KR20200033938A - 효소 조성물을 이용한 크레아티닌의 검출 조성물 및 그 방법 - Google Patents
효소 조성물을 이용한 크레아티닌의 검출 조성물 및 그 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200033938A KR20200033938A KR1020207005782A KR20207005782A KR20200033938A KR 20200033938 A KR20200033938 A KR 20200033938A KR 1020207005782 A KR1020207005782 A KR 1020207005782A KR 20207005782 A KR20207005782 A KR 20207005782A KR 20200033938 A KR20200033938 A KR 20200033938A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- creatinine
- optionally
- composition
- less
- creatinase
- Prior art date
Links
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 662
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 title claims abstract description 332
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 257
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 144
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 146
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 146
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 47
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 28
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108010077078 Creatinase Proteins 0.000 claims description 126
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 122
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 100
- 108010060059 Sarcosine Oxidase Proteins 0.000 claims description 97
- 102000008118 Sarcosine oxidase Human genes 0.000 claims description 97
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 80
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 79
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 49
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 49
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 40
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims description 40
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims description 40
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 40
- 238000001690 micro-dialysis Methods 0.000 claims description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 36
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 24
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 claims description 24
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 22
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 22
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 19
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 16
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 15
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 claims description 12
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 10
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 8
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 8
- GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical group O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]butane-1-sulfonic acid Chemical compound OCCN1CCN(CCCCS(O)(=O)=O)CC1 LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 claims description 6
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 claims description 6
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 6
- 108010053950 Teicoplanin Proteins 0.000 claims description 6
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 6
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N chembl2367892 Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(O)C=C(C=4)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CC=4C=C(Cl)C(O5)=CC=4)C(=O)N3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)NC(C)=O)C5=CC2=C1 DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N 0.000 claims description 6
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 229960002069 diamorphine Drugs 0.000 claims description 6
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000014 opioid analgesic Substances 0.000 claims description 6
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 claims description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229960001608 teicoplanin Drugs 0.000 claims description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical group OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VTOWJTPBPWTSMK-UHFFFAOYSA-N 4-morpholin-4-ylbutane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCCN1CCOCC1 VTOWJTPBPWTSMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 claims description 5
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 5
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims description 5
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims description 3
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 3
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 167
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 41
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 33
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 33
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 30
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 14
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 14
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 Zn 2+ Chemical class 0.000 description 7
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 7
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 6
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 231100000857 poor renal function Toxicity 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 6
- 108010066906 Creatininase Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000004750 isotope dilution mass spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 5
- WZCQRUWWHSTZEM-UHFFFAOYSA-N 1,3-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC(N)=C1 WZCQRUWWHSTZEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000860832 Yoda Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000007375 Jaffe assay Methods 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 3
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#CNC(=N/C)\NCCSCC1=NC=N[C]1C CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001380 cimetidine Drugs 0.000 description 3
- 238000013481 data capture Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 3
- 229940018564 m-phenylenediamine Drugs 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 3
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 3
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- 230000010248 tubular secretion Effects 0.000 description 3
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- BYHQTRFJOGIQAO-GOSISDBHSA-N 3-(4-bromophenyl)-8-[(2R)-2-hydroxypropyl]-1-[(3-methoxyphenyl)methyl]-1,3,8-triazaspiro[4.5]decan-2-one Chemical compound C[C@H](CN1CCC2(CC1)CN(C(=O)N2CC3=CC(=CC=C3)OC)C4=CC=C(C=C4)Br)O BYHQTRFJOGIQAO-GOSISDBHSA-N 0.000 description 2
- YGYGASJNJTYNOL-CQSZACIVSA-N 3-[(4r)-2,2-dimethyl-1,1-dioxothian-4-yl]-5-(4-fluorophenyl)-1h-indole-7-carboxamide Chemical compound C1CS(=O)(=O)C(C)(C)C[C@@H]1C1=CNC2=C(C(N)=O)C=C(C=3C=CC(F)=CC=3)C=C12 YGYGASJNJTYNOL-CQSZACIVSA-N 0.000 description 2
- WNEODWDFDXWOLU-QHCPKHFHSA-N 3-[3-(hydroxymethyl)-4-[1-methyl-5-[[5-[(2s)-2-methyl-4-(oxetan-3-yl)piperazin-1-yl]pyridin-2-yl]amino]-6-oxopyridin-3-yl]pyridin-2-yl]-7,7-dimethyl-1,2,6,8-tetrahydrocyclopenta[3,4]pyrrolo[3,5-b]pyrazin-4-one Chemical compound C([C@@H](N(CC1)C=2C=NC(NC=3C(N(C)C=C(C=3)C=3C(=C(N4C(C5=CC=6CC(C)(C)CC=6N5CC4)=O)N=CC=3)CO)=O)=CC=2)C)N1C1COC1 WNEODWDFDXWOLU-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 2
- CYJRNFFLTBEQSQ-UHFFFAOYSA-N 8-(3-methyl-1-benzothiophen-5-yl)-N-(4-methylsulfonylpyridin-3-yl)quinoxalin-6-amine Chemical compound CS(=O)(=O)C1=C(C=NC=C1)NC=1C=C2N=CC=NC2=C(C=1)C=1C=CC2=C(C(=CS2)C)C=1 CYJRNFFLTBEQSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylglycine Chemical compound CN(C)CC(O)=O FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000557 Nafion® Polymers 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000011094 buffer selection Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBPAYPRLUDCSEY-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)acetamide Chemical compound NC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YBPAYPRLUDCSEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZDXSXLYLMHYJA-UHFFFAOYSA-M 4-[(1,3-dimethylimidazol-1-ium-2-yl)diazenyl]-n,n-dimethylaniline;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=[N+](C)C=CN1C NZDXSXLYLMHYJA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NTDFJPCHHGBHCO-UHFFFAOYSA-N 7,9-dihydro-3H-purine-2,6,8-trione Chemical compound OC1=NC(O)=C2NC(O)=NC2=N1.N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 NTDFJPCHHGBHCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108030003307 Creatinine deaminases Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000001019 Inborn Errors Metabolism Diseases 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000000386 athletic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037147 athletic performance Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008081 blood perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 description 1
- 230000035601 cold sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 230000006012 detection of carbon dioxide Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 108700003601 dimethylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000000004 hemodialysis solution Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002048 multi walled nanotube Substances 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 229940078490 n,n-dimethylglycine Drugs 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 210000002796 renal vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000006016 thyroid dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/98—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
본 발명은 특정 용액에서 크레아티닌 수준의 민감한 측정을 가능하게 하는 조성물 및 시스템을 제공한다. 크레아티닌을 검출하기 위한 효소적 방법의 최적화를 통해 크레아티닌 수준 및 크레아티닌 제거율을 실시간으로 측정하는 방법을 제공하며, 그렇게 함으로써 신장 기능을 실시간으로 모니터링 할 수 있도록 한다. 이는 살아있는 대상의 모니터링 및 이식을 위한 신장과 같은 분리된 기관의 모니터링에서 모두 유용한 것으로 여겨진다.
Description
발명의 분야
본 발명은 특정 용액에서 크레아티닌 수준(level)의 민감한 측정을 가능하게 하는 조성물 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 조성물과 시스템을 이용하여 크레아티닌 수준 및 크레아티닌 제거율(creatinine clearance rates)을 실시간으로 측정하는 방법을 제공하며, 그렇게 함으로써 신장 기능을 실시간으로 모니터링 할 수 있도록 한다.
신장에는 네프론 및 사구체와 같은 많은 다른 성분들이 있지만, 이들의 기능은 개별적으로 손상될 수 있어, 특정 대상(a subject)의 신장 기능을 측정하는 현재의 방법은 신장의 전반적인 성능을 평가하는 것이지만, 신장의 어떤 부분이 영향을 받는지를 측정하는 것은 현재까지 불가능하다. 이러한 신장 기능의 전반적인 측정을 사구체 여과율(GFR: glomerular filtration rate)이라고 하며, 이는 혈액에서 크레아티닌과 같은 물질(불순물)을 제거하는 신장의 능력을 평가한다. 이는 임상 환경에서 일상적으로 사용되는 방법이다.
GFR은 종종 1.73m2의 체표면적에 대해 정규화된 ml/분(minute)의 값으로 보고된다. 정상적인 성인 GFR은 90ml/min/1.73m2 내지 130ml/min/1.73m2 사이에 있다. GFR의 저하는 환자의 만성 신장 질환의 단계를 평가하는 임상적 수단으로, 15ml/min 이하의 GFR인 경우 말기 신부전(end stage renal failure)이라고 한다.
크레아티닌 제거율을 기초로 GFR을 계산하는 데 사용되는 방정식은 다음과 같다:
소량의 크레아티닌은 또한 원위세관으로부터 분비되지만, 분비되는 양은 신장 기능이 저하되는 경우에도 일정하게 유지된다.
크레아티닌은 신장에 의한 지속적인 여과로 인해, 인간의 혈액에 마이크로몰(micromolar) 농도로 존재한다. 정상 상태 시스템에서, 신체의 골격근은 일정한 양의 크레아티닌을 혈류로 방출하고, 신장은 여과와 활성 요세관 분비의 조합을 통해 순환에 의해 이를 제거한다. 이 활성 요세관 분비는 더 낮은 기능적 극치에서 더 큰 분율의 크레아티닌 제거율을 구성하고, 사구체 여과율(GFR)의 과대평가를 초래한다.
임상실에서의 크레아티닌 측정
임상 샘플에서 크레아티닌 농도를 측정하기 위해 현재 세 가지 주요 기술이 사용된다: (i) 자페 반응(Jaffe reaction), (ii) 효소 방법 및 (iii) 동위원소 희석 질량 분석법(IDMS). 위 세 번째 방법은 현재 비교되는 다른 모든 방법들에 대응하는 방법이다.
IDMS
IDMS는 최신 임상 생화학에서 목적 분석물을 정량화하는 가장 정확한 방법으로 고려된다. 원리는 간단하며, 태그-앤-릴리즈(tag-and-release) 방법으로 야생 동물을 추정하는 것과 유사하다. 양은 알려지지 않고 동위원소 조성이 알려진 샘플로 시작하여, 그 샘플을 양과 동위원소 조성이 알려진 표준물질로 희석함으로써, 문제의 동위원소의 최종 희석비를 측정함으로써 최초 샘플의 농도를 결정할 수 있다. 이 방법은 고정밀(high precision)의 내부 비율측정 정규화(internal ratiometric normalisation)와 최신 질량 분석법의 낮은 검출 한계를 결합하여, 낮은 편차로 매우 정확하고 재현가능한 결과를 제공한다.
유감스럽게도, 이 분석을 수행하는데 필요한 GC-MS 장치의 방법론 및 그 규모와 비용은 연속적인 인라인(in-line) 크레아티닌 분석에 통합하기 위한 소형화에 적합하지 않다.
자페 반응(Jaffe Reaction)
크레아티닌을 검출하는 이 방법은 신장 기능의 중요한 지표로 인식된다. 피크르산(picric acid)과 비뇨기 크레아티닌(urinary creatinine)의 반응 생성물의 알칼리화에 따른 유색 화합물의 생산에 대한 최초의 공식적인 설명은 1886년 Max Jaffe(1841~1911)에 의해 공개되었으며, 그를 위하여 이 검출 방법의 이름이 명명되었다. 샘플에서의 색상 변화의 강도, 및 크레아티닌의 양은 520nm에서 최대 흡광도를 갖는 비색법 또는 분광광도법으로 신속하게 평가될 수 있다.
유감스럽게도, 이 방법에는 단점이 없지는 않으며, 적어도 실험실 간 표준화의 중요한 결여는 아니고, 이는 IDMS 표준의 개발로 이어지는 실험에 의해 입증된다[35]. 자페 반응은 또한 매우 비특이적이어서, 미량의 단백질, 포도당, 케톤체, 빌리루빈(bilirubin) 및 특정 아미노글리코시드(aminoglycoside) 및 세팔로스포린(cefalosporin) 항생제를 포함하여, 인간 샘플에서 흔히 발견되는 수많은 내인성 및 외인성 화합물로 허위 양성 또는 음성을 생성할 수 있다.
이들에 대해 교정을 시도하면 실제로 정상 기능과 비정상 기능 사이의 경계선 값에 더 큰 불확실성이 생길 수 있으며, 내인성 간섭물질이 발견되지 않는 소변의 크레아티닌 농도를 역설적으로 과소평가할 수 있다[37]. 작은 오차조차의 영향을 나타내는 예시로서, 혈청 크레아티닌 농도의 절대 값에서 단지 20μmol의 증가도 정상 기능과 조기 신부전의 차이를 의미할 수 있다.
이러한 이유로, 자페 방법은 선진국에서 효소 검출로 점차 대체되고 있다.
3-효소 시스템
이 방법은, 크레아티닌이 1:1:1 몰비의 과산화수소, 포름알데히드 및 글리신으로의 보다 복잡한 3단계 크레아티닌 소화에 의존하는데, 이때 중간체로서 크레아틴 및 사르코신이 생성되고, 중간 부산물로서 요소(urea)가 생성된다.
이 시스템은 두 가지 잠재적 비광학적 검출 대상인 요소와 H2O2를 초래한다.
요소 검출
요소 검출은 NH3 및 CO2의 생성을 촉매하는 우레아제(urease)에 대한 추가의 커플링 반응을 필요로 한다. NH3의 검출은 어려움으로 인해 복잡하지만, 일반적인 세베링하우스(Severinghaus) 전극 또는 보다 실험적으로 도핑된 나노물질로 CO2 생성은 정량화할 수 있다[51].
세베링하우스 전극은 알려진 pH의 NaHCO3의 용액 내에 매입되고, 가스-투과성 막에 의해 샘플 용액으로부터 분리된 유리 pH 전극의 특정한 내부 구성을 필요로 한다. CO2가 막을 통과할 때, NaHCO3 용액에 용해되어 H+ 이온을 방출한다. 그런 다음 내부 pH 전극에서 전위차적으로 감지된다.
원리가 잘 이해되고, 센서가 인간 혈액 pCO2의 정상 범위에 걸쳐 선형 방식으로 작동하지만, 이 삼중-벽, 액체-함유 센서는 소형화하기가 매우 어렵고, 응답 시간이 매우 느린, 미세기계화된 세베링하우스-유형 전극의 문헌에 대해서는 소수의 보고서만 있다.
또한, 크레아티닌의 완전한 소화로부터 발생된 CO2의 양은 기껏해야 밀리몰 이하(sub-millimolar) 범위에 있을 것이다. 이는 임의의 CO2 센서 시스템이, 샘플이 혈액 또는 소변에서 추출되는지 여부에 관계없이, 정상적인 신진대사(4.5―6 kPa, 1.75≡2.33 mmol)로부터 샘플에 용해된 CO2의 배경 수준에서 예상되는 신호 크기의 수십 배의 상쇄에 노출됨을 의미한다.
마지막으로, 임의의 생물학적 샘플에는 또한 크레아티닌보다 훨씬 큰 요소 수준이 포함된다.
H
2
O
2
검출
H2O2는 산화적 대사 과정의 결과로 혈액과 소변 내에서, 그러나 카탈라제, 헴(haeme) 및 아스코르베이트를 포함하여 혈장에서 내인성 산화방지제의 영향으로 빠르게 감소하는 낮은 미세몰 수준에서 발생한다[53]. 따라서, 삼중-효소 체계에서 유일하게 주목할 만한 H2O2 공급원은 사르코신 옥시다제를 통한 크레아티닌 자체이다. H2O2는 또한 전류측정법을 통해 쉽게 감지할 수 있다.
마지막으로, 3-효소 시스템의 전체 평형은 글루탐산 탈수소효소 및 글루탐산 산화효소를 통해 크레아티닌 디이미나제를 검출하는 것과는 달리, 생성물의 생성 및 기질의 소비와 가장 근접해 있다. 이는 생성물의 잠재적인 수준이 높을수록, 더 적은 양의 기질로 인해 신호가 발생하여, 이 시스템에 대한 신호 대 잡음비와 검출 한계가 개선됨을 나타낸다.
미세투석법(Microdialysis)
미세투석법은 간섭물질을 최소화하면서, 목적 조직 또는 용액으로부터 작은 분자의 연속 샘플을 얻는 방법이며, 원래 1970년대에 실험쥐 뇌에서의 신경전달물질을 샘플링하기 위해 개척되었다[55]. 이는 반투과성 막의 한쪽면에 목적 분자가 부족한 유체를 지속적으로 주입하여 표적 분자가 막을 가로질러 관류액 내로 농도 구배를 확산시킬 수 있도록 한다. 동시에, 막의 컷오프 중량(cut-off weight)을 초과하거나, 이미 관류액과 평형을 이루고 있는 분자는 농도가 변하지 않는다. 그 다음 포스트-멤브레인(post-membrane) 투석액은 표적 분자를 검출 시스템으로 운반한다.
미세유체공학(Microfluidics)
'미세유체공학'이라는 용어는 직경이 단지 수십에서 수백 미크론(microns)에 이르는 유동 채널로 나노리터(nanolitre) 스케일 또는 그 미만의 액체의 부피를 처리하는 방법을 나타낸다. 기존의 실험실 분석과 달리, 이 스케일에서 실험하면 민감도, 재현성 및 분석 속도를 향상시키면서, 필요한 양의 샘플과 잠재적으로 고가의 시약을 줄이는 측면에서 강력한 이점이 있다[56]. 이는 효소 자체가 특히 고가일 수 있고, 미세투석법의 경우와 같이, 소량의 기질만이 이용될 수 있는 효소-기반 반응에 특히 유용하다.
랩스미스(Labsmith) 플랫폼
랩스미스 미세유체 플랫폼 시스템(LabSmith, Inc., Livermore, California, USA)은 150μm 내부 직경 불활성 PEEK(Poly Ether Ether Ketone) 튜빙(tubing)(360μm 외경), 밀리리터 스케일의 맞춤형 기질 및 반응물 저장소, 마이크로리터 부피를 처리하여 초당 
8 나노리터(500nl/min) 이하의 유량을 생성할 수 있는 정밀 마이크로펌프 및 내부 PEEK 표면이 있는 3- 또는 4-방향 전환 밸브와 호환된다. 이러한 모든 구성요소는 빈틈없는 미세유체 연결을 만들기 위한 공통 잠금 페럴 피팅(ferrule fitting)과 다양한 기타 구성요소를 제자리에 고정하기 위한 나사-고정 브레드보드(breadboard) 시스템으로 완전히 모듈식이며 교환가능하다.
전류측정 센서(Amperimometric sensors)
전류측정법은 AgIAgCl에 대해 -0.6V 내지 -0.7V의 전위에서 용액의 산소 분압을 측정하기 위해 1950년대 Leyland Clark(1918-2005)이 발명한 것과 같이, 특정 전위에서 산화환원 반응에 의해 소비되거나 생성되는 전자 수를 측정하는 기술이다.
전류측정 센서는 세 가지 요소, 즉 (i) 목적 기판과의 산화환원 반응을 수행하기 위한 작동 전극, (ii) 산화환원 반응의 반대쪽을 균형을 잡기위한 보조 또는 상대-전극, 및 (iii) 전기 공간의 안정적인 지점에서 회로를 고정하기 위한 기준 전극을 포함한다.
분극 회로가 서보(servo) 증폭기를 사용하여 상대-전극으로부터의 전류 흐름을 자동으로 조정하여 산화환원 반응을 제어하기 위해 기준으로부터 고정 점에서 작동 전극의 전위를 유지하고, 기록 및 분석을 위한 전압 신호로 작동 전극에 의해 통과된 전류를 측정하기 위해 트랜스임피던스 증폭기와 결합시킨다.
트랜스임피던스 증폭기는 작동 전극에서 산화환원 반응과의 간섭을 방지하기 위해 10^12Ω 정도의 적절한 입력 임피던스를 가져야 하며, 새로운 기판의 표시와 함께 시스템 산화환원 속도의 예상되는 변화와 일치하는 주파수 응답을 가져야 한다. 마찬가지로, 서보 증폭기는 작동 전극에서 전위의 안정성을 유지할 수 있도록 충분히 낮은 출력 임피던스와 응답 속도를 가져야 한다.
3-효소 시스템은 크레아티닌의 수준을 측정하기 위해 선행 기술에서 사용되어 왔다.
Tsuchida and Yoda[40]는 3-효소 시스템을 사용한다. 저자들은 유리 용액에서 사르코신 옥시다제(sarcosine oxidase)의 최적 pH가 pH 7.5라고 밝혔지만, 일단 고정되면 pH 10으로 증가한다. 따라서, 유리 용액 3-효소 시스템의 최적 pH는 약 pH 7.5일 것으로 예상된다.
Khue et al[72]은 고정화된 효소를 포함하는 전극을 사용한다. 시험된 pH 6.5-8.5 범위에서, 시스템의 최적 pH는 pH 8.0으로 밝혀졌다. 후속 실험은 PBS 완충액의 생리학적 pH에서 수행되었다.
Sakslund et al[74]은 전극에 고정된, 3-효소 시스템의 최적 pH는 pH 7.7임을 발견하였다.
Madaras[77]는 3-효소 시스템의 효소가 층 내에 고정화되어 있는 전극을 논의하고 있다. 이 시스템의 검출 한계는 PBS의 pH 7.3-7.4에서 수행된 30uM 크레아티닌이었다.
분리된 관류 신장의 혈액 또는 소변에서 정상적인 크레아티닌 농도를 지속적으로 샘플링하고 분석하기 위해서는 휴대용, 저비용, 시스템이 필요하다.
자유 용액 중의 효소를 갖는 3-효소 시스템을 이용하는 센서 시스템에 대한 최적 pH가 오직 본 발명의 실험을 통해서만 측정되었다.
본 발명의 간단한 요약
상술한 바와 같이, 신장 기능을 측정하는 종래 기술의 방법은 부적절하고 진부하다. 본 발명자들은 놀랍게도 전극 상에 내장된 적어도 하나의 효소를 갖는 종래 기술의 접근법보다는, 유리 용액에서 3-효소 시스템을 사용하여 크레아티닌 수준을 측정하는 것이 신장 기능의 실시간 판단을 가능하게 하도록 충분히 놀랍도록 정확하고 민감한 판독값을 제공한다는 것을 발견하였다. 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 본 발명자들은 본 발명이 효소 용액이 반응을 거의 완결되게 함으로써, 효소가 짧은 시간 동안 기질에 노출만 되는 종래 기술의 바이오센서에 의해 얻어진 신호보다 더 높은 신호를 생성하고, 이러한 개선에 대해 최소한의 부분적인 원인이 된다는 사실을 고려하였다.
또한, 종래 기술, 예를 들어 Tsuchida and Yoda[40]의 교시와는 달리, 본 발명자들은 자유 용액에서 3-효소 시스템의 최적 pH가 실제로 비교적 높은 pH, 즉 pH 8.0-8.6임을 발견하였다. 이 최적화는 측정의 민감도를 더욱 향상시키는 것으로 고려된다.
전류측정 센서에 의해 생성된 H2O2의 검출과 조합된 3-효소 유리 용액 접근법은 특히 놀라운 민감도를 제공하는 것으로 고려되고 의학적으로 관련된 수준에서 크레아티닌의 실시간 검출을 처음으로 가능하게 하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 제1 양태는 크레아티니나제(creatininase), 크레아티나제(creatinase) 및 사르코신 옥시다제(sarcosine oxidase) 중 선택적으로 둘 또는 전부를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물은 액체이다. 또다른 구체예에서, 조성물은 고체이다. 고체란, 예를 들어 조성물의 성분이 전극 내에 또는 전극 상에 매립되는 것이 아니라, 건조 분말로서 제공됨을 의미한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 겔 형태이다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물은 크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 크레아티니나제 및 사르코신 옥시다제를 포함한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 사르코신 옥시다제 및 크레아티나제를 포함한다. 또다른 구체예에서, 조성물은 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함한다.
본 명세서에 언급된 3-효소 시스템은 3개의 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 모두 사용한다. 그러나, 당업자는 3-효소 시스템을 사용하기 위해 3개의 효소 모두가 동일한 조성일 필요는 없음을 이해할 것이다. 예를 들어, 크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함하는 본 발명의 조성물은 기질과 반응한 후, 센서에 의해 검출될 수 있는 과산화수소를 생성하기 위해 사르코신 옥시다제를 후속적으로 첨가할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 3-효소 시스템에 대한 언급은 모든 3 효소를 동시에, 즉 동일한 조성으로 또는 효소의 순차적 첨가로 사용하는 것을 지칭할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 조성물의 2개 이상의 효소는, 예를 들어 글루타르디알데히드(glutardialdehyde)에 의해, 서로 또는 BSA와 같은 또다른 작용제에 의해 가교결합되지만, 바람직한 구체예에서 효소는 가교결합되지 않는다.
따라서, 일 구체예에서 본 발명은 효소가 가교되지 않고, 선택적으로 글루타르디알데히드와 가교되지 않은 본 발명의 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의, 선택적으로 2개의, 선택적으로 모든 효소가 고정화되지 않은, 선택적으로 모든 효소가 용액 중에 있는 조성물을 제공한다.
조성물의 의도된 용도는 크레아티닌 수준의 측정, 또는 크레아티닌 수준의 정상 상태 실시간 모니터링에 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 조성물은 실제 반응 혼합물의 요건에 의해, 즉 본 발명의 조성물이 기판, 예를 들어 크레아티닌을 포함하고 과산화수소가 생성되는 샘플과 혼합될 때 정의된다. 예를 들어, 조성물은 특정 농도에서, 또는 크레아티닌을 함유하는 샘플, 예를 들어 투석액의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액과 본 발명의 효소 조성물의 다양한 파라미터가 충족되는 특정 농도 또는 특정 pH에서 특정 완충액에 효소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 희석시 필요한 농도에 도달하도록 농축된 양의 다양한 성분을 포함하는 조성물을 공급하는 것이 잘 알려져 있다. 이것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 정의된 임의의 바람직한 최종 반응 농도 또는 파라미터가 충족되도록 제조될 수 있다. 예를 들어 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 미세투석과 함께 사용되며 효소 혼합물은 특정 유량에서 미세투석액과 혼합된다. 당업자는 유량 및 관련된 파라미터에 기초하여, 사용시 필요한 파라미터를 제공하는 본 발명의 적합한 출발 조성물을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물이 액체인 경우, 액체는 완충액을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 완충액에서 본 발명의 조성물의 효소를 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물이 겔인 경우, 겔은 또한 완충액을 포함할 수 있다. 완충액에 대한 선호는 본 명세서에 기술된 바와 같다.
선택된 완충액은 효소의 활성 및 크레아티닌 검출의 결과적인 민감도에 상당한 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 3-효소 시스템을 사용하기 위한 종래 기술의 시도는 일반적으로 생리학적 pH 및 인산염 완충 식염수(PBS)에서의 효소의 사용에 초점을 두었다. 이러한 시도의 예는 도 19에 주어진다. 이 연구의 대부분은 또한 3-효소 시스템의 효소 중 하나 이상이 전극 중 하나에 통합된 바이오센서를 사용하였다. PBS는 인산염과 전극 사이에 유리한 상호작용이 발생하기 때문에 전기화학 센서와 함께 사용하기에 적합한 완충액으로 고려되었다.
그러나, 종래 기술에서 PBS의 많은 사용에도 불구하고, 발명자들은 놀랍게도 PBS가 본 발명에 사용하기에 가장 적합한 완충액이 아니라는 것을 발견하였다. 이는 PBS가 Zn2+, Mn2+ 및 Mg2+와 같은 2가 양이온을 분리시키는 능력을 가지기 때문일 수 있으며, 이들 모두는 다양한 종으로부터 분리된 크레아티니나제 효소에 대한 중요한 보조인자이다. PBS는 이들과 같은 양이온과 불용성 염을 형성하는 것으로 고려된다. 도 18은 다양한 완충 염의 용해도를 열거하며, 이로부터 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 완충액인지 아닌지를 쉽게 결정할 수 있다. 도 18은 예를 들어 2가 양이온의 인산 염의 불용성 수준을 예시한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 완충액은 크레아티니나제의 보조인자, 예를 들어 2가 양이온 보조인자, 예를 들어 Zn2+, Mn2+ 또는 Mg2+에 대해 크레아티니나제와 경쟁하지 않는다. 또다른 구체예에서, 완충액은 양이온, 예를 들어 2가 양이온, 예를 들어 Zn2+, Mn2+ 또는 Mg2+를 분리시키지 않는다.
따라서 일 구체예에서 완충액은 인산염 완충액 또는 PBS가 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, Tris 기반 완충액은 또한 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 것으로 간주되지 않는다. 따라서, 일 구체예에서, 완충액은 PBS가 아니거나 그리고/또는 Tris 기반 완충액이 아니다.
세 가지 효소(크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제)를 모두 포함하는 반응에 대한 최적 pH는 약 pH 8.0 내지 pH 8.95인 것으로 고려되므로, 본 발명의 일 구체예에서 완충액은 pKa가 7.0 내지 9.0인 완충액이다. 일 구체예에서, 완충액은 7.0 내지 9.0의 pKa를 갖지만 PBS 또는 테트라보레이트 또는 Tris가 아니다. 또다른 구체예에서, 완충액의 pKa는 7.05 내지 pH 8.95, 선택적으로 7.1 내지 8.9, 선택적으로 7.15 내지 8.85, 선택적으로 7.2 내지 8.80, 선택적으로 7.20 내지 8.75, 선택적으로 7.25 내지 8.70, 선택적으로 7.30 내지 8.65, 선택적으로 7.35 내지 8.60, 선택적으로 7.40 내지 8.55, 선택적으로 7.45 내지 8.50, 선택적으로 7.40 내지 8.45, 선택적으로 7.45 내지 8.40, 선택적으로 7.50 내지 8.35, 선택적으로 7.55 내지 8.30, 선택적으로 7.60 내지 8.25, 선택적으로 7.65 내지 8.20, 선택적으로 7.70 내지 8.15, 선택적으로 7.75 내지 8.10, 선택적으로 7.80 내지 8.05, 선택적으로 7.85 내지 8.00, 선택적으로 7.90 내지 7.95이거나, pKa는 상기 언급된 pKa 값 중 적어도 하나이거나, 상기 pKa 값 중 임의의 것보다 작다.
본 발명의 일 구체예에서, 완충액의 pKa는 7.3 내지 8.95이다.
본 발명의 일 구체예에서, 완충액의 pKa는 8.5 또는 약 8.5이다.
임의의 상기 pKa 범위에 대해, 일 구체예에서 완충액은 PBS가 아니거나 그리고/또는 테트라보레이트가 아니거나 그리고/또는 Tris가 아니거나 그리고/또는 HEPES가 아니다.
당업자는 다양한 완충액의 pKa의 목록을 잘 알고 있고 이에 대해 접근할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 유용한 것으로 고려되는 완충액의 특정 예 EPPS 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산. 또다른 구체예에서, HEPBS (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산))도 유용한 것으로 고려된다. 추가의 구체예에서, POPSO(피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판설폰산)), HEPPSO(N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-히드록시프로판-3-설폰산)) 및 MOBS(4-(N-모르폴리노)부탄설폰산)도 유용한 것으로 고려된다.
본 발명의 일 구체예에서 완충액은 그의 pKa의 1 pH 단위 내에서 사용되어야 한다고 고려된다.
pKa가 9보다 큰 완충액도 사용될 수 있다. 그러나, 예를 들어 혈액 또는 소변의 크레아티닌 수준을 측정하는 맥락에서, 9.5 초과의 pKa는 유용하지 않을 것이다. 그러나, 이러한 완충액, 즉 pKa가 9보다 크거나 9.5보다 큰 완충액은 다른 상황에서 유용할 수 있으며 본 발명의 일부로도 포함된다.
pKa를 포함한 다양한 완충액의 다양한 속성에 대한 자세한 정보는 쉽게 찾을 수 있다. 예를 들어 Sigma 웹 사이트에는 많은 완충액에 대한 자세한 정보가 있다(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html).
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 완충액은 실온, 예를 들어 18℃ 내지 25℃, 예를 들어 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃ 또는 25℃에서 사용된다. 완충액은 전형적으로 20℃에서 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 완충액은 실온 초과의 온도, 예를 들어 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃ 또는 그 이상에서 사용된다. 추가의 구체예에서, 완충액은 55℃ 이하의 온도, 예를 들어 50℃, 45℃, 40℃ 또는 그 이하에서 사용된다. 추가의 구체예에서, 완충액은 실온 미만의 온도에서는 사용되지 않는다.
사용된 완충액의 pKa 외에도 효소가 수행되는 반응 혼합물의 pH도 매우 중요하다. 일 구체예에서, 조성물 또는 완충액의 pH는 약 pH 8.0 내지 pH 8.95 사이이다. 본 발명의 일 구체예에서, 조성물 또는 완충액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 조성물 또는 완충액이다. 일 구체예에서, 조성물 또는 완충액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖지만 PBS 또는 테트라보레이트 또는 Tris는 아니다. 또다른 구체예에서, 조성물 또는 완충액의 pH는 7.05 내지 pH 8.95, 선택적으로 7.1 내지 8.9, 선택적으로 7.15 내지 8.85, 선택적으로 7.2 내지 8.80, 선택적으로 7.20 내지 8.75, 선택적으로 7.25 내지 8.70, 선택적으로 7.30 내지 8.65, 선택적으로 7.35 내지 8.60, 선택적으로 7.40 내지 8.55, 선택적으로 7.45 내지 8.50, 선택적으로 7.40 내지 8.45, 선택적으로 7.45 내지 8.40, 선택적으로 7.50 내지 8.35, 선택적으로 7.55 내지 8.30, 선택적으로 7.60 내지 8.25, 선택적으로 7.65 내지 8.20, 선택적으로 7.70 내지 8.15, 선택적으로 7.75 내지 8.10, 선택적으로 7.80 내지 8.05, 선택적으로 7.85 내지 8.00, 선택적으로 7.90 내지 7.95이거나, pH는 상기 언급된 pKa 값 중 적어도 임의의 것이거나 상기 pH 값 중 임의의 값보다 작다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물 또는 완충액의 pH는 7.3 내지 8.95이다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물 또는 완충액의 pH는 8.5 또는 약 8.5이다.
임의의 상기 pH 범위에 대해, 일 구체예에서 완충액은 PBS가 아니고/아니거나 테트라보레이트가 아니고/아니거나 Tris가 아니고/아니거나 HEPES가 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 5mM 내지 100mM, 선택적으로 10mM 내지 90mM, 선택적으로 15mM 내지 85mM, 선택적으로 20mM 내지 80mM, 선택적으로 25mM 내지 75mM, 선택적으로 30mM 내지 70mM, 선택적으로 35mM 내지 65mM, 선택적으로 40mM 내지 60mM, 선택적으로 45mM 내지 55mM, 선택적으로 50mM의 농도의 완충액을 포함한다. 당업자는 요구되는 적절한 농도의 완충액을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 (i) 헨더슨-하젤바르(Henderson-hasselbalch) 방정식을 사용하여, 예를 들어 pH 7.35에서 정상 인간 혈청을 계산하여 적절한 범위의 가장 낮은 끝을 얻도록, 예를 들어 pH 8.5의 0.1 이내로 범위를 유지하고, 그 다음에 (ii) 염기성 pKa가 예를 들어 pH 8.5의 0.1 이내에서 완충될 수 있다.
본 발명의 조성물의 pH는 특정 pH일 수 있지만, 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 조직 유체 샘플 중 또는 조직 유체 샘플의 첨가시, 생성된 혼합물의 pH는 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 바람직하게는, 일 구체예에서 조성물의 완충액의 pH가 3-효소 시스템에 대해 최적인 것으로 고려되고 최적 조건이 아닌 경우 T90에 도달하는 데 걸리는 시간이 연장될 수 있기 때문에 pH의 변화는 최소로 유지된다. 일 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0 내지 0.1 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.1 내지 0.2 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.2 내지 0.3 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.3 내지 0.4 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.5 내지 0.6 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.6 내지 0.7 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.7 내지 0.8 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.8 내지 0.9 pH 단위이다. 또다른 구체예에서, 생성된 혼합물의 pH는 본 발명의 조성물의 pH와 상이한 0.9 내지 1.0 pH 단위이다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 조성물의 완충액의 pH는 3-효소 시스템에 대해 최적인 것으로 고려되지 않지만, 일단 본 발명의 조성물이 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 조직 유체 샘플 동안 또는 조직 유체 샘플과 혼합되면, 최적 pH가 얻어지도록 설계된다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물은 pH 8.0-8.5에서 EPPS, pH 8.0-8.5에서 선택적으로 50mM EPPS, pH 8.0에서 선택적으로 50mM EPPS 또는 pH 8.5에서 50mM EPPS를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 pH 8.0 또는 pH 8.5에서 50mM EPPS를 포함한다.
위에서 논의된 바와 같이, 상이한 완충액의 pH를 포함하여 다양한 특성이 당업자에게 공지되어 있으며, 당업자는 상식과 조합하여 본 명세서에서 제공된 세부사항에 기초하여, 본 발명에 사용하기에 적합한 완충액을 쉽게 결정할 수 있다.
크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 용액과 이들 완충액 특성의 조합은 이전에 종래 기술에서 고려되지 않았다. 3-효소 반응의 최적 pH 및 완충액으로서 PBS의 부적합성을 확인한 것은 오직 본 발명자들의 연구였다.
중요한 것은 반응 혼합물의 pH이기 때문에, 효소를 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충액 또한 포함할 수 있지만, 대신에 완충액은 예를 들어 하나 이상의 또는 모든 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제와 함께 부품 키트의 일부로서 별도로 공급될 수 있음이 이해될 것이다. 이 경우 하나 이상의 효소가 완충액에 대해 별도로 반응 혼합물에 첨가되어, 적절한 pH를 유지한다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물 중 유일한 독립체는 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제이고, 완충액이 존재하는 경우에는 완충액이다. 이 경우에, 본 발명의 조성물은 상기 기술된 바와 같이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 임의의 2개 또는 전부, 및 존재하는 경우, 완충액으로 이루어지거나 필수적으로 이를 포함한다. 조성물이 고체인 경우, 조성물은 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 임의의 2개 또는 전부로만 구성될 수 있음이 이해될 것이다. 그러나, 조성물이 겔의 액체인 경우, 조성물은 또한 액체 또는 겔 성분을 포함해야 하며, 일 구체예에서 본 발명의 작용에 어떠한 물질 영향도 주지 않는 것으로 고려되므로, 이 경우의 조성물은 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 임의의 2개 또는 전부로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함한다.
그러나, 신장 기능의 모니터링과 같은 상황에서, 예를 들어 대상의 다른 대사산물 또는 파라미터를 모니터링하는 것 또한 유용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 조성물은 다른 유용한 작용제 또한 포함할 수 있는 것 이외에 상기 작용제를 포함한다. 예를 들어, 조성물이 또한 우레아제(urease)를 포함하는 경우 요소를 검출하는 것이 유용한 것으로 고려되지만, 당업자는 이 반응이 전기화학 물질을 생성하지 않으며, 암모니아 및 CO2의 생성에 의해 야기된 pH의 변화를 검출하는 수단을 사용해야 한다는 것을 이해할 것이다. 조성물은 또한 요산을 소화시키고 전기화학 물질을 생성하는 우리카제(uricase)를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 조성물은 또한 시스타틴 C 및 알부민을 검출하는 수단을 포함할 수 있다.
조성물의 효소는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 활성을 갖는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 효소는 야생형 효소, 즉 특정 유기체에서 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 서열을 갖는 효소일 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 효소는 비-천연 서열을 가질 수 있으며, 예를 들어 이들은 자연 발생 서열과 비교하여 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어, 효소는 예를 들어 그들의 활성 또는 특이성을 증가시키기 위해 의도적인 돌연변이를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제는 자연적으로 발생하는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 효소와 적어도 20% 동일성 또는 상동성을 가지며, 예를 들어 자연적으로 발생하는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제와 25% 이상, 또는 30% 이상, 또는 35% 이상, 또는 40% 이상, 또는 45% 이상, 또는 50% 이상, 또는 55% 이상, 또는 60% 이상, 또는 65% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 92% 이상, 또는 94% 이상, 또는 96% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 동일성 또는 상동성을 갖는다.
조성물의 효소는 필요한 반응을 촉매할 수 있는 경우, 즉 크레아티니나제가 크레아티닌을 크레아틴으로 전환시키고; 크레아티나제는 크레아틴을 사르코신 및 요소로 전환시키고; 사르코신 옥시다제는 사르코신을 글리신, 포름알데히드 및 과산화수소로 전환시키는 경우, 임의의 서열을 가질 수 있다.
조성물의 효소는 재조합 단백질일 수 있거나 합성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 크레아티니나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CNH-311로부터 유래하고; 그리고/또는 크레아티나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CRH-211로부터 유래하고; 그리고/또는 사르코신 옥시다제는 Sorachim 카탈로그 번호 SAO-351로부터 유래한다.
본 발명의 일 구체예에서, 3-효소 시스템에서 효소의 상대적인 비는 최적화된 반응 혼합물을 생성하는 데 중요한 것으로 고려된다. 당업자는 임의의 반응에서 속도 제한 단계가 있음을 이해할 것이다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 3-효소 시스템에서 사르코신 옥시다제 효소가 속도 제한 단계인 것으로 고려한다. 따라서, 당업자는 크레아티니나제 및 크레아티나제가 반응에 첨가되는 양에 관계없이, 일 구체예에서 과산화수소의 생성 속도가 사르코신 옥시다제의 양에 의해 제한될 것임을 이해할 것이다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 실제 물리적 양의 효소가 중요하다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 효소가 가장 적절한 비율일 때에도, 너무 적은 효소는 예를 들어, 전극에서 검출하기에 충분한 양의 과산화수소를 생성하지 않을 것이다. 첨가될 수 있는 효소의 양의 상한에는 제한이 없는 것으로 여겨지지만, 당업자는 초과 효소가 낭비되고 불필요한 비용이 발생한다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 일 구체예에서, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서, 크레아티니나제의 농도는 약 50U/ml 초과, 예를 들어 약 75U/ml 초과, 예를 들어 약 100U/ml 초과, 예를 들어 약 125U/ml 초과, 예를 들어 약 150U/ml 초과, 예를 들어 약 175U/ml 초과, 예를 들어 약 200U/ml 초과, 예를 들어 약 250U/ml 초과, 예를 들어 약 300U/ml 초과, 예를 들어 약 325U/ml 초과, 예를 들어 약 350U/ml 초과, 예를 들어 약 375U/ml 초과, 예를 들어 약 400U/ml 초과, 예를 들어 약 425U/ml 초과, 예를 들어 약 450U/ml 초과, 예를 들어 약 475U/ml 초과, 예를 들어 약 500U/ml 초과, 예를 들어 약 525U/ml 초과, 예를 들어 약 550U/ml 초과, 예를 들어 약 575U/ml 초과, 예를 들어 약 600U/ml 초과, 예를 들어 약 625U/ml 초과, 예를 들어 약 650U/ml 초과, 예를 들어 약 675U/ml 초과, 예를 들어 약 800U/ml 초과, 예를 들어 약 825U/ml 초과, 예를 들어 약 850U/ml 초과, 예를 들어 약 875U/ml 초과, 예를 들어 약 900U/ml 초과, 예를 들어 약 925U/ml 초과, 예를 들어 약 950U/ml 초과, 예를 들어 약 975U/ml 초과, 예를 들어 약 1000U/ml 초과이어야 한다고 고려된다. 당업자는 본 발명의 조성물에서 크레아티니나제의 적절한 출발 농도를 결정하여 반응 혼합물에서 필요한 최종 농도를 결정할 수 있을 것이다.
동일하거나 대안적인 구체예에서, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서, 크레아티나제의 농도는 약 50U/ml 초과, 예를 들어 약 75U/ml 초과, 예를 들어 약 100U/ml 초과, 예를 들어 약 125U/ml 초과, 예를 들어 약 150U/ml 초과, 예를 들어 약 175U/ml 초과, 예를 들어 약 200U/ml 초과, 예를 들어 약 250U/ml 초과, 예를 들어 약 300U/ml 초과, 예를 들어 약 325U/ml 초과, 예를 들어 약 350U/ml 초과, 예를 들어 약 375U/ml 초과, 예를 들어 약 400U/ml 초과, 예를 들어 약 425U/ml 초과, 예를 들어 약 450U/ml 초과, 예를 들어 약 475U/ml 초과, 예를 들어 약 500U/ml 초과, 예를 들어 약 525U/ml 초과, 예를 들어 약 550U/ml 초과, 예를 들어 약 575U/ml 초과, 예를 들어 약 600U/ml 초과, 예를 들어 약 625U/ml 초과, 예를 들어 약 650U/ml 초과, 예를 들어 약 675U/ml 초과, 예를 들어 약 800U/ml 초과, 예를 들어 약 825U/ml 초과, 예를 들어 약 850U/ml 초과, 예를 들어 약 875U/ml 초과, 예를 들어 약 900U/ml 초과, 예를 들어 약 925U/ml 초과, 예를 들어 약 950U/ml 초과, 예를 들어 약 975U/ml 초과, 예를 들어 약 1000U/ml 초과이어야 한다고 고려된다. 당업자는 반응 혼합물에서 필요한 최종 농도를 허용하기 위해 본 발명의 조성물에서 크레아티나제의 적절한 출발 농도를 결정할 수 있을 것이다.
동일하거나 대안적인 구체예에서, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서, 사르코신 옥시다제의 농도는 약 10U/ml 초과. 예를 들어 약 15U/ml 초과, 예를 들어 약 20U/ml 초과, 예를 들어 약 25U/ml 초과, 예를 들어 약 30U/ml 초과, 예를 들어 약 35U/ml 초과, 예를 들어 약 40U/ml 초과, 예를 들어 약 45U/ml 초과, 예를 들어 약 50U/ml 초과, 예를 들어 약 55U/ml 초과, 예를 들어 약 60U/ml 초과, 예를 들어 약 65U/ml 초과, 예를 들어 약 70U/ml 초과이어야 하는 것으로 고려된다. 바람직하게는 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서의 사르코신 옥시다제의 양은 30U/ml 이상이다. 당업자는 반응 혼합물에서 요구되는 최종 농도를 허용하기 위해 본 발명의 조성물에서 사르코신 옥시다제의 적절한 시작 농도를 결정할 수 있을 것이다.
당업자는 필요한 각 효소의 양, 특히 속도 제한인 것으로 고려되는 사르코신 옥시다제 효소의 양이 다수의 인자에 의존할 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 검출될 것으로 예상되는 크레아티닌의 양은 필요한 효소의 양에 영향을 줄 것이다. 따라서 한 구체예에서, 크레아티닌의 양을 측정하기 위해 반응에 사용된 각 효소의 양은 샘플의 크레아티닌의 양에 따라 조정된다.
바람직하게는 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액은 300U/ml 이상의 크레아티니나제를 포함한다.
바람직하게는 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액은 120U/ml 이상의 크레아티나제를 포함한다.
바람직하게는 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액은 15U/ml 이상의 사르코신 옥시다제를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액은 300U/ml 이상의 크레아티니나제, 120U/ml의 크레아티나제 및 15U/ml 이상의 사르코신 옥시다제를 포함한다.
크레아티닌을 함유하는 투석액 및 300U/ml 미만의 크레아티니나제, 및/또는 120U/ml 미만의 크레아티나제, 및/또는 15U/ml 미만의 사르코신 옥시다제를 포함하는 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액은 여전히 유용한 반응을 생성하는 것으로 고려되지만, 이들 값 이상의 효소 농도는 크레아티닌의 최종 검출가능한 과산화수소에 대한 반응에서 훨씬 더 큰 개선을 제공하는 것으로 고려된다.
당업자는 필요한 각 효소의 양이 또한 생성된 과산화수소의 검출 전에 반응이 진행되는 시간의 길이에 의존할 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 판독 빈도가 높을 필요가 없는 상황, 예를 들어 1 시간 이상 판독, 예를 들어 2 시간 이상마다 판독하는 경우, 반응이 예를 들어 0.5 초마다 또는 1 초마다 판독이 필요한 경우보다 더 긴 시간 동안 진행될 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어 크레아티닌의 90%가 과산화수소의 생성물(T90)과 반응하도록 반응이 진행되도록 하기위해서는 더 많은 양의 효소가 필요하지만, 전자의 경우에는 과산화수소를 검출하기 전에 반응이 더 오랜 시간 진행될 수 있기 때문에 적은 양의 효소가 필요하다.
본 발명자들은 건강한 개체에서 낮은 생리학적 수준의 혈장 크레아티닌 및 신장 기능이 감소된 개체에서 혈장 크레아티닌의 증가 수준을 고려하여 반응 조건을 최적화하였다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 크레아티닌을 함유하는 투석액과 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서의 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제의 비율은 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 각각 10:5:1 내지 49:8:1 U/ml이다. 예를 들어, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 각각의 비율은 임의의 적합한 비율일 수 있으며, 예를 들어 10:5:1, 또는 15:5:1, 또는 20:5:1, 또는 25:5:1, 또는 30:5:1, 또는 35:5:1, 또는 40:5:1, 또는 45:5:1, 또는 10:10:1, 또는 15:10:1, 또는 20:10:1, 또는 25:10:1, 또는 30:10:1, 또는 35:10:1, 또는 40:10:1, 또는 45:10:1, 또는 50:10:1, 또는 10:15:1, 또는 15:15:1, 또는 20:10:1, 또는 25:15:1, 또는 30:15:1, 또는 35:15:1, 또는 40:15:1, 또는 45:15:1, 또는 50:15:1, 또는 10:20:1, 또는 15:20:1, 또는 20:20:1, 또는 25:20:1, 또는 30:20:1, 또는 35:20:1, 또는 40:20:1, 또는 45:20:1, 또는 50:20:1, 또는 10:25:1, 또는 15:25:1, 또는 20:25:1, 또는 25:25:1, 또는 30:25:1, 또는 35:25:1, 또는 40:25:1, 또는 45:25:1, 또는 50:25:1, 또는 10:30:1, 또는 15:30:1, 또는 20:30:1, 또는 25:30:1, 또는 30:30:1, 또는 35:30:1, 또는 40:30:1, 또는 45:30:1, 또는 50:30:1, 또는 10:35:1, 또는 15:35:1, 또는 20:35:1, 또는 25:35:1, 또는 30:35:1, 또는 35:35:1, 또는 40:35:1, 또는 45:35:1, 또는 50:35:1, 또는 10:40:1, 또는 15:40:1, 또는 20:40:1, 또는 25:40:1, 또는 30:40:1, 또는 35:40:1, 또는 40:40:1, 또는 45:40:1, 또는 50:40:1, 10:45:1, 또는 15:45:1, 또는 20:45:1, 또는 25:45:1, 또는 30:45:1, 또는 35:45:1, 또는 40:45:1, 또는 45:45:1, 또는 50:45:1; 또는 10:50:1, 또는 15:50:1, 또는 20:50:1, 또는 25:50:1, 또는 30:50:1, 또는 35:50:1, 또는 40:50:1, 또는 45:50:1, 또는 50:50:1일 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 본 발명의 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서의 사르코신 옥시다제의 양이 약 10U/ml 초과 그리고 바람직하게는 30U/ml 이상인 경우 바람직한 것으로 고려된다. 이는 건강한 대상에서 발견되는 낮은 수준의 크레아티닌에 대해 신뢰할만한 신호를 제공하기에 충분한 양의 효소를 허용하는 것으로 고려되며, 2uM만큼 낮은 민감도를 증가시킬 것으로 예상되는 샘플에서의 크레아티닌 회수율이 개선되면서 4.3uM만큼 낮은 크레아티닌 수준을 검출할 수 있다. 건강한 개인의 혈청 크레아티닌 농도는 60uM 내지 120uM의 범위이므로, 청구된 발명의 민감도는 혈청 크레아티닌 수준의 정확한 측정을 가능하게 하기에 적합하게 높은 것이 명백하다.
본 발명의 특정 구체예에서, 완충액의 특정 pH 및/또는 조성물의 완충액 유형 및/또는 효소의 비율 및/또는 각 효소의 실제 양의 조합은 특히 효과적인 반응 조건의 세트를 제공하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 조성물은 크레아티닌을 함유하는 투석액과 효소 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액에서 600 U/ml 또는 크레아티니나제, 300 U/ml의 크레아티나제 및 60 U/ml의 사르코신 옥시다제가 존재하도록 효소 및 완충액을 포함한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 크레아티닌을 함유하는 투석액 및 효소 조성물의 혼합으로부터 생성되는 최종 혼합 용액에서 pH 8.5의 600 U/ml 또는 크레아티니나제, 300 U/ml의 크레아티나제 및 60 U/ml의 사르코신 옥시다제가 존재하도록 효소 및 완충액을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 조성물은 100uM 크레아티닌을 포함하는 반응의 T90이 10분 미만, 예를 들어 9.5분 미만, 예를 들어 9분 미만, 예를 들어 8.5분 미만, 예를 들어 8분 미만, 예를 들어 7.5분 미만, 예를 들어 7분 미만, 예를 들어 6.5분 미만, 예를 들어 6분 미만, 예를 들어 5.5분 미만, 예를 들어 5분 미만, 예를 들어 250초 미만, 예를 들어 225초 미만, 예를 들어 200초 미만, 예를 들어 190초 미만, 예를 들어 180초 미만, 예를 들어 170초 미만, 예를 들어 160초 미만, 예를 들어 150초 미만, 예를 들어 140초 미만, 예를 들어 130초 미만, 예를 들어 120초 미만, 예를 들어 110초 미만, 예를 들어 100초 미만, 예를 들어 90초 미만, 예를 들어 80초 미만, 예를 들어 70초 미만, 예를 들어 60초 미만, 예를 들어 50초 미만, 예를 들어 40초 미만, 예를 들어 30초 미만, 예를 들어 20초 미만 예를 들어 10초 미만이 되도록 크레아티니나제, 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제, 및 본 명세서에 기술된 완충액과 같은 다른 성분 중 어느 둘 이상을 포함한다. 일 구체예에서, T90은 195초 이하이다. 또다른 구체예에서, T90은 154초 이하이다. 또다른 구체예에서, T90은 135초 이하이다. 당업자는 적합한 파라미터를 결정할 수 있으며, 예시는 실시예에 제공된다.
본 발명의 조성물이 추가 성분 또는 작용제, 예를 들어 대상의 건강을 결정하는 데 유용한 다른 작용제를 포함할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 조성물은 요소, 예를 들어 우레아제 및/또는 우리카제의 수준을 검출하는 수단을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 시스타틴 C 및 알부민을 검출하는 수단을 포함할 수 있다.
본 명세서에 상세히 기술된 민감하고 최적화된 조성물은 다양한 방식으로 크레아티닌 수준을 검출하는 데 사용될 수 있음이 명백할 것이다.
따라서, 추가의 양태는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 및 적어도 제1 센서를 포함하는 센서 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 조성물로서 제공된다. 또다른 구체예에서, 3 개의 효소는 개별적으로 제공되고 반응 혼합물에 순차적으로 첨가된다. 상기 선호도는 2 이상의 크레아티니나제, 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제를 포함하는 조성물에 관한 것이지만, 최적의 반응 조건은 3 가지 효소가 참여하는 임의의 반응에 적용된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함하는 본 발명의 조성물은 별도의 조성물 또는 부분표본의 사르코신 옥시다제와 함께 사용될 수 있다. 바람직한 조건, 예를 들어 PBS가 아닌 완충액 및/또는 pH 8.5의 완충액이 여전히 적용된다. 따라서, 본 발명의 조성물과 관련하여 기술된 상기 조건 및 선호는 또한 3 개의 효소 모두가 개별적으로 공급되고, 예를 들어 반응 용기에 순차적으로 도입되는 상황에도 적용된다.
따라서 센서 시스템은 최소한 다음과 같은 다양한 상황을 포함할 수 있다:
크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함하지만, 사르코신 옥시다제는 포함하지 않는 조성물;
크레아티니나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하지만, 크레아티나제는 포함하지 않는 조성물;
크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하지만, 크레아티니나제는 포함하지 않는 조성물;
크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함하고, 사르코신 옥시다제가 별도로 공급되는 조성물;
크레아티니나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하고, 크레아티나제가 별도로 공급되는 조성물;
크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하고, 크레아티니나제가 별도로 공급되는 조성물; 및
크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제의 별도 공급 - 임의의 동일한 조성물의 일부가 아님.
위에서 논의된 바와 같이, 일 구체예에서, 센서 시스템은 또한 반응이 최적 조건 하에서 진행되도록 하기 위해 본 명세서에 설명된 바와 같은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다.
3-효소 시스템은 요소 및 과산화수소를 생성하며, 둘 다 검출가능하다.
사르코신 옥시다제 효소에 의해 생성된 과산화수소를 검출하는 것은 유리한 것으로 고려된다. 이는 예를 들어 전류측정 센서에 의한 민감한 전기화학 검출을 가능하게 한다. 과산화수소는 또한 특수화된 막을 사용하여 전위차적으로 검출될 수 있다. 또는, 과산화수소는 효소, 예를 들어 겨자무과산화효소 및 염료분자를 사용하여 광학적으로 검출될 수 있다. 따라서, 효소 시스템은 전류측정 센서 및/또는 전위차 감지를 위한 특수화된 막 및/또는 추가 효소, 예를 들어 겨자무과산화효소 및 염료 분자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 효소 시스템은 적어도 하나의 전류측정 센서를 포함한다. 전류측정 센서는 당업계에 잘 알려져 있다.
검출 전극은 다수의 작용제 중 하나에 의해 보호 장치가 되는 경우에 유용한 것으로 고려된다. 이러한 작용제는 당업계에 공지되어 있으며 mPD, 폴리페놀 및 나피온(nafion) 및 파라-페닐렌디아민(pPD)을 포함한다. 이러한 작용제는 불필요한 분자가 전극에 접근하는 것을 방지하면서, 과산화수소를 통과시키는 것으로 고려된다. 일 구체예에서, 검출 전극은 백금으로 만들어지며, 이는 과산화수소 전기화학에 가장 적합한 재료로 고려된다. 또다른 구체예에서, 검출 전극은 예를 들어 백금-스퍼터링된(platinum-sputtered) 실리콘 바늘 또는 탄소 나노튜브일 수 있다.
센서 시스템은 임의의 샘플, 예를 들어 대상으로부터 얻은 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 조직액 또는 뇌척수액에서 채취한 샘플; 또는 예를 들어 관류 신장에서 채취한 샘플, 예를 들어 장기 이식용 관류 신장으로부터 관류액의 샘플에서 크레아티닌을 검출하는 데 사용될 수 있다.
센서 시스템은 또한 모든 양의 샘플과 함께 사용할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 조성물 및 시스템은 미세유체, 예를 들어 미세유체 회로 및/또는 미세유체 장치 및/또는 미세유체 프로브(probe)와 함께 사용하기에 적합하다. 따라서, 일 구체예에서, 시스템은 미세유체 회로 및/또는 미세유체 장치 및/또는 미세유체 프로브를 포함한다. 미세유체 회로, 미세유체 장치 및 미세유체 프로브는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 특정 예시는 실시예에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시스템은 미세유체 프로브와 같은 샘플링 프로브를 포함한다. 적합한 미세유체 프로브는 당업계에 공지되어 있으며 Brain CMA-70(MDialysis); Freeflap CMA-70(MDialysis); MAB9.14.2(Microbiotech SE); MAB6.14.2(Microbiotech SE); MAB11.35.4(Microbiotech SE) 또는 MDialysis의 번호 67 정맥 미세투석 카테터(intravenous microdialysis catheter)를 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 시스템은 또한 샘플, 예를 들어 미세투석액이 본 발명의 조성물 또는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제와 혼합되어 과산화수소를 생성할 수 있는 구역을 포함한다. 시스템은 또한 또다른 구체예에서, 예를 들어 전류측정 센서에 의해 과산화수소가 검출되는 섹션을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 시스템은 또한 연속 흐름 시스템을 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 시스템은 연속 흐름 시스템을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가 구체예에서, 시스템은 정상 흐름을 유지하기 위한 수단을 포함한다. 이는 신장 기능의 실시간 또는 지속적인 모니터링이 필요할 때 유리한 것으로 고려된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 시스템은 정상 흐름을 유지하기 위한 수단을 포함하지 않는다. 예를 들어, 시스템은 선형 흐름 분석 시스템에 사용하기 위한 것일 수 있다. 이러한 시스템은 가정에서 사용하기에 적합한 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 상기 시스템은 본 명세서에 기재된 바와 같은 감지 시약(sensing reagent), 예를 들어 적합한 pH의 적합한 완충액, 및 센서, 예를 들어 전기화학적 센서인 센서를 포함하고, 여기서 시스템은 샘플, 예를 들어 혈액은 감지 시약 및 완충액이 존재하는 경우 이들과 혼합되어 혼합 및 반응한 후 생성된 과산화수소가 센서, 예를 들어 전류측정 센서 또는 전위차 감지 및/또는 효소 센서, 예를 들어 신장 기능의 정도를 시각적으로 판독할 수 있게 하는 겨자무과산화효소 및 염료분자로 감지되도록 싱글-샷 포인트의 주의 상황 또는 홈 테스트 키트 또는 장치에서 사용된다.
시스템은 또한 교정 표준기를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서 일 구체예에서 시스템은 교정 스트림과 샘플 스트림 사이를 전환하는 수단을 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 시스템은 병렬 스트림 형태의 교정 표준기를 포함할 수 있다. 이 후자의 구체예는 홈-시스템 또는 현장-관리 시스템의 상황에서 특히 유용한 것으로 고려된다.
시스템은 또한 환자로부터, 임의의 적합한 샘플이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있지만, 예를 들어 혈액, 소변, 혈장, 조직액 또는 뇌척수액으로부터 샘플을 채취하는 수단을 포함할 수 있다. 시스템은 또한 폐쇄-루프(closed-loop isolated) 분리 관류 기관, 예를 들어 신장으로부터 샘플을 채취하는 수단을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 샘플은 투석액, 예를 들어 미세투석액이다.
전술한 바와 같이, 당업자는 반응이 완료될수록 민감도가 더 높아짐을 이해할 것이다. 당업자는 또한 원하는 민감도와 반응 시간 사이에 도달할 수 있는 절충점이 있을 수 있음을 이해할 것이다. 완료 또는 완료에 가까운 시간을 줄이기 위해, 효소의 양을 늘릴 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 센서 시스템은 샘플을 센서와 접촉시키기 전에 감지 시약이 샘플에 첨가되도록 배열된다. 이러한 방식으로, 효소는 감지 전에 상당한 수준의 과산화수소를 생성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 반응은 감지 전에 완료되거나 감지 전에 적어도 95% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 95% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 90% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 85% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 80% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 75% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 70% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 65% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 60% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 55% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 50% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 45% 완료에 도달하였거나, 감지 전에 적어도 40% 완료에 도달하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 센서 시스템은 센서와 접촉하기 전에 감지 시약(상기 논의된 바와 같이, 크레아티니나제, 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 중 둘 이상을 포함하는 조성물일 수 있거나, 또는 별개의 부분 표본으로 3 개의 효소 모두일 수 있음)이 샘플에 첨가되도록 배치되며, 예를 들어 감지 시약을 샘플에 첨가하는 것과 센서와의 접촉 사이에 10분 이상이 되도록 배치된다. 한 구체예에서, 센서 시스템은 본 발명의 효소 또는 조성물을 샘플에 첨가하는 것과 센서와 접촉하는 것 사이에 10분 이상, 예를 들어 9.5분 이상, 예를 들어 9분 이상, 예를 들어 8.5분 이상, 예를 들어 8분 이상, 예를 들어 7.5분 이상, 예를 들어 7분 이상, 예를 들어 6.5분 이상, 예를 들어 6분 이상, 예를 들어 5.5분 이상, 예를 들어 5분 이상, 예를 들어 250초 이상, 예를 들어 225초 이상, 예를 들어 200초 이상, 예를 들어 190초 이상, 예를 들어 180초 이상, 예를 들어 170초 이상, 예를 들어 160초 이상, 예를 들어 150초 이상, 예를 들어 140초 이상, 예를 들어 130초 이상, 예를 들어 120초 이상, 예를 들어 110초 이상, 예를 들어 100초 이상, 예를 들어 90초 이상, 예를 들어 80초 이상, 예를 들어 70초 이상, 예를 들어 60초 이상, 예를 들어 50초 이상, 예를 들어 40초 이상, 예를 들어 30초 이상, 예를 들어 20초 이상 예를 들어 10초 이상, 예를 들어 5초 이상, 예를 들어 2초 이상, 예를 들어 1초 이상이 되도록 배치된다.
본 발명의 일 구체예에서, 센서 시스템은 본 발명의 효소 또는 조성물을 샘플에 첨가하고 센서와 접촉하는 사이가 10분 미만, 예를 들어 9.5분 미만, 예를 들어 9분 미만, 예를 들어 8.5분 미만, 예를 들어 8분 미만, 예를 들어 7.5분 미만, 예를 들어 7분 미만, 예를 들어 6.5분 미만, 예를 들어 6분 미만, 예를 들어 5.5분 미만, 예를 들어 5분 미만, 예를 들어 250초 미만, 예를 들어 225초 미만, 예를 들어 200초 미만, 예를 들어 190초 미만, 예를 들어 180초 미만, 예를 들어 170초 미만, 예를 들어 160초 미만, 예를 들어 150초 미만, 예를 들어 140초 미만, 예를 들어 130초 미만, 예를 들어 120초 미만, 예를 들어 110초 미만, 예를 들어 100초 미만, 예를 들어 90초 미만, 예를 들어 80초 미만, 예를 들어 70초 미만, 예를 들어 60초 미만, 예를 들어 50초 미만, 예를 들어 40초 미만, 예를 들어 30초 미만, 예를 들어 20초 미만 예를 들어 10초 미만, 예를 들어 5초 미만, 예를 들어 2초 미만, 예를 들어 1초 미만이 되도록 배치한다.
관류액 및 본 발명의 조성물 또는 감지 시약의 유량(3 개의 효소가 동시보다는 오히려 순차적으로 전달될 때)은 생성된 반응 혼합물의 조성물에 영향을 미친다. 당업자는 본 명세서에 기술된 바와 같이 최적의 반응 혼합물을 달성하기 위해 적절한 유량을 결정할 수 있을 것이다. 일 구체예에서, 센서 시스템은 관류액 유량이 0.1-10ul/분, 예를 들어 0.1ul/분 이상, 예를 들어 0.25ul/분 이상, 예를 들어 0.5ul/분 이상, 예를 들어 0.75ul/분 이상, 예를 들어 1.0ul/분 이상, 예를 들어 1.25ul/분 이상, 예를 들어 1.5ul/분 이상, 예를 들어 1.75ul/분 이상, 예를 들어 2.0ul/분 이상, 예를 들어 2.25ul/분 이상, 예를 들어 2.5ul/분 이상, 예를 들어 2.75ul/분 이상, 예를 들어 3.0ul/분 이상, 예를 들어 3.25l/분 이상, 예를 들어 3.5ul/분 이상, 예를 들어 3.75ul/분 이상, 예를 들어 4.0ul/분 이상, 예를 들어 4.25ul/분 이상, 예를 들어 4.5ul/분 이상, 예를 들어 4.75ul/분 이상, 예를 들어 5.0ul/분 이상, 예를 들어 5.25ul/분 이상, 예를 들어 5.5ul/분 이상, 예를 들어 5.75ul/분 이상¸ 예를 들어 6.0ul/분 이상¸ 예를 들어 6.25ul/분 이상¸ 예를 들어 6.5ul/분 이상, 예를 들어 6.75ul/분 이상, 예를 들어 7.0ul/분 이상, 예를 들어 7.25ul/분 이상, 예를 들어 7.75ul/분 이상, 예를 들어 8.0ul/분 이상, 예를 들어 8.25ul/분 이상, 예를 들어 8.5ul/분 이상, 예를 들어 8.75ul/분 이상, 예를 들어 9.0ul/분 이상, 예를 들어 9.25ul/분 이상, 예를 들어 9.5ul/분 이상, 예를 들어 9.75ul/분 이상, 예를 들어 10.0ul/분 이상이 되도록 배치된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 관류액의 유량은 1ul/분 내지 2ul/분이다. 일 구체예에서, 관류액의 유량은 1ul/분이다. 또다른 구체예에서, 유량은 2ul/분이다.
효소의 유량은 효소의 조합 및 반응 혼합물에서의 최종 목표 농도에 의존한다는 것이 이해될 것이다.
예를 들어, 조성물이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 각각 600U/ml, 200U/ml 및 60U/ml의 양으로 포함하는 경우, pH 8.5의 완충액에서, 효소 혼합물을 첨가하여 본 발명의 효소 혼합물/조성물:투석액의 1:1 및 1:10 사이의 최종 부피비를 생성할 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 효소 혼합물/조성물은 본 발명의 효소 혼합물/조성물:투석액의 1:4의 최종 부피비를 생성하기 위해 첨가된다. 이러한 구체예에서, 관류액의 유량은 2ul/분일 수 있고 본 발명의 효소/조성물의 유량은 0.5ul/분일 수 있다.
당업자는 효소의 농도가 증가 또는 감소하면, 효소 용액 대 관류액의 비가 변할 것임을 이해할 것이다.
사르코신 옥시다제와 사르코신 사이의 반응은 산소를 필요로 한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 시스템은 반응 혼합물에서 산소의 양을 증가시키는 수단을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 수단은 반응 용액에서 산소의 양을 10uM 이상으로 증가시킨다. 예를 들어, 반응 용액에서 산소량을 증가시키는 수단은 25uM 초과, 예를 들어 50uM 초과, 예를 들어 75uM 초과 또는 100uM 초과, 예를 들어 125uM 초과, 예를 들어 150uM 초과, 예를 들어 175uM 초과, 예를 들어 200uM 초과, 예를 들어 225uM 초과, 예를 들어 250uM 초과, 예를 들어 275uM 초과, 예를 들어 300uM 초과, 예를 들어 325uM 초과, 예를 들어 350uM 초과, 예를 들어 375uM 초과, 예를 들어 400uM 초과, 예를 들어 425uM 초과, 예를 들어 450uM 초과, 예를 들어 475uM 초과, 예를 들어 500uM 초과의 산소 농도를 초래한다. 일 구체예에서, 산소의 농도는 약 200uM 내지 250uM이다. http://www.engineeringtoolbox.com/oxygen-solubility-water-d_841.html의 엔지니어링 툴박스(engineering toolbox)는 상압에서 식염수의 산소 농도 범위를 나타낸다 - 압력 1 기압에서 35% 식염수의 225umol O2.
반응 혼합물 중 산소의 양은 여러 방식으로 증가될 수 있으며, 모두 본 발명의 시스템에 포함될 수 있는 것들이다. 예를 들어, 시스템은 배플(baffles) 또는 나선형 구역 또는 예를 들어 용액의 혼합을 증가시키는 임의의 것을 차례로 포함하는 혼합기를 포함할 수 있다. 혼합기는 PDMS와 같은 고 투과성 재료로 만들거나, 고갈된 산소 수준을 '재충전'할 수 있도록 테플론(Teflon) 튜브로 연결된 여러 혼합 단계를 가질 수 있다. 당업자는 투과성이 재료의 고유 투과성 또는 얇은 벽 또는 넓은 표면적, 또는 이들의 조합에 의해 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 일 구체예에서, 반응 혼합물의 산소 함량을 증가시키는 다중 수단, 예를 들어 다중 혼합기 및 테플론으로 이루어진 다중 연결이 사용된다. 추가의 구체예에서, 산소 함량을 증가시키는 수단 또는 다중 수단은 가압 용기에 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 반응 조건의 최적화는 크레아티닌 수준의 매우 민감하고 정확한 측정을 허용한다. 따라서 일 구체예에서, 시스템은 용액 중 4uM 이하의 수준에서 크레아티닌을 검출할 수 있고, 예를 들어 2uM 이하 또는 1uM 이하의 크레아티닌을 검출할 수 있다. 또다른 구체예에서, 센서 시스템은 예를 들어 40uM 내지 120uM의 크레아티닌의 배경 수준에 대해, 1uM 미만, 또는 2uM 미만 또는 3uM 미만 또는 4uM 미만, 또는 5uM 미만 또는 7.5uM 미만 또는 10uM 미만의 크레아티닌의 변화를 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 센서 시스템은 센서로부터 데이터를 수집하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 수단은 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 일례가 PowerLab/4SP이다.
센서 시스템은 또한 일부 구체예에서 데이터를 전송하기 위한 무선 전송 수단, 예를 들어 블루투스 송신기 또는 다른 무선 송신기를 포함할 수 있다.
센서 시스템은 또한 일부 구체예에서 데이터 분석 수단, 예를 들어 컴퓨터 또는 웨어러블 장치를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 데이터 분석 수단은 사구체 여과속도 추정(eGFR)을 계산한다. 바람직한 구체예에서, 센서 시스템은 무선 전송 수단, 데이터 분석 수단 및 무선 전송된 데이터를 수신하는 수단을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 시스템은 또한 적어도 하나의 폐기물 수거 용기를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예는 이동성일 수도 있고 아닐 수도 있는 실시간 모니터이다. 사용하기 쉽도록, 특히 장기 환경 및/또는 가정 환경에서, 반응 후 과산화수소를 감지한 미세투과액은 폐기물로 간주된다. 바람직한 구체예는 이 폐기물이 폐기물 용기에 놓여지는 것으로 본다. 용기는 바람직하게는 예를 들어 3ul/분의 조합된 샘플/감지 시약의 유량으로 매우 작으며, 24시간 동안 4.3ml 미만의 폐기물을 생성할 것이다. 따라서 일 구체예에서 폐기물 용기는 10ml 미만, 예를 들어 9.5ml 미만, 예를 들어 9ml 미만, 예를 들어 8.5ml 미만, 예를 들어 8ml 미만, 예를 들어 7.5ml 미만, 예를 들어 7ml 미만, 예를 들어 6.5ml 미만, 예를 들어 6ml 미만, 예를 들어 5.5ml 미만, 예를 들어 5ml 미만, 예를 들어 4.5ml 미만, 예를 들어 4 ml 미만, 예를 들어 3.5ml 미만, 예를 들어 3ml 미만, 예를 들어 2.5ml 미만, 예를 들어 2ml 미만, 예를 들어 1.5ml 미만, 예를 들어 1ml 미만, 예를 들어 0.5ml 미만, 예를 들어 0.25ml 미만의 부피를 갖는다.
이러한 폐기물 용기는 본 발명의 범위를 벗어난 용도를 가지며 임의의 미세투석법 처리 또는 분석의 맥락에서, 또는 다른 이동 장치와 함께 사용하기에 유용할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 센서 시스템은 이동식이다. 예를 들어, 센서 시스템은 대상이 연결되어야 하는 대형 기계에 대해 완전히 독립적일 수 있거나, 짧은 시간 동안 그러한 기계에 대한 연결을 필요로 할 수 있다.
본 명세서에 기재된 센서 시스템은 신장의 실시간 기능의 정확한 측정을 허용한다. 논의된 바와 같이, 이 정보는 임상의에게 특정 약제, 예를 들어 약물로의 치료를 중단할지 또는 약물 투여량을 조정해야 하는지 알리는 데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 센서 시스템은 약물 펌프와 같이, 약물을 전달하는 수단을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 센서 시스템은 계산된 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율에 기초하여, 약물 펌프의 작동, 즉 전달되는 약물의 양을 자동으로 조정하는 수단을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 필요한 약물의 양의 결정은 임상의의 개입 없이 자동으로 수행된다. 이러한 구체예는 신장 기능이 저하되거나 신장 기능이 손상될 위험이 있는 대상이 집에서 센서 시스템을 사용하여 신장 기능을 모니터링하고 적절한 양의 관련 약물을 투여하는 상황에서 특히 유용한 것으로 여겨진다.
본 발명의 시스템을 사용하여 투여를 조절함으로써 이익을 얻을 수 있는 약물 또는 제제의 예는 특히 신장 제거를 촉진하거나 손상시킬 수 있거나 생체활성이 제거율에 의존하는 모든 신장 제거 약물을 포함한다. 이러한 작용제는 영상화 연구를 위한 조영제를 포함하고, 관련 약물의 예는 면역억제제; 백금제와 같은 화학요법제; 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 및 페니실린과 같은 항균제; 및 몰핀, 디아몰핀 및 코데인과 같은 오피오이드 진통제를 포함한다.
이러한 접근법은 결과가 알려지기 전에, 어떤 시간, 예를 들어 몇 시간이 걸린 샘플을 기초로, 추정된 제거율 측정보다는 실시간으로 실제 신장 제거율 측정에 기초하여 약물의 용량을 개인화할 수 있게 한다.
본 발명의 조성물 또는 센서 시스템은 대상에서 크레아티닌의 정상-상태 수준을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이 수준의 상승은 신장 기능이 손상되고 있음을 나타낼 수 있다. 이 수준의 감소는 또한 다른 임상적 개입이 필요함을 나타낼 수 있다. 따라서, 크레아티닌의 정상-상태 수준의 판독은 유용한 것으로 고려된다.
그러나, GFR의 “실시간" 판독을 얻기 위해, 한 구체예에서 대상에게 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신을 투여하여, 이 인공적으로 유도된 크레아티닌 스파이크의 제거율을 측정하고, 신장에서 혈액으로부터 이를 제거하는 능력을 시험한다. 이러한 방법은 정상-상태 크레아티닌 수준에 영향을 줄 수 있는 인자에 영향을 받지 않기 때문에, 유리한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 크레아티닌 수치가 높으면 크레아티닌 생성이 증가하고 신장 기능이 저하되어 있지 않을 수 있다. 샘플 내 작용제의 분석 방해 또는 크레아티닌의 세뇨관 분비 감소에 의해 수치가 영향을 받을 수 있다. 혈청 크레아티닌의 증가는 또한 조리된 고기(요리의 열에 의해 크레아틴으로부터 전환된 크레아티닌 함유)의 섭취 증가 또는 운동 성능을 향상시키기 위해 섭취된, 단백질 및 크레아틴 보충제의 과도한 섭취에 기인할 수 있다. 강렬한 운동은 근육 파괴를 증가시켜 크레아티닌을 증가시킬 수 있다. 여러 약물과 크로모겐(chromogen)이 분석을 방해할 수 있다. 세뇨관에 의한 크레아티닌 분비는 일부 약물에 의해 차단되고, 다시 측정된 크레아티닌을 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 센서 시스템은 또한 예를 들어 규칙적인 간격으로, 대상에게 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신을 투여하는 수단을 포함할 수 있다. 임의의 양의 크레아티닌이 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 투여되는 크레아티닌의 양은 기준 수준을 10% 내지 250%, 예를 들어 20% 내지 230%, 예를 들어 30% 내지 210%, 예를 들어 40% 내지 200%, 예를 들어 50% 내지 190%, 예를 들어 60% 내지 180%, 예를 들어 70% 내지 170%, 예를 들어 80% 내지 160%, 예를 들어 90% 내지 150%, 예를 들어 100% 내지 140%, 예를 들어 110% 내지 130%, 예를 들어 120% 증가시키기에 충분하다.
투여되는 크레아티닌의 양이 기준 크레아티닌 수준의 2배로 수준을 증가시키기에 충분한 경우 특히 유용한 것으로 여겨진다.
당업자는 신장 기능이 심각하게 손상된 대상이 소량의 외인성으로 투여된 크레아티닌을 제거하는데에 어려움을 겪을 것이며, 건강한 신장을 가진 대상은 상대적으로 빠르게 외인성으로 투여된 크레아티닌을 다량으로 제거할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 필요한 분석이 이루어질 수 있도록 대상에게 투여하기에 적절한 양의 크레아티닌을 결정할 수 있을 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 크레아티닌, 크레아틴 및/또는 사르코신은 임상의의 개입없이 자동으로 투여된다. 이러한 구체예는 신장 기능이 저하되거나 신장 기능이 손상될 위험이 있는 대상이 집에서 센서 시스템을 사용하여 신장 기능을 모니터링하고 적절한 양의 관련 약물을 투여하는 상황에서 특히 유용한 것으로 여겨진다.
내인성 크레아틴 및 사르코신에 의해 생성된, 즉 크레아티닌으로부터 직접 유래되지 않은 약간의 과산화수소가 있을 수 있음이 이해될 것이다. 크레아티닌 수준 측정의 정확성을 향상시키기 위해, 당업자는 이러한 배경 수준을 고려할 수 있다. 일 구체예에서, 센서 시스템은 제2 센서 및 제2 샘플을 얻기 위한 제2 수단을 포함하도록 배치된다. 이 구체예에서, 제2 샘플은 제2 센서에서의 검출 전에 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제(즉, 크레아티니나제 없음)를 포함하는 제2 감지 시약과 접촉된다. 위에서 논의된 바와 같이, 반응이 진행되도록 허용된 효소 농도, 비율 및 시간은 모두 가장 높은 민감도를 제공하도록 최적화될 수 있다. 일 구체예에서, 센서 시스템은 감지 시약을 제2 샘플에 첨가하고 제2 센서와 접촉하는 것 사이에 10분 이상이 있도록 배치된다. 일 구체예에서, 센서 시스템은 본 발명의 효소 또는 조성물을 샘플에 첨가하고 센서와 접촉하는 사이에 10분 이상, 예를 들어 9.5분 이상, 예를 들어 9분 이상, 예를 들어 8.5분 이상, 예를 들어 8분 이상, 예를 들어 7.5분 이상, 예를 들어 7분 이상, 예를 들어 6.5분 이상, 예를 들어 6분 이상, 예를 들어 5.5분 이상, 예를 들어 5분 이상, 예를 들어 250초 이상, 예를 들어 225초 이상, 예를 들어 200초 이상, 예를 들어 190초 이상, 예를 들어 180초 이상, 예를 들어 170초 이상, 예를 들어 160초 이상, 예를 들어 150초 이상, 예를 들어 140초 이상, 예를 들어 130초 이상, 예를 들어 120초 이상, 예를 들어 110초 이상, 예를 들어 100초 이상, 예를 들어 90초 이상, 예를 들어 80초 이상, 예를 들어 70초 이상, 예를 들어 60초 이상, 예를 들어 50초 이상, 예를 들어 40초 이상, 예를 들어 30초 이상, 예를 들어 20초 이상 예를 들어 10초 이상, 예를 들어 5초 이상, 예를 들어 2초 이상, 예를 들어 1초 이상이 되도록 배치된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 센서 시스템은 또한 제1 센서로부터 획득된 데이터로부터 제2 센서로부터 획득된 데이터를 감산하는 수단을 포함한다. 이러한 방식으로 크레아티닌 수준의 진정한 측정이 달성된다. 그러나, 내인성 크레아틴 및 사르코신으로부터 생성될 수 있는 과산화수소의 배경 수준을 결정하는 것이 필수적인 것으로 고려되지는 않는다. 이 수준은 낮고 일반적으로 중요하지 않은 것으로 고려된다. 또한, 본 발명은 크레아티닌의 상대적 양이 측정되게 하고, 즉 특정 대상 내에서 그 변경을 허용한다. 크레아티닌의 실제 물리적 양은 예를 들어 약물 투여 후에 감지된 크레아티닌 양의 상대적인 변화만큼 중요하지는 않은 것으로 고려된다.
관형 크레아티닌 분비는 크레아티닌의 전체 총량에 기여하는 것으로 알려져있다. 이를 더 정정하기 위해, 시스템은 약물 시메티딘(cimetidine)이 또한 반응 전에 대상에게 투여되어 크레아티닌 수준을 측정하도록 배치될 수 있다. 시메티딘은 크레아티닌의 세뇨관 분비를 억제하는 것으로 여겨진다. 이 경우 반응속도는 완전 1차이며 혈액에서 크레아티닌의 양은 기능하는 네프론에만 의존한다.
본 발명의 실제 장점 중 하나는 신장 기능을 실시간으로 모니터링하는 능력의 실현이라는 것이 이해될 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 센서 시스템은 데이터를 연속적으로 캡처한다. 예를 들어, 센서 시스템이 미세유체를 포함하는 경우, 일 구체예에서 본 발명의 감지 시약은 대상으로부터 미세투석액 스트림으로 연속적으로 유동된다. 반응 혼합물이 센서에 도달할 때까지 걸리는 경로의 길이를 변경하여 간단하게 설정할 수 있는 적절한 반응 시간에 따라(바람직하게는 상기 논의된 바와 같이, 반응 혼합물에서 산소 농도를 증가시키는 하나 이상의 혼합기 및/또는 하나 이상의 성분을 통해), 과산화수소의 양을 측정한 다음, 샘플에서 크레아티닌의 양을 측정하고 필요한 경우 GFR을 계산하는 데 사용한다. 이는 연속적일 수 있으며 대상 크레아티닌 수준을 실시간으로 연속적으로 읽을 수 있게 한다.
또는, 크레아티닌 수준의 연속적인 판독은 불필요하다고 고려될 수 있고 상이한 불연속 시점으로부터의 데이터가 충분한 것으로 고려될 수 있다. 분석물의 흐름은 연속적일 수 있지만, 데이터의 샘플링은 연속적이거나 연속적이지 않을 수 있다. 데이터의 샘플링이 연속적이지 않은 경우에도 효과적인 연속 데이터 스트림을 위해 충분히 빠르게 일어날 수 있다. 예를 들어, 센서로부터의 판독값은 대략 200 Hz에서 디지털화될 수 있다. 샘플은 10 Hz의 낮은 주파수에서 디지털화될 수 있으며 여전히 효과적으로 연속적인 데이터 스트림을 제공한다. 센서의 판독값은 200 Hz보다 훨씬 빠른 속도로 디지털화될 수 있다. 그러나 특정 비율에서 얻은 데이터의 유용성에는 한계가 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 데이터는 대사산물 또는 분자 수준의 변화를 신속하게 감지할 수 있을 정도로 충분히 높은 속도로 얻어야 하지만, 데이터 분석 시스템을 압도할 수 있는 너무 많은 비-유용한 데이터를 생성하므로 속도가 그리 크지 않을 수 있다. 예를 들어 10 초마다의 판독값이 허용가능한 것으로 고려되거나 10 초마다 평균 판독값으로 간주되어 연속적으로 획득된 데이터의 평균을 제공한다.
따라서, 일 구체예에서, 센서 시스템은 적어도 24 시간마다 또는 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다, 예를 들어 적어도 0.5 초마다 데이터를 캡처한다.
본 발명의 일 구체예에서, 획득된 데이터는 특정 간격의 평균 판독값, 예를 들어 적어도 24 시간마다, 예를 들어 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다 예를 들어 적어도 0.5 초마다의 평균 판독값이다.
현재 임상 실습은 하루에 세 번 신장 기능을 분석하는 것이다. 따라서 일 구체예에서, 센서 시스템은 하루에 세 번, 예를 들어 8 시간마다 데이터를 캡처한다.
데이터 캡처는 정기적으로 발생하거나 불규칙할 수 있다. 예를 들어, 데이터 캡처는 위험이 증가할 때, 예를 들어 약물 투여 후 더 빈번하게 발생할 수 있으며, 위험이 적은 시간은 덜 빈번할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 센서 시스템은 데이터를 데이터 분석 수단으로 전송하는 무선 송신기를 포함할 수 있다. 데이터 캡처와 마찬가지로, 데이터의 전송은 연속적이거나 규칙적이거나 불규칙적인 간격일 수 있다. 예를 들어, 데이터는 적어도 24 시간마다, 예를 들어 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다 예를 들어 적어도 0.5 초마다 전송될 수 있다.
위에서 언급했듯이, 현재 임상 실습은 하루에 세 번 신장 기능을 분석하는 것이다. 따라서 일 구체예에서, 센서 시스템은 하루에 세 번, 예를 들어 8 시간마다 데이터를 전송한다.
본 발명의 일 구체예에서, 요소 수준을 모니터링하는 것이 유용한 것으로 여겨진다. 따라서 일 구체예에서, 시스템은 요소 수준을 측정하는 수단을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 또한 우레아제를 포함하여 요소의 검출을 가능하게하는 것이 유용한 것으로 여겨지지만, 당업자는 이 반응이 전기화학 물질을 생성하지 않으므로 시스템은 또한 암모니아와 CO2의 생성으로 인한 pH의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 조성물은 또한 요산을 소화시키고 시스템에서 하나 이상의 센서를 사용하여 검출될 수 있는 전기화학 물질을 생성하는 우리카제를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 시스템은 또한 시스타틴 C 및 알부민을 검출하는 수단을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 최적의 효소 활성을 위한 다양한 다른 성분 및 파라미터와 함께 임의의 2개 이상의 크레아티니나제, 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제를 포함하는 다양한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 조성물과 동일할 수 있거나 대신 순차적 사용을 위해 별도의 용기에서 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함할 수 있는 감지 시약 외에, 대상의 크레아티닌 수준의 실제 측정에 유리한 것으로 여겨지는 성분을 포함하는 센서 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 센서 시스템을 사용하는 다양한 방법을 제공한다. 상기 논의된 본 발명의 조성물, 감지 시약 및 센서 시스템의 다양한 특징에 대한 선호도 또한 아래에서 적용된다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준의 측정 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 샘플은 투석액 또는 미세투석액이다.
크레아티닌의 수준은 사구체 여과율(GFR)을 측정하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 본 발명은 또한 인간 또는 동물 대상에서 GFR을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 샘플은 투석액 또는 미세투석액이다.
본 발명은 크레아티닌 수준의 실시간 측정을 특출하게 허용하기 때문에, 본 발명은 또한 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준, 또는 크레아티닌 제거율 또는 GFR의 실시간 측정 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 센서 시스템의 조성물의 사용을 포함하며, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액이다.
방법에 대한 선호는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 센서 시스템과 관련하여 위에서 논의된 선호를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 방법에서, 일 구체예에서 본 발명의 조성물 또는 3 개의 개별 효소는 샘플을 센서와 접촉시키기 전에 첨가된다. 또다른 구체예에서, 대상에게 크레아티닌의 양이 투여되고 제거율이 측정된다. 또한 상기 논의된 바와 같이, 약물 시메티딘은 또한 크레아티닌 수준의 측정 전에 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 센서 시스템이 진단 방법에 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 따라 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율을 측정하는 단계를 포함하는, 급성 또는 만성 신장 질환을 앓고 있는 대상을 진단하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 크레아티닌의 정상-상태 수준이 상승하기 시작하면, 대상은 신장 손상 및 신장 기능 장애를 겪기 시작할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 이전 양의 크레아티닌을 투여했을 때의 제거율이 빠르지 않은 경우, 일정량의 크레아티닌을 투여한 후, 대상은 다시 신장 손상을 입을 수 있다.
이러한 진단 후, 상기 방법은 또한 대상을 급성 또는 만성 신장 질환을 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 여기에는 급성 또는 만성 신장 질환에서 사용이 금지되어 있거나 위험한 약물의 복용으로의 치료를 중단하거나 복용량을 줄이는 것이 포함되거나, 최근에 투여되어 신장 기능 장애에 책임이 있는 것으로 여겨지는 약물의 복용으로의 치료를 중단하거나 복용량을 줄이는 것이 포함될 수 있다.
예를 들어, 오피오이드 진통제 특히 몰핀, 디아몰핀, 코데인 및 백금제와 같은 화학요법제는 본 발명의 방법을 사용하여 신장 기능의 측정 후에 투여가 조절될 수 있는 약물로 고려된다. 다른 약물들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 http://www.eastmidlandscancernetwork.nhs.uk/Library/RenalDosageAdjustments.pdf는 여러 약물의 GFR에 따른 권장 복용량 조정에 대해 자세히 설명한다.
예를 들어, 시타라빈(cytarabine)은 GFR이 30ml/min 미만으로는 완전히 사용이 금지된다(CI). 본 발명에 의한 크레아티닌 수준의 검출의 정확성 및 민감도는 이들 환자가 치료를 완전히 중단하는 대신에, 이 유용한 약물의 개인화된 투여량을 수용할 수 있게 할 수 있다.
다른 이러한 약물에는 항생제, 예를 들어 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 또는 증가하는 용량의 페니실린이 포함된다. 자세한 내용은 https://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0ahUKEwjQh5v63JDVAhVgOMAKHSnrByUQFggtMAE&url=https%3A%2F%2Fwww.nuh.nhs.uk%2Fhandlers%2Fdownloads.ashx%3Fid%3D60983&usg=AFQjCNFrkdOqgEItY0E8rSWu4GJmTbRgOQ에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 대상에게 투여될 약물의 용량을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 약물의 투여 전 및 적어도 약물의 투여 후 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율을 측정하는 단계를 포함하며, 선택적으로 약물의 투여 전후의 크레아티닌 수준/제거율/사구체 여과율을 비교하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 것과 같은 약물의 용량을 조정하는 방법 또한 약물 시험에 유용한 것으로 고려된다.
본 발명은 또한 대상 단독의 기준 크레아티닌 수준에 기초하여 대상에게 투여될 약물의 용량을 결정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 대상이 높은 수준의 혈액 크레아티닌을 갖는 것으로 고려되는 경우, 약물의 용량은 감소되거나 전혀 투여되지 않을 수 있다.
또는, 상기 방법은 또한 약물 투여 후 크레아티닌 수준이 정상 상태를 유지하는 경우 약물 용량을 유지 또는 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법들은 만성 신장 질환이 있는 것으로 대상을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 만성 신장 질환은 일반적으로 장기간에 걸친 높은 수준의 크레아티닌에 기초하여 진단된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 반복되며, 예를 들어 크레아티닌 수준의 측정 및 GFR은 센서 시스템과 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 연속적으로 또는 규칙적이거나 불규칙적인 간격으로 이루어질 수 있다. 방법이 수행되어야 하는 빈도는 목적에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 대상이 신부전 위험이 있는 것으로 고려되는 경우 매우 빈번하게 수행될 수 있거나, 대상이 신부전 위험이 증가된 것으로 고려되지 않는 경우 덜 빈번하게 수행될 수 있다. 약물의 복용량은 정기적으로 또는 실시간으로 조정할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 상황에서 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신의 “스파이크(spike)”를 대상에게 투여하여, 크레아티닌 제거의 반응속도를 관찰하는 것이 유리하다. 예를 들어 크레아티닌 수준(예시)이 기준 수준으로 돌아가는 데 걸리는 시간은 신장의 기능을 나타낸다. 이러한 상황에서, 크레아티닌 투여 직후 크레아티닌(또는 경우에 따라 크레아틴 또는 사르코신) 수준을 모니터링하는 것이 유리하다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 임의의 방법은 대상, 예를 들어 혈액 샘플 또는 혈장 또는 소변 샘플, 또는 뇌척수액의 조직액으로부터의 임의의 유형의 샘플에 대해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 샘플은 예를 들어 혈액, 소변, 조직액 또는 뇌척수액 중 어느 것으로부터의 투석액 또는 미세투석액이다.
본 발명의 방법은 기준 샘플, 예를 들어 공지된 크레아티닌 농도의 기준 샘플과 분리하여, 신장 기능, 즉 본 발명에 의해 측정된 크레아티닌 수준에 기초한 GFR을 결정하는 데 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 일 구체예에서, 예를 들어 약물의 투여 여부 또는 투여할 약물의 양을 결정하는 데 사용되는 크레아티닌 수준 또는 계산된 GFR의 상대적인 변화는 그 대상의 신장 기능의 상대적 변화에만 기반한다. 예를 들어, 기준 크레아티닌 수준이 증가하기 시작하면, 대상은 신장 기능 장애의 징후를 나타내는 것으로 고려된다. 또는 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신으로 스파이킹(spiking) 한 후, 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신이 제거되는 속도는 이전 테스트에서 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신이 제거되는 속도보다 낮다.
그러나, 일부 구체예에서, 측정된 수준의 크레아티닌 또는 계산된 GFR은 공지된 크레아티닌 농도의 기준 샘플과 비교되므로 또다른 구체예에서 본 발명은 신장 기능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 샘플을 청구항에서 정의된 바와 같은 조성물 또는 감지 시약과 접촉시키는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 샘플에서 크레아티닌의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 선택적으로 기준 샘플 또는 알려진 기준 농도와의 비교를 추가로 포함하며, 선택적으로 상기 방법은 선택적으로 전기화학 센서의 사용, 선택적으로 전류측정에 의한 H2O2 수준의 검출을 포함한다.
실시간 모니터링이 없는 경우에도(본 발명으로 인해 현재는 가능함), 본 발명은 현재 실제로 사용되는 바와 같이, 예를 들어 크레아티닌 수준의 단일 측정에 유용한 것으로 고려된다. 이 경우, 대상 샘플과 기준 샘플, 또는 대상 샘플이 유용한 정보를 제공하기 위해 비교될 수 있는 다른 공지된 샘플 세트와 비교하는 것은 적절한 것으로 고려된다. 따라서 일 구체예에서, 본 발명은 샘플에서 크레아티닌의 농도를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물 또는 감지 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 예를 들어 전기화학 센서를 사용하여, 예를 들어 전류측정에 의해 H2O2의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 기준 샘플 또는 공지된 기준 농도와의 비교를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제는 모두 유리 용액에 있다. 상기 논의된 바와 같이, 효소는 대상 샘플에 개별적으로 첨가될 수 있거나, 즉 상기 감지 시약과 관련하여 논의된 바와 같이, 또는 예를 들어 본 발명의 조성물을 사용하여 둘 이상의 효소가 동시에 첨가될 수 있다. 또다른 구체예에서, 3개의 효소 모두가 동일한 조성물의 일부이므로, 3개의 효소 모두가 대상 샘플에 동시에 첨가된다. 감지 시약에도 적용되는 상기 논의된 조성물의 선호도, 예를 들어 완충액 선택, PBS가 아닌 완충액, pH 및/또는 pKa 선택은 모두 이(및 다른 모든) 구체예에 적용된다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 크레아티닌 농도의 상대 변화를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 하나 이상의 시점에서 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 기준 샘플 또는 공지된 기준 농도와 비교하는 것을 포함한다.
당업자는 본 명세서에 기술된 조성물, 감지 시스템 및 방법이 또한 장기 이식 분야에서 유용하다는 것을 이해할 것이다. 이식 전에 분리된 신장의 기능을 모니터링하여 신장 기능이 저하되기 시작하는 경우 다양한 조정을 할 수 있다면 유익한 것으로 고려된다.
본 발명은 이식을 위한 신장에 기초하여, 개념의 증명을 뒷받침하는 데이터를 본 명세서에서 제공하였다. 그러나 폐쇄-루프 관류 시스템(closed-loop perfusion system)에 특정 작용제를 첨가하고 장기 기능의 지표로서 대사산물의 제거 또는 전환을 모니터링하는 방법은 광범위하게 적용가능하며 대사산물이 있는 모든 장기에 적용될 수 있다고 고려되고, 그 생산 또는 감소를 모니터링 할 수 있다.
예를 들어, 이식에서 사용하기 위한 폐(즉, 대상으로부터 얻은 폐)의 기능은 이산화탄소 제거를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 이러한 상황에서, 부분 표본의 이산화탄소를 관류 시스템에 첨가하고 이산화탄소의 제거 속도를 모니터링할 수 있다. 당업자는 본 발명의 조성물이 이산화탄소 수준의 측정에 유용한 것으로 고려되지 않지만, 당업자는 예를 들어 혈액에서 이산화탄소의 수준을 측정하는 방법을 잘 알고있을 것이며, 이는 관류액에서의 이산화탄소 검출에 직접 적용될 수 있다. 그러한 접근법은 본 명세서에 제시된 작용에 기초하여 작동하는 것이 가능하다고 여겨진다.
유사하게, 간 기능의 수준은 폐쇄-루프 시스템에 헴(haeme)을 첨가함으로써 측정될 수 있고 빌리루빈(bilirubin)의 생산이 모니터링될 수 있으며, 이는 특정 시간에서의 간 기능의 직접적인 지표를 제공한다.
예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 이식 기관, 예를 들어 대상으로부터 이전에 취해진 이식 기관을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 건강한 기관에 의해 정상적으로 대사되는 작용제를 분리된 이식 기관에 투여하는 것을 포함하고, 이어서 상기 작용제의 수준 또는 상기 작용제의 대사산물을 측정하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 측정은 본 발명의 조성물, 센서 시스템 또는 방법의 사용을 추가로 포함한다. 바람직하게는 기관은 폐쇄-루프 시스템에 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 기관은 신장이므로, 본 발명은 대상으로부터 이전에 취해진 이식 신장을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 분리된 이식 신장에 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신을 투여하고 이어서 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신의 수준을 측정하는 것을 포함하고 여기서, 상기 측정은 본 발명의 조성물, 센서 시스템 또는 방법의 사용을 추가로 포함한다. 바람직하게는 신장은 폐쇄-루프 시스템에 있다.
이러한 시스템에서, 크레아티닌, 크레아틴 또는 사르코신이 투여되는 상기 논의된 "스파이크(spike)" 접근법 및 그 후 측정된 제거율이 적절한 것으로 고려된다.
본 발명의 조성물, 시스템 및 방법은 또한 유리피판술(free flap surgery)을 위한 이식의 모니터링에 유용한 것으로 고려된다. 손상된 근육 조직은 크레아티닌 및 칼륨을 누출하므로, 본 발명은 이식이 악화되고 있음을 나타내는 크레아티닌의 잠재적인 증가를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
이식된 기관을 포함하는 모든 방법에 대해, 바람직하게는 기관의 기능, 예를 들어 신장을 측정하는 데 관여되는 방법이 반복되고, 예를 들어 적어도 24 시간마다, 예를 들어 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다 예를 들어 적어도 0.5 초마다 규칙적으로 반복될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 이식을 위해 신장을 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 신장을 관류시키고 시스템에 일정량의 크레아티닌을 투여하는 단계 및 본 발명의 조성물 및/또는 시스템을 사용하여 크레아티닌 제거율을 측정하는 단계를 포함한다.
당업자는 해당 기관의 번역 후 대상에서 기관의 기능을 모니터링함에 있어서 본 발명의 유용성을 명확하게 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 이식 수용자의 신장 기능 모니터링 방법을 제공하며, 여기서 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 GFR 및/또는 신장 기능은 본 명세서에 기술된 조성물, 센서 시스템 및/또는 방법 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 측정된다.
본 발명은 또한 분리된 신장의 수명을 연장시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 청구항 중 어느 한 항의 조성물, 센서 시스템 및/또는 방법을 사용하여 신장 기능을 모니터링하는 단계를 포함하고, 선택적으로 신장 기능이 감소하기 시작하면 분리된 신장의 수명을 늘리기 위해 산소 전달, 온도, 압력 및 유량과 같은 파라미터가 수정된다. 이식 장기의 수명을 연장하는 방법에 대한 연구가 진행 중이고 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법은 본 연구의 종점을 확인하는 데 유용한 것으로 고려되며, 수명을 개선시키기 위해 약물을 개발하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물, 센서 시스템 및 방법은 다양한 부품 키트로 제공될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서 본 발명은:
크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 임의의 둘 또는 모두; 및/또는
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 조성물; 및/또는
크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신; 및/또는
적어도 하나의 폐기물 용기;
완충액, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충액, 예를 들어 PBS가 아닌 완충액 및/또는
미세투석 프로브; 및/또는
적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 개의 정밀 펌프를 포함하는 키트를 제공한다.
본 명세서에서 명백하게 우선-공개된 문서의 목록 또는 논의가 반드시 해당 문서가 최신 기술의 일부이거나 일반적인 상식으로 고려되어서는 안된다.
본 발명의 주어진 양태, 특징 또는 파라미터에 대한 선호도 및 옵션은, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 본 발명의 모든 다른 양태, 특징 및 파라미터에 대한 임의의 그리고 모든 선호도 및 옵션과 조합하여 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 pH 8.5 및 관류액 유량 4ul/분 및 효소/조성물 유량 0.5ul/분의 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 예시될 것이다.
도면의 설명
도 1. 50μm 전극을 사용하여 pH 7.0 - 8.0에서 10mM PBS 중 30U/ml SAO 비교.
도 2. 8x25μm 전극 어레이(array)를 사용하여 pH 7.5의 100mM PBS, pH 8.0의 50mM EPPS 및 pH 9.0의 50mM 붕산염을 30U/ml SAO와 비교하여, EPPS에서 1mM 사르코신에서 거의 3배 전류가 발생함을 나타낸다.
도 3. 다양한 완충액에서 30U/ml SAO 대 100uM 사르코신의 연속 희석 실험에서 얻은 표준화된 전류 응답 프로파일로서, 이 시스템에 대한 트리스(Tris) 및 보레이트(Borate) 완충액의 부적합성을 보여준다. 시간(분).
도 4. 100μM 크레아티닌의 효소 분해에서 신호의 정규화된 시간 진화를 보여주는 최종 효소 최적화 실험 중 하나. 모든 효소량은 Units/ml임. pH 3.0의 완충되지 않은 NaCl의 리딩 에지(leading edge)로 인한 작은 동요(small perturbation)(*)에 유의한다.
도 5. 잘-교반된 T1에서 표준 첨가하여 얻은, 잘 희석된 탈섬유소된 말 혈액(defibrinated horse blood)으로부터의 평행 샘플링 그래프로, 2μl/분에서의 미세투석에 대한 크레아티닌 교정 그래프. 둘 다 힐 방정식(Hill Equation)에 오토-피팅(auto-fitting)하여 구해진다.
도 6. 12 시간 동안 미세투석 샘플링 시스템의 안정성 테스트. 40 분마다(0.5μl/분으로 20μl) 효소 펌프 재충전으로 인한 스파이크에 유의한다. 효소 저장소가 소진된 12 시간을 넘어서서 실험을 종료하였다.
도 7. 아스코르브산(Asc), 요산(Uric) 및 파라세타몰(Para)에 의한 간섭 테스트. 라벨 아래의 값은 누계 농도이다. 요산의 농도는 20℃에서 물에 대한 최대 용해도로부터 추정되었다.
도 8. 용액에서 다른 수준의 크레아티닌으로 100ml/분 크레아티닌 제거율 시뮬레이션. 점선은 속도 상수와 반감기가 도출된 지수 곡선을 보여준다.
도 9. 100ml/분 - 25ml/분의 크레아티닌 제거율과 대응하는, CKD1 - CKD4의 다양한 정도의 신장 기능장애를 시뮬레이션하기 위한 희석 실험 결과.
도 10. Waters RM3 냉류 관류 시스템은 외부 막 산소공급기 및 열 교환기(사진 밖)와 함께 온혈 관류를 위해 구성되었다. 미세투석 시스템은 초기 교정을 완료하고 신장이 도착하기를 기다리고 있다.
도 11. 회색: 미세투석 시스템의 원시 신호는 RM3 펌프의 전기 스파이크를 정기적으로 나타냄. 검은색: Savitsky-Golay 스무딩 필터(smoothing filter)를 데이터에 적용한 결과.
도 12. 실제 혈액-관류 돼지 신장에서 테스트중인 시스템의 시-계열 이미지. 활발한 관류 실험의 결과는 초기 안정기 단계에 이어 산소화에 따른 신호 크기의 꾸준한 감소와 두 개의 후속 크레아티닌 테스트를 나타냄.
도 13. 누계 완충액으로서 a) pH 7.5, b) pH 8.0 및 c) pH 8.5에서 pH 3.0 50mM EPPS의 NaCl에서 100uM 크레아티닌의 소화.
도 14. pH 3.0의 NaCl 중 100uM 크레아티닌의 소화. a) 크레아티니나제:크레아티나제:사르코신 옥시다제- 150:300:60, b) 크레아티니나제:크레아티나제:사르코신 옥시다제- 300:300:60 및 c) 크레아티니나제:크레아티나제:사르코신 옥시다제- 600:300:60.
도 15. 누계 완충액으로서 a) pH 7.5, b) pH 8.0 및 c) pH 8.5에서 pH 3.0, 50mM EPPS의 NaCl에서 크레아티닌의 소화.
도 16. pH 3.0의 NaCl의 크레아틴 소화. a) 크레아티나제 대 SOA 비율=150:60, b) 크레아티나제 대 SOA 비율=180:60 및 c) 크레아티나제 대 SOA 비율=300:60.
도 17. a) 50mM EPPS에서 100uM 사르코신의 소화 및 b) 100uM 크레아티나제를 소화할 때 상이한 농도의 크레아티나제 대 사르코신 옥시다제에 대한 신호 반응 대 시간.
도 18. 용해도 표.
도 19. 크레아티닌의 3-효소 전류측정 검출에 대해 문헌에 기재된 실험 조건의 요약. CA = 크레아티니나제, CI = 크레아티나제, SO = 사르코신 옥시다제, 예비 용액에서 U/ml로 정규화되었으며, 여기서 1 Unit은 분당 1 μmol의 기질 전환을 촉매한다. 전극의 *U/cm2. **U/전극. ***mg의 효소는 전환이 불가능함.
실시예
실시예 1-설계 요건
전반적인 설계 개념은 대상, 예를 들어 환자의 분리된 관류 신장의 혈액 또는 소변에서 정상적인 크레아티닌 농도를 지속적으로 샘플링하고 분석하기 위한 휴대용, 저비용, 대부분의 턴키(turn-key), 미니어처 시스템을 만드는 것이었다. 이를 위해서는 혈액에 대해 60μm - 120μm에서 소변의 7 - 16mM 사이의 농도를 감지할 수 있는 시스템이 필요하다(아래 표 1.1). 이 혈액 크레아티닌 농도는 혈당 농도의 1/25 - 1/50에 불과하며, 현재 임상 환경에서 지속적인 실시간 크레아티닌 모니터링이 가능한 시스템은 없다[33].
경험을 통해 설계 과정 초기 단계에서 반응 생성물의 검출 방법을 고려하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있다. 크레아티닌 데이미나제에 대한 반응 체계 및 Tsuchida와 Yoda의 보다 복잡한 3 단계 공정은 둘 다 전기화학 또는 분광광도계 정량에 적합한 종을 생성한다. 이 두 가지 중에서, 전기화학적 방법은 소규모에서 광학 경로-길이의 문제와 비색 또는 흡수-기반 검출에 필요한 단색 광원의 생성 및 안정성으로 인해 소형화에 더 적합하다.
실시예 2-실시간 분석 시스템 개발
실험실 내에서 개발된 포도당 및 젖산염 샘플링 시스템은 미세투석, 미세유체 및 전류측정 감지의 조합을 활용하여 강력한 연속-흐름 실시간 분석 시스템을 만든다(예: WO 2016189301 참조).
전류측정 센서
본 발명의 실험실은 이전 박사 연구원인 Dr. Chu Wang이 설계한 전위차계를 사용한다[58]. 이는 트랜스임피던스 증폭기로 OPA129(Texas Instruments Inc., Dallas, Texas, USA)를 사용하는데, 이는 최대 입력 바이어스 전류는 100fA, 전류 잡음 지수는 0.1fA/
, 차동 입력 임피던스는 1013Ω이다. 이 설계에서, 전압 설정점은 트랜스임피던스 증폭기의 입력에서 발생가능한 잡음을 최소화하기 위해, 작동 전극에서의 방향 편향이 아니라 PowerLab 데이터 수집 시스템에서 상대-전극에 역 전압으로 적용된다. 회로의 서보(servo) 부분은 120μN의 저전압 오프셋, 1μV/℃의 오프셋 전압 드리프트, 1013Ω의 차동 입력 임피던스, 16Ω의 출력 임피던스 및 11MHz의 이득 대역폭 곱을 갖는 OPA140(Texas Instruments Inc., Dallas, Texas, USA)을 사용한다.
전기중합 m-페닐렌디아민(mPD)으로 표면 보호
바늘 미세전극을 제조할 때의 최종 단계는 작업 전극을 오염으로부터 보호하고 H2O2 규모의 분자만이 표면에 도달하도록 하는 것이다. 이 기술은 나피온[64], 폴리피롤[65] 및 폴리페놀[66]의 필름을 포함하여, 문헌에 존재하는 바이오센서를 형성하기 위해 전극 표면에 의해 효소를 포획하는 데 사용되는 중합체 필름의 다수의 보고로부터 발전되었다.
이들 중 가장 안정적이고 균일한 것은 인시튜(in-situ) 전기중합에 의해 형성된다. 이러한 방식으로 최종 필름의 정확한 위치, 속도 및 두께를 제어할 수 있다. 본 발명자들은 메타-페닐렌디아민(mPD)[67]을 중합하는 것이 작동 전극의 표면에 밀접하게 부착되고 페로센(ferrocene) 또는 생물학적 시스템에서 일반적으로 발견된 이들(우수한 반응 시간(< 1초)을 주기에 충분한 속도로 H2O2를 여전히 허용하면서 아스코르베이트, 요산염 또는 파라세타몰(N-(4-히드록시페닐아세트아미드))과 같은 더 큰 간섭 산화환원 종이 전극 표면에 도달하는 것을 방지하기에 충분히 조밀한 재현가능한 박막을 생성한다는 것을 발견하였다.
이 방법은 간단하다. 바늘 미세전극을 pH 7.4에서 10mM 포스페이트 완충 식염수 중 mPD의 100mM 용액 내에 현탁시키고, 전류가 점근적으로 낮은 수준으로 감소할 때까지 +0.7V(vs. AgIAgC1)의 전압을 작동 전극에 20 분 동안 가한다. 이어서, 공기 건조시키기 전, 전극을 추가로 2-5 분 동안 0V로 유지시킨 후, dH2O로 헹구었다. 그 후, mPD 층의 품질은 주기적 전압전류법으로 점검되는데, 여기서 양호한 결과는 동일한 산화 및 환원 프로파일로 은 오염의 증거가 없는 경우, 신호 피크의 크기를 95% 감소시킨 것으로 고려된다.
실시예 3- 3 효소 시스템 최적화
모든 실험은 Toyobo(Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)로부터 효소를 공급하는 Sorachim(Sorachim SA., Lausanne, Switzerland)으로부터 구매한 효소 크레아티니나제(CNH-311; EC 3.5.2.10; 259U/mg), 크레아티나제(CRH-221; EC 3.5.3.3; 9.18U/mg) 및 사르코신 옥시다제(SAO-351; EC 1.5.3.1; 13.3U/mg)를 사용하였다.
이 정제 과정은 완료하는 데 수 개월이 걸렸으며, LabSmith 미세유체 시스템의 최적 범위의 효소 혼합물, 완충액 및 레이아웃을 탐색하여 저농도에서 크레아티닌을 강력하게 검출할 수 있었다.
효소 반응의 선택 및 최적화에 관한 문헌을 검토한 후 3 가지 주목할만한 경향이 있었다. 첫째, 대다수의 연구자들은 다양한 형태의 전극에 직접 적용되는 기질에 내장된 효소와 함께 바이오센서를 사용하고 있었다. 둘째, 센서를 생성하는 데 사용되는 특정 양의 효소의 일관성이나 그로부터 유도된 검출 한계는 거의 없었다. 셋째, 지난 33년 동안 이 시스템에 대한 모든 연구에서 PBS(phosphate buffered saline)를 누계 완충액으로 사용하였다(도 19 참조).
도 19에 제시된 자료들 중에서, [73]과 [74]만이 각각 일련의 효소 반응 층과 함께 분광광도법과 흐름-주입-분석을 대신하여, 바이오센서를 사용하지 않았다.
실시예 4- 완충액 선택
PBS 이외의 완충액을 선택하려는 한 가지 이유는 소변이나 혈액에서 샘플링하기 위한 시스템의 의도된 사용이었다. 표 1.1은 정상적인 성인에서 소변 pH가 4.5(32μmol의 H+)만큼 낮을 수 있음을 보여준다. 본 발명자는 심한 국소빈혈에도 불구하고 민감도를 유지하기 위해, pH 3의 시스템을 과설계하기로 결정하였다. PBS의 pKa는 7.2에 불과하고, 이는 1mmol의 H+를 중화시키고 투석액의 pH를 pH 8.0의 0.1 단위로 유지하기에 충분한 용량을 제공하기 위해 고농도의 완충액이 필요하다는 것을 의미한다. PBS는 100mM의 농도가 필요하지만, 아래의 3.1에 따라 Henderson-Hasselbalch 방정식을 사용하여 입증된 것처럼, 8.0의 pKa를 갖는 완충액은 ±0.1 단위의 pH 변화에 저항하기 위해 20mM의 농도만 필요하다.
Henderson-Hasselbalch 방정식을 사용한 역-계산:
본 발명자는 다양한 대체 완충액을 조사하여, 8.0의 pKa, 저온 감수성, 및 양이온 복합체가 부족한 적절한 완충액을 찾고 이러한 모든 기준과 일치하는 흔치않은 피페라진-기반 작용제인 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-프로판술폰산(EPPS)을 확인하였다.
벤치탑(Benchtop) 테스트는 100mM의 PBS에서 효소에 대한 pH 7.5에 비해, 완충된 효소 용액과 1:4 부피비로 혼합될 때 50mM의 EPPS가 pH 3.0에서 식염수 용액을 최종 pH 7.7로 중화할 수 있음을 보여주었다.
실시예 5- 최적화 실험
실험실에서의 이전 연구는 2μ1/분에서의 관류액 흐름과 0.5μ1/분의 효소의 조합이 좋은 결과를 낳았다는 것을 보여주었다. 본 발명자는 사르코신 옥시다제에서 크레아티니나제로 거꾸로 실험하기로 결정했고, 미세투석 실험을 수행하기 전에, 효소 혼합물과 pH에 대해 각 단계를 차례로 직접 테스트하고 최적화하였다.
도 1은 8 x 25μm 전극을 만들기 전에 실행한 단일 50μm 전극에 대한 초기 실험 결과를 보여주고, 10mM PBS에서 30U/ml 사르코신 옥시다제의 신호 크기와 25μM에서 10mM의 사르코신을 비교하여, pH를 8.0으로 염기성화하면 신호가 개선될 것이라는 의혹을 확인하였다. 이러한 결과는 pH 7.5에서보다 8.0에서 높은 민감도를 갖는 2 단계 및 3 단계 혼합물에 대해 유사하다.
pH 7.5의 100mM PBS, pH 8.0의 50mM EPPS 및 pH 9.0의 50mM Borate 완충액에서 30U/ml SAO의 정면 비교는 최신 8 x 25μm 전극 배열을 사용하여, 도 2의 결과를 제공하였다. 농도가 높아짐에 따라 EPPS 신호의 표준 편차가 확대된 것은 기판 펌프의 결함으로 인해 발생했을 가능성이 높으며, 이는 이후 실험에서도 나타났고, 교체로 이어졌다.
도 3은 이러한 연속 희석 실험의 단계별 프로파일을 보여주며, PBS 및 EPPS에서 얻은 결과와 Tris 및 Borate 완충액의 결과를 입증하여, 추가로 이 시스템에 대한 부적합성을 확인하였다.
그 후, 일련의 실험을 수행하여 다양한 효소 혼합물에 대한 반응 곡선의 시간 프로파일을 조사하여 최단 시간 내에 최대 반응을 달성하고, 이를 통해 최소의 개선 이상을 볼 수 있었다. 이것은 효소 비율이 더 이상 제한되지 않고, 단지 효소의 양만 제한된다는 것을 나타낸다. 본 발명자는 시스템의 총 효소 함량(체중/부피)을 혈청 알부민(400mg/ml)의 총 효소 함량으로 제한하기로 결정했지만, 이는 이후 개발에서 더 추진될 수 있다. 본 발명자는 이러한 스케일에서 더 높은 단백질 농도에서 혼합 및 기질 확산에 대한 증가된 점도 및 간섭뿐만 아니라, 미세유체 시스템 내에서 퇴적물 생성의 가능성을 염두에 두었다.
모든 실험은 pH 3.0의 일반 식염수에 100μM 기질의 저장소로 수행되었으며, 여기에 효소 혼합물을 의도된 1:4 부피비로 첨가한 다음 2.5μl/분으로 센서를 지나 펌핑하여 최종 시스템의 전체 흐름을 재현한다. 효소 혼합물을 pH 7.5, 8.0 및 8.5에서 50mM EPPS에 완충시켰다. SAO 및 크레아티나제 함량이 100μm 크레아틴에 대해 최적화된 최종 실험 중 하나인 도 4를 제외하고는, 광범위한 연속 결과가 여기에 재현되지 않으며, 이 실험은 현재 pH 3.0의 정상 식염수에서 100μm 크레아티닌에 대한 최적의 크레아티니나제 양을 확인하려고 한다.
pH를 8.0에서 8.5로 증가시키는 것이 크레아티니나제 함량을 300U/ml에서 600U/ml로 두 배로 늘리는 것과(파란색 선 vs. 빨간색 선), pH 8.5에서 600:300:60의 혼합물로 반응이 증가한 것과 동일한 점에 유의한다. 미세투석 실험을 위해 선택된 최종 혼합물은 pH 8.0의 50mM EPPS에서 600:300:60이었지만, 이 실험은 HEPBS(8.3의 pKa)와 같이, 향후 8.5 정도 더 높은 pKa를 갖는 대안적인 완충액을 사용할 가능성을 높였다[94].
표 3.4는 하기에서 pH 8.0에서 이 실험 방법에 의해 수득된 T90 수준(업 스트로크의 시작으로부터 측정된 최대 90%에 도달하는 시간)의 모음을 나타내며, 이는 혼합물의 진화를 입증한다.
표 3.4: 최소 T90 수준을 달성하기 위한 pH 8.0에서 효소 최적화 실험 결과. 최종 혼합물의 반응 시간은 굵은 글씨로 강조표시된다.
이 결과로부터 본 발명자는 적절한 혼합과 반응 시간을 제공함으로써 최대 민감도를 보장하기 위해, 효소를 투석액에 공급하는 Y-접합부와 센서 사이에 3 분을 지연하기로 결정하였다.
실시예 6- 미세투석법 실험
100μM 수준에서 크레아티닌 검출에 최적화된 효소 양과 완충액을 사용하여, 미세투석을 통해 시뮬레이션된 최종 설정에서 시스템을 테스트하였다. 여기에, 18.8mm2의 막 표면적 및 20kDa의 컷오프(cut-off)를 갖는 심부 조직 샘플링을 위해 설계된 임상-등급 CMA 70 미세투석 프로브(M Dialysis AB, Stockholm, Sweden)를 표준-첨가 방법론에서 크레아티닌의 부분 표본을 첨가한 잘 교반된 T1 용액(세포 외 유체 유사체)(저장 용액은 dH20에 2.3mM 염화칼슘, 147mM 염화나트륨 및 4mM 염화칼륨을 함유 함)에 현탁하였다. T1은 또한 Harvard Apparatus PHD 2000 프로그램작동이 가능한 주입펌프(Harvard Bioscience Inc., Holliston, Massachusetts, USA)에 의해 2μl/분으로 전달되는 관류액으로 사용되었으며, 투석액이 본 발명자의 LabSmith 보드의 Y-접합부로 되돌아와 0.5μl/분으로 흐르는 완충된 효소 혼합물과 혼합된 다음, 지연 루프와 센서가 뒤따랐다. 이러한 결과로부터 Km 2.3mM(±1.3mM), Vmax 2.9mM(±1.0mM) 및 속도 상수 0.96μM/초(+0.05μM/초)의 효소 동역학에 대한 힐 방정식에 맞는, 시스템에 대한 교정 곡선을 구축할 수 있었다. 흥미롭게도, 시스템의 Km 값은 사르코신 옥시다제(Km 2.8mM)의 값을 포함하지만, 속도 제한 단계임을 나타낼 수 있는 크레아티닌(4.5mM) 또는 크레아티니나제(32mM)는 포함하지 않으며, 이는 용액(
250μm)의 산소 이용가능성으로 인한 것일 것이다.
이어서, 동일한 설정을 잘 교반된 탈섬유소 말 혈액(TCS Biosciences Ltd., Botolph Claydon, Buckingham, UK)에서 표준 첨가 실험에 사용하여 생물학적 유체에서 마이크로몰 양의 크레아티닌을 검출할 수 있음을 입증하였다. 결과는 도 5에 제시되었다.
T1에서 얻은 결과는 이 종류의 첫 번째 미세투석 설정이 4.3μM의 검출 한계와 500μM의 시험된 상한 범위에서, 크레아티닌을 측정하는 민감성 및 저잡음 방법임을 보여준다. 그래프의 Km은 이 방법이 추가 테스트 후 약 2mM 수준까지 유용할 수 있다는 것을 나타내며, 이는 광범위한 유용한 작업 범위를 제공한다. 더욱이, 미세투석 샘플링 방법론은 40%의 추정 회수율를 가졌으며, 이는 회수율을 개선시키는 것이 검출 한계를 약 2μM로 낮출 수 있음을 의미한다.
잘 교반된 말 혈액의 결과는 말의 기초 크레아티닌 수준이 180μM - 186μM임을 보여준다. 이것은 말의 정상 범위(100μM - 160μM)를 바로 넘어서지만, 이것을 얻은 말의 근육 질량이나 젠더 또는 운동 상태를 알지 못하여, 수준이 ≥200μM까지 올라갈 수 있다[95]. 적혈구 크레아틴이 효소 캐스케이드로 공급되면서, 샘플이 약간 용혈될 수도 있다(아래 표 3.5 참조). 이러한 결과의 더 넓은 표준 편차는 의심의 여지없이 대류 효과와 적혈구 질량으로 인해 확산 경로가 배제됨으로써 발생하고, 이는 무질서한 방식으로 투석 막을 가로지르는 흐름을 변경한다.
실시예 7- 안정성 시험
이 미세투석 시스템의 장기적인 안정성을 테스트하기 위해, 총 농도를 100μM로 만들기 위해 크레아티닌을 첨가한 잘 교반된 T1 포트에 프로브를 현탁시켰다. 도 6의 정규화된 결과는 시스템이 12 시간 동안 반응을 유지하며, 민감도는 9 시간 후 원래 신호의 50-60% 대(250pA에 해당)로 떨어지지만, 그 시점부터 계속 일정하게 유지됨을 보여준다. 11 시간 30 분 표시에서 잡음이 증가한 것은 아침에 실험을 시작한 결과였다. 스펙트럼 분석 결과 세 가지 주요 잡음 피크를 보인다 - 전원 공급장치에서 50Hz에서 첫 번째, 자석 교반기에서 가능한 13Hz에서 두 번째, 및 교반된 액체 또는 Harvard Apparatus PHD 2000 펌프의 스크류 드라이브 내에서 대류를 반영할 수 있는 전체 데이터 세트에 대해 보이는 훨씬 느린 0.2Hz 중첩된 사인곡선(sinusoid).
실시예 8- 간섭 테스트
AglAgC1에 대한 700mV의 바이어스 전압에서, 작업 전극은 혈액에서 흔히 발견되는 다른 화학물질, 예를 들어 파라세타몰, 요산 및 아스코르베이트를 산화시킬 수 있지만, 이들은 중합된 mPD 층에 의해 전극 표면에 도달하는 것이 방지되어야 한다. 3-효소 시스템은 또한 사르코신 및 크레아틴으로부터 H2O2를 생성할 수 있을 것이다.
이러한 공통 간섭의 수준은 아래 표 3.5에 나타나있다.
표 3.5: † 센서 테스트에 사용된 수준. * 혈청에서 기록된 정상 범위
사르코신의 내인성 수준이 낮은 마이크로몰 범위에 있고 대부분은 세포 내이기 때문에, 광범위한 용혈시 크레아틴의 수준만 문제를 일으켜야 하기 때문에, 최종 시스템의 크레아틴 및 사르코신 간섭은 테스트하지 않았다. 이 두 물질은 또한 전처리, 배경 제거 또는 다른 효소 혼합물을 사용한 병렬 샘플링 경로로 설명될 수 있다.
도 7은 잘 교반된 T1 용기에 대상 물질을 첨가한 간섭 테스트 결과를 보여준다. 아스코르베이트 및 파라세타몰을 문헌에 기재된 양을 초과하는 양으로 첨가하였다.
펌프 재충전 전에, 아스코르브 산의 두 번째가 아닌, 첫 번째 첨가에 대한 반응과 요산의 첨가에 대한 유사한 반응에 주목한다. 이는 프로브 팁이 실험에 사용된 작은 유리 샘플 포트의 내부와 접촉할 때 일시적으로 회복이 감소했기 때문이다. 아스코르베이트의 두 번째 첨가와 파라세타몰의 첨가로 인한 명백한 간섭은 없으며, 총 농도를 200μM로 만들기 위해 크레아티닌의 두 번째 부분표본량에 대한 반응과의 간섭도 없었다.
이러한 좋은 결과에도 불구하고, 본 발명의 시스템에서 임의의 잠재적인 간섭제의 영향을 무시할 수 있는 다른 방법이 있을 수 있음을 인식하였다.
실시예 9- 크레아티닌 제거율(
creatinine clearance)
측정
반응의 절대 등급을 측정할 때의 문제로는 작동 전극이 H2O2에 의해 독이 되거나, 단백질로 코팅되거나, 기준이 저하됨에 따라 센서의 민감도와 오프셋의 드리프트를 지속적으로 고려해야 할 필요가 있다는 것이다. 또한 이전 섹션에서 논의한 것처럼, 조작 결과를 제공할 수 있는 시스템의 임의의 잠재적 간섭제를 고려해야 한다.
크레아티닌이 배경 위에서 계속 검출가능한 한, 절대 농도를 측정하는 대신 속도 상수로 신장 기능을 유도하여 크레아티닌 제거율 자체에 대한 테스트를 구성하고 그렇게 함으로써 간섭제 및 센서 드리프트에 대한 모든 잠재적인 문제를 피할 수 있어야 함을 인식하였다. 폐쇄-루프 관류 시스템에 내인성 크레아티닌이 포함되어서는 안된다고 고려하면, 규칙적인 간격의 순환량에 알려진 양의 크레아티닌을 첨가할 수 있어야 하며 1차 역학으로 작동하는 신장에 의해 소변으로 여과될 때 감소율을 모니터링 할 수 있어야 한다. 감소 이상의 수준에서, 활성 관 분비에 의한 기여는 최소이므로, 제거율은 GFR을 반영해야 한다.
따라서 연속 미세투석 샘플링 동안 T1에서 알려진 양의 크레아티닌에 대해 다른 크레아티닌 제거율을 시뮬레이션하기 위해 일련의 실험을 구성하였다. 예를 들어, 100ml/분의 제거율은 1/분의 속도(일반 성인 인간의 혈액 순환 속도(51/분에서 5 리터의 혈액)와 동일)로 순환하는 1리터 샘플을 5 분 안에 원래 농도의 반으로 할 것이다. 이 제거율은 알려진 양의 크레아티닌을 포함하는 2ml 샘플의 부피를 5분 이상 또는 400μl/분으로 꾸준히 두 배로 늘려서 시뮬레이션 할 수 있다.
CKD1(Stage 1 Chronic Kidney Disease)에서 CKD4까지 다양한 기능장애 상태에서 신장의 제거율을 각각 100ml/분, 75ml/분, 50ml/분 및 25ml/분으로 재현하기로 결정하였다. 아래의 표 1.2는 처음으로 GFR과 CKD의 단계 사이의 관련성을 소개하였다. 도 6에 도시된 안정성 테스트 중 신호 감소 속도는 2ml/분의 제거율과 같음에 주의한다.
도 8은 100ml/분의 모의(simulated) 제거율로 세 가지 농도의 크레아티닌(100μM, 200μM 및 300μM)에 대한 희석 테스트 결과를 보여준다.
200μM 및 300μM 실험의 결과는 매우 유사하며, 시간 상수들은 각각 476±0.86 초 및 471±1.0 초의 반감기를 제공한다. 100μM 샘플의 반감기는 620±2.8 초로 훨씬 더 높았다. Albery 방정식[100]에 설명된 것을 연상시키는 감소 곡선은 주목할 만한 가치가 있는데, 이는 프로브 배치, 교반 속도 및 온도를 제어하지 않았기 때문에, 투석액에서 전극으로의 기판 공급의 변동성이 아마도 실험적 오류의 근본 원인일 수 있음을 나타낸다.
도 9는 다른 수준의 CKD를 시뮬레이션하기 위한 후속 실험을 도시한다. 각 신호는 서로 다른 감소율을 강조하기 위해 100%에서 시작하도록 표준화되었다.
이들 곡선의 반감기는 미가공 데이터의 지수적 조정(exponential fit)으로부터 도출되어, 75ml/분, 50ml/분 및 25ml/분 제거율 각각에 대해 약 13분 40초, 16분 30초 및 27분을 제공하였다. 이들은 실험 설계와 직접적으로 일치하지는 않지만, 획득된 값들 사이에 어느 정도 비례적인 순서를 따른다. 결과는 더 낮은 희석 속도에서 더욱 안정적이며, 이는 오류의 원인으로서 투석 회수 및 혼합을 추가로 포함한다.
실시예 10- 혈액 투과성 돼지 신장을 사용한 시스템 시험
최종 실험은 격리된 관류 신장 셋업에서 본 발명의 시스템의 기능을 탐구하였다. 이를 위해, 영국의 주요 신장 이식 센터 중 하나인 해머스미스 병원(Hammersmith Hospital)에서 근무하는 임상 연구원 바이반트 샌드후 박사와 파트너 관계를 맺었다. 그녀의 연구는 RM3 관류 장치(미국 미네소타주 로체스터 소재의 Waters Medical Systems LLC)를 이용한 돼지 신장의 온혈 관류에 관한 것이었다. 인근의 허가된 도축장에서 성인 돼지 신장을 채집하여 4 시간 동안 냉장실에 보관하였다. 이어서, 따듯한 관류를 위해 열 교환기 및 산소 발생기로 재구성된 RM3 관류 장치에 연결되었다. 재관류 실험을 위해 수집된 자가 혈액을 가시적으로 용혈시키고, 이 혈액은 사용하기 전에 여과해야 하는 다량의 혈전을 함유하였다.
Y-접합부에 직접 주입된 100μM 크레아티닌에 대해 센서 시스템을 보정한 다음 교반되지 않은 100μM 크레아티닌-T1 용액에서 미세투석 프로브를 통해, 흐름이 잘되도록 프로브 팁(tip)을 신정맥의 남은 부분에 깊숙이 놓았다. 도 10은 실험 장치를 보다 자세히 보여준다. 이어서, 재배치 동안 프로브 막이 손상되고 실험을 포기해야 할 때까지 다음 시간의 재관류에 걸쳐 데이터를 수집하였다.
데이터 분석을 위해서는 먼저 도 11과 같이, RM3의 관류 펌프로 인한 가시적인 전기 스파이크를 제거하기 위해 Savitsky-Golay 스무딩 필터(513개 샘플의 창을 갖는 2차 다항식)를 사용해야 한다.
이 결과는 
300μM 크레아티닌에 해당하는, 시스템 설정 및 초기 관류 중 초기 안정기를 보여준다. 이 높은 시스템 오프셋은 아마도 도축 과정에서 발생하는 근육 손상과 자가 혈액의 광범위한 용혈로 인한 것이고, 이는 관류액으로 크레아틴을 방출시킨다. 관류가 처음 시작되었을 때, 신장이 산소를 소비하기 시작하면서 혈액이 눈에 띄게 어두워졌다. 막 산소공급기로 산소 공급을 개방하면 혈액이 루비 레드 색상으로 빠르게 되돌아오고 신호 크기가 갑자기 감소하여 곧 높은 기준선으로 돌아왔다. 이것은 실제로 사르코신 옥시다제가 정상적으로 기능하는 데 필요한 산소를 소비하는 허혈성 신장으로부터의 갑작스러운 산화성 파열 또는 센서에 의해 검출된 pH의 빠른 변화를 반영했을 수 있다.
그런 다음 신장은 이전 100ml/분 크레아티닌 제거율 실험과 동등한 속도에서 결과는 완전히 같지 않을 수 있는, 반감기 652±3.5초로, 검출가능한 대사산물을 분비하는 것으로 보였다. 그런 다음 RM3 시스템의 동맥 저장소에 100μmoles의 크레아티닌의 두 개의 개별 부분표본(10mls x 10mM)을 섞어, 도 12에 표시된 결과를 얻었다. 이 곡선은 각각 27초와 18초의 반감기를 가지며, 이는 이 결과들이 제거율보다 희석으로 인한 것 같다는 것을 나타낸다.
유감스럽게도, 시스템에서 검출가능한 대사산물이 낮은 정상 상태로 감소하기 전에 실험을 종료해야 했다. 가정된 최종 재관류 시스템에서, 관류액은 내인성 크레아티닌이 없는 등장성 결정질 용액에서 세척된 적혈구를 포함하여, 순수한 제거율 시험을 가능하게 한다.
결론
이 프로젝트의 이 부분은 크레아티닌의 미세투석 샘플링 및 전류측정 테스트를 기반으로 한 독립적 시스템이 4.3μM의 검출 한계를 달성하고 500μM의 상위 범위를 테스트하여, 문헌에 보고된 것과 일치하거나 초과하는 것으로 나타났음을 보여준다(표 3.3). 이 성능은 포텐시오스타트(potentiostat), 미세전극 센서 어레이 및 Tsuchida와 Yoda[40]의 삼중 효소 시스템에 대한 일련의 개선과 최적화로 인한 것이었다. 작업 전극 상으로 mPD를 전기중합하는 공정은 또한 그러한 시험을 수행하는 다른 그룹에 의해 보고된 것보다 훨씬 많은 간섭제 수준에 대해 우수한 보호를 제공하였다.
실시간 크레아티닌 모니터링 시스템(반응 시간 3분 지연)을 개발하는 것 외에도 센서 교정 없이 신장 기능을 모니터링하는 새로운 방법을 제안하고 탐색하여, 배경 잡음이나 센서 오프셋, 드리프트 또는 시간 경과에 따른 민감도 손실의 변화를 보충할 필요가 없다. 이것은 크레아티닌 분비의 감소 곡선의 시간 상수(또는 반감기)를 측정함으로써 달성될 수 있다고 생각하며, 돼지 신장을 포함하는 폐쇄 루프 관류 시스템에서 이것을 실험적으로 입증하였다.
실시간 모니터링에 이 미세유체 시스템을 사용하는 경제성 또한 유리하다. 분석에 사용된 효소의 지속적인 낭비에도 불구하고, 일주일의 연속 모니터링은 600:300:60 혼합물의 5ml만을 소모할 것이다. 2016년 9월 현재 3가지 효소에 대한 시장 가격은 주당 ￡50 미만이다.
앞으로의 연구는 HEPBS와 같은 pKa가 더 높은 완충액에서 효소의 재-최적화, 관류 회로에 인라인 포함을 위한 모듈식 미세투석 샘플링 프로브의 생성 및 실시간 크레아티닌 모니터링을 위한 ‘핫 플러그가 가능한’ 시스템을 제공하기 위해 마이크로채널 내에 마이크로전극 어레이의 형성을 표준화하려는 시도를 볼 수 있다. 시스템은 또한 3분 지연 루프에서 발생하는 것처럼, 신호 크기를 줄이기 위해 더 나은 혼합 및 더 적은 테일러 분산을 생성하면서 공통 센서와 병렬로 다수 효소 반응의 멀티플렉싱를 허용하기 위해 액적 미세유체를 사용하는 이점을 얻을 수 있다. 추가 개발을 통해, 이 시스템은 집중 치료 환경에서 실시간 신장 기능을 모니터링하기 위해 시험될 수도 있다.
전반적으로, 본 발명은 이식 전에 장기를 최적의 상태로 유지하고 매 초마다 중요한 환경에서 시간을 번다는 목표에 보다 근접하게 한다.
참고 문헌
33. Randviir EP, Banks CE. Analytical methods for quantifying creatinine within biological media. Sensors and Actuators B: Chemical. 2013; 183:239-252.
35. Myers GL, Miller WG, Coresh J, Fleming J, Greenberg N, Greene T, et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clinical Chemistry. 2006;52(1):5-18.
37. Panteghini M. Enzymatic assays for creatinine: time for action. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 2008;68(sup241):84-88.
40. Tsuchida T, Yoda K. Multi-enzyme membrane electrodes for determination of creatinine and creatine in serum. Clinical Chemistry. 1983;29(1):51-55.
51. Xu JC, Hunter GW, Lukco D, Liu CC, Ward BJ. Novel carbon dioxide microsensor based on tin oxide nanomaterial doped with copper oxide. IEEE Sensors Journal. 2009;9(3):235-236.
52. Suzuki H, Arakawa H, Karube I. Performance characteristics of a urea microsensor employing a micromachined carbon dioxide electrode. Electroanalysis. 2000;12(16):1327-1333.
53. Halliwell B, Clement MV, Long LH. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS letters. 2000;486(1):10-13.
55. Ungerstedt U, Pycock C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bulletin der Schweizerischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften. 1974;30(1-3):44-55.
56. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442(7101):368-373.
58. Wang C. Development of clinical instruments for traumatic brain injury patients: design, realisation, and performance. Imperial College London; 2015.
64. Liu H, Ying T, Sun K, Li H, Qi D. Reagentless amperometric biosensors highly sensitive to hydrogen peroxide, glucose and lactose based on N-methyl phenazine methosulfate incorporated in a Nafion film as an electron transfer mediator between horseradish peroxidase and an electrode. Analytica Chimica Acta. 1997;344(3):187-199.
65. Guerrieri A, De Benedetto G, Palmisano F, Zambonin P. Electrosynthesized non-conducting polymers as permselective membranes in amperometric enzyme electrodes: a glucose biosensor based on a co-crosslinked glucose oxidase/overoxidized polypyrrole bilayer. Biosensors and Bioelectronics. 1998;13(1):103-112.
66. Nakabayashi Y, Wakuda M, Imai H. Amperometric Glucose Sensors Fabricated by Electrochemical Polymerization of Phenols on Carbon Paste Electrodes Containing Ferrocene as an Electron Transfer Mediator. Analytical Sciences. 1998;14(6):1069-1076.
67. Mitchell KM. Acetylcholine and Choline Amperometric Enzyme Sensors Characterized in Vitro and in Vivo. Analytical Chemistry. 2004 Feb;76(4):1098-1106. Available from: http://dx.doi.org/10.1021/ac034757v.
72. Khue NV, Wolff CM, Seris JL, Schwing JP. Immobilized enzyme electrode for creatinine determination in serum. Analytical Chemistry. 1991;63(6):611-614.
73. Weber J, Van Zanten A. Interferences in current methods for measurements of creatinine. Clinical Chemistry. 1991;37(5):695-700.
74. Sakslund H, Hammerich O. Effects of pH, temperature and reaction products on the performance of an immobilized creatininase-creatinase-sarcosine oxidase enzyme system for creatinine determination. Analytica Chimica Acta. 1992;268(2):331-345.
75. Yamato H, Ohwa M, Wernet W. A polypyrrole/three-enzyme electrode for creatinine detection. Analytical Chemistry. 1995;67(17):2776-2780.
76. Schneider J, Gr
ndig B, Renneberg R, Cammann K, Madaras M, Buck R, et al. Hydrogel matrix for three enzyme entrapment in creatine/creatinine amperometric biosensing. Analytica Chimica Acta. 1996;325(3): 161-167.
77. Mγdγraº MB, Popescu IC, Ufer S, Buck RP. Microfabricated amperometric creatine and creatinine biosensors. Analytica Chimica Acta. 1996;319(3):335-345.
78. Mγdγraº MB, Buck RP. Miniaturized biosensors employing electropolymerized permselective films and their use for creatinine assays in human serum. Analytical Chemistry. 1996;68(21):3832-3839.
79. Khan G, Wernet W. A highly sensitive amperometric creatinine sensor. Analytica Chimica Acta. 1997;351(1):151-158.
80. Kim EJ, Haruyama T, Yanagida Y, Kobatake E, Aizawa M. Disposable creatinine sensor based on thick-film hydrogen peroxide electrode system. Analytica Chimica Acta. 1999;394(2):225-231.
81. Shin JH, Choi YS, Lee HJ, Choi SH, Ha J, Yoon IJ, et al. A planar amperometric creatinine biosensor employing an insoluble oxidizing agent for removing redox-active interferences. Analytical Chemistry. 2001 ;73(24):5965-5971.
82. Tombach B, Schneider J, Matzkies F, Schaefer RM, Chemnitius GC. Amperometric creatinine biosensor for hemodialysis patients. Clinica Chimica Acta. 2001;312(1):129-134.
83. Erlenk
tter A, Fobker M, Chemnitius GC. Biosensors and flow-through system for the determination of creatinine in hemodialysate. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2002;372(2):284-292.
84. Stefan RI, Bokretsion RG, van Staden JF, Aboul-Enein HY. Simultaneous determination of creatine and creatinine using amperometric biosensors. Talanta. 2003;60(6):1223-1228.
85. Hsiue GH, Lu PL, Chen JC. Multienzyme-immobilized modified polypropylene membrane for an amperometric creatinine biosensor. Journal of Applied Polymer Science. 2004;92(5):3126-3134.
86. Berberich JA, Yang LW, Madura J, Bahar I, Russell AJ. A stable three-enzyme creatinine biosensor. 1. Impact of structure, function and environment on PEGylated and immobilized sarcosine oxidase. Acta Biomaterialia. 2005;1(2):173-181.
87. Berberich JA, Yang LW, Bahar I, Russell AJ. A stable three enzyme creatinine biosensor. 2. Analysis of the impact of silver ions on creatine amidinohydrolase. Acta Biomaterialia. 2005;1(2):183-191.
88. Berberich JA, Chan A, Boden M, Russell AJ. A stable three-enzyme creatinine biosensor. 3. Immobilization of creatinine amidohydrolase and sensor development. Acta Biomaterialia. 2005;1(2):193-199.
89. Staden RISv, Bokretsion RG. Simultaneous Determination of Creatine and Creatinine using Monocrystalline Diamond Paste―Based Amperometric Biosensors. Analytical Letters. 2006;39(11):2227-2233.
90. Nieh CH, Tsujimura S, Shirai 0, Kano K. Amperometric biosensor based on reductive H2O, detection using pentacyanoferrate-bound polymer for creatinine determination. Analytica Chimica Acta. 2013; 767:128-133.
91. Seraf
n V, Hernandez P, Agui L, Yanez-Sedeno P, Pingarron J. Electrochemical biosensor for creatinine based on the immobilization of creatininase, creatinase and sarcosine oxidase onto a ferrocene/horseradish peroxidase/gold nanoparticles/multi-walled carbon nanotubes/Teflon composite electrode. Electrochimica Acta. 2013; 97:175-183.
92. Yoshimoto T, Tanaka N, Kanada N, Inoue T, Nakajima Y, Haratake M, et al. Crystal structures of creatininase reveal the substrate binding site and provide an insight into the catalytic mechanism. Journal of Molecular Biology. 2004;337(2):399-416.
93. Hall SB, Khudaish EA, Hart AL. Electrochemical oxidation of hydrogen peroxide at platinum electrodes. Part IV: phosphate buffer dependence. Electrochimica Acta. 1999;44(25):4573-4582.
94. Ferreira CM, Pinto IS, Soares EV, Soares HM. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions―a review. RSC Advances. 2015;5(39):30989-31003.
95. Judson G, Frauenfelder H, Mooney G. Biochemical Changes in Thoroughbred Racehorses Following Submaximal and Maximal Exercise. In: Equine Exercise Physiology. Granta Editions Cambridge; 1983. p. 408-415.
96. Fang J, Alderman MH. Serum uric acid and cardiovascular mortality: the NHANES I epidemiologic follow-up study, 1971-1992. JAMA. 2000;283(18):2404-2410.
97. Allen RH, Stabler SP, Lindenbaum J. Serum betaine, N, N-dimethylglycine and N-methylglycine levels in patients with cobalamin and folate deficiency and related inborn errors of metabolism. Metabolism. 1993 Nov;42(11):1448-1460. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/0026-0495(93)90198-W.
98. Schedel JM, Tanaka H, Kiyonaga A, Shindo M, Schutz Y. Acute creatine ingestion in human: consequences on serum creatine and creatinine concentrations. Life Sciences. 1999;65(23):2463￢2470.
99. Verhelst J, Berwaerts J, Marescau B, Abs R, Neels H, Mahler C, et al. Serum creatine, creatinine, and other guanidino compounds in patients with thyroid dysfunction. Metabolism. 1997;46(9):1063-1067.
100. Albery WJ, Haggett BG, Svanberg LR. The development of electrochemical sensors. In: Advanced Agricultural Instrumentation. Springer; 1986. p. 349-392.
본 발명은 또한 아래와 같은 구체예를 제공한다:
1. 효소 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 선택적으로 2개 또는 모두를 포함하는 조성물.
2. 구체예 1에 있어서, 상기 효소의 최소한 하나, 선택적으로 2개, 선택적으로 모든 효소는 고정화되지 않고, 선택적으로 모든 효소가 용액 내에 존재하는 조성물.
3. 구체예 1에 있어서, 상기 조성물은 완충액을 포함하는 조성물.
4. 구체예 3에 있어서, 상기 완충액은 포스페이트 완충액 또는 PBS가 아니거나, 그리고/또는 트리스(Tris) 완충액이 아니거나, 그리고/또는 테트라보레이트가 아니거나 그리고/또는 HEPES가 아닌 조성물.
5. 구체예 3 또는 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충액은 EPPS, HEPBS, POPSO, HEPPSO 및 MOBS로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
6. 구체예 3-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충액은 pKa가 7.0 내지 9.0, 선택적으로 7.3 내지 8.95, 선택적으로 8.5인 조성물.
7. 구체예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 또는 상기 완충액은 pH가 7.0 내지 9.0, 선택적으로 7.3 내지 8.95, 선택적으로 8.5인 조성물.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 pH 8.0-8.5에서 EPPS, 선택적으로 pH 8.0-8.5에서 50mM EPPS, 선택적으로 pH 8.0에서 50mM EPPS 또는 pH 8.5에서 50mM EPPS를 포함하는 조성물.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 우레아제 및/또는 우리카제 및/또는 시스타틴(Cystain) C를 검출하는 수단 및/또는 알부민을 검출하는 수단을 추가로 포함하는 조성물.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 크레아티니나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CNH-311로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 크레아티나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CRH-211로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 사르코신 옥시다제는 Sorachim 카탈로그 번호 SAO-351로부터 유래하는 조성물.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제의 농도는 최종 반응 혼합물에서 크레아티니나제의 농도가 300U/ml 이상, 및/또는 크레아티나제의 농도가 120U/ml 이상이고 사르코신 옥시다제의 농도가 10U/ml 이상인 조성물.
12. 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 상기 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 10:5:1 내지 49:8:1 U/ml의 비율로 포함하는 조성물.
13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 상기 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 600 U/ml, 300 U/ml 및 60 U/ml 양으로 포함하고, 선택적으로 상기 조성물은 pH 8.5에 있는 조성물
14. 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 및 적어도 하나의 제1 센서를 포함하고, 상기 제1 센서는 선택적으로는 전류측정 센서이고. 상기 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제는 구체예 1 내지 13중 어느 하나에 따른 조성물의 일부인 센서 시스템.
15. 구체예 14에 있어서, 미세유체 회로, 미세유체 장치 및 미세투석 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하는 센서 시스템.
16. 구체예 14 및 15 중 어느 하나에 있어서, 연속 흐름 시스템을 추가로 포함하는 센서 시스템.
17. 구체예 14-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 샘플을 얻기 위한 수단, 선택적으로 환자로부터의 샘플 또는 폐쇄-루프 분리 관류 기관으로부터의 샘플, 선택적으로 신장을 추가로 포함하고,
선택적으로 환자로부터의 상기 샘플은 미세투석액, 선택적으로 혈액, 소변, 혈장, 조직액, 뇌척수액으로부터 유래되는 센서 시스템.
18. 구체예 14-17 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 상기 센서와 접촉시키기 전에 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제 또는 구체예 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 조성물을 상기 샘플에 첨가되도록 배치하고, 선택적으로, 상기 감지 시약은 상기 센서와 접촉하기 전에 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250초, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10분 이상으로 첨가되는 센서 시스템.
19. 구체예 14-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 상기 감지 시약의 첨가 전 또는 후에, 상기 샘플에서 산소의 양을 증가시키는 수단을 포함하고, 선택적으로 상기 산소의 양을 증가시키는 수단은:
선택적으로 배플(baffles) 또는 나선형의 구역을 포함하는 혼합기(선택적으로 상기 혼합기는 PDMS와 같은 고 투과성 재료로 만들어짐);
테플론(Teflon) 튜브에 의해 연결된 다수의 혼합 단계;
가압 용기;
중 선택적으로 하나 또는 그 이상으로부터 선택되는 센서 시스템.
20. 구체예 14-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 10uM 미만, 선택적으로 7.5uM 미만, 선택적으로 5uM 미만, 선택적으로 4uM 미만, 선택적으로 3uM 미만, 선택적으로 2uM 미만, 선택적으로 1uM 미만의 농도에서 크레아티닌을 검출할 수 있는 센서 시스템.
21. 구체예 14-20 중 어느 하나에 있어서, 상기 센서 시스템은 40uM 내지 120uM의 크레아티닌의 배경 수준에 대해, 1uM 미만, 또는 2uM 미만 또는 3uM 미만 또는 4uM 미만, 또는 5uM 미만 또는 7.5uM 미만 또는 10uM 미만의 크레아티닌 농도의 변화를 검출할 수 있는 센서 시스템.
22. 구체예 14-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 센서 시스템은 상기 센서로부터 데이터를 수집하기 위한 수단, 선택적으로 PowerLab/4SP를 포함하고, 선택적으로 상기 시스템은 상기 데이터를 전송하기 위한 무선 전송 수단을 더 포함하는 센서 시스템.
23. 구체예 14-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 데이터 분석 수단, 선택적으로 컴퓨터 또는 웨어러블 장치를 더 포함하고, 선택적으로 상기 데이터 분석 수단은 무선으로 전송된 데이터를 수신하는 수단을 포함하는 센서 시스템.
24. 구체예 14-23 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 폐기물 수집 용기를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 폐기물 수집 용기의 부피는 10ml 미만, 예를 들어 9.5ml 미만, 예를 들어 9ml 미만, 예를 들어 8.5ml 미만, 예를 들어 8ml 미만, 예를 들어 7.5ml 미만, 예를 들어 7ml 미만, 예를 들어 6.5ml 미만, 예를 들어 6ml 미만, 예를 들어 5.5ml 미만, 예를 들어 5ml 미만, 예를 들어 4.5ml 미만, 예를 들어 4 ml 미만, 예를 들어 3.5ml 미만, 예를 들어 3ml 미만, 예를 들어 2.5ml 미만, 예를 들어 2ml 미만, 예를 들어 1.5ml 미만, 예를 들어 1ml 미만, 예를 들어 0.5ml 미만, 예를 들어 0.25ml 미만인 센서 시스템.
25. 구체예 14-24 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 이동식 시스템인 센서 시스템.
26. 구체예 14-25 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율을 계산하는 수단을 포함하는 센서 시스템.
27. 구체예 14-26 중 어느 하나에 있어서, 작용제, 선택적으로 조영제 또는 약물 또는 크레아티닌, 또는 크레아틴, 또는 사르코신을 전달하기 위한 수단을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 수단은 약물 펌프이고,
선택적으로, 상기 약물은 면역억제제; 백금제와 같은 화학요법제; 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 및 페니실린과 같은 항균제; 및 몰핀, 디아몰핀 및 코데인과 같은 오피오이드 진통제;로 이루어진 군으로부터 선택되고,
선택적으로, 상기 전달되는 제제의 양은 계산된 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율에 기초하여 조정되는 센서 시스템.
28. 구체예 14-27 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템은 제2 센서 및 선택적으로 제2 샘플을 수득하기 위한 제2 수단을 추가로 포함하고, 상기 제2 샘플은 상기 제2 센서에서 검출하기 전에 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하는 제2 감지 시약과 접촉되고, 선택적으로, 상기 시스템은 상기 제2 감지 시약이 상기 센서와 접촉하기 전에 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250 초, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 분 이상 첨가된 제2 샘플에 첨가되도록 배치되는 센서 시스템.
29. 구체예 28에 있어서, 상기 시스템은 상기 제1 센서로부터 획득된 데이터로부터 상기 제2 센서로부터 획득된 데이터를 감산하는 수단을 포함하는 센서 시스템.
30. 구체예 14-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 센서는 데이터를 연속적으로 캡처하는 센서 시스템.
31. 구체예 14-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 센서는 적어도 24 시간마다, 또는 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다 예를 들어 적어도 0.5 초마다 데이터를 캡처하는 센서 시스템.
32. 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준의 측정 방법으로서, 상기 방법은 구체예 1-31 중 어느 하나의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액인 방법.
33. 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 측정 방법으로서, 상기 방법은 구체예 1-31 중 어느 하나의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세 투석액인 방법.
34. 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 수준을 실시간으로 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 구체예 1-31 중 어느 하나의 센서 시스템의 조성물의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액인 방법.
35. 급성 또는 만성 신장 질환을 갖는 대상을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 구체예 32-34 중 어느 하나의 방법에 따른 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율을 측정하는 단계를 포함하고, 선택적으로 급성 또는 만성 신장 질환에 대한 대상을 치료하거나 급성 또는 만성 질환에 사용이 금지되거나 위험한 약물로의 치료를 중단하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 약물은
면역억제제; 백금제와 같은 화학요법제; 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 및 페니실린과 같은 항균제; 및 몰핀, 디아몰핀 및 코데인과 같은 오피오이드 진통제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
36. 구체예 32-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 측정은 선택적으로 약물의 투여 전 및 후에, 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신의 양의 투여 후에 측정되는 방법.
37. 구체예 32-36 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 약물의 투여량의 투여를 추가로 포함하고, 상기 투여량은 상기 센서 시스템에 의해 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율에 기초하여 측정되는 방법.
38. 이식을 위해 신장을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 신장을 관류시키고 일정량의 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신을 시스템에 투여하고, 구체예 1-37 중 어느 하나의 조성물 및/또는 시스템 및/또는 방법을 사용하여 크레아티닌 제거율을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
39. 이식 수용자의 신장 기능을 모니터링하는 방법으로서, 상기 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율은 구체예 1-38 중 어느 하나의 조성물, 센서 시스템 및/또는 방법을 사용함으로써 측정되는 방법.
40. 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 선택적으로 둘 또는 모두; 및/또는
구체예 1 내지 13중 어느 하나에 따른 조성물;
크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신; 및/또는
적어도 하나의 폐기물 용기;
완충액, 선택적으로 구체예 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 완충액;
미세투석 프로브; 및/또는
적어도 하나, 선택적으로 적어도 두 개의 정밀 펌프
를 포함하는 키트.
Claims (56)
- 사르코신 옥시다제 및/또는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및 적어도 하나의 제1 센서를 포함하고, 상기 제1 센서는 선택적으로 전류측정 센서이고, 상기 사르코신 옥시다제 및/또는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제는 조성물의 일부인 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 효소 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제 및 크레아티나제 중 선택적으로 2개 또는 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제 및 크레아티나제를 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 효소의 최소한 하나, 선택적으로 2개, 선택적으로 모든 효소는 고정화되지 않고, 선택적으로 상기 모든 효소가 용액 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제4항에 있어서, 상기 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제 및 크레아티나제는 용액 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 조성물이 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제6항에 있어서, 상기 완충액은 포스페이트 완충액 또는 PBS가 아니거나, 그리고/또는 트리스(Tris) 완충액이 아니거나, 그리고/또는 테트라보레이트가 아니거나 그리고/또는 HEPES가 아닌 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 완충액은 EPPS, HEPBS, POPSO, HEPPSO 및 MOBS로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 상기 완충액은 pH가 7.0 내지 9.0, 선택적으로 7.3 내지 8.95, 선택적으로 8.5인 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 pH 8.0-8.5에서 EPPS, 선택적으로 pH 8.0-8.5에서 50mM EPPS, 선택적으로 pH 8.0에서 50mM EPPS 또는 pH 8.5에서 50mM EPPS를 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 우레아제 및/또는 우리카제 및/또는 시스타틴(Cystain) C를 검출하는 수단 및/또는 알부민을 검출하는 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크레아티니나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CNH-311로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 크레아티나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CRH-211로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 사르코신 옥시다제는 Sorachim 카탈로그 번호 SAO-351로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서 사르코신 옥시다제 및/또는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제의 농도는 최종 반응 혼합물에서 크레아티니나제의 농도가 300U/ml 이상, 및/또는 크레아티나제의 농도가 120U/ml 이상이고 사르코신 옥시다제의 농도가 10U/ml 이상인 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 10:5:1 내지 49:8:1 U/ml의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 600 U/ml, 300 U/ml 및 60 U/ml 양으로 포함하고, 선택적으로 상기 조성물은 pH 8.5에 있는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 회로, 미세유체 장치 및 미세투석 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 흐름 시스템을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 샘플을 얻기 위한 수단, 선택적으로 환자로부터의 샘플 또는 폐쇄-루프 분리 관류 기관으로부터의 샘플, 선택적으로 신장을 추가로 포함하고,
선택적으로 환자로부터의 상기 샘플은 미세투석액, 선택적으로 혈액, 소변, 혈장, 조직액, 뇌척수액으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 센서와 접촉시키기 전에 사르코신 옥시다제 및/또는 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물은 상기 샘플에 첨가되도록 배치되고, 선택적으로, 상기 감지 시약은 상기 센서와 접촉하기 전에 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250초, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10분 이상으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 감지 시약의 첨가 전 또는 후에, 상기 샘플 내 산소의 양을 증가시키는 수단을 포함하고, 선택적으로 상기 산소의 양을 증가시키는 수단은:
선택적으로 배플(baffles) 또는 나선형의 구역을 포함하는 혼합기(선택적으로 상기 혼합기는 PDMS와 같은 고 투과성 재료로 만들어짐);
테플론(Teflon) 튜브에 의해 연결된 다수의 혼합 단계;
가압 용기;
중 임의의 하나 또는 그 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 10uM 미만, 선택적으로 7.5uM 미만, 선택적으로 5uM 미만, 선택적으로 4uM 미만, 선택적으로 3uM 미만, 선택적으로 2uM 미만, 선택적으로 1uM 미만의 농도에서 크레아티닌을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센서 시스템은 40uM 내지 120uM의 크레아티닌의 배경 수준에 대해, 1uM 미만, 또는 2uM 미만 또는 3uM 미만 또는 4uM 미만, 또는 5uM 미만 또는 7.5uM 미만 또는 10uM 미만의 크레아티닌 농도의 변화를 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 센서로부터 데이터를 수집하기 위한 수단, 선택적으로 PowerLab/4SP를 포함하고, 선택적으로 상기 시스템은 상기 데이터를 전송하기 위한 무선 전송 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 데이터 분석 수단, 선택적으로 컴퓨터 또는 웨어러블 장치를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 데이터 분석 수단은 무선으로 전송된 데이터를 수신하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폐기물 수집 용기를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 폐기물 수집 용기의 부피는 10ml 미만, 예를 들어 9.5ml 미만, 예를 들어 9ml 미만, 예를 들어 8.5ml 미만, 예를 들어 8ml 미만, 예를 들어 7.5ml 미만, 예를 들어 7ml 미만, 예를 들어 6.5ml 미만, 예를 들어 6ml 미만, 예를 들어 5.5ml 미만, 예를 들어 5ml 미만, 예를 들어 4.5ml 미만, 예를 들어 4 ml 미만, 예를 들어 3.5ml 미만, 예를 들어 3ml 미만, 예를 들어 2.5ml 미만, 예를 들어 2ml 미만, 예를 들어 1.5ml 미만, 예를 들어 1ml 미만, 예를 들어 0.5ml 미만, 예를 들어 0.25ml 미만인 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 이동식 시스템인 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율을 계산하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제, 선택적으로 조영제 또는 약물 또는 크레아티닌, 또는 크레아틴, 또는 사르코신을 전달하기 위한 수단을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 수단은 약물 펌프이고,
선택적으로 상기 약물은 면역억제제; 백금제와 같은 화학요법제; 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 및 페니실린과 같은 항균제; 및 몰핀, 디아몰핀 및 코데인과 같은 오피오이드 진통제로 이루어진 군으로부터 선택되고,
선택적으로 상기 전달되는 작용제의 양은 계산된 크레아티닌 수준/크레아티닌 제거율/사구체 여과율에 기초하여 조정되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 제2 센서 및 선택적으로 제2 샘플을 수득하기 위한 제2 수단을 추가로 포함하고, 상기 제2 샘플은 상기 제2 센서에서 검출하기 전에 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 포함하는 제2 감지 시약과 접촉되고, 선택적으로, 상기 시스템은 상기 제2 감지 시약이 상기 센서와 접촉하기 전에 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250 초, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 분 이상 첨가된 제2 샘플에 첨가되도록 배열되는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제29항에 있어서, 상기 시스템은 상기 제1 센서로부터 획득된 데이터로부터 상기 제2 센서로부터 획득된 데이터를 감산하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 센서는 데이터를 연속적으로 캡처하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 센서는 적어도 24 시간마다, 또는 적어도 22 시간마다, 예를 들어 적어도 20 시간마다, 예를 들어 적어도 18 시간마다, 예를 들어 적어도 16 시간마다, 예를 들어 적어도 14 시간마다, 예를 들어 적어도 12 시간마다, 예를 들어 적어도 10 시간마다, 예를 들어 적어도 8 시간마다, 예를 들어 적어도 6 시간마다, 예를 들어 적어도 5 시간마다, 예를 들어 적어도 4 시간마다, 예를 들어 적어도 3 시간마다, 예를 들어 적어도 2 시간마다 예를 들어 적어도 1.5 시간마다, 예를 들어 적어도 1 시간마다, 예를 들어 적어도 50 분마다, 예를 들어 적어도 45 분마다, 예를 들어 적어도 40 분마다, 예를 들어 적어도 35 분마다, 예를 들어 적어도 30 분마다, 예를 들어 적어도 25 분마다, 예를 들어 적어도 20 분마다, 예를 들어 적어도 15 분마다, 예를 들어 적어도 10 분마다, 예를 들어 적어도 5 분마다, 예를 들어 적어도 2 분마다, 예를 들어 적어도 1.5 분마다, 예를 들어 적어도 60 초마다, 예를 들어 적어도 45 초마다, 예를 들어 적어도 30 초마다, 예를 들어 적어도 15 초마다, 예를 들어 적어도 10 초마다, 예를 들어 적어도 5 초마다, 예를 들어 적어도 2 초마다, 예를 들어 적어도 1 초마다 예를 들어 적어도 0.5 초마다 데이터를 캡처하는 것을 특징으로 하는 센서 시스템.
- 효소 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제, 및 크레아티나제 중 선택적으로 2개 또는 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제 및 크레아티나제를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 효소의 최소한 하나, 선택적으로 2개, 선택적으로 모든 효소는 고정화되지 않고, 상기 모든 효소가 용액 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 사르코신 옥시다제, 크레아티니나제 및 크레아티나제가 용액 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제37항에 있어서, 상기 완충액은 포스페이트 완충액 또는 PBS가 아니거나, 그리고/또는 트리스(Tris) 완충액이 아니거나, 그리고/또는 테트라보레이트가 아니거나 그리고/또는 HEPES가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 완충액은 EPPS, HEPBS, POPSO, HEPPSO 및 MOBS로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액은 pKa가 7.0 내지 9.0, 선택적으로 7.3 내지 8.95, 선택적으로 8.5인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 상기 완충액은 pH가 7.0 내지 9.0, 선택적으로 7.3 내지 8.95, 선택적으로 8.5인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 pH 8.0-8.5에서 EPPS, 선택적으로 pH 8.0-8.5에서 50mM EPPS, 선택적으로 pH 8.0에서 50mM EPPS 또는 pH 8.5에서 50mM EPPS를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 우레아제 및/또는 우리카제 및/또는 시스타틴(Cystain) C를 검출하는 수단 및/또는 알부민을 검출하는 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크레아티니나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CNH-311로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 크레아티나제는 Sorachim 카탈로그 번호 CRH-211로부터 유래하고; 그리고/또는 상기 사르코신 옥시다제는 Sorachim 카탈로그 번호 SAO-351로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크레아티니나제 및/또는 크레아티나제 및/또는 사르코신 옥시다제의 농도는 최종 반응 혼합물에서 크레아티니나제의 농도가 300U/ml 이상, 그리고/또는 크레아티나제의 농도가 120U/ml 이상이고 사르코신 옥시다제의 농도가 10U/ml 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 10:5:1 내지 49:8:1 U/ml의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 크레아티닌을 함유하는 샘플과 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항의 상기 조성물의 혼합으로부터 생성된 최종 혼합 용액이 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제를 600 U/ml, 300 U/ml 및 60 U/ml 양으로 포함하고, 선택적으로 상기 조성물은 pH 8.5에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준의 측정 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 측정 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 조성물 또는 센서 시스템의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 인간 또는 동물 대상으로부터의 샘플에서 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 수준을 실시간으로 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 센서 시스템의 조성물의 사용을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 투석액 또는 미세투석액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 급성 또는 만성 신장 질환을 갖는 대상을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율을 측정하는 단계를 포함하고, 선택적으로 급성 또는 만성 신장 질환에 대한 대상을 치료하거나 급성 또는 만성 신장 질환에 사용이 금지되거나 위험한 약물로의 치료를 중단하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 약물은
면역억제제; 백금제와 같은 화학요법제; 글리코펩티드 반코마이신 및 테이코플라닌 및 페니실린과 같은 항균제; 및 몰핀, 디아몰핀 및 코데인과 같은 오피오이드 진통제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율의 측정은 선택적으로 약물의 투여 전 및 후에, 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신의 양의 투여 후에 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약물의 투여량의 투여를 추가로 포함하고, 상기 투여량은 상기 센서 시스템에 의해 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율에 기초하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 이식을 위해 신장을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 신장을 관류시키고 일정량의 크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신을 시스템에 투여하고, 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 조성물 및/또는 시스템 및/또는 방법을 사용하여 크레아티닌 제거율을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 이식 수용자의 신장 기능을 모니터링하는 방법으로서, 상기 크레아티닌 수준 및/또는 크레아티닌 제거율 및/또는 사구체 여과율은 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 조성물, 센서 시스템 및/또는 방법을 사용함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 크레아티니나제, 크레아티나제 및 사르코신 옥시다제 중 선택적으로 둘 또는 모두; 및/또는
제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 조성물;
크레아티닌 및/또는 크레아틴 및/또는 사르코신; 및/또는
적어도 하나의 폐기물 용기;
완충액, 선택적으로 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 완충액;
미세투석 프로브; 및/또는
적어도 하나, 선택적으로 적어도 두 개의 정밀 펌프
를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1712592.3 | 2017-08-04 | ||
| GBGB1712592.3A GB201712592D0 (en) | 2017-08-04 | 2017-08-04 | Novel compositions and uses thereof |
| PCT/GB2018/052231 WO2019025815A1 (en) | 2017-08-04 | 2018-08-03 | DETECTION OF CREATININE LEVELS USING ENZYMATIC COMPOSITIONS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200033938A true KR20200033938A (ko) | 2020-03-30 |
Family
ID=59894970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207005782A KR20200033938A (ko) | 2017-08-04 | 2018-08-03 | 효소 조성물을 이용한 크레아티닌의 검출 조성물 및 그 방법 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20200371117A1 (ko) |
| EP (1) | EP3662077A1 (ko) |
| JP (2) | JP2020529212A (ko) |
| KR (1) | KR20200033938A (ko) |
| CN (1) | CN111315894A (ko) |
| AU (1) | AU2018311346A1 (ko) |
| CA (1) | CA3071765A1 (ko) |
| GB (1) | GB201712592D0 (ko) |
| WO (1) | WO2019025815A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220070121A (ko) * | 2020-11-20 | 2022-05-30 | 중앙대학교 산학협력단 | 금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115356410B (zh) * | 2022-08-05 | 2024-03-15 | 吴昕辰 | 一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| DE3515586A1 (de) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisiertes sarcosinoxidase-praeparat |
| JP3070726B2 (ja) * | 1997-03-17 | 2000-07-31 | 東洋紡績株式会社 | 溶液中のザルコシンオキシダーゼの安定化方法 |
| AT408662B (de) * | 2000-05-16 | 2002-02-25 | Hoffmann La Roche | Creatinin-sensor |
| US6867012B2 (en) * | 2000-12-05 | 2005-03-15 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Determination method of biological component and reagent kit used therefor |
| JP4058475B2 (ja) * | 2001-02-02 | 2008-03-12 | 株式会社シノテスト | クレアチニン又はクレアチン測定方法及び測定試薬並びにｍタンパク影響回避剤 |
| JP2006349412A (ja) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | クレアチニンバイオセンサ |
| TWI318107B (en) * | 2006-01-02 | 2009-12-11 | Univ Chung Yuan Christian | Dual type potentiometric creatinine biosensor based on ion electrodes and fabricating method thereof |
| WO2007128286A1 (de) * | 2006-05-08 | 2007-11-15 | 8Sens.Biognostic Gmbh | Verfahren zum gekoppelten enzym-immunchemischen nachweis von analyten mittels endogener kalibratoren |
| EP2122343A4 (en) * | 2007-02-21 | 2015-01-07 | Bard Inc C R | MONITOR RENAL |
| GB0711849D0 (en) * | 2007-06-19 | 2007-07-25 | Oxford Biosensors Ltd | Redox Mediators |
| JP5925026B2 (ja) * | 2011-04-28 | 2016-05-25 | アークレイ株式会社 | クレアチニン測定用乾式試験片及びクレアチニン測定法 |
| CN107003326B (zh) * | 2014-12-18 | 2019-10-22 | 雷迪奥米特医学公司 | 对用于测量肌酸酐浓度的设备进行校准的方法 |
| CN114958814A (zh) * | 2015-02-27 | 2022-08-30 | 雷迪奥米特医学公司 | 改性的肌酸酶 |
| GB2538731B (en) * | 2015-05-26 | 2019-05-22 | Imperial Innovations Ltd | Methods |
| CN106124779B (zh) * | 2016-06-15 | 2019-10-18 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种用于测定肌酐的试剂盒和方法 |
-
2017
- 2017-08-04 GB GBGB1712592.3A patent/GB201712592D0/en not_active Ceased
-
2018
- 2018-08-03 WO PCT/GB2018/052231 patent/WO2019025815A1/en unknown
- 2018-08-03 KR KR1020207005782A patent/KR20200033938A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-08-03 CN CN201880059729.2A patent/CN111315894A/zh active Pending
- 2018-08-03 US US16/636,598 patent/US20200371117A1/en active Pending
- 2018-08-03 EP EP18759678.8A patent/EP3662077A1/en active Pending
- 2018-08-03 JP JP2020505873A patent/JP2020529212A/ja active Pending
- 2018-08-03 AU AU2018311346A patent/AU2018311346A1/en active Pending
- 2018-08-03 CA CA3071765A patent/CA3071765A1/en active Pending
-
2023
- 2023-05-08 JP JP2023076910A patent/JP2023106453A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220070121A (ko) * | 2020-11-20 | 2022-05-30 | 중앙대학교 산학협력단 | 금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023106453A (ja) | 2023-08-01 |
| EP3662077A1 (en) | 2020-06-10 |
| GB201712592D0 (en) | 2017-09-20 |
| AU2018311346A1 (en) | 2020-02-13 |
| JP2020529212A (ja) | 2020-10-08 |
| CN111315894A (zh) | 2020-06-19 |
| WO2019025815A1 (en) | 2019-02-07 |
| US20200371117A1 (en) | 2020-11-26 |
| CA3071765A1 (en) | 2019-02-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lad et al. | Electrochemical creatinine biosensors | |
| Jobst et al. | Thin-film microbiosensors for glucose− lactate monitoring | |
| Killard et al. | Creatinine biosensors: principles and designs | |
| Mǎdǎraş et al. | Miniaturized biosensors employing electropolymerized permselective films and their use for creatinine assays in human serum | |
| Suzuki | Advances in the microfabrication of electrochemical sensors and systems | |
| Eklund et al. | A microphysiometer for simultaneous measurement of changes in extracellular glucose, lactate, oxygen, and acidification rate | |
| JP6646579B2 (ja) | 高アンモニア血症の検出のためのデバイス及びデバイスを使用する方法 | |
| Jin et al. | Determination of Glucose in Submicroliter Samples by CE− LIF Using Precolumn or On-Column Enzymatic Reactions | |
| CN100570353C (zh) | 双通道自校准多参数快速全血生化分析传感器 | |
| JP2023106453A (ja) | 酵素組成物を用いたクレアチンレベルの検出 | |
| McKenzie et al. | Real-time monitoring of cellular bioenergetics with a multianalyte screen-printed electrode | |
| Deroco et al. | Paper‐based wearable electrochemical sensors: a new generation of analytical devices | |
| Liu et al. | Thin-layer potentiometry for creatinine detection in undiluted human urine using ion-exchange membranes as barriers for charged interferences | |
| Higson et al. | Enzyme and other biosensors: Evolution of a technology | |
| Shitanda et al. | Air-bubble-insensitive microfluidic lactate biosensor for continuous monitoring of lactate in sweat | |
| Bezinge et al. | Rapid electrochemical flow analysis of urinary creatinine on paper: unleashing the potential of two-electrode detection | |
| Moon et al. | Development and characterization of a microfluidic glucose sensing system based on an enzymatic microreactor and chemiluminescence detection | |
| Nagy et al. | Development and study of an amperometric biosensor for the in vitro measurement of low concentration of putrescine in blood | |
| Böhm et al. | A flow-through amperometric sensor based on dialysis tubing and free enzyme reactors | |
| Dong et al. | Advancements in amperometric biosensing instruments for creatinine detection: A critical review | |
| US11213228B2 (en) | Stacked sensor assembly for fluid analyzer | |
| Han et al. | Clinical determination of glucose in human serum by a tomato skin biosensor | |
| JP4660768B2 (ja) | 微小分析装置及び微少試料の分析方法 | |
| D’Orazio | Electrochemical sensors: a review of techniques and applications in point of care testing | |
| Kauffmann et al. | The electrochemical biosensor era |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |