KR20160075504A - 분석 시험 장치, 키트 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배터리, 판독 장치, 및 기타 회로소자와 같은 인쇄 전자를 갖는 장치를 사용함에 의한 및/또는 민감성 인디케이터 pH 염료를 이용하여 시험하기 위한 비색 수단을 사용함에 의한, 또는 양자에 의한 결과의 모니터, 감지, 판독 및 디스플레이용 분석 시험 장치, 및 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

분석 시험 장치, 키트 및 사용 방법{ASSAY TEST DEVICE, KIT AND METHOD OF USING}
본 발명은 분석 시험 장치, 키트, 및, 장치가 시험하고자 하는 검출값을 감지, 모니터링, 판독 및 결과를 디스플레이하기 위한 시험 장치의 사용 방법에 관한 것이다. 종래의 장치는, 생물학적 샘플, 물질, 유기 또는 무기 샘플을 포함하는 (이것으로 제한되는 것은 아니지만) 샘플 내에 매우 낮은 농도로 존재하는 미량의 화학 및/또는 생물학적 타겟(들)을 검출 또는 모니터하기 위해 이용되어 왔다. 미량의 화학 및/또는 생물학적 타겟(들)은 생물/화학 생성물, 단편 또는 전체 타겟(들), 예컨대 핵산 서열, 세포, 바이러스, 병원균, 화학 물질과, 캐어/사이트/관심 및 실험실 분야에 대한 적용, 예컨대 약물 유전체학, 병원균 검출 및 모니터링, 유전적 소인의 결정, 임상 시험, 진단, 사전 진단, 감염성 질환 진단 및 모니터링를 위한 유전자 분류, 생체 방어, 포렌식 분석, 친자 확인, 동물과 식물 육종, 식품 검사, 인간 식별, 유전자 변형 유기체 검사, 화학적 오염, 식품 안전, 모니터링 및 생산 사슬 및 생산 인-라인 모니터링/제어의 추적을 포함할 수 있다.
본 발명은 몇몇 방식의 조합으로 이루어진다. 한 방식은 측정하고자 하는 변화(예컨대 pH)를 감지하기 위해 인쇄 전자(printed electronics)의 사용을 통하여 이루어진다. 반응 변화를 측정하기 위한 다른 방식은, 다른 것들 중에서 결과를 검출하기 위한 한 방식으로서, 인쇄 전자를 사용하여 검출된 비색 매질(clorimetric media)(색상 변화를 나타내거나 또는 볼 수 있게 되는 색상의 변화)을 사용하는 것이다. 또한, 인쇄 전자 센서(printed electronics sensors)는 통합된 유닛 상에 측정된 결과를 디스플레이하기 위해 사용된다.
존재하는 몇몇 장치로는, 예를 들면, 진단 분석에서 사용하기 위한 측방 유동 장치 및 방법(lateral flow devices and methods)이다. US SN 14/345,276은 본 출원에서 그 전체가 참고문헌으로 포함된다. US SN 14/345,276에 개시된 방법 및 장치는 제공된 샘플 내에서 매우 낮은 농도로 발견되는 화학적, 생물학적 및 물질 타겟과 같은 타겟을 검출 또는 모니터링하기에 유용하다. 그러나, US 14/345,276의 방법 및 장치는 본 발명의 방법, 장치 및 키트를 이용하지 않는다.
측방 유동 장치(lateral flow devices) 이외에, 종이 상의 마이크로 플루이 딕 연료 셀(micro fluidic fuel cells)이 본 발명에서 사용될 수 있다.
이 시점까지, 인쇄 전자(printed electronics)는 다양한 기술 분야에서 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명의 장치의 디스플레이 측면에서, 시험되는 결과를 디스플레이하기 위하여 인쇄 전자를 처음으로 사용하였다. 이들 인쇄 전자는 하나 이상의 인쇄 회로 디스플레이 및/또는 배터리를 인쇄된 형태로 포함한다. 그것은 또한 센서 모니터, 차동 준비 유닛(differential ready unit) 및/또는 디스플레이 유닛이 인쇄된 형태의 그의 전자기기를 갖도록 되어있다. 이들 전자기기(electronics) 예컨대 회로, 디스플레이 및 배터리는 모두, 장치에 의해 측정되고자 하는 결과를 판독하기 위해, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 측방 유동 장치(lateral flow devices)와 같은(그러나 이에 제한되는 것은 아니다) 의료 장치 상에 위치해 있다.
인쇄 전자는, 일반적인 인쇄 장비를 사용하여 전기 장치를 다양한 기판상에 생성하기 위하여 사용되는 인쇄 방법이다. 패턴은 스크린 인쇄, 플렉소그래피, 그라비어, 오프셋 리소그래피, 및 잉크젯과 같이(이들이 일반적으로 저비용 프로세스이므로) 물질상에 인쇄된다. 전자 기능 전자(electronically functional electronic) 또는 광학 잉크(optical ink)는 박막 트랜지스터(thin film transistor) 또는 레지스터(resistor)와 같은 능동적 혹은 수동적 장치를 생성하는 기판상에 사용된다.
용어 "인쇄 전자(printed electronics)"는 하나(또는 그 이상)의 잉크가 탄소계 화합물로 구성되는 유기 전자기기(organic electronics) 또는 플라스틱 전자기기를 의미한다. 인쇄 전자는, 대조적으로, 공정을 구체화하고, 선택된 인쇄 공정의 특정 요구에 따라, 임의의 용액 기저 물질(solution-based material)을 이용할 수 있다. 이것은 그 중에서도 유기 반도체, 무기 반도체, 금속 도체, 및 나노입자를 포함한다.
인쇄 전자를 준비하기 위하여, 거의 모든 산업적 인쇄 방법이 이용된다.
인쇄의 가장 중요한 장점은 저비용이다. 더 낮은 비용은 더 많은 곳에 적용할 수 있게 해준다. 예로서 무역 및 운송에서 비접촉 식별을 가능하게 하는 RFID-시스템이다. 또한, 가요성 기판 상의 인쇄는 전자기기가 곡면상에 배치될 수 있도록 한다.
본 발명은 또한 진단, 유전자 검사, 가계 및 혈통 선택 검사, 유전자 변형 유기체 검사, 병원균 검출, 유전자형(genotyping), 돌연변이 검출, 처방 또는 임상 치료를 위한 동반 유전자 검사(companion gene testing), 암 타입의 검출, 암의 모니터링 및 예후에 관한 것이다. 유전자 검사는 널리 임상 적용, 식품 공업, 법의학적 테스트(forensic testing), 인간 식별화, 병원균 전염병 감시 및 새로운 질환 균주의 검출에 널리 사용되었다. 이 유전자 검사는 분석물질로 부터 핵산의 검출 및 식별을 포함하는 기술의 범위를 포함한다. 그 예로, DNA 염기서열 결정법(DNA sequencing), 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction), DNA 마이크로어레이(DNA microarray), 및 제한효소 단편 다형성(RFLP: restriction fragment length polymorphism)을 포함한다. 본 발명은, 인쇄 전자의 사용을 통해 또는 염료 pH 인디케이터 혹은 양자를 모두 사용하는 시스템 내에서, 이러한 검사를 수행하기 위한 개선된 수단을 제공한다.
종종 미량으로 존재하는 핵산을 검출하기 위한 전통적인 방법은 샘플을 처리, 타겟을 증폭, 및 증폭을 검출하기 위한 여러 장치 및 단계가 필요하다. 핵산, DNA 또는 RNA의 증폭은 잘 확립되어 있으며, 오늘날 상이한 분석 요건에 대하여 다양한 방법이 존재한다. 심지어 검출된 전기 신호를 사용하는 PCR에 대한 뉴클레오티드(nucleotide) 삽입을 모니터하는 기존의 반응 방법(reaction method)은 본 발명의 인쇄 전자(printed electronics) 또는 비색 방법(clorimetric methods)을 사용하지 않는다(US 788,015 B2 및 US 8,114,591 B2 참조).
열순환(thermocycling) 기반의 중합 효소 연쇄 반응을(PCR)을 기반으로 하는 증폭은 핵산 뿐만 아니라 복제 수 변이(copy number variation) 또는 단일- 뉴클레오티드 다형성(single- nucleotide polymorphism)과 같은 유전자 변형 검출에서 신뢰성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 종종 임상 및 법의학적 적용과 같은 가장 규제가 필요한 적용을 위한 표준 방법으로 잘 확립되어 있다. 핵산 증폭 방법과는 상관없이, 증폭 생성물은 시각화 방법 없이 검출되지 않는다. 현재의 핵산 시각화 방법은 증폭 반응에 형광 프로브(fluorescent probe)를 부착하는 것에 관한 것이다. 이들 프로브는 Taqman 검출 올리고(Taqman detection oligo) 및 이중 가닥 DNA 킬레이터 (double-stranded DNA chelator)에서 형광 태그, Sybr Green 또는 반응 생성물에 민감한 다른 형광 화학물질을 포함한다. 형광 화합물은 형광 분자로부터의 높은 양성자 방출 때문에, 이러한 타입의 검출에 필수적이고, 상기 방출은 반응 생성물의 존재에서만 검출된다. 상기 방출은 Taqman 검출 올리고의 형광 프로브가 증폭 생성물로 하이브리드화되고 DNA 폴리메라제(DNA polymerase)에 의해 절단되거나 또는 Sybr Green이 증폭 생성물에 킬레이트화 될 때에만 발생한다.
그러나, 이들 형광 화학물질은 광 노출에 민감하거나 또는 냉동과 같은 특수한 저장 조건이 필요하다. 주변 광에의 노출은 형광 화학 물질에 광퇴색으로 지칭되는 현상인 비가역적인 손상이 발생한다. 임의의 형광 방법에 관하여, 여기 광원(excitation light source)은 임의의 방출이 발생하도록 하기 위하여 또한 요구될 것이다. UV 광원은 일반적으로 여기 광원으로서 사용되어, 측정할 수 있는 광 방출을 생성하기 위해 형광 프로브를 여기시킨다. 한 예로 문헌『Paul LaBarre of PATH, Seattle, USA(PloS One V6, issue 6, e19738)』에 공개되었으며, 그 전체가 참고문헌으로 포함된다. 형광 방출은 증폭 생성물인 피로포스페이트(pyrophosphate)가 형광 화학물질을 켄칭(quenching)으로부터 완화시킬 때 가능하다. UV 광원이 필요하며 휴대용 UV LED에 의해 제공된다. 빛의 강도는 생성물의 양 및 주변 광 조건에 의존한다. 미지 샘플과 양성 대조군(positive control) 및 음성 대조군(negative control)을 비교하는 경우, 단일 UV LED는 세 샘플 모두에 균일한 조도를 제공할 수 없을 것이다. 기기의 도움 없이 음성 반응으로부터 양성 반응을 구별하는 것은 어려울 것이다. 교란의 또 다른 원인은 형광 염료로부터의 일관성 없는 방출이다. 상기 방출은 증폭 반응 이외의 이차 반응인 두 금속 이온 간의 스왑(swap)에 의존하므로, EDTA 혈액 또는 다른 조작 변형에 일반적으로 존재하는 다른 금속 킬레이터로부터 간섭된다.
샘플이 형광 판독을 저해 또는 방지하는 또 다른 예는 샘플이 비처리된 전혈일 때와 같이, 용액이 투명한 용액이 아닐 때이다. 정밀 기기 없이, 1 마이크로리터 미만의 샘플 부피를 처리하는 것은 거의 불가능하다. 한편 대부분의 핵산 반응은 50 마이크로리터 이하에서, 더 일반적으로 25 또는 10마이크로리터에서 수행되며, 샘플이 혼탁하거나 또는 강하게 착색된 경우, 형광 방법은 심하게 제한된다. 반응 전에 대규모 희석 또는 정제 단계가 필요하다.
pH 민감성 시스템을 사용한 핵산 검출을 위한 증폭 방법은 형광 염료를 사용하기보다는 수소 이온을 직접적으로 측정한다. 이는 감이온 전계효과 트랜지스터(ISFET: ion-sensitive effect transistor) 센서와 함께 CMOS 칩 기술을 이용함으로써 달성된다 ["A pH-ISFET based micro sensor system on chip using standard CMOS technology," Haigang Yang et al, Systems-On-Chip for real-time appliction, Proceeding of the Fifth International Workshop, 2005]. 수소이온 감지 층은 CMOS 칩의 상부 층인 질화규소(silicon nitride)이다. 이 기술은 비용 효율적인, 핵산 분석을 가능하게 한다. 임의의 CMOS 칩에 대하여 전기적으로 접속하는 것은 필수적이며, 측정 및 증폭 반응을 허용하도록 하기 위하여 칩의 특수 패키징이 필요하다. 결과적으로, 방법은 고가이며 어렵다. 그것은 CMOS 칩의 설계 및 생산, 양자와 관련된 높은 비용으로 인하여 고가이다. 그것은 2 이상의 이유 때문에 어렵다: 1. 핀 홀 또는 사소한 패키징 결함을 통해 증폭 액체 누출로부터의 단락의 위험성, 및 2. 감지 층, 예를 들면 질화규소,와 반응 성분 간의 강한 간섭의 위험성. 이들 어려움과 우려로 인하여, 그것은 비용 효과적이고 간단한 유전자 시험을 위한 이상적인 해결책은 아니다.
그러므로, 본 발명은 또한 데이터를 판독 가능한 전자장비 세트를 생성하거나 또는 핵산 증폭의 존재하에 색상 차이를 생성하는 새로운 방법, 장치 및 키트에 관한 것이다. 어떠한 반응에 대하여, 반응 후 반응 용기를 안전하게 밀봉되도록 유지하는 것이 중요하다. 이것은 이전에 증폭된 핵산에 의해 다른 추가의 반응물이 오염되는 것을 방지한다. 검출 또는 반응을 위한 필수적인 성분은 반응물에 샘플 핵산을 첨가한 후 증폭 시약과 함께 밀봉되어야 한다. 핵산 증폭이 pH 강하를 초래할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 기기의 도움 없이, 출발 pH(starting pH)를 체크하고 이에 따라 필요한 조정을 수행하는 것과 같은 pH 의존 핵산 증폭을 어떻게 수행할 수 있는가에 대하여는 알려져있지 않다. 여분의 염료 성분에 의해 반응이 억제됨이 없이 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 핵산 증폭을 어떻게 수행할 수 있는가에 대하여도 또한 알려져 있지 않다. 예를 들어, 표준 PCR 반응에서, 10mM Tris 또는 그 이상의 농도는 증폭 시약에 항상 포함된다. 현재의 방법에서, 총 완충 용량은, pH 변화가 완충액에 의해 저해되지 않도록, 5mM 이하 또는 바람직하게는 2mM 이하 또는 바람직하게는 1mM 이하로 제한될 수 있다.
pH 염료와 연관된 또 다른 문제점은 염료가 증폭반응을 저해하는 것이다. 1mg/mL 농도의 BTB(bromothymol blue)와 같은 pH 인디케이터 염료는 양호한 색상 강도를 나타내지만 LAMP 반응을 완전히 저해한다. 핵산 증폭 방법에서 가용성 염료를 사용할 때, 염료와 증폭 성분의 접촉을 제한하는 것은 중요하다. 이것은 희석에 의해 또는 분자 접촉 표면적을 제한함에 의해 수행될 수 있다. 희석에 의해, 염료의 농도는 간섭이 최소가 되도록 제한된다. 더 바람직한 방법에서, 염료는 가용성이 아니어야 하며, 증폭 시약에의 염료의 분자 접촉 표면적이 급격하게 감소하도록 증폭 시약과 접촉하는 염료는 고체상태로 존재한다.
증폭에서, 여분의 트리스 완충액의 존재 없이 안정된 출발 pH(starting pH)를 제공하는 것이 가능하다. 반응으로부터의 염료의 색상은 용기가 밀봉으로 유지된다면 많은 날이 지나도 변화하지 않을 것이다.
Mg 이온 농도 및 증폭의 출발 pH(starting pH)에 따라, 증폭 후 pH 변화는 양성 또는 음성일 수 있다. 그러므로 출발 pH를 제어하는 것이 중요하다. 출발 pH(starting pH)는 그 후 약한 완충액 성분을 첨가하거나 또는 산/염기를 첨가하여 조정하도록 설정된다. pH 염료를 증폭 시약과 미리 혼합할 때, pH 미터가 필요없이 출발 pH가 옳은지의 여부를 더 용이하게 알 수 있다.
염료 성분이 가용성이거나 또는 반응물과 접촉하는 고체 표면에서 존재할 수 있으므로, ISFET와 반대로 반응 쳄버의 유형에 대한 제한은 없다. 시각적 판독을 위하여, 용기의 적어도 일부분은 보는 것이 허용되도록 완전히 불투명하지 않아야 한다. 전체 공정은 Xpert of Cepheid, 또는 Biofilm Array of BioFire의 경우와 같이, 반응 카트리지의 전매 디자인에 대한 필요없이 임의의 장기 보존 반응 바이알(over-the-shelf reaction vial)과 호환성이 있다.
분석 시험은 시험 샘플을 분석하기 위하여 사용되었으며, 특히, 그러한 사용을 위한 측방 유동 장치(lateral flow devices)는 사용이 용이하며 사용이 상대적으로 저렴하기 때문에 시험 적용의 점에서 사용되었다. 본 출원에서 그의 전체를 참고문헌으로 포함시킨 US SN 14/345,276 참조. 이들 확립된 판독 장치는, 분석물질이 착색 입자와 접촉시에 볼 수 있도록 하기 위해, 금, 라텍스 또는 형광과 같은 착색 입자에 일반적으로 의존한다. 이 결과로 나타나는 색상은 사용자가 볼 수 있다. 이와 같이, 착색 패턴에 대한 사용자 해석이 있기 때문에 결과를 어떻게 해석하느냐에 대한 불일치가 야기될 수 있다.
색상 패턴의 잠재적인 해석을 경감시키는 데 도움이 되도록 하기 위해, 별개의 전자 판독기가 측방 유동 막(lateral flow membrane)의 시험 영역 상에서 색상 또는 형광의 패턴을 스캔 및 판독하는 디지털 측방 유동 분석기(digital lateral flow analyzer)가 개발되었다. 이러한 종류의 측정기의 예로 IDEXX Laboratories의 ESEQuant Lateral Flow Immunoassay Reader 및 SNAPshot Dx Analyzer가 포함돤다.
시판되는 상기 유형의 장치 몇몇은 이들의 사용과 관련된 본래의 문제가 있다. 예를 들어, 판독기-카세트 접촉은 이러한 장치가 비용이 많이 들게 한다. 대부분의 이들 상황에서, 일회용 미터는 측방 유동 장치(lateral flow devices)의 흐름에 통합될 것이다. 이러한 하나의 장치가 클리어 블루 임신 검사 장치인데, 반응 영역에서 착색 라인이 라인의 출현을 모니터하도록 광학적으로 감지된다. 이러한 타입의 장치는 두 개의 측방 유동 분석(FLA: lateral flow assay) 스트립, 적절한 전자 부품(예를들면 포토-광학 센서(phto-optic sensors), 프로세서, LCD(액정 디스플레이) 및 배터리)이 있는 인쇄 회로 기판(PCB)를 갖는다. 이러한 타입의 검사 장치는 hcG를 위한 LFA, 임신 마커를 사용한다. 한 LFA가 캘리브레이션 제어(calibration control)이고 다른 것은 검출 스트립이다.
불행하게도, 이러한 타입의 장치는 단지 한 번의 사용 후 폐기되기 때문에 매우 낭비가 있다. 더욱이, 이러한 장치의 제조는 여러 단계가 필요하며, 이에 의해 비용이 증가한다. 그러므로, 더 쉽게 제조되고 단 한 번의 사용 후 폐기되지 않는 그런 장치에 대한 필요가 있다.
예를 들어, 중합체 및 기타 분자와 같은 전도성 및 반전도성 물질은 전자기기의 어레이에서 오늘날 사용된다. 이러한 사용은 전통적인 전자기기 대신에 이러한 장치에 사용되는 유기 전자기기(및 무기 전자 기기)와 함께 모바일 서비스의 디스플레이를 포함한다.
전자 장치의 사용의 예로 RFID(radio frequency identification)이지만, 100KHz 이상의 주파수의 안테나와 메모리 입력 및 고속 스위칭 트랜지스터의 개발은 여전히 추구된다. 유기 트랜지스터는 시험 분석과 같은 사용을 위해 전자기기(electronics)를 표면에 제공하기 위한 해결책일 수 있다.
종이에 유기 전자기기(electronics)를 부가하면 판독 오류, 위조, 위반 및 보안 문제를 완화한다.
본 발명이 기술의 단점을 극복하는 하나의 방법은 트랜지스터 용도 및 기타 용도에 호환성이 있는 전자 잉크 물질을 이용하는 것이다. 본 발명은 전하 수송을 조절하는 물질 시스템으로 사용, 디스플레이에 사용, 뿐만 아니라 전력 저장 또는 전환에 사용되는 메커니즘 또는 스위치 현상을 위해 제공한다.
종이는 인간에 의해 제조되는 가장 많이 제조되는 생성물이기 때문에, 그것은 유기/무기 전자기기에 사용되는 로직 기판이다. 종이는 본 발명의 기초를 형성하는 다수의 경로 및 물질 증착단계의 사용을 감소시킬 수 있다.
인쇄 기술은 시이트(sheet) 기반 및 롤투롤(roll-to-roll) 기반 인쇄를 포함한다. 시이트 기반 잉크젯 및 스크린 인쇄는 전형적으로 저용량, 고정밀 작업에 사용된다. 그라비어, 오프셋 및 플렉소그래픽 인쇄는 또한 고용량 제조를 위해 사용된다. 오프셋 및 플렉소그래픽 인쇄(flexographic printing)는 무기 및 유기 도체를 위해 주로 사용되는 한편, 그라비어 인쇄는 품질 민감성 층을 위해 특히 적당하다. 유기 전계 효과 트랜지스터(organic field-effect transistors) 및 집적 회로는 매스 프린팅(mass-printing) 방법에 의해 제조된다.
스크린 인쇄는 또한 페이스트-유사(paste-like) 물질로부터 패턴화된 두꺼운 층을 제조하는 능력으로 인하여 전자기기의 제작에 사용된다.
에어로졸 제트 인쇄는 인쇄 전자를 이용하는 또 다른 방식이다. 에어로졸 제트 공정은 80℃ 이하로 가열될 수 있는 잉크의 원자화로 시작되어 1 내지 2 마이크로미터 정도의 직경의 액적(droplets)을 생성한다. 원자화된 액적은 가스 흐름에 비말동반되고 인쇄 헤드로 전달된다.
인쇄와 유사점을 가진 다른 방법은, 그들 중에서 마이크로컨택트 인쇄(microcontact printing)와 나노 임프린트 리소그래피(nano-imprint lithography)가 또한 유용하다. 여기에서, ㎛- 및 nm-크기의 층은 각기 소프트 및 하드 형태의 스탬핑과 유사한 방법에 의해 제조된다. 종종 실제 구조는, 예컨대 에칭 마스크의 증착 또는 리프트-오프(lift-off) 공정에 의해 제조된다. 예를 들면, OFET에 대한 전극이 제조될 수 있다.
유기 및 무기 물질이 인쇄 전자를 위해 사용된다. 잉크 물질은 용액, 분산액 또는 현탁액을 위하여 액체 형태로 이용될 수 있어야 하며, 이들은 도체, 반도체, 유전체, 또는 절연체로서 작용하여야 한다.
유기 인쇄 전자는 인쇄, 전자, 화학 및 물질과학으로부터, 특히 유기 및 중합체(polymer) 화학으로부터의 지식 및 개발을 통합한다. 일부 유기 물질은 장치 및 회로 설계 및 최적화뿐만 아니라 제조 방법에 영향을 미치는 구조, 작동 및 기능면에서 기존의 전자기기와 상이하다.
복합 중합체(conjugated polymers)의 개발 및 그들의 가용성 물질로의 개발은 첫 번째 유기 잉크 물질을 제공하였다. 이러한 부류의 중합체로부터의 물질은 전도성, 반전도성, 전자발광, 광전지 및 기타 성질을 갖는다.
유기 반도체는 폴리(스티렌 술포네이트),(PEDOT:PSS) 및 폴리(아닐린)(PANI)으로 도핑된 전도성 중합체 폴리(3,4-에틸렌 디옥시티오펜)을 포함한다. 이들 중합체는 상이한 제형으로 시판되며 각기 잉크젯, 스크린 및 오프셋 인쇄 또는 스크린, 플렉소 및 그라비어 인쇄를 사용하여 인쇄되어 왔다. 임피던스 변화를 통해 pH 변화를 감지하기 위한 폴리알라닌 층을 이용한 가요성 센서의 용도는 『Sensing Technology, 2011 Fifth International Conference entitled "Flexible pH sensor with polyaniline layer based on impendance measurement."』에 있는 초록에 개시되어 있다.
무기 전자기기는 고차 레이어 및 인터페이스를 제공한다.
은 나노입자는 플렉소, 오프셋 및 잉크젯으로 사용된다. 금 입자는 잉크젯으로 사용된다.
다른 중요한 기판 기준은 전처리(코팅, 코로나) 튜닝될 수 있는 낮은 조도(roughness) 및 적당한 습윤성이다. 종래의 인쇄와는 대조적으로, 높은 흡수도는 일반적으로 불리하다.
본 발명의 목적 중의 하나는 장치의 전자 시스템 부분이 유기 반도체 물질 또는 무기 물질을 사용하여 인쇄되는 인쇄 전자를 이용함에 의한 의료 시험 장치 분석법, 장치 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인쇄 방법에 의해 제작된 본 발명의 트랜지스터, 레지스터, 커패시터, 다이오드, 인터커넥터 및 기타 관련 전자기기를 포함한다. 본 발명에서 유용한 인쇄 방법 중에 원자층 증착, 증기 증착, 사출 인쇄, 롤투롤 인쇄 및/또는 스크린 인쇄가 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 그러므로 고 용량 출력 시스템을 이용함에 의한 이들 성분을 인쇄하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 예를 들어, 잉크 기재 롤투롤 인쇄는 제조 비용을 절감하고 이들 장치의 전체 사용을 단순화함에 의해 본 발명의 전자 부품을 수백만 인쇄할 수 있다.
본 발명의 목적은 샘플과 혼합하기 전에 증폭시약과 혼합된 하나 이상의 pH 인디케이터 염료를 제공하는 것이다. 샘플을 첨가한 후 증폭반응이 있을 때, pH 변화는 pH 인디케이터 염료의 색상 변화를 야기한다. 색상 변화는 DNA 중합효소 또는 핵산이 아닌 수소 이온에 투과성인 고체 매트릭스에 염료가 고정되었을 때 육안으로 훨씬 더 용이하게 볼 수 있다. 차동 투과성으로 인하여, 반응의 억제 위험의 증가 없이 고체 매트릭스 내에서 염료 농도의 증가에 의해 광학 밀도를 증가시키는 것은 가능하다. pH 인디케이터는 입자 또는 입자에 고정될 수 있다. 입자의 크기는 염료 또는 색상의 선택에 의해 제한되지 않는다. 입자의 크기는 오로지 반응 용기 또는 조건의 선택에 관련된다. 염료는 또한 증폭반응으로의 간섭을 최소화하도록 용기의 표면 또는 필름상에 고정시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 또한 예를 들어, 핵산 증폭을 검출 또는 모니터하기 위해 사용된 pH 민감성 염료를 제공하는 것이다. 염료는 비드 또는 스트립과 같은 삼차원 객체 상에서 용액으로, 또는 용기 또는 구획 또는 이의 조합으로 발견될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 그러므로, 인쇄 전자 장치 또는 비색 메커니즘에 의해 관측될 수 있는 pH 또는 시각 신호를 생성하는 측방 유동 플랫폼을 제공하는 것이다. 이 목적은 적어도 3 이상의 방식의 조합으로 달성된다. 한 방식은 비색 매질(색상 변화 또는 가시적이됨)의 사용을 통해 인쇄 전자 광전도체를 검출하는 것이다. 또 다른 방식은 상이한 전압 출력을 초래하는 인쇄 전자 센서(센서로서 기록된 변화는 상이한 pH에 노출됨)를 통해; 및 통합 디스플레이 유닛(들) 상의 결과의 디스플레이를 초래하는 인쇄 전자 센서(센서로 기록된 변화는 상이한 pHs에 노출됨)의 사용이다. 판독은 초기 베이스라인에서 일정 기간에 걸쳐 취하여진다. 그 후, 변화를 기록하고 관측은 화학 또는 생물학적 반응에 의해 영향을 받는 임계 pH 변화로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 그러므로 인쇄 전자 장치에 의해 관측되는 pH 또는 시각적 신호를 생성하는 뉴클레오티드 검출 플랫폼(정량적 및/또는 정성적 검출)을 제공하는 것이다. 이러한 플랫폼상에서 사용된 증폭 방법은 다른 것들 중에서 등온 또는 PCR이며, 하기 세 방법 또는 그 이상의 조합에 의해 달성된다:
1) 색상 메트릭 매질(예컨대 pH 염료)(색상 변화 또는 가시적이 됨)은 인쇄 전자 광전도체에 의해 검출된다; 2) 상이한 전압 출력을 초래하는 임피던스 인쇄 전자 센서(센서로서 임피던스 변화는 상이한 pH에 노출됨); 및/또는 3) 통합 디스플레이 유닛 상에서 결과의 디스플레이를 초래하는 임피던스 인쇄 전자 센서(센서로서 임피던스 변화는 상이한 pH에 노출됨).
본 발명의 목적 중의 하나는 장치의 전자 시스템 부분이 유기 반도체 물질 또는 무기 물질을 사용하여 인쇄되는 인쇄 전자를 이용함에 의한 의료 시험 장치 분석법, 장치 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 센서로서 기능 화학/유기 분야 트랜지스터를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 컨트롤러로서 기능적인 인쇄 가능한 검출 회로,뿐만 아니라 볼 수 있는 형태의 결과의 판독기를 제공한다.
또한, 본 발명은 PIT 레벨에 따라 전기 전도성을 변화시키는 인쇄가능한 성분 및 물질을 사용함으로써 프로그램 가능한 간격 타이머(PIT)를 측정하는 센서 장치를 제공한다.
본 발명에서 유용한 유기 물질은 폴리아닐린, 폴리(3-헥실티오펜), 펜타센, 폴리트리아릴아민, 5',5-비스-(7-도데실-9H-플루오렌-2-일)-2,2'-비티오펜, 폴리에틸렌, 나프탈레이트, 및/또는 폴리(4,4' 디데실비티오펜-코-2,5-티에노[2,3-b] 티오펜)과 같은 물질을 포함한다. 본 발명에서 유용한 무기 물질은 탄타늄 펜톡시드, 실버 클로라이드, 실버 페이스트, 규소, 이산화규소, 질화규소, 산화알루미늄 및/또는 기타 광물 반도체, 금속 및 금속 산화물을 포함한다. 또한, 나노입자, 나노튜브 및/또는 그래핀은 본 발명에서 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 인쇄 방법에 의해 제작된 본 발명의 트랜지스터, 레지스터, 커패시터, 다이오드, 인터커넥터 및 기타 관련 전자기기를 포함한다. 본 발명에서 유용한 인쇄 방법 중에 원자층 증착, 증기 증착, 사출 인쇄, 롤투롤 인쇄 및/또는 스크린 인쇄가 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 그러므로 고 용량 출력 시스템을 이용함에 의한 이들 성분을 인쇄하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 예를 들어, 잉크 기재 롤투롤 인쇄는 제조 비용을 절감하고 이들 장치의 전체 사용을 단순화함에 의해 본 발명의 전자 부품을 수백만 인쇄할 수 있다.
또한, 본 발명은, 경량화되는 장점을 가지며, 성분에 가요성 향상을 제공한다. 가요성 센서는 이러한 장치의 측방 유동 스트립과 양호한 접촉을 제공하지만, 이러한 장치의 막 구조에 잠재적인 손상을 방지한다. 더욱이, 인쇄 전자의 실제 중량이 전형적인 인쇄 회로 판(PCB) 부품,(이들은 인쇄 회로 판 및 이산 부품 예컨대 패키지 로직 및 메모리 칩, 레지스터, 인덕터, 및 커패시터를 포함한다)보다 매우 더 적기 때문에, 측방 유동 스트립은 잠재적인 손상으로부터 더 잘 보호된다.
본 발명은 시이트와 같은 단일 시스템으로 센서를 통합한다. 이와 같이, 일회용 시스템은 전기화학 전이를 통합함에 의해 원하는 특정 물질로 중단하도록 구성될 수 있다. 또한, 전자 신호는 그 후 본원에서 제공된 숫자 값을 심지어 더 잠재적으로 디스플레이하여, 증폭 및 탈코딩될 수 있다.
그러므로 본 발명은 인쇄가능한 전자 센서 시스템, 트랜지스터, 감지 트랜지스터, 제어 회로, 신호 처리 회로, 디스플레이 회로 및 임의로, 배터리를 포함하며 많은 부품의 사용을 제거하는 방식으로 인쇄한다.
본 발명의 실시양태는 모니터로 인쇄된 로직 회로 및 일정 기간에 걸쳐 센서로부터의 전기 신호이다.
그러므로, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 또 다른 실시양태는 pH 인디케이터 방법이며, 여기에서 샘플 예를 들어, 핵산 증폭은 기판상의 미세유체 채널을 통해 유동하며, 채널의 길이를 따라 연속적으로 반복하기 위한 적당한 기판 또는 베이스에 제공된 온도 구역을 통해 연속적으로 통과하여 유동한다. pH 인디케이터 염료는 모든 PCR 및 본원에서 기술된 측방 유동 장치와 같은 다른 실시양태에 통합될 수 있다. 이 방법, 장치 및/또는 키트를 사용할 때 관측된 판독은 색상 변화, 초기에 없던 라인이 라인 또는 다른 패턴으로 출현, 흰색 배경 상에서 라인의 출현 또는 음성 효과를 나타내는 라인의 사라짐, 다른 관측 사이에서 반응 결과 판독을 나타낸다.
상기 설명에서 열순환으로 설계된 PCR 시스템을 일반적으로 설명하지만, 다양한 등온 핵산 증폭 기술은 공지되어 있다, 예컨대, 이러한 기술을 사용한 단일 가닥 변위 증폭(SDA), 및 DNA 또는 RNA 증폭은 본 발명에 따라 동등하게 모니티될 것이다.
본 발명의 목적은 샘플과 혼합하기 전에 증폭시약과 혼합된 하나 이상의 pH 인디케이터 염료를 제공하는 것이다. 샘플을 첨가한 후 증폭반응이 있을 때, pH 변화는 pH 인디케이터 염료의 색상 변화를 야기한다. 색상 변화는 DNA 중합효소 또는 핵산이 아닌 수소 이온에 투과성인 고체 매트릭스에 염료가 고정되었을 때 육안으로 훨씬 더 용이하게 볼 수 있다. 차동 투과성으로 인하여, 반응의 억제 위험의 증가 없이 고체 매트릭스 내에서 염료 농도의 증가에 의해 광학 밀도를 증가시키는 것은 가능하다. pH 인디케이터는 입자 또는 입자에 고정될 수 있다. 입자의 크기는 염료 또는 색상의 선택에 의해 제한되지 않는다. 입자의 크기는 오로지 반응 용기 또는 조건의 선택에 관련된다. 염료는 또한 증폭반응으로의 간섭을 최소화하도록 용기의 표면 또는 필름상에 고정시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 또한 예를 들어, 핵산 증폭을 검출 또는 모니터하기 위해 사용된 pH 민감성 염료를 제공하는 것이다. 염료는 비드 또는 스트립과 같은 삼차원 객체 상에서 용액으로, 또는 용기 또는 구획 또는 이의 조합으로 발견될 수 있다.
비드의 사용은 유리하게 사용될 수 있다. 비드는 염료, 예컨대 실리카, 폴리스티렌, 아가로스 또는 덱스트란의 부착을 위한 적당한 물질로부터 합성된 구형 입자이다. 입자는 코어-쉘 구조를 사용하여 합성될 수 있으며 따라서 입자는 상자성 물질 및 염료 히드로겔 양자에 의해 형성될 수 있다. 실리카로부터의 비드는, 예를 들어, 용액 내에 일정한 위치에서 비드를 유지하는 것이 용이하도록 또는 반응 바이알을 반전하여 용액으로부터 비드를 이동하도록 고밀도를 갖는다.
본 발명은 또한 용액 중의 pH 민감성 염료의 사용 또는 비드와 같은 하나 이상의 3D 구조상에서 고정화를 통해 이들 분석 결과를 시각화하는 한 방식으로서 비색 감지의 유리한 용도를 갖는다. 또한, 시스템은 반응 쳄버 또는 용기 내에서 일어날 수 있으며, 한편 상기 조합도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 그러므로, 인쇄 전자 장치 또는 비색 메커니즘에 의해 관측될 수 있는 pH 또는 시각 신호를 생성하는 측방 유동 플랫폼을 제공하는 것이다. 이 목적은 적어도 3 이상의 방식의 조합으로 달성된다. 한 방식은 비색 매질(색상 변화 또는 가시적이됨)의 사용을 통해 인쇄 전자 광전도체를 검출하는 것이다. 또 다른 방식은 상이한 전압 출력을 초래하는 인쇄 전자 센서(센서로서 기록된 변화는 상이한 pH에 노출됨)를 통해; 및 통합 디스플레이 유닛(들) 상의 결과의 디스플레이를 초래하는 인쇄 전자 센서(센서로 기록된 변화는 상이한 pHs에 노출됨)의 사용이다. 판독은 초기 베이스라인에서 일정 기간에 걸쳐 취하여진다. 그 후, 변화를 기록하고 관측은 화학 또는 생물학적 반응에 의해 영향을 받는 임계 pH 변화로 이루어진다.
본 발명의 장치의 바람직한 실시양태에서, 센서는 감이온 전계 효과 트랜지스터(ISFET)이다. 이러한 ISFET는 감지 PIT 및 모니터 pH 값에 사용된다. OFET(유기 전계 효과 트랜지스터)도 또한 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 그러므로 인쇄 전자 장치에 의해 관측되는 pH 또는 시각적 신호를 생성하는 뉴클레오티드 검출 플랫폼(정량적 및/또는 정성적 검출)을 제공하는 것이다. 이러한 플랫폼상에서 사용된 증폭 방법은 다른 것들 중에서 등온 또는 PCR이며, 하기 세 방법 또는 그 이상의 조합에 의해 달성된다:
1) 색상 메트릭 매질(예컨대 pH 염료)(색상 변화 또는 가시적이 됨)은 인쇄 전자 광전도체에 의해 검출된다; 2) 상이한 전압 출력을 초래하는 임피던스 인쇄 전자 센서(센서로서 임피던스 변화는 상이한 pH에 노출됨); 및/또는 3) 통합 디스플레이 유닛 상에서 결과의 디스플레이를 초래하는 임피던스 인쇄 전자 센서(센서로서 임피던스 변화는 상이한 pH에 노출됨).
본 발명의 ISFET의 실시양태에서, 장치는 대조 구역, 시험 구역 및 배경 구역 사이에서 어떤 활동이 일어나는지 모니터하기 위해 차동 측정으로 인쇄된 회로를 갖는다.(도 1 참조).
본 발명의 임의의 특징은 가요성 기판 또는 인쇄 회로 판에 탑재된 가요성 센서 부품 및 ASIC 칩을 포함하는 하이브리드 방법을 사용한다.
본 발명은, 경량화되는 장점을 가지며, 성분에 가요성 향상을 제공한다. 가요성 센서는 이러한 장치의 측방 유동 스트립과 양호한 접촉을 제공하지만, 이러한 장치의 막 구조에 잠재적인 손상을 방지한다. 더욱이, 인쇄 전자의 실제 중량이 전형적인 인쇄 회로 판(PCB) 부품,(이들은 인쇄 회로 판 및 이산 부품 예컨대 패키지 로직 및 메모리 칩, 레지스터, 인덕터, 및 커패시터를 포함한다)보다 매우 더 적기 때문에, 측방 유동 스트립은 잠재적인 손상으로부터 더 잘 보호된다.
본 발명은 시이트와 같은 단일 시스템으로 센서를 통합한다. 이와 같이, 일회용 시스템은 전기화학 전이를 통합함에 의해 원하는 특정 물질로 중단하도록 구성될 수 있다. 또한, 전자 신호는 그 후 본원에서 제공된 숫자 값을 심지어 더 잠재적으로 디스플레이하여, 증폭 및 탈코딩될 수 있다.
도 1: 이 도면은 시험 구역(ISFET1) 및 배경 구역(ISFET2), 대조 구역( ISFET3)에서의 센서 간이 신호 차이를 측정하기 위한 기본적인 차동 모드 회로를 제공하는 것이다.
도 2: 시험 구역에서 pH 변화를 모니터링하는 본 발명의 설계.
도 3: 색상 변화에 의해 모니터된 효소 의존 pH 값.
도 4: 본 발명의 pH 인디케이터, 여기에서(1)은 샘플 패드이고, (2)는 컨쥬게이트 패드이며, (3)은 크로마토그래피 막이고, (4)는 시험 라인이며, (5)는 대조 라인이고,(6)은 흡수 패드이며 (8)은 지지체 물질이다.
도 5A: 이 도면은 개별 성분을 이용한 선행 시스템을 나타낸다.
도 5B: 이 도면은 단지 몇몇 인쇄 단계로 전체 시스템을 만들기 위한 물질의 사용을 나타낸다.
도 6. pH 범위에 상응하는 각 염료 필름의 색상이다.
도 7. 사진은 2C19 유전자형에 대한 LAMP 반응에서 pH 필름의 색상 반응을 도시한다.
도 8. K1 화학물질은 필름, 셀룰로오스 입자 및 가용성 분자의 형태로 시험된다.
도 9. 사진은 LAMP 반응 전에 각각의 튜브에서 염료의 색상을 나타낸다.
도 10. 이 사진은 증폭이 상단 행의 램프 반응에서 일어난 튜브는 염료의 색상 변화가 있는 반면 하단 행의 램프 반응에서 증폭이 없는 튜브는 염료의 색상 변화가 없음을 나타낸다.
도 11A 및 B. 이것은 증폭 검출 시험에 대한 두 개의 다른 필름을 나타낸다.
도 12. 브로모티몰 블루는 색상 변화를 생성하지 않았으며, pH는 변화되지 않는다.
도 13. 이 도면은 예시적인 센서 및 pH 시험 결과를 설명한다.
도 14. 각 튜브의 염료 색상은 LAMP 반응 전에 분홍색이다.
도 15. 염료 색상은 그 후 튜브 1 내지 7에 대하여 황색으로 변하고, 튜브 8-10은 분홍색으로 남아 있는다.
도 16. 이 차트는 양성 및 음성 차별 반응을 나타낸다.
도 17. 이들은 레인 1 내지 7에서 LAMP 증폭을 나타내는 아가로스 전기영동 사진이다.
도 18. 이것은 DNA에 관하여 양성 또는 음성인 반응 전의 염료 색상을 나타낸다.
도 19. 이것은 DNA에 관하여 양성 또는 음성인 반응 후의 염료 색상을 나타낸다..
도 20. 이것은 반응 전에 염료 색상에 대한 전혈 효과이다.
도 21. 이것은 반응 후의 전혈 효과이다.
도 22. 이것은 용액을 진탕하여 염료를 제거한 후 고정된 염료의 색상을 나타낸다.
도 23. 이것은 아가로스 전기영동을 사용한 각각의 튜브로부터의 LAMP 반응이다.
도 24. 이것은 염료의 존재로 PCR 반응의 결과를 나타낸다.
도 25. 이것은 가교 중합체 매트릭스에 물리적 포획 및 화학적 연결 pH 인디케이터 염료의 개략도이다.
도 26. 이것은 히드로겔 슬래브가 사용될 때 반응 대 비반응 간의 색상 차이를 나타낸다.
도 27. 이것은 2mm 직경의 셀룰로오스 아세테이트 볼 상에서 pH 반응성 염료 컨쥬게이트된 폴리우레탄의 히드로겔의 예를 나타낸다.
본 발명의 한 장치는 도 2에서 설명된 바와 같이 컨쥬게이션 패드, 흡수 패드, 시험 라인 및 대조 라인을 포함한다. 샘플이 컨쥬게이션 패드 상에 로딩될 때, 유두력으로 인하여, 샘플은 시험 라인 쪽으로 이동한다. 시약은 컨쥬게이션 패드(이것은 샘플 수집 튜브일 수 있다) 내에 있다. 중간에서, 두 개는 인쇄 모니터에 의해 시험 라인 및 대조 라인에서 분리된다. 분석물질이 존재할 때, 면역 착물이 시험 라인에서 형성된다. 대조 라인은 활성 시약이 존재함을 나타낸다. 임의로, 스트립은 크로마토그래피 막을 포함할 수 있다.
전자기기의 인쇄는 잘 문서화되어 있지만 진단 장치는 그렇지 않다. 전자 기기의 인쇄를 위해 사용되는 기술 중 일부는, 유기 LED 디스플레이, 가요성 터치 스크린, RFID 수퍼 커패시터 및 광발전 막을 포함한다. 디스플레이 부분으로서 사용된 유기 LED는 상이한 색상 또는 글꼴로 예/아니오 대답을 나타낼 수 있다.
스마트 패키징은 또한 OLED로서 사용될 수있다. 본 발명의 장치는 OLED를 이용하여 소정 메시지를 나타낸다.
RFID는 재고 관리 및 위조 방지 방식으로 사용될 수 있다. 인쇄 전자의 통합은 위조 방지를 허용한다(예를 들어, 장치가 전혀 사용되지 않았거나 또는 훔치거나 장치가 승인되지 않은 위치에서 사용되지 않았는지를 확인하기 위한 로컬/원격 데이터베이스에 대한 장치의 일련의 코드 검증은 본 발명에 의해 달성될 수 있다). 본 발명에서, 장치는 검출하여야 할 타겟이 무엇인지를 알고, 결과와 함께 타겟을 디스플레이한다.
예로서, 인쇄 전자에 대한 인터커넥터는 전도성 잉크로서 사용된 은을 사용할 수 있다. 본 발명의 회로는 전도성 잉크, 반도체 잉크, 분할기, 콤퍼레이터, NOT 게이트 및 증폭기를 포함하는 도핑 및 유전 물질을 사용한다.
본 실시예에서 사용된 모든 프라이머는 통합 DNA Technologies 또는 Thermo Fisher에 의해 합성된다. 반응물 내에 pH 염료의 존재는 증폭 반응에 대한 최소 효과를 야기하므로, 증폭 시약의 조성을 변화시킬 필요는 없다. 단지 하나의 예외는 데옥시뉴클레오티드가 마그네슘 이온과 착물을 형성하도록 예컨대 1.5mM 또는 바람직하게는 2mM 이상으로 마그네슘 이온(Mg2+)이 충분히 높아야 한다는 것이다.
LAMP는 DNA에 하이브리드화 하기 위하여 및 특정 관심 서열의 타겟을 위하여 프라이머를 사용하는 이중 가닥 DNA의 증폭의 과정이다. 증폭은 중합효소의 가닥-전위 활성, 및 타겟 서열과 새롭게 합성된 가닥의 지수 증폭에 의하여 외부 프라이머에 의해 후에 대체되는 내부 프라이머로부터 템플레이트 DNA 확장으로 하이브리드화를 형성하는 프라이머에 의해 달성된다.
프라이머, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 반응 완충액, 인디케이터 염료, 및 중합효소는, 비 특이적 반응을 방지하기 위하여 마지막 단계에서 첨가되는 중합 효소를 제외하고, 특정한 단계의 순서 없이 예비 혼합된다. 동결건조되지 않는 제형을 사용하는 반응을 위하여, 상기 시약은 비특이적 반응을 방지하기 위하여 냉장 된 박스 상에서 어셈블 되어야 한다. 샘플 DNA, 예컨대 정제된 인간 게놈 DNA, 동물 DNA, 식물 DNA, 신선한 인간 전혈, 람다 DNA, pUC19 플라스미드, 상이한 바이러스, 천연 또는 합성 기원의, 모든 핵산 세그먼트, 또는 키메라 인공 핵산 유사체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA) 및 합성 염기, 또는 기타 핵산 템플레이트 예컨대 RNA는 용기를 밀봉하고, 가열이 필요한 경우 용기를 가열 블록에 놓기 전에 마지막 단계에서 첨가한다. 증폭 반응의 종료 점에서, 반응 용기는 육안 또는 간단한 카메라로 관측된다.
본 발명을 형성하는 기타 타겟은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 리포단백질 예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 당단백질, 리포단백질, 예컨대 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 아밀로이드 베타 및 HIVp24 단백질의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 사카라이드 중합체 예컨대 세균 캡슐형 폴리사카라이드 및 리포폴리사카라이드 예컨대 엔도톡신이 본 발명에서 사용된다.
본 발명의 방법, 장치 및 키트를 사용하여 진단된 특정 바이러스 및/또는 세균 질환은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 다른 것들 중에서 B형 간염(HBV), C형 간염(HCV), 헤르페스 바이러스, HIV, 인유두종 바이러스(HPV), 에볼라 바이러스, 새우의 흰 반점 증후군, 고양이 백혈병 바이러스를 포함한다. 이들 진단과 관련되고 본 발명의 장치, 키트 및 방법을 형성하는 단백질은 재조합 핵단백질, 자이르(Zaire) 에볼라 바이러스의 당단백질, 및 또한 S-유전자 단백질; B형 간염 코어 멀티에피토프; 안티-HCV 면역글로불린 G 및 재조합 B 바이러스 당단백질을 포함한다.
본 발명에 의해 진단되는 세균성 질환은 매독, 클라미디아 및 임질을 포함한다.
동결건조된 시약이 사용될 때, 첫 번째 단계는 샘플 타겟을 첨가하기 전에 물과 건조된 시약을 재현탁 시키는 것이다. 단계의 나머지는 동결 건조되지 않은 반응에서 기술된 것과 동일한 순서를 따른다.
본 예는 또한 비색 방법 측정 및 전자 인쇄 방법을 사용함에 의해 pH 변화를 측정하기 위한 장치, 키트 및 방법을 또한 제공한다.
PCR 모니터링을 위한 통합 액츄에이터(히터)가 있는 규소로 제작된 나노리터 반응기 챔버가 예를 들어 문헌 『Iordanov et al. 'Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication, IEEE(2004) 229-232(참고로 그의 전체를 본원에서 통합함)』에 존재한다. Iordanov 등에 의해 언급된 바와 같이, 상술한 논문에서, 미처리된 규소 및 규소 관련 표준 물질은 Taq 중합 효소의 억제제이다. 따라서, 규소 또는 규소 관련 물질, 예를 들어 규소 게르마늄 또는 염색된 규소(이하, "규소")가 핵산 증폭을 위한 챔버 또는 채널의 제작에 이용될 때, SU8, 폴리메틸-메타크릴레이트(PMMA), Perspex™ 또는 유리와 같은 규소에 의해 중합 효소 효능의 감소를 방지하는 물질로 피복되는 것이 일반적일 것이다.
PCR을 위한 마이크로제작된 규소-유리 칩도 또한 Shoffner 등에 의해 기술된다. 『핵 Acid Res.(1996) 24, 375-379』은 그의 전체를 참고로 본원에서 통합한다. 규소 칩은 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 제작하고 115μm의 깊이로 에칭하였다. Pyrex™ 유리 커버는 각각의 규소 칩의 상부에 배치하고 규소와 유리를 결합시킨다. 이들은 본 발명에서 사용하는 표면 중 소수의 예이다. 기타 산화 실리콘을 포함한다.
대안으로서, PCR 모니터링을 위한 샘플이 미세유체 장치의 채널 또는 쳄버를 통해 유동할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 샘플은 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장의 PCR 단계에 적합한 상이한 온도 구역을 통해 연속적으로 통과하는 채널 또는 쳄버를 통해 유동할 수 있다.
그러므로, 본 방법을 수행하기 위한 한 실시양태에서, 핵산 증폭을 위한 샘플은 기판상의 미세 유체 채널을 통해 유동하고, 그 유동으로 채널 길이를 따라 연속 반복에 적당한 기판 또는 베이스에 제공된 온도 구역을 연속적으로 통과한다. pH 인디케이터 염료는 본원에서 상술한 PCR 실시양태 모두에서 통합될 수 있다.
상기에서 열순환을 달성하기 위해 설계된 PCR 시스템을 일반적으로 설명하였지만, 다양한 등온 핵산 증폭 기술이 알려져 있으며, 예컨대, 단일 가닥 변위 증폭(SDA), 및 이러한 기술을 사용한 DNA 또는 RNA 증폭이 동등하게 본 발명에 따라 모니터 될 수 있다.
LAMP는 DNA에 하이브리드화 하기 위하여 및 특정 관심 서열의 타겟을 위하여 프라이머를 사용하는 이중 가닥 DNA의 증폭의 과정이다. 증폭은 중합효소의 가닥-전위 활성, 및 타겟 서열과 새롭게 합성된 가닥의 지수 증폭에 의하여 외부 프라이머에 의해 후에 대체되는 내부 프라이머로부터 템플레이트 DNA 확장으로 하이브리드화를 형성하는 프라이머에 의해 달성된다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제공되는 것이며 이것으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
pH 검출 장치 및 그 장치를 사용하는 방법은 신호 강도를 계산하기 위한 회로소자를 제어하는 pH 민감성 센서 및 디스플레이 픽셀을 가지며, 모두 장치의 전자기기의 롤투롤 인쇄 또는 스크린 인쇄를 사용한다. 이들은 가요성 플라스틱과 같은 유전 물질 상에 인쇄된다. 장치의 제조는 장치 손상으로 인한 낭비를 방지하고 높은 생산량으로 제조된다. 이 장치는 라인 관측이 반응 결과를 나타내는 LFA로서 유용하다.
실시예 2
실시예 1의 인쇄 전자는 pH 민감성 센서, 제어 회로(신호 강도를 계산함) 및 디스플레이 픽셀 (이들 모두 롤투롤 또는 스크린 인쇄를 통해 인쇄됨)과 함께 LFA 스트립의 상부에 배치된다. 이들 전자 부품은 가요성 플라스틱과 같은 유전 물질상에 인쇄된다.
특히, pH를 측정하기 위하여, 인쇄 전자 시스템은 크로마토그래피 매질과 접촉된다. pH의 변화는 10분 및 30분에서 측정하여 pH 변화의 속도로서 모니터된다. 다른 것들 중에서, 접착제가 매개층으로서 첨가될 수 있다.
실시예 3
인쇄 센서도 또한 인쇄 배터리, 또는 임의의 특징으로서, 회로에 전력을 공급하는 버튼 배터리를 포함한다. 배터리 물질의 선택은 화재 위험 또는 화학적인 위험 성질을 갖지 않아야 한다. 바람직하게는, 배터리는 자체 시험 기능을 포함한다.
인쇄 센서는 결과(예/아니오/실패, 등)를 나타내는 디스플레이 모니터(예컨대 OLED 유기 발광 다이오드)를 함유한다. 이러한 인쇄 센서는 간단한 계산을 하는 능력을 갖는다. 임의의 요소로서, 센서는 환자 정보 및 결과를 기지국(예컨대 노트북 PC, 맞춤형 기지국, 터치패드, 스마트폰 또는 이의 조합)에 업로드하는 통신 모듈(예컨대 RFID)을 갖는다.
또 다른 임의 요소는 특정 장치가 환자의 ID로 "점화(burned)"되도록, 기지국(예컨대 노트북 PC, 맞춤형 모바일 유닛, 터치패드, 스마트폰 또는 이의 조합)으로부터 환자의 정보를 다운로드 할 수 있는 센서이다. 이들 통신은 임의로 유선 시스템 또는 무선 시스템 중 하나로 암호화된다.
모든 센서 성분은 연속 인쇄 제조 공정(예컨대 롤투롤)으로 통합된다. 센서 어셈블리 및 LFA는 별개로 만들어진다.
또한, 온도 센서는 주위 온도가 결정된 허용 범위 내에 있지 않은 경우, 장치의 사용을 보상/조정/방지하기 위하여 존재한다.
PCR 모니터링을 위한 통합 액츄에이터(히터)가 있는 규소로 제작된 나노리터 반응기 챔버가 예를 들어 문헌 『Iordanov et al. 'Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication, IEEE(2004) 229-232(참고로 그 전체가 본원에 포함된)』에 존재한다. Iordanov 등에 의해 언급된 바와 같이, 상술한 논문에서, 미처리된 규소 및 규소 관련 표준 물질은 Taq 중합 효소의 억제제이다. 따라서, 규소 또는 규소 관련 물질, 예를 들어 규소 게르마늄 또는 염색된 규소(이하, "규소")가 핵산 증폭을 위한 챔버 또는 채널의 제작에 이용될 때, SU8, 폴리메틸-메타크릴레이트(PMMA), Perspex™ 또는 유리와 같은 규소에 의해 중합 효소 효능의 감소를 방지하는 물질로 피복되는 것이 일반적일 것이다.
PCR을 위한 마이크로제작된 규소-유리 칩도 또한 Shoffner 등에 의해 기술된다. 『Nucleic Acid Res.(1996) 24, 375-379』은 그의 전체가 참고로 본원에 포함된다. 규소 칩은 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 제작하고 115μm의 깊이로 에칭하였다. Pyrex™ 유리 커버는 각각의 규소 칩의 상부에 배치하고 규소와 유리를 결합시킨다. 이들은 본 발명에서 사용하기 위한 표면의 일부 예이다. 기타 산화된 실리콘을 포함한다.
대안으로서, PCR 모니터링을 위한 샘플이 미세유체 장치의 채널 또는 챔버를 통해 유동할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 샘플은 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장의 PCR 단계에 적합한 상이한 온도 구역을 통해 연속적으로 통과하는 채널 또는 챔버를 통해 유동할 수 있다.
그러므로, 본 방법을 수행하기 위한 한 실시양태에서, 핵산 증폭을 위한 샘플은 기판상의 미세 유체 채널을 통해 유동하고, 그 유동으로 채널 길이를 따라 연속 반복에 적당한 기판 또는 베이스에 제공된 온도 구역을 통해 연속적으로 통과한다. pH 인디케이터 염료는 상술한 PCR 실시양태 모두에서 통합될 수 있다.
상기에서 열순환을 달성하기 위해 설계된 PCR 시스템을 일반적으로 설명하였지만, 다양한 등온 핵산 증폭 기술이 공지되어 있으며, 예컨대, 단일 가닥 변위 증폭(SDA), 및 이러한 기술을 사용한 DNA 또는 RNA 증폭이 동등하게 본 발명에 따라 모니터 될 수 있다.
본 실시예에서 사용된 모든 프라이머는 통합 DNA Technologies 또는 Thermo Fisher에 의해 합성된다. 반응물 내에 pH 염료의 존재는 증폭 반응에 대한 최소 효과를 야기하므로, 증폭 시약의 조성을 변화시킬 필요는 없다. 단지 하나의 예외는 데옥시뉴클레오티드가 마그네슘 이온과 착물을 형성하도록 예컨대 1.5mM 또는 바람직하게는 2mM 이상으로 마그네슘 이온(Mg2+)이 충분히 높아야 한다는 것이다.
LAMP는 DNA에 하이브리드화 하기 위하여 및 특정 관심 서열의 타깃을 위하여 프라이머를 사용하는 이중 가닥 DNA의 증폭의 과정이다. 증폭은 중합효소의 가닥-변위 활성, 및 타깃 서열과 새롭게 합성된 가닥의 지수 증폭에 의하여 외부 프라이머에 의해 나중에 대체되는 내부 프라이머로부터 템플레이트 DNA 확장으로 하이브리드화를 형성하는 프라이머에 의해 달성된다.
프라이머, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 반응 완충액, 인디케이터 염료, 및 중합효소는, 비 특이적 반응을 방지하기 위하여 마지막 단계에서 첨가되는 중합 효소를 제외하고, 특정한 단계의 순서 없이 예비 혼합된다. 동결건조되지 않는 제형을 사용하는 반응을 위하여, 상기 시약은 비특이적 반응을 방지하기 위하여 냉장 된 박스 상에서 어셈블 되어야 한다. 샘플 DNA, 예컨대 정제된 인간 게놈 DNA, 신선한 인간 전혈, 람다 DNA, pUC19 플라스미드, 또는 기타 핵산 템플레이트는 용기를 밀봉하고, 가열이 필요한 경우 용기를 가열 블록에 놓기 전에 마지막 단계에서 첨가한다. 증폭 반응의 종료 점에서, 반응 용기는 육안 또는 간단한 카메라로 관측된다.
동결건조된 시약이 사용될 때, 첫 번째 단계는 샘플 타깃을 첨가하기 전에 물과 건조된 시약을 재현탁 시키는 것이다. 나머지 단계들은 동결 건조되지 않은 반응에서 기술된 것과 동일한 순서를 따른다.
실시예 4
무기 전계 효과 트랜지스터(FET)와 유사하게, OFET는 소스, 드레인 및 게이트 전극을 갖는다. 소스 및 드레인 전극 사이의 채널 전류는 전계 효과 도핑으로 인한 게이트 전압에 의해 조절된다. 규소 FETs와 비교하여, OFETs는 비교적 더 낮은 캐리어 이동성 및 안정성을 나타내지만 가요성, 생체 적합성, 큰 면적 및 용액 가공성의 측면에서 더 우수한 성능을 나타낸다. 그러므로 OFETs는 일회용 센서에서의 적용에 적당하다.
표 1은 OFET 기반의 화학 및 생물학적 센서의 예를 요약한다.
표 1
Figure pct00001
실시예 5
본 발명의 진단 키트의 예는 크로마토그래피 매질을 포함하는 측방 유동 분석 장치를 포함한다. 이 크로마토그래피 매질은:(a) 검출 구역의 상류에 위치한 샘플 로딩 구역;(b) 샘플 로딩 구역 및 검출 구역 사이에 위치한 리포팅 캐리어 구역 (여기에서, 리포팅 캐리어 구역은 분석물질과 착물을 형성할 수 있는 리포팅 캐리어를 포함한다. 본 발명의 리포팅 캐리어는 캐리어 및 하나 이상의 숙련된 효소 카세트를 포함한다. 숙련된 효소 카세트 또는 숙련된 효소는 속도가 효소 카세트당 1000/초 초과가 되도록 반응을 촉진하는 효소(들)의 어셈블리로서 정의된다. 그 값은 또한 효소학에서 Kcat 또는 회전율로 지칭된다); 및 (c) 검출 구역을 포함하며, 여기에서 검출 구역은 분석물질 및 인디케이터를 위한 캡처 성분을 포함한다. 샘플은 시험 샘플과 적용 구역에서 접촉되며, 여기에서 시험 샘플은 샘플 로딩 구역에서 검출 구역으로 및 검출 구역 밖으로 크로마토그래피 매질을 따라 리포팅 캐리어 구역을 통해 이동한다. 리포팅 캐리어를 함유하며 시험 샘플 내에서 분석 물질의 존재 또는 부재에 상응하는 검출 구역 내에서 인디케이터의 반응을 생성하는 숙련된 효소 분석물질의 존재에서 기판이 반응을 진행하는 검출 구역으로의 기판의 첨가는 이 장치로 달성된다.
실시예 6
본 발명의 진단 키트의 예는 크로마토그래피 매질에서 효소를 이용한 증폭 방법을 사용하여 분석물질의 존재 또는 부재를 검출한다. 분석물질은 항체 또는 항체- 유사물로 인지될 수 있는 항원과 같은 바이오마커이다. 이 실시예에서, 리포팅 캐리어는 분석물질 및 숙련된 효소에 결합하는 제1 항체를 갖는다. 캡처 성분은 제1 항체로부터의 상이한 에피토프에서 분석물질에 결합하는 제2 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 항체는 숙련된 효소에 공유 가교결합된다.
리포팅 캐리어는 스트렙타비딘 및 비오티닐화 숙련된 효소 및 비오티닐화 항체를 포함한다. 제1 항체는 결합되거나 또는 비공유 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 통해 숙련된 효소와 연관된다.
실시예 7
본 발명의 또 다른 예에서, 분석물질은 핵산 서열이다. 이 실시예에서 리포팅 캐리어는 제1 핵산과 연관된 숙련된 효소인 타깃 핵산 서열의 일부분에 하이브리드화하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 제1 핵산은 숙련된 효소에 공유 가교결합된다. 리포팅 캐리어는 스트렙타비딘 및 비오티닐화 숙련된 효소 및 비오티닐화 제1 핵산을 포함한다. 제1 핵산은 비공유 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 통해 숙련된 효소에 연관된다.
리포팅 캐리어는 본 발명의 한 실시예에서 HIV의 p24 단백질에 결합된다. 또 다른 적용에서, 리포팅 캐리어는 HIV 핵산에 결합한다. 기판은 장치의 일부로서 액체 용액이다. 용액은 마지막 단계에서 스트립 상에 첨가될 것이다.
한 실시양태에서, 시험 라인(도 4에서 (4))은 또한 pH 색상 인디케이터도 포함한다. 라인의 색상(도 4에서 (4))은 분석물질의 존재에서 변화한다. C 라인(도 4에서 (5)) 상에서 동일한 pH 색상 인디케이터도 있다. 리포팅 캐리어의 존재하에 색상 변화. 실시양태의 예는 도 11에 나타낸다.
한 실시양태에서, pH 색상 인디케이터는 시험 및 대조 라인의 상부에 배치된 필름이다. 또 다른 실시양태에서, pH 색상 인디케이터는 시험 및 대조 라인의 위치에서 크로마토그래피 매질로 인쇄된다.
또 다른 실시양태에서, 기판 용액은 pH 인디케이터를 함유한다. 시험 라인(도 4에서 (4))의 색상은 pH 변화로 인하여 분석물질의 존재에서 나타난다. 대조 라인(도 4에서 (5))의 색상은 리포팅 캐리어의 존재에서 변한다. 반응의 예도 또한 도 2에 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 타깃은 인간 C형 간염 바이러스의 코어 단백질이다. 코어 단백질의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체는 리포팅 캐리어에 연결된다. 코어 단백질의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체는 크로마토그래피 매질의 검출 구역상에 고정된다. 개시된 방법은 적어도 0.5pg의 단백질 또는 그 이상을 검출한다. 단백질은 바이러스 단백질 예컨대 이것으로 제한되는 것은 아니지만 HIV, B형 간염(HBV), C형 간염(HBV), 인유두종 바이러스(HPV), 에볼라 바이러스, 헤르페스 바이러스, 예로서; 종양 단백질(전립선암에 대한 전립선 특이적 항원(PSA); 난소암에 대한 암 항원 125(CA 125); 갑상선 수질암에 대한 칼시토닌; 간암에 대한 알파-태아단백질(AFP); 및 생식 세포 종양, 예컨대 고환암 및 난소암에 대한 인간 융모성 고나도트로핀(HCG)); 심혈관 단백질, 예컨대 인간 심장 트로포닌 T 또는 I, 또는 폐 단백질, 간장 단백질, 신장 단백질 및 신경학적 단백질, 예컨대 아밀로이드 베타 단백질; 세균 단백질 예컨대 매독, 클라미디아 및 임질을 검출하기 위하여 사용되는 것들을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 타깃은 심근 경색에 대한 인간 심장 트로포닌 T 및/또는 심장 또는/및 트로포닌 I이다. 진단 키트는 신속한 측정을 위한 정량적 결과를 제공하는 인쇄 전자 센서 및 제어 회로를 포함한다. 키트의 민감도는 고감도 심장 트로포닌 I 분석을 위해 또한 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 전기센서는 일정 기간 동안 연속 적인 pH 판독을 생성하여 시간 의존성 pH 곡선을 생성한다. 검출의 예/아니오 대답은 시험 구역 또는 대조 구역을 제외한 상이한 시험 구역, 대조 구역, 및 크로마토그래피 매질 상의 다른 지점의 곡선을 비교함에 의해 임계 값에서 보인다. 유사하게, 반정량적 또는 정량적 측정은 시험/대조 구역을 제외한 크로마토그래피 매질 상과 시험 구역, 대조 구역, 및 또 다른 지점의 곡선을 비교하여 수행된다. 게다가, 반응의 차동 판독도 또한 시간의 지남에 따른 반응물의 진행을 모니터링 및 기록 할 때 기록된다.
실시예 8
Figure pct00002
도 6. 각 염료 필름의 색상은 pH 범위에 상응한다.(도 6)
K1 필름은 포타슘 1-히드록실-4-[4-(히드록시에틸술포닐)-페닐아조]-나프탈렌-2-술포네이트로 컨쥬게이트된 20마이크로미터 두께의 셀룰로오스 필름이다.
K2 필름은 4-[4-(2-히드록실에탄술포닐)-페닐아조]-2,6-디메톡시페놀로 컨쥬게이트된 20마이크로미터 두께의 셀룰로오스 필름이다.
K1 용액은 포타슘 1-히드록실-4-[4-(히드록시에틸술포닐)-페닐아조]-나프탈렌-2-술포네이트이다.
K1 입자는 셀룰로오스 미세입자 Avicel ® PH-101이다. 직경 50마이크로미터는 포타슘 1-히드록실-4-[4-(히드록시에틸술포닐)-페닐아조]-나프탈렌-2-술포네이트와 컨쥬게이트된다.
상이한 염료 형태를 사용한 검출:
K1 필름, K1 입자, 및 가용성 K1인 세 개의 상이한 형태의 K1 염료를 분석에 사용한다. 분석은 염료 형태의 상용성 및 LAMP 반응을 나타낸다. LAMP 반응은 p450 2C19 와일드 타입 프라이머 세트 및 K562 게놈 DNA를 사용하는 것으로 설정된다. 약 300 복제인 1ng의 K562는 반응 성분과 혼합한다. 염료는 반응 전에 각각의 튜브에 포함된다. 반응물은 30분 동안 63℃로 유지하고, 반응물의 색상을 관측한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
도 7
사진은 2C19 유전자형에 대한 LAMP 반응에서 pH 필름의 색상 반응을 나타낸다. 사진은 LAMP 반응 후에 찍은 것이다. 그래프에서 순서는 K1 필름 와일드타입(A) 또는 돌연변이(D); K1 분말 와일드타입(B) 또는 돌연변이(E); K1 용액 와일드타입(C) 또는 돌연변이(F)이다.
표 2는 제공된 LAMP 반응에서 K1 염료의 색상 값 및 pH 값을 요약한다.
표 2
Figure pct00005
Figure pct00006
도 8
K1 화학물질은 필름, 셀룰로오스 입자, 및 가용성 분자의 형태로 시험된다.(상기 도 8의 그래프 참조). 2C19 유전자형의 색상 변화는 색상 패널을 사용한 숫자로 전환된다. 차트는 pH 값 변화(출발 pH-종료pH) 및 색상 변화(출발 색상-종료 색상)를 나타낸다. 임계가 색상 변화 또는 pH 변화에 대하여 1로 유지될 때, LAMP 반응이 있는 샘플은 LAMP 반응이 없는 것과 구별된다. pH 값의 변화는 색상 변화와 일치하여 100%이다.
실시예 9
반응은 p450 2C19 와일드 타입 프라이머 세트 및 K562 게놈 DNA 사용하는 것으로 설정된다. 약 300 복제인 1ng의 K562는 이들 반응 성분과 혼합한다. pH 인디케이터 염료는 반응 전에 각각의 튜브에 포함된다. dNTPs는 음성 대조 샘플 중에 (데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트)의 2.8mM 혼합물로 대체된다. 반응은 30분 동안 63℃로 유지하고 반응의 색상을 관측한다.
Figure pct00007
각각의 튜브에서, 별개의 염료 필름(K1 및 K2) 또는 가용성 pH 인디케이터(브로모티몰 블루, 0.1mg/mL)는 LAMP 반응 전에 증폭 시약과 혼합한다. 두 별개의 필름은 증폭 검출을 위해 시험 된다. 반응 설정 및 결과의 사진은 도 9 및 10에 나타낸다. 색상 변화는 코딩 패널을 사용하여 값으로 전환된다. 컴파일된 값은 표 3에 나타낸다. 증폭이 없는 것에 대한 증폭 및 색상 차이를 시각화하기 위하여 값은 도 8에 플롯된다.
결과는 템플레이트의 존재로 색상 변화를 나타낸다.
Figure pct00008
도 9
사진은 LAMP 반응 전 각각의 튜브에서 염료의 색상을 나타낸다. 사진에서 튜브는 템플레이트가 있는(A) 및 템플레이트 없는(D) K1 필름 LAMP 반응, 템플레이트가 있는 (B) 및 템플레이트가 없는(E) K2 필름, 템플레이트가 있는(C) 및 템플레이트가 없는(F) 브로모티몰 블루 용액이다.
Figure pct00009
도 10
도 9 및 10은 LAMP 반응(상단 행)중 증폭이 발생하는 튜브 내에서 염료 색상은 변하고 한편, LAMP 반응(하단 행) 중 증폭이 없는 곳에서 염료의 색상이 변하지 않음을 나타낸다. 사진에서 튜브는 템플레이트가 있는(A) 및 템플레이트가 없는 (D) K1 필름 LAMP 반응, 템플레이트가 있는(B) 및 템플레이트가 없는(E) K2 필름, 템플레이트가 있는(C) 및 템플레이트가 없는(F) 브로모티몰 블루 용액이다(도 10 참조).
표 3은 LAMP 반응에 상관관계가 있는 색상 결과 및 pH를 나타낸다.
표 3
Figure pct00010
Figure pct00011
도 11A
Figure pct00012
도 11B
Figure pct00013
도 12
두 별개의 필름은 증폭 검출을 위해 시험하였다. 두 별개의 pH 인디케이터는 셀룰로오스 필름상에서 고정화하였다. 각 필름의 색상 변화는 그 자신의 색상 패널을 사용하여 다수로 전환시켰다. 표 3은 pH 값 변화(출발 pH-종료 pH) 및 색상 변화(출발 색상-종료 색상)를 나타낸다. LAMP 반응의 값은 모든 세 염료 필름에서 LAMP 반응이 없는 것과 뚜렷하게 구별된다. pH 값 변화는 색상 변화와 100% 일치한다. 각각의 튜브로부터의 샘플은 도 12에서 아가로스 전기영동을 사용하여 분석한다.
색상 변화의 강도는 결과가 육안으로 용이하게 결정될 수 있도록 매우 강하다. 유의한 색상 변화도 또한 가용성 염료(브로모티몰 블루, 0.1mg/mL)가 인디케이터로서 사용될 때 존재한다. 그것은 가용성 염료를 사용하는 것이 가능함을 나타낸다.
그러나, 더 높은 농도에서, 염료는 반응을 저해한다. 가용성 K1 염료가 LAMP 반응과 혼합될 때도 유사하게 관측된다. 가용성 화학물질은 증폭을 간섭하고 저해하는 경향이 있다.
Figure pct00014
도 13
브로모티몰 블루는 색상 변화를 보이지 않았으며 pH는 8.5로 변화하지 않았다(도 13 참조).
실시예 10
반응은 람다 프라이머 세트(도 22) 및 람다 게놈 DNA를 사용하도록 설정된다. DNA 템플레이트는 람다 DNA의 1, 10, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 및 10,000000 복제를 나타내는 다양한 농도로 희석된다. K2 필름은 반응 전에 각각의 튜브에 포함된다. 음성 대조는 람다 DNA를 함유하지 않는다. 반응은 63℃에서 30분 동안 유지하고 반응의 색상을 관측한다. K2 필름은 증폭이 있을 때 색상은 딥 마젠타에서 밝은 황색으로 변화한다. 민감도의 한계는 이 분석에서 10 복제로 나타난다.
Figure pct00015
튜브 1 내지 7에서 염료 색상은 황색으로 변한다. 튜브 8 내지 10은 여전히 분홍색이다. 결과는 검출 한계가 람다 DNA의 10 복제임을 암시한다(도 14 및 15 참조).
표 4
Figure pct00016
다른 복제 수의 반응물의 색상 값 및 pH 값의 결과가 제공된다.
Figure pct00017
도 14
각각의 튜브의 염료 색상은 LAMP 반응 전에 분홍색이다. 각각의 튜브는 람다 DNA 농도에 상응한다(도 14 참조).
Figure pct00018
도 15
튜브 1 내지 7에서 염료 색상은 황색으로 변한다. 튜브 8 내지 10은 여전히 분홍색이다. 결과는 검출 한계가 람다 DNA의 10복제임을 암시한다(도 15 참조).
표 5: 다른 복제 수의 반응물의 색상 값 및 pH 값의 결과가 제공된다.
표 5
Figure pct00019
도 16
양성 및 음성 반응의 차별을 나타내는 차트는 용이하게 구별된다. K2 필름을 사용한 검출은 람다 DNA의 10 복제만큼 낮은 것으로 나타난다(도 16 참조).
Figure pct00020
도 17
아가로스 전기영동 사진은 복제 수가 각기 10,000,000, 1,000,000, 100,000, 10,000, 1,000, 100, 및 10인 레인 1 내지 레인 7에서의 LAMP 증폭을 나타낸다. 레인 8은 증폭이 관측되지 않는 람다 DNA의 단일 복제에 해당한다. 레인 9 및 10은 람다 DNA가 없는 반응이다.
실시예 11
각각의 튜브에서, 가용성 pH 인디케이터(브로모티몰 블루, 0.1mg/mL), K1 필름 및 pH 시험지(Merck Millipore cat#1.09543.0001, 비-블리딩 종이)는 LAMP 반응 전에 증폭 시약과 혼합된다.
반응은 p450 2C19 와일드 타입 프라이머 세트 및 K562 게놈 DNA를 사용하도록 설정된다. 약 300 복제인 1ng의 K562는 50uL 반응물 중에 있는 반응 성분, 50mM KCl, 5mM MgSO4, 5mM NH4Cl, 1M 베타인, 1mg/mL BSA, 0.1% Tween 20, 2.8mM dNTPs(데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시티미딘 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 및 데옥시시티딘 트리포스페이트), 1.6μM FIP 및 BIP, 0.8μM 루프-F 및 루프-B, 0.2μM F3 및 B3, 및 32U의 Bst 중합효소와 혼합한다. pH는 Bst, K562, 또는 전혈을 첨가하기 전에 8.0으로 조정한다. dNTPs는 음성 대조 샘플 중에 있는 (데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트)의 2.8mM 혼합물로 대체한다. 또 다른 패널에서, 손가락을 찔러서 얻은 신선한 전혈 2 마이크로리터를 각각의 튜브에 첨가한다. 반응은 30분 동안 63℃로 유지하며 색상 반응이 관측된다.
K1 필름을 제외한 모두에서 전혈의 존재하에 증폭이 없는 것과 증폭 간의 차이를 보는 것은 매우 어려운 것이다. K1 필름으로부터 혼탁한 전혈 용액을 제거하는 것은 간단하고 용이하기 때문에, 핵산 증폭은 사진에서 나타낸 바와 같이 모니터될 수 있었다.
Figure pct00021
도 18.
사진은 정제된 DNA와 함께(양성) 또는 없이(음성) 반응하기 전의 염료 색상을 나타낸다. 반응은 템플레이트로서 정제된 DNA를 사용하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 튜브는 염료를 함유한다: 브로모티몰 블루(A 및 B), K1 필름(C 및 D), 및 pH 시험지(E 및 F). pH 8에서 튜브 A 및 B는 밝은 청색이며, 튜브 C 및 D(K1 필름)는 딥 마젠타이고, 튜브 E 및 F(Merck-Millipore제조의 pH 시험지)는 녹갈색이다.
Figure pct00022
도 19.
사진은 DNA 템플레이트와 함께(양성) 또는 없이(음성) 반응한 후의 염료 색상을 나타낸다. 염료의 색상은 반응물에 DNA 템플레이트가 있을 때 변화하였다. 튜브 B(브로모티몰 블루)는 밝은 청색에서 황색으로 변한다. 튜브 D(K1 필름)는 딥 마젠타에서 주황색으로 변한다. 튜브 F(pH 시험지)는 녹갈색에서 밝은 황색으로 변한다.
Figure pct00023
도 20.
사진은 반응 전 염료 색상에 대한 전혈 효과를 나타낸다. 템플레이트 DNA가 있는 튜브는 양성 부호로 라벨을 붙이고 한편 DNA가 첨가되지 않은 튜브는 음성 부호로 라벨을 붙인다. 각각의 튜브는 2마이크로리터의 신선한 전혈을 함유한다. 오른쪽에서 왼쪽으로, 튜브는 브로모티몰 블루(A 및 B), K1 필름(C 및 D), 및 pH 시험지(E 및 F)을 함유한다. pH 8에서 브로모티몰 블루는 밝은 청색이며, K1 필름은 딥 마젠타이고, Merck-Millipore 제조의 pH 시험지는 불균일 색상 혼합으로 인하여 색상을 정의하는 것은 곤란하다.
Figure pct00024
도 21
사진은 반응 후의 전혈 효과를 나타낸다. 가용성 염료, 브로모티몰 블루(A 및 B)의 색상은, 전혈의 존재로 구별하기가 곤란하게 된다.
Figure pct00025
도 22
사진은 용액을 진탕하여 염료를 제거한 후 고정된 염료의 색상을 나타낸다. 혈액은 K1 필름(C 및 D) 및 pH 시험지(E 및 F)의 경우에 고정화된 염료로부터 제거될 수 있다. 이동 과정은 사용자가 튜브를 열 필요가 없으며 따라서 오염의 위험이 없다. 혈액을 제거 한 후, pH 시험지의 색상도 또한 증폭이 없는 것(E)으로부터 증폭(F)을 구별하는 것은 곤란하다. 이것은 그 안에 혈액을 포획한 종이의 다공성 구조에 기인한다. K1 필름의 색상만이 증폭이 없는 것(C, 색상 값=3) 및 증폭이 있는 것(D, 색상 값 =1) 간의 뚜렷한 구별을 나타내는 반응이다.
Figure pct00026
도 23
각각의 튜브로부터의 LAMP 반응은 아가로스 전기영동을 사용한다. BTB는 브로모티몰 블루이다(도 23 참조).
실시예 12
PCR 실시양태
Figure pct00027
핵 증폭을 모니터링하기 위한 인디케이터 염료 필름은 PCR에서 사용된다. 필름은 PCR 반응 조건과 호환성이다. 한 실시예에서, 분석은 C형 간염 바이러스 코어 1b 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하여 어셈블된다. 반응은 PCR 반응 전에 염료 필름으로 설정된다. 각각의 반응 pH는 8.0-8.2로 조정된다. 열순환 프로그램은, 세 단계 모듈, 즉, 30초 동안 94℃, 20초 동안 65℃, 및 15초 동안 72℃를 55 반복하여, 2분 동안 94℃에서 초기 변성 단계를 따른다. 반응은 72℃에서 2분 동안 반응의 마지막 단계를 유지하여 반응이 완료된다. 튜브의 색상은 기계에서 꺼낸 후에 알 수 있다.
결과는 증폭 있는 튜브(황색) 및 증폭 없는 튜브(분홍색) 간에 뚜렷한 색상 차이를 나타낸다.
Figure pct00028
도 24
염료의 존재하의 PCR 반응의 결과는 도 33에 제공된다. K1 필름은 A, C, E, 및 G를 나타내는 한편 K2 필름은 B, D, F, 및 H를 나타낸다. PCR 반응 전에, 모든 필름은 주황색을 나타낸다. PCR 반응 후에, 증폭이 없는 튜브(E 및 F)는 분홍색을 나타낸다. 증폭이 있는 플라스미드 템플레이트가 있는 튜브는 황색(G 및 H)을 나타낸다.
실시예 13
샘플을 제조함이 없이 및 샘플로부터 최종 결과까지 2단계를 초과할 필요 없이 및 결과 해석을 위한 장비 없이 유전자를 검출할 수 있는 분석의 개발에 대하여 오랫동안 소망해왔다. 본 발명은 이들 요건을 이행하는 방법을 제공한다. 유전자는 직접적으로 손가락을 찔러서 얻은 전혈의 존재하에 증폭시켰다. 유전자의 존재는 고정화된 염료를 사용하여 증폭을 모니터링함에 의해 검출된다. 그 결과는 하나로 이들 모든 단계를 줄인다.
첫 번째로, 물은 인디케이터 염료의 존재하에 동결건조된 증폭 시약을 함유하는 하나 이상의 반응 용기(들)에 소정 체적의 용기로부터 로딩하고, 전혈과 같은 샘플은 반응 용기(들)에 로딩한다.
오염을 방지하기 위하여, 용기는 핵산 증폭 후에 안전하게 닫혀진 기기에 남아있어야 한다. 기기의 도움 없이, 증폭 결과는 증폭 반응이 전혈 증폭과 같은 투명한 용액이 아닐 때, 판독하기가 일반적으로 곤란하다. 현탁된 콜로이드 입자 또는 샘플과 함께 제공되는 착색 화합물로부터의 간섭을 극복하기 위해, 샘플은 일반적으로 희석 또는 가열 또는 양자에 의해 사전 처리된다. 실시예는 DNA 킬레이팅 형광 염료, YO-PRO-1 또는 Sybr Green(Genome Letters, 2, 119-126, 2003), 금속 킬레이팅 염료, 칼세인 및 히드록시 나프톨 블루(Biotechniques, 46, 167-172, 2009)와 같은 기기 없는 종래의 검출을 포함한다.
본 발명은 염료 화학 물질(K1 및 K2)이 증폭이 발생하는 용기에 맞는 히드로겔 3D 객체에 공유적으로 연결된 것을 보여준다. 그것은 육안으로 핵산 증폭 결과를 용이하게 판독하도록 허용하는 K1 또는 K2로 컨쥬게이트된 필름을 사용한 본 개시물로부터 알 수 있다. 그러나, 필름이 용기의 벽에 접착하는 경향이 있으므로, 반응 용기의 개방 없이, 용기 내에서 필름으로부터 용액을 분리하는 것은 항상 쉬운 것은 아니다. 3D 객체는 인디케이터 염료와 용기 사이의 접촉 표면을 최소화하여 문제를 해결한다.
3D 객체는 3D 객체와 반응물 간에 접촉 면적이 최소화되도록 하는 볼이다. 3D 볼은 폴리스티렌 볼, 셀룰로오스 볼, 또는 기타 물질로 만들어진 볼과 같은 볼에 히드로겔층을 적용하여 형성될 수 있다. 상이한 색상의 볼은 육안을 위하여 심지어 더 우수한 색상변화를 용이하게 하는 인디케이터 색상 염료의 콘트라스트를 향상시키도록 선택된다.
본 발명은 또한 염료가 인디케이터 볼이거나 또는 3D 염료 인디케이터 객체가 외부 자기장에 의해 영향을 받는 설계를 기술한다. 상자성 또는 강자성 물질이 3D 객체 또는 볼에 삽입될 때, 염료가 혼탁한 용액의 간섭없이 볼 수 있도록 염료의 위치를 제어하는 것이 가능하며, 이것은 용기를 안전하게 밀봉하여 수행된다. 삽입은 히드로겔 코팅 전 중합체 볼에 철 핀을 펀칭하는 것과 같이 간단하다.
또 다른 실시양태에서, 3D 객체는 외부 자기력의 영향하에 3D 객체의 클러스터를 형성할 수 있는 작은 입자의 집합이다. 입자는 구형 볼과 동일한 직경의 마이크로 미터이거나 또는 자기 조작을 위해 합리적으로 용이한 다른 크기이다.
히드로겔은 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리우레탄(PU), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(PEGMA), 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(PEGDMA), 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 또는 폴리이미드(PI)로 구성된다.
염료는 임의의 반응성 비닐술포닐 염료 또는 pH 인디케이터 염료이다.
히드로겔은 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)를 사용하여 형성되며, 히드로겔은 K2 염료로 컨쥬게이트되고, 또한 4-[4-(2-히드록시에탄술포닐)-페닐아조]-2,6-디메톡시페놀 인디케이터 염료(비닐술포닐 염료)로 공지되어 있다.
물질은 다음과 같다:
1) 2-히드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 4-[4-(2-히드록시에탄술포닐)-페닐아조]-2,6-디메톡시페놀(pH 인디케이터 염료), 황산, 수산화나트륨, 및 탄산나트륨.
히드로겔 제조
히드로겔에 사용된 시약의 화학 조성은 표 6에 제공된다.
표 6
Figure pct00029
표 5: 히드로겔의 형성을 위해 사용된 시약의 화학 조성
모든 시약은 칭량 후 함께 첨가하고 10분 동안 교반을 수행하여 균일한 혼합물을 수득한다. 이 혼합물을 유리 페트리접시로 용매 캐스팅한다. 페트리접시는 3분 동안 UV조사를 수행하고, 여기에서 중합화 및 가교 반응이 함께 수행된다. UV 하에, 각각의 광개시제 분자에 대하여 두 라디칼을 생성하는 DMPA(광 개시제)의 해리가 발생한다. 라디칼은 PHEMA를 형성하는 HEMA의 중합을 개시하며, 동시에 폴리(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트(가교제)도 또한 PHEMA 사슬의 분자간 가교를 수행하도록 활성화된다. 3분 후, 히드로겔은 페트리접시로부터 박리되고, 1시간 동안 탈이온수에 침지하여 모든 부산물 및 미반응 시약의 제거를 보장한다.
4-[4-(2- 히드록시에탄술포닐 )- 페닐아조 ]-2,6- 디메톡시페놀과의 PHEMA 히드로겔의 화학 염색
전형적인 고정화 절차에서, 100mg의 인디케이터 염료는 1g 농축 황산과 완전히 혼합하고(막자 사발에서), 30분 동안 실온에서 방치한다. 이로써, 인디케이터 염료의 2-히드록시에틸술포닐기를 술포네이트로 전환시킨다. 혼합물은 900ml의 증류수에 붓고 1.6ml 32% 수산화나트륨 용액으로 중화한다. 그 후, 25.0g의 탄산나트륨은 100ml의 물에 용해시키고 후속하여, 5.3ml의 32% 수산화나트륨 용액을 첨가한다. 이 단계에서, PHEMA 히드로겔층이 이 염색 용액에 배치된다. 염기성 조건하에, 염료 술포네이트는 화학 반응성인 비닐술포닐 유도체로 전환되고, 이와 동시에, 비닐술포닐기와 중합체의 반응성 기(예컨대 PHEMA 히드로겔의 히드록실기)와의 마이클 첨가가 발생한다. 12시간 후, 착색층은 염색 조로부터 제거되고 증류수로 수회 세척한다.
Figure pct00030
도 25
이 단계에서, 염료 분자는 가교 중합체 매트릭스에 화학적으로 연결된다. 또한 수용액을 흡수하는 히드로겔의 능력으로 인하여, 염료는 매트릭스에 물리적으로 로딩된다. 이것은 본원에서 하기에 나타낸 바와 같이 중합체로의 염료의 비공유 타입 결합이다. 충분히 세척한 후, 히드로겔로부터의 염료의 용출이 정지되고, 이 단계에서 착색 히드로겔은 핵산 시험에 사용되는 작은 조각으로 절단된다.
실시예 14
반응은 람다 프라이머 세트 및 람다 DNA를 사용하도록 설정된다. 약 100억 복제 람다 DNA가 히드로겔의 슬래브의 존재하에 반응 성분과 혼합된다(튜브 2). dNTPs는 음성 대조 샘플(튜브 1)에서 2.8mM 혼합물 (데옥시아데노신 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트)로 대체된다. 반응은 63℃에서 30분 동안 유지하고, 반응물의 색상을 관측한다. 히드로겔 슬래브는 약 2mm x 4mm x 1mm이다. 반응의 말기에, 히드로겔 슬래브는 모두 네 개의 데옥시뉴클레오티드의 존재하에 마젠타에서 주황색으로 변하며, 한편 누락한 데옥시티미딘 트리포스페이트가 LAMP 반응을 억제할 때 색상은 마젠타로 유지한다는 것은 명백하다.
Figure pct00031
Figure pct00032
도 26
히드로겔 슬래브가 사용되었을 때 반응과 비 반응 간의 색상 차이는 도 26에 제공된다.
Figure pct00033
2mm 직경의 셀룰로오스 아세테이트 볼 상에서 pH 반응성 염료 컨쥬게이트된 폴리우레탄 히드로겔의 예.
Figure pct00034
도 27
코어-쉘 히드로겔 입자의 pH 반응. 히드로겔 코팅된 셀룰로오스 아세테이트는 pH 인디케이터 염료와 공유적으로 연결되며, 염료의 색상은 디스플레이된다. pH 7에서, 색상은 황색이다. pH 8.5에서, 색상은 마젠타이다.
람다 프라이머 세트
람다_FIP 5'-CAGCATCCCTTTCGGCATACCAGGTGGCAAGGGTAATGAGG-3′'
람다_BIP 5'-GGAGGTTGAAGAACTGCGGCAGTCGATGGCGTTCGTACTC-3'
람다_F3 5'-GAATGCCCGTTCTGCGAG-3'
람다_B3 5'-TTCAGTTCCTGTGCGTCG-3'
람다_LF 5'-GGCGGCAGAGTCATAAAGCA- 3'
람다_LB 5'-GGCAGATCTCCAGCCAGGAACTA-3′'
CYP2C19 프라이머 세트
2C19_F3 5'-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT C-3'
2C19_B3 5'-AGG GTT GTT GAT GTC CAT-3'
2C19_FIP.와일드 5'-CCG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3'
2C19_BIP.와일드 5'-CGG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
2C19_FIP.Mut 5'- CTG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3'
2C19_BIP.Mut 5'- CAG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C -3'
2C19_LF 5'-GAT AGT GGG AAA ATT ATT GC-3'
2C19_LB 5'-CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TT-3'
프라이머 서열:
Figure pct00035
실시예 15
센서 및 검출 회로가 전자적으로 인쇄 및 사용되는 장치가 만들어진다. pH 센서는 세 개의 층을 갖는 것으로 만들어진다. 한 층은 시험될 분석물질 또는 기판이 수용되는 층이다. 그것은 또한 각기 pH 감지 물질로 피복되는 둘 이상의 전극을 포함한다. 이 실시예에서, 폴리아닐린이 사용된다. 마지막으로, 전극과 기판 또는 분석물질 사이에 배리어를 배치하기 위한 절연체로서 작용하는 제3층이 있다.
레지스터 및 배터리도 또한 시스템 또는 장치의 일부분이다.
본 실시예에서 측정되는 저항 변화를 측정하기 위하여, 분할 회로는 전압의 변화로서 측정된 값을 갖도록 사용된다.
이 장치는 특히 사용된 pH 레벨을 측정하기 위하여 사용된다. pH 범위가 측정될 필요가 있는 것이라면 하나 초과의 분할회로가 사용된다. 더욱이, 시간 내에 다양한 판독은 잠재적으로 선형 또는 측정될 다른 반응에 대하여 취하여진다.
실시예 16
폴리아닐린은 두 평면 광전도체를 피복하는 필름으로서 사용된다. 폴리아닐린 필름은 색상 대조 필터로서 작용한다. 이 장치의 광전도체 중의 하나는 대조로서 작용하며, 그의 폴리아닐린 필름은 pH 변화를 위해 측정되는 분석물질과 접촉하지 않는다. 다른 광전도체는 장치의 시험 부분이며, 그의 폴리아닐린 필름은 분석물질과 반응하고 pH 반응을 근거로 색상을 변경한다. 배터리를 위한 분압기도 또한 제공된다. 폴리아닐린은 산성 pH에서 녹색이고 염기성 pH에서 청색이다.

Claims (87)

  1. 인쇄 전자 회로, 디스플레이 및 배터리, 센서, 모니터, 판독 및 디스플레이 유닛을 포함하며,
    하나 이상의 전자기기가 인쇄되거나 또는 장치가 화학적 또는 생물학적 반응의 측정에서 색상 변화를 검출하기 위하여 비색 매질(clorimetric media)을 사용하는 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 통합 시험 측방 유동 장치(integrated testing lateral flow devices)인 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 통합 시험 측방 유동 장치는, 상기 전자기기가 유기 반도체 물질을 사용하여 인쇄되는 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 통합 시험 측방 유동 장치는, 상기 유기 반도체 물질이 poly(3-hexylthiophene), pentacene, polytriarylamine, 5',5-bis-(7-dodecyl-9H-fluoren-2-yl)-2,2'-bithiopene, polyethylene, naphthalate, poly(4,4' didecylbithiopene-co-2,5-thieno[2,3-b] thiophene, polyaniline 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 통합 시험 측방 유동 장치는, 상기 전자기기가 무기 물질을 사용하여 인쇄되는 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 통합 시험 측방 유동 장치는, 상기 무기 물질이 탄탈룸 퍼옥시드(tantalum peroxide), 실버 클로라이드(silver chloride), 실버 페이스트(silver paste), 규소, 이산화규소, 질화규소(silicon nitride), 산화알루미늄(aluminum oxide), 광물 반도체(mineral semiconductors), 금속, 금속 산화물 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 의료 시험 장치.
  7. (i) 검출 구역의 상류에 위치한 샘플 로딩 구역;
    (ii) 상기 샘플 로딩 구역 및 검출 구역 사이에 위치하며, 분석물질과 착물을 형성할 수 있는 리포팅 캐리어를 포함하는 리포팅 캐리어 구역; 및
    (iii) 분석물질 및 인디케이터를 위한 캡처 성분을 함유하는 검출구역;
    을 포함하며, 크로마토그래피 매질(chromatographic medium)을 함유하는 장치용 진단 키트로서, 상기 장치는 상기 리포팅 캐리어, 캐리어 및 하나 이상의 효소 카세트(proficient enzyme cassette)를 함유하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 진단 키트는, 시험 샘플이 있는 샘플 로드 구역(sample load zone)을 더욱 포함하며, 상기 시험 샘플이 리포팅 캐리어 구역을 통해 크로마토그래피 매질을 따라 샘플 로딩 구역에서 검출 구역 및 검출 구역 너머로 이동하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 진단 키트는, 시험 샘플이 있는 샘플 로드 구역(sample load zone)을 더욱 포함하며, 상기 시험 샘플이 샘플 로드 구역을 로딩하기 전에 리포팅 캐리어와 혼합되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 진단 키트는, 검출 구역에 기판을 첨가하되 상기 기판이 리포팅 캐리어를 함유하는 효소 분석물질(proficient enzyme analyte)의 존재하에 반응이 진행되며, 시험 샘플에서 분석물질의 존재 또는 부재에 상응하는 검출 구역 내에서 인디케이터의 반응을 생성하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  11. 크로마토그래피 매질에서 효소를 이용한 증폭 방법을 사용한 분석물질의 존재를 검출하기 위한, 하기를 포함하는 진단 키트: 바이어마커로서 분석물질, 상기 바이어마커를 인지하는 실체; 분석물질에 결합하는 제1 실체를 갖는 리포팅 캐리어 및 캡처 성분.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 바이어마커가 항원이며, 상기 캡처 성분은 제1 항체로부터의 상이한 에피토프에서 분석물질에 결합하는 제2 항체인 진단 키트.
  13. 제 12 항에 있어서, 제1 항체가 숙련된 효소에 공유 가교 결합된 진단 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 스트렙타비딘 및 비오티닐화 숙련된 효소 및 비오티닐화 항체를 포함하며, 제1 항체는 비공유 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 통해 숙련된 효소와 연관된, 진단 키트.
  15. 제 11 항에 있어서, 분석물질이 핵산 서열인 진단 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 타깃 핵산 서열의 일부분을 하이브리드화하는 제1 핵산 서열, 및 제1 핵산과 연관된 숙련된 효소를 포함하는 진단 키트.
  17. 제 16 항에 있어서, 제1 핵산이 숙련된 효소에 공유 가교 결합된 진단 키트.
  18. 제 17 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 스트렙타비딘 및 비오티닐화 숙련된 효소 및 비오티닐화 제1 핵산을 포함하며, 제1 핵산은 비공유 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 통해 숙련된 효소와 연관되는 진단 키트.
  19. 제 11 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 HIV, HBV, HCV, HPV, 또는 헤르페스 바이러스의 p24 단백질; 매독, 클라미디아, 임질에 대한 세균 단백질의 핵산 또는 단백질; 리포단백질 또는 이의 핵산; 당단백질 또는 이의 핵산에 결합하는 진단 키트.
  20. 제 15 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 HIV 핵산에 결합하는 진단 키트.
  21. 회로, 디스플레이, 배터리, 센서, 모니터, 판독 유닛, 디스플레이 유닛의 군으로부터 선택된 하나 이상의 전자기기를 함유하는 인쇄 전자 장치를 사용하여 분석물질을 첨가하는 단계; 반응을 관측하는 단계; 결과를 판독하는 단계; 데이터 입력 및 데이터 출력 메커니즘 및 전원 입력 메커니즘을 포함하는, 화학 또는 생물학적 반응의 측정 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 장치가 측방 유동 장치 또는 미세유체 장치인 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 장치가 색상 변화 검출 또는 화학 또는 생물학적 반응을 시각화하기 위한 비색 매질을 사용하는 장치.
  24. 제 23 항에 있어서, 비색 매질이 pH 민감성 인디케이터 염료인 장치.
  25. 제 24 항에 있어서, pH 민감성 염료가 용액이며; 하나 이상의 3D 구조상에서 고정되어 있고; 반응 쳄버 또는 용기에 고정되어 있으며; 또는 이의 조합인 장치.
  26. 상기 pH 변화를 측정하기 위한 제25항의 장치를 사용하는 단계를 포함하는, pH 변화를 위한 시험 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, pH 민감성 염료가 하나 이상의 3D 구조 상에서 고정된 장치.
  28. 제 25 항에 있어서, pH 민감성 염료가 반응 쳄버 또는 용기에 고정된 장치.
  29. 제 25 항에 있어서, pH 민감성 염료의 조합이 용액, 또는 하나 이상의 3D 구조 또는 반응 쳄버 또는 용기 내에 고정된 장치.
  30. 제 1 항에 있어서, 인쇄 전자가 나노입자, 나노튜브, 그래핀 또는 이의 조합인 장치.
  31. 제 1 항에 있어서, 인쇄 전자가 원자층 증착, 증기 증착, 사출 인쇄, 롤투롤 인쇄, 스크린 인쇄 또는 이의 조합에 의해 인쇄된 장치.
  32. 제 1 항에 있어서, 트랜지스터, 제어 회로, 신호 회로, 디스플레이 회로, 배터리, 데이터 기록을 위한 입력 및 출력 및 전력원을 추가로 포함하는 장치.
  33. 상기 장치가 시험 라인, 대조 라인 및 컨쥬게이션 패드를 함유하는 인쇄 센서 시스템을 포함하는, pH 변화를 측정하기 위한 장치.
  34. 제 33 항에 있어서, 흡수 패드를 더 포함하는 장치.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 장치가 예/아니오 반정량적, 또는 정량적 디스플레이; 이전에 라인이 없는 것으로 판독된 곳에서 라인 출현; 흰색 배경에서 라인 출현; 상이한 패턴의 출현; 색상 변화; 라인의 사라짐; 또는 이의 조합을 제공하는 장치.
  36. 제 33 항에 있어서, 분석 결과와 관련된 텍스트 정보가 있는 하나 이상의 발광 다이오드 또는 발광 다이오드의 어레이가 디스플레이된 장치.
  37. 인쇄 배터리, 인쇄 센서 및 정보를 업로드 하는 통신 모듈을 포함하며, 상기 통신 모듈은 기지국으로 정보를 업로드 하는 것을 포함하는 의료 시험 장치.
  38. 검출 구역으로부터 샘플 로딩 구역 상류를 갖는 크로마토그래피 매질; 리포팅 캐리어 구역; 검출 구역을 포함하며, 리포팅 캐리어는 샘플 로딩 구역 및 검출 구역 사이에 위치하는 통합 시험 측방 유동 장치.
  39. 제 38 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 캐리어 및 하나 이상의 숙련된 효소를 포함하는 장치.
  40. 제 39 항에 있어서, 크로마토그래피 매질에서 효소를 이용한 증폭 방법에 의해 분석물질의 존재 또는 부재가 검출되는 장치.
  41. 제 40 항에 있어서, 분석물질이 항체에 의해 인지되는 바이어마커 항원인 장치.
  42. 제 41 항에 있어서, 리포트 캐리어가 분석물질 및 숙련된 효소에 결합하는 제1 항체를 포함하며; 캡처 성분은 제1 항체와는 상이한 에피토프에서 분석물질에 결합하는 제2 항체를 포함하는 장치.
  43. 제 42 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 스트렙토비딘, 비오티닐화 숙련된 효소, 비오티닐화 항체 및/또는 이의 조합인 장치.
  44. 제 43 항에 있어서, 분석물질이 핵산 서열인 장치.
  45. 제 41 항에 있어서, 리포팅 캐리어가 HIV 핵산에 결합하는 장치.
  46. 제 24 항에 있어서, 인디케이터 염료, 즉 포타슘 1-히드록시-4-[4-(히드록시에틸술포닐)-페닐아조]-나프탈렌-2-술포네이트 또는 4-[4-(2-히드록시에탄술포닐)-페닐아조]-2,6-디메톡시페놀 또는 반응성 비닐술포닐 염료 또는 이의 조합을 포함하는 장치.
  47. 제 25 항에 있어서, 인디케이터 염료가 반응 시약에 혼합된 장치.
  48. 제 25 항에 있어서, pH 인디케이터 염료가 반응 전 증폭 시약의 일부인 장치.
  49. 제 25 항에 있어서, pH 인디케이터 염료가 반응 후에 첨가되는 장치.
  50. 제 25 항에 있어서, pH 인디케이터가 얇은 입자 미세입자, 얇은 필름, 또는 삼차원 객체에 고정화된 장치.
  51. 제 50 항에 있어서, 입자가 중합체, 다공성 입자, 또는 코어-쉘 입자로 만들어진 마이크로 입자이며, 염료는 마이크로 입자에 공유적으로 컨쥬게이트된 장치.
  52. 제 51 항에 있어서, 입자가 중합체, 다공성 입자 또는 코어-쉘 입자로 만들어진 장치.
  53. 제 52 항에 있어서, 하나 이상의 입자가 적어도 하나 이상의 입자를 결합하는, 단립자로서 존속 가능한 장치.
  54. 제 50 항에 있어서, 삼차원 객체가 외부 자기력의 영향하에 있는 장치.
  55. 제 50 항에 있어서, 얇은 필름이 pH 인디케이터 염료와 공유적으로 컨쥬게이트된 필름인 장치.
  56. 제 50 항에 있어서, 삼차원 객체가 히드로겔로 만들어졌거나 또는 밀리 또는 마이크로 미터 크기의 비히드로겔 삼차원 객체의 표면상에 코팅된 장치.
  57. 제 56 항에 있어서, 삼차원 객체가 비 수소 물질로부터 착색된 배경의 색상 강도 도입을 향상시키는 질량 밀도를 증가시키기 위해 비-히드로겔 물질과 혼합된 장치.
  58. 제 56 항에 있어서, 삼차원 객체가 외부 자기력의 영향하에 삼차원 객체의 클러스터를 형성하는 작은 입자의 집합인 장치.
  59. 제 58 항에 있어서, 삼차원 객체가 하나 이상의 밀리 입자이며, 밀리 입자는 외부 자기력의 영향하에 반응 용기 내에서 이동되는 장치.
  60. 제 56 항에 있어서, 히드로겔이 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리우레탄(PU), 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(PEGMA), 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(PEGDMA), 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 폴리(비닐알콜)(PVA), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 또는 폴리이미드(PI), 또는 이의 조합으로 만들어진 장치.
  61. 제 23 항에 있어서, 하나 이상의 인디케이터 염료가 출발 pH를 위한 인디케이터로서 작동하는 장치.
  62. 제 61 항에 있어서, 하나 이상의 pH 인디케이터가 상이한 pKa의 대상이 되는 각각의 pH 인디케이터로 사용되는 장치.
  63. 제 61 항에 있어서, 2 이상의 pH 인디케이터는 출발 pH가 범위 밖의 표시를 제공하기 위하여 사용되는 장치.
  64. 제 61 항에 있어서, 반응 전에 라인이 존재하지 않은 라인 또는 기타 패턴의 존재가 관측된 화학 또는 생물학적 반응을 나타내는 장치.
  65. 제 61 항에 있어서, 비색 변화는 화학 또는 생물학적 반응의 관측을 나타내는 장치.
  66. 제 23 항에 있어서, 증폭 방법이 반응을 수행하기 위하여 사용되며, 방법은 열순환 방법 또는 등온 방법인 장치.
  67. 제 66 항에 있어서, 열순환 방법이 PCR, 실시간 PCR 또는 역 전사 PCR인 방법.
  68. 제 66 항에 있어서, 등온 방법(isothermal method)이 루프 매개 증폭(LAMP), 가닥 변위 증폭(SDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 핵산 서열-기재 증폭(NASBA), 전사-매개 증폭(TMA), SMART(Nucl. Acids Res. 29:e54, 2001), 헬리카제-종속 증폭(HDA), 크로스 프라이밍 증폭(CPA), 회전환 증폭(RCA), 분기된 회전환 증폭(RAM), 절단 효소 증폭 반응(NEAR), 절단 효소 매개 증폭(NEMA, CN100489112 C), 등온 사슬 증폭(ICA), 지수 증폭 반응(EXPAR), 비이콘-조력 검출 증폭(Beacon-Assisted Detection Amplification)(BAD AMP) 프라이머 생성-회전환 증폭(PG-RCA), 또는 기타 핵산 증폭 방법이며, 증폭은 열순환이 필요하지 않는 방법.
  69. (a) 하나 이상의 용기(들), (b) 증폭 시약, 및 (c) 하나 이상의 pH 인디케이터를 포함하는 핵산 증폭 검출을 위한 키트.
  70. 제 69 항에 있어서, pH 인디케이터가 포타슘 1-히드록실-4-[4-(히드록시에틸 술포닐)-페닐아조]-나프탈렌-2-술포네이트 또는 4-[4(2-히드록실에탄술포닐)-페닐아조]-2,6-디메톡시페놀 또는 반응성 비닐술포닐 염료 또는 이의 조합인 키트.
  71. 신호 강도를 계산하기 위한 회로소자를 제어하는 pH 민감성 센서 성분 및 디스플레이 픽셀 성분을 포함하며, 상기 성분은 유전 물질상에서 인쇄되는 pH 검출 장치.
  72. 제 71 항에 있어서, 유전 물질이 가요성 플라스틱인 장치.
  73. 하기를 포함하는, 화학 또는 생물학적 샘플 내에서 비색 변화 검출을 위한 장치:
    a. 전극 상에서 전자 인쇄된 2 이상의 광 전도체;
    b. 광전도체 중 하나를 피복하는 한 필름은 대조로서 작용하며 시험 매질과 상호작용하지 않는, 광전도체 중 하나를 피복하는 유기 필름;
    c. 다른 광전도체의 색상 변화를 검출하는 pH 측정 장치;
    d. 배터리; 및
    e. 데이터 및 전원 입력 및 출력.
  74. 제 73 항에 있어서, 필름으로서 사용된 유기 물질이 폴리알라닌이며, pH 변화는 색상 변화로서 반영되는 장치.
  75. pH 변화에 따른 전도도를 측정하는 인쇄 전자 기기를 사용함에 의한, 하기를 포함하는 pH 변화 측정 장치:
    a. 2 이상의 전극이 배치되며, 전극은 인쇄 전극이고, 기판 또는 분석물질이 배치되는, 구획 또는 층;
    b. 그 후 인쇄된 pH 감지 물질을 함유하는 제2 구획 또는 층; 및
    c. 인쇄 전극 및 기판 또는 분석물질 간에 배리어를 야기하는 절연재를 갖는 제3 구획 또는 층.
  76. 제 75 항에 있어서, 측정 가능한 전압으로 저항을 기록하는 분할 회로를 추가로 포함하는 장치.
  77. 제 76 항에 있어서, 전압 변화가 전기영동 및/또는 일렉트로크로매틱으로 디스플레이되는 장치.
  78. 화학 및/또는 생물학적 반응을 감지하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 전기 신호 출력 검출 단계;
    b. 화학 및/또는 생물학적 반응에서 pH가 변할 때 전기 신호 모니터링 단계를 포함하며; 반응의 전자적 검출을 위해 하나 이상의 검출 및 모니터링 성분이 기판상에 있는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 화학 및/또는 생물학적 반응의 검출이 단일 구역에서; 차동 출력을 사용하여; 또는 반응 동안 상이한 시점에서 pH를 측정하는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 반응이 PCR 반응, 실시간 PCR 또는 역 전사 PCR인 방법.
  81. 제 78 항에 있어서, 반응이 비색 반응인 방법.
  82. 제 79 항에 있어서, 반응이 등온 반응인 방법.
  83. 제 77 항에 있어서, 등온 반응이 단일 가닥 변위 증폭(SDA), DNA 증폭, RNA 증폭, 또는 이의 조합인 방법.
  84. 제 23 항에 있어서, 민감성 인디케이터 염료가 증폭 시약으로 동결건조되는 방법.
  85. 제 23 항에 있어서, 2 이상의 pH 인디케이터가 출발 pH가 범위 밖의 표시를 제공하기 위하여 사용되는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서, 각각의 민감성 인디케이터 염료가 출발 pH를 위한 인디케이터로서 작동하는 방법.
  87. 제 79 항에 있어서, 등온 방법이 루프 매개 증폭(LAMO), 가닥 변위 증폭(SDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 핵산 서열-기재 증폭(NASBA), 전사-매개 증폭(TMA), SMART(Nucl. Acids Res. 29:e54, 2001), 헬리카제-종속 증폭(HDA), 크로스 프라이밍 증폭(CPA), 회전환 증폭(RCA), 분기된 회전환 증폭(RAM), 절단 효소 증폭 반응(NEAR), 절단 효소 매개 증폭(NEMA, CN100489112 C), 등온 사슬 증폭(ICA), 지수 증폭 반응(EXPAR), 비이콘-조력 검출 증폭(BAD AMP), 프라이머 생성-회전환 증폭(PG-RCA), 또는 기타 핵산 증폭 방법이며, 증폭은 열순환이 필요하지 않는 방법.
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