CN107941712A - 一种基于液晶生物传感器检测天蚕素b的方法 - Google Patents

一种基于液晶生物传感器检测天蚕素b的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，将N,N‑二甲基‑N‑十八烷基(3‑[三甲氧基硅烷]丙基)氯化铵/三乙氧基丁醛硅烷(DMOAP/TEA)混合自组装修饰玻片表面，诱导液晶分子取向；采用TEA中的醛基将天蚕素B固定于自组装膜修饰的基底表面，天蚕素B抗体与固定于玻片表面的天蚕素B特异性结合后，会扰乱液晶分子的取向，导致光学信号的颜色和亮度发生变化，以此实现对天蚕素B的检测。本发明在检测天蚕素B时，结合液晶生物传感器的优点，从而具有灵敏度高、特异性好、非标记和操作简单等特点。

Description

一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法。
背景技术
天蚕素作为一种最早被发现并且被研究的动物抗菌肽，属于阳离子抗菌肽。天蚕素B含有35个氨基酸残基，不含半胱氨酸，结构中不含二硫键。其N端区域具有强碱性，而在C端区域可形成疏水螺旋，N末端区域富含亲水碱性氨基酸残基，这种结构有利于天蚕素吸附到带负电荷的细胞膜上，C末端含较多的疏水性氨基酸残基，疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细胞膜的双层脂质膜中，分子两端各形成一个两亲性ɑ-螺旋，这种结构是破坏、裂解细菌的主要结构。天蚕素B对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌均具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒，而在动植物抗病基因工程、植物育种、生物饲料添加剂等领域有着巨大的潜在应用价值。
然而，现有的检测手段，现有多肽检测方法有电位滴定法、高效液相色谱法、免疫分析法等，电位滴定法滴定终点难以判定，且受客观环境影响大；高效液相色谱法的分析成本高，耗时长；免疫分析法对抗原抗体标记要求高。而本发明使用的方法具有灵敏度高、特异性好、非标记和操作简单等优点。
发明内容
为了克服现有技术的的上述不足，本发明的目的是提供一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法。本发明为快速检测天蚕素B（CB）存在提供了一种新的方法，具有灵敏度高、特异性好、非标记和操作简单等优点。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，将N,N-二甲基-N-十八烷基(3-[三甲氧基硅烷]丙基)氯化铵/三乙氧基丁醛硅烷(DMOAP/TEA)混合自组装修饰玻片表面，诱导液晶分子取向；采用TEA中的醛基将天蚕素B固定于自组装膜修饰的基底表面，天蚕素B抗体与固定于玻片表面的天蚕素B特异性结合后，会扰乱液晶分子的取向，导致光学信号的颜色和亮度发生变化，以此实现对天蚕素B的检测。本发明包括以下步骤：
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入(1%-5%)（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠（PH=5.0）溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，备用。
3)天蚕素B的固定
取适量的CB溶液滴加至下玻片表面，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的天蚕素B抗体溶液与不同浓度的天蚕素B溶液37℃恒温混匀10 min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察；
所述的步骤1）中酸处理玻片并用无水乙醇浸泡10min，使基底表面固定足够的羟基。
所述的步骤2）中上玻片在0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中常温下浸泡30 min。
所述的步骤2）中下玻片在（1%-5%）(体积分数)TEA和1%(体积分数) DMOAP 的乙醇溶液在80℃浸泡2h。
所述的步骤3）中将(50-100 ng/L)的CB溶液加在经自组装修饰的下玻片上，用洗耳球吹开，于37℃温育2.5h，使基底表面固定CB。
所述的步骤4）中将一定浓度的anti-CB和不同浓度的CB溶液加在固定有CB的玻片上，洗耳球吹开，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。
所述的步骤5）中将上玻片和下玻片面对面组装成液晶盒，玻片之间用Mylar聚酯片隔开。
所述的步骤5）中先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从中间开凸型空腔的Mylar聚酯片开孔处注入，液晶由于毛细管作用力而布满整个空腔。
所述的步骤5）中将制作好的液晶池自然冷却到28℃左右用偏光显微镜观察其光学现象。
优选的，本发明基于液晶生物传感器检测CB的方法包括以下几个步骤：
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入(1%-5%)（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，备用。
3)天蚕素B的固定
取适量的CB溶液滴加至下玻片表面，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与不同浓度的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察；
优选的，所述的步骤2）中上玻片用0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液浸泡30min。
优选的，所述的步骤2）中下玻片用（1%-5%）(质量分数)TEA和1%(质量分数)DMOAP的乙醇溶液中于80℃浸泡2h，使基底表面功能化。
优选的，所述的步骤3）中通过TEA中的醛基与CB的羧基作用将浓度为(50-120nmoL/L)CB固定在玻片上。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明可以快速，微量地检测CB的含量，并且无需标记，不会造成任何污染。
附图说明
图1为不同体积比的TEA/DMOAP基低自组装膜制备的液晶池光学成像；
图2为固定化CB浓度对液晶池光学成像的影响对比照片；
图3为不同浓度天蚕素B制备的液晶池光学成像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明不局限于以下实施例。
一、实施例1~5 对TEA/DMOAP比例的确定
实施例1
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入5%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50 ℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，备用。
3)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察；
实施例2
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，备用。
3)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例3
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入3%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例4
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入2%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例5
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入1%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
将实施例1~5制备的液晶池在偏光显微镜下进行观察，得到图1结果，图中TEA/DMOAP体积比为：(a)5:1；(b)4:1；(c)3:1；(d)2:1；(e)1:1。如图1所示，当TEA/DMOAP比例较高时(图a)，光学成像中亮斑大且多，随着TEA/DMOAP比例减小，光学成像中亮斑逐渐减少，当两者比等于或小于2:1时，光学成像均为均一黑色图案。为了使基底固定有既能诱导液晶垂直排列又能提供足够的醛基固定CB，因此选择TEA/DMOAP比例为2:1。
二、实施例6~9 对固定化CB含量的确定
实施例6
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入2%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50 ℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取500ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例7
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取250ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例8
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例9
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取80ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
将实施例6~9制备的液晶池置于偏光显微镜下观察，得到图2照片，图中，固定化CB浓度分别为：(a)500 ng/ml；(b)250 ng/ml；(c)100 ng/ml；(d)80 ng/ml。如图2所示，当CB浓度较高时(500 ng/ml)，对液晶分子取向扰乱程度较大，光学成像中有较大的彩色亮斑出现(图a)，背景值较高，干扰后续检测。随着固定化CB浓度的减小，对液晶分子取向扰乱减小，液晶池光学成像逐渐变暗，当固定化抗原浓度为100、80 ng/ml时，光学成像中只有少数星点亮斑，由于需要足够的抗原与抗体反应，因此选择固定化CB浓度为100ng/ml固定于基底表面，进行后续检测。
三、实施例10~14 CB的检测
实施例10
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与0ng/ml的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例11
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与1.0ng/ml的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例12
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与10 ng/ml的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例13
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与50ng/ml的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
实施例14
1)将玻片切割成2cm×2cm，用新配制的Piranha溶液[V(H2SO4):V(H2O2)=7:3]于80℃浸泡1h，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，于110℃干燥3h，防尘备用。
2)玻片的组装
上玻片的DMOAP溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸0.2%(体积分数)的DMOAP水溶液中，常温下静置30min，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥，防尘备用。
下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装:将清洗烘烤后的玻片浸入4%（体积分数）的TEA和1%（体积分数）DMOAP的10mmol/L醋酸-醋酸钠(PH=5.0)溶液中，于50℃恒温2h，超纯水冲洗干净，N2吹干，于110℃干燥1h，防尘备用。
3)天蚕素B的固定
取100ng/ml的CB溶液滴加至下玻片表面，用洗耳球吹开，于37℃温浴2.5h，取出后分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干,置于-20℃下冷冻保存。
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的anti-CB溶液与100ng/ml的CB溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应。分别用PBS缓冲液(PH=7.4)和超纯水冲洗，N2吹干备用。
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定。先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
将实施例10~14制备的液晶池分别置于偏光显微镜下进行观察，得到图3结果，图中天蚕素B的浓度分别为：(a)0 ng/ml；(b)1.0ng/ml；(c)10 ng/ml；(d)50ng/ml；(e)100ng/ml。如图3所示，在一定浓度范围内，待测天蚕素B的浓度越低，结合到基底玻片表面的天蚕素B抗体分子越多，图像越亮；反之，待测天蚕素B浓度越高，结合到基底玻片表面的天蚕素B抗体分子越少，图像趋于全黑。因此，天蚕素B含量超过10ng/ml时，光学信号出现明显变化。
以上结果显示，利用竞争免疫法检测CB，在CB的含量超过10ng/ml时，光学信号出现明显变化。因此，可以实现对CB的快速高效地检测。

Claims (9)

1.一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)玻片的预处理
将玻片切割成所需大小，用新配制的Piranha溶液于80℃充分浸泡，再分别用乙醇和去离子水清洗干净，经N2吹干，干燥，防尘备用；
2)玻片的组装
2-1)上玻片的DMOAP溶液组装：将经过步骤1)预处理的玻片浸入DMOAP水溶液中，充分浸泡后，用超纯水冲洗干净，N2吹干，干燥，防尘备用；
2-2)下玻片的TEA和DMOAP混合溶液组装：将经过步骤1)预处理的玻片浸入50℃的TEA:DMOAP体积比为1-5:1的醋酸-醋酸钠溶液中，充分浸泡后，用超纯水冲洗干净，N2吹干，干燥，防尘备用；
3)天蚕素B的固定
取适量的CB溶液滴加至下玻片表面，于37℃温育2.5h，取出后分别用PBS缓冲液和超纯水冲洗，除去未固定的CB分子，N2吹干，冷冻保存；
4)天蚕素B抗原抗体竞争免疫反应
将一定浓度的天蚕素B抗体溶液与不同浓度的天蚕素B溶液37℃恒温混匀10min后滴加至固定有抗原的玻片上，于37℃温育1.5h，抗原抗体即可实现免疫竞争反应；分别用PBS缓冲液和超纯水冲洗，N2吹干备用；
5)液晶池的制作
液晶池由上玻片和下玻片面对面组装而成，玻片之间用Mylar聚酯片隔开，Mylar聚酯片中间开凸型空腔，除开孔方向外，其它三边边缘用小夹子固定；先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从Mylar聚酯片开孔处注入并通过毛细管作用力布满整个空腔，自然冷却到28℃左右观察。
2.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤1)中对玻片表面进行酸处理，使玻片表面产生大量羟基。
3.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤2)中对酸处理过后的上玻片用体积分数0.2%的DMOAP水溶液浸泡30min。
4.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤2)中对酸处理过后的下玻片用含体积分数1%-5%TEA且含体积分数1%DMOAP的溶液在50℃下恒温2h，使基底表面存在功能化的自组装膜。
5.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤3)中将一定量的天蚕素B溶液加在经功能化修饰的基底上，用洗耳球吹开，于37℃温育2.5h，使天蚕素B固定在下玻片上。
6.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤4)中将一定量的天蚕素B和天蚕素B抗体混合均匀后，加在固定有天蚕素B的下玻片上，用洗耳球吹开，与37℃温育1.5h，即可进行抗原抗体的竞争免疫反应。
7.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤5)中将上玻片和下玻片面对面组装成液晶盒，玻片之间用Mylar聚酯片隔开。
8.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤5)中先将液晶5CB加热到40℃左右使其呈各向同性的液态，然后将其从中间开凸型空腔的Mylar 聚酯片开孔处注入，液晶由于毛细管作用力而布满整个空腔。
9.根据权利要求1所述的一种基于液晶生物传感器检测天蚕素B的方法，其特征在于：所述的步骤5）中将制作好的液晶池自然冷却到室温用偏光显微镜观察其光学现象。
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