CN103243102A

CN103243102A - 一种肺表面活性物质相关蛋白a适配子及其筛选方法

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Publication number: CN103243102A
Application number: CN2013101871804A
Authority: CN
Inventors: 张娟琨; 刘利娟; 陈怡�
Original assignee: TIANJIN QIANFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN QIANFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103243102B

Abstract

本发明涉及一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为：SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。本发明以SP-A蛋白为靶分子，利用指数富集配基系统进化法技术从随机ssDNA文库筛选SP-A特异结合的寡核苷酸适配子，并对所筛选出的适配子结构进行了初步分析，为进一步筛选以寡核苷酸适配子为基础的肺疾病治疗药物奠定基础。

Description

一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。

背景技术

肺表面活性物质相关蛋白A(Surfactant Protein A，SP-A)是一种多功能糖蛋白，在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有十分重要作用。SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞中合成，在肺外表达量很少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。其表达水平的高低与临床某些肺部疾病直接相关，是某些肺部疾病的特异性诊断和判断预后的指标。很多肺部疾病在早期依据临床表现、X线征象以及一些创伤性检查，难以做到早期诊断并评价肺泡一毛细血管屏障损伤程度。近年来很多实验表明，血清SP-A是反映肺功能障碍和血气屏障损伤敏感而可靠的指标。当疾病导致肺部损伤后，肺内SP-A可通过损伤的肺泡－毛细血管膜屏障进入血液循环而成为肺损伤的血清标志物。血清中SP-A的量和肺损伤程度密切相关，肺部损伤越重血清中SP-A浓度就越高，检测患者血循环中SP-A水平可以判断肺损伤程度，预测疾病转归情况。但是目前检测SP-A的方法都较为繁琐。

指数式富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术是一种新的组合化学技术，应用大容量的随机寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经几轮或数轮的筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。在实验诊断和临床治疗的分子识别领域，它提供了一个比抗体更快速、灵敏的技术手段。目前，该技术已成功应用于许多靶物质的筛选，包括蛋白、小分子、金属离子，甚至病毒、细菌、细胞等一些复杂靶标，部分核酸适配子已进入临床试验阶段。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与SP-A结合率高、特异性强的肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。

本发明实现目的的技术方案是：

一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为：

SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。

而且，其二级结构为：

或，

或，

如上所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，步骤如下：

⑴SELEX筛选：SP-A蛋白包被于96孔酶联板上，包被液为pH9.6，0.05mol/L NaHCO₃100uL，于4℃过夜，同时设空白对照孔；SP-A蛋白包被孔和空白对照孔均以质量分数3%的BSA200uL37℃封闭2h；取1000pmol随机ssDNA与100uL结合缓冲液与经3%BSA封闭的空白对照孔37℃结合45min，反筛去除与BSA结合的ssDNA，转移到SP-A蛋白包被孔与SP-A蛋白37℃结合45min；然后用200uL冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA；再加200uL洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与SP-A蛋白结合的ssDNA，取200uL酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20×TE缓冲液中；

⑵PCR优化：

PCR反应体系为：

PCR反应条件：A.94℃，3min；B.94℃，45s，55℃，30s；72℃，40s；共12个循环；C.72℃，7min；

⑶适配子亲和力及特异性检测：将带有SP-A适配子序列的克隆质粒进行PCR扩增，切胶回收，纯化PCR产物，将5ug SP-A蛋白包被于96孔板上，37℃孵育2h，取10ug纯化物与400uL结合缓冲液混合，加入到蛋白孔中结合30min，然后用洗脱缓冲液洗去未结合ssDNA，再加入50uL洗脱缓冲液，80℃孵育10min，洗脱下与蛋白结合的ssDNA，测定其含量，分析各适配子的亲和力；根据适配子亲和力测定结果，筛选出亲和力高的几个适配子按上述过程将各适配子分别与SP-A及BSA进行结合反应，通过适配子对两种蛋白亲和力的不同判断其特异性；

⑷克隆与测序及适配子结构分析：经9轮筛选得到的ssDNA，经PCR扩增成dsDNA，回收纯化后连PuC18载体，经蓝白斑筛选，挑选亲和力及特异性高的3个克隆进行序列测定，使用DNAMAN软件分析，即得肺表面活性物质相关蛋白A适配子。

而且，所述步骤⑴中结合缓冲液为SHCMK液：20mmol/L Hepes pH7.35，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂。

而且，所述步骤⑴中冲洗缓冲液为SHCMK液与质量分数为0.05%的Tween20的混合液，V_SHCMK:V_Tween20为20:1。

而且，所述步骤⑴中洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-Hcl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/LDTT，pH8.3。

而且，所述步骤⑴中酚：氯仿的体积比为1:1。

而且，所述步骤⑶中克隆质粒的制备方法为：将第9轮筛选SP-A适配子进行扩增，产物纯化后与PuC18载体分别进行双酶切，再将两者的双酶切产物在16℃条件下过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌中，即得。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明本发明以SP-A蛋白为靶分子，利用指数富集配基系统进化法技术从随机ssDNA文库筛选SP-A特异结合的寡核苷酸适配子，并对所筛选出的适配子结构进行了初步分析，为进一步筛选以寡核苷酸适配子为基础的肺疾病治疗药物奠定基础。

2、本发明筛选方法筛选出的SP-A适配子可在体外合成，稳定性好，易存储，易修饰，在实验诊断和临床治疗的分子识别领域，它提供了一个比抗体更快速、灵敏的技术手段。

附图说明

图1为本发明第9轮筛选产物的PCR扩增结果图；其中，M：DNA Maker；1：PCR扩增产物；

图2为本发明不同加入量SP-A蛋白与适配子的结合率图；

图3为本发明不同循环次数的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：DNA Maker；1-8;5、8、12、16、20、24、28、32个循环时的PCR产物；

图4为本发明不同温度梯度的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：DNA Maker；1-5：退火温度为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时的PCR扩增产物。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂如无特殊说明，均为市售产品。

随机ssDNA文库序列（SEQ ID No:4）：5’-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA(N19)GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG-3’，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列。上游引物（SEQ ID No:5）：5’-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA-3’；下游引物（SEQ ID No:6）：5’-CGG AAG CTT GCT CTC AAA CTT TTT CTT GCG GC-3’，

一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为：

AP-1为：5’-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA GGA CAG GTT CAA TGG AAC GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG-3’（SEQ ID No:1）；

或，AP-2为：5’-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA TGT ACG CCT ACT GTG TGT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG-3’（SEQ ID No:2）；

或，AP-3为：5’-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA TAC AGT CCA AAG TGC TCT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG-3’（SEQ ID No:3）。

上述适配子具体的二级结构如下所示：

AP-1为：

AP-2为：

AP-3为：

一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，步骤如下：

⑴SELEX筛选：SP-A蛋白包被于96孔酶联板上，包被液为pH9.6，0.05mol/L NaHCO₃100uL，于4℃过夜，同时设空白对照孔。SP-A蛋白包被孔和空白对照孔均以质量分数3%的BSA 200uL 37℃封闭2h。取1000pmol随机ssDNA与100uL结合缓冲液(结合缓冲液为SHCMK液：20mmol/L Hepes pH 7.35，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂)与经3%BSA封闭的空白对照孔37℃结合45min，去除与BSA结合的ssDNA，转移到SP-A蛋白包被孔与SP-A蛋白37℃结合45min；然后用冲洗缓冲液(SHCMK液+质量分数为0.05%的Tween20，V_SHCMK:V_Tween20=20:1)洗6次，洗去未结合的ssDNA；再加200uL洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-Hcl，4mol/L 异硫氰酸胍，1mmol/L DTT，pH8.3）于80℃作用10min，洗脱下与SP-A蛋白结合的ssDNA，经酚：氯仿（V酚:V氯仿=1:1）抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20×TE缓冲液中。

⑵PCR优化：SELEX筛选过程中制备下一轮文库时涉及到对称PCR及不对称PCR扩增，为了保证文库的特异性及足够量，必须进行PCR优化。在本发明中，主要对其最佳退火温度及循环次数进行优化。PCR反应条件：A.94℃，3min；B.94℃，45s，X℃，30s；72℃，40s；共Y个循环；C.72℃，7min。X为退火温度梯度，分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。Y为PCR循环次数，分别为5、8、12、16、20、24、28、32。

PCR反应体系见表1：

表1PCR反应体系

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取10uL PCR产物与2uL6×上样缓冲液混匀加入凝胶孔中，接通电泳仪，电压设定为5V/cm，电泳45min.小心取出凝胶，于EB中浸泡15min，照胶，分析结果，根据结果确定最佳条件。

以第9轮筛选产物为模板进行PCR扩增,产物经2%琼脂糖凝胶电泳,结果如图1所示,扩增产物单一,满足克隆要求,切下目的条带,回收纯化.得到克隆用的目的DNA片段。

⑶适配子亲和力及特异性检测：将克隆质粒（第9轮筛选产物（即SP-A适配子）进行扩增，产物纯化后与PuC18载体分别进行双酶切（PCR纯化产物酶切体系见表2，pUC18载体酶切体系见表3），再将两者的双酶切产物在16℃条件下过夜连接（载体与纯化产物连接体系见表4），将连接产物转入大肠杆菌中）进行PCR扩增（PCR反应条件：A.94℃，3min；B.94℃，45s，55℃，30s；72℃，40s；共24个循环；C.72℃，7min；），切胶回收，纯化PCR产物。将5ug SP-A蛋白包被于96孔板上，37℃孵育2h。取10ug纯化物与400uL结合缓冲液混合，加入到蛋白孔中结合30min。然后用洗脱缓冲液洗去未结合ssDNA，再加入50uL洗脱缓冲液，80℃孵育10min，洗脱下与蛋白结合的ssDNA，测定其含量，分析各适配子的亲和力。根据适配子亲和力测定结果，筛选出亲和力高的几个适配子按上述过程将各适配子分别与SP-A及BSA进行结合反应，通过适配子对两种蛋白亲和力的不同判断其特异性。

表2PCR纯化产物酶切体系

Figure 2013101871804100002DEST_PATH_IMAGE001

Figure 2013101871804100002DEST_PATH_IMAGE002

表3pUC18载体酶切体系

表4载体与纯化产物连接体系

⑷克隆与测序及适配子结构分析：经9轮筛选得到的ssDNA，经PCR扩增成dsDNA，回收纯化后连PuC18载体，经蓝白斑筛选，挑选亲和力及特异性高的3个克隆进行序列测定，使DNAMAN软件分析。

3.结果与讨论

SP-A蛋白特异结合寡核苷酸适配子的SELEX筛选：

每一轮筛选用的ssDNA与SP-A蛋白的用量直接关系到筛选是否成功。最初几轮筛选时，为了获得与SP-A蛋白特异性结合的ssDNA，ssDNA与SP-A蛋白用量要大。后续的筛选是为了把已经筛选出的特异性更高、亲和力更强的筛选出来，ssDNA与SP-A蛋白用量减少，但ssDNA/SP-A要提高，使亲和力更强ssDNA竞争到SP-A蛋白上的结合靶点，筛去亲和力相对较弱的ssDNA，以获得特异性更高、亲和力更强的适配子。各轮筛选所加的SP-A蛋白， ssDNA量具体见表5。

表5各轮筛选的ssDNA及SP-A蛋白用量

SELEX筛选共进行了9轮，为了获得与SP-A蛋白特异性结合的适配子，第一轮筛选投入较大量的ssDNA文库及SP-A蛋白，其后几轮降低用量以增加筛选压力；我们将每轮筛选的产物纯化后，测定其洗脱下的ssDNA浓度，即为结合到SP-A蛋白上的ssDNA的含量，与投入量相比，得到适配子与SP-A蛋白的结合率，结果如图2所示。第一轮适配子的结合率为1.3%，随着筛选轮次的增加，结合率逐渐升高，第5轮明显提高到21.17%，第9轮时达到峰值33%，其中8、9轮适配子结合率没有明显变化，说明达到峰值平台期，筛选次数不必再增加。从而筛选出与SP-A蛋白具有较高亲和力及特异性的适配子。

PCR扩增条件优化：

随机ssDNA文库的PCR扩增条件与常规PCR扩增条件有所不同，循环次数的选择将直接影响目的DNA的纯度和产量。当退火温度设定为55℃时，分别进行5、8、12、16、20、24、28、32个循环的PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果发现经12个循环扩增可以得到相对特异的目的片段，但从16个循环起非特异性扩增产物增加(图3)。实验还发现，降低模板ssDNA的用量，经过20个循环扩增仍然可得到较高纯度的目的dsNDA片段。因此每一轮的筛选过程都必须控制从ssDNA扩增为dsDNA的PCR循环数。

根据上述优化结果，将循环次数设为12个循环时，退火温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时扩增结果如图4所示。结果发现在45—65℃之间的5个退火温度对PCR产物影响不大，均能得到较好的PCR产物。随着退火温度的增高，PCR产物并没有明显减少，非特异性产物也没有增加。因此，我们选择55℃为最佳退火温度.在后续实验过程中，根据实验实际结果必要时再调整PCR反应条件参数。

克隆与测序及适配子结构分析：

将筛选出的3个高亲和力，高特异性适配子(AP-1，AP-2，AP-3)进行测序分析，其序列长度与预期值一致，均为81bp随机序列长度为19bp。其中AP-2缺少一个碱基随机序列，见表6。

表6适配子随机序列

根据DNA自由能最低能量值的法则，用DNAMAN软件模拟适配子的理论二级结构，结果如下式：

AP-1

AP-2

AP-3

如式所示，适配子的二级结构主要以茎环结构为主。AP-1，AP-2，AP-3适配子的最低自由能量值分别为-19.00kcal/mol，0.00kcal/mol，-22.90kcal/mol。自由能是热力学常数，它指进行一个反应所需要的能量，形成碱基对时必须释放能量才能使其结构稳定存在。所以，结构的稳定性是由形成时所释放能量的大小决定的。结构形成时放出的能量越多，要拆开它时就需要给予更多的能量，其稳定性越高。AP-3适配子二级结构的自由能最低为-22.90kcal/mol，确定了其能高特异性结合SP-A蛋白。

Claims

1.一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于：其基因序列为：

SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。

2.根据权利要求1所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于：其二级结构为：

或，

或，

3.一种如权利要求1或2所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，其特征在于：步骤如下：

⑵PCR优化：

PCR反应体系为：

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中结合缓冲液为SHCMK液：20mmol/L Hepes pH7.35，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂，1mmol/LCaCl₂。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中冲洗缓冲液为SHCMK液与质量分数为0.05%的Tween20的混合液，V_SHCMK:V_Tween20为20:1。

6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中洗脱缓冲液为：20mmol/LTris-Hcl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/L DTT，pH8.3。

7.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中酚：氯仿的体积比为1:1。

8.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑶中克隆质粒的制备方法为：将第9轮筛选SP-A适配子进行扩增，产物纯化后与PuC18载体分别进行双酶切，再将两者的双酶切产物在16℃条件下过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌中，即得。