ES2927062T3 - Dispositivos y procedimientos para modificar propiedades ópticas - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan dispositivos y métodos para modificar las propiedades ópticas de muestras biológicas o aspectos de las mismas. Los métodos en cuestión incluyen generar un producto de reacción con un dispositivo y hacer reaccionar el producto de reacción para modificar suficientemente una propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivos y procedimientos para modificar propiedades ópticas
Los ensayos biológicos se utilizan para determinar una o más características de las muestras biológicas. Estos ensayos pueden evaluar cualitativamente y/o medir cuantitativamente la presencia, la cantidad y/o la actividad funcional de uno o más analitos en una muestra biológica. Dicha evaluación puede realizarse sobre la base de un cambio o de la ausencia de cambio en el ensayo. Por ejemplo, un cambio en la transmitancia y/o el color de una muestra biológica que se produce en condiciones particulares durante un ensayo puede indicar una o más características de la muestra que se está evaluando.
El documento US2008/000892 describe microplacas que pueden precargarse con al menos algunos materiales componentes del ensayo, como reactivos, y que pueden incorporarse una vez llenas a un termociclador de un sistema de detección de secuencias de alta densidad para analizar muestras biológicas.
El documento US2008/233015 describe dispositivos de sellado para microplacas para el análisis de muestras biológicas.
Sumario de la invención
La materia para la que se solicita protección es la definida en las reivindicaciones.
Se proporcionan dispositivos y procedimientos para modificar las propiedades ópticas de muestras biológicas o aspectos de las mismas. Los procedimientos en cuestión incluyen la generación de un producto de reacción con un dispositivo y la reacción del producto de reacción para modificar suficientemente una propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada, como por ejemplo por un ojo humano no asistido.
La divulgación en cuestión incluye dispositivos de modificación de las propiedades ópticas de los ensayos de muestras biológicas. En algunas versiones, una muestra biológica empleada en un dispositivo de ensayo es una muestra de amplificación de ácido nucleico. Varias realizaciones de los dispositivos divulgados incluyen un cartucho receptor de muestras que tiene una o más cámaras de reacción, por ejemplo, cámaras de reacción microfluídicas, para recibir una muestra biológica y cada una de ellas incluye un reactivo modificador de las propiedades ópticas, por ejemplo, un reactivo de ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), y/o una composición de amplificación de ácidos nucleicos. Un cartucho receptor de muestras puede incluir una entrada de muestras que conecta operativamente cada una de las una o más cámaras de reacción.
En algunas versiones de los dispositivos, cada una de las una o más cámaras de reacción incluye una primera abertura en un primer lado del cartucho receptor de muestras y una segunda abertura en un segundo lado del cartucho receptor de muestras, en el que el primer lado es opuesto al segundo lado y la capa adhesiva forma una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción sellando cada segunda abertura. En varios aspectos de los dispositivos, los dispositivos incluyen un elemento de ventilación selectiva, por ejemplo, un elemento de ventilación selectiva de polietileno, que forma una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción. En algunas realizaciones, un elemento de ventilación selectiva sella cada primera abertura. Según varias realizaciones, un cartucho receptor de muestras es transparente y/o incluye un material polimérico como el polietileno.
Los dispositivos también tienen un sustrato, por ejemplo, un sustrato de placa de circuito impreso, que puede incluir un elemento calefactor y una fuente de energía operativamente acoplada al elemento calefactor. Los elementos calefactores son elementos configurados para generar energía térmica y pueden estar próximos a una o más cámaras de reacción. Por "próximo" se entiende cercano. En algunas versiones, los elementos de calentamiento pueden estar configurados para calentar una muestra en una o más cámaras de reacción. Un sustrato también puede incluir una unidad de control y/o un sensor para detectar la presencia de la muestra en la una o más cámaras de reacción. En algunas versiones, una unidad de control activa un elemento calefactor para calentar una muestra en la una o más cámaras de reacción cuando un sensor detecta la muestra en la una o más cámaras de reacción. Una unidad de control también puede estar configurada para realizar un análisis colorimétrico de una muestra en la una o más cámaras de reacción. El sustrato también puede incluir una fuente de luz que emite luz cuando el sensor detecta la muestra en la una o más cámaras de reacción.
Los dispositivos en cuestión también incluyen una capa adhesiva que conecta operativamente el cartucho receptor de muestras y el sustrato, formando así una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción. Una capa adhesiva, en algunas variaciones, se compone de una primera capa laminada con una segunda capa. Una capa adhesiva puede ser transparente, reflectante y/o incluir uno o más adhesivos, por ejemplo, un adhesivo acrílico. La capa adhesiva también puede ser opaca y/o blanca. En algunas versiones, la capa adhesiva no incluye un ácido.
Los dispositivos en cuestión también incluyen una carcasa. La carcasa incluye una primera porción y una segunda porción acoplable con la primera porción para encapsular el cartucho receptor de muestras, el sustrato y la capa adhesiva. Los dispositivos en cuestión pueden ser dispositivos sostenibles en mano. Así, en algunas versiones, las carcasas tienen un volumen de 300 cm3 o menos.
La divulgación del objeto también incluye procedimientos para modificar una propiedad óptica en un ensayo de muestra biológica. Dichos procedimientos incluyen la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción de un cartucho receptor de muestras de un dispositivo modificador de propiedades ópticas de ensayo de muestras biológicas, en el que las cámaras incluyen cada una un reactivo modificador de propiedades ópticas, generando así una mezcla de reacción. En algunos aspectos, la transmisión de una muestra biológica a la una o más cámaras de reacción incluye el flujo de la muestra a través de una entrada de muestra que conecta operativamente cada una de las una o más cámaras de reacción. La transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción también puede incluir el flujo de un gas, por ejemplo, aire, a través de un elemento de ventilación selectivo.
Según algunos aspectos, un sustrato incluye un sensor, y la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción incluye la detección de la muestra en la una o más cámaras de reacción con el sensor. Un sustrato también puede incluir una fuente de luz, y la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción puede incluir la activación de la fuente de luz para que emita luz. Además, en algunos aspectos, un dispositivo modificador de propiedades ópticas incluye una carcasa que tiene una primera porción que incluye un receptáculo, y una segunda porción acoplable con la primera porción para encapsular el cartucho receptor de muestras y el elemento calefactor. En tales realizaciones, la transmisión de la muestra biológica a la una o más cámaras de reacción puede incluir el flujo de la muestra a través del receptáculo.
Los procedimientos también incluyen el calentamiento de la mezcla de reacción con un elemento calefactor del dispositivo, generando así un producto de reacción. En algunos aspectos, el calentamiento acelera una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico y la composición de amplificación, generando la reacción un ácido nucleico amplificado y el producto de reacción, donde el producto de reacción comprende una pluralidad de protones.
Según algunas realizaciones, los procedimientos incluyen hacer reaccionar el producto de reacción con el reactivo modificador de propiedades ópticas, en el que la reacción modifica suficientemente una propiedad óptica del reactivo modificador de propiedades ópticas para permitir la detección de la propiedad óptica modificada, tal como por un ojo humano no asistido y/o un dispositivo, tal como un dispositivo de detección de propiedades ópticas, tal como un dispositivo que incluye una cámara.
En algunos aspectos de los procedimientos, un dispositivo de modificación de las propiedades ópticas incluye un elemento de ventilación selectiva. En tales aspectos, los procedimientos pueden incluir la contención de la muestra en la una o más cámaras de reacción con el elemento de ventilación selectiva.
La modificación de una propiedad óptica de la muestra biológica también puede, en varios aspectos, incluir la realización de un análisis colorimétrico de una muestra en la una o más cámaras de reacción con una unidad de control. Este análisis puede realizarse sobre el producto de reacción después de hacerlo reaccionar con el reactivo modificador de las propiedades ópticas. En algunas versiones, un cartucho receptor de muestras es transparente, y la realización de un análisis colorimétrico incluye la detección de una o más características de la luz transmitida a través del cartucho receptor de muestras. Los procedimientos también pueden incluir la realización de un análisis colorimétrico de un producto de reacción después de hacerlo reaccionar con un reactivo modificador de las propiedades ópticas, en el que la capa adhesiva es de color blanco opaco, y en el que la realización del análisis colorimétrico incluye la inspección visual de las cámaras para detectar una propiedad óptica modificada.
En algunos aspectos, cada una de las una o más cámaras de reacción incluye una primera abertura en un primer lado del cartucho receptor de muestras y una segunda abertura en un segundo lado del cartucho receptor de muestras, donde el primer lado es opuesto al segundo lado. Según algunas versiones de los procedimientos, un dispositivo modificador de propiedades ópticas incluye una capa adhesiva que forma una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción sellando cada segunda abertura, y en el que la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción incluye contener la muestra en la una o más cámaras de reacción con la capa adhesiva.
También se proporcionan en el presente documento procedimientos de modificación de una propiedad óptica con el dispositivo modificador de propiedades ópticas del ensayo de muestras biológicas. Estos procedimientos incluyen la generación de un producto de reacción a partir de una muestra biológica. Dichos procedimientos también pueden incluir la reacción del producto de reacción con el reactivo modificador de la propiedad óptica, donde la reacción modifica suficientemente una propiedad óptica del reactivo modificador de la propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada por un ojo humano no asistido.
También se describen procedimientos de fabricación de un dispositivo modificador de las propiedades ópticas del ensayo de muestras biológicas. Tales procedimientos pueden incluir el acoplamiento operativo del cartucho receptor de muestras y el sustrato con la capa adhesiva. En algunas versiones, una capa adhesiva incluye un primer lado y un segundo lado opuesto al primer lado, y en el que el acoplamiento operativo del cartucho receptor de muestras y el sustrato incluye la fijación adhesiva del cartucho receptor de muestras al primer lado y del sustrato al segundo lado.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La FIG. 1 proporciona una vista en perspectiva de acuerdo con realizaciones de la divulgación del objeto. La FIG. 2 proporciona una vista representativa en sección transversal de un dispositivo de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.
La FIG. 3 muestra la secuencia de ADN de una región diana de molécula de ácido nucleico de plantilla de Schistosoma mansoni (SEQ ID NO: 23, según una realización;
La FIG. 4 es un gráfico que indica las mediciones de pH para las reacciones de amplificación isotérmica positiva y negativa, según una realización.
La FIG. 5 es un gráfico que muestra la detección del color (tonalidad) de las reacciones de amplificación isotérmica positiva y negativa en los puntos finales de la reacción, según una realización.
La FIG. 6 muestra los resultados de un ensayo de electroforesis en gel de productos de reacción de amplificación isotérmica positivos y negativos, según una realización.
La FIG. 7 muestra los valores de tonalidad normalizados para las reacciones de amplificación utilizando varias concentraciones de tampón Tris, según una realización.
La FIG. 8 muestra los valores de tonalidad normalizados para las reacciones de amplificación que utilizan cantidades variables de equivalentes de iones de hidronio adicionales, según una realización.
La FIGS. 9A, 9B, 9C y 9D muestran los valores de tonalidad normalizados para las reacciones de amplificación utilizando diversas concentraciones de agentes halochromicos, según una realización.
La FIG. 10 muestra la compatibilidad de diferentes polimerasas con la detección visual de la amplificación LAMP, según una realización.
Las FIG. 11A y 11B muestran los valores de tonalidad normalizados para las reacciones de amplificación utilizando diferentes profundidades de canal, según una realización.
La FIG. 12 muestra los valores de tonalidad normalizados en el tiempo para SDA, según una realización. La FIG. 13 muestra los valores de tonalidad normalizados en el tiempo para la PCR, según una realización. La FIGS. 14A y 14B muestran los cambios de contraste normalizados para las reacciones de amplificación utilizando combinaciones de agentes halochromicos, según una realización.
La FIG. 15 muestra los cambios de contraste normalizados en el tiempo para diferentes concentraciones de plantilla de ADN, según una realización.
La FIG. 16 proporciona datos de amplificación LAMP de la amplificación en un dispositivo que tiene un elemento de ventilación selectiva.
La FIG. 17 proporciona tiempos de reacción de amplificación de ácidos nucleicos a través de seis cámaras de reacción diferentes en un dispositivo modificador de propiedades ópticas según realizaciones de la divulgación en cuestión.
La FIG. 18 proporciona los cambios de color, medidos utilizando la escala CIE94 Delta-E, resultantes de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos a través de seis cámaras de reacción diferentes en un dispositivo modificador de propiedades ópticas según las realizaciones de la divulgación en cuestión. La FIG. 19 proporciona un perfil de temperatura de una cámara de reacción, por ejemplo, un depósito fluídico, acoplado operativamente a un elemento calefactor de la manera descrita según realizaciones de la divulgación del objeto.
La FIG. 20 proporciona uniformidad de temperatura a través de seis ubicaciones de calentamiento en un elemento de calentamiento, por ejemplo, una placa de calentamiento electrónica, acoplada operativamente con un ensayo de amplificación de ácido nucleico multiplexado según las realizaciones de la divulgación en cuestión.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se proporcionan dispositivos y procedimientos para modificar las propiedades ópticas de muestras biológicas o aspectos de las mismas. Los procedimientos en cuestión incluyen la generación de un producto de reacción con un dispositivo y la reacción del producto de reacción para modificar suficientemente una propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada, como por ejemplo por un ojo humano no asistido.
Antes de que la presente divulgación se describa con mayor detalle, debe comprenderse que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que éstas pueden, por supuesto, variar. Se deberá entender, además, que la terminología que se usa en la presente memoria es para el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el ámbito de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones anexas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviniente, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior (a menos que el contexto dicte claramente lo contrario), entre el límite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor declarado o interviniente en ese intervalo declarado, está incluido en la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos más pequeños y también se engloban dentro de la divulgación, sin perjuicio de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Donde el intervalo indicado incluya uno o los dos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos se incluyen también en la invención.
Ciertos intervalos pueden presentarse aquí con valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente" El término "aproximadamente" se utiliza aquí para dar soporte literal al número exacto al que precede, así como a un número cercano o aproximado al que precede el término. Para determinar si un número es cercano o aproximado a un número específicamente citado, el número cercano o aproximado no citado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número específicamente citado.
A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos con experiencia en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también se puede usar en la práctica o ensayo de la presente divulgación, ahora se describen los procedimientos y materiales preferidos.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una divulgación previa. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación presentes que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Debe observarse que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, se observa que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base previa para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "sólo" y similares en relación con la recitación de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Además, ciertas realizaciones de los dispositivos divulgados y/o los procedimientos asociados pueden representarse mediante dibujos que pueden incluirse en esta solicitud. Las realizaciones de los dispositivos y sus características espaciales específicas y/o habilidades incluyen las que se muestran o se muestran sustancialmente en los dibujos o que son razonablemente deducibles de los dibujos. Dichas características incluyen, por ejemplo, una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, etc.) de: simetrías en torno a un plano (por ejemplo, un plano de sección transversal) o eje (por ejemplo, un eje de simetría), bordes, periferias, superficies, orientaciones específicas (por ejemplo, proximal; distal), y/o números (por ejemplo, tres superficies; cuatro superficies), o cualquier combinación de ellas. Dichas características espaciales también incluyen, por ejemplo, la falta (por ejemplo, la ausencia específica de) una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, etc.) de: simetrías en torno a un plano (por ejemplo, un plano de sección transversal) o eje (por ejemplo, un eje de simetría), bordes, periferias, superficies, orientaciones específicas (por ejemplo, proximal), y/o números (por ejemplo, tres superficies), o cualquier combinación de las mismas.
Como será aparente para los expertos en la técnica tras leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes y características discretas que pueden ser fácilmente separadas o combinadas con las características de cualquiera de las otras realizaciones sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Cualquier procedimiento citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Al describir más a fondo la invención en cuestión, se discutirán en mayor detalle los dispositivos en cuestión para su uso en la práctica, seguido de una revisión de los procedimientos asociados.
Definiciones
Los términos utilizados en las reivindicaciones y memoria descriptiva se definen como se establece a continuación a menos que se especifique lo contrario.
El término "colorimetría" o "colorimétrico" se refiere a las técnicas de cuantificación u observación de concentraciones de compuestos coloreados en solución. "Detección colorimétrica" se refiere a cualquier procedimiento de detección de dichos compuestos coloreados y/o del cambio de color de los compuestos en solución. Los procedimientos pueden incluir la observación visual, las mediciones de absorbencia o de fluorescencia, entre otros.
El término "agente halocrómico" se refiere a una composición que cambia de color tras alguna reacción química. En particular, un agente halochromico puede referirse a una composición que cambia de color con un cambio de pH. Diferentes agentes halocrómicos pueden cambiar de color en diferentes intervalos de transición de pH.
El término "intervalo de transición de pH" o "intervalo de transición de pH" se refiere a un intervalo de pH sobre el cual cambia el color de una muestra o compuesto particular. Un intervalo de pH de transición específico para una muestra puede depender de un agente halochromico en la muestra (ver arriba).
El término "amplificación de ácidos nucleicos" o "reacción de amplificación" se refiere a procedimientos de amplificación de ADN, ARN o versiones modificadas de los mismos. La amplificación del ácido nucleico incluye varias técnicas, como una reacción isotérmica o una reacción termociclada. Más concretamente, la amplificación de ácidos nucleicos incluye procedimientos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación por recombinasa polimerasa (RPA), la amplificación dependiente de la helicasa (HDA), la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), la amplificación por círculo rodante (RCA) y la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). El término "amplificación isotérmica" se refiere a un procedimiento de amplificación que se realiza sin cambiar la temperatura de la reacción de amplificación. Los protones se liberan durante una reacción de amplificación: por cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP) que se añade a un molde de ADN monocatenario durante una reacción de amplificación, se libera un protón (H+).
El término "cantidad suficiente" significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para causar la agregación de proteínas en una célula.
El término porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia, según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias que se describen a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para los expertos) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de "identidad" puede existir sobre una región de la secuencia que se compara, por ejemplo, sobre un dominio funcional, o, alternativamente, existir sobre toda la longitud de las dos secuencias que se comparan.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa.
La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. Math, 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de identidad de secuencias de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. Biol, 48: 443 (1970), por el procedimiento de búsqueda de semejanza de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST , que se describe en Altschul et al., (1977) Nuc. Biol. 215;403:410-1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information.
Dispositivos
Los aspectos de la divulgación en cuestión incluyen dispositivos modificadores de las propiedades ópticas de los ensayos de muestras biológicas. Tal y como se utiliza en el presente documento, una "muestra biológica" es una muestra que contiene una cantidad de material orgánico, por ejemplo, una o más moléculas orgánicas, como uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ARN o porciones de los mismos, que puede tomarse de un sujeto. Como tal, un "ensayo de muestra biológica" es una prueba en una muestra biológica que se realiza para evaluar una o más características de la muestra. En algunos aspectos, una muestra biológica es una muestra de amplificación de ácidos nucleicos, que es una muestra que incluye uno o más ácidos nucleicos o porciones de los mismos que pueden ser amplificados según las realizaciones del tema.
Una muestra biológica puede ser recolección de un sujeto e incluir una o más células, como células de tejido del sujeto. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tejido" se refiere a uno o más agregados de células en un sujeto (por ejemplo, un organismo vivo, como un mamífero, por ejemplo, un ser humano) que tienen una función y estructura similares o a una pluralidad de tipos diferentes de dichos agregados. El tejido puede incluir, por ejemplo, tejido orgánico, tejido muscular (por ejemplo, músculo cardíaco; músculo liso; y/o músculo esquelético), tejido conectivo, tejido nervioso y/o tejido epitelial. El tejido puede, en algunas versiones, incluir células del interior de la mejilla de un sujeto y/o células de la saliva de un sujeto.
Como se ha indicado anteriormente, se puede recoger una muestra biológica de un sujeto. En ciertas realizaciones, un sujeto es un "mamífero" o un sujeto "mamífero", donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase mamíferos, incluyendo los órdenes carnívoro (por ejemplo, perros y gatos), rodentia (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, humanos, chimpancés y monos). En una realización, el sujeto es un humano. El término "humanos" puede incluir sujetos humanos de ambos sexos y en cualquier etapa de desarrollo (por ejemplo, fetal, neonatos, bebés, jóvenes, adolescentes y adultos), donde en ciertas realizaciones el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Aunque los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento pueden aplicarse en asociación con un sujeto humano, debe entenderse que los dispositivos y procedimientos en cuestión también pueden aplicarse en asociación con otros sujetos, es decir, en "sujetos no humanos"
Una muestra biológica, tal como se menciona en el presente documento, puede ser en algunas versiones una muestra biológica preparada. Una muestra de ensayo biológico preparada es una muestra de ensayo biológico que ha sido procesada, por ejemplo, exponiendo la muestra a una solución de preparación, como una solución que incluye un agente lisante, como un detergente. En consecuencia, en algunas realizaciones, una muestra biológica es un lisado. Dicha preparación puede permitir que la muestra biológica preparada reaccione, por ejemplo, con una composición de amplificación y/o un reactivo modificador de las propiedades ópticas tras su exposición. La exposición puede incluir la lisis de las células de la muestra con un agente lisante de la solución de preparación y/o la extracción de ácidos nucleicos de la misma. Dichos ácidos nucleicos extraídos pueden ser liberados en una solución de muestra preparada resultante. En algunas realizaciones, se incluye un paso de extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico de una muestra biológica. Si se desea, la solución de preparación es una solución de preparación de amplificación de ácidos nucleicos y la exposición a la solución prepara los ácidos nucleicos de la muestra para la amplificación, por ejemplo, la amplificación isotérmica.
Además, tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "propiedad óptica" se refiere a una o más características ópticamente reconocibles, como una característica resultante de la longitud de onda y/o la frecuencia de la radiación, por ejemplo, la luz, emitida desde un aspecto, como el color, la fluorescencia, la fosforescencia, etc. Como tal, modificar una propiedad óptica se refiere a cambiar dicha característica.
En la FIG. 1 se proporciona una realización de un dispositivo modificador de las propiedades ópticas de una muestra biológica para su uso en la práctica de los procedimientos en cuestión. En varias realizaciones, el dispositivo 100 incluye un cartucho receptor de muestras 101 que incluye una o más cámaras de reacción 102 para recibir una muestra biológica y cada una de ellas incluye un reactivo modificador de propiedades ópticas. Dicho dispositivo 100 también puede incluir un sustrato 103 que incluye un elemento calefactor 104 y/o una fuente de energía 105 acoplada operativamente al elemento calefactor 104.
Por "operativamente acoplado", "operativamente conectado" y "operativamente unido", tal como se utiliza en este documento, se entiende conectado de una manera específica que permite que los dispositivos divulgados funcionen y/o que los procedimientos se lleven a cabo de manera efectiva en la forma descrita en este documento. Por ejemplo, el acoplamiento operativo puede incluir el acoplamiento removible o el acoplamiento fijo de dos o más aspectos. El acoplamiento operativo también puede incluir el acoplamiento fluido y/o eléctrico y/o acoplado y/o adhesivo de dos o más componentes. Asimismo, por "acoplado de forma removible", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende acoplado, por ejemplo, física y/o fluidamente y/o eléctricamente, de manera que los dos o más componentes acoplados puedan desacoplarse y volverse a acoplar repetidamente.
Como se muestra en la FIG. 1, el dispositivo 100 también incluye una capa adhesiva 106. Dicha capa 106 puede conectar operativamente el cartucho receptor de muestras 101 y el sustrato 103 y formar así una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción 102. El dispositivo 100 también incluye un elemento de ventilación selectiva 107 que también forma una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción 102. Además, como se indica en la FIG. 1, el dispositivo incluye una carcasa compuesta por una primera porción 108 que incluye un receptáculo 111 y una segunda porción 109 acoplable con la primera porción para encapsular el cartucho receptor de muestras 101, el sustrato 103 y la capa adhesiva 106. En dicha configuración, el cartucho receptor de muestras 101, el sustrato 103 y la capa adhesiva 106 pueden estar dispuestos entre al menos dos porciones opuestas, por ejemplo, paredes, de la primera porción 108.
Mientras que la realización proporcionada en la FIG.. 1, se muestra en una conformación no ensamblada con fines ilustrativos, una realización representativa del dispositivo se proporciona en la FIG. 2. La FIG. 2 proporciona específicamente una ilustración representativa de muchos de los mismos elementos que la FIG. 1 en una conformación ensamblada. La FIG. 2 también muestra específicamente un reactivo modificador de propiedades ópticas 201 dentro de cada una de las una o más cámaras de reacción 102. También se muestran los conductos 202 que acoplan operativamente cada una de las una o más cámaras de reacción 102 entre sí y/o con una entrada de muestra 110.
En varias realizaciones, un cartucho receptor de muestras puede incluir una o más, como una pluralidad, como dos o más, como 5 o más, como 10 o más, como 15 o más, como 20 o más, como 50 o más cámaras de reacción. Un cartucho receptor de muestras puede incluir 50 o menos, como 20 o menos, como 15 o menos, como 10 o menos, como 5 o menos cámaras de reacción. Un cartucho receptor de muestras puede incluir de 1 a 25, como de 1 a 20, como de 1 a 15, como de 1 a 10 como de 1 a 5, cámaras de reacción, o de 2 a 20, como de 2 a 15, como de 5 a 15 cámaras de reacción, donde cada intervalo es inclusivo. Tal y como se utiliza aquí, "inclusivo" se refiere a un intervalo proporcionado que incluye cada uno de los números de la lista. A menos que se indique lo contrario, todos los intervalos proporcionados son inclusivos. Un cartucho receptor de muestras puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más cámaras de reacción.
Cada cámara de reacción puede tener forma de cilindro, caja rectangular, cubo, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, cada cámara de reacción puede extenderse desde una primera abertura en una primera superficie de un cartucho receptor de muestras, a través del cartucho hasta una segunda abertura en una segunda superficie de un cartucho receptor de muestras opuesta a la primera. Además, como se indica en el presente documento, cada abertura puede estar sellada por una porción, por ejemplo, la superficie, de un componente, como una capa adhesiva y/o un elemento de ventilación selectiva, cada uno de los cuales forma una pared de una cámara de reacción. Por ejemplo, una capa adhesiva puede formar una pared de una cámara de reacción en un primer extremo y/o un elemento de ventilación selectivo puede formar una pared de la cámara de reacción en un segundo extremo opuesto al primero. Al hacerlo, la capa adhesiva puede sellar cada segunda abertura y/o el elemento de ventilación selectiva puede sellar cada primera abertura.
Cada cámara de reacción puede ser también una cámara de reacción microfluídica. Las cámaras de reacción del sujeto pueden tener cada una un volumen de 1 pl a 1000 pl, tal como 1 pl a 100 pl, tal como 1 pl a 50 pl, tal como 10 |jl a 30 |jl, tal como 15 pl a 30 pl, o 50 pl o menos, o 30 pl o menos. Como tal, cada cámara de reacción está configurada para recibir contenidos, por ejemplo, contenidos que incluyen medios sólidos y/o líquidos, como una muestra biológica y/o reactivos modificadores de las propiedades ópticas, que tienen un volumen igual o menor que cualquiera de los volúmenes proporcionados.
En varias realizaciones, cada cámara de reacción puede incluir, tal como contener dentro de una cámara, uno o más reactivos modificadores de propiedades ópticas. Dichos reactivos modificadores de las propiedades ópticas pueden incluir, por ejemplo, tintes sensibles al pH, tintes fluorescentes, tintes FRET, micro y nano partículas, proteínas fluorescentes, sustratos colorimétricos, enzimas y reactivos, estructuras plasmónicas, reactivos y sustratos de precipitación, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas versiones, el reactivo modificador de la propiedad óptica es o incluye un reactivo de ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA). En algunos aspectos, el reactivo ELISA se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitrobluetetrazolio), Tm B (3,3',5,5' tetrametilbencidina), DAB (3,3',4,4' diaminobencidina), 4CN (4-cloro-1-naftol). TMB (sustrato de doble función), ABTS (sulfonato de 2,2'-azino-di [3-etilbenzotiazolina]), OPD (ofenilendiamina), MUG (galactósido de 4-metilumbeliferilo), HPA (ácido hidroxifenilacético) y HPPA (ácido 3-phidroxifenilpropónico).
También, en algunas versiones, un reactivo modificador de propiedades ópticas, puede ser almacenado en un cartucho receptor de muestras en forma seca, por ejemplo, liofilizado. Como tal, el traslado de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica fluida, a una cámara de reacción puede incluir la mezcla de la muestra biológica y el reactivo modificador de propiedades ópticas y/o la hidratación del reactivo modificador de propiedades ópticas. Según algunas realizaciones, una propiedad óptica de un reactivo modificador de la propiedad óptica se cambia debido a la presencia o la ausencia de un marcador particular en una muestra biológica cuando la muestra biológica o uno o más aspectos de la misma, como uno o más ácidos nucleicos amplificados y/o protones, se exponen al reactivo modificador de la propiedad óptica.
En algunas versiones, la realización de una modificación de las propiedades ópticas incluye el cambio del pH del contenido de la cámara de reacción mediante la realización de una reacción. Un reactivo modificador de las propiedades ópticas puede producir una modificación basada en la localización y el alcance de dicho cambio de pH.
En algunos casos, cada cámara de reacción puede incluir, tal como contener dentro de una cámara, una o más composiciones de amplificación de ácidos nucleicos. Dicha composición de amplificación de ácidos nucleicos puede incluir, por ejemplo, uno o más cebadores, desoxinucleótidos (dNTPs), y/o polimerasas, cristales preestablecidos Trizma (tampón Tris, pH 8,8; Sigma, cat. no. T9443), cloruro de potasio (KCl; Wako Pure Chemicals, cat. no. 163­ 03545), sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4; Wako Pure Chemicals, cat. no. 137-00402), sulfato de amonio ((NH4)2SO4; Kanto Chemical, cat. 01322-00), Tween 20 (Tokyo Chemical Industry, cat. no. T0543), solución de betaína (Betaine, 5 M; Sigma, cat. no. B0300), calceína (DOJINDO, cat. no. 340-00433) más todos los demás reactivos de modificación óptica mencionados anteriormente, cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2; Wako Pure Chemicals, n° de catálogo 133-00725), agarosa S, solución de EtBr, ácidos nucleicos molde o cualquier combinación de los mismos. Además, en algunas versiones, una composición de amplificación de ácido nucleico, puede almacenarse en un cartucho receptor de muestras en forma seca, por ejemplo, liofilizada. Como tal, el traslado de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica fluida, a una cámara de reacción puede incluir la mezcla de la muestra biológica y la composición de amplificación de ácido nucleico y/o la hidratación de la composición de amplificación de ácido nucleico.
En algunas versiones de la divulgación del objeto, la composición de amplificación de ácido nucleico puede incluir uno o más tampón y/o agua. Una composición de amplificación de ácido nucleico es una solución que prepara una muestra biológica de manera que uno o más ácidos nucleicos de la misma puedan ser amplificados, por ejemplo, amplificados isotérmicamente.
Una composición de amplificación de ácido nucleico puede ser un reactivo que prepara una muestra biológica para la amplificación con un protocolo de amplificación isotérmica que incluye: amplificación mediada por transcripción, amplificación por desplazamiento de hebra, amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico, amplificación por círculo rodante, amplificación isotérmica mediada por bucle, amplificación isotérmica por desplazamiento múltiple, amplificación dependiente de la helicasa, amplificación circular dependiente de la helicasa, amplificación isotérmica con un solo cebador, amplificación mediada por bucle o cualquier combinación de las mismas.
En varias realizaciones, la amplificación según las realizaciones del objeto es una amplificación mediada por bucle de transcriptasa inversa (RT-LAMP). En varios aspectos, la RT-LAMP es un procedimiento de amplificación génica isotérmica en el que la reacción puede ser procesada a una temperatura constante, por ejemplo, 63°C, por un tipo de enzima, por ejemplo, la polimerasa Bst, en un solo paso. La RT-LAMP, en varios aspectos, utiliza seis cebadores que reconocen ocho regiones en un ácido nucleico objetivo. En varias realizaciones, las sensibilidades y especificidades de la técnica RT-LAMP son mayores que las asociadas a la realización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El procedimiento RT-LAMP también es rápido, produciendo una señal de unas pocas copias de ARN en 60 minutos, o menos, 45 minutos o menos, 30 minutos o menos, o 15 minutos o menos. La RT-LAMP tampoco requiere ningún reactivo especial. Además, según las realizaciones del objeto, una "detección" según las realizaciones del objeto es una detección de uno o más aspectos, como marcadores genéticos patógenos específicos en las muestras. La amplificación según las realizaciones del objeto también puede realizarse aplicando la PCR.
Además, como se ha indicado anteriormente, los cartuchos receptores de muestras también incluyen uno o más conductos que conectan operativamente, por ejemplo, de forma fluida, cada una o cualquier combinación de las una o más cámaras de reacción entre sí y/o con una entrada de muestras. Cada uno de los uno o más conductos puede tener forma de cilindro o de prisma cuadrangular y puede tener dimensiones que incluyan una longitud de 10 m o menos, tal como 1 m o menos, tal como 10 cm o menos, tal como 1 mm o menos, y/o tener un diámetro, una anchura y/o una altura de 100 mm o menos, tal como 10 mm o menos, tal como 1 mm o menos, tal como .1 mm o menos, tal como 10 micrómetros o menos. Cada uno de los uno o más conductos también puede tener un volumen de 1000 pl o menos, como 10 pl o menos, como 1 pl o menos, como .1 pl o menos, como 1 nl o menos. El movimiento, por ejemplo, la difusión, de un líquido o de un componente del mismo de una cámara de reacción a otra se impide sustancialmente por los conductos debido a la longitud de los mismos. En consecuencia, cada una de las cámaras de reacción está aislada de la otra y la cantidad de dicho movimiento durante la duración de un ensayo es insignificante para influir en el resultado del mismo.
Además, los cartuchos receptores de muestras también incluyen una o más entradas que conectan operativamente, por ejemplo, fluidamente, cada una o cualquier combinación de las una o más cámaras de reacción entre sí y/o con un entorno externo al dispositivo. Cada una de las una o más entradas puede tener la forma de un tubo que se extiende desde una superficie del cartucho microfluídico a través del cartucho. Un primer extremo de la entrada puede extenderse desde una superficie del cartucho hasta una abertura en la carcasa y estar configurado para recibir un fluido, por ejemplo, una muestra biológica, en ella. Un segundo extremo, o una pluralidad de segundos extremos, opuestos al primer extremo de la entrada, pueden terminar cada uno en una cámara de reacción y estar configurados para transportar fluido, por ejemplo, una muestra biológica, a la cámara. Además, un segundo extremo, o una pluralidad de segundos extremos, opuestos al primer extremo de la entrada, pueden terminar cada uno en un conducto, como se describe en el presente documento. Una entrada también puede ser microfluídica y puede estar configurada de manera que un fluido fluya automáticamente a través de ella tras su introducción en un primer extremo. Una entrada puede tener un diámetro que va de 1 pm a 10 cm y también puede tener un volumen de 1 pL a 1 mL. Además, en algunas versiones, las entradas pueden incluir uno o más conectores, por ejemplo, conectores fluídicos, por ejemplo, conectores luer, como en un extremo, para conectarse operativamente a uno o más conectores recíprocos, por ejemplo, conectores fluídicos, por ejemplo, conectores luer, como uno o más conectores de un dispositivo de preparación de muestras.
Además, en varias realizaciones, los cartuchos receptores de muestras o porciones de los mismos, por ejemplo, los sustratos, están compuestos de uno o más materiales incluyendo, por ejemplo, materiales poliméricos (por ejemplo, materiales que tienen uno o más polímeros incluyendo, por ejemplo, plástico y/o caucho) y/o materiales metálicos. Los materiales de los que puede estar compuesto cualquiera de los componentes del dispositivo, incluidos los cartuchos receptores de muestras o partes de los mismos descritos en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a: materiales poliméricos, por ejemplo plásticos, como el politetrafluoroeteno o el politetrafluoroetileno (PFTE), incluido el politetrafluoroetileno expandido (e-PFTE), el polietileno, el poliéster (DacronTM), el nailon, el polipropileno, el polietileno, el polietileno de alta densidad (HDPE), el poliuretano, el polidimetilsiloxano (PDMS), uno o más adhesivos acrílicos, adhesivos de silicona, adhesivos epoxídicos, o cualquier combinación de ellos, etc, metales y aleaciones metálicas, por ejemplo, titanio, cromo, aluminio, acero inoxidable, etc., y similares. En varias realizaciones, los materiales son transparentes y, como tales, permiten que la luz dentro del espectro visible pase eficientemente a través de ellos.
Además, en varios casos, un cartucho receptor de muestras, o una porción del mismo es transparente a la luz, por ejemplo, a la luz visible. De este modo, un usuario puede observar una modificación de las propiedades ópticas de una muestra o un aspecto de la misma a través del cartucho receptor de muestras. Además, en algunas versiones, un cartucho receptor de muestras, o una parte del mismo, es opaco y/o blanco.
Los dispositivos en cuestión incluyen un sustrato. El sustrato, en algunos casos, puede ser una placa de circuito, por ejemplo, una placa de circuito impreso, compuesta, por ejemplo, de una capa de contactos de Silicio y/o Cobre y/o Oro y/o Aluminio en ella o sobre ella. Los sustratos pueden ser placas de circuito impreso compuestas, por ejemplo, de una capa, por ejemplo, una capa de silicio, que tiene contactos metálicos fijados en ella con uno o más adhesivos, por ejemplo, epoxi. Los sustratos de acuerdo con las realizaciones del tema también pueden tener una o más superficies, por ejemplo, una primera superficie y una segunda superficie opuesta a la primera, que tienen una rugosidad (Ra) de 5 pm o más, como 10 pm o más, como 20 pm o más, como 50 pm o más. Los sustratos también pueden tener una rugosidad (Ra) de 50 pm o menos, como 2o pm o menos, como 10 pm o menos, como 5 pm o menos.
Los sustratos, en varios casos, pueden incluir una o más sustancias modificadoras de las propiedades ópticas y, como tales, estar configurados para que se modifique una de sus propiedades ópticas, como el color. Como tal, los procedimientos incluyen la modificación de una o más propiedades ópticas de un sustrato. En algunos aspectos, los sustratos pueden incluir una o más enzimas, por ejemplo, una enzima colorimétrica, que puede proporcionar un cambio de color. Como tal, la modificación de una propiedad óptica puede incluir el cambio de color y/o la opacidad de un sustrato.
Los sustratos incluyen uno o más elementos de calentamiento. Los elementos calefactores son elementos y/o uno o más reactivos que están configurados para generar energía térmica y pueden estar configurados para calentar una o más cámaras de reacción y su contenido, por ejemplo, una muestra biológica y/o un reactivo modificador de propiedades ópticas y/o una composición de amplificación de ácidos nucleicos. Ejemplos de tales elementos de calentamiento incluyen elementos de calentamiento termoeléctricos, por ejemplo, elementos de calentamiento termoeléctricos que incluyen conductores resistivos, por ejemplo, termistores, dispositivos Peltier, u otros elementos que generan calor.
En algunos aspectos, los elementos calefactores son o incluyen uno o más reactantes generadores de calor, por ejemplo, reactantes líquidos, que provocan una reacción exotérmica/exotérmica cuando se exponen entre sí o a una o más de las composiciones y/o reactivos aquí divulgados, por ejemplo, agua. Además, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen la adición a los contenidos de un dispositivo como el divulgado aquí, por ejemplo, contenidos que incluyen una muestra biológica, de uno o más reactivos de calentamiento que, cuando se mezclan, causan una reacción exotérmica. Dicha reacción puede, por ejemplo, calentar una muestra para su lisis o producir un cambio colorimétrico como se describe en el presente documento. Las reacciones exotérmicas pueden generar calor y/o gas. Las reacciones exotérmicas pueden incluir la hidratación de una mezcla compuesta por óxidos encapsulados y/o no encapsulados como el óxido de calcio y/o el óxido de magnesio y la zeolita deshidratada y/o hidratada, o cualquier combinación de los mismos. Este proceso puede acoplarse con el control del pH de la mezcla mediante compuestos como el ácido cítrico, o mezclas exotérmicas combinadas, como el Cao y el Mg-Fe. La modulación puede incluir la liberación temporizada/controlada de los reactivos encapsulados y puede incluir partículas con una distribución de tamaño adaptada y diferentes características de quemado. Los materiales de cambio de fase (PCM) pueden utilizarse para controlar la estabilidad térmica de la reacción. Los PCM incluyen, por ejemplo, los orgánicos (parafinas, no parafinas y ácidos grasos) y los inorgánicos (hidratos de sal). Los reactivos aplicados en las reacciones exotérmicas u otros reactivos productores de gas también pueden aplicarse para producir gas dentro de una o más de las cámaras, por ejemplo, cámaras selladas, de los dispositivos aquí divulgados y así aumentar la presión en el uno o más recipientes.
Los elementos de calentamiento pueden configurarse para elevar la temperatura de una cámara de reacción y/o su contenido, por ejemplo, una muestra biológica, en 1 °C o más, 5 ° C o más, 10 °C o más, 15 °C o más, 25 °C o más, 50 °C o más, o 100 °C o más. Dichos elementos pueden estar configurados para aumentar la temperatura de una cámara de reacción y/o su contenido desde la temperatura ambiente, por ejemplo, 21 °C, hasta 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, o 67 °C y/o dentro de un intervalo de 50-75 °C, tal como 60-70 °C, tal como 60-66 °C, en 10 minutos o menos, tal como en 5 minutos o menos, tal como en 3 minutos o menos, tal como en 2 minutos o menos. Por ejemplo, un elemento calefactor puede estar configurado para aumentar la temperatura de una cámara de reacción y/o su contenido desde la temperatura ambiente hasta 63 °C ± 1 °C en 3 minutos o menos y/o puede estar configurado para mantener dicha temperatura durante 30 minutos o más. Los elementos calefactores también pueden estar configurados para mantener la temperatura de una cámara de reacción y/o el contenido de la misma durante un período de tiempo tal como 2 horas o más o 2 horas o menos, tal como 1 hora o menos, tal como 30 minutos o menos, tal como 15 minutos o menos. Dicha temperatura puede mantenerse, por ejemplo, a 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C o 67 °C y/o dentro de un intervalo de 50-75 °C, como 60-70 °C, como 60-66 °C. El mantenimiento de dicha temperatura puede realizarse mediante la aplicación de un termistor como elemento sensor de la calefacción y/o puede basarse en la retroalimentación del sensor a una unidad de control. Los elementos calefactores pueden estar configurados para elevar la temperatura de una cámara de reacción y/o el contenido de la misma, repetidamente, por ejemplo, calentar el contenido una primera vez y luego una segunda. Los elementos calefactores en cuestión también pueden calentar el contenido de una cámara de reacción para que se produzca una modificación de las propiedades ópticas y/o una amplificación del ácido nucleico. Además, los elementos calefactores en cuestión también pueden calentar contenidos para realizar termociclos para reacciones de amplificación, como la PCR.
Los sustratos en cuestión incluyen una o más fuentes de energía. Una fuente de energía puede estar conectada operativamente a uno o más elementos de calentamiento. Por "fuente de energía", tal y como se utiliza aquí, se entiende un dispositivo que suministra energía eléctrica a una carga eléctrica. Como tal, en algunos aspectos, las fuentes de alimentación pueden incluir, por ejemplo, una o más baterías, una fuente de alimentación de corriente continua (DC), una fuente de alimentación de corriente alterna (AC), una fuente de alimentación regulada lineal, una fuente de alimentación conmutada, una fuente de alimentación programable, una fuente de alimentación ininterrumpida, una fuente de alimentación de alto voltaje y/o un multiplicador de voltaje. La cantidad de potencia, corriente y/o voltaje que puede proporcionar una fuente de alimentación puede, por ejemplo, ser equivalente a la requerida para alimentar los elementos de calefacción para generar calor según las realizaciones del tema y/o otros elementos descritos en el presente documento, por ejemplo, uno o más controladores, para proporcionar sus funciones descritas. Una fuente de energía puede, en algunos aspectos, ser una o más baterías, por ejemplo, una batería portátil y/o autónoma y/o reemplazable, como una o dos baterías AA, una toma de corriente u otra fuente de energía eléctrica. En algunos aspectos, una fuente de alimentación puede incluir uno o más cables eléctricos, por ejemplo, cables configurados para conectar operativamente un dispositivo a una toma de corriente. Los cables de las fuentes de alimentación pueden estar configurados para conectarse de forma removible a un dispositivo y/o a una toma de corriente.
Las realizaciones de las fuentes de energía incluyen fuentes de energía configuradas para encenderse para proporcionar energía eléctrica a otro componente y/o apagarse para dejar de proporcionar energía eléctrica a otro componente. Dichas fuentes de energía pueden estar configuradas para ser encendidas y/o apagadas, por ejemplo, mediante la operación de un interruptor, botón, temporizador u otro componente operativamente conectado o incluido en la fuente de energía, como una unidad de control.
Como se indica en el presente documento, las fuentes de energía pueden, en ciertos aspectos, estar conectadas operativamente a uno o más componentes de los sistemas divulgados, por ejemplo, una unidad de control. Como tal, las realizaciones de las fuentes de energía incluyen conexiones eléctricas desde una fuente de energía a los componentes de los sistemas divulgados. Dichas conexiones eléctricas pueden incluir una o más longitudes de material eléctricamente conductor, por ejemplo, contactos, trazos y/o cables.
Cuando se desee, los sustratos pueden incluir una o más unidades de control, por ejemplo, una unidad central de procesamiento (CPU) o una matriz de puertas programables en campo (FPGA). Dicha unidad puede incluir una memoria y/o un procesador, por ejemplo, un microprocesador, configurado para generar una o más salidas, por ejemplo, señales eléctricas, basadas en uno o más conjuntos de entradas, por ejemplo, entradas de un usuario y/o un sensor, y/o un temporizador, y/o instrucciones almacenadas en la memoria. Un dispositivo también puede incluir una interfaz de usuario para recibir una entrada y acoplada operativamente a la unidad de control.
En algunas versiones, una unidad de control está configurada para realizar una modificación de la propiedad óptica y/o un análisis colorimétrico de una muestra biológica en la una o más cámaras de reacción. Como tal, una unidad de control puede estar configurada para determinar, basándose en una entrada de uno o más sensores, si se ha producido un cambio en una propiedad óptica, por ejemplo, el color, de uno o más contenidos de una cámara de reacción. Sobre la base de la determinación, la unidad de control puede estar configurada para generar una salida, como una salida a un usuario a través de una pantalla, en la que la salida refleja al usuario si se ha producido un cambio.
Además, en algunos casos, un sustrato puede incluir uno o más sensores, por ejemplo, una pluralidad de sensores, configurados para detectar la presencia y/o ausencia de un líquido, por ejemplo, una muestra biológica, en una o más de las cámaras de reacción. En algunos casos, los sensores están conectados operativamente a la unidad de control y envían una entrada a la misma basada en la presencia y/o ausencia detectada de una muestra. Por ejemplo, una unidad de control puede generar una salida que active un elemento calefactor de un dispositivo para calentar el contenido, por ejemplo, una muestra biológica, de una o más cámaras de reacción transmitiendo energía térmica a través de una capa adhesiva a las cámaras de reacción cuando se recibe una entrada de un sensor que indica la presencia de una muestra biológica en una cámara de reacción. En algunas versiones, el uno o más sensores pueden estar configurados para detectar una propiedad óptica, por ejemplo, una longitud de onda de la luz, por ejemplo, el color, y/o un cambio en una propiedad óptica, como una longitud de onda de la luz emitida desde el contenido de una cámara de reacción, por ejemplo, una muestra biológica.
En varios aspectos, los sustratos según las realizaciones del objeto incluyen una o más fuentes de luz configuradas para emitir luz. Dichas fuentes de luz pueden estar acopladas operativamente a uno o más sensores y/o unidades de control de manera que cuando un sensor detecta un líquido, por ejemplo, una muestra biológica, en la una o más cámaras de reacción, la fuente de luz emite luz. Dichas fuentes de luz también pueden estar acopladas operativamente a los uno o más sensores y/o unidades de control de tal manera que cuando se produce o no una modificación de la propiedad óptica en la una o más cámaras de reacción, la fuente de luz emite luz. Las fuentes de luz según las realizaciones del objeto también pueden incluir uno o más diodos emisores de luz (LED).
Además, en algunas versiones, los dispositivos incluyen una o más pantallas para mostrar una o más salidas, por ejemplo, el resultado de la reacción, y/o el estado, a un usuario. En algunas versiones, los dispositivos también incluyen una interfaz para recibir una entrada, en la que la interfaz está acoplada operativamente a la unidad de control.
Los dispositivos divulgados también pueden incluir un transmisor de señales inalámbricas y/o un receptor de señales inalámbricas. Un transmisor de señales inalámbricas puede estar acoplado operativamente a la unidad de control y puede estar configurado para transmitir una señal, como una señal de audio, desde la unidad de control a, por ejemplo, un receptor inalámbrico acoplado operativamente a uno o más dispositivos, como una segunda unidad central de procesamiento y/o un analizador de muestras, que puede ser un dispositivo móvil, como un teléfono celular. El receptor de señales inalámbricas puede estar configurado para recibir una señal y transmitirla para que sea procesada por la unidad de control.
Los dispositivos en cuestión incluyen una carcasa. Dichas carcasas incluyen una primera porción y una segunda porción acoplable, por ejemplo, acoplable a presión, con la primera porción para encapsular el cartucho receptor de muestras, el sustrato y la capa adhesiva. En algunas versiones, una segunda porción es sustancialmente plana y una primera porción se compone de cinco paredes separadas por bordes y configuradas para contener, por ejemplo, contener completamente, uno o más componentes de un dispositivo, como por ejemplo reteniendo los componentes entre al menos dos porciones, por ejemplo, paredes opuestas, del mismo. En algunas versiones, una segunda porción constituye una superficie inferior de la carcasa y ésta incluye una abertura de entrada en una superficie superior de la carcasa opuesta a la superficie inferior.
Las carcasas de los dispositivos en cuestión pueden estar compuestas por una o más capas de material, por ejemplo, un material polimérico, como se describe en el presente documento, y pueden tener la forma sustancial de una caja rectangular. Las carcasas incluyen una o más aberturas de entrada que proporcionan acceso fluídico, a una entrada de un cartucho receptor de muestras para que una muestra biológica pueda ser cargada en el cartucho a través de la misma. En algunas versiones, dicha abertura está en una superficie superior del dispositivo y/o está en una primera porción.
Según algunas realizaciones, los dispositivos en cuestión y sus componentes, por ejemplo, las carcasas, son dispositivos o componentes sostenibles en mano. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sostenible en mano" se refiere a la capacidad característica de un aspecto para ser sostenido (por ejemplo, retenido, o sostenido fácil o cómodamente) en una mano, como la mano de un mamífero, como la mano de un humano, como la mano de un hombre o una mujer adulta de tamaño y/o fuerza media. Como tal, un aspecto de sostenible en mano es un aspecto que tiene un tamaño y/o forma para ser retenido (por ejemplo, fácil o cómodamente retenido) en la mano de un humano. Un aspecto de sostenible en mano también puede ser un aspecto que puede ser movido (por ejemplo, fácilmente movido, como fácilmente movido en una dirección vertical y/o horizontal) por un humano (por ejemplo, una o dos manos de un humano).
En algunas realizaciones, una carcasa tiene un volumen y/o define un volumen exterior o interior, suficiente para contener cualquiera de los componentes descritos en ella. Una carcasa puede tener un volumen, por ejemplo, de 1 cm3 a 500 cm3, como de 10 cm3 a 200 cm3, como de 50 cm3 a 150 cm3. En algunos casos, una carcasa también puede tener un volumen de 1 cm3 o más, como 50 cm3 o más, como 100 cm3 o más, como 200 cm3 o más, como 300 cm3 o más, como 500 cm3 o más. Una carcasa también puede tener un volumen de 500 cm3 o menos, como 300 cm3 o menos, como 200 cm3 o menos, como 100 cm3 o menos, como 50 cm3 o menos, como 10 cm3 o menos.
Los dispositivos en cuestión incluyen una o más capas adhesivas que conectan operativamente un cartucho receptor de muestras y un sustrato. Como se muestra, por ejemplo, en la FIG. 2, dicha capa también forma una pared de cada una de las una o más cámaras de reacción. Al formar una pared, una capa adhesiva puede sellar y/o extenderse sobre una abertura en un extremo de una cámara de reacción. Como tal, una capa adhesiva y/o una porción de la misma, por ejemplo, una hoja y/o un material adhesivo puede definir un extremo de una cámara de reacción y/o contener de forma sellada uno o más medios sólidos y/o fluidos, por ejemplo, una muestra biológica y/o un reactivo modificador de propiedades ópticas y/o una composición de amplificación de ácidos nucleicos, dentro de la cámara de reacción. En diversas realizaciones, una capa adhesiva puede acoplarse operativamente a un cartucho receptor de muestras de manera que la capa adhesiva selle fluidamente una o más aberturas, por ejemplo, una abertura en un extremo, de una o más cámaras de reacción del cartucho.
Una capa adhesiva según las realizaciones del tema puede ser o incluir una hoja, por ejemplo, una hoja sólida, de uno o más materiales, por ejemplo, dos materiales, que tienen una forma delgada y/o planar. Una capa adhesiva u otros componentes de los dispositivos en cuestión pueden incluir una superficie superior y una superficie inferior, cada una de las cuales define un plano paralelo a la otra y separado por un espesor. En varias realizaciones, una hoja es o incluye una capa uniforme de un solo material. Una capa adhesiva también puede estar compuesta por dos o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, o más, etc. hojas laminadas entre sí. En algunas versiones, las capas adhesivas son laminados adhesivos acrílicos.
En varias realizaciones, una capa adhesiva puede estar compuesta enteramente de un material adhesivo o puede tener un material adhesivo, por ejemplo, un revestimiento y/o una capa de material adhesivo, en una primera superficie y/o una u otras superficies, por ejemplo, una segunda superficie opuesta a la primera. Dicho adhesivo puede ser un adhesivo acrílico. En consecuencia, una capa adhesiva puede incluir una o más hojas, por ejemplo, hojas laminadas, y tener un material adhesivo en una superficie superior y/o una superficie inferior de la misma. Una capa de material adhesivo puede conectar operativamente la capa adhesiva con un sustrato y/o otra capa de material adhesivo puede conectar operativamente la capa adhesiva y un cartucho receptor de muestras.
Una hoja puede, en algunos aspectos, tener una longitud, una anchura y una altura, también denominada espesor. Una hoja puede tener forma de caja rectangular cuya anchura y longitud son sustancialmente mayores que el grosor. El grosor de una capa adhesiva y/o de una hoja, por ejemplo, el grosor entre una primera superficie y una segunda superficie opuesta a la primera, puede ser de 5 mm o menos, 3 mm o menos, 1 mm o menos, 0,5 mm o menos, 0,1 mm o menos, o 50 micrones o menos. El grosor de una capa adhesiva y/o de una hoja de la misma también puede oscilar, por ejemplo, entre 5 mm y 50 micrones, como 3 mm y 0,1 mm, como 1 mm y 0,1 mm, ambos inclusive. Además, la longitud y/o la anchura de una capa adhesiva y/o de una hoja también puede oscilar entre 1 mm y 2 m, tal como entre 1 cm y 1 m, tal como entre 1 cm y 10 cm, tal como entre 1 cm y 5 cm.
Las capas adhesivas pueden ser y/o tener un área que defina cualquier tamaño o forma adecuada, incluyendo un: círculo, semicírculo, óvalo, rectángulo, cuadrado, triángulo, polígono, cuadrilátero, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, en las realizaciones en las que la capa adhesiva es un rectángulo, la longitud de la capa adhesiva es mayor que la anchura. Una capa adhesiva puede incluir una o más hojas de material sólido, uniforme e integrado y, en algunas versiones, no incluye ninguna abertura a través de ella.
Una capa adhesiva y/o una hoja de la misma puede tener tres bordes, cuatro bordes o más de cuatro bordes que definen el área de la capa adhesiva. En varias realizaciones, los bordes se unen en las esquinas, por ejemplo, tres, cuatro, cinco o diez o más esquinas. En algunas versiones, un primer borde de una capa adhesiva es opuesto a un segundo borde de una capa adhesiva y adyacente a un tercer y/o cuarto borde de una capa adhesiva. En dicha realización, el tercer borde puede ser opuesto a un cuarto borde y el cuarto borde puede ser adyacente al primer y/o segundo borde.
De acuerdo con las realizaciones del objeto, las capas adhesivas pueden estar compuestas cada una de una variedad de materiales y pueden estar compuestas de los mismos o diferentes materiales. Los módulos receptores de muestras y/o las tapas o porciones de los mismos pueden estar compuestos de materiales poliméricos, por ejemplo, materiales que tienen uno o más polímeros incluyendo, por ejemplo, plástico y/o caucho. Dichos materiales pueden tener características de flexibilidad y/o alta resistencia (por ejemplo, resistente al desgaste) y/o alta resistencia a la fatiga (por ejemplo, capaz de conservar sus propiedades físicas durante largos períodos de tiempo independientemente de la cantidad de uso o del entorno). Los materiales de interés de los que pueden estar compuestas las capas adhesivas o porciones de las mismas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: materiales poliméricos, por ejemplo, plásticos, como el politetrafluoroeteno o el politetrafluoroetileno (PFTE), incluido el politetrafluoroetileno expandido (e-PFTE), el poliéster (DacronTM), el nailon, el polipropileno, el polietileno, el polietileno de alta densidad (HDPE), el poliuretano, uno o más adhesivos acrílicos, el adhesivo de silicona, el adhesivo epoxi o cualquier combinación de los mismos. Como se ha descrito, cada uno de dichos materiales puede incluir revestimientos o capas de materiales adhesivos, por ejemplo, materiales adhesivos acrílicos, en una o más superficies de los mismos.
Además, en varios casos, una capa adhesiva, o una parte de la misma, como una primera y/o segunda capa laminada, no incluye un ácido. Además, en algunas versiones, una capa adhesiva, o una parte de ella, por ejemplo, como una primera y/o segunda capa laminada, es opaca y/o blanca. Cuando una capa adhesiva o una parte de ella es blanca, la capa blanca proporciona un fondo uniforme de inspección visual de una o más cámaras de reacción. En algunas versiones, una capa, por ejemplo, una primera capa y/o una segunda capa y/o una capa adhesiva, es opaca y/o de un color complementario al color de inicio de la reacción, por ejemplo, rojo, naranja, amarillo, verde, azul, índigo, violeta, negro, dorado, plateado, marrón, o cualquier combinación de los mismos. Un color de inicio de reacción es el color del producto de reacción y/o del reactivo modificador de la propiedad óptica antes de que se produzca una reacción que modifique suficientemente una propiedad óptica del reactivo modificador de la propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada. El color complementario a un color de inicio de la reacción puede proporcionar un contraste de color suficiente, por ejemplo, un mayor contraste de color en contraposición a un solo color, de las cámaras de reacción de tal manera que, por ejemplo, la detección de la propiedad óptica modificada puede ser realizada por un ojo humano sin ayuda.
En varios casos, una capa adhesiva, o una parte de ella, es transparente a la luz, por ejemplo, a la luz visible. En otras versiones, una capa adhesiva, o una parte de ella, es reflectante, por ejemplo, total o sustancialmente reflectante a la luz, por ejemplo, a la luz visible. Además, como se indica en el presente documento, una capa adhesiva puede incluir una primera capa laminada con una segunda capa. En tales realizaciones, por ejemplo, una primera capa no incluye un ácido y/o una segunda capa es opaca y/o blanca.
Además, en varios casos, una capa adhesiva, o una porción de la misma como una hoja, tiene una conductividad térmica que va de 0,1 W/m-K a 10 W/m-K, como 0,1 W/m-K a 5 W/m-K, como 1 W/m-K a 5 W/m-K.
De acuerdo con algunas versiones, una capa adhesiva es una capa adhesiva estampada. En tales realizaciones, la capa adhesiva puede ser o tener una porción que es porosa y/o incluye una o más aberturas que se extienden desde una primera superficie de una capa adhesiva a una segunda superficie de la capa adhesiva opuesta a la primera superficie, de tal manera que uno o más contenidos, por ejemplo, líquidos, de una cámara de reacción pueden pasar a través de ella. Como tal, en algunos aspectos, uno o más contenidos, por ejemplo, líquidos, de una cámara de reacción pueden entrar en contacto con un sustrato y/o uno o más componentes del mismo, por ejemplo, un sensor y/o un elemento de calentamiento, directamente mientras se realiza un ensayo.
Como se describe en el presente documento, los dispositivos y procedimientos en cuestión pueden utilizarse para detectar la presencia y/o ausencia de uno o más ácidos nucleicos en una o más cámaras de reacción. Los dispositivos y procedimientos en cuestión también pueden aplicarse, por ejemplo, para detectar la presencia y/o ausencia de uno o más biomarcadores, como proteínas, en la una o más cámaras de reacción.
En varias realizaciones, los dispositivos modificadores de propiedades ópticas contienen uno o más, por ejemplo, tres, controles de ensayo: un control de adecuación de la muestra, un control positivo, por ejemplo, un control positivo interno, y/o un control negativo. El control de adecuación de la muestra detecta, por ejemplo, abundantes marcadores de ácido nucleico humano como genes de mantenimiento, ARN y/o ácido desoxirribonucleico (ADN) de p-actina humano para garantizar que se ha recogido una muestra de hisopo suficiente. El control positivo amplifica un oligonucleótido sintético que será coempaquetado y/o colofonado en el pocillo de reacción. Dicho oligonucleótido sintético puede incluirse, por ejemplo, en un reactivo modificador, un reactivo modificador de propiedades ópticas y/o una composición de amplificación. Este control garantiza que el dispositivo funciona en condiciones que permiten la amplificación de los marcadores genéticos de interés. El control negativo también amplifica el control positivo, pero sin el oligonucleótido sintético colofón. Este control garantiza la ausencia de cualquier amplicón contaminante autoamplificado.
Además, los dispositivos de modificación de las propiedades ópticas o partes de los mismos, por ejemplo, las carcasas, pueden incluir calibradores para un algoritmo de análisis de datos de imágenes realizado, por ejemplo, por una unidad de control de un analizador de muestras. Por ejemplo, un código de respuesta rápida (QR), puede ser un objetivo de calibración de la resolución. Además, el analizador de muestras puede aplicar una carcasa blanca, y específicamente una región próxima a las cámaras de reacción, para la calibración del balance de blancos y la calibración de la uniformidad de la iluminación. Además, las carcasas pueden incluir objetivos de color impresos para calibrar las mediciones de cambio de color.
Los dispositivos modificadores de propiedades ópticas también pueden incluir uno o más códigos, por ejemplo, un código de respuesta rápida (QR), en el exterior de una carcasa del mismo. Dicho código puede incluir una identificación del tipo de ensayo, la fecha de caducidad del dispositivo, el número de serie o cualquier combinación de los mismos. Un analizador de muestras puede estar configurado para leer y/o reconocer dicho código, de manera que se pueda realizar una identificación adecuada del dispositivo y utilizarlo en consecuencia.
Como se ha señalado anteriormente, en varias realizaciones, los dispositivos incluyen un elemento de ventilación selectiva. Los elementos de ventilación selectiva pueden ser porosos y, como tales, tener una pluralidad de poros que se extienden a través de ellos. Los elementos de ventilación selectiva según las realizaciones del tema también pueden tener una porosidad sintonizable pasivamente. La expresión "porosidad sintonizable pasivamente", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a la capacidad de tener una primera conformación en la que uno o más gases, por ejemplo, el aire, pueden pasar a través de ella, por ejemplo, a través de los poros, y una segunda conformación en la que se impide el paso de fluidos que incluyan uno o más gases y líquidos, tales como líquidos que incluyan una muestra biológica, por ejemplo, a través de los poros, y pasar automáticamente de la primera a la segunda conformación al entraren contacto con un líquido. En la segunda conformación, los elementos de ventilación selectiva impiden la evaporación de los líquidos a través de ellos, por ejemplo, a través de los poros. Además, en la segunda conformación, los elementos de ventilación selectiva pueden sellar fluidamente una cámara de reacción en un extremo de la misma cubriendo una abertura de la misma e impidiendo el paso de fluido, incluyendo la evaporación, a través de la misma. Los elementos de ventilación selectiva pueden estar configurados para pasar de la primera conformación a la segunda conformación de forma pasiva, por ejemplo, automáticamente sin la interacción del usuario, al entrar en contacto con uno o más líquidos, como los líquidos que incluyen una muestra biológica, con los elementos de ventilación selectiva o una parte de los mismos, por ejemplo, una superficie, como una superficie que forma una pared de una cámara de reacción. Así, en algunas versiones, los elementos de ventilación selectiva pueden ser autosellantes a los líquidos y gases cuando entran en contacto con un líquido. Además, en algunas versiones, los elementos de ventilación selectiva pueden cubrir y/o sellar una o más aberturas de entrada y/o de recepción de muestras de un dispositivo y, por lo tanto, pueden regular, por ejemplo, permitir y/o impedir el flujo de líquido y/o gas a través de ellas de la misma manera que a través de una o más aberturas de ventilación.
Además, cada cámara de reacción puede incluir una abertura de recepción de muestra para recibir una muestra biológica desde la entrada de muestra y/o un conducto. Una abertura de recepción de la muestra puede ser operativamente, por ejemplo, fluidamente, conectado a una entrada de la muestra. En algunas versiones, cada cámara de reacción incluye una o más, por ejemplo, dos, aberturas adicionales, como una abertura "ventilada" y una "suplementaria", o una "primera" y una "segunda". Por consiguiente, en algunas versiones, una abertura de recepción de muestras es una tercera abertura y es adyacente a la primera y/o segunda abertura. Las cámaras de reacción también pueden incluir una cuarta abertura que acopla operativamente la cámara a una o más cámaras y/o a la entrada a través de uno o más conductos.
Además, una o más porciones o materiales de los elementos de ventilación selectiva pueden tener una porosidad sintonizable pasivamente. Por ejemplo, en algunas versiones, los elementos de ventilación selectiva pueden estar compuestos por un hidrogel que tiene una porosidad sintonizable pasivamente. Dicho hidrogel puede ser capaz de hincharse y reducir la porosidad de la matriz polimérica porosa al entrar en contacto con un líquido, por ejemplo, un líquido acuoso.
Además, los elementos de ventilación selectiva pueden estar compuestos por una variedad de materiales, incluyendo una o más matrices poliméricas, como una matriz polimérica porosa, como el polietileno. Los elementos de ventilación selectiva también pueden estar compuestos por un hidrogel como la carboximetilcelulosa. Otros materiales de los que pueden estar compuestos los elementos de ventilación selectiva o partes de los mismos, como los revestimientos, son los sacáridos, las proteínas, los materiales delicuescentes, el nailon, el ABS, el policarbonato y el poli(metacrilato de metilo), y otros materiales higroscópicos, o cualquier combinación de los mismos. Los elementos de ventilación selectiva también pueden ser o incluir uno o más revestimientos. Los elementos de ventilación selectiva pueden tener forma de peine. Como tal, los elementos pueden incluir un cuerpo y una o más protuberancias, por ejemplo, protuberancias cilíndricas, que se extienden desde el cuerpo para cubrir cada una de una o más aberturas, por ejemplo, la primera o la segunda, de las cámaras de reacción. Un elemento de ventilación selectiva de un dispositivo puede tener un número de salientes igual al número de cámaras de reacción del dispositivo. Además, un elemento de ventilación selectiva puede acoplarse operativamente a la carcasa de un dispositivo y/o a un cartucho microfluídico y puede disponerse entre dichos elementos dentro de un dispositivo.
Procedimientos de la invención
La presente divulgación incluye procedimientos para modificar una propiedad óptica en un ensayo de muestras biológicas. Dicha modificación puede realizarse en una muestra biológica, o en un aspecto asociado a ella, como una mezcla de reacción o un producto de reacción. La modificación de una propiedad óptica puede llevarse a cabo con un dispositivo modificador de propiedades ópticas para ensayos de muestras biológicas, tal como se describe en el presente documento.
Modificar una propiedad óptica se refiere a cambiar una o más características ópticamente reconocibles de un aspecto, por ejemplo, una muestra, como una característica resultante de la longitud de onda y/o la frecuencia de la radiación, por ejemplo, la luz, emitida desde un aspecto, como el color, la fluorescencia, la fosforescencia, etc. Por ejemplo, en algunas versiones, la propiedad óptica es el color y la modificación de la propiedad óptica incluye el cambio de color. En algunos aspectos, dicha modificación de la propiedad óptica, por ejemplo, el cambio de color, es detectable por un ojo humano no asistido bajo, por ejemplo, la luz ambiental, y los procedimientos en cuestión incluyen hacer dicha detección con un ojo humano no asistido. La modificación de una propiedad óptica también puede incluir el cambio de la transmitancia y/o la opacidad de una sustancia y puede incluir el cambio sustancial de la sustancia de transparente a opaca o de opaca a transparente. Como tal, los procedimientos pueden incluir la detección de dicho cambio con un ojo humano no asistido.
En algunos aspectos, los procedimientos en cuestión incluyen la exposición de un reactivo o sustancia como se divulga en el presente documento y/o un dispositivo o parte del mismo, por ejemplo, un cartucho receptor de muestras, a la luz externa, por ejemplo, ambiental, para medir así el cambio en la propiedad óptica. Dicha luz externa puede incluir un flash de cámara o una luz de excitación fluorescente. La exposición a la luz externa puede proporcionar un cambio en las condiciones que permita medir la propiedad óptica.
Según algunas versiones de los procedimientos en cuestión, los procedimientos incluyen la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción de un cartucho receptor de muestras de un dispositivo modificador de propiedades ópticas. Transmitir una muestra puede incluir mover, por ejemplo, hacer fluir, una muestra, a una ubicación particular, como una o más cámaras de reacción. La transmisión puede incluir el flujo de la muestra a través de una entrada de muestra y/o uno o más conductos que conectan operativamente cada una de las una o más cámaras de reacción. Dicho flujo puede incluir la predisposición, por ejemplo, el bombeo, de la muestra para que se mueva a través de la entrada y/o los conductos. El flujo también puede incluir el flujo de la muestra en una abertura de la entrada de la muestra a través de una abertura del receptáculo en la carcasa de un dispositivo.
En varias realizaciones, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción incluye el acoplamiento operativo de un dispositivo modificador de propiedades ópticas de ensayo de muestras biológicas con un dispositivo de preparación de muestras y el flujo de una muestra biológica preparada desde el dispositivo de preparación de muestras al dispositivo modificador de propiedades ópticas de ensayo de muestras biológicas. El acoplamiento operativo de dichos dispositivos puede incluir el acoplamiento de conectores recíprocos, por ejemplo, conectores fluídicos, por ejemplo, conectores luer, de cada dispositivo.
Como se ha indicado anteriormente, una o más cámaras de reacción de un dispositivo pueden incluir uno o más reactivos modificadores de las propiedades ópticas. Como tal, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción puede incluir la mezcla de una muestra biológica con el uno o más reactivos modificadores de las propiedades ópticas y generar así una mezcla de reacción que incluya la muestra biológica y el reactivo modificador de las propiedades ópticas. Una mezcla de reacción es una mezcla que puede ser empleada en una o más reacciones como se designa en el presente documento. Una mezcla de reacción también puede incluir, por ejemplo, una cantidad de tampón, agua, y/o otras composiciones como una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica preparada, una composición de amplificación, por ejemplo, una composición de amplificación de ácidos nucleicos, y/o uno o más reactivos modificadores de las propiedades ópticas, o cualquier combinación de los mismos.
Las realizaciones del objeto también incluyen el calentamiento de una mezcla de reacción con un elemento de calentamiento de un dispositivo. En algunas versiones dicho calentamiento incluye la transferencia de energía térmica a una o más cámaras de reacción a través de una capa adhesiva. El calentamiento de la mezcla de reacción a su vez puede generar un producto de reacción, por ejemplo, un producto de reacción que incluye una pluralidad de protones. Un producto de reacción puede incluir, por ejemplo, una o más composiciones, por ejemplo, un aspecto de una muestra biológica, por ejemplo, protones, que, cuando reaccionan con un reactivo modificador de la propiedad óptica, dan lugar a una modificación de una o más propiedades ópticas.
Cuando se desea, un elemento de calentamiento se acopla operativamente a un sustrato, por ejemplo, una placa de circuito, como una placa de circuito impreso, de un dispositivo. Un sustrato también puede incluir y/o estar acoplado operativamente a uno o más sensores y/o una unidad de control y/o una fuente de energía, y/o una o más fuentes de luz. Como tal, en algunas versiones, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción incluye la detección de una muestra, por ejemplo, un líquido, en una o más cámaras de reacción con uno o más sensores. Los sensores pueden ser, por ejemplo, sensores electroquímicos. Los sensores pueden estar configurados para enviar y/o recibir energía eléctrica hacia y/o desde una o más cámaras de reacción a través, en algunas versiones, de una capa adhesiva y/o uno o más contactos eléctricos. Dichos sensores pueden estar configurados para detectar la presencia y/o ausencia de líquido en una o más cámaras de reacción. Además, en algunas variaciones en las que un sustrato está acoplado operativamente a una fuente de luz, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción puede incluir la activación de la fuente de luz para que emita luz y/o la desactivación de la fuente de luz para que deje de emitir luz. En algunas versiones de los dispositivos en cuestión, los sensores, la unidad de control y/o el elemento calefactor están conectados operativamente de manera que cuando el líquido entra en una cámara de reacción, el sensor detecta el líquido y el elemento calefactor comienza a calentar la cámara de reacción automáticamente, por ejemplo, sin que se requiera una acción particular del usuario.
En realizaciones en las que un sustrato incluye una unidad de control, la modificación de una propiedad óptica de la muestra biológica puede incluir la realización de un análisis de propiedades ópticas, por ejemplo, colorimétrico, de una muestra en la una o más cámaras de reacción con la unidad de control. Este análisis puede realizarse sobre un producto de reacción después de hacerlo reaccionar con el reactivo modificador de las propiedades ópticas. La realización de un análisis de propiedades ópticas, por ejemplo, colorimétrico, puede incluir la determinación, basada en una entrada, por ejemplo, una entrada de uno o más sensores, de si se ha producido un cambio en una propiedad óptica, por ejemplo, el color, de uno o más contenidos de una cámara de reacción. Basándose en la determinación, la realización del análisis puede incluir la generación de una salida, como una salida para un usuario a través de una pantalla, en la que la salida refleja al usuario si se ha producido una modificación. La realización de un análisis de propiedades ópticas, por ejemplo, colorimétricas, también puede ser realizada por un usuario sin emplear una unidad de control, como por ejemplo utilizando un dispositivo de análisis o haciendo una determinación basada en una inspección visual. Además, la realización de un análisis de propiedades ópticas, por ejemplo, colorimétrico, también puede incluir la obtención de datos de imagen, por ejemplo, foto y/o vídeo, de una modificación de las propiedades ópticas o la falta de ellas con, por ejemplo, una cámara, como la de un teléfono móvil, y la evaluación de los datos visualmente o con un dispositivo de análisis, como un teléfono móvil.
En algunas versiones, los procedimientos en cuestión incluyen la transferencia de energía eléctrica desde uno o más elementos de un sustrato, por ejemplo, una unidad de control y/o un sensor, a una o más cámaras de reacción a través de una capa adhesiva. Los procedimientos también pueden incluir la transferencia de energía eléctrica desde una o más cámaras de reacción a uno o más elementos de un sustrato, por ejemplo, una unidad de control y/o un sensor, a través de una capa adhesiva. En algunos aspectos, la realización de un análisis de modificación de propiedades ópticas requiere la transmisión de dicha energía eléctrica.
En algunas versiones de los procedimientos, el cartucho receptor de muestras es transparente, y la realización de un análisis de propiedades ópticas, por ejemplo, colorimétrico, incluye la detección, la visualización, de una o más características de la luz, por ejemplo, el color o la opacidad, transmitida a través del cartucho receptor de muestras. En algunos aspectos de los procedimientos, un dispositivo modificador de las propiedades ópticas también incluye una capa adhesiva, una capa adhesiva opaca y/o blanca, conectada operativamente al cartucho receptor de muestras. En tales aspectos, los procedimientos pueden incluir la realización de un análisis de propiedades ópticas, como por ejemplo mediante la inspección visual de las cámaras para detectar una propiedad óptica modificada, del producto de reacción después de hacerlo reaccionar con un reactivo modificador de propiedades ópticas.
Los dispositivos modificadores de las propiedades ópticas de los ensayos de muestras biológicas también pueden fabricarse según los procedimientos de la materia acoplando operativamente un cartucho receptor de muestras y/o un sustrato con la capa adhesiva. Dicho acoplamiento puede realizarse colocando una capa adhesiva contra un cartucho receptor de muestras y/o un sustrato y fijándolo, como por ejemplo uniendo y/o fundiendo adhesivamente los componentes entre sí. Específicamente, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen el contacto de una capa adhesiva directamente con un sustrato, por ejemplo, una placa de circuito impreso, y la unión, por ejemplo, la unión adhesiva, o la laminación de los dos juntos. En algunos aspectos, una capa adhesiva tiene un primer lado y un segundo lado opuesto al primer lado. Como tal, la fabricación de un dispositivo acoplando operativamente un cartucho receptor de muestras y un sustrato puede incluir la fijación adhesiva del cartucho receptor de muestras al primer lado y del sustrato al segundo. Dicha fabricación puede realizarse de forma manual o automática, como por ejemplo con un dispositivo de fabricación electrónico, como un dispositivo de fabricación que puede programarse para realizar uno o más pasos de fabricación.
En algunas versiones, las cámaras de reacción incluyen cada una una composición de amplificación, por ejemplo, una composición de amplificación de ácido nucleico. Como se ha indicado anteriormente, una o más cámaras de reacción de un dispositivo pueden incluir cada una una composición de amplificación, por ejemplo, una composición de amplificación de ácidos nucleicos. Como tal, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción puede incluir la mezcla de una muestra biológica con la una o más composición de amplificación. Dicha mezcla puede incluir la provocación de una reacción química entre ambos.
En algunos casos, el calentamiento de una mezcla de reacción con un elemento calefactor incluye la aceleración de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos entre, por ejemplo, ácidos nucleicos de una muestra biológica y uno o más aspectos de una composición de amplificación, por ejemplo, una composición de amplificación de ácidos nucleicos. Como tal, en varios aspectos, la reacción genera uno o más ácidos nucleicos amplificados. Dicha reacción también puede generar un producto de reacción. Dicho producto de reacción puede ser o incluir una pluralidad de protones y/o uno o más ácidos nucleicos amplificados.
Los procedimientos en cuestión también pueden incluir la reacción del producto de reacción, o un aspecto del mismo, como uno o más protones y/o uno o más ácidos nucleicos amplificados, con un reactivo modificador de la propiedad óptica. Dicha reacción puede realizarse, por ejemplo, poniendo el producto de reacción, o un aspecto del mismo, como uno o más protones y/o uno o más ácidos nucleicos amplificados, en contacto con un reactivo modificador de las propiedades ópticas, como por ejemplo mezclándolos en uno o más recipientes, por ejemplo, una o más cámaras de reacción. La reacción del producto de reacción, o de un aspecto del mismo, con un reactivo modificador de las propiedades ópticas puede incluir la modificación química del producto de reacción y/o del reactivo modificador de las propiedades ópticas, como por ejemplo mediante la unión de uno o más protones al reactivo modificador de las propiedades ópticas, de modo que uno u otro muestre una o más propiedades ópticas diferentes, como un color y/o una opacidad.
Al hacer reaccionar el producto de reacción, o un aspecto del mismo, como uno o más protones y/o uno o más ácidos nucleicos amplificados, con un reactivo modificador de propiedades ópticas, en varias realizaciones, se modifica suficientemente una propiedad óptica, por ejemplo, el color y/o la opacidad, del reactivo modificador de propiedades ópticas para permitir la detección de la propiedad óptica modificada por un ojo humano no asistido. El término "humano", tal y como se utiliza en este documento, puede incluir a usuarios o sujetos humanos de ambos sexos y en cualquier etapa de desarrollo, por ejemplo, fetal, neonatos, bebés, jóvenes, adolescentes, adultos, donde en ciertas realizaciones el sujeto o usuario humano es un joven, adolescente o adulto. Asimismo, un ojo humano no asistido se refiere a un ojo humano que no está mejorado por uno o más dispositivos que aumentan o modifican la capacidad visual. Tales dispositivos pueden incluir una cámara, una lupa óptica, un microscopio, o una optimización, por ejemplo, de gafas o lentes de contacto filtradas, por ejemplo, polarizadas, etc.
Una realización de los procedimientos en cuestión puede ser ilustrada en asociación con el dispositivo 100 como se muestra en las FIGS. 1 y 2. En consecuencia, en algunos aspectos, los procedimientos incluyen la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción 102 de un cartucho receptor de muestras 101 de un dispositivo modificador de propiedades ópticas de ensayo de muestras biológicas 100 y, por tanto, la generación de una mezcla de reacción. Dicha transmisión puede realizarse a través de la entrada de muestra 110 y/o los conductos 202.
Los procedimientos también pueden incluir el calentamiento de la mezcla de reacción con un elemento calefactor 104 del dispositivo 100 y generar así un producto de reacción. En varios casos, los procedimientos también incluyen hacer reaccionar el producto de reacción con el reactivo modificador de propiedades ópticas 201, en el que la reacción modifica suficientemente una propiedad óptica del reactivo modificador de propiedades ópticas para permitir la detección de la propiedad óptica modificada por un ojo humano no asistido mientras el producto de reacción está con la una o más cámaras de reacción 102 del cartucho receptor de muestras 101. La detección de la propiedad óptica modificada con un ojo humano no asistido puede realizarse, por ejemplo, a través de un cartucho receptor de muestras 101, que puede ser transparente.
Además, en algunas versiones, los procedimientos incluyen contener, por ejemplo, detener un movimiento sustancial, como un flujo de, una muestra en la una o más cámaras de reacción 102 con un elemento de ventilación selectiva 107 y/o una capa adhesiva 106. En tales realizaciones, la transmisión de una muestra biológica a una o más cámaras de reacción 102 incluye el flujo de un gas, por ejemplo, aire, a través del elemento de ventilación selectivo 107 antes de poner en contacto un líquido, por ejemplo, una muestra biológica, con el elemento de ventilación selectivo 107 y, por lo tanto, hacerlo impermeable al flujo de líquido y gas.
En varios casos, un dispositivo 100 incluye una carcasa que incluye una primera porción 108 que tiene un receptáculo 111, y una segunda porción 109 acoplable con la primera porción. Como tal, la transmisión de la muestra biológica a la una o más cámaras de reacción 102 puede incluir el flujo de una muestra a través del receptáculo 111.
Además, en algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión incluyen la recolección de una muestra biológica, como la recolección de una muestra con un colector de muestras. Dicha muestra puede incluir, por ejemplo, saliva humana, orina, moco humano, sangre o un tejido sólido como el tejido bucal. Dicha muestra también puede incluir bacterias o esporas. La recolección puede incluir el contacto, por ejemplo, frotando y/o raspando, del colector de muestras contra una o más superficies de un sujeto y/o superficies de una muestra biológica de un sujeto, como una muestra líquida, por ejemplo, de saliva y/o sangre, extraída del sujeto. Como tal, en algunas versiones, la recolección incluye la extracción de una o más muestras biológicas del sujeto. En algunas versiones, la recolección de la muestra biológica puede incluir la instrucción a un sujeto para que produzca una muestra biológica, como por ejemplo escupiendo sobre y/o en un colector de muestras. La recolección de la muestra biológica también puede incluir la retención de una muestra biológica o una porción de la misma, por ejemplo, una o más células, en el colector de muestras mientras, por ejemplo, se transfiere el colector de muestras a un dispositivo de ensayo. En algunos casos, el colector de muestras es un hisopo y la recolección de la muestra biológica incluye el hisopado del interior de la boca y/o nariz del sujeto para obtener la muestra biológica en el colector. En algunas versiones, los colectores de muestras son hisopos nasofaríngeos, de cornete medio y/o nasales. Después de recoger una muestra biológica, los procedimientos, en algunas versiones, incluyen el procesamiento de la muestra biológica para que sea una muestra biológica preparada como se describe en el presente documento.
Además, en algunas versiones de los procedimientos, se fabrica un dispositivo encapsulando dentro de una carcasa un elemento de ventilación selectiva, un cartucho receptor de muestras, una capa adhesiva y/o un sustrato, o cualquier combinación de los mismos, poniéndolos en contacto en un único paso concertado. En algunas variaciones, los procedimientos no incluyen la fabricación de un dispositivo, por ejemplo, mediante la realización de un primer paso de patronaje de una capa de sustrato, tal como una capa de vidrio, silicio y/o polímero, y/o la unión de un patrón, por ejemplo, uniéndolo química y/o físicamente, a una capa sin patrón, por ejemplo, una capa de sellado, y un segundo paso posterior de integración de la capa unida y/o sellada en una carcasa o casete que proporciona funcionalidad adicional para emplear el dispositivo fluídico. Además, en varias realizaciones, los procedimientos de fabricación de los dispositivos en cuestión incluyen la preservación sustancial de la funcionalidad, por ejemplo, la funcionalidad química, de los contenidos de las cámaras de reacción, como los reactivos modificadores de las propiedades ópticas y/o las composiciones de amplificación, mientras los contenidos están contenidos en las cámaras de reacción durante la fabricación. Esto se consigue porque el proceso de fabricación no expone a los reactivos a temperaturas extremas ni a entornos químicos. Además, en algunas versiones de los procedimientos, los procedimientos incluyen la fabricación de un dispositivo mediante el acoplamiento operativo de una capa adhesiva y un sustrato, mientras que el contenido de la cámara de reacción, como los reactivos modificadores de las propiedades ópticas y/o las composiciones de amplificación, están retenidos dentro de las cámaras de reacción. En algunas versiones, el acoplamiento operativo de una capa adhesiva y un sustrato no incluye el calentamiento de la capa adhesiva, el sustrato o el entorno que los rodea.
La reacción de amplificación proporcionada en el presente documento amplifica nucleótidos de una plantilla de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación isotérmica, como una reacción de desplazamiento de hebra. En otra realización, la reacción de desplazamiento de la cadena es proporcionada por una polimerasa con actividad de desplazamiento de la cadena en condiciones de reacción tales que el desplazamiento de la cadena es posible. Ejemplos de reacciones de desplazamiento de hebra son la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), la amplificación por círculo rodante (RCA) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). En otras realizaciones, la reacción de amplificación incluye otras reacciones de amplificación no isotérmicas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En ciertas realizaciones, la reacción de amplificación realizada es LAMP. En una reacción LAMP, se amplifica un molde de ADN de doble o simple cadena en equilibrio dinámico a una temperatura elevada utilizando dos o tres pares de cebadores. Los cebadores se diseñan basándose en la plantilla de ADN, utilizando un software de diseño de cebadores como LAMP Designer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA). En el primer paso de la reacción LAMP, la región F2 del FIP (Forward Inner Primer) se anuda al ADN monocatenario en la posición complementaria respectiva (F2c). A continuación, una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra incorpora dNTPs a lo largo de la plantilla desde el extremo 3' de F2. La incorporación de nucleótidos libera protones, reduciendo el pH de la mezcla de reacción. A continuación, el cebador F3 forward se anula en la región F3c, antes de la región F2 y en la plantilla. El cebador F3 forward comienza a amplificar la cadena molde, que libera más protones y desplaza la cadena incorporada por el FIP que se sintetizó previamente. Esta cadena única contiene una secuencia F1 (dentro de la secuencia objetivo) junto con su secuencia complementaria F1c (dentro del FIP). Esto forma un bucle de tallo, ya que F1c se anuda a F1 en el extremo 5'. Al mismo tiempo, el BIP (Backward Inner Primer) se anuda al otro extremo de la cadena y los nucleótidos se extienden desde B2, liberando más protones. El cebador retrógrado B3 se une entonces a la región B3c, aguas abajo de la región B2, desplaza las hebras amplificadas por el BIP y promueve la extensión para crear la doble hebra. Esta hebra desplazada contiene ahora una secuencia B1 (dentro de la secuencia objetivo) junto con su secuencia complementaria B1c (dentro del BIP), formando otro bucle de tallo en el extremo 3'. La estructura tiene ahora dos estructuras de bucle de tallo en cada extremo, a partir de las cuales se producen desplazamientos y extensiones continuas para amplificar la plantilla. La reacción LAMP puede amplificarse añadiendo más cebadores de bucle hacia delante y hacia atrás para producir más amplicones con estructuras de bucle de tallo.
El procedimiento LAMP puede tener lugar a una temperatura fija, minimizando la necesidad de cualquier equipo costoso de termociclaje. Normalmente, los procedimientos isotérmicos requieren una temperatura establecida, que viene determinada por los reactivos seleccionados. Por ejemplo, las enzimas funcionan mejor entre 60-65°C en los procedimientos LAMp .
La detección colorimétrica del producto de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede realizarse en tiempo real a lo largo de la reacción de amplificación, o después de la realización de la reacción de amplificación. La detección del cambio colorimétrico de la mezcla de reacción puede asociarse a una indicación digital de la presencia o ausencia del producto de la reacción de amplificación. En otras palabras, una observación visual del cambio de color de la mezcla de reacción puede proporcionar información sobre la presencia o ausencia del producto de la reacción de amplificación. En ciertas realizaciones, la detección de un cambio colorimétrico de la mezcla de reacción indica que se ha obtenido la fase exponencial o de meseta de la reacción de amplificación.
En algunas realizaciones, la detección del producto de la reacción de amplificación se acelera en relación con una reacción de amplificación que utiliza una mezcla de reacción sin un agente halochromico. En otras realizaciones, el cambio colorimétrico de la mezcla de reacción se detecta en menos de 60 minutos a partir de un tiempo de inicio de la reacción de amplificación. La detección acelerada del producto de la reacción de amplificación se obtiene porque el agente halocrómico (un ácido o una base débil) en la mezcla de reacción absorbe los protones generados durante la reacción de amplificación, y la recombinación de los protones libres actúa para acelerar la detección de la reacción de amplificación. La reacción puede diseñarse de forma que se requiera una amplificación mínima para generar una transición de pH suficiente para que el agente halochromico cambie de color. Las técnicas de amplificación convencionales que utilizan tintes intercalados fluorescentes, balizas moleculares, sondas de hibridación, detección basada en tintes, UV-Vis u otros procedimientos de detección requieren que se produzca una determinada cantidad de amplificación umbral antes de que una señal de amplificación sea detectable. Sin embargo, los procedimientos de la presente invención requieren una cantidad umbral de amplificación relativamente menor antes de que sea detectable un cambio de color del agente halochromico, y por lo tanto la detección de un producto de reacción de amplificación se acelera en relación con los procedimientos de amplificación convencionales.
En algunas realizaciones, el producto de la reacción de amplificación se detecta visualmente mediante la observación de un cambio de color de la mezcla de reacción. En otra realización, se utiliza el ojo humano para la detección visual. En otra realización, se utiliza una cámara, un ordenador o algún otro dispositivo óptico para la detección visual o para obtener imágenes de la mezcla de reacción. Los programas de imágenes incluyen Photoshop (Adobe, San José CA), ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda MD) y MATLAB (MathWorks, Natick MA). En otra realización, el producto de la reacción de amplificación se detecta midiendo la fluorescencia de la mezcla de reacción, utilizando procedimientos de espectroscopia de fluorescencia. En otra realización, el producto de la reacción de amplificación se detecta midiendo la absorbancia de la mezcla de reacción, utilizando procedimientos de espectroscopia de absorción. En otra realización, el punto final o el cambio global en la absorbancia o la fluorescencia de la mezcla de reacción se mide a una determinada longitud de onda o conjunto de longitudes de onda.
Las FIG. 17 proporciona tiempos de reacción de amplificación de ácidos nucleicos a través de seis cámaras de reacción diferentes en un dispositivo modificador de propiedades ópticas según realizaciones de la divulgación en cuestión. Las columnas representan las posiciones de las cámaras de reacción y las filas representan los diferentes dispositivos. Un cartucho de calentamiento y fluido integrado proporciona un calentamiento uniforme, permitiendo condiciones de reacción multiplexadas uniformes. Como tal, en esta realización, el dispositivo de modificación de las propiedades ópticas incluye un elemento calefactor integrado. El ensayo asociado a los datos presentados en la FIG.
17 es un ensayo de control LAMP similar al ensayo de ADN lambda descrito en este documento.
Además, la FIG. 18 proporciona los cambios de color, medidos utilizando la escala CIE94 Delta-E, resultantes de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos a través de seis cámaras de reacción diferentes en un dispositivo modificador de propiedades ópticas según las realizaciones de la divulgación en cuestión. Como se muestra en la FIG.
18, las columnas representan las posiciones de las cámaras de reacción y las filas los diferentes dispositivos. Un cartucho de calentamiento y fluido integrado proporciona un calentamiento uniforme, permitiendo condiciones de reacción multiplexadas uniformes. Como tal, en esta realización, el dispositivo de modificación de las propiedades ópticas incluye un elemento calefactor integrado. El dispositivo aplicado también incluye una capa adhesiva. La capa adhesiva interpuesta entre los canales fluídicos y el sustrato del calentador proporciona conducción térmica, así como un fondo blanco uniforme para la lectura del color. El ensayo asociado a los datos presentados en la FIG. 18 es un ensayo de control LAMP similar al ensayo de ADN lambda descrito aquí. Esta arquitectura de dispositivo representa una solución de bajo coste para la lectura visual de ensayos de amplificación de ácidos nucleicos multiplexados.
Además, la FIG. 19 proporciona un perfil de temperatura de una cámara de reacción, por ejemplo, un depósito fluido, acoplado operativamente y/o adyacente a un elemento de calentamiento, por ejemplo, un calentador electrónico, de la manera descrita. Además, la FIG. 20 proporciona una representación de la uniformidad de la temperatura a través de seis ubicaciones de calentamiento en un elemento de calentamiento, por ejemplo, una placa de calentamiento electrónica, para acoplar operativamente con un ensayo de amplificación de ácido nucleico multiplexado. En dicha realización, el ensayo incluye un dispositivo modificador de propiedades ópticas que incluye cámaras de reacción según realizaciones de la divulgación del objeto.
Composiciones
Las composiciones proporcionadas a continuación pueden aplicarse en cualquier realización de los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento para la detección colorimétrica acelerada y eficiente de los productos de reacción de amplificación de ácidos nucleicos. En una realización, se utiliza un ensayo colorimétrico para detectar visualmente la presencia de un producto de ácido nucleico amplificado, lo que elimina la necesidad de una instrumentación cara y sofisticada.
En algunas realizaciones, la detección colorimétrica de los productos de amplificación se consigue amplificando una molécula molde de ácido nucleico objetivo para obtener el producto de la reacción de amplificación. La reacción de amplificación incluye una mezcla de reacción. En una realización, la mezcla de reacción incluye una molécula molde de ácido nucleico, una o más enzimas para catalizar la reacción de amplificación y uno o más agentes halochromicos para la detección colorimétrica. En otra realización, la mezcla de reacción también incluye un tampón que tiene una capacidad tamponadora equivalente al tampón Tris en una concentración entre 1 mM-19 mM en una solución que tiene un pH inicial de 8,0. En otras realizaciones, la mezcla de reacción también incluye una pluralidad de cebadores de ácido nucleico, desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), sales adecuadas para la enzima y otros productos químicos no tamponados que permiten la amplificación del ácido nucleico.
Durante la reacción de amplificación, se libera un protón por cada dNTP que se incorpora a una molécula molde de ácido nucleico. Así, el pH de la mezcla de reacción disminuye a lo largo de la reacción de amplificación. En una realización, si el ácido nucleico diana está presente, la reacción de amplificación cambia el pH inicial de la mezcla de reacción para causar un cambio colorimétrico detectable del agente halochromico, indicando así la presencia del ácido nucleico diana, y si el ácido nucleico diana no está presente, la reacción de amplificación no genera un número suficiente de protones para cambiar el pH inicial de la mezcla de reacción lo suficiente como para causar un cambio colorimétrico detectable del agente halocrómico, indicando así que el producto de la reacción de amplificación no se ha producido. En una realización, el agente halocrómico (o indicador de pH) en la mezcla de reacción tiene un intervalo de pH de transición para un cambio colorimétrico del agente halocrómico que es más estrecho que un cambio de pH esperado entre (1) un pH inicial de la mezcla de reacción antes de que se realice la reacción de amplificación, y (2) un pH final de la mezcla de reacción después de que se haya realizado la reacción de amplificación.
En una realización, el agente halocrómico es un agente colorimétrico o un agente fluorescente. Entre los agentes halocrómicos adecuados se encuentran el rojo de fenol, el púrpura de bromocresol, el azul de bromotimol, el rojo neutro, la naftaleína, el rojo de cresol, la cresolftaleína, la fenolftaleína, el rojo de metilo y la timolftaleína, entre otros. Se puede utilizar una amplia gama de concentraciones de estos agentes halochromicos en la mezcla de reacción. Los diferentes agentes halocrómicos tienen diferentes intervalos de pH de transición. En algunas realizaciones, el agente halocrómico tiene un intervalo de pH de transición entre pH 5-10, entre pH 6-9, o entre pH 6,5-8,8. En otra realización, el agente halochromico está en una concentración entre 25-100 pM en la mezcla de reacción. En otra realización, el agente halocrómico está en una concentración entre 50-260 pM. En algunas realizaciones, se utiliza una combinación de dos o más agentes halocrómicos en la mezcla de reacción, que aumenta el cambio de contraste de color normalizado de la mezcla de reacción al ser de colores complementarios al principio y de colores similares al final de la reacción de amplificación. En otra realización, la combinación de agentes halocromáticos comprende el rojo de fenol y el azul de bromotimol. En otra realización, la combinación de agentes halocrómicos comprende rojo de cresol y azul de bromotimol.
En un ejemplo, el rojo de fenol es un agente halocrómico que tiene un intervalo de pH de transición de alrededor de 6,4-8,0. En el límite superior del intervalo de pH de transición, el rojo de fenol es rojo, y en el límite inferior del intervalo de pH de transición, el rojo de fenol es amarillo. Una mezcla de reacción que contenga rojo de fenol cambiará de color de rojo a amarillo a lo largo de la reacción de amplificación, siempre que el pH inicial de la mezcla de reacción esté alrededor o por encima de 8,0, y el pH final de la mezcla de reacción esté dentro del intervalo de pH de transición o alrededor o por debajo de 6,4.
En algunas realizaciones, el pH inicial de la mezcla de reacción se establece añadiendo un ácido o una base a la mezcla de reacción hasta que se alcance el pH inicial deseado. El pH final de la mezcla de reacción se determina realizando una reacción de amplificación de la muestra y midiendo el pH final (por ejemplo, con un electrodo de micropH). En una realización, el agente halocrómico para una reacción de amplificación se selecciona de manera que el intervalo de pH de transición se encuentra entre el pH inicial y el pH final. En otra realización, el agente halocrómico se selecciona de manera que el intervalo de pH de transición esté más cerca del pH inicial que del pH final. El agente halocrómico también puede seleccionarse en función de la enzima concreta utilizada para catalizar la reacción de amplificación. Cerca del pH final, la enzima en la mezcla de reacción termina la polimerización de la reacción de amplificación a medida que el pH disminuye a concentraciones desfavorables de H+. En una realización, se añaden iones de hidronio o equivalentes de iones de hidronio adicionales a la mezcla de reacción a través de la muestra. Por ejemplo, se pueden tolerar entre 4,8 * 10'9 y 4,8 * 10'18 equivalentes de iones de hidronio adicionales por 10 pl de mezcla de reacción para que la reacción de amplificación siga adelante. En otra realización, se puede tolerar entre 4,8 * 10'1°y 4,8 * 10'18, 4,8 * 10'12y4,8 * 10'18, o 4,8 * 10'15y4,8 * 10'18.
Generalmente, la enzima catalizará las reacciones de amplificación dentro de un intervalo de pH que abarca o está cerca del intervalo de pH de transición del agente halochromico seleccionado. Se pueden utilizar varias enzimas para la reacción, y diferentes enzimas catalizan las reacciones de amplificación en diferentes intervalos de pH. Por ejemplo, se cree que la polimerasa Bst cataliza las reacciones de amplificación dentro del intervalo de pH de 6,6-9,0. El pH de partida preferido para la polimerasa Bst es superior a 7, más preferentemente superior a 8,2, y más preferentemente a 8,8. Otros ejemplos de un pH de partida preferido para la polimerasa Bst se encuentran en U.S. Pat. No.
5.830.714/410,093, depositada el 17 de abril de 1996. En una realización, el rojo de fenol se acopla con la polimerasa Bst en una mezcla de reacción, ya que el intervalo de pH en el que la polimerasa Bst es activa (6,6-9,0) abarca el intervalo de pH de transición del rojo de fenol (6,4-8,0). En otra realización, el rojo de metilo se acopla con el fragmento U exo-Klenow (polimerasa para la amplificación dependiente de la helicasa, h Da ) en una mezcla de reacción, ya que el pH de partida en el que el fragmento U exo-Klenow es activo (alrededor de 7,5) es superior al intervalo de pH de transición del rojo de metilo (4,8-6,2).
Aparte de la polimerasa Bst o Bst 2.0, otras enzimas que pueden utilizarse para catalizar la reacción de amplificación incluyen la polimerasa de Thermus aquaticus (TAQ), las polimerasas de ADN I-IV, la polimerasa Kapa, las polimerasas de ARN I-V, la polimerasa de ARN t 7, una transcriptasa inversa, cualquier polimerasa de ADN o polimerasa de ARN, una helicasa, una recombinasa, una ligasa, una endonucleasa de restricción y una proteína de unión a una sola cadena. En algunas realizaciones, una reacción de amplificación isotérmica utiliza una enzima que es una polimerasa de desplazamiento de hebra, como la phi29-DNA-Polimerasa, la Klenow DNA-Polimerasa, la Vent DNA Polimerasa, la Deep Vent DNA Polimerasa, la Bst DNA Polimerasa, la 9oNm(TM) DNA Polimerasa, el fragmento U exo-Klenow, o mutantes y variantes de las mismas. En algunas realizaciones, también se añaden a la mezcla de reacción sales adecuadas para la enzima. En ciertas realizaciones, el pH inicial de la mezcla de reacción se establece en base a un pH óptimo para la enzima específica utilizada para catalizar la reacción de amplificación. En una realización, el pH de toda la muestra de ADN está entre el pH 3 y el pH 11.
En otras realizaciones, se utiliza un agente halocrómico fluorescente para detectar los protones liberados durante la amplificación. El agente halocrómico puede cambiar las propiedades ópticas (como la amplitud y la longitud de onda emitida) a medida que cambia el pH de la mezcla de reacción durante la reacción de amplificación. Los agentes halocrómicos fluorescentes incluyen la fluoresceína, la piranina y el colorante pHrodo (Life Technologies, Carlsbad CA).
La base y/o el ácido añadidos a la mezcla de reacción mantienen el pH inicial de la mezcla de reacción alrededor o por encima de un límite superior del intervalo de pH de transición del agente halochromico. Por ejemplo, puede añadirse a la mezcla de reacción un ácido, como el ácido clorhídrico (HCl) o el ácido sulfúrico (H2SO4), o una base, como el hidróxido de sodio (NaOH) o el hidróxido de potasio (KOH). En algunas realizaciones, el ácido o la base establece el pH inicial de la mezcla de reacción entre el pH 6-10, entre el pH 7-8, o entre el pH 8-8,6. En una realización, la mezcla de reacción es capaz de compensar el pH inicial de la mezcla de reacción en menos de 0,1 unidades de pH. En otra realización, la mezcla de reacción tiene un pH inicial inferior a 2 unidades de pH por encima del límite superior del intervalo de pH de transición del agente halochromico. En otras realizaciones, la mezcla de reacción tiene un pH inicial inferior a 1 unidad de pH, 0,5 unidades de pH o 0,1 unidades de pH por encima del límite superior del intervalo de pH de transición del agente halochromico. En otra realización, el ruido de la amplificación no específica se minimiza estableciendo el intervalo de transición de pH suficientemente separado del pH inicial de la mezcla de reacción, de modo que cualquier cambio de color sólo se consigue mediante una amplificación específica y sostenida.
En una realización, la mezcla de reacción no requiere ningún agente tampón adicional para la reacción de amplificación, ya que un agente tampón podría evitar que se produzcan grandes cambios de pH durante la reacción de amplificación. En otra realización, la mezcla de reacción contiene una cantidad mínima de agente amortiguador, de manera que la capacidad de tamponamiento de la mezcla de reacción es menor que el cambio esperado en el pH durante la amplificación. En algunas realizaciones, el tampón está en una concentración entre 1 mM y 3 mM. En otra realización, el tampón tiene una concentración de 1 mM. En ciertas realizaciones, el tampón utilizado es el tampón Tris (formulado a pH 8,8), HEPES (pH 7-9) o TAPS (pH 7-9). En otra realización, el tampón utilizado es un tampón que tiene una capacidad tampón equivalente a un tampón Tris a una concentración entre 1 mM-19 mM en una solución que tiene un pH inicial de 8,0. Esta amplia gama de concentraciones de tampón adecuadas permite que la mezcla de reacción resista los cambios de pH iniciales no deseados durante la configuración de la reacción, a diferencia de las configuraciones de reacción con equivalentes de tampón Tris mínimos (<1mM) (véase US 13/799,995, presentado el 13 de marzo de 2013). Estos cambios no deseados en el pH se producen debido a los equivalentes de iones de hidronio o hidróxido añadidos a la reacción a través de los reactivos de la muestra. Como la detección colorimétrica y la cinética de la enzima dependen del pH inicial, es importante la presencia de una capacidad tampón en la mezcla de reacción lo suficientemente alta como para evitar el cambio de pH inicial, pero lo suficientemente baja como para permitir el cambio de color tras la amplificación. En otra realización, el pH de la mezcla de reacción está entre el pH 7,5-8,8. La tabla 1 muestra varios tampones que tienen capacidades de tamponamiento equivalentes a un tampón Tris a una concentración entre 1 mM-19 mM en una solución que tiene un pH inicial de 8,0. La capacidad tampón (p) se define como los equivalentes de ácido o base necesarios para cambiar el pH de 1 litro de tampón en 1 unidad de pH. Esto se puede calcular como: p = 2.3* C * (Ka*[H3O+]/(Ka [H3O+])2); donde C es la concentración del tampón, Ka es la constante de disociación del tampón y [h 3o ] es la concentración de iones hidronio del tampón (que se calcula a partir del pH inicial de la reacción). Se comprobó que la capacidad tampón de 1 mM -19 mM de Tris (en una solución con un pH inicial de 8,0) oscilaba entre 0,000575 y 0,010873. El pH inicial del tampón se consideró en el intervalo de 7,5 - 8,8 para que fuera compatible con la bioquímica de la reacción (función de la polimerasa, fusión del ácido nucleico, etc.). En otras realizaciones, el tampón tiene una capacidad tamponadora equivalente a un tampón Tris a una concentración entre 1,5 mM -19 mM, 2 mM -19 mM, 3 mM -19 mM, 4 mM -19 mM, 5 mM -19 mM, 6 mM -19 mM, 7 mM -19 mM, o de otro modo, en una solución que tiene un pH inicial de 8,0. En otras realizaciones, el tampón tiene una capacidad tamponadora equivalente a un tampón Tris a una concentración entre 1,92 mM - 36,29 mM, 3 mM -36,29 mM, 4 mM - 36,29 mM, 5 mM - 36,29 mM, o de otra manera, en una solución que tiene un pH inicial de 8,8. En otras realizaciones, el tampón tiene una capacidad tamponadora equivalente a un tampón Tris a una concentración entre 1,48 mM - 27,92 mM, 2 mM - 27,92 mM, 3 mM - 27,92 mM, 4 mM - 27,92 mM, 5 mM - 27,92 mM, o de otro modo, en una solución que tiene un pH inicial de 7,5.
Tabla 1: Tabla de capacidad del tampón
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En una realización, se añade un compuesto de magnesio a la mezcla de reacción, porque el magnesio promueve la incorporación de nucleótidos en la plantilla e influye en la actividad de la polimerasa. En otra realización, la concentración de un compuesto de magnesio (como el sulfato de magnesio) en la mezcla de reacción es de al menos 0,5 mM, al menos 1 mM, al menos 2 mM o al menos 4 mM. En una realización, la concentración de ion magnesio añadido depende de la concentración de dNTPs, plantilla de ácido nucleico y cebadores. En una realización, la relación entre los dNTPs y el sulfato de magnesio en la mezcla de reacción es inferior a 1:2, inferior a 1:3, inferior a 1:4 o inferior a 1:5.
En algunas realizaciones, se añaden cationes monovalentes a la mezcla de reacción. Los cationes monovalentes incluyen el potasio, el amonio y el amonio cuaternario, entre otros. Los cationes monovalentes pueden afectar a las características de fusión del molde de ácido nucleico y mejorar la eficacia de la enzima. En una realización, el potasio está en la mezcla de reacción a una concentración inferior a 50 mM, o inferior a 15 mM. En otra realización, las sales de amonio cuaternario están en la mezcla de reacción a una concentración superior a 2mM, superior a 5mM o superior a 8mM. En otra realización, un compuesto de amonio (como el cloruro de amonio) está en la mezcla de reacción a una concentración de menos de 15mM, o menos de 10 mM. El amonio (NH4+) tiene cierta capacidad tamponadora, por lo que la concentración final de compuestos de amonio en la mezcla de reacción debe minimizarse manteniendo un rendimiento óptimo de amplificación.
En una realización, las concentraciones de otros reactivos de la mezcla de reacción se mantienen en las cantidades generalmente utilizadas en las reacciones de amplificación. Véase Notomi T et. al. (1997), Nucleic Acids Res., 2000 Jun;28(12): E63; Nature Protocols 2008, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, 2008 3(5): pg 880. En una realización, se utiliza la enzima Bst o Bst 2.0, y la cantidad de enzima es de al menos 0,8 unidades por microlitro de fluido combinado. En esta realización, la betaína también está presente en la mezcla de reacción a una concentración entre 0-1,5 M o 0,8M-1 M, y la concentración total de cebadores está entre 3,6|jM y 6,2|j M. En algunas realizaciones, cualquiera de los siguientes reactivos está presente en la mezcla de reacción: Tampón Tris (pH 8,8) a 20 mM, KCl a 10 mM, MgSO4 a 8 mM, (N H ^S O 4 a 10 mM, Tween 20 al 0,1 %, Betaína a 0,8 M, dNTPs a 1,4 mM cada uno, MnCh a 0,5 mM, FIP a 1,6 j M, F3 a 0,2 j M, B3 a 0,2 j M, cebadores a una concentración total de 5,2 j M (2*(1,6+0,8+0,2), y Bst / Bst 2.0 a 8 U por 10jl.
Se ha comprobado que las concentraciones de reactivos anteriores proporcionan un buen rendimiento de amplificación y una baja capacidad de tamponamiento, de modo que se puede utilizar un sensor de pH halochromico para detectar los protones liberados durante la reacción de amplificación. En algunas realizaciones, las concentraciones de los reactivos de la mezcla de reacción dependen de la selección de la enzima. En otras realizaciones, los fabricantes de enzimas ofrecen orientación sobre las concentraciones adecuadas de los reactivos. En una realización, la relación entre el volumen de la muestra y el volumen de la mezcla de reacción es tal que la muestra se diluye entre el 5 % y el 40 % cuando se añade la mezcla de reacción.
En algunas realizaciones, los reactivos de la reacción de amplificación se almacenan por separado antes de ser añadidos a una mezcla de reacción, ya que algunos reactivos tienen condiciones específicas requeridas para su estabilidad. Por ejemplo, la enzima puede almacenarse a largo plazo en una solución moderadamente tamponada y separada de los demás reactivos para garantizar la estabilidad de la enzima. Al mezclarse con el resto de los reactivos de la mezcla de reacción, el agente amortiguador se diluye lo suficiente como para no enmascarar significativamente un cambio de pH. Además, los cebadores para genes específicos de interés pueden suministrarse en una solución separada o en forma liofilizada.
En algunas realizaciones, la reacción de amplificación se realiza dentro de un microtubo. En otras realizaciones, la reacción de amplificación se lleva a cabo dentro de una estructura fluídica o microfluídica. En algunas realizaciones, la estructura fluídica o microfluídica es un pocillo, cámara o canal que recibe los reactivos y la muestra de ácido nucleico por separado, y luego mezcla los componentes. En otra realización, la estructura fluídica o microfluídica es un pocillo, cámara o canal que recibe la mezcla de reacción premezclada. En otra realización, la estructura fluídica o microfluídica posee un largo camino óptico para la observación colorimétrica, o una fuente de excitación de fluorescencia/absorbancia y un detector. En otra realización, la estructura fluídica o microfluídica recibe los reactivos en forma liofilizada, y posteriormente recibe la muestra de ácido nucleico y la solución de hidratación. En una realización, una estructura fluídica o microfluídica de cámara tiene una profundidad de canal que oscila entre 50 jm -400 jm o más. En otra realización, la observación colorimétrica se lleva a cabo para profundidades de canal (longitud de trayectoria) de 50 jm , 50 jm-400 jm , o 50 jm o más.
Algunas realizaciones incluyen un kit para la detección colorimétrica de un producto de amplificación. El kit puede incluir uno o más agentes halocrómicos, una o más enzimas para catalizar una reacción de amplificación, e instrucciones para poner en contacto una muestra con una mezcla de reacción que incluye el tampón y la enzima y el agente halocrómico en condiciones en las que se produce una reacción de amplificación y se obtiene un producto de reacción de amplificación si la muestra contiene una molécula molde de ácido nucleico diana, la mezcla de reacción tiene un pH inicial, y si la molécula molde de ácido nucleico diana está presente, la reacción de amplificación cambia el pH inicial de la mezcla de reacción para provocar un cambio colorimétrico detectable del agente halochromico, indicando así la presencia del ácido nucleico diana, y si la molécula molde del ácido nucleico diana no está presente, la reacción de amplificación no genera un número suficiente de protones para cambiar el pH inicial de la mezcla de reacción lo suficiente como para provocar un cambio colorimétrico detectable del agente halochromico, indicando así que no se ha producido el producto de la reacción de amplificación. En otra realización, las instrucciones son para poner en contacto una molécula molde de ácido nucleico con el agente halocrómico y la enzima en una mezcla de reacción, bajo condiciones que resultan en (1) una reacción de amplificación que amplifica la molécula molde de ácido nucleico para producir un producto de reacción de amplificación, y (2) la generación de un número suficiente de protones para que un pH final de la mezcla de reacción sea suficientemente bajo para producir un cambio colorimétrico detectable del agente halocrómico, indicando así que el producto de reacción de amplificación se ha producido. En otras realizaciones, el kit también incluye un ácido o una base, dNTPs, cebadores y cationes monovalentes. En otra realización, el kit incluye los siguientes reactivos en las siguientes concentraciones:
• Bst o Bst 2.0 polimerasa, al menos 0,8 unidades por microlitro;
• Betaína a 0,8 M;
• Cebadores a 3,6 jM en total;
° Cebadores FIP y BIP a 1,6 jM
° F3 y B3 a 0,2 jM
• Sulfato de magnesio a 8 mM;
• Sulfato de amonio a 10 mM;
• Cloruro de potasio a 10mM;
• Hidróxido de sodio para fijar el pH inicial de la mezcla de reacción;
• Tween20 al 0,1 %;
• dNTP's a 1,4 mM cada uno;
• Rojo de fenol a 50 jM .
En otra realización, el kit incluye cebadores LoopF y LoopB a 0,8 jM cada uno.
Kits
También se divulgan aquí kits que incluyen los dispositivos en cuestión y que pueden ser utilizados según los procedimientos en cuestión. Los kits en cuestión pueden incluir dos o más, por ejemplo, una pluralidad, tres o menos, cuatro o menos, cinco o menos, diez o menos, o quince o más, dispositivos modificadores de las propiedades ópticas de los ensayos de muestras biológicas o componentes de los mismos, según cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, o cualquier combinación de las mismas.
Los kits pueden incluir una o más composiciones y/o reactivos, como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, reactivos modificadores de las propiedades ópticas, composiciones de amplificación, soluciones de preparación y/o tampones, que pueden almacenarse en los kits en contenedores separados de los dispositivos. Además, los kits pueden incluir cualquier dispositivo u otro elemento que pueda facilitar el funcionamiento de cualquier aspecto de los kits. Por ejemplo, un kit puede incluir uno o más dispositivos para preparar una muestra y/o analizar una o más características de una muestra, por ejemplo, una muestra preparada. Los kits también pueden incluir un embalaje, por ejemplo, para enviar los dispositivos sin que se rompan.
En ciertas realizaciones, los kits que se divulgan en el presente documento incluyen instrucciones, como por ejemplo instrucciones de uso de los dispositivos. Las instrucciones de uso de los dispositivos están, en algunos aspectos, grabadas en un medio de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse en un sustrato, como papel o plástico, etc. Como tal, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del contenedor del kit o de los componentes del mismo (es decir, asociado al envase o subenvase, etc.). En otras realizaciones, las instrucciones están presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, por ejemplo, una unidad Flash portátil, un CD-ROM, un disquete, en la nube, etc. Las instrucciones pueden ser almacenables y/o reproducibles dentro de uno o más programas, tales como aplicaciones informáticas. Las instrucciones pueden adoptar cualquier forma, incluidas las instrucciones completas para el uso de los dispositivos o como una dirección de sitio web con la que se puede acceder a las instrucciones publicadas en la red mundial.
UTILIDAD
Como se ha demostrado anteriormente, los dispositivos y procedimientos en cuestión están dirigidos a la realización de ensayos biológicos mediante la modificación de las propiedades ópticas de las muestras biológicas o aspectos de las mismas. Los dispositivos y procedimientos en cuestión modifican suficientemente una propiedad óptica para permitir la detección de la propiedad óptica modificada por un ojo humano no asistido. Como tal, el contenido de la divulgación en cuestión elimina la necesidad de técnicas o equipos de evaluación complejos para leer o interpretar una señal generada por un ensayo biológico. Debido a que un usuario puede reconocer una propiedad óptica modificada con el ojo del usuario, la realización de un ensayo con los procedimientos en cuestión puede reducir el tiempo y los gastos en comparación con la realización de dicho ensayo utilizando otros equipos o procedimientos. Los dispositivos en cuestión también pueden ajustarse con precisión para proporcionar una conducción eficiente de la energía, por ejemplo, del calor o de la energía eléctrica, hacia una red fluídica y/o variaciones específicas en las propiedades ópticas, como el color del adhesivo. Además, los ensayos biológicos anteriores también han implicado un alto grado de complejidad en el análisis, por ejemplo, han requerido el uso de uno o más ordenadores, lo que a su vez ha proporcionado una fiabilidad y usabilidad limitadas. Por consiguiente, los procedimientos y dispositivos en cuestión son más baratos, menos complejos y/o más precisos que otros dispositivos o procedimientos de este tipo.
Además, los procedimientos anteriores de ensamblaje de dispositivos de ensayo biológico han incluido el estampado de una capa de sustrato, por ejemplo, una capa de vidrio, silicio o polímero, y luego la adhesión a una capa de sellado no estampada utilizando enlaces químicos o físicos. Una vez que el dispositivo fluídico fue ensamblado, por ejemplo, ensamblado por ser pegado y sellado, entonces se ha integrado en una carcasa o casete que proporciona la funcionalidad adicional requerida para utilizar el sistema fluídico. Sin embargo, muchas técnicas de unión de dispositivos microfluídicos han tenido el potencial de dañar cualquier reactivo frágil precargado. Al emplear la conformación del dispositivo divulgado en el presente documento, se evitan tales dificultades, ya que la capa adhesiva puede emplearse para sellar simultáneamente el sistema microfluídico e integrarse en el ensamblaje final, preservando al mismo tiempo la funcionalidad de los reactivos, como la de los reactivos precargados en las cámaras de reacción. Como tal, los procedimientos y dispositivos en cuestión simplifican el funcionamiento de dichos dispositivos, así como la fabricación de los mismos, a la vez que mejoran la eficacia en la generación de un resultado de ensayo.
EJEMPLOS
A continuación se presentan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, hay que tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.
La práctica de los diversos aspectos de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's; Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. Mack Publishing Company, 1990) Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Volúmenes A y B, 1992).
Ejemplo 1: Detección colorimétrica de un producto de reacción de amplificación de ácido nucleico
En un ensayo para la detección colorimétrica de un producto de reacción de amplificación de ácido nucleico, se mezclaron los siguientes reactivos para producir una mezcla de reactivos 2X:
• Sulfato de magnesio (Sigma Aldrich) a 16 mM
• Sulfato de amonio (Sigma Aldrich) a 20 mM
• Cloruro de potasio (Sigma Aldrich) a 20mM
• Hidróxido de sodio (Sigma Aldrich) a una concentración que fije el pH inicial de la mezcla de reactivos en 8,8 pH
La mezcla de reactivos se ajustó a un pH inicial de 8,8 para permitir una polimerización inicial eficiente. La mezcla de reactivos se esterilizó en autoclave durante 1 hora. A continuación se añadieron los siguientes ingredientes (en forma estéril) a la mezcla de reactivos para generar la mezcla de reacción:
• Tween20 (Sigma Aldrich) al 0,1 % (v/v)
• dNTPs (NEB) a 1,4 mM cada uno
• Rojo fenol (Sigma Aldrich) a 50 pM
• Bst polimerasa (NEB) a 0,8 unidades por microlitro (el tampón de almacenamiento de la enzima contribuye con un tampón Tris 1 mM, KCl 5 mM, Ed TA 0,01 mM, DTT 0,1 mM, Tritón X-1000,01 % (v/v) y glicerol 5 % (p/v) a la mezcla de reacción)
• Betaína (Sigma Aldrich) a 0,8 M
Se añadieron a la mezcla de reacción cebadores y un molde de ácido nucleico. Los cebadores se diseñaron para LAMP e incluían dos pares de cebadores (solubilizados en el tampón IX Tris EDTA) a una concentración total de 3,6 pM, como se ha descrito anteriormente. Pip F3 tiene la secuencia: GATCTGAATCCGACCAACCG (SEQ ID NO: 1) el cebador B3 tiene la secuencia: AACGCCCACGCTCTCGCA (SEQ ID NO: 2); el cebador FIP tiene la secuencia AAATCCGTCCAGTGGTTTTTTTGAAAATCGTTGTATCTCCG (SEQ ID NO: 3); y el cebador BIP tiene la secuencia CCGAAACCACTGGACGGATTTTTATTTTTAATCTAAAACAAACATC (SEQ ID NO: 4). La molécula molde de ácido nucleico se purificó a partir de Schistosoma mansoni. La FIG. 3 muestra la región objetivo SM1-7 de la molécula molde de ácido nucleico (véase Hamburger et al, Detection of Schistosoma mansoni and Schistosoma haematobium DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification: Identification of infected Snails from Early Prepatency, Am J Trop Med Hyg, 2010). Las reacciones de prueba positivas contenían ADN molde, y las reacciones de control negativas contenían agua. Las mezclas de reacción tenían un pH inicial en el intervalo de 7,5 - 8,5. Las mezclas de reacción se calentaron en microtubos a 63°C en un termociclador para permitir la amplificación del molde. Tras un periodo de reacción predeterminado de 45 minutos, durante el cual se produjo una amplificación suficiente de la plantilla, se observó visualmente el color resultante de la mezcla de reacción.
Durante el proceso de amplificación, el pH de la mezcla de reacción se redujo de 7,5-8,5 a alrededor de 6,6 de forma repetida. La FIG. 4 es un gráfico que muestra las mediciones de pH para las reacciones repetidas de amplificación positiva (prueba) y negativa (control negativo). El agente halocrómico utilizado fue el rojo de fenol, que tiene un intervalo de pH de transición de 6,8 a 8,2. El rojo de fenol cambia de color en este intervalo de pH de transición del rojo al amarillo (cuando el pH se reduce del límite superior del pH al límite inferior del pH). En el ensayo, la mezcla de reacción cambió de color de rojo (a pH 8,0) a amarillo (a pH 6,6) en respuesta al cambio de pH durante la amplificación del ácido nucleico. La FIG. 5 es un gráfico que muestra la diferencia de valor de contraste utilizando HSV (tonalidad, saturación, valor) de las imágenes de las mezclas de reacción de una reacción de amplificación positiva y negativa en los puntos finales de la reacción. El cambio de color se demuestra cuantitativamente en la variable de la tonalidad. Para confirmar que el cambio de color se debía a la amplificación del ADN diana, se analizaron las reacciones finales mediante electroforesis en gel para verificar la presencia de amplicones (FIG. 6).
Usando este procedimiento, la amplificación de un molde de ADN puede ser fácilmente observada, ya sea en el punto final de la reacción o en tiempo real a lo largo de la reacción, observando visualmente el cambio de color en la mezcla de reacción, o midiendo la absorbancia o fluorescencia de la mezcla de reacción. Este mecanismo genera un contraste mucho mayor en comparación con otras técnicas de detección colorimétrica y puede obtenerse la imagen sin necesidad de una costosa instrumentación óptica.
Ejemplo 2: Detección de la amplificación de LAMP utilizando un agente visual halocrómico
Las reacciones de LAMP se realizaron con una mezcla de reacción compuesta por 10 mM de (NH4)2SO4, 15 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 0,1 mM de DTT, 0,01 % de Tritón X-100 (v/v), 5 % de glicerol, 8 mM de MgSO4 , 1,4 mM de cada uno de los dNTPs, 0,1 % v/v de Tween-20, 0,8 M de betaína. Se añadieron tres pares de cebadores, específicos para diferentes objetivos, a una concentración final de 1,6 pM cada uno para FIP/BIP, 0,2 pM cada uno para F3 /B3, 0,4 |jM cada uno para LoopB/F. El volumen final de la reacción es de 10 |jl y se mantuvo a 63 °C durante diferentes tiempos de incubación.
En la FIG. 7, la concentración final de tampón Tris de la mezcla de reacción se varió de 0,34 mM a 19 mM (variando la cantidad de tampón Tris formulado a pH 8,8). Las reacciones se realizaron con cebadores para el ADN del fago lambda, 5 ng de ADN lambda (New England Biolabs), 0,8 U /jl de ADN polimerasa Bst 2.0 (New England Biolabs) y 0,2 mM de rojo neutro (Sigma Aldrich). A continuación, se tomaron imágenes de los tubos de reacción y se calculó el valor del tono normalizado para el color de la mezcla de reacción. El valor de Tono Normalizado se definió como la diferencia en los valores de Tono entre una reacción positiva y una negativa sin patrón. Se observó un cambio de color, indicado por un cambio en el valor del Tono Normalizado por encima del umbral de visualización (línea punteada), para concentraciones de tampón tan altas como 19mM Tris. Esto indica que la mezcla de reacción con capacidades de tampón equivalentes a >1mM y <19mM de Tris permiten un cambio de pH suficiente para la detección visual del cambio de color.
En la Fig. 8, se evaluó la tolerancia de este procedimiento de detección visual al exceso de iones de hidronio añadidos a la mezcla de reacción. Esta tolerancia es importante para permitir el uso de una amplia variedad de muestras de ADN que pueden añadir una gama de equivalentes de iones de hidronio o hidróxido a la reacción. Las reacciones se realizaron con una concentración final de tampón Tris de 2mM, 5 ng de ADN lambda objetivo, 0,8 U /jl de ADN polimerasa Bst y 0,2 mM de agente halochromico Rojo Neutral. El cambio en el valor del tono normalizado indica que esta química de detección visual funciona con 4,8 * 10-9 hasta 4,8*10'18 equivalentes de iones de hidronio adicionales por 10 uL de reacción.
En las Figs. 9A-9D, se evaluó la compatibilidad de diferentes indicadores de pH y objetivos de amplificación con la detección visual de la amplificación lAm P. Las reacciones se realizaron con una concentración final de tampón Tris en el intervalo de 1,2 -1,3 mM y 0,8 U /jl de ADN polimerasa B s t . Se probaron tres indicadores diferentes con 5 ng de ADN lambda como objetivo: 50 j M de rojo de fenol, 260 j M de rojo de cresol y 160 j M de azul de bromotimol (FIG.
9 A). Se observó un gran cambio de contraste en el valor del tono normalizado para todos los indicadores probados.
También se realizaron barridos de concentración para estos indicadores Azul de Bromotimol (FIG. 9B arriba a la izquierda), Rojo Cresol (FIG. 9B arriba a la derecha), Rojo Neutral (FIG. 9B abajo a la izquierda) y Rojo Fenol (FIG.
9B abajo a la derecha) con el objetivo Lambda, lo que demostró la amplia gama de concentraciones que son compatibles con la química. También se probaron los ensayos LAMP utilizando 130 ng de ADNg de Schistosoma mansoni con 50 j M de Rojo Fenol (FIG. 9C) y el ARNm de GAPDH humano con 0,2 mM de rojo neutro (FIG. 9D). La detección visual de estos objetivos se demostró en el punto final.
En la FIG. 10, se evaluó la compatibilidad de diferentes polimerasas con la detección visual de la amplificación LAMP. Las reacciones se realizaron con una concentración final de tampón Tris de 1,3 mM, 5 ng de ADN lambda diana y 0,2 mM de Rojo Neutral. 0.se utilizaron 8 U /jl de dos polimerasas diferentes, Bst 2.0 y Gspm 2.0 (OptiGene). Se observó un cambio de color de alto contraste para ambas polimerasas tras 60 minutos de incubación (FIG. 10).
Tabla 2: Secuencias utilizadas
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Ejemplo 3: Detección visual de la amplificación de LAMP en longitudes de trayectos submilimétricos
Las reacciones de LAMP se realizaron como en el Ejemplo 1 con una concentración final de tampón Tris de 1,3 mM (tampón formulado a pH 8,8), 0,8 U /jl de Bst 2.0 ADN Polimerasa, 5 ng de molde de ADN lambda y 0,2 mM de Rojo Neutral o 160 jM de Azul de Bromotimol. Tanto las reacciones positivas como las negativas sin molde se añadieron después de la amplificación a cámaras de flujo con profundidades de canal variables (FIG. 11A para el rojo neutro y FIG. 11B para el azul de bromotimol). Estas cámaras de flujo se mecanizaron en acrílico con profundidades de canal que van de 50 jm a 400 jm . Se observó una diferencia de color de alto contraste (por encima del umbral de detección visual; línea punteada) entre las reacciones positivas y las negativas para profundidades de canal de 50 jm y superiores. Esto demuestra que esta química de detección visual es susceptible de ser utilizada en cámaras de reacción con longitudes de recorrido (profundidades) submilimétricas y superiores. Estas cámaras de reacción pueden utilizarse para reducir la cantidad de reactivos utilizados y para permitir que se produzcan múltiples reacciones en un espacio determinado (por ejemplo, en un cartucho de microfluidos).
Ejemplo 4: Detección de la amplificación de LAMP en dispositivos que tienen un elemento de ventilación selectivo
Las reacciones de LAMP se realizaron como en el Ejemplo 1 con una concentración final de tampón Tris de 1,6 mM (tampón formulado a pH 8,8), 0,8 U /jl de Bst 2.0 ADN Polimerasa, 5 ng de molde de ADN lambda, y Rojo Fenol y Azul Bromotimol a concentraciones de 50 jM y 160 jM respectivamente. La solución se cargó en un dispositivo fluídico con cámaras de reacción que consta de una entrada de recepción de muestras y una salida de ventilación. La salida de ventilación de cada cámara de reacción se selló con un elemento de ventilación selectivo, por ejemplo, un elemento autosellante. Las cámaras alternas tenían cebadores lambda secados en ellas. Las entradas de recepción de muestras están todas conectadas a un canal de bus conectado a la entrada del dispositivo. La mezcla de reacción se calienta a 63 °C durante 1 horas. El cambio de color en las cámaras se midió con una cámara y los datos se muestran en la FIG.
16.
Ejemplo 5: Detección de la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) mediante un agente visual halocrómico
Las reacciones SDA se llevaron a cabo utilizando una mezcla de reacción compuesta por: 1.3 mM de concentración final de tampón Tris (tampón formulado a pH 8,8), 10 mM de (NH4)2SO4, 50 mM de KCl (ajustado a pH 8,5), 8 mM de MgSO4 , 4,4 mM de cada dATP, dGTP, dTTP, 08 mM de dCTP-aS (TriLink Biotechnologies), 0,1 % v/v de Tween-20, 0,8 M de betaína, 0,32 U /jl de Bst ADN polimerasa (New England Biolabs), 0,2U/uL de BSoBI (New England Biolabs) y 0,2 mM de agente halochromico Rojo Neutral. Cebadores diseñados para el BRCA1 humano (SDAf: La SEQ ID NO: 17; SDAr: La SEQ ID NO: 18; BF: La SEQ ID NO: 19; BR: La SEQ ID NO: 20) se añadieron a la reacción a una concentración final de 0,5 jM cada una. se añadieron 5 ng de ADNg de HeLa a un volumen de reacción final de 25 j l y se mantuvo a 65 °C durante diferentes tiempos de incubación. Un cambio en el valor del Tono Normalizado a lo largo del tiempo (FIG. 12) indica que esta química de detección visual funciona con SDA.
Ejemplo 6: Detección de la amplificación de PCR utilizando un agente visual halocrómico
Las reacciones de PCR se realizaron utilizando una mezcla de reacción compuesta por: 50 mM de KCl y 2 mM de MgCl2 (pH ajustado a 8,5), 0,5 mM de cada dNTP, 5U de Taq ADN polimerasa (New England Biolabs) y 0,2 mM de agente halochromico Rojo Neutral. Concentración total de Tris-HCl arrastrada del tampón de almacenamiento de la enzima y de los cebadores (Forward: La SEQ ID NO: 21; Reverso: La SEQ ID NO: 22) era de 1,15 mM en la mezcla de reacción final. Se diseñaron cebadores para el gen 16s rRNA de Escherichia coli y se añadieron a la reacción a una concentración final de 0,5 jM cada uno. se añadieron 10 ng de ADNg de E.coli a un volumen de reacción final de 25 j l y se mantuvo inicialmente a 95 °C durante 2 minutos, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 30 segundos. Se observó un cambio en el valor del tono normalizado con el tiempo (FIG. 13) indica que esta química de detección visual funciona con la PCR.
Ejemplo 7: Aumento del contraste de detección visual con la combinación de agentes halocrómicos
Las reacciones de LAMP se realizaron como en el Ejemplo 1 con una concentración final de tampón Tris de 1,3 mM (tampón formulado a pH 8,8), 0,8 U /jl de Bst 2.0 ADN Polimerasa y 5 ng de plantilla de ADN lambda. El contraste de cambio de color se evaluó para el rojo de fenol a una concentración de 50 jM y la combinación de rojo de fenol y azul de bromotimol a concentraciones de 50 jM y 160 jM respectivamente (FlG. 14 A). También se evaluó el contraste de cambio de color para el rojo de cresol a una concentración de 260 jM y la combinación de rojo de cresol y azul de bromotimol a concentraciones de 260 jM y 160 jM respectivamente (FIG. 14B). Los valores de contraste se calcularon a partir de los valores RGB de las imágenes de la mezcla de reacción mediante la fórmula: 0.299R 0,587G 0,114B. El cambio de contraste normalizado se definió como la diferencia entre los valores de contraste de reacción positiva y negativa normalizados con respecto al fondo. El aumento del cambio de contraste normalizado con el uso de la combinación de agentes halocrómicos demuestra la utilidad de tales combinaciones.
Ejemplo 8: Monitorización en color de la amplificación en tiempo real para la cuantificación mediante agentes visuales halo-crómicos
Las reacciones de LAMP se realizaron como en el Ejemplo 1 con una concentración final de tampón Tris de 1,3 mM (tampón formulado a pH 8,8), 0,8 U /jl de Bst 2.0 ADN Polimerasa, Rojo de Fenol y Azul de Bromotimol a concentraciones de 50 jM y 160 jM respectivamente y variando las concentraciones de molde de ADN lambda. Se evaluó el contraste de cambio de color para el objetivo de ADN lambda a concentraciones finales de 0,5 fg /jl, 0,05 pg/jl y 0,5 pg/jl. Los valores de contraste se calcularon a partir de los valores RGB de las imágenes de la mezcla de reacción como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados (FIG. 15) indican que las concentraciones de ADN más altas provocaron un cambio detectable en el contraste visual antes que las concentraciones de ADN más bajas. Por lo tanto, se demostró la capacidad de distinguir entre diferentes concentraciones del objetivo con la monitorización del color en tiempo real de esta química.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo modificador de las propiedades ópticas (100) para ensayos de muestras biológicas, comprendiendo el dispositivo (100):
a. Un cartucho receptor de muestras (101) que comprende cámaras de reacción (102), en las que cada cámara de reacción (102) comprende un reactivo modificador de las propiedades ópticas (201);
b. - un sustrato (103) que comprende:
i. un elemento calefactor (104); y
ii. una fuente de energía (105) acoplada operativamente al elemento calefactor (104); y
c. una capa adhesiva (106) que conecta operativamente el cartucho receptor de muestras (101) y el sustrato (103), formando así una pared de cada una de las cámaras de reacción (102);
en el que el cartucho receptor de muestras comprende una entrada de muestra (110) que conecta operativamente cada una de las cámaras de reacción (102), en el que el cartucho receptor de muestras (101) comprende uno o más conductos que conectan operativamente las cámaras de reacción (102) con la entrada de muestra (110), y caracterizado porque el dispositivo comprende además una carcasa, comprendiendo la carcasa
una primera porción (108) y
una segunda porción (109) acoplada a la primera porción (108),
donde la carcasa encapsula el cartucho receptor de muestras (101), el sustrato (103) y la capa adhesiva (106); y donde la carcasa comprende además una o más aberturas de entrada que proporcionan acceso a la entrada de muestra (110) para cargar una muestra en el cartucho receptor de muestras,
opcionalmente, donde cada una de las cámaras de reacción son cámaras de reacción microfluídicas.
2. El dispositivo (100) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada una de las cámaras de reacción (102) comprende una primera abertura en un primer lado del cartucho receptor de muestras (101) y una segunda abertura en un segundo lado del cartucho receptor de muestras (101), en el que el primer lado es opuesto al segundo lado y la capa adhesiva forma una pared de cada una de las cámaras de reacción sellando cada segunda abertura, y que además comprende un elemento de ventilación selectivo (107) que sella cada primera abertura, donde el elemento de ventilación selectivo es poroso y está configurado para pasar, al entrar en contacto con un líquido, de una primera conformación, en la que uno o más gases pueden pasar a través de él, a una segunda conformación que reduce la permeabilidad del fluido a través de él, donde la primera conformación permite el flujo desde la entrada de la muestra (110) hacia las cámaras de reacción (102), opcionalmente donde la reducción de la permeabilidad es suficiente para hacer que uno o más elementos de ventilación selectivo sean impermeables al fluido.
3. El dispositivo (100) de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el cartucho receptor de muestras (101) es transparente, y opcionalmente comprende un material polimérico como el polietileno.
4. El dispositivo (100) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la capa adhesiva (106) es transparente, o reflectante u opaca y blanca, y opcionalmente en el que la capa adhesiva (106) comprende un adhesivo acrílico, y opcionalmente en el que la capa adhesiva (106) tiene una conductividad térmica de 0,1 W/m-K a 10 W/m-K.
5. El dispositivo (100) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que cada una de las cámaras de reacción (102) comprende una composición de amplificación de ácidos nucleicos.
6. El dispositivo (100) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la capa adhesiva (106) comprende una primera capa laminada con una segunda capa, opcionalmente en la que la segunda capa es opaca y blanca.
7. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además uno o más sensores acoplados operativamente al sustrato y al elemento calefactor, de manera que cuando la muestra entra en la cámara de reacción, el sensor detecta el líquido y el elemento calefactor puede comenzar a calentar la cámara de reacción.
8. Un procedimiento de modificación de una propiedad óptica con el dispositivo modificador de propiedades ópticas para ensayos de muestras biológicas (100) de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo el procedimiento:
a. generar un producto de reacción a partir de una muestra biológica;
b. hacer reaccionar el producto de reacción con el reactivo modificador de la propiedad óptica (201), en el que la reacción modifica suficientemente una propiedad óptica del contenido de las cámaras de reacción (102) para permitir la detección de la propiedad óptica modificada.
9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la generación de un producto de reacción a partir de una muestra biológica comprende:
transmitir una muestra biológica a una o más de las cámaras de reacción (102), generando así una mezcla de reacción; y
calentar la mezcla de reacción con el sustrato (103) del dispositivo (100), generando así un producto de reacción.
10. El procedimiento según el punto 9, en el que la transmisión de una muestra biológica a una o más de las cámaras de reacción comprende el acoplamiento operativo del dispositivo modificador de propiedades ópticas del ensayo de muestras biológicas con un dispositivo de preparación de muestras y el flujo de la muestra biológica desde el dispositivo de preparación de muestras a la entrada de muestras del dispositivo modificador de propiedades ópticas del ensayo de muestras biológicas.
11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende además realizar un análisis colorimétrico del contenido de las cámaras de reacción (102) después de hacer reaccionar el producto de reacción con el reactivo modificador de las propiedades ópticas (201).
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la capa adhesiva (106) es de color blanco opaco, y en el que realizar el análisis colorimétrico comprende inspeccionar visualmente las cámaras de reacción (102) para detectar una propiedad óptica modificada.
13. Un procedimiento de fabricación del dispositivo modificador de propiedades ópticas (100) de ensayo de muestras biológicas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo el procedimiento:
a. acoplar operativamente el cartucho receptor de muestras (101) y el sustrato (103) con la capa adhesiva (106).
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el procedimiento comprende además insertar el reactivo modificador de propiedades ópticas (201) en cada una de las cámaras de reacción (102) y almacenar el reactivo modificador de propiedades ópticas (201) en las mismas mientras se mantiene la funcionalidad del reactivo modificador de propiedades ópticas (201).
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