CN104569371B - Pda修饰的纸基微流控芯片及其在dna比色检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PDA修饰的纸基微流控芯片及其在DNA比色检测中的应用，该芯片的制备方法包括以下步骤：加工纸基微流控芯片、制备带伯胺基团的PDA衍生物，用MES缓冲液润湿纸基微流控芯片的反应池，然后加入PDA溶液，避光晾干；使用前，将芯片在紫外光下照射数秒，得到PDA修饰的纸基微流控芯片。相比于传统的DNA定量检测，本发明PDA修饰的纸基微流控芯片比色检测方法无需加入荧光或放射性标记物、无需添加任何酶，因此比色检测芯片在操作上更安全，且可以长期保存而不失生物活性。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种聚二乙炔(PDA)修饰的纸基微流控芯片及其在双链DNA(dsDNA)比色检测中的应用。
背景技术
目前，纸基DNA检测的方法有以下几种：电化学法、电致化学发光法、荧光分析法、比色分析法等。相比于其它检测方法，比色分析法操作简单、噪声低、无需使用昂贵的仪器设备，这对发展中国家或地区来说是一种可以被大众接受的检测方法。
2007年，Whitesides小组首次提出纸基微流控概念。近年来，纸基微流控技术已经得到非常迅速的发展。与传统的硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片相比较，纸基微流控芯片具有成本低、分析系统微型化、便于携带、生物兼容性好、后处理简单无污染等优点。到目前为止，一些加工方法已用于纸基微流控芯片制作，比如剪纸法、照相平板加工法、喷墨印刷法、等离子处理法、蜡转染法等。相比于这些加工方法，蜡网印加工方法的优势在于：制作容易、成本低、且所需设备简单，无需高技术人才。
PDA是一类新型的环境响应共轭聚合物，它是由紫外线或者伽玛射线辐照形成的蓝色聚合物。聚合反应过程不需要其他任何催化剂或者引发剂，因此所形成的PDA产物没有任何其他杂质，无需后处理，从而极大地方便了后期DNA检测。PDA是一种基于分子自组装的生物识别器件，与传统的亲和层析、印迹法、凝胶电泳检测核酸相比，无需加入荧光和放射性标记物质、无需添加任何酶、更安全、且长期保存而不失生物活性。此外，PDA具有生物兼容性好、响应速度快等优点，因而受到了广泛的关注。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种PDA修饰的纸基微流控芯片的制备方法，该方法首次将PDA与纸基微流控芯片结合起来，利用了纸的非特异性吸附性质，并结合PDA的传感特性来检测dsDNA，从而制成一种基于PDA的纸基微流控芯片比色传感器。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的纸基微流控芯片，该芯片操作简单、便于携带。
本发明的再一目的在于提供上述的纸基微流控芯片在dsDNA比色检测中的应用，该技术巧妙地结合了PDA光感材料和纸基微流控技术的优点，无需任何复杂设备、操作简单、实用性强。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种PDA修饰的纸基微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)纸基微流控芯片加工
将网板紧贴在层析纸上方，然后在网板上涂蜡，蜡透过网板渗透在纸上；然后，将附着层析纸的网板置于加热板上加热，层析纸与加热板直接接触；加热后，层析纸与网板分离，室温冷却晾干，得到微阵列纸基微流控芯片；网板通过加热擦拭去除多余的蜡，从而可反复使用；
所述的层析纸是Whatman1号层析纸(20mm×20mm)，网印时层析纸被分成三等份，每份纸的大小约为6.7mm×20mm；
所述的网板优选为300目网纱网板；
所述的将网板置于加热板上加热，优选温度85℃加热5s；
所述网板的图案由AdobeIllustrateCS5软件设计，该网板拟在纸上网印出亲水区的阵列圆直径优选为8mm；
(2)带伯胺基团的PDA衍生物制备
2.1制备PCDA-NHS：将10,12-二十五二炔酸(PCDA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于二氯甲烷溶液中，在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应3h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，旋蒸得到白色固体PCDA-NHS；
2.2制备PCDA-EDEA：将所得的PCDA-NHS溶于二氯甲烷中；然后将PCDA-NHS溶液加入到2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(EDEA)中，边加入边搅拌以加速反应，在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应5h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，接着旋蒸去除乙酸乙酯；将得到的白色固体通过硅胶柱层析，旋蒸得到纯PCDA-EDEA；
2.3PCDA与PCDA-EDEA自组装形成PDA：将PCDA与上述得到的PCDA-EDEA溶解于二氯甲烷中，用N2流吹干溶液得到白色固体；将白色固体溶于2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中，在80℃下超声处理20min，经0.5μL注射式过滤器过滤得到溶液；溶液置于4℃冰箱中过夜处理，得到PDA(避光、密封保存)；
(3)纸基微流控芯片的PDA修饰
用pH值5.5的MES缓冲液润湿纸基微流控芯片的反应池，然后用氮气吹干反应池；取上述的PDA溶液滴加到反应池中，待溶液均匀充满整个反应池，避光晾干，或者用N2吹干；使用前，将芯片在紫外光下照射数秒，使芯片上修饰的PDA聚合，得到PDA修饰的纸基微流控芯片；不立即使用时将该芯片避光、密封保存，以储备待用。
上述方法制得的PDA修饰的纸基微流控芯片可用于dsDNA比色检测，具体包括以下步骤：
将待测dsDNA样品加入到紫外聚合过的反应池中，室温条件下进行比色反应数分钟；采用智能手机来采集反应池颜色变化，得到JPG格式图片；获得的图片通过Photoshop软件的RGB通道来分析，从而得到纸基反应池中PDA对待测DNA的比色响应值；比色响应值越大，表示样品中dsDNA的浓度越大；
比色响应值(colorimetricresponse，CR)通过以下式子计算：
CR(％)＝[(PB0-PBf)/PB0]×100
其中，PB0表示未加入dsDNA时蓝色聚二乙炔的RGB蓝色通道颜色强度占RGB红蓝通道颜色强度的百分比；PBf表示加入dsDNA反应后红色聚二乙炔的RGB蓝色通道颜色强度占RGB红蓝通道颜色强度的百分比；
PB＝Ablue/(Ablue+Ared)，Ablue表示聚二乙炔对RGB蓝色通道的颜色强度，Ared表示聚二乙炔对RGB红色通道的颜色强度。
本发明方法的基本原理是：利用层析纸纤维素非特异性吸附固定PDA脂质体。PDA作为光感材料，在紫外光照射下，有序排列的带伯胺基团的PCDA衍生物(PCDA-EDEA)与PCDA分子发生聚合反应，通过1,4加成反应生成聚二乙炔，其骨架自发地发生扭曲，呈现蓝色。当待检dsDNA滴加到带伯胺基团的PDA修饰的纸基微流控反应池中时，PDA迅速发生质子化，形成的PDA衍生物带正电荷，它与DNA双螺旋结构中的磷酸基团负电荷发生离子反应。该反应影响到聚合物骨架构象，从而使聚二乙炔颜色由蓝色变为红色。
此方法可以提供快速的、视觉上的半定量dsDNA检测。更重要的是，该方法根据聚乙二炔由蓝色转变为红色的程度，可以实现定量检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)相比于传统的DNA定量检测，本发明PDA修饰的纸基微流控芯片比色检测方法无需加入荧光或放射性标记物、无需添加任何酶，因此比色检测芯片在操作上更安全，且可以长期保存而不失生物活性。
(2)本发明方法充分利用纸纤维素的非特异性吸附作用来固定PDA光感材料。因此，相比于以玻璃材质为基础的基因比色检测法，本发明的方法无需对芯片进行氧化修饰等预处理，从而避免了带伯胺功能基团的PDA与玻片氧化产生的醛基键合反应不完全所带来的不利影响。
(3)相比于其它方法的芯片制备过程，本发明方法在PDA修饰的芯片制备过程中不涉及到任何冲洗过程，从而完全避免了由反复冲洗所带来的后续检测的不利影响。
(4)相比于液相PDA比色检测dsDNA方法，本发明方法极大地提高了检测灵敏度，检测限低达10nM，提高了1个数量级。
(5)相比于液相PDA比色检测dsDNA方法，本发明方法极大地提高了检测速度，约5min可完成检测。
(6)相比于其它昂贵且复杂的检测系统，本发明的比色检测方法只需要简单、廉价的智能手机。利用Photoshop软件对所获图像进行分析处理，极大地节省了检测成本。
附图说明
图1是PDA修饰的纸基微流控芯片制作过程及该芯片用于DNA比色检测的示意图。
图2是本发明的纸基微流控芯片的实物图。
图3是纸基芯片反应池中PDA对不同浓度dsDNA的比色响应成像图。
图4是本发明方法中待检dsDNA浓度与比色响应值之间的关系图。
图5是本发明中待检dsDNA的PDA比色响应值随反应时间变化的成像图。
图6是本发明中待检dsDNA的PDA比色响应值与反应时间之间的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种PDA修饰的纸基微流控芯片，由以下步骤制备得到：
(1)纸基微流控芯片加工
采用AdobeIllustrateCS5软件设计网板图案，根据该图案加工形成300目涤纶网纱网板；将网板压在层析纸上方(两者紧贴)，然后在网板上涂蜡(图1步骤1)；涂蜡完成后，将附着层析纸的网板置于加热板上(层析纸与加热板接触)，在85℃下加热5s(图1步骤2)，接着层析纸与网板分离，室温冷却形成纸基微流控芯片(图1步骤3)。网板通过加热擦拭去除多余蜡，可反复使用。网板上不透蜡的部分在纸上网印出亲水性的圆反应池阵列(4行，12列，池直径为8mm)(图2)。
(2)带伯胺基团的PDA衍生物制备
PCDA-NHS制备：将1g10,12-二十五二炔酸(PCDA)，345mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，596mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10mL二氯甲烷溶液中；在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应3h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，旋蒸得到1.18g白色固体PCDA-NHS。
PCDA-EDEA制备：将上述所得的PCDA-NHS溶于40mL二氯甲烷；利用注射泵将PCDA-NHS溶液加入到3.71g2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(EDEA)中，在注射过程中进行磁力搅拌以加速反应，注入速度为20mL/h；在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应5h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，接着旋蒸去除乙酸乙酯，得到的白色固体通过硅胶柱层析，旋蒸得到纯1gPCDA-EDEA,其中层析过程中的淋洗剂为甲醇、二氯甲烷以及二乙胺，其体积比为1:30:0.031。
PCDA与PCDA-EDEA自组装形成PDA：将上述得到的505mgPCDA-EDEA与375mgPCDA充分溶解于10mL二氯甲烷中，用N2流吹干溶液得到白色固体；将白色固体溶于pH值为5.5的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中，在80℃下超声处理20min；经0.5μL注射式过滤器过滤得到4mM溶液；置于4℃冰箱中过夜处理，得到PDA(避光、密封保存)。
(3)纸基微流控芯片的PDA修饰
用10μLpH值5.5的MES缓冲液润湿纸基微流控反应池，并氮气干燥(图1步骤4)；取上述制得的15μLPDA溶液滴加到反应池中，待溶液均匀充满整个反应池，避光晾干(或者N2吹干)(图1步骤5)；避光、密封保存，以储备待用；(d)样品待检前，将纸基微流控芯片在254nm紫外光下聚合(图1步骤6)，从而形成可使用的PDA修饰过的纸基微流控芯片(图1步骤7)。
实施例2
实施例1制得的PDA修饰的纸基微流控芯片在不同浓度dsDNA比色检测中的应用，具体包括以下步骤：
将7组dsDNA样品(体积3μL，dsDNA的浓度分别为0nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM)分别加入到PDA修饰过的纸基微流控芯片反应池中(图1步骤8)；在室温条件下进行比色反应数分钟；采用智能手机来采集反应池颜色变化，得到JPG格式图片(图1步骤9)；获得的图片通过Photoshop软件的RGB通道来分析，从而得到纸基反应池中PDA对待测DNA的比色响应值。
图3是纸基微流控芯片反应池中PDA对不同浓度dsDNA的比色响应成像图；
图4是纸基微流控芯片反应池中dsDNA浓度与比色响应值之间的关系图。
从图4可以看出：随着dsDNA浓度增加，比色响应值相应地增加，检测限度为10nM。
实施例3
利用实施例1制得的PDA修饰的纸基微流控芯片进行dsDNA比色检测，探求比色响应值随反应时间的变化关系。
将3μL100nMdsDNA样品加入到PDA修饰过的纸基微流控芯片反应池中。设置了若干反应时间，分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、1min、2min、3min、4min、5min和6min。
图5是比色响应随反应时间变化的成像图。
图6是比色响应值与反应时间之间的关系图。
从图中可以看出：在加入dsDNA10s后，比色响应值发生明显变化，出现颜色变化(由蓝变红)。然后，dsDNA与PDA继续反应可导致颜色进一步加深，从10s到1min颜色强度变化很大，但是2min后颜色变化很小，肉眼几乎观察不到颜色变化。由此可见，本发明方法检测dsDNA的速度很快，有潜力在1min内完成检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种PDA修饰的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）纸基微流控芯片加工
将网板紧贴在层析纸上方，然后在网板上涂蜡，蜡透过网板渗透在纸上；然后，将附着层析纸的网板置于加热板上加热，层析纸与加热板直接接触；加热后，层析纸与网板分离，室温冷却晾干，得到微阵列纸基微流控芯片；
（2）带伯胺基团的PDA衍生物制备
2.1制备PCDA-NHS：将10,12-二十五二炔酸、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中，在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应3h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，旋蒸得到白色固体PCDA-NHS；
2.2制备PCDA-EDEA：将所得的PCDA-NHS溶于二氯甲烷中；然后将PCDA-NHS溶液加入到2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)中，边加入边搅拌，在室温、避光密封、磁力搅拌的条件下反应5h；旋蒸去除有机溶剂；将旋蒸后的固体用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去残留水分，接着旋蒸去除乙酸乙酯；将得到的白色固体通过硅胶柱层析，旋蒸得到纯PCDA-EDEA；
2.3PCDA与PCDA-EDEA自组装形成PDA：将PCDA与上述得到的PCDA-EDEA溶解于二氯甲烷中，用N2流吹干溶液得到白色固体；将白色固体溶于2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在80℃下超声处理20min，经0.5μL注射式过滤器过滤得到溶液；溶液置于4℃冰箱中过夜处理，得到PDA；
（3）纸基微流控芯片的PDA修饰
用pH值5.5的MES缓冲液润湿纸基微流控芯片的反应池，然后用氮气吹干反应池；取上述的PDA溶液滴加到反应池中，待溶液均匀充满整个反应池，避光晾干，或者用N2吹干；使用前，将芯片在紫外光下照射数秒，使芯片上修饰的PDA聚合，得到PDA修饰的纸基微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的PDA修饰的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的将附着层析纸的网板置于加热板上加热，是85℃加热5s。
3.根据权利要求1所述的PDA修饰的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于：网板的图案由AdobeIllustrateCS5软件设计，该网板拟在纸上网印出亲水区的阵列圆直径为8mm。
4.一种PDA修饰的纸基微流控芯片，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的PDA修饰的纸基微流控芯片在dsDNA比色检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的PDA修饰的纸基微流控芯片在dsDNA比色检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：
将待测dsDNA样品加入到紫外聚合过的反应池中，室温条件下进行比色反应数分钟；采用智能手机来采集反应池颜色变化，得到JPG格式图片；获得的图片通过Photoshop软件的RGB通道来分析，从而得到纸基反应池中PDA对待测DNA的比色响应值；比色响应值越大，表示样品中dsDNA的浓度越大。
7.根据权利要求6所述的PDA修饰的纸基微流控芯片在dsDNA比色检测中的应用，其特征在于：
比色响应值通过以下式子计算：
CR(%)=[(PB0-PBf)/PB0]×100
其中，PB0表示未加入dsDNA时蓝色聚二乙炔的RGB蓝色通道颜色强度占RGB红蓝通道颜色强度的百分比；PBf表示加入dsDNA反应后红色聚二乙炔的RGB蓝色通道颜色强度占RGB红蓝通道颜色强度的百分比；
PB=Ablue/（Ablue+Ared），Ablue表示聚二乙炔对RGB蓝色通道的颜色强度，Ared表示聚二乙炔对RGB红色通道的颜色强度。
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