CN114235714A - 一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了本申请公开了一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,包括如下步骤:S1、制备若干个液晶核酸传感器;S2、确定检测所需的表面活性剂溶液的特定体积分数;S3、向核酸适配体溶液中加入待测核酸溶液,并加入步骤S2中得出的特定体积分数的表面活性剂溶液,得到待测液;S4、将待测液加入液晶核酸传感器中,观察光学图像,记录检测结果。本发明可以解决目前“三步法”检测过程中面临的检测时间长,光学图像不稳定的问题,可以实现瞬时检测,且具有检测速率快、稳定性好、灵敏度高、普适性强的优势。
Description
技术领域
本发明涉及传感器技术领域,特别涉及一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法。
背景技术
液晶核酸传感器的主要原理是利用液晶分子-表面活性剂-核酸适配体-待测核酸四者相互作用影响液晶分子排布,进而影响其在偏光显微镜下的光学图像。当检测到待测核酸时,待测核酸和核酸适配体以氢键相互作用连接,表面活性剂游离并驱动液晶分子呈垂直排布;当未检测到待测核酸时,核酸适配体与表面活性剂以静电相互作用连接,液晶分子呈混乱排布。
现有的液晶核酸传感器采用“三步法”的方法进行核酸检测。其步骤包括:1)添加表面活性剂,表面活性剂驱动液晶排布;2)添加核酸适配体溶液,核酸适配体通过静电相互作用与表面活性剂结合,打乱液晶排布;3)添加待测物溶液,待测物通过氢键相互作用与表面活性剂竞争结合核酸适配体,驱动液晶排布。该三步法中,静电相互作用和氢键相互作用的竞争耗时较长,一方面降低了液晶核酸传感器的检测效率,另一方面由于液相挥发改变了传感器的光学图像,影响了其稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,以克服现有技术中的不足。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本申请公开了一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1、制备若干个液晶核酸传感器;
S2、确定检测所需的表面活性剂溶液的体积分数;
S3、向核酸适配体溶液中加入待测核酸溶液,并加入步骤S2中确定的体积分数的表面活性剂溶液,得到待测液;
S4、取一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为检测传感器,将待测液加入检测传感器中,观察光学图像,记录检测结果。
作为优选,所述步骤S1具体包括如下子步骤:
S11、将玻璃片基底置于取向剂溶液中浸泡,进行取向层修饰,取出玻璃片基底,用乙醇冲洗并且烘干,得到取向层修饰后的玻璃片;
S12、在取向层修饰后的玻璃片表面放置微栅网膜;
S13、向微栅网膜中灌注液晶,并在加热条件下静置,得到液晶核酸传感器。
作为优选,所述步骤S2具体包括如下子步骤:
S21、取另一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为预备传感器,将表面活性剂溶液加入预备传感器,直到预备传感器的光学图像变为暗场;记录加入表面活性剂溶液的体积;
S22、将核酸适配体溶液逐滴加入步骤S21中的预备传感器,直至预备传感器的光学图像变为亮场;记录加入核酸适配体溶液的体积;
S23、将步骤S21中加入表面活性剂溶液的体积与步骤S22中加入核酸适配体溶液的体积的比值记为所需表面活性剂溶液的体积分数。
作为优选,所述步骤S11取向剂溶液为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液,或十八烷基三氯硅烷的正庚烷溶液中的任意一种,所述取向剂溶液中,溶质的重量百分比可为1.0~2.5wt%。
作为优选,所述步骤S11中的浸泡温度为40℃~80℃,浸泡时间为大于等于30min。
作为优选,所述步骤S12中,微栅网膜可为铜网,镍网,金网,不锈钢网中的任意一种。
作为优选,所述步骤S13中的液晶可为单体液晶或混合液晶中的任意一种。
作为优选,所述步骤S13中加热条件为加热温度大于液晶分子的各向同性转变温度,所述静置时间为大于等于15min。
作为优选,所述核酸适配体为待测核酸的互补核酸单链,所述待测核酸为任意寡核苷酸单链。
作为优选,所述待测核酸溶液的体积分数为1%~10%。
本发明的有益效果:
本发明一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,若待测核酸溶液中不含待测核酸,则待测液中核酸适配体和表面活性剂以静电相互作用结合,液晶分子缺少取向力,呈混乱排布,导致液晶传感器在偏光显微镜下可以通过双折射产生亮场;反之,若待测核酸溶液中含有待测核酸,则待测液中核酸适配体与待测核酸以氢键相互作用结合,表面活性剂游离并排布在液晶相界面,使液晶分子垂直排布,导致液晶传感器在偏光显微镜下呈暗场;在传统“三步法”中,存在静电相互作用和氢键相互作用的竞争过程,该过程需要20分钟以上;而本发明提出的“一步法”(步骤S3)通过按特定顺序和比例预混溶液避免了这一过程。因此,本发明可以解决目前“三步法”检测过程中面临的检测时间长,光学图像不稳定的问题,可以实现瞬时检测,且具有检测速率快、稳定性好、灵敏度高、普适性强的优势。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
附图说明
图1为目前“三步法”的检测流程图;
图2为本发明“一步法”的检测流程图;
图3为本发明中液晶传感器表面加入表面活性剂时的示意图;
图4为本发明中液晶传感器表面加入表面活性剂和核酸适配体时的示意图;
图5为本发明方法用于SARS病毒寡核苷酸检测情况下,检测和未检测到待测核酸时的光学图像;
图6为本发明方法中液晶传感器检测到待测核酸时的示意图;
图7为本发明方法用于新冠病毒寡核苷酸检测情况下,检测和未检测到待测核酸时的光学图像;
图8为本发明方法的检测限测试结果;
图9为本发明传感器在初始状态下的光学图像;
图10为本发明方法用于新冠病毒寡核苷酸检测情况下,检测和未检测到待测核酸时的光学图像;
图11为本发明传感器在初始状态下的光学图像;
图12为本发明方法用于SARS病毒寡核苷酸检测情况下,检测和未检测到待测核酸时的光学图像。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面通过附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限制本发明的范围。任何通过更换其它试剂开展的一步法检测均会对本发明专利造成侵权。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:S1、制备若干个液晶核酸传感器;包括2个、3个、4个或其他数量;S2、确定检测所需的表面活性剂溶液的体积分数;S3、向核酸适配体溶液中加入待测核酸溶液,并加入步骤S2中确定的体积分数的表面活性剂溶液,得到待测液;待测核酸溶液的体积分数为1%~10%,核酸适配体为待测核酸的互补核酸单链,所述待测核酸为任意寡核苷酸单链;S4、取一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为检测传感器,将待测液加入检测传感器中,观察光学图像,记录检测结果。
本发明提出的“一步法”即步骤S3,通过按特定顺序和比例预混溶液避免“三步法”中存在静电相互作用和氢键相互作用的竞争过程,节省了大量的时间。
其中,步骤S1具体包括如下子步骤:
S11、将玻璃片基底置于取向剂溶液中浸泡,浸泡温度为40℃~80℃,浸泡时间为大于等于30min,进行取向层修饰,取出玻璃片基底,用乙醇冲洗并且烘干,得到取向层修饰后的玻璃片;取向剂溶液为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液,或十八烷基三氯硅烷的正庚烷溶液中的任意一种,所述取向剂溶液中,溶质的重量百分比可为1.0~2.5wt%;
S12、在取向层修饰后的玻璃片表面放置微栅网膜;微栅网膜可为铜网,镍网,金网,不锈钢网中的任意一种;
S13、向微栅网膜中灌注液晶,液晶可为单体液晶或混合液晶中的任意一种,并在加热条件下静置,加热条件为加热温度大于液晶分子的各向同性转变温度,所述静置时间为大于等于15min,得到液晶核酸传感器。
其中,步骤S2具体包括如下子步骤:
S21、取另一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为预备传感器,将表面活性剂溶液加入预备传感器,直到预备传感器的光学图像变为暗场;记录加入表面活性剂溶液的体积;
S22、将核酸适配体溶液逐滴加入步骤S21中的预备传感器,直至预备传感器的光学图像变为亮场;记录加入核酸适配体溶液的体积;
S23、将步骤S21中加入表面活性剂溶液的体积与步骤S22中加入核酸适配体溶液的体积的比值记为所需表面活性剂溶液的体积分数。
若待测核酸溶液中不含待测核酸,则待测液中核酸适配体和表面活性剂以静电相互作用结合,液晶分子缺少取向力,呈混乱排布,导致液晶传感器在偏光显微镜下可以通过双折射产生亮场;反之,若待测核酸溶液中含有待测核酸,则待测液中核酸适配体与待测核酸以氢键相互作用结合,表面活性剂游离并排布在液晶相界面,使液晶分子垂直排布,导致液晶传感器在偏光显微镜下呈暗场,暗场所对应的亮度是相对于亮场而言的。如果将亮场的平均亮度定义为1,当感兴趣的区域平均亮度低于0.2时,则视为暗场。
实施例1、利用液晶传感器实现SARS病毒寡核苷酸的一步法检测
本实施例中,制备液晶传感器所用的微栅网膜为微栅镍网,所用的液晶为E7液晶。灌注E7液晶后,传感器在90℃下静置20min,以保证E7液晶完全进入微栅镍网的网格。检测过程中,所用表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),核酸适配体为SARS病毒寡核苷酸的互补DNA单链,其序列为5’-GCA TCA CCG GAT GAT-3’,待测核酸为SARS病毒寡核苷酸,其序列为5’-AUC AUC CGG UGA UGC-3’。如图1所示,若采用现有“三步法”进行检测,其检测流程复杂,检测耗时长,光学图像不稳定。因此本实施例使用图2的“一步法”进行检测,具体步骤如下:
步骤一:液晶传感器制备。将玻璃片基底浸泡于1.5wt%的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液溶液中,在60℃下浸泡30min。取出玻璃片,用乙醇冲洗并烘干后,表面放置微栅镍网。随后,利用毛细管向微栅镍网中灌注E7液晶,并在90℃下静置20min,即得到下述一步法核酸检测所需的液晶核酸传感器;
步骤二:确定CTAB的体积分数。将0.1mm的CTAB加入液晶传感器,直至传感器的光学图像变为暗场。如图3所示,此时CTAB分布于液晶-液相界面之间,通过分子间作用力驱动液晶分子垂直排布。随后,进一步向液晶传感器中加入50nm的核酸适配体溶液,直至传感器的光学图像刚好变为亮场。如图4所示,此时核酸适配体通过静电相互作用和CTAB结合,液晶分子表面缺少取向力,呈混乱排布。将此时加入传感器的表面活性剂溶液和核酸适配体溶液体积比记为CTAB体积分数V%。
步骤三:核酸检测。向核酸适配体溶液中加入5%体积分数的待测核酸溶液和V%体积分数的CTAB溶液,得到待测液,并将待测液加入液晶传感器,观察光学图像。如图5所示,若待测核酸溶液中不含新冠病毒寡核苷酸,则传感器中的液晶分子呈混乱排布,光学图像混乱。若待测核酸溶液中含有新冠病毒寡核苷酸,则新冠病毒寡核苷酸和其适配体结合,表面活性剂游离并排布于液晶分子表面,液晶分子垂直排布,此时光学图像均匀。利用该方法检测不同浓度的待测核酸,可以实现3s以内的瞬时检测,检测限为10fM以下。
实施例2、利用液晶传感器实现新冠病毒寡核苷酸的一步法检测
本实施例中,制备液晶传感器所用的微栅网膜为微栅铜网,所用的液晶为E7液晶。灌注E7液晶后,传感器在80℃下静置30min,以保证E7液晶完全进入微栅网格。检测过程中,所用表面活性剂为十二烷基三甲基溴化铵(DTAB),核酸适配体为新冠病毒寡核苷酸的互补DNA单链,其序列为5’-GCA TCT CCT GAT GAG-3’,待测核酸为新冠病毒寡核苷酸,其序列为5’-CUC AUC AGG AGA UGC-3’。若采用现有“三步法”进行检测,其检测流程复杂,检测耗时长,光学图像不稳定。因此本实施例使用“一步法”进行检测,具体步骤如下:
步骤一:液晶传感器制备。将玻璃片基底浸泡于2.0wt%的十八烷基三氯硅烷的正庚烷溶液中,在80℃下浸泡35min。取出玻璃片,用乙醇冲洗并烘干后,表面放置微栅铜网。随后,利用毛细管向微栅镍网中灌注E7液晶,并在80℃下静置30min,即得到下述一步法核酸检测所需的液晶核酸传感器;
步骤二:确定DTAB的体积分数。将0.3mm的DTAB加入液晶传感器,直至传感器的光学图像变为暗场。此时DTAB分布于液晶-液相界面之间,通过分子间作用力驱动液晶分子垂直排布。随后,进一步向液晶传感器中加入100nm的核酸适配体溶液,直至传感器的光学图像刚好变为亮场。此时核酸适配体通过静电相互作用和DTAB结合,液晶分子表面缺少取向力,呈混乱排布。将此时加入传感器的表面活性剂溶液和核酸适配体溶液体积比记为DTAB体积分数V%。
步骤三:核酸检测。向核酸适配体溶液中加入10%体积分数的待测核酸溶液和V%体积分数的DTAB溶液,得到待测液,并将待测液加入液晶传感器,观察光学图像。如图6所示,若待测核酸溶液中含有新冠病毒寡核苷酸,则新冠病毒寡核苷酸和其适配体结合,表面活性剂游离并排布于液晶分子表面,液晶分子垂直排布。此时,传感器的光学图像均匀。若待测核酸溶液中不含新冠病毒寡核苷酸,则传感器中的液晶分子呈混乱排布,光学图像混乱。图7展示了此液晶传感器检测到新冠病毒寡核苷酸前后的光学图像。如图8所示,利用该方法检测不同浓度的待测核酸,可以实现3s以内的瞬时检测,检测限为10fM以下。
实施例3、利用液晶传感器实现新冠病毒寡核苷酸的一步法检测
本实施例中,制备液晶传感器所用的微栅网膜为微栅铜网,所用的液晶为E7液晶。灌注E7液晶后,传感器在80℃下静置30min,以保证E7液晶完全进入微栅网格。检测过程中,所用表面活性剂为十二烷基三甲基溴化铵(DTAB),核酸适配体为新冠病毒寡核苷酸的互补DNA单链,其序列为5’-GCA TCT CCT GAT GAG-3’,待测核酸为新冠病毒寡核苷酸,其序列为5’-CUC AUC AGG AGA UGC-3’。若采用现有“三步法”进行检测,其检测流程复杂,检测耗时长,光学图像不稳定。因此本实施例使用“一步法”进行检测,具体步骤如下:
步骤一:液晶传感器制备。将玻璃片基底浸泡于1.0wt%的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液中,在40℃下浸泡40min。取出玻璃片,用乙醇冲洗并烘干后,表面放置微栅铜网。随后,利用毛细管向微栅镍网中灌注E7液晶,并在80℃下静置30min,即得到下述一步法核酸检测所需的液晶核酸传感器。如图9所示,此时,利用偏光显微镜可以观察到传感器中液晶分子呈垂直排布;
步骤二:确定DTAB的体积分数。将0.3mm的DTAB加入液晶传感器,直至传感器的光学图像变为暗场。此时DTAB分布于液晶-液相界面之间,通过分子间作用力驱动液晶分子垂直排布。随后,进一步向液晶传感器中加入100nm的核酸适配体溶液,直至传感器的光学图像刚好变为亮场。此时核酸适配体通过静电相互作用和DTAB结合,液晶分子表面缺少取向力,呈混乱排布。将此时加入传感器的表面活性剂溶液和核酸适配体溶液体积比记为DTAB体积分数V%。
步骤三:核酸检测。向核酸适配体溶液中加入4%体积分数的待测核酸溶液和V%体积分数的DTAB溶液,得到待测液,并将待测液加入液晶传感器,观察光学图像。如图10所示,若待测核酸溶液中含有新冠病毒寡核苷酸,则新冠病毒寡核苷酸和其适配体结合,表面活性剂游离并排布于液晶分子表面,液晶分子垂直排布。此时,传感器的光学图像均匀。若待测核酸溶液中不含新冠病毒寡核苷酸,则传感器中的液晶分子呈混乱排布,光学图像混乱。利用该方法检测不同浓度的待测核酸,可以实现3s以内的瞬时检测,检测限为10fM以下。
实施例4、利用液晶传感器实现SARS病毒寡核苷酸的一步法检测
本实施例中,制备液晶传感器所用的微栅网膜为微栅铜网,所用的液晶为E7液晶。灌注E7液晶后,传感器在80℃下静置30min,以保证E7液晶完全进入微栅网格。检测过程中,所用表面活性剂为十二烷基三甲基溴化铵(DTAB),核酸适配体为SARS病毒寡核苷酸的互补DNA单链,其序列为5’-GCA TCA CCG GAT GAT-3’,待测核酸为SARS病毒寡核苷酸,其序列为5’-AUC AUC CGG UGA UGC-3’。若采用现有“三步法”进行检测,其检测流程复杂,检测耗时长,光学图像不稳定。因此本实施例使用“一步法”进行检测,具体步骤如下:
步骤一:液晶传感器制备。将玻璃片基底浸泡于2.5wt%的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液中,在80℃下浸泡30min。取出玻璃片,用乙醇冲洗并烘干后,表面放置微栅铜网。随后,利用毛细管向微栅镍网中灌注E7液晶,并在80℃下静置30min,即得到下述一步法核酸检测所需的液晶核酸传感器。如图11所示,此时,利用偏光显微镜可以观察到传感器中液晶分子呈垂直排布;
步骤二:确定DTAB的体积分数。将0.3mm的DTAB加入液晶传感器,直至传感器的光学图像变为暗场。此时DTAB分布于液晶-液相界面之间,通过分子间作用力驱动液晶分子垂直排布。随后,进一步向液晶传感器中加入100nm的核酸适配体溶液,直至传感器的光学图像刚好变为亮场。此时核酸适配体通过静电相互作用和DTAB结合,液晶分子表面缺少取向力,呈混乱排布。将此时加入传感器的表面活性剂溶液和核酸适配体溶液体积比记为DTAB体积分数V%。
步骤三:核酸检测。向核酸适配体溶液中加入2%体积分数的待测核酸溶液和V%体积分数的DTAB溶液,得到待测液,并将待测液加入液晶传感器,观察光学图像。如图12所示,若待测核酸溶液中含有新冠病毒寡核苷酸,则新冠病毒寡核苷酸和其适配体结合,表面活性剂游离并排布于液晶分子表面,液晶分子垂直排布。此时,传感器的光学图像均匀。若待测核酸溶液中不含新冠病毒寡核苷酸,则传感器中的液晶分子呈混乱排布,光学图像混乱。利用该方法检测不同浓度的待测核酸,可以实现3s以内的瞬时检测,检测限为10fM以下。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1、制备若干个液晶核酸传感器;
S2、确定检测所需的表面活性剂溶液的体积分数;
S3、向核酸适配体溶液中加入待测核酸溶液,并加入步骤S2中确定的体积分数的表面活性剂溶液,得到待测液;
S4、取一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为检测传感器,将待测液加入检测传感器中,观察光学图像,记录检测结果。
2.如权利要求1所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于,所述步骤S1具体包括如下子步骤:
S11、将玻璃片基底置于取向剂溶液中浸泡,进行取向层修饰,取出玻璃片基底,用乙醇冲洗并且烘干,得到取向层修饰后的玻璃片;
S12、在取向层修饰后的玻璃片表面放置微栅网膜;
S13、向微栅网膜中灌注液晶,并在加热条件下静置,得到液晶核酸传感器。
3.如权利要求1所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于,所述步骤S2具体包括如下子步骤:
S21、取另一个步骤S1中制备的液晶核酸传感器作为预备传感器,将表面活性剂溶液加入预备传感器,直到预备传感器的光学图像变为暗场;记录加入表面活性剂溶液的体积;
S22、将核酸适配体溶液逐滴加入步骤S21中的预备传感器,直至预备传感器的光学图像变为亮场;记录加入核酸适配体溶液的体积;
S23、将步骤S21中加入表面活性剂溶液的体积与步骤S22中加入核酸适配体溶液的体积的比值记为所需表面活性剂溶液的体积分数。
4.如权利要求2所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述步骤S11取向剂溶液为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的水溶液,或十八烷基三氯硅烷的正庚烷溶液中的任意一种,所述取向剂溶液中,溶质的重量百分比可为1.0~2.5wt%。
5.如权利要求2所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述步骤S11中的浸泡温度为40℃~80℃,浸泡时间为大于等于30min。
6.如权利要求2所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述步骤S12中,微栅网膜可为铜网,镍网,金网,不锈钢网中的任意一种。
7.如权利要求2所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述步骤S13中的液晶可为单体液晶或混合液晶中的任意一种。
8.如权利要求2所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述步骤S13中加热条件为加热温度大于液晶分子的各向同性转变温度,所述静置时间为大于等于15min。
9.如权利要求1所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述核酸适配体为待测核酸的互补核酸单链,所述待测核酸为任意寡核苷酸单链。
10.如权利要求1所述的一种用液晶传感器实现一步法核酸检测的方法,其特征在于:所述待测核酸溶液的体积分数为1%~10%。
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CN114235714B (zh) | 2022-05-27 |
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