CN105713824A - 一种微滴式数字pcr专用生物芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微滴式数字PCR专用生物芯片，包括基片、微孔阵列片和盖片，所述基片正面设有容纳所述微孔阵列片的凹槽，所述盖片与基片的正面配合将所述凹槽包围形成密封的腔体，所述凹槽底面设有固定支撑微孔阵列片的凸脚，所述微孔阵列片上的微孔为通孔。本发明微滴式数字PCR专用生物芯片通过在基片正面的凹槽底面设有固定支撑微孔阵列片的凸脚，微孔阵列片上的微孔为通孔，在使用时，微孔阵列片架空于基片的凹槽内，使得反应时的微滴溶液上下都被油相介质包裹，有利于精确控制反应的温度。

Description

一种微滴式数字PCR专用生物芯片
技术领域
本发明涉及生物检测分析设备领域，特别是涉及一种微滴式数字PCR专用生物芯片。
背景技术
微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)是近年来新出现的一种PCR技术。在原有PCR技术的基础上，该技术进行了大幅革新。该技术将传统PCR中的每一份样品反应体系均分为20000个独立微滴，然后再进行PCR反应。在制作微滴时，只有部分微滴可以包裹到目的基因。PCR反应结束后用设备检测所有微滴的荧光信号值。再根据荧光信号的阈值来区分每一个微滴的信号值，高于阈值的微滴信号值判定为该微滴包裹到了目的基因，称为阳性微滴。低于阈值的微滴信号，判定为该微滴没包裹到目的基因，称为阴性微滴。含有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，计算得出靶分子的起始拷贝数。
与经典的荧光定量PCR相比，ddPCR可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析，具有无可比拟的精确性，不再需要标准曲线。ddPCR提供了独立互不干扰的极微小的密闭反应微孔，能够使得模板分子真正成为以单一分子为模板开始，进行PCR扩增的过程，能够区分混样模板中的极低含量靶核酸分子。ddPCR已经被用于癌症分子标志物的发现、传染病研究、基因组结构变异分析、基因表达分析等领域。
CN105132571A公开了一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法。所述方法包括重组质粒的构建、样本制备、提取血浆DNA和ExosomeDNA、对血浆进行预处理，以及使用微滴式数字化PCR分析重组质粒mtDNA拷贝数等步骤。所述方法不仅具备优于qPCR的高灵敏度、特异性和重复性的特点，且其对干扰物(如抗凝剂等)耐受能力高于qPCR。此外，本发明在建立检测方法的基础上，进一步利用血浆样本直接作为ddPCR的模板，进行血浆mtDNA的分析，不仅消除由于提取所带来检测不确定性，更加便于临床检验。
CN105296663A公开了一种基于荧光染料法数字微滴PCR检测血液中结核杆菌的方法，在于，包括以下步骤：步骤(1)采集血液，提取血液中的总DNA；步骤(2)将总DNA进行数字微滴PCR反应，反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹结核杆菌DNA，高于阈值的微滴包裹结核杆菌DNA，为阳性微滴，低于阈值的微滴不包裹结核杆菌为阴性微滴；步骤(3)统计阳性微滴数，计算得出结核杆菌DNA的拷贝数，继而得到血液中结核杆菌DNA的总拷贝数。本发明提供的方法取样方便快捷，仅需采集微量血液即可检测出微量结核菌的存在，灵敏度高，检测快速，仅需2小时就可完成检测过程。
现有微滴式数字PCR专用生物芯片的微孔阵列片与基片正面的凹槽底部粘合，微孔阵列片上的微孔不是通孔，每张芯片的微孔阵列包含20000个微孔，用于一个样本的检测，每个微孔可以容纳一个微滴在里面，水相反应液配置完成后，即加入油相，先形成油包水结构，然后进入到反应器中进行PCR。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种温控更加精确的微滴式数字PCR专用生物芯片。
一种微滴式数字PCR专用生物芯片，包括基片、微孔阵列片和盖片，所述基片正面设有容纳所述微孔阵列片的凹槽，所述盖片与基片的正面配合将所述凹槽包围形成密封的腔体，所述凹槽底面设有固定支撑微孔阵列片的凸脚，所述微孔阵列片上的微孔为通孔。
每个微孔阵列片上包含20000个微孔，用于一个样本的检测，每个微孔可以容纳一个微滴。
优选的，所述凹槽底面设有与所述微孔阵列片角部配合的限位凸脚。优选的，限位凸脚为4对，微孔阵列片的每个角设置一对限位凸脚。
优选的，所述微孔阵列片与凸脚通过粘结剂粘结固定。所述粘结剂为环氧树脂保密胶或硅胶粘合剂。
优选的，所述基片的背面设有限位凹槽。所述限位凹槽设置于基片背面的边缘，用于将本发明微滴式数字PCR专用生物芯片固定到微滴式数字PCR反应仪器上。
优选的，所述盖片的背面设有伸入凹槽的凸台。所述凸台的设置有利于盖片的定位和固定。
优选的，所述盖片上带有加液排气孔。反应液加完后，先加入部分油相介质，然后盖上盖片，通过加液排气孔再加入油相介质，直至加满油相介质并将空气排尽，加完油相介质后，将加液排气孔密封。加液排气孔的设置方便排尽空气。所述的油相介质可以是：烷烃类、硅油、氟化油。
优选的，所述凸脚设于微孔阵列片的边缘，顶端设有与微孔阵列片边缘配合的台阶结构。所述凸脚数量为4个，每个凸脚固定支撑微孔阵列片的一边，微孔阵列片架设于所述台阶结构内侧的较低一级台阶上，微孔阵列片的侧边抵住较高一级台阶的侧边。
优选的，所述微孔阵列片表面经亲水处理。所述亲水处理的方法为：在高温热生长表面氧化膜后，用亲水试剂进行清洗。所述的亲水试剂可以是：丙酮、乙醇、乙二醇、。优选的，所述的亲水试剂为丙酮。微孔阵列片表面经亲水处理使得水溶性的微滴通过亲水作用进入微孔内，同时因为微滴体积足够小，所以微滴能够通过表面张力悬停于微孔中，而不会从微孔的下端流出。
所述微孔阵列片可选材料主要有硅片、玻璃、石英及聚甲基丙烯酸甲酯一类的高分子聚合物。优选的，所述微孔阵列片为硅片。硅片相对其他材质的微孔阵列片具有价格便宜、加工简单等优点。
所述硅片的制备方法包括以下步骤：
(1)取硅原片，清洗后吹干；
(2)在硅原片双面涂覆光刻胶，烘干后进行光刻，显影；
(3)在经光刻的硅原片双面沉积若干层贵金属；
(4)将沉积贵金属的硅原片置于腐蚀液中，反应形成通孔；
(5)清洗，吹干。
所述的硅原片为单晶硅，所述的单晶硅为n型硅原片或p型硅原片。
所述烘干温度为90～120℃，烘干时间为30s～2min。优选的，烘干温度为100～110℃，烘干时间为45s～90s。最优选的，烘干温度为105℃，烘干时间为1min。
所述步骤(3)中，先沉积一层银，再沉积一层金；银层厚度为3～10nm，金层厚度为5～20nm。优选的，银层厚度为3～7nm，金层厚度为7～15nm。最优选的，银层厚度为5nm，金层厚度为10nm。
所述腐蚀液配置方法为：配置浓度为4.0～8.0mol/L的氢氟酸溶液和浓度为0.3～0.7mol/L的过氧化氢溶液，两者再以体积比10∶1混合。优选的，所述腐蚀液配置方法为：配置浓度为5.0～6.5mol/L的氢氟酸溶液和浓度为0.4～0.55mol/L的过氧化氢溶液，两者再以体积比10∶1混合。最优选的，所述腐蚀液配置方法为：配置浓度为5.74mol/L的氢氟酸溶液和浓度为0.46mol/L的过氧化氢溶液，两者再以体积比10∶1混合。
所述微滴式数字PCR专用生物芯片使用前已经将微孔阵列片固定于基片的凹槽中的凸脚上。所述微滴式数字PCR专用生物芯片使用方法如下：
(1)将固定有微孔阵列片的基片和盖片分别置于加样器指定加样槽和盖片槽中；
(2)在样品加载叶片中加入所需体积的反应液；
(3)启动加样器将加载叶片中的反应液涂扫于微孔阵列片表面；
(4)加样完成后，用微量注射器滴加油相介质，使油相介质将微孔阵列片包围；
(5)将盖片盖于基片上，通过粘合剂将两者粘连在一起；
(6)通过盖片上的加液排气孔继续注入油相介质，以排净芯片内的空气；
(7)在加液排气孔滴加适量密封胶，用紫外线活化使胶凝固。
本发明微滴式数字PCR专用生物芯片通过在基片正面的凹槽底面设有固定支撑微孔阵列片的凸脚，微孔阵列片上的微孔为通孔，在使用时，微孔阵列片架空于基片的凹槽内，使得反应时的微滴溶液上下都被油相介质包裹，有利于精确控制反应的温度。
附图说明
图1为本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的盖片正视图；
图2为本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的基片正视图；
图3为本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的基片后视图；
图4为图2中A向剖视图；
图5为本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的微孔阵列片置于基片凹槽内示意图；
图6为本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的微孔阵列片、基片和盖片组合示意图；
图7为本发明硅片制备工艺流程图；
图8为本发明硅片的微孔显微图；
图9为实施例4中本发明微滴式数字PCR专用生物芯片用于分析低拷贝核酸的信号强度散点图。
具体实施方式
实施例1微滴式数字PCR专用生物芯片
如图1～6所示，本发明微滴式数字PCR专用生物芯片包括基片1、带微孔阵列的微孔阵列片2和盖片3。基片1正面设有容纳微孔阵列片2的凹槽11，凹槽11底面设有固定支撑微孔阵列片2的凸脚12，凸脚12数量为4个，每个凸脚12固定支撑微孔阵列片2的一边，凸脚12顶端设有与微孔阵列片2边缘配合的台阶结构13，微孔阵列片2架设于台阶结构13内侧的较低一级台阶上，微孔阵列片2的侧边抵住较高一级台阶的侧边。凹槽11底面设有与微孔阵列片2角部配合的限位凸脚13，限位凸脚13数量为4对，微孔阵列片2的每个角设置一对限位凸脚13。基片1的背面设有限位凹槽14，限位凹槽14设置于基片1背面的边缘处，基片1的四个角及其中三条边各有一个限位凹槽14，限位凹槽14用于将本发明微滴式数字PCR专用生物芯片固定到微滴式数字PCR反应仪器上。
微孔阵列片2上的微孔21为通孔。每个微孔阵列片2上包含20000个微孔21，形成一个微孔阵列，一个微孔阵列片用于一个样本的检测，每个微孔可以容纳一个微滴在里面。微孔阵列片2与凸脚12通过粘结剂粘结固定。微孔阵列片2表面经亲水处理，使得水溶性的微滴通过亲水作用进入微孔21内，同时因为微滴体积足够小，所以微滴能够通过表面张力悬停于微孔21中，而不会从微孔21的下端流出。
盖片3的背面设有伸入凹槽11的凸台31。盖片3上带有加液排气孔32。盖片3与基片1的正面配合将凹槽11包围形成密封的腔体。
实施例2硅片制备
硅片制备工艺流程如图7所示。具体步骤如下：
(1)将电阻率0.1～1Ω·cmp、厚度300μm的硅原片在在丙酮和乙醇中各超声清洗5分钟，清洗两遍。然后用热去离子水和冷去离子水分别清洗2～3遍，氮气吹干备用。
(2)将清洗吹干后的硅原片，双面涂光刻胶，105℃烘1分钟，光刻机双面光刻曝光1.4秒，再显影45秒。
(3)利用电子束蒸发设备在光刻后的硅原片正反两面上依次沉积厚度为5nm的银和10nm的金。
(4)配制5.74mol/L氢氟酸溶液和0.46mol/L过氧化氢溶液，两者以体积比10∶1混合制得腐蚀液。
(5)将步骤(3)中硅原片置于配制好腐蚀液中反应，反应7.5小时后取出。
(6)将刻蚀好的硅原片取出，用去离子水清洗几遍，再放入腐蚀液中10分钟，然后泡入丙酮溶液中10分钟后取出，再用大量去离子水清洗后氮气吹干，获得带有微孔的硅片。微孔的显微结构如图8所示。
实施例3硅片制备
(1)将电阻率0.01～0.09Ω·cmp、厚度300μm的硅原片在在丙酮和乙醇中各超声清洗5分钟，清洗两遍。然后用热去离子水和冷去离子水分别清洗2～3遍，氮气吹干备用。
(2)将清洗吹干后的硅原片，双面涂光刻胶，105℃烘1分钟，光刻机双面光刻曝光1.4秒，再显影45秒。
(3)利用电子束蒸发设备在光刻后的硅原片正反两面上依次沉积厚度为5nm的银和10nm的金。
(4)配制5.74mol/L氢氟酸溶液和0.46mol/L过氧化氢溶液，两者以体积比10∶1混合制得腐蚀液。
(5)将步骤(3)中硅原片置于配制好腐蚀液中反应，反应7.5小时后取出。
(6)将刻蚀好的硅原片取出，用去离子水清洗几遍，再放入腐蚀液中10分钟，然后泡入丙酮溶液中10分钟后取出，再用大量去离子水清洗后氮气吹干，获得带有微孔的硅片。
实施例4微滴式数字PCR专用生物芯片用于分析低拷贝核酸
为了验证本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的性能，使用本发明微滴式数字PCR专用生物芯片与Bio-rad公司的QX100dPCR、Life公司的StepOneplusqPCR分别同时对非小细胞肺癌T790M片段进行扩增，扩增使用引物和探针分别为：
上游引物：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’；
下游引物：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3’；
荧光探针1：5’-VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQ-3’；
荧光探针2：5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3’。
实验步骤如下：
(1)提取样本DNA；
(2)将样本DNA与引物、探针及预混的缓冲液混匀获得反应液，反应液成分如下：
(3)使用加样器将反应液涂扫于微孔阵列片的微孔中；
(4)使用油相介质对生物芯片的微孔阵列片上的微孔进行封液，盖上盖片后，通过加液排气孔继续加油相介质以排净空气，然后将加液排气空密封；
(5)将生物芯片置于热循环加热模块上，设置反应程序，进行PCR扩增反应，反应程序为：50℃反应2min(UNG酶作用)；96℃预变性10min；98℃变性30s，63℃退火2min，40个循环；25℃保存；
(6)信号读取与分析，计算靶DNA或RNA分子的拷贝数浓度＝-lnP/0.75nL，其中P＝阴性微孔数量/总有效微孔数量。
荧光信号读取与分析时软件运算法则为：读取所有荧光强度转化的数字信号，统计学分析，扣除整个芯片背景噪音值，得到有效数字信号值，通过某种荧光染料的中间数(1/2最大值与最小值)数字信号值划定某种荧光染料的阈值基线，对于FAM信号，判定高于阈值的数字信号值为阳性信号值，标记为蓝色；对于VIC信号，判定高于阈值的数字信号值为阳性信号值，标记为红色；当两个信号都为阳性时，标记为绿色；当两个信号都为阴性时，标记为黄色，然后，在X-Y两维的坐标轴图视化所有的数字信号值，根据信号的颜色进行归类判断。其中，VIC的信号代表野生型，FAM的信号表示基因突变。
使用本发明微滴式数字PCR专用生物芯片的结果如图9所示。三组实验中阳性微孔数量如表1所示，本发明微滴式数字PCR专用生物芯片所得结果与市场上的产品Bio-rad公司的QX100dPCR和Life公司的StepOneplusqPCR所得结果相近。
表1阳性拷贝数结果比较。
三次实验均值 Bio-rad QX100 dPCR Life StepOne plus qPCR 本发明结果
FAM(copies/μL) 217.35 220.14 219.45
VIC(copies/μL) 69.90 73.21 69.88

Claims (10)

1.一种微滴式数字PCR专用生物芯片，包括基片、微孔阵列片和盖片，所述基片正面设有容纳所述微孔阵列片的凹槽，所述盖片与基片的正面配合将所述凹槽包围形成密封的腔体，其特征在于，所述凹槽底面设有固定支撑微孔阵列片的凸脚，所述微孔阵列片上的微孔为通孔。
2.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述凹槽底面设有与所述微孔阵列片角部配合的限位凸脚。
3.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述微孔阵列片与凸脚通过粘结剂粘结固定。
4.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述基片的背面设有限位凹槽。
5.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述盖片的背面设有伸入凹槽的凸台。
6.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述盖片上带有加液排气孔。
7.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述凸脚设于微孔阵列片的边缘，顶端设有与微孔阵列片边缘配合的台阶结构。
8.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述微孔阵列片表面经亲水处理。
9.如权利要求1所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述微孔阵列片为硅片。
10.如权利要求9所述的微滴式数字PCR专用生物芯片，其特征在于，所述硅片的制备方法包括以下步骤：
(1)取硅原片，清洗后吹干；
(2)在硅原片双面涂覆光刻胶，烘干后进行光刻，显影；
(3)在经光刻的硅原片双面沉积若干层贵金属；
(4)将沉积贵金属的硅原片置于腐蚀液中，反应形成通孔；
(5)清洗，吹干。
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