JP6807232B2 - 試料調製デバイスおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、これによりすべての目的に対してその全体を本願に引用して援用する、2014年5月30日に出願された米国仮特許出願第62/005,662号の優先権の利益を主張する。
腎臓組織試料を分析用調製のために試料容器に置いた。約3〜6mgの腎臓組織試料をそれぞれ8個の試料容器に置いた。試料容器を、水を満たしたチャンバーに入れ、20,000psi、10サイクルで加圧した。各サイクルは、20,000psiで20秒間と、その後に続く大気圧での10秒間を含む。組織の破砕の程度を視覚的に評価した。図8bに示すように、破砕されていない組織片は黒くチューブの底に残っている。破砕された組織の破砕物は薄い色で現れ、チューブの壁に沿って分布する。
テーパー付きの挿入体で種々の直径のものを肝臓組織試料の均一化のために使用した。分析用調製のために、肝臓組織試料を内径が0.125インチの試料容器に置いた。約0.5から約1.5mgの肝臓組織試料をそれぞれ80個の試料容器に置いた。試料容器を、水を満たしたチャンバーに入れ、35,000psi、60サイクルで加圧した。各サイクルは、35,000psiで20秒間と、その後に続く大気圧での10秒間を含む。組織破砕の程度を視覚的に評価し、抽出されたタンパク質の収率をブラッドフォード法で測定し、組織の重量(mg)あたりのタンパク質(μg)で表現した。図9は、先端直径(およびそれにより環状ギャップの寸法)の効果、組織破砕の効果および組織被験物からのタンパク質抽出効率を示す。テーパー付きの挿入体で異なる直径のものを使用するとき、過剰に緊密に適合させることは、結果として効果的な組織破砕にならないことが実証されており、恐らく組織がチューブの底に堅固に圧縮されてしまい、組織がチューブの側面に沿って挿入体先端を通り過ぎて押し出されるための十分な隙間が取れなかった結果による。図9に見られるように、挿入体直径が0.118〜0.122インチでは、挿入体直径が0.114〜0.118インチよりも高いタンパク質収率で製造された。挿入体直径が0.114〜0.118インチでは、挿入体直径が0.110〜0.114インチ(この場合は挿入体直径が0.122〜0.126インチよりも高いタンパク質収率で製造されている)よりも高いタンパク質収率で製造された。
約0.6〜1.7mgのラットの肝臓に約30μlのIEF抽出試薬(脱イオン水中に、7Mの尿素、2Mのチオ尿素および4%のCHAPS)を加えた試料を各チューブに添加した。圧力サイクル破砕を35,000psiで示されたサイクル数で実施した。陰性対照は、抽出試薬に浸漬された、破砕されていない組織片であった。
2mg未満のラット肝臓に30μLのIEF抽出試薬を加えた試料を各チューブに添加した。圧力サイクル破砕を35,000psiで、示された圧力として示されたサイクル数で、テーパー付きの挿入体を用いて実施した。陰性対照は、試験試料と同様に扱われたが、圧力サイクルにはかけなかった。
解凍したラットの肝臓および心筋組織の試料をPBSでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った(群あたりn=6)。約30μLの溶解バッファーを各試料に添加した。図12aに見られるように、テーパー付きの挿入体を使用して、試料毎に試料の質量を≦2mgに減少させると、より大きな試料(試料あたり5〜10mg)と比較して、結果としてより良好な収率となった(組織の質量(mg)あたりのタンパク質(μg)として測定した)。図12bに見られるように、比較できる質量および体積の条件を使用したとき、テーパー付きの挿入体(図中で「Micro Pestle(微小ペッスル)」とラベル付けしたもの)を、圧力をかけて使用して、肝臓組織から得られたタンパク質収率は、陽性対照を使用する収率と同等である。陽性対照は、使い捨てのプラスチックペッスルを使用して手動で均一化した。陰性「浸漬」対照は、どのような方法においても破砕せず、その組織を溶解バッファー中でその他の試料と同一の全時間インキュベートした。挿入体は、圧力サイクルと併せて使用した。
通常の手順(40,000psiで60サイクル)、または超音波処理のみで(超音波浴で2回×30秒)、または組合せ(40,000psiで30サイクルの後、超音波処理を30秒の後、40,000psiで30サイクルの後、超音波処理を30秒)を使用して、IFE中で肝臓組織を抽出した。すべての試料は<2mgの組織を含み、30μLの溶解バッファーに入れた。群あたり6個の試料であった。
図13に見られるように、通常の微小ペッスルによる手順は、超音波処理単独よりも高収率であった2種の方法の組合せよりも、高収率であった。
ラットの肝臓組織を用いた1−6−14に関して、挿入体の2つのバッチを使用した。多数回使われてきたより古いバッチである1つは、約0.120インチから約0.123インチの先端直径を有するペッスルを備えた。約0.127インチのやや広いペッスル直径を有する新規のバッチは、結果として全体的な収率が低かった。それらはその後洗浄され、一試行あたり60サイクルを14回の、全部で840サイクル再試行された。挿入体をチューブから取り除き、試行毎に再挿入した。これら同一の20個の「新」挿入体を、続いて肝臓組織で再度、1−10−14で使用した。
約0.5から約1.5mgの間のラットの肝臓組織の試料をPBSでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った(群あたりn=12)。すべての試料(陰性対照を除く)を圧力45,000psiで60サイクルの処理をした。サイクルの長さは、溶解バッファー中ですべてのインキュベーション時間を修正するために調製した。0.5時間の試料用には、30秒毎のサイクルを使用した。1時間の試料用には、1分毎のサイクルを使用した。図15に見られるように、挿入体無しでは、組織試料が圧力にかけられるか否かにかかわらず収率は同一であり、圧力サイクル単独では、体積(30μL対60μL)またはインキュベーション時間(0.5対1時間)などのその他の要因に関係なく、細胞タンパク質を放出するための組織構造の破砕が効果的でないことを示唆している。収率は、テーパー付きの挿入体と共に加圧した試料でのみ、著しく向上する。
0.5から1.5mgの間の組織の試料をPBSでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った(別段の指示がない限り、群あたりn=10)。30μLの溶解バッファーを各試料に添加した。挿入体は、圧力サイクルが有りおよび無しで使用した。示された圧力で30サイクルの圧力サイクルを実施した。棒は、肝臓組織からのタンパク質抽出の平均±標準偏差を示す。表は、心筋組織からのタンパク質抽出の収率および平均値の標準誤差(SEM)を示す。0kpsiの対照は、挿入体は配置するが、圧力サイクルはかけない設定をすることを意味する。これは、「浸漬のみ」の対照と同一ではない。図16に見られるように、45kpsiの圧力のものが最大量のタンパク質をもたらした。
図17に示すように、テーパー付きの挿入体801は、圧力下で試料チューブ805と共に使用できるいくつかの互換的な密封器802、803、804のうちの1つである。そのため、以下のような手順は、試料を1つの容器から他の容器に移転すること無しに実行でき、試料の損失、相互汚染および使用者への曝露の危険性を低減する。
1. 4Mの尿素を含む30μLの溶解バッファーと共に組織を試料チューブに入れ、テーパー付きの挿入体で密封する。
2. 挿入体の入った密封チューブを、barocycler内での圧力処理(図18)の間に、チューブ902を保持するように設計されたカートリッジ901に入れる。カートリッジは、チューブを安全に保ち、キャップのゆるみ(試料の漏れ出し、または加圧媒体の漏れ込みをもたらす)を防ぐように設計されている。
3. 圧力サイクルで試料を処理する。
4. barocyclerおよびカセットからチューブを取り出す。テーパー付きの挿入体を取り除く。
5. チューブ内の均一化された試料に10μlの適切なバッファーを添加して、溶解バッファー中の尿素を4Mから3Mに希釈する。タンパク質分解酵素のLys−Cなどの適切な酵素を添加する。
6. チューブをキャップ(過剰な空気を排除して圧力下でのチューブのへこみを防ぐのに十分な長さであるが、試料容積を収容するのに十分な短さである)で密封し、密封されたチューブを、圧力処理の間チューブを保持するように設計されたカートリッジに入れる。
7. 試料を、Lys−Cによる消化を加速するために適当な条件の下で、圧力サイクルで処理する。
8. barocyclerおよびカセットからチューブを取り出す。長いキャップを取り出す。
9. チューブ内の部分的に消化された試料に100μlの適切なバッファーを添加して、バッファー中の尿素を3Mから0.8Mに希釈する。トリプシンなどの適切な酵素を添加する。
10. 全試料容積を収容できる短いキャップで、満たしたチューブを密封する。密封チューブを、圧力処理の間にチューブを保持するように設計されたカートリッジに入れる。
11. 試料をトリプシンによる消化を加速するために、適当な条件の下で圧力サイクル処理する。
本明細書で考察したデバイス、システムおよび方法の実施形態は、構成の詳細な適用において、および続く説明または添付図面で例示して明らかにした構成部品の配置において、限定されないことが理解されよう。デバイス、システムおよび方法は、他の実施形態でも実施でき、様々な方法で実行または履行され得る。特定の実施態様の実施例は、例示的な目的のみで本明細書に提供されており、限定されることを意図していない。特に、任意の1つ以上の実施形態に関連して考察した行為、要素および特徴は、任意のその他の実施形態での同様の役割から排除されることを意図していない。
Claims (15)
- 内表面、上部、および底部を有するチューブ(101,401)であって、前記底部に試料(105,402,507)を収容し、試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたチューブと、
前記チューブ(101,401)の前記上部に着脱可能に連結されたキャップと、
前記キャップから前記チューブ(101,401)内に前記チューブの長さに沿って延びるテーパー付きの硬い細長い部材(102,302,414,505,705)であって、前記チューブの前記内表面および前記チューブの前記底部の中の前記試料(105,402,507)に接触するように構成されたテーパー付き硬い細長い部材と、
を備える試料調製デバイスであって、
前記チューブ(101,401)は、圧力下の操作で前記チューブが前記テーパー付きの細長い部材(102,302,414,505,705)に対して変形して、前記試料(105,402,507)の破砕を促進するように変形可能であることを特徴とする試料調製デバイス。 - 請求項1に記載のデバイスであって、前記試料(105,402,507)が細針生検試料であることを特徴とするデバイス。
- 請求項1に記載のデバイスであって、前記試料(105,402,507)の大きさが約30mg未満であることを特徴とするデバイス。
- 請求項1に記載のデバイスであって、前記チューブ(101,401)および前記テーパー付きの細長い部材(102,302,414,505,705)のうちの少なくとも1つがポリテトラフルオロエチレン(PTFE)またはフッ化エチレンプロピレン(FEP)から作製されていることを特徴とするデバイス。
- 請求項1に記載のデバイスであって、前記チューブ(101,401)および前記テーパー付きの細長い部材(102,302,414,505,705)のうちの少なくとも1つが単回使用向けの消耗品であることを特徴とするデバイス。
- 請求項1に記載のデバイスであって、前記テーパー付きの細長い部材が前記キャップと一体であることを特徴とするデバイス。
- 各ウェルが内壁および底部を備えるウェルのアレーを有するマルチウェルプレートであって、各ウェルの前記底部に試料(105,402,507)を収容し、試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたマルチウェルプレートと、
前記マルチウェルプレートと対をなして各ウェル用のキャップを形成するように構成されたマットと、
前記マットから前記ウェルのアレー内に延びる複数のテーパー付きの硬い細長い部材であって、各テーパー付きの細長い部材が、前記ウェルの長さに沿った内表面および前記ウェルの前記底部の中の前記試料(105,402,507)に接触するように構成された細長い部材と、
を備える試料調製キットであって、
前記マルチウェルプレートは、圧力下の操作で前記ウェルが前記テーパー付きの細長い部材に対して変形して、前記試料(105,402,507)の破砕を促進するように変形可能であることを特徴とする試料調製キット。 - 請求項7に記載のキットであって、前記試料(105,402,507)が細針生検試料であることを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットであって、前記マルチウェルプレートの各ウェルに導入するための試薬または酵素の供給源をさらに含むことを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットであって、前記マルチウェルプレートおよび前記テーパー付きの細長い部材のうちの少なくとも1つがポリテトラフルオロエチレン(PTFE)またはフッ化エチレンプロピレン(FEP)から作製されていることを特徴とするキット。
- 内壁、上部および底部を有するチューブ(101,401)に試料(105,402,507)を導入するステップであって、前記チューブは試料調製のために圧力サイクル技術システム内に受容されるように構成されているステップと、
前記チューブ(101,401)にキャップを着脱可能に連結するステップであって、前記キャップは前記チューブの長さに沿って前記チューブ内に延びるテーパー付きの硬い細長い部材(102,302,414,505,705)を備え、前記テーパー付きの細長い部材は前記チューブの内表面に接触し前記チューブの前記底部の中の前記試料(105,402,507)を捕捉するように構成されているステップと、
前記チューブの前記内壁および前記底部が前記テーパー付きの細長い部材(102,302,414,505,705)に対して交互に圧縮および減圧して前記試料(105,402,507)の破砕を促進するように、前記チューブ(101,401)を昇圧した静水圧P1からより低い圧力P2への圧力サイクル変化にかけるステップと、
圧力サイクルに続いて前記試料(105,402,507)から成分を単離するステップと、
単離された試料成分を下流の分離および/または分析装置に導入するステップと、
を含むことを特徴とする試料調製方法。 - 請求項11に記載の方法であって、前記単離された試料成分が質量分析装置によって分析されることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記圧力サイクルの範囲が137.90MPa(20,000psi)から689.48MPa(100,000psi)であることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法であって、圧力サイクルに先立ち前記チューブ(101,401)に試薬および/または酵素を導入するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記試料(105,402,507)が細針生検試料であることを特徴とする方法。
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