CN107505469A - 一种检测肺表面活性蛋白a的核酸适配体液晶生物传感器及其制备和检测方法 - Google Patents

一种检测肺表面活性蛋白a的核酸适配体液晶生物传感器及其制备和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，及其制备和检测方法，此方法是基于核酸适体的检测平台，当一个最佳浓度的肺表面活性蛋白A的核酸适配体修饰到到醛基化的玻璃表面,玻片表面微小拓扑变化几乎不会影响传感系统并且仍然保持偏光显微镜下一个黑暗的背景，当肺表面活性蛋白A存在时,肺表面活性蛋白核酸适配体会与肺表面活性蛋白A反应，形成一个类似双链DNA的结构，从而大大改变了玻片表面拓扑结构，此变化可以扰乱液晶的取向,导致偏光显微镜下出现一个由黑暗变化到彩色的液晶光学图像，从而可以检测到肺表面活性蛋白A，这种液晶生物传感器构造非常简单,方便,有很高的灵敏度和很好的选择性，通过使用这种方法,肺表面活性蛋白A的检测限是5 nmol·L‑1。

Description

一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器及 其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，以及该液晶生物传感器的制备方法与检测方法。
背景技术
肺表面蛋白A(Pulmonary Surfactant Protein A，SP-A)， 是一种多功能糖蛋白，它在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺部免疫和炎症反应中起着重要的作用。SP-A主要形成于Ⅱ型肺泡上皮细胞，肺外少量表达，在肺内的高表达。肺表面活性蛋白A的高或低表达水平和一些临床肺部疾病直接相关，与此同时它也是一些特定的肺部疾病诊断和预后的指标。许多肺部疾病在早期很难根据早期临床表现，X射线检查和一些创伤性迹象检查来评估肺泡毛细血管屏障的损伤程度。最近，许多实验表明， SP-A血清水平的敏感和可靠指标能够反映肺功能障碍和血气屏障的损害。疾病导致肺损伤时，SP-A通过破坏的肺泡毛细血管膜屏障进入血液循环，成为肺损伤的血清标志物。血清SP-A与肺损伤的程度密切相关。SP-A在血清的浓度越高，肺损伤程度越重。血液循环SP-A水平的检测可以判断患者肺损伤程度, 预测疾病的结果。目前， SP-A主要的检测方法是放射免疫分析（RIA）测定的方法， 酶联免疫吸附(ELISA)， 化学发光法和单个或多个斑点免疫印迹方法，这些方法存在制备周期过长，抗体高成本，容易失活等缺点。
液晶（Liquid crystal ,LC）兼有液体的流动性及固体的光、电、磁等各向异性等特点。处于向列型液晶态的液晶分子具有长程取向序而无位置序，这一独特的分子排列方式导致表面微小的地貌或化学结构变化即可引起取向变化，同时此取向变化能传播至数十微米的液晶体中，因此液晶具有很强的光学信号放大作用。液晶生物传感器的检测原理是建立在液晶具有双折射特性基础上，根据传感界面接触目标物前后，液晶分子在基底表面的取向排列发生变化，改变对光线的折射能力，导致光学图像信号的颜色和亮度发生变化，实现对目标分子的检测。由于液晶传感器具有响应快、无需标记、无需复杂和昂贵的读取装置和可肉眼直接检测等优点，同时利用核酸适配体的液晶传感器用于肺表面活性蛋白A的检测尚鲜见报道。
核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的一段单链DNA或RNA分子，可以特异性结合目标分子。由于具有选择性高、易合成、易修饰和相对稳定的优点，目前在检测蛋白质、金属离子、有机小分子等领域中应用广泛。本发明首次将基于核酸适配体的液晶生物传感器用于检测肺表面活性蛋白A。与此同时,我们也建立一个新型敏感的核酸适配体液晶生物分子分析的平台。
发明内容
本发明的第一目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述的液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体。该液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体，该液晶生物传感器具有低成本、操作简单、可肉眼观测、灵敏度高等优点，可以快速的结合目标分子，达到快速准确检测SP-A的目的。
一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述肺表面活性蛋白A核酸适配体的序列为5'-NH2-(CH2)6-TGTACGCCTACTGTGTGT-3' ，且在5'端修饰了氨基。
本发明的第二目的是提供一种核酸适配体液晶传感器的制备方法和检测方法。
本发明所述的检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器的制备方法和检测方法，包括以下步骤：
步骤一：玻片的清洗与处理
玻片处理用以去除玻璃表面的灰尘和有机物，同时使表面羟基化,将载玻片切割成尺寸为2 cm×2 cm后放入大烧杯中，往烧杯中倒入浓H2SO4，再倒入双氧水溶液，其中浓H2SO4和双氧水体积比为7:3，将烧杯置于80 ℃水浴锅中温育1小时，取出后用无水乙醇和去离子水依次清洗5至6次，氮气吹干置于110 ℃烘箱中干燥2-3小时，防尘保存；
步骤二：传感器基底的组装：
上玻片：上玻片用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(简称DMOAP)水溶液组装
将处理的玻片浸入含体积比为0.35% DMOAP的水溶液中，常温下静置反应30min，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时。
下玻片：下玻片用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(简称DMOAP)和氨丙基三乙氧基硅烷(简称APTES)混合溶液组装
将处理的玻片浸入含体积比为3% APTES和体积比为0.3% DMOAP的无水乙醇溶液中，80℃水浴加热2小时，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时，备用。
下玻片进行戊二醛（简称GA）组装
将用DMOAP和APTES修饰后的下玻片浸入体积分数为2%的GA水溶液中常温下浸泡1h，使玻片表面醛基化，取出用大量去离子水冲洗，氮气吹干，作为下玻片防尘备用。
步骤三：清洗溶液的制备和核酸适配体缓冲溶液的制备
核酸适配体缓冲溶液的制备：配制含有10m mol·L-1的NaCl和10m mol·L-1的MgCl2的pH=7.4的Tris-HCl溶液作为用于稀释核酸适配体的缓冲溶液。
清洗溶液的制备：配制含有体积比为0.01%SDS的2×SSC溶液，用NaOH定容至pH=7.0。
步骤四：肺表面活性蛋白A核酸适配体的固定
将200 μL的100nml·L-1的核酸适配体（Aptamer）溶液滴加到步骤二中的下玻片上，37℃反应2h，用含有步骤三中的清洗溶液和超纯水冲洗，去除多余的核酸适配体分子，然后用氮气吹干。然后再用80mmol·L-1的甘氨酸溶液室温（25度左右）下封闭玻片上未反应的醛基1h，用超纯水冲洗，氮气吹干，以去除传感器的非特异性干扰。
步骤五：基于核酸适配体的液晶传感器的制作
首先用移液枪吸取200μL不同梯度浓度的SP-A溶液（由0.01mol·L-1的PBS溶液配制）滴到载玻片上与步骤四中已经修饰在玻片上的肺表面活性蛋白A的核酸适配体在室温下反应1h,然后分别用pH=7的0.01mol·L-1的PBS溶液和大量的超纯水冲洗,小流量氮气吹干。随后,液晶5CB被加热到各向同性的液态（约40℃），然后装配进步骤二中由DMOAP修饰的上玻片和SP-A修饰的下玻片，中间放置用于控制液晶厚度的干净的铜载网（20μm，150目）于液晶盒中,液晶充满整个铜载网，液晶盒冷却至室温（约28℃），然后用三个小长尾夹夹在一起制成液晶盒。
步骤六：样品检测
将步骤五中检测样品的液晶盒置于偏光显微镜(XP-201POL,上海长方，中国)下，通过安装在显微镜筒上的数码相机获取图像(佳能A640，日本)。液晶盒图见说明书附图1和说明书附图2。
本发明的检测原理是，检测方法的原理图见说明书附图3。在预处理后的玻片上固定DMOAP/APTES/GA，DMOAP是长链状富含烷基的分子，能有效诱导液晶垂直排列，GA活化APTES，提供醛基以固定核酸适配体，作为下玻片（见说明书附图3A）。下玻片与DMOAP组装的上玻片制作成液晶盒，注入液晶，液晶在DMOAP和核酸适配体的诱导下垂直有序排列（见说明书附图3F），此时利用偏光显微镜观察不到任何光透过，偏光显微镜下呈现均一的黑色（见说明书附图3G）。肺表面活性蛋白A能与其核酸适配体（Aptamer）形成类似双链DNA的结构（见说明书附图3B），基底表面地貌变化，周围液晶的垂直排列被扰乱（见说明书附图3C）。垂直取向的液晶分子与分子之间依靠微弱的范德瓦尔斯作用力维系，且具有多米洛骨牌效应，一旦有一定数量的液晶分子取向变化，能导致周围数十微米空间的分子取向发生变化，呈现水平或倾斜的排列，表现出双折射性质，这时利用偏光显微镜观察能看到双折射纹理（见说明书附图3D）。
本发明具有如下有益效果：本发明公开了一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，利用液晶的双折射特性配合核酸适配体能与SP-A进行特异性结合，从而快速高效的对肺表面活性蛋白A进行检测。
附图说明
图1为液晶盒俯视图。
图2为液晶盒主视图。
图3为液晶传感器的制作以及检测肺表面活性蛋白A的原理图。
图4为APTES/DMOAP混合组装的液晶的光学信号图。
图5为SP-A Aptamer液晶光学信号图。
图6为液晶传感器对肺表面活性蛋白A检测的液晶光学信号图。
图7为液晶传感器对不同物质检测的液晶光学信号图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例一
下玻片APTES/DMOAP最佳比例的确定
为了保证液晶的垂直均一取向，同时为了保证传感器尽可能高的灵敏度，先后考察了APTES/DMOAP混合比例对液晶取向的影响，检测结果详见说明书附图4。当APTES/DMOAP体积比为5：1时，图像呈现均一的黑色（见说明书附图4a），当APTES/DMOAP体积比提高至10：1时，图像仍然呈现均一的黑色（见说明书附图4b），当二者的体积比继续提高到15：1时，图像中开始出现施列仑纹理（见说明书附图4c），当体积比进一步提高到20：1时，图像出现明显的施列仑纹理（见说明书附图4d），为了保证后续能固定尽可能多的核酸适配体，又能获得垂直均一的图像，选择APTES/DMOAP的体积比为10：1。
实施例二
玻片表面修饰核酸适配体（Aptamer）的最佳浓度
将修饰了氨基的核酸适配体固定于醛基化的玻片表面，可以预见Aptamer的浓度会影响液晶分子的取向，(具体见说明书附图5） SP-A Aptamer液晶光学信号图)因此，需要进一步确定固定于玻片表面的合适的Aptamer的浓度，当Aptamer浓度较高时（500 nmol·L-1、300 nmol·L-1、200 nmol·L-1）时，由于固定于玻片表面的Aptamer的数量过多，对液晶分子取向影响比较大，导致图像中出现了大片的彩色和明亮区域（见说明书附图5a，b，c），为了保证后续的检测不受影响，需要降低Aptamer的浓度。当Aptamer浓度降至150 nmol·L-1时，图像中仍然有少量的光斑（见说明书附图5d）。当浓度继续降至100 nmol·L-1时，光学图像呈现为均一的黑色（见说明书附图5e），当然继续降低Aptamer的浓度至50 nmol·L-1时，图像仍然是均一的黑色（见说明书附图5f）。但是，为了保证尽可能多的Aptamer固定于玻片的表面以提高后续检测的灵敏度，本实验选取Aptamer的浓度为100 nmol·L-1。
实施例三
传感器灵敏度的考察
将不同浓度的肺表面活性蛋白A（SP-A）溶液滴加在固定了核酸适配体的下玻片上，处理后与DMOAP修饰的上玻片面对面组装成液晶盒，在正交偏光显微镜下观察，观察结果详见说明书附图6。肺表面活性蛋白A的浓度越高，与Aptamer结合的就越多，因此对液晶分子的垂直取向破坏就越大，图像中的彩色明亮区域以及施列仑纹理就越明显，当肺表面活性蛋白A的浓度为200nmol·L-1时，偏光显微镜下看到彩色织构光学图像（见说明书附图6a）；当肺表面活性蛋白A的浓度降为100 nmol·L-1, 20 nmol·L-1和10 nmol·L-1时，偏光显微镜下仍然可以看到彩色织构光学图像（见说明书附图6b，c，d），这是由于结合在传感器基底表面的肺表面活性蛋白A密度较大，对液晶分子垂直取向的破坏仍然较大，双折射现象明显；当SP-A浓度低至5 nmol·L-1时，仍然有明显的光学信号响应（见说明书附图6e）；当SP-A浓度低至0 nmol·L-1时，没有明显的光学信号响应（见说明书附图6f），因此，此方法检测肺表面活性蛋白A的灵敏度低至5nmol·L-1。
实施例四
传感器特异性考察
为了检验液晶传感器的选择性，分别考察了液晶对与肺表面活性蛋白A有类似结构的牛血红蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白的偏光信号变化（浓度均为100 nmol·L-1，由0.01mol·L-1的PBS溶液配制）。检查结果详见说明书附图7。肺表面活性蛋白A的光学图像呈现明显的彩色织构区域（见说明书附图7d），而对照组中的牛血红蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白的光学图像中除有少数亮斑外，其他部分仍为黑色图像（见说明书附图7a，b，c）。实验表明，基于核酸适配体的液晶传感器对肺表面活性蛋白A的检测具有良好的选择性。

Claims (3)

1.一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述的液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述肺表面活性蛋白A核酸适配体的序列为5'-NH2-(CH2)6-TGTACGCCTACTGTGTGT-3' ，且在5'端修饰了氨基。
3.一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器的制备及检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一：玻片的清洗与处理
玻片处理用以去除玻璃表面的灰尘和有机物，同时使表面羟基化,将载玻片切割成尺寸为2 cm×2 cm后放入大烧杯中，往烧杯中倒入浓H2SO4，再倒入双氧水溶液，其中浓H2SO4和双氧水体积比为7:3，将烧杯置于80 ℃水浴锅中温育1小时，取出后用无水乙醇和去离子水依次清洗5至6次，氮气吹干置于110 ℃烘箱中干燥2-3小时，防尘保存；
步骤二：传感器基底的组装
上玻片：上玻片用DMOAP水溶液组装
将处理的玻片浸入含体积比为0.35% DMOAP的水溶液中，常温下静置反应30min，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时；
下玻片：下玻片用DMOAP和APTES混合溶液组装
将处理的玻片浸入含体积比为3% APTES和体积比为0.3% DMOAP的无水乙醇溶液中，80℃水浴加热2小时，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时，备用；
下玻片进行GA组装
将用DMOAP和APTES修饰后的下玻片浸入体积分数为2%的GA水溶液中常温下浸泡1h，使玻片表面醛基化，取出用大量去离子水冲洗，氮气吹干，作为下玻片防尘备用；
步骤三：清洗溶液的制备和核酸适配体缓冲溶液的制备
核酸适配体缓冲溶液的制备：配制含有10m mol·L-1的NaCl和10m mol·L-1的MgCl2的pH=7.4的Tris-HCl溶液作为用于稀释核酸适配体的缓冲溶液；
清洗溶液的制备：配制含有体积比为0.01%SDS的2×SSC溶液，用NaOH定容至pH=7.0；
步骤四：肺表面活性蛋白A核酸适配体的固定
将200 μL的100nmol·L-1的核酸适配体Aptamer溶液滴加到步骤二中的下玻片上，37℃反应2h，用含有步骤三中的清洗溶液和超纯水冲洗，去除多余的核酸适配体分子，然后用氮气吹干，然后再用80mmol·L-1的甘氨酸溶液室温下封闭玻片上未反应的醛基1h，用超纯水冲洗，氮气吹干，以去除传感器的非特异性干扰；
步骤五：基于核酸适配体的液晶传感器的制作
首先用移液枪吸取200μL 不同梯度浓度的SP-A溶液滴到载玻片上与步骤四中已经修饰在玻片上的肺表面活性蛋白A的核酸适配体在室温下反应1h,然后分别用pH=7的0.01mol·L-1的PBS溶液和大量的超纯水冲洗,小流量氮气吹干，随后,液晶5CB被加热到各向同性的液态，然后装配进步骤二中由DMOAP修饰的上玻片和SP-A修饰的下玻片，中间放置用于控制液晶厚度的干净的铜载网于液晶盒中,液晶充满整个铜载网，液晶盒冷却至室温，然后用三个小长尾夹夹在一起制成液晶盒；
步骤六：样品检测
将步骤五中检测样品的液晶盒置于偏光显微镜下，通过安装在显微镜筒上的数码相机获取图像。
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