CN105296630A - 流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素。本发明的试剂盒具有高特异度、灵敏度，而且具有同时检测多个样本、多个指标的能力，可以用于临床急性高原病（AMS）重点易感基因的检测诊断，还可应用于应对批量需要急进高原的人群，短时间内进行检测并分型。

Description

流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒
技术领域
本发明涉及人类基因诊断试剂盒，采用流式荧光杂交法定性检测急性高原病易感基因中的SNP位点。适用于临床急性高原病易感基因的预测诊断，还可用于高原适应人群和AMS患者基因组检测。
背景技术
青藏高原地域辽阔、物产丰富，蕴含着巨大的经济发展潜力；青藏高原地处祖国西南边睡，是重要的天然屏障，军事地理位置重要。但高原自然生存环境恶劣，在海拔3000米高原，大气压降至537mmHg，仅为海平面的70%，大气氧分压为103mmHg，肺泡气氧分压为62mmHg，高原缺氧导致机体劳动能力明显降低，在海拔4500米地区，人的体力只有平原的60%。高原特殊的环境因素可导致高原病的发生，急性高原病(AcutemountainsieknessAMS)最为常见，危害也最大。流行病学调查显示，AMS多发生于海拔2500米以上的高原，而我国海拔3000米以上的高原就占国土面积的1/6，常住人口约6000多万。目前AMS已经成为我国高原地区的重大公共卫生问题，严重阻碍着当地经济、社会及各项事业的发展。由于AMS发展迅速，后果严重，目前又缺乏非常有效的治疗措施，因此，寻找有效的预防措施显得尤为迫切。AMS是一种多基因疾病，是高原低氧的环境因素和许多微效致病基因共同作用的结果。大量研究表明，诱导AMS形成的易感基因产物在AMS患者和高原习服人群之间的表达存在显著性差异。如果在进入高原之前，通过遗传标记的检测，将携带这种易感基因型的个体筛检出来，避免其暴露于高原低氧环境，就能有效预防AMS的发生。但现有的实验室检测方法均不能进行易感基因型检测。总之，研发急性高原病易感基因的预测诊断试剂盒仍然是人们面对的挑战之一。
流式液相芯片技术又称流式荧光技术或悬浮阵列流式荧光技术，其原理是将荧光标记后的单细胞（或颗粒）悬液随鞘液进入流动室，压力迫使鞘液包裹的液滴包含单一细胞或颗粒垂直通过检测区。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出荧光，根据其本身标记的荧光和激发后发出的荧光综合分析进行检测。其在小样本、高通量、操作简便、快速准确、敏感度、特异度高等方面优于传统的分析方法，而且其所有反应均在液相中进行，保持天然构象，有利于探针和待测物充分反应，目前已广泛用于各类核酸及蛋白检测，如基因分型、抗原/抗体检测、感染性疾病诊断等，其中HPV检测及分型试剂盒、呼吸道病毒检测试剂盒、细胞因子检测试剂盒、肿瘤标志物检测试剂盒等已经在美国和中国经FDA及SFDA批准用于临床检测。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种高特异度、灵敏度，且具有同时检测多个样本、多个指标能力的试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：
流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素（SA-PE）；
其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下：
S-R0409-1：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAG-3'；
S-R0409-2：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAT-3'；
S-F1：5'-GAGACTTCCGCTACTCAGATGG-3'；
S-P1：5'-AAACTACACCAACTGGTACCGAG-3'。
进一步地，所述预混液由4XBuffer、dNTPs、TaqPolymerase组成。
具体地，预混液的用量为：10μl，特异性PCR引物混合液的用量为：2μl。
另外，所述试剂盒还包含ddH2O。具体地，ddH2O的用量为：6μl。在进行检测时，待检DNA的用量为：2μl。
上述试剂盒在实际使用过程中的PCR反应条件为：首先热启动95℃10min，然后进入35个循环；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min。
取PCR产物3μl与22μl微球杂交液混合，95℃变性5min，48℃杂交30min后，加入SA-PE75μl，48℃温育15min。使用Luminex200流式荧光分析仪检测杂交产物。
本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的试剂盒具有高特异度、灵敏度，而且具有同时检测多个样本、多个指标的能力，可以用于临床急性高原病（AMS）重点易感基因的检测诊断，还可应用于应对批量需要急进高原的人群，短时间内进行检测并分型。
附图说明
图1为1号标本SP-A2位点测序结果。
图2为2号标本SP-A2位点测序结果。
图3为3号标本SP-A2位点测序结果。
图4为4号标本SP-A2位点测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
急性高原病（AMS）易感基因SNP位点的选择：
使用NCBI核酸数据库公开信息及文献调研，筛选高原急性不适易感靶基因及位点，通过生物信息学比对研究，筛选急性高原病（AMS）易感基因，对选取的AMS易感基因SNP位点的序列号查询和基因组序列下载。SNP位点的选择原则：该位点尽量位于基因编码区、调控区等蛋白活性关系密切的区域，各SNP位点基因频率分布资料均来自中国汉族人群。根据SNP位点选择原则，选定1个易感基因的1个SNP位点。所选SNP位点为：肺表面活性蛋白A2基因（SP-A2）基因：rs1965708。
通过对SNP位点的选择，本申请研究出了以下试剂盒：
该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素（SA-PE）。
所述预混液由4XBuffer、dNTPs、TaqPolymerase组成。该预混液可从市面上直接购买。
所述特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针（S-P1号）与39号荧光微球耦联、TE缓冲液及四甲基氯化氨(TMAC)杂交缓冲液制备。其具体的制备方法和采用的其他原料均是现有技术，本发明仅是采用了不同的探针和荧光微球，然后制备方法是现有的。
其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下：
S-R0409-1：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAG-3'；
S-R0409-2：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAT-3'；
S-F1：5'-GAGACTTCCGCTACTCAGATGG-3'；
S-P1：5'-AAACTACACCAACTGGTACCGAG-3'。
具体地，试剂盒中的预混液用量为：10μl，特异性PCR引物混合液用量为：2μl。
另外，所述试剂盒还包含ddH2O。具体地，ddH2O的用量为：6μl。在进行检测时，待检DNA的用量为：2μl。也就是说本申请试剂盒的PCR反应体系的总体积为20μl。
然而，PCR反应条件为：首先热启动95℃10min，然后进入35个循环；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min。杂交反应条件为取PCR产物3μl与22μl微球杂交液混合，95℃变性5min，48℃杂交30min后，加入SA-PE75μl，48℃温育15min。
本发明的试剂盒使用时，引物对为两对：①S-R0409-1\S-F1，②S-R0409-2\S-F1。采用Luminex200流式荧光检测仪进行检测。
本发明的临床验证：
采集2015年1月西藏某医院收治的4例临床诊断为急性高原病的患者全血，提取DNA采用AMS易感基因流式液相芯片检测并分型。通过扩增、杂交并用Luminex200流式荧光检测仪检测，检测结果如表1。
表1急性高原病的患者流失液相芯片检测结果
结果表明，如果只有引物对①或引物对②的产物杂交结果是阳性（MFI＞500），则判定为纯合突变，SNP类型为引物对①或引物对②带有的碱基类型。如果引物对①和引物对②的产物杂交结果都呈阳性，则判定为杂合突变。
检测后将基因组DNA进行测序验证结果（华大基因），测序结果见图1～4。病例标本编号为：1、2、3、4，测序结果与本发明检测结果完全吻合。
4例急性高原病的患者标本中，SP-A2（rs1965708）突变4例，其中，编号1的病例为纯合G突变，编号2的病例为纯合A突变，编号3的病例为纯合C突变，编号4的病例为纯合C突变。说明该方法与临床诊断一致性非常好。
SEQUENCELISTING
<110>吴艾霖
<120>流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒
<130>
<160>12
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>S-R0409-1
<400>1
catctgtgtacatctccacacacag25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>S-R0409-2
<400>2
catctgtgtacatctccacacacat25
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>S-F1
<400>3
gagacttccgctactcagatgg22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>S-P1
<400>4
aaactacaccaactggtaccgag23

Claims (5)

1.流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素；
其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下：
S-R0409-1：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAG-3'；
S-R0409-2：5'-CATCTGTGTACATCTCCACACACAT-3'；
S-F1：5'-GAGACTTCCGCTACTCAGATGG-3'；
S-P1：5'-AAACTACACCAACTGGTACCGAG-3'。
2.根据权利要求1所述的流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，其特征在于，预混液的用量为：10μl，特异性PCR引物混合液的用量为：2μl。
3.根据权利要求1或2所述的流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ddH2O。
4.根据权利要求3所述的流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，其特征在于，ddH2O的用量为：6μl。
5.根据权利要求1所述的流式液相芯片急性高原病肺表面活性蛋白A2基因rs1965708位点检测试剂盒，其特征在于，特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针S-P1与39号荧光微球耦联、TE缓冲液及四甲基氯化氨杂交缓冲液制备。
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