CN113406011A

CN113406011A - 一种液晶型适配体生物传感器及其制备方法和在检测前列腺特异性抗原中的应用

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Publication number: CN113406011A
Application number: CN202110573073.XA
Authority: CN
Inventors: 金丽虹; 潘兴隆; 吕九宫; 牟晓雨; 张翔宇; 李晶怡; 申炳俊; 夏冰; 高妍
Original assignee: Changchun University of Science and Technology
Current assignee: Changchun University of Science and Technology
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明涉及一种液晶型适配体生物传感器及其制备方法和在检测前列腺特异性抗原中的应用，所述生物传感器包括依次排列的经一定步骤处理的上玻片、铜载网和下玻片。本发明为快速检测前列腺特异性抗原(PSA)提供了一种新的方法，PSA液晶型适配体传感器具有特异性好、线性范围宽、灵敏度高、无需标记和检测方便快捷等优点，利于广泛应用。

Description

一种液晶型适配体生物传感器及其制备方法和在检测前列腺特异性抗原中的应用

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，具体地，涉及一种宽线性范围、低检出限的前列腺特异性抗原液晶型适配体生物传感器及其制备方法和定量检测应用。

背景技术

前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)是一种由雄性激素调节的分子量约为33kDa的丝氨酸蛋白酶，这种酶是激肽释放酶家族的一员，产生于前列腺腺体和导管的上皮细胞。作为第一个被美国FDA批准的肿瘤标志物，PSA被广泛应用于前列腺癌患者筛查及诊断中，其对前列腺癌敏感度高达90％以上。健康的前列腺分泌到人体循环系统中的PSA浓度一般低于4.0ng/mL， 4.0ng/mL是国际通用评估前列腺癌的浓度阈值。对于前列腺切除患者，则需以更低的血清PSA浓度进行分析，若术后PSA高于0.1ng/mL则表明存在癌症复发的风险。由于血清样本检测前往往需要进行稀释，这直接导致PSA实际检测浓度远低于该数值。因此，血清PSA检测方法的高灵敏度、特异性和低检测限，对前列腺癌的筛查、诊断及预后评估至关重要。

临床上对血清PSA的检测方法多基于免疫学原理，如放射免疫分析法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法，这几种方法均存在操作步骤繁琐且反应时间较长等共性问题。近年来，发展PSA检测的先进分析技术成为全世界重要课题之一。以抗体、多肽为特异识别分子，利用荧光、比色、动态光散射(DLS) 和电化学分析法等技术高灵敏检测PSA方法被相继报道，PSA检出限可达到fg～ ng/mL。然而，抗体、多肽存在制备周期长、成本高和容易失活等问题，这在一定程度上限制了其临床的广泛应用。

适配体(Aptamer)是一种人工筛选出来的单链DNA或RNA分子，它能够高特异性和高亲和力与靶标结合，过程类似抗原-抗体的结合反应。与抗体相比，适配体作为识别元件应用于生物传感领域具有许多优势，如体积小、化学稳定、成本低、保存条件不苛刻等。2017年，Yang等人将适配体应用到表面增强拉曼光谱(SERS)技术中，利用磁铁分离游离和结合的金纳米粒子后，根据SERS 信号进行PSA检测，其线性范围5～500pg/mL、检出限低至5.0pg/mL。2012 年，Chen等人利用共振散射光谱(RLS)法在0.13～110ng/mL线性范围内实现PSA定量检测，其检出限为32pg/mL。然而，SERS和RLS两种分析方法存在操作复杂和设备或耗材昂贵等缺点，难以实现广泛使用。

液晶(Liquid crystal，LC)由于兼具液体流动性和固体各向异性的独特性质而被广泛应用于传感器的研究。液晶型生物传感器是利用传感器检测目标分子前后液晶分子在敏感膜表面的取向变化情况、液晶折射光线能力的改变，导致传感器的颜色和亮度发生变化，从而实现对目标分子的检测。近年来，越来越多的肿瘤标志物适配体被筛选出来，以适配体为分子识别元件、液晶分子为信号放大与换能元件构建的液晶型适配体生物传感器为肿瘤标志物检测提供了新的途径。目前，仅有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、黏蛋白(MUC1)和PSA少量肿瘤标志物液晶型适配体生物传感器被研究。2020年，Qi等利用偶联磁珠适配体1(Apt1)捕获的PSA进一步结合适配体2(Apt2)，磁珠-Apt1-PSA-Apt2磁分离后，根据部分双链适配体2和适配体2互补单链对液晶分子取向影响差异，实现PSA定量检测，其线性范围0.04～0.5ng/mL、检出限为70pg/mL。该文献报道PSA液晶型适配体传感器存在检测线性范围窄，单、双链适配体成本较高等问题。

本发明提供了一种具有特异性好、灵敏度高、检测范围宽、轻巧便携、低成本、操作简单以及不需要昂贵检测仪器的PSA液晶型适配体传感器制备及定量检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种液晶型适配体生物传感器及其制备方法和定量检测PSA的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了达到上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种液晶型适配体生物传感器，所述生物传感器包括依次排列的上玻片、铜载网和下玻片；所述上玻片和下玻片部分或全部重合，且所述铜载网置于所述上玻片和下玻片之间；其中：

所述下玻片的组装膜基底经N,N-二甲基-N-十八烷基氯化铵(DMOAP)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合液处理，再用二醛化合物的一个醛基对 3-氨丙基三乙氧基硅烷膜氨基进行醛基化修饰、另一醛基固定5′端修饰氨基 PSA适配体；

所述铜载网置于所述下玻片固载所述PSA适配体的检测物面中心，4-氰基 -4戊基联苯(5CB)液晶分子转移至整个所述铜载网；

所述上玻片经N,N-二甲基-N-十八烷基氯化铵处理以诱导所述4-氰基-4戊基联苯的液晶分子垂直取向。

所述液晶型适配体生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)上玻片预处理：用N,N-二甲基-N-十八烷基氯化铵(DMOAP)修饰经表面洁净化处理的上玻片，将修饰后的上玻片洗净于室温下浸泡在体积百分比为0.35％的N,N-二甲基-N-十八烷基氯化铵(DMOAP)水溶液中，时间为 30min；然后，用超纯水冲洗、N₂吹干，110℃恒温干燥1h，得到固定N,N- 二甲基-N-十八烷基氯化铵膜的上玻片备用；

(2)下玻片预处理：用N,N-二甲基-N-十八烷基氯化铵(DMOAP)和3- 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合液修饰经表面洁净化处理的下玻片，得到下玻片自组装DMOAP和APTES混合膜，清洗后置于体积百分比为0.3％DMOAP 和0.3％APTES的无水乙醇混合液中，80℃浸泡2h，然后用无水乙醇、超纯水依次冲洗，N₂吹干，110℃恒温干燥1h；再用二醛化合物的一个醛基对 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)膜氨基进行醛基化修饰、另一醛基固定5′端修饰氨基PSA适配体；

(3)铜载网预处理：铜载网置于步骤(2)得到的下玻片固载所述PSA适配体的检测物面中心，将4-氰基-4戊基联苯(5CB)液晶分子转移并布满整个所述铜载网；

(4)将步骤(1)和步骤(2)中预处理得到的上玻片和下玻片叠合在一起，且将步骤(3)中预处理得到铜载网置于它们之间，获得包括预处理后的上玻片、铜载网和下玻片依次排列组成的所述生物传感器。

所述表面洁净化处理为：将上玻片或下玻片用新配置的Piranha溶液于 80℃浸泡2h，洗净后(可用无水乙醇冲洗)在无水乙醇中超声30min，去除所述上玻片和下玻片表面的有机物并使玻片表面羟基化，然后用大量超纯水冲洗，去除残留酸液，N₂吹干，110℃恒温干燥3～5h后，取出防尘备用。

所述铜载网为150目、厚度20μm。

所述上玻片、下玻片由载玻片切割获得，推荐尺寸为2cm×2cm。

所述Piranha溶液指体积比为H₂SO₄：H₂O＝7：3的溶液。

所述下玻片预处理过程包括如下步骤：

用APTES-GA/DMOAP修饰下玻片，得到DMOAP和APTES复合膜基底的下玻片，然后置于体积百分比为0.1％的GA水溶液中，室温下浸泡45min，使下玻片表面APTES醛基化，取出后用超纯水冲洗，N₂吹干，得到修饰了 APTES-GA/DMOAP基底的下玻片备用。

所述下玻片预处理过程还可以包括如下步骤：

用APTES-GA-Apt/DMOAP层修饰下玻片，将200μL浓度为100pmol/L 适配体Apt的Tris-HCl溶液(内有10mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、5mmol/L KCl和5mmol/L MgCl₂，pH7.4)滴加到所述修饰了APTES-GA/DMOAP层的下玻片膜基底表面，37℃下孵育12h，用体积比为0.005％、pH值为7.0 的十二烷基硫酸钠(SDS)清洗液和超纯水冲洗，去除下玻片上未固定的多余适配体，小流量N₂吹干备用。

所述制备方法还包括所述下玻片上未反应的醛基活性位点封闭：在室温下用80mmol/L甘氨酸溶液浸泡所述预处理的下玻片1h，用超纯水冲洗，N₂吹干，去除非特异性吸附物质的干扰。

所述氨基PSA适配体的碱基序列为：5′ -5AmMC6-AATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3′；其中，5AmMC6是指在适配体5′端修饰氨基。

所述制备方法还包括如下生物传感器和PSA适配体的孵育步骤：将200μL 不同浓度的PSA适配体溶液、干扰物或血清样本滴加到所述固定5′端修饰氨基 PSA适配体的下玻片表面，室温下反应1h，分别用0.01mol/L、pH7.4的PBS 缓冲溶液和超纯水冲洗，小流量N₂吹干。

所述4-氰基-4戊基联苯(5CB)经过了如下处理：加热至＞35℃(如40℃)，得到各向同性的液态5CB。

所述生物传感器在检测前列腺特异性抗原中的应用，将固载有不同浓度PSA 的检测样品(所述检测样品可选自PBS溶液、干扰物、血清样本等)的所述生物传感器置于偏光显微镜(SOPTOP-CX40P，宁波舜宇，中国)载物台上，利用偏光显微镜上的数码相机(SONY-IMX178，日本)获取偏振显微图像，根据所述偏振显微图像的亮区覆盖率实现样本的PSA快速无标记检测。

进一步地，所述应用包括利用MATLAB对所述偏振显微图像进行水平矫正、液晶膜区图像分割、计算每个检测区域的亮区覆盖率，所述亮区覆盖率＝亮区面积/界面总面积，所述亮区面积、界面总面积等价为所述偏振显微图像的像素个数。

当样本中无PSA时，由于下玻片组装的PSA适配体体积较小，不足以扰乱液晶5CB的垂直取向，传感器呈现全黑的偏光显微图像；当样本中存在PSA时， PSA能够诱导下玻片固定的适配体空间构象改变并与之特异性结合，PSA浓度达到一定量时会扰动液晶分子的垂直取向排列，造成液晶型适配体传感器偏光显微图像的颜色和亮度发生变化。根据测得的偏光图像亮区覆盖率(Br)可以实现样本PSA快速无标记检测，液晶型适配体传感器检测PSA示意图及液晶池的组装过程见图2所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)一条适配体单链作为液晶型适配体传感器的分子识别元件，这较抗体、多肽在体积小、化学稳定性、生成成本低和保存条件不苛刻方面有优势，较基于一条适配体单链和一条部分双螺旋适配链的磁分离辅助的液晶传感器检测PSA 操作过程更加简便。

(2)5CB液晶分子作为液晶型适配体传感器信号放大与换能元件，根据偏光显微图像亮区覆盖率获得PSA含量，检测过程不需要昂贵仪器。

(3)通过增加下玻片修饰适配体分子识别元件固载量、MATLAB自动识别并计算偏光显微图像亮区覆盖两个方面来提高该传感器检测PSA线性范围、灵敏度，降低PSA检测限。

综上所述，本发明为快速检测前列腺特异性抗原(PSA)提供了一种新的方法，PSA液晶型适配体传感器具有特异性好、线性范围宽、灵敏度高、无需标记和检测方便快捷等优点。

附图说明

图1为实施例4中液晶型适配体生物传感器的结构示意图。

图2为实施例7中液晶型适配体传感器检测前列腺特异性抗原示意图及液晶池的组装过程。

图3为实施例7中DMOAP修饰后的上玻片偏光显微图像。

图4为实施例1中不同浓度比的APTES/DMOAP修饰的下玻片偏光显微图像。

图5为实施例2中不同浓度GA的(APTES-GA)/DMOAP修饰的下玻片偏光显微图像。

图6为实施例3中不同浓度适配体的(APTES-GA-Apt)/DMOAP修饰的下玻片偏光显微图像。

图7为实施例4中不同浓度PSA的液晶型适配体生物传感器偏光显微图像。

图8为实施例4中PSA浓度与液晶型适配体生物传感器偏光显微图像亮区覆盖率(Br)线性关系图。

图9为实施例5中MATLAB软件进行偏光显微图像水平矫正。

图10为实施例5中MATLAB软件进行液晶膜区图像分割。

图11为实施例5中偏光显微图像处理MATLAB软件UI界面。

图12为实施例5中MATLAB软件计算每个液晶池检测区域亮区覆盖率。

图13为实施例6中干扰物下液晶型适配体生物传感器偏光显微图像。

图14为实施例8中PSA血清样本下液晶型适配体生物传感器偏光显微图像。

具体实施方式

下面，结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但所述内容不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的保护涵盖范围之内。另外，需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：传感器基底表面自组装APTES/DMOAP混合膜比例优化

为了保证液晶传感器5CB液晶分子的均一垂直取向,传感器下玻片基底固载更多的适配体分子来提高PSA检测范围，进行了传感器下玻片基底表面自组装 APTES/DMOAP混合膜的APTES和DMOAP比例优化。

(1)下玻片修饰的DMOAP浓度固定为0.3％(v/v)，改变APTES浓度分别为0.3％、1.5％和3.0％。将清洗后的下玻片浸泡于APTES和DMOAP 的无水乙醇混合溶液中，80℃浸泡2h，用大量无水乙醇、超纯水冲洗依次冲洗，N₂吹干，110℃恒温干燥1h，完成传感器下玻片基底表面自组装 APTES/DMOAP混合膜。

(2)APTES/DMOAP浓度比为1：1时，下玻片偏光显微图像呈现均一全黑色(见图4a)；APTES/DMOAP浓度比为5：1时，下玻片偏光显微图像仍呈现均一全黑色(见图4b)；APTES/DMOAP浓度比为10：1时，下玻片偏光显微图像出现明显的明亮纹理(见图4c)。可以看出，当APTES/DMOAP浓度比值1：1和5：1时，偏光显微图像为均一的黑色，1：1和5：1为传感器基底表面自组装APTES/DMOAP混合膜最佳浓度比。

实施例2：APTES/DMOAP＝1：1时传感器基底表面GA和适配体浓度优化

为了将修饰了氨基的核酸适配体固定于下玻片表面，需要对下玻片表面修饰的APTES进行醛基化处理。分别采用0.1％和0.5％(v/v)的GA对自组装 APTES/DMOAP混合膜的下玻片进行孵育。

(1)0.1％GA处理获得的(APTES-GA)/DMOAP混合膜的下玻片，进一步偶联氨基化适配体，适配体浓度为100nmol/L时，偏光显微图像出现了显著的彩色和明亮区域(见图5a)，过量的适配体影响了铜载网内5CB分子取向；适配体浓度为1nmol/L时,图像中仍然有部分光斑(见图5b)；适配体浓度降至 100pmol/L时,偏光显微图像呈现为均一的黑色(见图5c)。

(2)0.5％GA处理获得的(APTES-GA)/DMOAP混合膜的下玻片，进一步偶联氨基化适配体，适配体浓度为100nmol/L时，偏光显微图像呈现彩色和明亮区域(见图5d)，过量的适配体影响了铜载网内5CB分子取向；适配体浓度为1nmol/L时，图像中仍然有部分光斑(见图5e)；适配体浓度降至100pmol/L 时,偏光显微图像呈现为均一的黑色(见图5c)。

因此，APTES/DMOAP＝1：1修饰的传感器基底醛基化GA浓度为0.1％。实施例3：APTES/DMOAP＝5：1时传感器基底表面GA和适配体浓度优化

为了提高传感器下玻片基底表面固载适配体分子数量，需要提高APTES醛基化分子数。分别采用0.1％和0.5％(v/v)的GA孵育下玻片基底表面自组装APTES/DMOAP混合膜。0.1％(v/v)GA醛基化的(APTES-GA)/DMOAP 复合层下玻片，偏光显微图像呈现均一黑色(见附图6a)，进一步固定适配体；当适配体浓度为100pmol/L时，偏光显微图像出现了大片的彩色和明亮区域(见图6b)。为了令更多的适配体分子固定在传感器基底下玻片表面，以提高液晶型适配体生物传感器检测PSA灵敏度，本专利采用实施例2优化条件，即传感器基底自组装(APTES-GA)/DMOAP膜条件为：0.3％APTES、0.3％DMOAP 和0.1％GA，适配体浓度为100pmol/L。

实施例4：传感器灵敏度考察

(1)将不同浓度PSA溶液滴加到固载适配体下玻片上，随后用80mmol/L 甘氨酸溶液浸泡，封闭下玻片表面未与适配体偶联的醛基非特异性活性位点；与修饰有DMOAP上玻片面对面组装成液晶盒,中心部位夹5CB液晶分子铜载网，组装结构见说明书图1。

(2)溶液PSA浓度越高，与之结合的适配体分子就越多，对5CB液晶分子的垂直取向破坏也越大，偏光显微图像中的彩色明亮区域以及明亮纹理就会越明显。PSA浓度为1μg/mL时,偏光显微图像呈现彩色织构形态(见图7a)；PSA 浓度为100ng/mL，1ng/mL和1pg/mL时,偏光显微图像仍然为彩色织构形态 (见图7b，c，d)，这是由于结合在传感器基底表面的PSA分子较大，对5CB 液晶分子垂直取向的破坏仍然较大，双折射现象明显；PSA浓度低至1fg/mL 时，仍然有明显的光学信号响应(见图7e)；PSA浓度低至0ng/mL时,偏光显微图像呈现黑色没有光学信号响应(见图7f)。

(3)由MATLAB自动识别并计算PSA浓度在0～1μg/mL范围内偏光显微图像亮区覆盖，结果见图8。PSA浓度对数与亮区覆盖率(Br)具有线性关系，线性方程为Br＝7.869998logCPSA+6.50541，R2＝0.99413；液晶型适配体生物传感器PSA检测下限为1fg/L，检测限为81fg/L。

实施例5：自动识别液晶型适配体生物传感器偏光显微图像并计算亮区覆盖

利用MATLAB进行偏光显微图像水平矫正、液晶膜区图像分割、计算每个检测区域亮区覆盖率，亮区覆盖率(Br)＝亮区面积/界面总面积，结果见图9～ 12。

部分程序如下：

flag1＝0；flag2＝0；flag3＝0；flag4＝0；

％上侧部分

％下侧部分

％左侧部分

％右侧部分

实施例6：传感器特异性考察

选择人血清白蛋白(HSA)和癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原12-5(CA12-5)和糖类抗原72-4(CA72-4)五种血清肿瘤标示物做特异性对照实验。实验对照组的HSA浓度为42g/L、CEA 浓度为5μg/L、AFP浓度为20μg/L、CA19-9浓度为37kU/L、CA12-5浓度为35kU/L和CA72-4为7U/L，采用与PSA相同的实验方法，获得偏光显微图像，结果见图13。可以看出，六组对照实验的偏光显微图像均呈现全黑背景，个别干扰物偏光显微图像存在少量分散亮斑，这可能是由于传感器基底玻片上的一些未反应物质残留所致。因此，液晶型适配体生物传感器对PSA检测具有良好特异性。

实施例7：生物传感器的构建

(1)载玻片切割成尺寸为2cm×2cm，获得上、下玻片，用新配置的Piranha 溶液于80℃浸泡2h，无水乙醇冲洗后，在无水乙醇中超声30min，去除上、下玻片表面有机物，使玻片表面羟基化，然后用大量超纯水冲洗，去除残留酸液， N₂吹干，110℃恒温干燥3～5h后，取出防尘备用。

(2)室温下，将表面羟基化的上玻片浸泡于体积百分比为0.35％的DMOAP 水溶液中，时间为30min；然后，用超纯水冲洗、N₂吹干，110℃恒温干燥1h，得到固定DMOAP膜的上玻片，偏光显微图像呈现黑色(见图3)。

(3)将表面羟基化的下玻片浸泡于0.3％(v/v)APTES和0.3％DMOAP 的无水乙醇混合溶液中，80℃浸泡2h，用大量无水乙醇、超纯水冲洗依次冲洗，N₂吹干，110℃恒温干燥1h，完成传感器下玻片基底表面自组装 APTES/DMOAP混合膜。

(4)用0.1％GA处理APTES-GA/DMOAP混合膜的下玻片，进一步偶联氨基化适配体，适配体浓度为100pmol/L时，得到APTES-GA-Apt/DMOAP 修饰下玻片。

(5)将1ng/mLPSA溶液滴加到固载适配体下玻片上，随后用80mmol/L 甘氨酸溶液浸泡，封闭下玻片表面未与适配体偶联的醛基非特异性活性位点；与修饰有DMOAP上玻片面对面组装成液晶盒,中心部位夹5CB液晶分子铜载网。液晶型适配体传感器检测前列腺特异性抗原示意图及液晶池的组装过程，见图 2。

(6)由MATLAB自动识别并计算PSA浓度偏光显微图像亮区覆盖，根据亮区覆盖率和PSA浓度线性方程为Br＝7.869998logCPSA+6.50541，R2＝0.99413，获得PSA溶液浓度0.95±0.06。

实施例8：血清样品检测

在健康女性血清样本中加入一定量PSA，获得PSA浓度分别为50pg/mL、 100pg/mL、4ng/mL、10ng/mL和100ng/mL的血清样品，液晶型适配体生物传感器检测血清样品方法同实施例4，偏光显微图像见图14a～c。由实施例3 的PSA浓度对数与亮区覆盖率(Br)线性关系，获得的血清样本的PSA浓度，结果如下表所示：

C<sub>PSA</sub>(ng/mL)	C<sub>PSA</sub>检测值(均值±RSD ng/mL)
		0.05	0.045±0.02
0.10	0.097±0.04
		4.00	3.97±0.57
10.00	96.80±1.10
		100.00	102.21±1.51

Claims

1.一种液晶型适配体生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括依次排列的上玻片、铜载网和下玻片；所述上玻片和下玻片部分或全部重合，且所述铜载网置于所述上玻片和下玻片之间；其中：

所述下玻片的组装膜基底经DMOAP和APTES混合液处理，再用二醛化合物的一个醛基对APTES膜氨基进行醛基化修饰、另一醛基固定5′端修饰氨基PSA适配体；

所述铜载网置于所述下玻片固载所述氨基PSA适配体的检测物面中心，并且所述铜载网上布满5CB液晶分子；

所述上玻片经DMOAP处理以诱导所述5CB液晶分子的垂直取向。

2.权利要求1所述液晶型适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)上玻片预处理：用DMOAP修饰经表面洁净化处理的上玻片，将修饰后的上玻片洗净于室温下浸泡在体积百分比为0.35％的DMOAP水溶液中，时间为30min；然后，用超纯水冲洗、N₂吹干，110℃恒温干燥1h，得到固定DMOAP膜的上玻片备用；

(2)下玻片预处理：用DMOAP和APTES混合液修饰经表面洁净化处理的下玻片，得到下玻片自组装DMOAP和APTES混合膜，清洗后置于体积百分比为0.3％DMOAP和0.3％APTES的无水乙醇混合液中，80℃浸泡2h，然后用无水乙醇、超纯水依次冲洗，N₂吹干，110℃恒温干燥1h；再用二醛化合物的一个醛基对APTES膜氨基进行醛基化修饰、另一醛基固定5′端修饰氨基PSA适配体；

(3)铜载网预处理：铜载网置于步骤(2)得到的下玻片固载所述PSA适配体的检测物面中心，将5CB液晶分子转移并布满整个所述铜载网；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表面洁净化处理为：将上玻片或下玻片用新配置的Piranha溶液于80℃浸泡2h，洗净后在无水乙醇中超声30min，去除所述上玻片和下玻片表面的有机物并使玻片表面羟基化，然后用大量超纯水冲洗，去除残留酸液，N₂吹干，110℃恒温干燥3～5h后，取出防尘备用。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述下玻片预处理过程为：

用APTES-GA/DMOAP修饰下玻片，得到DMOAP和APTES复合膜基底的下玻片，然后置于体积百分比为0.1％的GA水溶液中，室温下浸泡45min，使下玻片表面APTES醛基化，取出后用超纯水冲洗，N₂吹干，得到修饰了APTES-GA/DMOAP基底的下玻片备用。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述下玻片预处理过程为：

用APTES-GA-Apt/DMOAP修饰下玻片，将200μL浓度为100pmol/L适配体Apt的Tris-HCl溶液滴加到所述修饰了APTES-GA/DMOAP的下玻片膜基底表面，37℃下孵育12h，用体积比为0.005％、pH值为7.0的十二烷基硫酸钠清洗液和超纯水冲洗，去除下玻片上未固定的多余适配体，小流量N₂吹干备用。

6.根据权利要求2至6任一所述的制备方法，其特征在于，还包括所述下玻片上未反应的醛基活性位点封闭：在室温下用80mmol/L甘氨酸溶液浸泡所述预处理的下玻片1h，用超纯水冲洗，N₂吹干，去除非特异性吸附物质的干扰。

7.根据权利要求2至6任一所述的制备方法，其特征在于，所述氨基PSA适配体的碱基序列为：5′-5AmMC6-AATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3′；其中，5AmMC6是指在适配体5′端修饰氨基。

8.根据权利要求2至6任一所述的制备方法，其特征在于，还包括如下生物传感器和PSA适配体的孵育步骤：将200μL不同浓度的PSA适配体溶液、干扰物或血清样本滴加到所述固定5′端修饰氨基PSA适配体的下玻片表面，室温下反应1h，分别用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液和超纯水冲洗，小流量N₂吹干。

9.权利要求1至8任一所述生物传感器在检测前列腺特异性抗原中的应用，其特征在于，将固载有不同浓度PSA的检测样品的所述生物传感器置于偏光显微镜载物台上，利用偏光显微镜上的数码相机获取偏振显微图像，根据所述偏振显微图像的亮区覆盖率实现样本的PSA快速无标记检测。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用MATLAB对所述偏振显微图像进行水平矫正、液晶膜区图像分割、计算每个检测区域的亮区覆盖率，所述亮区覆盖率＝亮区面积/界面总面积，所述亮区面积、界面总面积等价为所述偏振显微图像的像素个数。