CN104698043A - 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及一种检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器及其制备方法，用于检测大肠杆菌；本发明针对大肠杆菌16SrDNA的特异性序列区间，分别合成HRP-Avidin(辣根过氧化物酶-亲和素)功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针序列，加入TMB-H2O2(四甲基联苯胺-过氧化氢)后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号，制备出检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及一种检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器及其制备方法，用于检测大肠杆菌。
背景技术
大肠杆菌是严重危害健康的食源性肠道致病菌之一，实现对大肠杆菌的快速检测，是预防与控制食源性疾病的关键环节之一。16SrDNA作为研究分类学和系统进化的分子受到高度重视，16SrDNA为所有细菌所共有，分子量大小适中便于序列分析；在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的；而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的细菌，通过对16SrDNA基因序列设计相应核酸探针，对于食品中病原菌的快速诊断具有重要的实际意义和应用价值。
目前PCR(聚合酶链反应法)和ELISA(酶联免疫法)是目前较常用的食品病原菌快速检测手段；但是因为其两者均需要通过一系列复杂的生化处理过程，操作比较繁琐，仍未从根本上降低病原菌的检测时间提高检测速度，难以满足实际快速检测的要求。实践中需要一种更为可靠的新型检测技术，电化学生物传感检测技术作为一种新型检测技术在食品致病菌检测技术中逐步成为关注的焦点。
本发明针对大肠杆菌16S rDNA的特异性序列区间，分别合成HRP-Avidin(辣根过氧化物酶-亲和素)功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针序列，加入TMB-H2O2(四甲基联苯胺-过氧化氢)后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号，制备出检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器。
发明内容
本发明目的是提供一种可以灵敏、快速及定量检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其具体制备步骤如下：
(1)将电极充分打磨清洗后，在电极表面加入11-巯基十一烷酸溶液，然后将电极放入温箱中孵育后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干。
(3)在电极表面加入EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)混合液后在室温下孵育后，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干；再分别加入BPA(生物酰胺化亲和素)后，在电极表面成功构建11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层；
(4)在电极表面加入生物素化DNA捕获探针，孵育后取出用PBS轻轻冲洗，再加入大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液后加入HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后放入水浴箱中充分孵育杂交后取出，用PBS缓冲液冲洗，再加入TMB-H2O2后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号；
(5)通过差分脉冲电流图统计数据，根据所检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA绘制工作曲线。
本发明用于定量检测大肠杆菌的原理：
当检测食物标本中含有大肠杆菌时，通过处理食物标本形成大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液，通过在电极表面构建生物素化DNA检测探针识别层，分别加入待检液和后HRP-Avidin功能化的DNA检测探针，待检液中的大肠杆菌16S rDNA靶序列在孵育过程中被捕获探针特异性捕获，在加入TMB-H2O2后，通过HRP-Avidin功能化的检测探针对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应，该信号与待检液中的大肠杆菌16S rDNA靶序列浓度成正比，通过绘制工作曲线，可以对未知食物标本中的大肠杆菌进行检测与定量分析。
本发明所建立的检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其体现的特点是：
(1)从核酸分子检测大肠杆菌无需细菌培养，可以避免因长时间细菌培养所造成的检测速度缓慢；
(2)采用HRP-TMB-H2O2生物学信号放大体系，稳定性好灵敏度高，无需PCR对靶核酸分子的扩增，简化核酸检测流程。
附图说明
图1是本发明制备方法中检测大肠杆菌16S rDNA将核酸杂信息交转换电流信号的差分脉冲图。
图2是本发明制备方法中检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA所得的工作曲线。
图中数字代码表示不同浓度的大肠杆菌16S rDNA，其中1，2为0.01μmol／L；3，16为0.03μmol／L；5，14为0.05μmol／L；7，8为0.10μmol／L。
具体实施方案：
检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法：
(1)电极表面处理：将电极充分打磨至镜面光滑后，在双蒸水中清洗两次，再放入无水乙醇中超声清洗5分钟后取出，烘干1min；
(2)在电极表面加入5μL0.5mmol／L的11-巯基十一烷酸溶液，然后将电极放入到充满氮气的氮气箱中48h，然后取出用无水乙醇轻轻清洗30s，并在氮气中烘干1min；
(3)在电极表面加入20μL EDC和NHS混合液后在室温下孵育10min，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干1min；再在表面加入5μL BPA；
(4)在电极表面加入2μL 0.1μmol／L的生物素化DNA捕获探针，孵育10min后取出，用PBS轻轻冲洗5s，再加入食物标本中分离的靶序列待检液，再往电极表面加入1μL0.1μmol／L的HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后将电极放入65℃水浴箱中充分孵育杂交40min后取出，用PBS缓冲液冲洗5s，再加入TMB-H2O2；
(5)根据绘制的工作曲线，推算所检测的未知标本是否含有大肠杆菌及其含量浓度。
Claims (4)
1.一种检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)电极表面11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层的制备；
(2)电极表面HRP-Avidin功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针及检测体系的制备；
(3)检测大肠杆菌工作曲线的绘制。
2.根据权利要求1所述的电极表面11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层的制备，其特征在于：在打磨处理后的电极表面加入EDC和NHS混合液后在室温下孵育，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干后加入BPA。
3.根据权利要求1所述的电极表面HRP-Avidin功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针及检测体系的制备，其特征在于：
(1)在电极表面加入生物素化DNA捕获探针，孵育后取出用PBS轻轻冲洗，再加入食物标本中分离的大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液；
(2)在电极表面再加入HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后将修饰后的电极入水浴箱中充分孵育杂交后取出，用PBS缓冲液冲洗，加入TMB-H2O2。
4.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌工作曲线的绘制，其特征在于：通过差分脉冲电流图统计数据，根据所检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA绘制工作曲线。
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