；
优选的，超声次数为3-5次，进一步优选为3次；
优选的，每次超声时间为4-6分钟，进一步优选为5分钟；
或，还包括待测样品孵育过程，包括如下步骤，待检测样品与水凝胶溶液混合，将混合溶液置于合适温度环境下孵育一段时间；
优选的，所述检测样品与水凝胶溶液体积比为1:1.2，优选为1:1；
优选的，将混合溶液置于37℃环境下孵育15分钟。
优选的，还包括指示性试纸条刻度获取过程，包括如下步骤：将不同标准浓度的待测物与分别水凝胶混合，分别置于指示性试纸条一端，将浓度对应的刻度记录，用于后续对目标检测浓度进行对照。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种抑制剂类分子的测试方法，将目标分子、抑制剂分子与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端；
目标分子引起水凝胶水解，因此水凝胶分解释放出的水，会在pH试纸条上产生一定距离的移动，通过测量移动距离的长短实现对目标检测物的检测；
抑制剂分子抑制目标分子发挥作用，减少水凝胶的水解，混合溶液也会在pH试纸条上产生一定距离的移动，测量移动距离实现对抑制剂类分子抑制能力的测试。
以抑肽酶和胰蛋白酶为例，本公开抑制剂类分子抑制能力的测试方法的原理为：当抑肽酶和胰蛋白酶同时存在时，胰蛋白酶活性被抑制，明胶不能被水解或水解程度低(此时没有水被释放或释放水的量较低)，上没有水移动痕迹或移动距离短；当胰蛋白酶存在，抑肽酶不存在时，则明胶水解释放水，指示性试纸条上可观察到水移动痕迹。
优选的，所述目标分子为酶，所述抑制剂分子为酶抑制剂；
优选的，所述目标分子为抑肽酶，所述抑制剂分子为胰蛋白酶。
优选的，还包括抑制浓度测试过程，包括如下步骤：所述目标分子为不同浓度的目标分子，所述抑制剂为不同浓度抑制剂。
优选的，所述抑制剂类分子抑制能力的测试方法在疏水性基板上进行，先将混合溶液滴在疏水性基板上，一段时间后，再将指示性试纸条一端置于液滴上表面；
优选的，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板中的一种；
优选的，所述一段时间为1-30分钟，进一步优选为5分钟。
实施例1：
本实施例提供一种血浆中胰蛋白酶浓度的检测方法，使用明胶作为水凝胶基质，基于图1所示的检测装置及原理，成功实现了对胰蛋白酶的检测。具体操作步骤如下：
步骤一、明胶使用浓度的优化选择：
使用10mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)配置不同质量浓度的明胶溶液(例如1wt％，2wt％，3wt％，4wt％，5wt％等)，37℃下充分溶解后，分别取30μL滴加到疏水性基底板上，室温下(20℃)观察液滴在5分钟后的是否可以变成凝胶，此时选择液滴变成凝胶状态时对应的水凝胶浓度作为最适浓度，此处确定水凝胶最适使用浓度为5wt％，如图2所示，则后续一系列检测所使用的的水凝胶检测浓度为5wt％。
步骤二、疏水性基底板和pH试纸条处理：
此处使用的指示性试纸条为pH试纸条，以此为例，将pH试纸条的尺寸裁剪为5mm×70mm；
疏水性基底板清洗：使用乙醇和去离子水的混合溶液(体积比为1:2)超声清洗3次，每次5分钟。
步骤三、样品测试：
(1)使用PBS和正常人血清混合液(其中PBS与血清体积比为3:2)配置不同浓度的胰蛋白酶溶液，浓度分别为2×10-1mg/mL,2×10-2mg/mL,2×10-3mg/mL,2×10-4mg/mL,2×10-5mg/mL,2×10-6mg/mL；作为对照组，不添加胰蛋白酶
(2)使用PBS配置10wt％明胶溶液；
(3)分别将(1)中制备的样品与明胶溶液按体积比1:1混合，将混合溶液置于37℃环境下孵育15分钟；
(4)取30ul反应后的溶液滴加到疏水性PS基底板上，过5分钟后，将pH试纸条一端放到液滴上表面，通过智能手机等拍照工具记录和观察明胶水解后释放的水在pH试纸条上的移动距离，从而实现对目标物的检测；
(6)可利用Photoshop和Origin等软件工具统计移动距离占pH试纸条整体的比例进行定量计算；
本实例基于的原理是：明胶水解程度与胰蛋白酶的量成正相关，胰蛋白酶浓度越高，明胶水解程度越大，释放的水量越大，则在pH试纸条上移动距离越长或出现水印的地方所占比例更高。当胰蛋白酶不存在时，明胶不发生水解，并转变成凝胶状态，此时pH试纸条上不会出现水移动的痕迹。
实施例2：
本实施例提供一种透明质酸酶的检测方法，与实施例1基于相同装置和原理，将检测物换为透明质酸酶，水凝胶替换为透明质酸水凝胶，可实现对透明质酸酶的检测。
实施例3：
本实施例提供一种DNA剪切酶的检测方法，与实施例1基于相同装置和原理，将检测物换为DNA剪切酶等，水凝胶替换为DNA水凝胶，可实现对DNA剪切酶的检测。
实施例4：
将一些酶的抑制剂加入到水凝胶溶液中，可实现对酶抑制剂的抑制效果检测。
本实施例提供一种抑肽酶抑制能力的测试方法，当抑肽酶和胰蛋白酶同时存在时，胰蛋白酶活性被抑制，明胶不能被水解或水解程度低(此时没有水被释放或释放水的量较低)，pH试纸条上没有水移动痕迹或移动距离短；当胰蛋白酶存在，抑肽酶不存在时，则明胶水解释放水，pH试纸条上可观察到水移动痕迹。
对比例1
本实施例提供一种血浆中胰蛋白酶浓度的检测方法，与实施例1基于相同装置和原理，加入不含胰蛋白酶的溶液或者加入其它酶溶液，明胶溶液不能在pH试纸条上移动。
对比例2
本实施例提供一种血浆中胰蛋白酶浓度的检测方法，与实施例1基于相同装置和原理，将将明胶替换为琼脂，发现琼脂难以被水解，无法在pH试纸上发生移动。
从对比例1,2与实施例1的对比来看，显然磷酸盐缓冲溶液活化后的明胶溶液与pH试纸的配合可以很好的配合水凝胶的水解与pH试纸的移动速度，观测效果较好。
以上所揭露的仅为本公开的优选实施例而已，当然不能以此来限定本公开之权利范围，因此依本公开申请专利范围所作的等同变化，仍属本公开所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种生物分子的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测物与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端，不同量的目标检测物引起水凝胶的水解程度不同，因此水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在pH试纸条上产生不同距离的移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。
2.如权利要求1所述的生物分子的检测方法，其特征在于，所述水凝胶与待测物有如下性质：水凝胶随待测物的浓度变化，分解能力增强；
优选的，所述水凝胶为明胶类水凝胶体系、透明质酸类水凝胶体系、DNA类水凝胶体系；
优选的，所述水凝胶为明胶类水凝胶体系，待测物为血清中胰蛋白酶；
优选的，所述水凝胶为透明质酸类水凝胶体系，待测物为透明质酸酶；
优选的，所述水凝胶为DNA类水凝胶体系，待测物为DNA剪切酶、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)；
进一步优选的，所述水凝胶为磷酸活化后的明胶，待测物为血清中胰蛋白酶；
进一步优选的，磷酸在明胶中的比例为1-5wt％，进一步优选为5wt％。
3.如权利要求1所述的生物分子的检测方法，其特征在于，所述指示性试纸条为pH试纸条，聚酯膜类试纸条、碳纤维素膜类试纸条、玻璃纤维类试纸条中的一种，优选为pH试纸条；
进一步优选的，所述pH试纸条为常用广范试纸条，pH范围为1-14。
4.如权利要求1所述的生物分子的检测方法，其特征在于，所述生物分子浓度的检测方法在疏水性基板上进行，先将混合溶液滴在疏水性基板上，一段时间后，再将指示性试纸条一端置于液滴上表面；
优选的，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板等中的一种；
优选的，所述一段时间为3-7分钟，进一步优选为5分钟。
5.如权利要求1所述的生物分子的检测方法，其特征在于，还包括水凝胶浓度的优化过程，包括如下步骤：使用磷酸盐缓冲溶液配置不同质量浓度的水凝胶溶液，分别将其滴加到疏水性基底板上，观察液滴在一段时间后的是否可以变成凝胶，此时选择液滴变成凝胶状态时对应的水凝胶浓度作为最适浓度，用于下一步检测；
优选的，所述一段时间为1-30分钟，进一步优选为5分钟；
或，还包括疏水性基底板清洗过程，包括如下步骤：使用乙醇和去离子水的混合溶液超声清洗多次；
优选的，乙醇和去离子水的体积比为1:1.5-2.5，进一步优选为1:2；
优选的，超声次数为3-5次，进一步优选为3次；
优选的，每次超声时间为4-6分钟，进一步优选为5分钟；
或，还包括待测样品孵育过程，包括如下步骤，待检测样品与水凝胶溶液混合，将混合溶液置于合适温度环境下孵育一段时间；
优选的，所述检测样品与水凝胶溶液体积比为1:1.2，优选为1:1；
优选的，将混合溶液置于37℃环境下孵育15分钟。
6.如权利要求1所述的生物分子的检测方法，其特征在于，还包括指示性试纸条刻度获取过程，包括如下步骤：将不同标准浓度的待测物与分别水凝胶混合，分别置于指示性试纸条一端，将浓度对应的刻度记录，用于后续对目标检测浓度进行对照。
7.一种抑制剂类分子的测试方法，其特征在于，将目标分子、抑制剂分子与水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端；
目标分子引起水凝胶水解，因此水凝胶分解释放出的水，会在pH试纸条上产生一定距离的移动，通过测量移动距离的长短实现对目标检测物的检测；
抑制剂分子抑制目标分子发挥作用，减少水凝胶的水解，混合溶液也会在pH试纸条上产生一定距离的移动，测量移动距离实现对抑制剂类分子抑制能力的测试。
8.如权利要求7所述的抑制剂类分子的测试方法，其特征在于，所述目标分子为酶，所述抑制剂分子为酶抑制剂；
优选的，所述目标分子为抑肽酶，所述抑制剂分子为胰蛋白酶。
9.如权利要求7所述的抑制剂类分子的测试方法，其特征在于，还包括抑制浓度测试过程，包括如下步骤：所述目标分子为不同浓度的目标分子，所述抑制剂为不同浓度抑制剂。
10.如权利要求7所述的抑制剂类分子的测试方法，其特征在于，所述抑制剂类分子抑制能力的测试方法在疏水性基板上进行，先将混合溶液滴在疏水性基板上，一段时间后，再将指示性试纸条一端置于液滴上表面；
优选的，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板等中的一种；
优选的，所述一段时间为1-30分钟，进一步优选为5分钟。
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