CN106841050A - 一种用于检测uo22+的液晶生物传感方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，所述方法首先在传感基底表面修饰TEA/DMOAP混合自组装膜，将捕获探针固定于经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，然后滴加UO₂ ²⁺与DNA酶双链复合物反应的混合溶液，将修饰有DMOAP敏感膜的上玻片和修饰TEA/DMOAP混合敏感膜且接有DNA的下玻片面对面组装制成液晶盒，用偏光显微镜观察光学信号响应。本发明所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，发展了一种简单直观的液晶生物传感方法并实现了对UO₂ ²⁺的检测，该方法具有操作简单，特异性好且不需要标记等优点。

Description

一种用于检测UO22+的液晶生物传感方法

技术领域

本发明属于液晶生物传感器领域，尤其是涉及一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法。

背景技术

液晶(LC)是一种在一定温度范围内呈现既不同于固态、液态，又不同于气态的特殊物质态，它既具有各向异性的晶体所特有的双折射性，又具有液体的流动性，对外界条件的刺激能够灵敏响应，并能将界面事件转变为仅用偏光显微镜就能观察到的光学响应。液晶已成为在固相界面和液晶-水相相界面监控界面现象的一个强有力的工具。固相界面的传感机理主要是基于固定在传感基底表面的自组装敏感膜能够识别生物、化学分子前后发生的空间构象和几何尺寸的变化，引起基底表面物理形貌改变，扰乱液晶分子初始有序排列，导致液晶分子在偏振光显微镜下的光学成像变化，从而实现对特定的蛋白质、核酸、重金属离子等分子的检测。液晶-水相界面的传感机理主要是基于自组装敏感膜与液晶分子在均相介质中相互作用诱导液晶分子垂直于水-液晶界面取向排列，目标分子的存在会打乱这种作用，使得界面的微环境性质改变(如pH变化，电荷密度变化，亲疏水性变化等)，诱导液晶分子重新取向排列，导致液晶分子在偏正光显微镜下的光学成像变化，从而实现对目标分子的分析检测。

铀(U)是一种具有放射性的重金属，而UO₂ ²⁺是U在水中存在最稳定的化学形式，UO₂ ^{2 +}高溶解性对人类的健康构成重大威胁，能够造成机体免疫、消化、造血以及生殖系统紊乱。目前，大多数检测U的方法主要依靠仪器分析方法，根据U元素本身特有的性质，主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体法、电位滴定法、分光光度法、荧光法和拉曼光谱法等，大多数仪器分析方法需要繁琐的样本预处理，并且所需设备精密昂贵。因此，构建操作简单、方便快捷、灵敏、选择性高的U检测新方法是困难而又重要的，对于安全评估、监测环境中U污染、环境治理及减少人群暴露等有着重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，发展了一种简单直观的检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，该方法操作简单，特异性好且不需要标记等优点，能够实现对最低浓度为25nMUO₂ ²⁺的检测。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，首先在传感基底表面修饰TEA/DMOAP混合自组装膜，将捕获探针固定于经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，然后滴加UO₂ ²⁺与DNA酶双链复合物反应的混合溶液，将修饰有DMOAP敏感膜的上玻片和修饰TEA/DMOAP混合敏感膜且接有DNA的下玻片面对面组装制成液晶盒，用偏光显微镜观察光学信号响应。

进一步的,一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，包括以下步骤：

(1)玻片基底的预处理：将载玻片用钢化玻璃刀切成大小约为1.5cm×2cm的方块，置于培养皿中，用新鲜配制的体积比为6：3～8：3的浓硫酸与双氧水的Piranha溶液在恒温槽中浸泡，然后用超纯水冲洗，在无水乙醇中浸泡，氮气吹干，放置于烘箱中加热干燥，取出防尘备用；

(2)玻片基底敏感膜的组装：(a)、上玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在体积分数为0.2％～0.6％的DMOAP水溶液中，室温放置10min，然后取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干后置于烘箱中加热干燥；

(b)、下玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在TEA和DMOAP的乙醇混合溶液中，恒温浸泡后依次用乙醇、超纯水冲洗干净，氮气吹干，置于烘箱中加热干燥。

(3)捕获探针的固定：将捕获探针滴加到经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，37℃恒温反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干；

(4)铀酶链和底物链进行杂交反应：在pH 5.5的MES缓冲液中将DNA酶链和等量的底物链充分混合，在水浴锅中加热到75～90℃退火2～5min，然后冷却到室温，得到DNA酶双链复合物，然后加入不同浓度的UO₂ ²⁺，混合均匀后于室温下反应，将上述溶液滴加到固定有捕获探针的下玻片上，37℃反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干；

(5)液晶盒的制备：将步骤(4)得到的接有目标物的下玻片与上玻片面对面组装，中间用一边缘开有小口的厚度约为20μm的凸型Mylar聚酯片隔开，除开有小孔方向的其他三边用长尾夹固定，将其放置于自制的密闭加热装置中，加热至40℃使液晶分子成各向同性的液态，通过开有小口的玻片边缘处移取5～10μL的5CB液晶注入液晶盒，然后冷却到室温；

(6)用偏光显微镜观察并采集图片、分析结果。

进一步的，所述1×SSC洗液由6×SSC储备洗液稀释得到；6×SSC储备洗液为0.9mol/L NaCl、0.09mol/L二水合柠檬酸三钠、质量分数0.01％十二烷基硫酸钠的混合溶液。

相对于现有技术，本发明所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法具有以下优势：

(1)本发明所述的提出了一种新颖的液晶生物传感策略用于UO₂ ²⁺检测，利用在UO₂ ^{2 +}存在的条件下，UO₂ ²⁺能跟DNA酶结合，引起液晶盒前后偏光图像信号改变，发展了一种简单直观的液晶生物传感方法并实现了对UO22+的检测，该方法具有操作简单，特异性好且不需要标记等优点，能够实现对最低浓度为25nMUO₂ ²⁺的检测；

(2)本发明所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，该传感器实现了UO₂ ²⁺特异性的DNA酶的高通量检测。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的原理示意图；

图2为本发明实施例所述的不同UO₂ ²⁺浓度的响应信号图像；

图3为本发明实施例所述的不同金属离子的光学响应图像。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1

标准溶液的配制

Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)：20mM Tris-HCl、50mM NaCl、100mM Mg²⁺、10mMNaBH₃CN。

6×SSC储备洗液(pH 7.0)：0.9M NaCl、0.09M二水合柠檬酸三钠、0.01％十二烷基硫酸钠；使用时用超纯水稀释至1×SSC(用于除去非特异性吸附的DNA)。

MES缓冲液(pH 5.5)：50mM MES、300mM NaCl

UO₂ ²⁺标准溶液的配制：准确称取42.4mgUO₂(CH₃COO)₂于10ml离心管中加灭菌水溶解，避光保存。

UO₂ ²⁺工作溶液：取一定体积的UO₂ ²⁺标准溶液用MES缓冲溶液稀释至所需浓度。

实验中用到的核苷酸序列均由大连宝生物工程有限公司合成，如下表：

表3.1本实验所用到的核酸序列

具体实验步骤如下：

(1)玻片基底的预处理：将载玻片用钢化玻璃刀切成大小约为1.5cm×2cm的方块，置于培养皿中，用新鲜配制的体积比为6：3～8：3的浓硫酸与双氧水的Piranha溶液在恒温槽中浸泡，然后用超纯水冲洗，在无水乙醇中浸泡，氮气吹干，放置于烘箱中加热干燥，取出防尘备用；

(2)玻片基底敏感膜的组装：(a)、上玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在体积分数为0.2％～0.6％的DMOAP水溶液中，室温放置10min，然后取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干后置于烘箱中加热干燥；

(b)、下玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在TEA和DMOAP的乙醇混合溶液中，恒温浸泡后依次用乙醇、超纯水冲洗干净，氮气吹干，置于烘箱中加热干燥。

(3)捕获探针的固定：将捕获探针滴加到经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，37℃恒温反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干；

(4)铀酶链和底物链进行杂交反应：在pH 5.5的MES缓冲液中将DNA酶链和等量的底物链充分混合，在水浴锅中加热到75～90℃退火2～5min，然后冷却到室温，得到DNA酶双链复合物，然后加入不同浓度的UO₂ ²⁺，混合均匀后于室温下反应，将上述溶液滴加到固定有捕获探针的下玻片上，37℃反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干；

(5)液晶盒的制备：将步骤(4)得到的接有目标物的下玻片与上玻片面对面组装，中间用一边缘开有小口的厚度约为20μm的凸型Mylar聚酯片隔开，除开有小孔方向的其他三边用长尾夹固定，将其放置于自制的密闭加热装置中，加热至40℃使液晶分子成各向同性的液态，通过开有小口的玻片边缘处移取5～10μL的5CB液晶注入液晶盒，然后冷却到室温；

(6)用偏光显微镜观察并采集图片、分析结果。

在优化实验条件下，本实验考察了传感体系对UO₂ ²⁺的响应信号，实验结果如图2所示。从实验结果可以看出，本传感方法具有良好的信噪比，随着UO₂ ²⁺浓度的降低，双折射现象越不明显，偏光图像中出现的彩色织构越少。当UO₂ ²⁺浓度的为600nM时，整个图像都是黑白织构(如图2中A图)。当UO₂ ²⁺浓度降低时，与玻片基底表面结合的目标DNA序列减少，对液晶有序排列的扰乱作用变小，光学图象中的光亮度及液晶织构现象减弱(如图2中B-D图)；当UO₂ ²⁺浓度降低至25nM时，图像上出现一点点但可明显区分的双折射亮区(如图2中E图)；当UO₂ ²⁺浓度低于25nM时，光学图像趋于黑色(如图2中F图)，说明本传感方法能检测到UO₂ ²⁺的浓度为25nM。

选择性实验

选择性是检测传感器性能的一个十分重要的指标，为了检验本方法对UO₂ ²⁺检测的特异性，本实验中UO₂ ²⁺的浓度为50nM，浓度为50μM的Ca²⁺；Zn²⁺；Mn²⁺；Fe²⁺；Mg²⁺；Ni²⁺；Cu²⁺；Cd^{2 +}8中不同的金属离子在同等条件下进行检测。实验结果如图3所示50nM UO₂ ²⁺所获得的图像与50μM其他金属离子的所获得的图像存在明显差异。只有当溶液中有UO₂ ²⁺存在时，才会出现能够产生明显双折射现象的光学信号响应，说明只有UO₂ ²⁺存在条件下才能有效扰乱液晶分子的有序排列，干扰金属离子不会扰乱液晶垂直排列，偏光图像仍然是全黑背景。这些结果表明该传感器具有极高的选择性，DNA酶对UO₂ ²⁺特异性强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：首先在传感基底表面修饰TEA/DMOAP混合自组装膜，将捕获探针固定于经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，然后滴加UO₂ ²⁺与DNA酶双链复合物反应的混合溶液，将修饰有DMOAP敏感膜的上玻片和修饰TEA/DMOAP混合敏感膜且接有DNA的下玻片面对面组装制成液晶盒，用偏光显微镜观察光学信号响应。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)玻片基底的预处理；

(2)玻片基底敏感膜的组装；

(3)捕获探针的固定；

(4)铀酶链和底物链进行杂交反应；

(5)液晶盒的制备；

(6)用偏光显微镜观察并采集图片、分析结果。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：步骤(1)具体为将载玻片用钢化玻璃刀切成大小约为1.5cm×2cm的方块，置于培养皿中，用新鲜配制的体积比为6：3～8：3的浓硫酸与双氧水的Piranha溶液在恒温槽中浸泡，然后用超纯水冲洗，在无水乙醇中浸泡，氮气吹干，放置于烘箱中加热干燥，取出防尘备用。

4.根据权利要求2所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：步骤(2)具体为：

(a)、上玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在体积分数为0.2％～0.6％的DMOAP水溶液中，室温放置10min，然后取出用超纯水冲洗干净，氮气吹干后置于烘箱中加热干燥；

(b)、下玻片组装：将Piranha处理过的玻片浸泡在TEA和DMOAP的乙醇混合溶液中，恒温浸泡后依次用乙醇、超纯水冲洗干净，氮气吹干，置于烘箱中加热干燥。

5.根据权利要求2所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：步骤(3)具体为将捕获探针滴加到经过化学敏感膜修饰的下玻片基底表面，37℃恒温反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干。

6.根据权利要求2所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：步骤(4)具体为在pH 5.5的MES缓冲液中将DNA酶链和等量的底物链充分混合，在水浴锅中加热到75～90℃退火2～5min，然后冷却到室温，得到DNA酶双链复合物，然后加入不同浓度的UO₂ ²⁺，混合均匀后于室温下反应，将上述溶液滴加到固定有捕获探针的下玻片上，37℃反应1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超纯水冲洗，氮气吹干。

7.根据权利要求2所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：步骤(5)具体为将步骤(4)得到的接有目标物的下玻片与上玻片面对面组装，中间用一边缘开有小口的厚度约为20μm的凸型Mylar聚酯片隔开，除开有小孔方向的其他三边用长尾夹固定，将其放置于自制的密闭加热装置中，加热至40℃使液晶分子成各向同性的液态，通过开有小口的玻片边缘处移取5～10μL的5CB液晶注入液晶盒，然后冷却到室温。

8.根据权利要求5所述的一种用于检测UO₂ ²⁺的液晶生物传感方法，其特征在于：1×SSC洗液由6×SSC储备洗液稀释得到；6×SSC储备洗液为0.9mol/L NaCl、0.09mol/L二水合柠檬酸三钠、质量分数0.01％十二烷基硫酸钠的混合溶液。