TW201530119A - 分析試驗裝置、套組及使用方法 - Google Patents

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Abdur Rub Abdur Rahman
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Stephen Chang-Chi Kao
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Abstract

本發明係關於分析試驗裝置，及藉由使用具有印刷電子元件(諸如電池、閱讀裝置及其他電路)之裝置及/或藉由使用敏感指示劑pH染料使用用於測試之比色構件或兩者皆有以監測、感測、閱讀及展示結果之方法及套組。

Description

分析試驗裝置、套組及使用方法
本發明係關於分析試驗裝置、套組及使用該等試驗裝置以感測、監測、區分讀數及展示該裝置欲測試之結果之方法。先前之裝置可用於偵測或監測以極低濃度存在於樣本(包括但不純粹為生物樣本、材料、有機或無機樣本)中之痕量化學及/或生物目標。該等痕量化學及/或生物目標可包括生物/化學產品、片段或整個目標，例如核酸序列、細胞、病毒、病原體、化學品，其在諸如以下領域中應用於照護/現場/關注(point of care/site/interest)及實驗室方面：醫藥基因組學、病原體偵測及監測、遺傳素質之測定、用於臨床試驗之基因分類、診斷學、預測學、傳染性疾病診斷學及監測、生物防護、法醫分析、親子鑑定、動植物育種、食品檢測、人體鑑定、基因改造生物體檢測、化學污染物、食品安全、流水線之監測及跟蹤及在線生產之監測/控制。
本發明以組合之方法達成。一種方法係經由使用印刷電子元件以感測需要測量的變化，諸如pH。另一種測量反應變化之方法係藉由使用可用印刷電子元件偵測之比色介質(顏色上變化，以顏色變化指示或變為可見)，作為其他方法中之一種偵測結果之方法。另外，使用印刷電子感測器在整合單元上展示測量結果。
存在之一些裝置為例如橫向流動裝置及於診斷分析中使用其等之方法。US SN 14/345,276以全文引用之方式併入本文中。US SN 14/345,276揭示之方法及裝置可用於偵測或監測以極低濃度存在於提供之樣本中之目標，諸如化學、生物及材料目標。然而，US SN 14/345,276之方法及裝置並不利用本發明之方法、裝置及套組。
除橫向流動裝置以外，本發明理論上亦可使用微流體燃料電池。
到目前為止，印刷電子元件已用於多種技術領域。然而，本發明之裝置之顯示態樣第一次使用印刷電子元件以展示所測試之結果。該等印刷電子元件包括至少一印刷電路顯示器及/或呈印刷形式之電池。現已決定，該感測監視器、微分閱讀單元及/或顯示器單元傾向於具有印刷形式之電子元件。該等電子元件諸如電路、顯示器及電池皆位於醫學裝置諸如但不限於橫向流動裝置上，以閱讀意欲被該裝置測量之結果。
印刷電子學係藉由使用常見印刷設備以在多種基板上創建電子裝置之印刷方法。圖案係印刷於材料上，諸如絲網印刷、柔性印刷、凹版印刷、平板微影印刷及噴墨印刷，因為此等為典型低成本製程。然後在基板上使用電子功能性電子或光學墨水，創造主動或被動裝置，諸如薄膜電晶體或電阻器。
術語印刷電子元件指其中一種(或多種)墨水由碳基化合物組成之有機電子元件或塑膠電子元件。印刷電子元件，相反地，指定該製程，並服從於所選之印刷製程之特定要求，可利用任何溶液基材料。此尤其包括有機半導體、無機半導體、金屬導體及奈米顆粒。
為製備印刷電子元件，幾乎使用所有工業印刷方法。
印刷之最重要之益處為低成本。較低成本使其可用於更多應用中。一個實例為RFID系統，其可於貿易及運輸中使用無接觸鑑定。同樣，於可撓性基板上之印刷允許電子元件安置於彎曲表面上。
本發明另外係關於診斷、基因測試、血統及品種選擇測試、基 因改造生物體測試、病原體偵測、基因分型、突變偵測、用於處方或臨床治療之伴侶基因測試、癌症類型之偵測、癌症之監測及預後。基因測試已廣泛用於臨床應用、食品工業、法醫鑑定、人體鑑定、病原體疫情監測及新疾病菌株之偵測。該基因測試包括涉及從分析物偵測及鑑定核酸之一系列技術。實例包括DNA測序、實時聚合酶鏈反應(PCR)、DNA微陣列及限制性片段長度多態性(RFLP)等。本發明提供增強之構件，可藉由該等構件進行該等偵測，經由使用印刷電子元件或在系統中使用pH染料指示劑，或兩者皆有。
用於偵測通常以微量形式發現的核酸之傳統方法需要多種裝置及步驟以處理樣本、擴增目標及偵測該擴增。核酸(DNA或RNA)之擴增已存在已久，且如今已存在多種用於不同分析需求之方法。甚至使用偵測的電信號監測用於PCR之核苷酸插入物之現存反應方法並不使用本發明之印刷電子元件或比色方法(參見US 788,015 B2及US 8,114,591 B2)。
基於熱循環之基於聚合酶鏈反應(PCR)之擴增已顯示出在偵測核酸及基因變異(諸如拷貝數變異或單核苷酸多態性)中係可靠的。該方法已存在已久，使得其常常為一種用於需要很多規則之應用諸如臨床及法醫應用之標準方法。不論何種核酸擴增方法，沒有可視化方法均無法偵測擴增產物。當前之核酸可視化方法係關於使螢光探針附接至擴增試劑。該等探針包括Taqman偵測寡核苷酸及雙股DNA螯合劑中之螢光標籤、Sybr Green或其他對反應產物敏感之螢光化學品。該螢光化合物在該類型之偵測中必不可少，因為螢光分子發射大量質子，且該發射只有在反應產物存在下才可偵測。只有當Taqman偵測寡核苷酸之螢光探針與擴增產物雜交並被DNA聚合酶分解或將Sybr Green螯合至擴增產物時，該發射才會發生。
然而，此等螢光化學品對曝光敏感或需要特別的存儲條件諸如 冷藏。曝露於周圍光會對螢光化學品造成不可逆的損害，這種現象稱作光漂白。對於任何螢光方法，任一種發射之發生都需要激發光源。
一般使用UV光源作為激發光源以刺激螢光探針以產生可測量之光發射。一個實例由Paul LaBarre，PATH,Seattle,USA(PloS One V6，第6期，e19738)公開，該案以全文引用之方式併入本文中。當擴增產物焦磷酸鹽釋放螢光化學品以使其不被淬滅時，可能發生螢光發射。需要UV光源且該UV光源藉由手持UV LED提供。光強度取決於產物之量及周圍光條件。在將一未知樣本與一陽性對照及一陰性對照比較之情況下，單一UV LED無法為所有三個樣本提供均勻照明。無設備之幫助，很難從陰性樣本中區分陽性反應。另一種擾動之來源係螢光染料之不一致發射。因為該發射依賴兩種金屬離子結合之間的交換，不同於擴增反應，該交換為二級反應，所以受到一般存在於EDTA血樣或其他操作變動中之其他金屬螯合劑之干擾。
其中樣本可抑制或阻止螢光閱讀之另一實例為當溶液為非澄清溶液時，諸如當樣本為未處理之全血時。在無精密儀器的情況下，幾乎不可能處理體積少於1微升之樣本。雖然大部份核酸反應係在50微升下，更常見為在25或10微升下實施，但當樣本渾濁或嚴重有色時，螢光法嚴重受限。在反應之前需要大量稀釋或純化步驟。
一種用於偵測核酸之擴增方法使用pH敏感系統直接測量氫離子而不是使用螢光染料。這藉由利用CMOS芯片技術及離子敏感效應電晶體(ISFET)感測器[「一種使用標準CMOS技術之在芯片上之基於pH-ISFET之微感測器系統(A pH-ISFET based micro sensor system on chip using standard CMOS technology)」Haigang Yang等人，Systems-On-Chip for real-time appliction,Proceeding of the Fifth International Workshop,2005]而完成。氫離子感應層為CMOS芯片頂層之氮化矽。該技術導致具有成本效益之核酸分析。針對任何CMOS芯片，電路連 接係必不可少的，且需要芯片之特殊封裝以允許測量及擴增反應。因此，該方法昂貴且具有挑戰。其之所以昂貴是因為與任何CMOS芯片之設計及生產有關之高成本。其之所以具有挑戰是因為至少兩個原因：1.經由引腳洞或次要封裝缺陷之擴增液體洩露之短路風險，及2.在感應層例如氮化矽與反應組分之間之強干擾之風險。因為該等挑戰及顧慮，對於具有成本效益及簡單之基因測試，其並非理想解決方案。
因此，本發明亦係關於一種在核酸擴增之存在下產生可讀電子資料組或產生色差之新方法、裝置及套組。對於任何反應，在反應之後確保反應容器安全密封係至關重要的。其為防止其他進一步反應被之前擴增之核酸污染。在向反應中加入樣本核酸之後，任何用於偵測或反應之必要組分應與擴增試劑一起密封。儘管已知核酸擴增可產生pH下降，但是並不知曉如何在無設備之幫助下實施依賴pH之核酸擴增，諸如檢查正確之起始pH及相應地實施必要之調整。亦不知曉如何實施核酸擴增(諸如聚合酶連鎖反應(PCR))而使反應不被額外染料組分抑制。例如，在標準PCR反應中，擴增試劑中始終包括10mM之Tris或更高濃度。在當前方法中，總緩衝液容量可限於5mM下或較佳地為2mM下或較佳地為1mM下，以使得pH變化將不被緩衝液抑制。
另一個關於pH染料之問題係染料會抑制擴增反應。pH指示染料諸如溴百里酚藍在1mg/mL濃度下產生良好的顏色強度但其完全抑制LAMP反應。當在核酸擴增方法中使用可溶染料時，限制染料與擴增組分之接觸係至關重要。可藉由稀釋或藉由限制分子接觸表面積完成。藉由稀釋限制染料之濃度，以使得干擾最小。在一更佳之方法中，染料應不溶，且該染料存在於與擴增試劑接觸之固相中，以使得徹底削減染料對擴增試劑之分子接觸表面積。
在一擴增中，可在無額外三羥甲基胺基甲烷緩衝液之存在下提 供穩定之起始pH。若容器保持密封，則反應中染料之顏色將不會改變達數日。
取決於Mg離子濃度及擴增之起始pH，在擴增之後之pH變化是陽性或陰性。因此，控制起始pH很重要。然後，藉由加入弱緩衝液組分或加入酸/鹼以調整而設定起始pH。當pH染料與擴增試劑預混合時，因此更容易在無需pH計時知道起始pH是否正確。
由於染料組分可溶或存在於與反應接觸之固體表面，因此反應室之形式無限制，而ISFET相反。對於視覺閱讀，該容器之至少一部份並非完全不透明以允許觀察。整個過程與任何存儲期發生之反應(over-the-shelf reaction)小瓶相容而無需設計專用反應匣體，諸如Cepheid之Xpert或BioFire之生物薄膜排列之案例。
已使用分析試驗以分析試驗樣本，且特定言之，已使用該等用途之橫向流動裝置於即時試驗應用中，因為其易於使用並相對便宜使用。參見US SN 14/345,276，該案以全文引用之方式併入本文中。該等已確立之可讀裝置一般依賴於有色顆粒(諸如金、乳膠或螢光)以當分析物與有色顆粒接觸時變得可見。該所得之顏色可被使用者觀察。本質上，可能因為使用者對顏色式樣之闡釋而可能存在如何闡釋結果之不一致性。
為幫助緩解該顏色式樣之潛在闡釋，已開發數位橫向流動分析器，其中單獨之電子閱讀器在橫向流動膜之試驗區域上掃描並讀取式樣，無論顏色或螢光。該等類型之儀錶之實例包括ESEQuant橫向流動免疫測定閱讀器及IDEXX實驗室之SNAPshot Dx分析器。
市售之一些類型之裝置具有與其用途相關之內建問題。例如，卡式帶閱讀器之方法使該等裝置變得昂貴。在大多數該等情況中，可將一次性儀錶整合入橫向流動裝置之流動中。一個該等裝置為Clear Blue之驗孕裝置，其中可視覺觀測反應區域之有色線以監測線之出現。該類型之裝置具有兩個橫向流動分析(LFA)條、印刷電路板(PCB)及合適之電子組件諸如光學感測器、處理器、LCD(液晶顯示器)及一電池。該類型之測試裝置針對hcG(一種懷孕標記)使用LFA。一種LFA係校準控制而另一種係偵測條。
不幸地，由於電子組件在僅使用一次後丟棄，所以該等類型之裝置非常浪費。此外，該等裝置之製造需要多種步驟，由此增加成本。因此，需要該等更容易生產並無需僅使用一次後丟棄之裝置。
例如，導體及半導體材料諸如聚合物及其他分子如今已用於一列電子元件中。該等用途包括行動服務中之顯示器，其中該等裝置中使用有機電子元件(及無機電子元件)代替傳統電子元件。
電子裝置之用途之一實例係射頻識別(RFID)，但仍在尋求一種加上記憶體輸入一起的快速切換電晶體及100KHz頻率之天線之開發方案。有機電晶體可係為表面提供電子元件以用於諸如試驗分析用途之解決方案。
對紙加入有機電子元件可緩解錯誤閱讀、偽造、破壞及安全問題之問題。
本發明解決該技術缺點之一種方法係藉由利用與電晶體使用及其他使用相容之電子墨水材料。本發明提供一種與調節電荷輸送之材料系統使用之機制或開關現象，其於顯示器中使用或亦用於電力儲存或轉化。
由於紙是由人類製造的最多的產品，因此其係邏輯基板以供待使用之有機/無機電子元件使用。紙可減少很多途徑及材料沉積步驟之使用，從而形成本發明之基礎。
印刷技術包括基於薄片之印刷及基於捲軸式之印刷。基於薄片之噴墨及絲網印刷通常用於低容量、高精確度工作中。凹版印刷、平 板印刷及柔性印刷亦用於高容量生產。然而平板印刷及柔性印刷主要用於無機及有機導體，凹版印刷尤其適用於質量敏感層。有機場效應電晶體及整合電路藉由大塊印刷方法製得。
絲網印刷亦用於製造電子元件，因為其具有自糊狀物質生產圖案化厚層之能力。
氣溶膠噴墨印刷係另一種利用印刷電子元件之方法。氣溶膠噴墨製程開始於墨水之霧化，其可加熱至80℃，產生直徑大約1至2微米之液滴。霧狀液滴夾雜在蒸汽中並被遞送至印刷頭。
其他與印刷尤其微接觸印刷及奈米壓印微影術相似之方法亦有效。於此，μm-及nm-尺寸層各自藉由類似於分別以軟或硬形式衝壓之方法製備。通常以減法方式製備實際結構，例如，藉由蝕刻遮罩之沉積或藉由剝離工藝。例如可製備OFET之電極。
使用有機及無機材料用於印刷電子元件。墨水材料必須以液體形式可用，例如溶液、分散液或懸浮液且其必須用作導體、半導體、介電體或絕緣體。
有機印刷電子學整合來自印刷、電子、化學及材料學，尤其係來自有機及聚合物化學之知識及開發方案。從結構、操作及功能性之角度，有機材料部份不同於習知電子元件，其影響裝置、電路設計及最優化及製造方法。
共軛聚合物之發現及其於可溶物質中之開發提供第一有機墨水材料。該種類之聚合物之材料擁有導電性、半導電性、電致發光、光電及其他性質。
有機半導體包括經聚(苯乙烯磺酸鹽)摻雜之導電聚合物聚(3,4-伸乙基二氧噻吩)(PEDOT：PSS)及聚乙烯(苯胺)(PANI)。該等聚合物以不同配方形式購得且各自使用噴墨、絲網及平板印刷或絲網、柔性及凹版印刷而印刷。利用聚丙胺酸層經阻抗變化感測pH變化之可撓性感 測器之使用揭示於Sensing Technology，標題為「Flexible pH sensor with polyaniline layer based on impendance measurement」之2011年第五屆國際大會(2011 Fifth International Conference)中呈現之摘要中。
無機電子元件提供高度有序層及界面。
銀奈米顆粒與柔版、平板及噴墨一起使用。金顆粒與噴墨一起使用。
其他重要之基板標準係低粗糙程度及適宜可濕性，其可在預處理(塗覆、電暈)前經調整。與習知印刷相反，高吸收性通常不利。
本發明之一目標為藉由利用印刷電子元件提供醫學試驗裝置分析、裝置及套組，其中該裝置之電子系統部份係藉由使用有機半導體材料或無機材料而印刷。
本發明提供一功能性化學/有機場效應電晶體作為感測器。此外，本發明提供功能性可印刷偵測電路作為控制器及結果呈可見形式之閱讀器。
另外，本發明提供一種藉由使用依PIT水平改變導電性之可印刷組件及材料以測量可程式化間隔計時器(PIT)之感測器裝置。
可用於本發明之有機材料包括該等材料如聚苯胺、聚(3-己基噻吩)、并五苯、聚三芳胺、5',5-雙-(7-十二烷基-9H-茀-2-基)-2,2'-雙噻吩、聚乙烯、萘二甲酸酯、及/或聚(4,4'-二癸基雙噻吩-共聚-2,5-噻吩并[2,3-b]噻吩)。可用於本發明之無機材料包括五氧化鉭、氯化銀、銀漿、矽、二氧化矽、氮化矽、氧化鋁及/或其他礦物半導體、金屬及金屬氧化物。另外，奈米顆粒、奈米管及/或石墨烯可用於本發明中。
本發明之另一目標為包括藉由印刷方法製得的本發明之電晶體、電阻器、電容器、二極體、內部聯線及其他相關電子元件。可用 於本發明之印刷方法有原子層沉積、蒸氣沉積、噴印、捲軸式印刷及/或絲網印刷。
此外，本發明之另一目標因此提供一種藉由利用高容量輸出系統印刷該等組件之新穎方法。例如，基於墨水之捲軸式印刷可印刷數百萬本發明之電子組件，藉以削減製造成本並簡化該等裝置之全部使用。
另外，本發明具有重量輕之優勢並提供組件之增強之可撓性。 一可撓性感測器提供與該等裝置之橫向流動條之良好接觸，但其避免對任何該等裝置之膜結構之潛在破壞。此外，因為印刷電子元件之實際重量比一典型印刷電路板(PCB)組件小很多，(此等包括印刷電路板及離散組件諸如封裝邏輯及記憶芯片、電阻器、電感器及電容器)，所以橫向流動條受到更好保護而免受潛在破壞。
本發明將感測器整合為單一系統，諸如在薄片上。依此，可藉由將電化學轉變整合以懸浮於所要之特定物質來建構單次使用系統。 此外，本文提供的是，任何電子信號隨後可經擴增及甚至進一步解碼以潛在地展示數值。
因此，本發明包括一可印刷電子感測器系統、一電晶體、一感測電晶體、控制電路、信號處理電路、顯示電路及視情況以無需使用許多組件之形式印刷之電池。
本發明之一實施例為經印刷用以監測之邏輯電路及來自一感測器在一段時間內之電信號。
因此，用於進行本發明之方法之另一實施例為pH指示劑方法，其中樣本例如核酸擴增流動通過基板上之一微流體通道，且其流動時，沿著該通道之長度連續地穿過適用於連續重複之基板或基底提供之溫度區域。該pH指示劑染料可併入所有PCR及其他實施例諸如本文描述之橫向流動裝置中。當使用該方法、裝置及/或套組時，所觀測 之內容在其他指示反應結果內容之觀測中尤其為顏色變化、當最初未發現線的地方出現一條線或其他圖案、在白色背景上出現一條線或線消失以指示陰性結果。
雖然以上內容一般說明經設計用以達到熱循環之PCR系統，多種等溫核酸擴增技術係已知，例如單股置換擴增(SDA)，且可同樣依照本發明監測使用該等技術之DNA或RNA擴增。
本發明之一目標為提供至少一種在與樣本混合前與擴增試劑混合之pH指示劑染料。當在加入樣本之後有擴增反應時，pH變化導致pH指示劑染料之顏色變化。當染料固定於一固體基質時，該固體基質可透過氫離子而非DNA聚合酶或核酸，可更容易地用肉眼觀察顏色變化。因為差異滲透性，可藉由增加固體基質中之染料濃度以增加光密度而不增加抑制該反應之風險。pH指示劑可為顆粒或固定於顆粒上。該等顆粒之尺寸不受染料或顏色之選擇之限制。該等顆粒之尺寸只與反應容器或條件之選擇相關。亦可將染料固定於薄膜或容器之表面，以使得其對擴增反應之干擾最小化。
本發明之另一目標亦為提供用於偵測或監測例如核酸擴增之pH敏感染料。染料可在溶液中、在三維物件諸如珠子或長條上、或在容器或隔間中或其組合。
珠子之使用可有利地使用。珠子係自任何適用於染料之附著之材料(例如矽石、聚苯乙烯、瓊脂糖或聚葡糖)合成的球形顆粒。可使用核殼結構合成該等顆粒，因此可藉由順磁性材料及染料水凝膠形成顆粒。例如自矽石獲得之珠子具有更高的密度，以使得容易保持珠子在溶液中處於恆定位置或藉由反轉反應小瓶將珠子從溶液中除去。
本發明亦具有比色法感測之一有利用途，其作為一種經由使用含於溶液中或固定於一或多個3D結構(諸如珠子)上之pH敏感染料而使該等分析結果可視化之方法。同樣，該系統可發生於一反應室或容器 中，可使用上述之組合。
因此本發明之另一目標為提供生成可藉由印刷電子裝置或比色機制觀測之pH或視覺信號之橫向流動平臺。可由至少三個或多個方法組合達成該目標。一個方法為經由使用藉由印刷電子光電導體偵測之比色介質(改變顏色或變得可見)。另一個方法為經由產生不同電壓輸出之印刷電子感測器(當感測器曝露於不同pH時記錄變化)；及使用導致整合顯示器單元上顯示結果之印刷電子感測器(當感測器曝露於不同pH時記錄變化)。在起始基線上並在一段時間內閱讀內容。然後，記錄變化且觀察到被化學或生物反應影響之pH變化臨限值。
在本發明之裝置之一較佳實施例中，該感測器為離子敏感場效應電晶體(ISFET)。使用該ISFET以感測PIT及監測pH值。OFET(有機場效應電晶體)亦有效。
因此本發明之另一目標為提供產生可藉由一印刷電子裝置觀測之pH或視覺信號之核苷酸偵測平臺(定量或定性偵測)。在該平臺上使用之擴增方法尤其係等溫或PCR，並可藉由以下3種方法或更多組合實現：
1)藉由印刷電子光電導體偵測比色介質(諸如pH染料，改變顏色或變得可見)；2)產生不同電壓輸出之阻抗印刷電子感測器(當感測器曝露於不同pH時阻抗變化)；及/或3)導致在整合顯示器單元上顯示結果之阻抗印刷電子感測器(當感測器曝露於不同pH時阻抗變化)。
在本發明之ISFET之實施例中，該裝置具有印刷為微差測量之電路，以監測在控制區、試驗區及背景區之間發生何種活動。(見圖1)。
本發明之一可選特徵使用混合方法，其包括安裝至可撓性基板或印刷電路板之一可撓性感測器組件及ASIC芯片。
1‧‧‧樣本墊
2‧‧‧聯結墊
3‧‧‧層析膜
4‧‧‧試驗線
5‧‧‧控制線
6‧‧‧吸收墊
8‧‧‧支撐物質
圖1：該圖提供一種用於測量在試驗區之感測器(ISFET1)與背景區之感測器(ISFET2)之間之信號差異之基本差模電路，且控制區為ISFET3。
圖2：一種在試驗區監測pH變化之本發明之設計。
圖3：由顏色變化監測之酶依賴性pH值。
圖4：一種本發明之pH指示劑，其中1為樣本墊，2為聯結墊，3為層析膜，4為試驗線，5為控制線，6為吸收墊及8為支撐材料。
圖5A：該圖表示利用個別組件之先前系統。
圖5B：該圖表示僅用幾個印刷步驟構成整個系統之材料之使用。
圖6：每個染料薄膜之顏色對應一pH範圍。
圖7：該照片闡釋pH薄膜在LAMP反應中針對2C19基因分型之顏色反應。
圖8：以薄膜、纖維素顆粒及可溶分子之形式測試K1化學品。
圖9：該照片展示在LAMP反應之前每個試管中染料之顏色。
圖10：該照片展示位於頂部一排之在LAMP反應中發生擴增的試管中，染料之顏色變化，而位於底部一排之在LAMP反應中無擴增的試管中，染料之顏色不變。
圖11A及B：該圖展示用於擴增偵測試驗之兩種不同薄膜。
圖12：溴百里酚藍並不產生顏色變化，且pH保持不變。
圖13：該圖闡釋實例感測器及pH試驗結果。
圖14：在LAMP反應之前，每個試管中染料之顏色為粉紅。
圖15：針對1至7試管，染料顏色隨後變為黃色，針對8至10試管，染料顏色保持粉色。
圖16：該圖表展示陽性及陰性區別反應。
圖17：該等為展示1至7泳道中之LAMP擴增之瓊脂糖電泳照片。
圖18：該圖展示在反應前之關於DNA之陽性或陰性之染料顏色。
圖19：該圖展示在反應後之關於DNA之陽性或陰性之染料顏色。
圖20：該圖為反應前對染料顏色之全血結果。
圖21：該圖為反應後之全血結果。
圖22：該圖展示在將染料振盪出溶液後經固定之染料之顏色。
圖23：該圖為每個使用瓊脂糖電泳之試管中之LAMP反應。
圖24：該圖展示在染料之存在下PCR反應之結果。
圖25：該圖為物理截留及化學連接pH指示劑染料至交聯聚合物基質之示意圖。
圖26：該圖展示當使用水凝膠板時，反應與無反應之間的顏色差異。
圖27：該圖展示pH反應染料與聚胺基甲酸酯之水凝膠在直徑2mm之纖維素乙酸酯小球上結合之實例。
本發明之一個装置包括聯結墊、吸收墊、試驗線及控制線，如圖2中闡釋。當將樣本加載至聯結墊上時，由於突起阻力，樣本朝向試驗線移動。試劑位在聯結墊(其可為樣本收集試管)中。在中間，兩者在試驗線及控制線處經印刷監視器分開。當有分析物存在時，在試驗線上形成免疫複合物。控制線指示存在活性試劑。視情況地，該條帶可包括一層析膜。
電子元件之印刷有完備記載，但診斷裝置則沒有。一些用於電子元件之印刷之技術包括有機LED顯示器、可撓性觸控屏幕、RFID超級電容器及光伏打膜。用作顯示器部份之有機LED可用不同顏色或字體展示一個是/否之答案。
智能封裝亦可用作OLED。本發明之一裝置使用OLED展示一預設訊息。
RFID可用於存貨控制及防偽。印刷電子元件之整合允許防偽(例如，本發明可完成與本地/遠端資料庫確認裝置系列代碼，以確保該裝置從未被使用或未被盜或未在該裝置未經批准之地點使用)。在本發明中，該裝置知道必須偵測何種目標，且其展示該目標及結果。
作為一實例，印刷電子元件上之內部連線可使用銀，用作導電墨水。本發明之電路使用導電墨水、半導體墨水、摻雜質及介電物質，包括分配器、比較器、反閘(NOT gate)及放大器。
本發明實例中使用之所有引物藉由Integrated DNA Technologies或賽默飛世爾(Thermo Fisher)合成。因為反應中pH染料之存在對擴增反應之影響極小，所以無需改變擴增試劑之組成。唯一例外係鎂離子(Mg2+)應足量，例如1.5mM或較佳為2mM或更高，以使得脫氧核苷酸與鎂離子形成錯合物。
LAMP係使用引物以與DNA雜交並靶向感興趣之特定序列之雙股DNA擴增方法。該擴增係藉由引物與模板DNA形成雜交、自該內引物(該內引物隨後藉由聚合酶之股置換活性被一外引物置換)延伸及目標序列及新合成股之指數式擴增來達成。
將該引物、脫氧核苷酸(dNTP)、反應緩衝液、指示劑染料及聚合酶預先混合，除聚合酶係在最後一步加入以預防非特異性反應以外，無特定步驟順序。對於使用非凍乾調配物之反應，以上試劑應裝配於冷凍盒中以預防非特異性反應。在密封容器並將該容器放至加熱塊(若需加熱)之前，在最後一步加入樣本DNA，諸如經純化之人類基因組DNA、動物DNA、植物DNA、新鮮人類全血、λ DNA、pUC19質體、不同病毒、任何核酸片段(自然生成或合成的)或嵌合、人造核酸類似物(諸如肽核酸(PNA))、嗎啉基及鎖核酸(LNA)、乙二醇核酸 (GNA)、蘇糖核酸(TNA)及合成鹼或任何其他核酸模板(諸如RNA)。在擴增反應結束時，用肉眼或用一簡單相機觀察反應容器。
其他形成本發明之目標包括但不限於脂蛋白(諸如肽)、多肽、醣蛋白(諸如α-甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、澱粉樣β及HIVp24蛋白)之胺基酸序列。
另外，本發明使用醣類聚合物諸如細菌莢膜多醣及脂多醣諸如內毒素。
使用本方法之方法、裝置及套組診斷之特定之病毒及/或細菌疾病尤其包括但不限於B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、疱疹病毒、HIV、人乳頭瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、對蝦白斑症候群、貓白血病毒。與該等疾病之診斷相關聯並形成本發明之裝置、套組及方法之蛋白質包括重組核蛋白、扎伊爾埃博拉病毒之醣蛋白及S基因蛋白、B型肝炎核心多表位、抗HCV免疫球蛋白G及重組B病毒醣蛋白。
藉由本發明診斷之細菌疾病包括梅毒、衣原體及淋病。
當使用凍乾試劑時，第一步為在加入樣本目標前，用水重懸浮乾燥之試劑。其餘步驟依照非凍乾反應描述之相同順序。
本發明亦提供藉由使用比色法測量及電子印刷法測量pH變化之裝置、套組及方法。
存在用於PCR監測之具有整合致動器(加熱器)之用矽製成之奈升反應室，參見Iordanov等人，「Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication」,IEEE(2004)229-232(以全文引用之方式併入本文中)。如Iordanov等人在上文中記載，未處理之矽及標準之與矽相關之材料係Taq聚合酶之抑制劑。因此，當使用矽或與矽相關之材料例如矽鍺或應變矽(下文中為「矽」)製造用於核酸擴增之反應室或通道時，通常用材料將其覆蓋以防止聚合酶效率由於矽而降低，諸如SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PerspexTM或玻璃。
用於PCR之微製造之矽玻璃芯片亦由Shoffner等人之於Nucleic Acid Res.(1996)24,375-379中描述，該案以全文引用之方式併入本文中。使用標準光微影程序製造矽芯片並蝕刻至115μm之深度。將PyrexTM玻璃蓋置於每個矽芯片之頂部且使矽及玻璃接合。該等為用於本發明之少數淺顯實例。其他包括經氧化之矽。
作為替代，用於PCR監測之樣本可流動通過微流體裝置之通道或反應室。因此，例如該樣本可流動通過一通道或一反應室，該通道或該反應室連續地穿過適用於變性、引物退火及引物延伸之PCR階段之不同溫度區域。
因此，在一個用於進行本方法之實施例中，用於核酸擴增之樣本流動通過一基板上之微流體通道，且其流動時，沿著該通道之長度連續穿過適用於連續重複之基板或基底提供之溫度區域。pH指示劑染料可併入上文描述之所有PCR實施例中。
雖然上文通常闡釋經設計以達成熱循環之PCR系統，多種等溫核酸擴增技術已知，例如單股置換擴增(SDA)，且可同樣依照本發明監測使用該等技術之DNA或RNA擴增。
LAMP係使用引物以與DNA雜交並靶向感興趣之特定序列之雙股DNA擴增方法。該擴增係藉由引物與模板DNA形成雜交並自該內引物(該內引物隨後藉由聚合酶之股置換活性被一外引物置換)延伸及目標序列及新合成股之指數式擴增來達成。
以下實施例係提供作為本發明之說明但並不限制本發明。
實例1
pH偵測裝置及使用該裝置之方法，該pH偵測裝置具有pH敏感感測器、用於計算信號強度之控制電路及顯示器像素，該裝置之電子器件均使用捲軸式印刷或絲網印刷。該等產品在介電材料諸如可撓性塑膠上印刷。該裝置之生產避免因裝置損壞之浪費並以大生產量生產。 該裝置可用作LFA，其中線之觀察指示反應結果。
實例2
將實例1之印刷電子元件放置於LFA條帶之頂部，其中pH敏感感測器、控制電路(計算信號強度)及顯示器像素全部經由捲軸式或絲網印刷而印刷。將該等電子組件印刷至介電材料諸如可撓性塑膠上。
特定言之，為測量pH，使印刷電子系統與層析介質接觸。監測pH之變化，正如藉由在10分鐘及在30分鐘時測量pH變化之速率來監測。膠水尤其可添加作為中間層。
實例3
印刷感測器亦包括一印刷電池或(作為可選特徵)一紐扣電池以對電路供電。電池材料之選擇不應具有火災隱患或化學危險品性質。較佳地，該電池包括一自測功能。
該印刷感測器包含一顯示監測器(例如OLED有機發光二極體)以指示結果(是/否/失敗，等)。該印刷感測器具有做簡單計算之能力。作為一可選元件，該感測器具有一通信模組(例如RFID)以上傳患者資訊及結果至基站(諸如膝上型PC、客製化基站、觸摸板、智慧型手機或其組合)。
另一可選元件為能夠從基站(例如膝上型PC、客製化行動單元、觸摸板、智慧型手機或其組合)下載患者資訊之感測器，以使得該特定裝置被「烙」上患者之ID。該等通信可視情況加密至連線系統或無線系統。
於連續印刷生產製程(例如捲軸式)中整合所有該等感測器組件。分開製造該感測器及LFA之總成。
另外，若周圍溫度不在規定可接受範圍內，則呈現一溫度感測器以補償/調整/阻止該裝置之使用。
存在用於PCR監測之具有整合致動器(加熱器)之用矽製成之奈升 反應室，參見Iordanov等人，「Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication」,IEEE(2004)229-232(以全文引用之方式併入本文中)。如Iordanov等在上文中記載，未處理之矽及標準之與矽相關之材料係Taq聚合酶之抑制劑。因此，當使用矽或與矽相關之材料例如矽鍺或應變矽(下文中為「矽」)製造用於核酸擴增之反應室或通道時，通常用材料將其覆蓋以防止聚合酶效率由於矽而降低，諸如SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PerspexTM或玻璃。
用於PCR之微加工之矽玻璃芯片亦由Shoffner等人在Nucleic Acid Res.(1996)24,375-379中描述，該案以全文引用之方式併入本文中。使用標準光微影程序製造矽芯片並蝕刻至115μm之深度。將PyrexTM玻璃蓋置於每個矽芯片之頂部且使矽及玻璃接合。該等為用於本發明之少數淺顯實例。其他包括經氧化之矽。
作為替代，用於PCR監測之樣本可流動通過微流體裝置之通道或反應室。因此，例如該樣本可流動通過一通道或一反應室，該通道或該反應室連續地穿過適用於變性、引物退火及引物延伸之PCR階段之不同溫度區域。
因此，在一個用於進行本方法之實施例中，用於核酸擴增之樣本流動通過一基板上之微流體通道，且其流動時，沿著該通道之長度連續穿過適用於連續重複之基板或基底提供之溫度區域。pH指示劑染料可併入上文描述之所有PCR實施例中。
雖然上文通常闡釋經設計以達成熱循環之PCR系統，多種等溫核酸擴增技術已知，例如單股置換擴增(SDA)，且可同樣依照本發明監測使用該等技術之DNA或RNA擴增。
本發明實施例中使用之所有引物藉由Integrated DNA Technologies或賽默飛世爾(Thermo Fisher)合成。因為反應中pH染料之存在對擴增反應之影響極小，所以無需改變擴增試劑之組成。唯一 例外係鎂離子(Mg2+)應足量，例如1.5mM或較佳為2mM或更高，以使得脫氧核苷酸與鎂離子形成錯合物。
LAMP係使用引物以與DNA雜交並靶向感興趣之特定序列之雙股DNA擴增方法。該擴增係藉由引物與模板DNA形成雜交並自該內引物(該內引物隨後藉由聚合酶之股置換活性被一外引物置換)及目標序列及新合成股之指數式擴增來達成。
將該引物、脫氧核苷酸(dNTP)、反應緩衝液、指示劑染料及聚合酶預先混合，除聚合酶係在最後一步加入以預防非特異性反應以外，無特定步驟順序。對於使用非凍乾調配物之反應，以上試劑應裝配於冷凍盒中以預防非特異性反應。在密封容器並將容器放至加熱塊(若需加熱)之前，在最後一步加入樣本DNA，諸如經純化之人類基因組DNA、新鮮人類全血、λ DNA、pUC19質體或任何其他核酸模板。在擴增反應結束時，用肉眼或用一簡單相機觀察反應容器。
當使用凍乾試劑時，第一步為在加入樣本目標前，用水重懸浮乾燥之試劑。其餘步驟依照非凍乾反應描述之相同順序。
實例4
與無機場效應電晶體(FET)相似，OFET具有一源極、汲極及閘電極。在源極及汲極之間之通道電流係藉由場效應摻雜所產生的閘極電壓調節。與矽FET比較，OFET顯示相對低之載子遷移率及穩定性但在柔韌性、生物適應性、大區域及溶液可加工性方面顯示更好的效能。因此，OFET適用於一次性感測器之應用。
實例5
本發明之診斷套組之實例包含包括層析介質之橫向流動分析裝置。該層析介質包括：(a)位於偵測區上游之樣本加載區；(b)位於樣本加載區與偵測區之間之報告載劑區，其中該報告載劑區包括可與分析物形成錯合物之報告載劑。本發明之報告載劑包括載劑及一或多種高效酶盒。高效酶盒或高效酶係定義為催化反應以使得該速率高於1000/秒/酶盒之酶組合。該值在酶學中亦稱為週轉率或Kcat；及(c)一偵測區，其中該偵測區包括用於分析物之捕獲組分及指示劑。該樣本在應用區中與測試樣本接觸，其中該測試樣本從樣本加載區沿著層析 介質移動通過報告載劑區至偵測區並流過偵測區。在向該偵測區加入一受質，其中該受質在包含報告載劑之高效酶分析物之存在下經歷反應，並由該裝置完成在該偵測區內產生對應於該測試樣本中分析物之存在與否之指示劑反應。
實例6
本發明之診斷套組之實例在層析介質中使用酶輔助擴增方法偵測分析物之存在或不存在。該分析物係生物標記諸如可由抗體或抗體類似物識別之抗原。在該實例中，該報告載劑具有隨後結合至該分析物及高效酶之第一抗體。該捕獲組分包括在不同於該第一抗體之抗原決定基結合至該分析物之第二抗體。在一個實施例中，該第一抗體共價交聯至高效酶。
該報告載劑包括鏈酶親和素及生物素化高效酶及生物素化抗體。該第一抗體經由非共價鏈酶親和素-生物素交互作用結合至或締合至高效酶。
實例7
在本發明之另一個實例中，該分析物為核酸序列。在該實例中，該報告載劑包括與目標核酸序列之一部份雜交之第一核酸序列，該目標核酸序列係與該第一核酸締合之高效酶。該第一核酸共價交聯至該高效酶。該報告載劑包括鏈酶親和素及生物素化高效酶及生物素化第一核酸。該第一核酸經由非共價鏈酶親和素-生物素交互作用締合至高效酶。
在本發明之一個實施例中，該報告載劑結合至HIV之p24蛋白質。在另一個應用中，該報告載劑結合至HIV核酸。該受質為液體溶液，其作為該裝置之部份。在最後一步將該溶液加在條帶上。
在一個實施例中，試驗線(圖4中之4)亦包括pH顏色指示劑。線(圖4中之4)之顏色在分析物之存在下改變。在C線(圖4中之5)上亦有相 同之pH顏色指示劑。顏色在報告載劑之存在下變化。在圖11中可找到實施例之實例。
在一個實施例中，pH顏色指示劑係薄膜，其放置於試驗線及控制線頂部。在另一個實施例中，pH顏色指示劑在試驗線及控制線之位置上印刷於層析介質中。
在另一實施例中，該受質溶液包含pH指示劑。試驗線(圖4中之4)之顏色在分析物之存在下顯現，此歸因於pH變化。控制線(圖4中之5)之顏色在報告載劑之存在下變化。反應之實例於圖2中展示。
在另一實施例中，目標為人類C型病毒肝炎之核心蛋白質。使對該核心蛋白質之第一抗原決定基具有特異性之第一抗體連接至報告載劑。使對該核心蛋白質之第二抗原決定基具有特異性之第二抗體固定於層析介質之偵測區上。所揭示之方法偵測至少0.5pg之蛋白質或更多。該等蛋白質包括病毒蛋白，諸如但不限於例如HIV、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、疱疹病毒；腫瘤蛋白質(針對前列腺癌之前列腺特異抗原(PSA)；針對卵巢癌之癌症抗原125(CA 125)；針對甲狀腺髓樣癌之降血鈣素；針對肝癌之α-甲胎蛋白(AFP)；及針對生殖細胞瘤(諸如睾丸癌及卵巢癌)之人類絨毛膜促性腺激素(HCG))；心血管蛋白質諸如人類心肌肌鈣蛋白T或I，或肺臟蛋白質、肝臟蛋白質、腎臟蛋白質及神經蛋白質，諸如澱粉樣β蛋白；細菌蛋白質諸如用於偵測梅毒、衣原體及淋病之彼等。
在另一實施例中，目標為針對心肌梗塞之人類心肌肌鈣蛋白T及/或心肌或/及肌鈣蛋白I。該診斷套組包括印刷電子感測器及控制電路以為快速測量提供定量結果。該套組之靈敏性亦用於高敏感性心肌肌鈣蛋白I分析。
在另一實施例中，該等電性感測器在一段時間內產生連續pH閱 讀以產生一時間依賴性pH曲線。偵測之是/否答案藉由比較不同試驗區、控制區及層析介質上之除試驗區或控制區以外之任何其他部份之曲線參照臨限值。同樣地，藉由比較試驗區、控制區及層析介質上之除測試/控制區以外之另一部份之曲線實施半定量或定量測量。另外，當監測及記錄反應隨時間之進程時，亦記錄反應之微分讀數。
實例8
圖6.每個染料薄膜之顏色對應一pH範圍。(圖6)
K1薄膜係與1-羥基-4-[4-(羥基乙基磺醯基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀結合之20微米厚度之纖維素薄膜。
K2薄膜係與4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚結合之20微米厚度之纖維素薄膜。
K1溶液係1-羥基-4-[4-(羥基乙基磺醯基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀。
K1顆粒係與1-羥基-4-[4-(羥基乙基磺醯基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀結合之直徑50微米之纖維素微粒Avicel® PH-101。
使用不同染料形式之偵測：在分析中使用三種不同形式之K1染料，K1薄膜、K1顆粒及可溶K1。該分析顯示該染料形式及該LAMP反應之相容性。建立該等LAMP反應以使用p450 2C19野生型引物組及K562基因組DNA。將約300拷貝數之1ng之K562與反應組分混合。在反應前，每個試管均包括染料。在攝氏63度下維持該反應逹30分鐘，觀測該反應之顏色。
該照片顯示pH薄膜在LAMP反應中針對2C19基因分型之顏色反應。該照片在LAMP反應後拍攝。在圖表中，該順序為K1薄膜野生型(A)或突變異種(D)；K1粉末野生型(B)或突變異種(E)；K1溶液野生型 (C)或突變異種(F)。
K1化學品以薄膜、纖維素顆粒及可溶分子之形式測試。(見圖8之上表)。使用顏色面板將2C19基因分型之顏色變化轉化為數字。該圖表顯示pH值變化(起始pH至結束pH)及顏色變化(起始顏色至結束顏色)。當顏色變化或pH變化的臨限值設定為1時，有LAMP反應之樣本與沒有LAMP反應之樣本不同。pH值變化與顏色變化100%一致。
實例9
建立該等反應以使用p450 2C19野生型引物組及K526基因組DNA。將約300拷貝數之1ng之K562與此等反應組分混合。在反應 前，每個試管均包括pH指示劑染料。在陰性對照樣本中用(脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧鳥苷三磷酸鹽、脫氧胞苷三磷酸鹽)之2.8mM混合物置換dNTP。在攝氏63度下維持該反應逹30分鐘並觀測反應之顏色。
在每個試管中，在LAMP反應前將不同的染料薄膜(K1及K2)或可溶pH指示劑(溴百里酚藍，0.1mg/mL)與擴增試劑混合。針對擴增偵測檢測兩種不同薄膜。反應設定之照片及結果展示於圖9及10中。藉由使用譯碼面板將顏色變化轉化為值。該等編譯值展示於表3中。為顯現顏色差異及擴增對未擴增，值繪製於圖8中。
結果顯示在模板存在下之顏色變化。
該照片顯示在LAMP反應前每個試管中染料之顏色。在該照片中，該等試管為具有模板(A)及不具有模板(D)之K1薄膜LAMP反應、具有模板(B)及不具有模板(E)之K2薄膜、具有模板(C)及不具有模板(F)之溴百里酚藍溶液。
圖9及10顯示在LAMP反應中發生擴增的試管(頂列)中染料之顏色變化，而在LAMP反應中無擴增的試管(底列)中染料之顏色保持不 變。在該照片中，該等試管為具有模板(A)及不具有模板(D)之K1薄膜LAMP反應、具有模板(B)及不具有模板(E)之K2薄膜、具有模板(C)及不具有模板(F)之溴百里酚藍溶液(見圖10)。
針對擴增偵測檢測兩種不同薄膜。將兩種不同pH指示劑固定於纖維素薄膜上。使用其自身顏色面板將每個薄膜之顏色變化轉化為數字。表3顯示pH值變化(起始pH至結束pH)及顏色變化(起始顏色至結束顏色)。在所有三種染料薄膜中，LAMP反應之值與無LAMP反應之值顯著不同。pH值之變化與顏色變化100%一致。在圖12中，使用瓊脂糖電泳分析每個試管中之樣本。
顏色變化之強度非常強，以使得可容易藉由肉眼觀測結果。當使用可溶染料(溴百里酚藍，0.1mg/mL)作為指示劑時，顯著之顏色變化亦存在。這顯示可使用可溶染料。
然而，在較高濃度下，染料抑制反應。當將可溶K1染料與LAMP反應混合時，亦觀測到類似性。該可溶化學品傾向於干擾及抑制擴增。
溴百里酚藍並不產生顏色變化且pH保持在8.5不變(見圖13)。
實例10
建立該等反應以使用λ引物組(圖22)及λ基因組DNA。將DNA模板稀釋至表現為1、10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000及10,000,000拷貝數λ DNA之多種濃度。在反應前每個試管中均包括K2薄膜。陰性對照並不包含λ DNA。在攝氏63度下維持該反應逹30分鐘並觀測該反應之顏色。當有擴增時，該K2薄膜顏色從深紅紫色變為 淡黃色。在本分析中敏感顯示之限度為10拷貝數。
對於試管1至7，染料顏色變為黃色。試管8至10保持粉色。結果顯示偵測之限度為10拷貝數λ DNA(見圖14及15)。
提供不同拷貝數之反應之色值及pH值結果。
在LAMP反應前，每個試管中染料之顏色為粉色。每個試管對應一λ DNA濃度(見圖14)。
對於試管1至7，染料顏色變為黃色。試管8至10保持粉色。結果顯示偵測之限度為10拷貝數λ DNA(見圖15)。
圖16
該圖表顯示可容易地區分陽性反應及陰性反應之區別。使用K2薄膜之偵測顯示低至10拷貝數之λ DNA(見圖16)。
該瓊脂糖電泳照片顯示LAMP擴增發生在泳道1至泳道7，其中拷貝數分別為10,000,000、1,000,000、100,000、10,000、1,000、100及10。泳道8對應單個拷貝之λ DNA，其中未觀測到擴增。泳道9及10為無λ DNA之反應。
實例11
在每個試管中，在LAMP反應前，將可溶pH指示劑(溴百里酚藍，0.1mg/mL)、K1薄膜及pH試紙(默克密理博(Merck Millipore)器材，目錄號1.09543.0001，不滲出試紙)與擴增試劑混合。
建立該等反應以使用p450 2C19野生型引物組及K526基因組DNA。將約300拷貝數之1ng之K562與反應組分、50mM KCl、5mM MgSO4、5mM NH4Cl、1M三甲銨乙內酯、1mg/mL BSA、0.1%吐溫20(Tween 20)、2.8mM dNTP(脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧胸苷三磷酸鹽、脫氧鳥苷三磷酸鹽及脫氧胞苷三磷酸鹽)、1.6μM FIP及BIP、0.8μM Loop-F及Loop-B、0.2μM F3及B3、及32U之Bst聚合酶在50uL反 應中混合。在加入Bst、K562或全血前，將pH調整到8.0。在陰性對照樣本中用(脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧鳥苷三磷酸鹽、脫氧胞苷三磷酸鹽)之2.8mM混合物置換dNTP。在另一面板中，將從手指扎針採集之2微升新鮮全血加入每個試管中。在攝氏63度下維持該反應逹30分鐘並觀測該反應之顏色。
除K1薄膜外，所有其他都很難觀察在全血存在下擴增相對無擴增之間的差別。由於可簡單容易地從K1薄膜中除去渾濁的全血溶液，故可如照片中所展示監測核酸擴增。
該照片顯示在反應前有(陽性)或無(陰性)經純化之DNA之染料顏色。該反應使用經純化之DNA作為模板。從左至右，試管包含染料：溴百里酚藍(A及B)、K1薄膜(C及D)及pH試紙(E及F)。在pH為8時試管A及B為淡藍色，試管C及D(K1薄膜)為深紅紫色，且試管E及F(默克密理博之pH試紙)為褐綠色。
該照片顯示在反應後有(陽性)或無(陰性)DNA模板之染料顏色。 當在反應中有DNA模板時，染料顏色變化。試管B(溴百里酚藍)從淡藍色變為黃色。試管D(K1薄膜)從深紅紫色變為橘色。試管F(pH試紙)從褐綠色變為淡黃色。
該照片顯示在反應前全血對染料顏色之作用。具有模板DNA之試管貼上正號之標籤而無添加之DNA之試管貼上負號之標籤。每個試管包含2微升新鮮全血。從左至右，試管包含溴百里酚藍(A及B)、K1薄膜(C及D)及pH試紙(E及F)。在pH為8時溴百里酚藍為淡藍色，K1薄膜為深紅紫色，而默克密理博之pH試紙很難確定顏色，此歸因於不同顏色之混合。
該照片顯示反應後之全血作用可溶染料(溴百里酚藍(A及B))之顏色在全血存在下變得不能辨別。
該照片顯示在將染料振盪出溶液後經固定之染料之顏色。在K1薄膜(C及D)及pH試紙(E及F)之情況中，可從經固定之染料中除去全血。移除之過程無需使用者打開試管，因此沒有污染之風險。除去全血後，pH試紙之顏色亦難以區分無擴增(E)及擴增(F)。此歸因於試紙多孔滲水之結構困住全血。K1薄膜之顏色係唯一顯示在無擴增(C，色值=3)及擴增(D，色值=1)之間不同區別之反應。
每個試管中之LAMP反應使用瓊脂糖電泳。BTB為溴百里酚藍(見圖23)。
實例12
PCR實施例
在PCR中使用用於監測核酸擴增之指示劑染料薄膜。該薄膜與PCR反應條件相容。在一個實例中，藉由使用包含C型病毒肝炎核心1b基因之質體進行該分析。在PCR反應前用染料薄膜建立該等反應。將每個反應之pH調整為8.0至8.2之間。該熱循環程序開始於在攝氏94度下經歷2分鐘之初始變性，並將以下三步驟模組重複55次：攝氏94度下歷時30秒、攝氏65度下歷時20秒、攝氏72度下歷時15秒。該反應之最後一步在攝氏72度下維持2分鐘後反應結束。將試管從機器中取出後觀察試管顏色。
結果顯示有擴增之試管(黃色)及無擴增之試管(粉色)之間不同之顏色區別。
在染料存在下之PCR反應之結果提供於圖33中。K1薄膜顯示於A、C、E及G中，而K2薄膜顯示於B、D、F及H中。PCR反應前，所有薄膜均顯示橘色。PCR反應後，無擴增之試管(E及F)顯示粉色。發生擴增之具有質體模板之試管顯示黃色(G及H)。
實例13
一直以來都希望開發一種可偵測基因而無需樣本製備且從樣本至最終結果無需多於2個步驟且亦無需結果闡釋之工具之分析。本發明提供實現該等要求之方法。基因在直接從手指扎針採集之全血存在下擴增。藉由使用經固定之染料監測擴增來偵測基因之存在。結果削減所有該等步驟至1個步驟。
首先，將水從預定體積之容器裝入至一或多個包含在指示劑染料存在下之凍乾擴增試劑之反應容器中，並將樣本(諸如全血)裝入至該(等)反應容器中。
為預防污染，該容器應維持在任何核酸擴增後工具保持緊密密封。當擴增試劑為非澄清溶液諸如全血擴增時，在無任何工具之幫助下，擴增結果通常難以讀取。為克服來自與樣本一起帶入的懸浮膠狀顆粒或有色化合物之干擾，通常藉由稀釋或加熱或兩種方法預處理樣本。該等實例涵蓋無諸如DNA螯合螢光染料、YO-PRO-1或Sybr Green(Genome Letters,2,119-126,2003)、金屬螯合染料、鈣黃綠素及羥基萘酚藍(Biotechniques,46,167-172,2009)之工具之習知偵測。
本發明展示該染料化學品(K1及K2)係共價連接至安裝於發生擴增之容器中之水凝膠3D物件。本發明所揭示之內容顯示，使用與K1或K2結合之薄膜允許肉眼容易讀取核酸擴增之結果。然而，在不打開反應容器的情況下，並不總是容易在容器中自薄膜分離溶液，因為薄膜趨向於黏著在容器壁上。該3D物件藉由使指示劑染料與容器之間之接觸表面最小化而解決此問題。
該3D物件為球體，以使得在該3D物件與試劑之間之接觸面積為最小。可藉由對一球體(諸如聚苯乙烯球、纖維素球或由其他材料製造之球)塗覆一層水凝膠來形成該3D球體。可選擇不同之球體顏色以增強與指示劑染料顏色之反差以促進肉眼更好地讀取顏色變化。
本發明亦描述一種受外部磁場影響之設計，其中該染料為一指示劑球或一3D染料指示劑物件。當在該3D物件或球體中植入順磁性或鐵磁性物質時，可控制染料之位置，以使得可在無渾濁溶液干擾下觀察該染料，且在容器安全密封時可如此操作。該植入係如在塗覆水凝膠前將一鐵針壓入一聚合物球體中一樣簡單。
而在另一實施例中，該3D物件係在外部磁力影響下可形成一串3D物件之小顆粒之集合。該等顆粒具有相當於球體的微米直徑或其他可適度簡單地進行磁力操作之尺寸。
水凝膠由聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(PHEMA)、聚胺基甲酸酯(PU)、聚(乙二醇)(PEG)、聚甲基丙烯酸乙二醇酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯啶酮)(PVP)或聚醯亞胺(PI)組成。
該染料為任何反應性乙烯基磺醯基染料或pH指示劑染料。
藉由使用聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)形成水凝膠，該水凝膠係與K2染料結合，K2染料亦稱作4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚指示劑染料(乙烯基磺醯系染料)。
材料為：甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚(pH指示劑染料)、硫酸、氫氧化鈉及碳酸鈉。
水凝膠製備
在水凝膠中使用之試劑之化學組成於表6中給出。
表5：用於形成水凝膠之試劑之化學組成。
所有試劑在稱重後一起加入，且攪拌10分鐘以獲得均勻混合物。將此混合物溶劑澆注至玻璃培養皿中。UV照射該培養皿3分鐘，其中進行聚合及交聯反應。在UV下發生DMPA(光引發劑)之分解，從而使每個光引發劑分子生成兩種基團。該等基團觸發HEMA之聚合以形成PHEMA並同時活化聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(交聯劑)以進行PHEMA鏈之分子間交聯反應。3分鐘後，從培養皿中將水凝膠分層並蘸上DI水歷時1小時以確保除去所有副產物及未反應之試劑。
以4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚化學著色PHEMA水凝膠
在一典型固定程序中，將100mg指示劑染料與1g濃硫酸徹底地混合(用杵在研缽中搗)並在室溫下靜置30分鐘。此使指示劑染料之2-羥基乙烷磺醯基轉化為磺酸根。然後將混合物倒入900ml蒸餾水中並用1.6ml 32%之氫氧化鈉溶液中和。然後，將25.0g碳酸鈉溶於100ml水中且隨後加入5.3ml 32%之氫氧化鈉溶液。在此階段，將PHEMA水凝膠層置入該染料溶液中。在鹼性條件下，磺酸鹽染料轉化為化學反應性乙烯基磺醯基衍生物，同時發生乙烯基磺醯基與聚合物之反應性基團(例如PHEMA水凝膠之羥基)之邁克爾加成。12小時後，從染色浴 中除去有色層並用蒸餾水洗滌數次。
在此階段，染料分子以化學方法連接至交聯聚合物基質。同時歸因於水凝膠吸收水溶液之能力，染料被物理性載入至基質中。此為如下文所示之染料結合至聚合物之非共價類型。在充分洗滌後，染料停止從水凝膠滲出，且在此階段將有色水凝膠切割成小片以用於核酸檢測。
實例14
建立該等反應以使用λ引物組及λ DNA。在水凝膠片之存在下，將約100億拷貝數之λ DNA與反應組分混合(試管2)。在陰性對照樣本中用(脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧鳥苷三磷酸鹽、脫氧胞苷三磷酸鹽)之2.8mM混合物置換dNTP(試管1)。在攝氏63度下維持該反應逹30分鐘，並觀測該反應之顏色。水凝膠片為約2mm x 4mm x 1mm。在反應結束後，很顯然在所有四種脫氧核苷酸之存在下，水凝膠片從紅紫色變為橘色，而當缺失之脫氧胸苷三磷酸鹽阻止LAMP反應時，顏色保持紅紫色。
當使用水凝膠片時，反應對無反應之間的顏色差異提供於圖26中。
經pH反應性染料結合之聚胺基甲酸酯水凝膠在直徑2mm之醋酸纖維素球體上之實例。
核殼水凝膠顆粒之pH反應。塗覆水凝膠之醋酸纖維素與pH指示劑染料共價連接，並顯示染料之顏色。在pH為7時，顏色為黃色。在pH為8.5時，顏色為紅紫色。
λ引物組
λ_FIP 5'-CAGCATCCCTTTCGGCATACCAGGTGGCAAGGGTAATGAGG-3'
λ_BIP 5'-GGAGGTTGAAGAACTGCGGCAGTCGATGGCGTTCGTACTC-3'
λ_F3 5'-GAATGCCCGTTCTGCGAG-3'
λ_B3 5'-TTCAGTTCCTGTGCGTCG-3'
λ_LF 5'-GGCGGCAGAGTCATAAAGCA-3
λ_LB 5'-GGCAGATCTCCAGCCAGGAACTA-3'
CYP2C19引物組
2C19_F3 5’-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT C-3’
2C19_B3 5’-AGG GTT GTT GAT GTC CAT-3’
2C19_FIP.野生 5’-CCG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3’
2C19_BIP.野生 5’-CGG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3’
2C19_FIP.突變 5’-CTG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3’
2C19_BIP.突變 5’-CAG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
2C19_LF 5’-GAT AGT GGG AAA ATT ATT GC-3’
2C19_LB 5’-CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TT-3’
引物序列：
實例15
製造一種裝置，其中感測器及偵測電路係電子印刷並使用。建立一具有三層之pH感測器。一層儲藏受質或待測之分析物。其亦包含至少兩個電極，每個均由pH感測物質覆蓋。在該實例中使用聚苯胺。最終，第三層作為絕緣體以在電極與受質或分析物之間放置障壁。
電阻器及電池亦為該系統或裝置之部份。
為測量本實例中被測量之電阻變化，使用一分配器電路以使值作為電壓變化而測量。
使用本裝置測量特定使用之pH水平。若需測量pH範圍，則使用多於一個分配器電路。此外，為待測量之潛在線性或其他反應取多個時間讀數。
實例16
使用聚苯胺作為覆蓋兩個平面光電導體之薄膜。該聚苯胺薄膜用作一顏色控制過濾器。本裝置之一個光電導體用作一控制器，且其聚苯胺薄膜並不接觸測量pH變化之分析物。另一個光電導體為本裝置之檢測部份，且其聚苯胺薄膜與分析物反應並基於pH反應改變顏色。亦提供用於電池之電壓分配器。聚苯胺在酸性pH下為綠色且在鹼性pH下為藍色。
1‧‧‧樣本墊
2‧‧‧聯結墊
3‧‧‧層析膜
4‧‧‧試驗線
5‧‧‧控制線
6‧‧‧吸收墊
8‧‧‧支撐物質

Claims (87)

  1. 一種醫藥試驗裝置，該裝置包括：印刷電子電路、顯示器及電池、一感測器、一監視器、一閱讀及顯示單元，其中該等電子元件中之至少一者係經印刷或其中該裝置使用比色介質以偵測在測量化學或生物反應中之顏色變化。
  2. 如請求項1之裝置，其中該裝置係一整合試驗橫向流動裝置。
  3. 如請求項2之整合試驗橫向流動裝置，其中該等電子元件係使用有機半導體材料印刷。
  4. 如請求項3之整合試驗橫向流動裝置，其中該等有機半導體材料為聚(3-己基噻吩)、并五苯、聚三芳胺、5',5-雙-(7-十二烷基-9H-茀-2-基)-2,2'-雙噻吩、聚乙烯、萘二甲酸酯、聚(4,4'-二癸基雙噻吩-共聚-2,5-噻吩并[2,3-b]噻吩、聚苯胺或其組合。
  5. 如請求項2之整合試驗橫向流動裝置，其中該等電子元件係使用無機材料印刷。
  6. 如請求項5之整合試驗橫向流動裝置，其中該等無機材料為過氧化鉭、氯化銀、銀漿、矽、二氧化矽、氮化矽、氧化鋁、礦物半導體、金屬、金屬氧化物或其組合。
  7. 一種包含層析介質之裝置之診斷套組，該裝置包括：(i)位於偵測區上游之一樣本加載區；(ii)位於該樣本加載區與偵測區之間之一報告載劑區，其中該報告載劑區包括可與分析物形成錯合物之報告載劑且其中該裝置包含該報告載劑(一載劑及一或多種高效酶盒)；及(iii)一偵測區，其中該偵測區包括用於該分析物之捕獲組分及一指示劑。
  8. 如請求項7之套組，其另外包括：具有試驗樣本之樣本加載區，其中該試驗樣本從樣本加載區沿著層析介質移動通過報告載劑 區至偵測區並流過偵測區。
  9. 如請求項8之套組，其另外包括：具有試驗樣本之樣本加載區，其中該試驗樣本在載入樣本加載區前與該報告載劑混合。
  10. 如請求項9之套組，其另外包括：向該偵測區加入一受質，其中該受質在包含報告載劑之高效酶分析物之存在下經歷反應，並在該偵測區內產生對應於該試驗樣本中分析物之存在與否之指示劑反應。
  11. 一種在層析介質中使用酶輔助擴增方法來偵測分析物之存在之診斷套組，該套組包括：一作為生物標記之分析物、一識別該生物標記之實體、一具有結合至該分析物之第一實體之報告載劑、及一捕獲組分。
  12. 如請求項11之診斷套組，其中該生物標記係一抗原，該捕獲組分係在不同於該第一抗體之抗原決定基結合至該分析物之第二抗體。
  13. 如請求項12之診斷套組，其中該第一抗體係共價交聯至一高效酶。
  14. 如請求項13之診斷套組，其中該報告載劑包括鏈酶親和素及生物素化高效酶及生物素化抗體，其中該第一抗體經由非共價鏈酶親和素-生物素交互作用與高效酶締合。
  15. 如請求項11之診斷套組，其中該分析物係核酸之序列。
  16. 如請求項15之診斷套組，其中該報告載劑包括一與目標核酸序列之一部份雜交之第一核酸序列，且其中該高效酶與該第一核酸締合。
  17. 如請求項16之診斷套組，其中該第一核酸係共價交聯至該高效酶。
  18. 如請求項17之診斷套組，其中該報告載劑包括：鏈酶親和素及 生物素化高效酶及生物素化第一核酸，且其中該第一核酸經由非共價鏈酶親和素-生物素交互作用締合至該高效酶。
  19. 如請求項11之診斷套組，其中該報告載劑結合至HIV之p24蛋白、HBV、HCV、HPV或疱疹病毒；梅毒、衣原體及淋病之細菌蛋白之核酸或蛋白質；脂蛋白或其核酸；醣蛋白或其核酸。
  20. 如請求項15之診斷套組，其中該報告載劑結合至HIV核酸。
  21. 一種用於測量化學或生物反應之方法，該方法包括：使用包含至少一個選自電路、顯示器、電池、感測器、監視器、閱讀單元、顯示單元之群之電子元件之一印刷電子裝置，加入一分析物；觀察該反應；讀取結果；其具有一資料輸入及資料輸出機制及一電力輸入機制。
  22. 如請求項21之方法，其中該裝置為一橫向流動裝置或微流體裝置。
  23. 如請求項1之裝置，其中該裝置使用比色介質來偵測顏色變化或使化學或生物反應可視化。
  24. 如請求項23之裝置，其中該比色介質為一pH敏感指示劑染料。
  25. 如請求項24之裝置，其中該pH敏感染料係含於溶液中；固定於一個或多個3D結構上；固定於一反應室或容器中；或其組合。
  26. 一種用於測試pH變化之方法，該方法包括：使用如請求項25之裝置來測量該pH變化。
  27. 如請求項25之裝置，其中該pH敏感染料係固定於一或多個3D結構上。
  28. 如請求項25之裝置，其中該pH敏感染料係固定於一反應室或容器中。
  29. 如請求項25之裝置，其中pH敏感染料之組合係固定於溶液中、或一或多個3D結構上或一反應室或容器中。
  30. 如請求項1之裝置，其中該等印刷電子元件為奈米顆粒、奈米管、石墨烯或其組合。
  31. 如請求項1之裝置，其中該等印刷電子元件係藉由原子層沉積、蒸氣沉積、噴印、捲軸式印刷、絲網印刷或其組合印刷。
  32. 如請求項1之裝置，其另外包括：電晶體、控制電路、信號電路、顯示電路、電池、用於資料記錄之輸入及輸出及電源。
  33. 一種用於測量pH變化之裝置，其中該裝置包括：一包含一試驗線、一控制線及一聯結墊之印刷感測器系統。
  34. 如請求項33之裝置，其進一步包括一吸收墊。
  35. 如請求項32之裝置，其中該裝置提供是/否半定量或定量顯示器；在最初未發現線的地方出現一條線；在白色背景上出現一條線；出現不同圖案；顏色變化；線消失；或其組合。
  36. 如請求項33之裝置，其中展示具有關於分析結果之文字資訊之至少一個發光二極體或一發光二極體陣列。
  37. 一種醫藥試驗裝置，該裝置包括：一印刷電池、一印刷感測器及一用來上傳資訊之通信模組，其中該通信模組上傳資訊至一基站。
  38. 一種包括層析介質之整合試驗橫向流動裝置，其具有一位於偵測區上游之樣本加載區；一報告載劑區；一偵測區，其中該報告載劑係位於該樣本加載區與該偵測區之間。
  39. 如請求項38之裝置，其中該報告載劑包括一載劑及一種或多種高效酶。
  40. 如請求項39之裝置，其中在層析介質中藉由酶輔助擴增方法來偵測分析物之存在與否。
  41. 如請求項40之裝置，其中該分析物為一由抗體識別之生物標記抗原。
  42. 如請求項41之裝置，其中該報告載劑包括一結合至該分析物之第一抗體及高效酶；及該捕獲組分包括一在不同於該第一抗體之抗原決定基結合至該分析物之第二抗體。
  43. 如請求項42之裝置，其中該報告載劑係鏈酶親和素、生物素化高效酶、生物素化抗體及/或其組合。
  44. 如請求項43之裝置，其中該分析物係核酸序列。
  45. 如請求項41之裝置，其中該報告載劑結合至HIV核酸。
  46. 如請求項24之裝置，其包括：1-羥基-4-[4-(羥基乙基磺醯基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀或4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚之指示劑染料或任何反應性乙烯基磺醯基染料或其組合。
  47. 如請求項25之裝置，其中該指示劑染料係混合於反應試劑中。
  48. 如請求項25之裝置，其中該pH指示劑染料在反應前係擴增試劑之部份。
  49. 如請求項25之裝置，其中該pH指示劑染料係在反應後加入。
  50. 如請求項25之裝置，其中該pH指示劑係固定於薄顆粒微粒、薄膜或三維物件上。
  51. 如請求項50之裝置，其中該等顆粒為由聚合物、多孔顆粒或核殼顆粒製成之微粒，且其中該染料係共價結合至該等微粒。
  52. 如請求項51之裝置，其中該等顆粒係由聚合物、多孔顆粒或核殼顆粒製成。
  53. 如請求項52之裝置，其中一或多種顆粒可以離散粒子、組合至少一種或多種顆粒的形式實現。
  54. 如請求項50之裝置，其中該三維物件係受外部磁力影響。
  55. 如請求項50之裝置，其中該薄膜係與pH指示劑染料共價結合之薄膜。
  56. 如請求項50之裝置，其中該三維物件係由水凝膠製造或係塗覆於毫米或微米尺寸之非水凝膠三維物件之表面上。
  57. 如請求項56之裝置，其中該三維物件係與非水凝膠材料混合以增加質量密度，從而強化由非水凝膠材料之有色背景引入的顏色強度。
  58. 如請求項56之裝置，其中該三維物件係在外部磁力影響下形成一串三維物件之小顆粒之集合。
  59. 如請求項58之裝置，其中該三維物件係一或多個毫米顆粒，且其中該等毫米顆粒在外部磁力影響下在反應容器中移動。
  60. 如請求項56之裝置，其中該水凝膠係由聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(PHEMA)、聚胺基甲酸酯(PU)、聚(乙二醇)(PEG)、聚甲基丙烯酸乙二醇酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯啶酮)(PVP)或聚醯亞胺(PI)或其組合製成。
  61. 如請求項23之裝置，其中一或多種指示劑染料用作起始pH之指示劑。
  62. 如請求項61之裝置，其中使用一或多種pH指示劑，其中每個pH指示劑具有一不同pKa。
  63. 如請求項61之裝置，其中使用至少兩種pH指示劑來給出起始pH超出範圍之指示。
  64. 如請求項61之裝置，其中當在反應前不存在線的地方出現一條線或其他圖案則指示觀測到化學或生物反應。
  65. 如請求項61之裝置，其中比色變化指示觀測到化學或生物反應。
  66. 如請求項23之裝置，其中使用一擴增方法來進行反應且該方法係熱循環方法或等溫方法。
  67. 如請求項66之方法，其中該熱循環方法係PCR、實時PCR或逆轉錄PCR。
  68. 如請求項66之方法，其中該等溫方法係環介導擴增(LAMP)、股置換擴增(SDA)、重組聚合酶擴增(RPA)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、轉錄介導擴增(TMA)、SMART(Nucl.Acids Res.29：e54,2001)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、交叉引物擴增(CPA)、滾動循環擴增(RCA)、分枝滾動循環擴增(RAM)、切口酶擴增反應(NEAR)、切口酶介導擴增(NEMA，CN100489112 C)、等溫鏈擴增(ICA)、指數擴增反應(EXPAR)、信標輔助偵測擴增(BAD AMP)、引物生成之滾動循環擴增(PG-RCA)或其他核酸擴增方法，其中該擴增並不需要熱循環。
  69. 一種偵測核酸擴增之套組，該套組包括：(a)一個或多個容器、(b)擴增試劑、及(c)至少一種pH指示劑。
  70. 如請求項69之套組，其中該pH指示劑係1-羥基-4-[4-(羥基乙基磺醯基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀或4-[4-(2-羥基乙烷磺醯基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚或任何反應性乙烯基磺醯基染料或其組合。
  71. 一種pH偵測裝置，其包括：一控制用於計算信號強度之電路之pH敏感感測器組件及顯示器像素組件，其中該等組件係印刷於介電材料上。
  72. 如請求項71之裝置，其中該介電材料係可撓性塑膠。
  73. 一種用於偵測化學或生物樣本中之比色變化之裝置，該裝置包括：a.至少兩個電子式印刷於電極上之光電導體；b.一覆蓋其中一個光電導體之有機薄膜，其中該覆蓋其中一個光電導體之一薄膜係用作一控制器且不與試驗介質互相作 用；c.一偵測另一光電導體之顏色變化之pH測量裝置；d.一電池；及e.資料及電力輸入及輸出。
  74. 如請求項73之裝置，其中用作該薄膜之有機材料係聚丙胺酸且其中pH變化反映為顏色變化。
  75. 一種藉由使用依照pH變化測量導電率之印刷電子元件來測量pH變化之裝置，該裝置包括：a.一隔間或層，其中放置至少兩個電極且其中該等電極係印刷電極且其中放置一受質或分析物；b.此後，一包含印刷pH感測材料之第二隔間或層；及c.一具有絕緣性以在該等印刷電極與該受質或分析物之間產生障壁之第三隔間或層。
  76. 如請求項75之裝置，其另外包括一分配器電路以記錄轉化為可測量電壓的電阻。
  77. 如請求項76之裝置，其中該電壓變化係以電泳及/或電層析方式顯示。
  78. 一種用於感測化學及/或生物反應之方法，該方法包括：a.偵測電信號輸出；b.監測當化學及/或生物反應中pH變化時之電信號；其中該等用於電子偵測該反應之偵測及監測組件中之至少一者係位在物質上。
  79. 如請求項78之方法，其中該化學及/或生物反應之偵測係在一單一區域中；使用差動輸出；或測量在反應過程中不同時間點之pH。
  80. 如請求項79之方法，其中該反應係PCR反應、實時PCR或逆轉錄 PCR。
  81. 如請求項78之方法，其中該反應係比色反應。
  82. 如請求項79之方法，其中該反應係等溫反應。
  83. 如請求項77之方法，其中該等溫反應係單股置換擴增(SDA)、DNA擴增、RNA擴增或其組合。
  84. 如請求項23之方法，其中該敏感指示劑染料係與擴增試劑一起經凍乾。
  85. 如請求項23之方法，其中使用至少兩種pH指示劑來給出起始pH超出範圍之指示。
  86. 如請求項85之方法，其中每個敏感指示劑染料用作起始pH之指示劑。
  87. 如請求項79之方法，其中該等溫方法係環介導擴增(LAMP)、股置換擴增(SDA)、重組聚合酶擴增(RPA)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、轉錄介導擴增(TMA)、SMART(Nucl.Acids Res.29：e54,2001)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、交叉引物擴增(CPA)、滾動循環擴增(RCA)、分枝滾動循環擴增(RAM)、切口酶擴增反應(NEAR)、切口酶介導擴增(NEMA，CN100489112 C)、等溫鏈擴增(ICA)、指數擴增反應(EXPAR)、信標輔助偵測擴增(BAD AMP)、引物生成之滾動循環擴增(PG-RCA)或其他核酸擴增方法，其中該擴增並不需要熱循環。
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