WO2007128286A1 - Verfahren zum gekoppelten enzym-immunchemischen nachweis von analyten mittels endogener kalibratoren - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for the detection of numerous analytes, e.g. of metabolites and antigens in biological or other liquid samples, by means of analytical elements, in particular lateral-flow test strips, flow-through test systems, microtiter wells or wells. Fields of application of the invention are above all medical diagnosis, the pharmaceutical industry and environmental protection.
- Analytical elements such as e.g. Immunochromatographic test systems, for the detection of numerous analytes in biological fluids or for the detection of pollutants in environmental samples have been known for years and have proven very successful in practice. They mainly work according to the sandwich or competition principle (with small analytes).
- affinity assays for example immunoassays, receptor and DNA assays
- sample matrices e.g., urine, saliva, tears, sweat, cerebrospinal fluid, or blood.
- sample matrices e.g., urine, saliva, tears, sweat, cerebrospinal fluid, or blood.
- An example of these substances acting as endogenous calibrators is creatinine in the sample matrix urine. Concentration fluctuations between 4 and 28 mmol creatinine per liter of urine are quite normal in spontaneous urine samples from healthy volunteers (Fundamentals of Laboratory Testing: Urine, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). If one compares these values with the average value (15 mmol / l) of the 24-Stunden Urine, then it becomes clear that a dilution by a factor of 3.5 in the normal range, the urine can also be concentrated by a factor of 2.
- the determined measured value must be corrected accordingly, so it is a double determination (endogener calibrator and analyte) and a subsequent calculation necessary.
- the creatinine concentration is first determined via an enzymatic cascade, and in the second step, the amount of the analyte (usually immunochemical).
- This approach is time consuming and labor intensive.
- the object of the invention was therefore to find novel solutions for test systems which determine different analytes in sample matrices with non-constant concentrations.
- the invention is realized according to the claims. It relates to a method for the detection of numerous analytes, e.g. of metabolites and antigens in biological or other liquid samples, by means of analytical elements, in particular lateral-flow test strips, flow-through test systems, microtiter plate wells or tubes, the method being based on coupled enzyme and affinity reactions, and is realized by endogenous calibrators.
- analytical elements in particular lateral-flow test strips, flow-through test systems, microtiter plate wells or tubes, the method being based on coupled enzyme and affinity reactions, and is realized by endogenous calibrators.
- the main idea is that enzyme and immunochemical methods are coupled and the concentration of endogenous calibrators of the respective sample matrix is included in the overall result, whereby the analyte concentration to be determined is automatically corrected by the implemented system.
- body fluids are incubated with an enzyme mix (Reaction 1), whereby the hydrogen peroxide (H2O2) produced during the incubation by conversion of the endogenous calibrator is partially or completely dissolved in a second, now immune reaction (Reaction 2), with the same body fluid is used by a marker enzyme for signal formation. This signal is detected and compared or offset with the signal of the H 2 O 2 produced in the first reaction.
- the two reactions of the process can be carried out simultaneously or sequentially, and they can be carried out in one or two separate compartments.
- the preferred compartments are lateral-flow test strips, flow-through test systems, wells / wells of microtiter plates or tubes.
- the signal acquisition takes place according to Invention visually (naked eye), colorimetric, by fluorescence or electrochemical.
- the evaluation is carried out by means of nomogram, comparator (reference strip), reading device or mere visual comparison, whereby in the latter case the number of signals enzymatically generated by calibrator (eg test lines or test dots) in relation to the number of signals immunologically generated by analyte (eg test lines or test points (dots)) is set.
- calibrator eg test lines or test dots
- analyte eg test lines or test points (dots)
- body fluids such as urine, saliva, tears, sweat, cerebrospinal fluid or blood can be examined.
- creatinine, glucose, glucose-6-phosphate, lactate, glutamate, aspartate, cholesterol, pyruvate, urea and triglycerides serve as endogenous calibrators.
- Marker enzymes are preferably peroxidases and oxidases.
- an enzyme mix which reacts with the endogenous calibrator present in the respective body fluid to form H 2 O 2 .
- creatinine is the endogenous calibrator that uses a mixture of creatininase, creatinase and sarcosine oxidase.
- glucose is used as the endogenous calibrator in the same sample matrix, glucose oxidase is used to generate H 2 O 2 .
- Example 1 Detection of cardiac-specific fatty acid binding protein (FABP) with simultaneous correction by means of endogenous calibrator (creatinine) in lateral-flow test systems in the urine sample matrix (see Figures 1, 3, 4 and 6).
- FBP cardiac-specific fatty acid binding protein
- the urine sample (200 ⁇ l) is portioned into 2 equal parts (A and B). Part A is added to a tube (see Figure 3) containing the following enzyme mix lyophilized (20 ⁇ l each): creatininase (18.8 U / ml), creatinase (7.5 U / ml) and sarcosine oxidase (11.3 U / ml). ml). The tube is mixed and incubated for 20 minutes at room temperature (20-25 0 C). The reconstituted enzyme mix converts endogenous creatinine in the urine into hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), among other things (see Figure 1).
- H 2 O 2 hydrogen peroxide
- Part B is first diluted 1: 4 with a commercial protein stabilizer and then 50 ⁇ l are applied to the test strip ( Figure 4, Sample Port 1).
- the immobilized under sample port 1 anti-FABP / horseradish peroxidase conjugate is thus dissolved out of its matrix, forms a complex with the analyte (FABP - anti-FABP / horseradish peroxidase) and flows over the test field, on which another anti-FABP Antibody is immobilized as a catcher.
- the latter binds in the presence of FABP the mentioned complex depending on the analyte concentration. 20 minutes after the application of Part B, 100 ⁇ l of pre-incubated Part A are added to the sample port 2.
- the Calibrator (glucose) in microtiter plate-based macro-dot assays in the urine sample matrix see Figures 2 and 5).
- the macro-dot assays use commercial membrane-coated microtiter plates (96 wells) ( Figure 5/1).
- the membrane material is preferably PVDF or nitrocellulose.
- the point (dot) scheme used depends on the particular application; Examples are shown in Figure 5/2.
- work is done with 5 dots ( Figure 5/3), the center dot usually acting as a control.
- the outer dots can be used both for the detection of different analytes and for dilution corrections of individual analyte concentration.
- Figure 5 shows both the RGB images without (4) and with FABP addition (5) as well as those for evaluation used grayscale images without (6) and with FABP addition (7).
- the quantification was carried out, the data of which are shown in Table 1.
- the effects of this self-calibrating assay are evident when adding 100 ng / ml FABP to both urine samples. From the last line it can be seen that the morning urine used is 74 times more concentrated than the urine 1.
- the signals generated by the scheme used in the capture antibodies (1; 2; 4 and 8 ng / ml) are evaluated for their dynamics. After strong signals for 1 ng / ml of capture antibody from 2 ng / ml catcher antibody is a continuous signal rise to saturation.
- Measured values correspond to the average pixel value of the area selected for evaluation
- Example 3 Flow-through macro-dot assays for the detection of
- Example 3 describes the use of flow-through macro-dot assays for the detection of analytes with simultaneous correction by means of endogenous calibrators for various sample matrices.
- 7 points are applied to a flow-through-device system (see Figure 7). Items “1” to “4" contain respective anti-analyte antibodies in increasing concentrations.
- Point “K” acts as a control and preferably contains anti-mouse immunoglobulin G or protein A.
- Point “EK” serves to detect the respective endogenous calibrator, ie it preferably consists of single enzymes or enzyme mixtures and peroxidase.
- Point “EK-Ü” is optional and contains in application the respective calibrator (eg creatinine or glucose) in the optimal concentration for the application as well as the components, which are necessary for the conversion of the calibrator into for example H 2 O 2. All points are Using this test system, the sample is first preincubated in a tube containing the enzyme mix necessary for conversion of the respective endogenous calibrator or the corresponding single enzyme and horseradish peroxidase-coupled anti-analyte antibody When analyte is present in the sample, the analyte-horseradish peroxidase-coupled anti-analyte antibody complex binds to the respective capture antibodies (points "1" to "4") due to different capture antibody concentrations success t a saturation in the direction of point "4".
- the respective calibrator eg creatinine or glucose
- the product formed by conversion of the endogenous calibrator in the reaction mixture (preferably H 2 O 2 ) now initiates the conversion of the immobilized in each dot H 2 O 2 -free, locally tightly limited precipitating peroxidase substrate from its colorless precursor to a blue-violet Precipitate.
- the amount of precipitate depends on the local peroxidase and, for example, the H 2 O 2 concentration.
- Figure 1 Complete reaction scheme for the sample matrix urine and the endogenous calibrator creatinine
- Figure 6 Comparator card for the detection of FABP with simultaneous correction by means of endogenous calibrator (creatinine) in lateral flow test systems in the urine sample matrix
- Figure 7 Flow-through macro-dot assays for the detection of analytes with simultaneous correction by endogenous calibrators for various sample matrices
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zahlreichen Analyten, wie z.B. von Metaboliten und Antigenen in biologischen oder anderen flüssigen Proben, mittels Analyseelementen, insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss- Membransystemen (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen, wobei das Verfahren auf miteinander gekoppelte Enzym- und Affinitätsreaktionen beruht und mittels endogener Kalibratoren, also endogen gebildeter Substanzen, mit deren Hilfe Verdünnungen von Probenmatrices korrigiert werden können (z.B. Kreatinin, Glucose, Glucose-6-Phosphat, Lactat, Glutamat, Aspartat, Cholesterol, Pyruvat, Harnstoff und Triglyceride), realisiert wird. Anwendungsgebiete der Erfindung sind vor allem die medizinische Diagnostik, die pharmazeutische Industrie und der Umweltschutz. Bevorzugt betrifft die Erfindung den simultanen oder sequentiellen Nachweis von Antigenen und Metaboliten. Dabei handelt es sich im Sinne der Erfindung vor allem um hochmolekulare Antigene, wie z.B. Proteine, oder niedermolekulare Haptene, wie z.B. Pestizide, Neopterin, Schadstoffe oder Hormone, bei den Metaboliten z.B. um Glucose oder Kreatinin. Die Ergebnisse können mit Hilfe eines Nomogramms, Komparators (Referenzstreifen), Lesegerätes oder durch den bloßen visuellen Vergleich direkt aus dem Assay ermittelt werden.
Description
Verfahren zum gekoppelten enzym-immunchemischen Nachweis von Analyten mittels endogener Kalibratoren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zahlreichen Analyten, wie z.B. von Metaboliten und Antigenen in biologischen oder anderen flüssigen Proben, mittels Analysenelementen, insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss- Membransystemen (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind vor allem die medizinische Diagnostik, die pharmazeutische Industrie und der Umweltschutz. Analytische Elemente, wie z.B. immunochromatografische Testssysteme, zum Nachweis von zahlreichen Analyten in biologischen Flüssigkeiten oder zum Nachweis von Schadstoffen in Umweltproben sind seit Jahren bekannt und haben sich in der Praxis sehr bewährt. Sie arbeiten vornehmlich nach dem Sandwich- oder Konkurrenzprinzip (bei kleinen Analyten). Die Verwendung von Affinitätsassays, zum Beispiel Immunoassays, Rezeptor- und DNA-Assays, ist von immer größerer Bedeutung für klinische und zahlreiche andere Anwendungen. Dabei werden in verschiedenen Probenmatrices (z.B. Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Liquor oder Blut) sehr unterschiedliche Analyte nachgewiesen. Ein Problem stellt dabei gegenwärtig noch dar, dass zumindest ein Teil der genannten Matrices (z.B. Urin) in ihrer Verdünnung nicht konstant sind; im Tagesverlauf treten also deutliche Konzentrationsänderungen auf, die dem entsprechend den Analyt-Messwert beeinflussen. Für einzelne Körpermatrices sind jedoch endogen gebildete Substanzen beschrieben, mit deren Hilfe die jeweilige Verdünnung korrigiert werden kann; das System wird somit kalibrierbar (Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 5 2005; Norpoth K, Heger M (1984) Kreatinin als Bezugsgröße bei der Angabe von Stoffkonzentrationen im Harn. In: Hentschler D, Lehnert G (Hrsg) Biologische Arbeitsstoff-Toleranz-Werte (BAT-Werte)
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Urins, dann wird deutlich, dass eine Verdünnung um den Faktor 3,5 im Normbereich liegt, der Urin aber auch um den Faktor 2 aufkonzentriert sein kann. Bezogen auf einen Analyten, der in der Probenmatrix Urin bestimmt werden soll, heißt das: der ermittelte Messwert muss entsprechend korrigiert werden, es ist also eine Doppelbestimmung (endogener Kalibrator und Analyt) und eine anschließende Kalkulation notwendig. In der Praxis bedeutet das die Durchführung von zwei separaten Tests. Im Falle von Urin wird über eine enzymatische Kaskade zunächst die Kreatininkonzentration bestimmt und im zweiten Schritt die Menge des Analyten (meist immunchemisch). Diese Herangehensweise ist zeit- und arbeitsaufwendig. Die Aufgabe der Erfindung war deshalb, für Testsysteme, welche verschiedene Analyte in Probenmatrices mit nicht konstanten Konzentrationen bestimmen, neuartige Lösungen zu finden.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Sie betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zahlreichen Analyten, wie z.B. von Metaboliten und Antigenen in biologischen oder anderen flüssigen Proben, mittels Analysenelementen, insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss-Membransystemen (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen, wobei das Verfahren auf miteinander gekoppelte Enzym- und Affinitätsreaktionen beruht und mittels endogener Kalibratoren realisiert wird.
Die Hauptidee besteht darin, dass enzym- und immunchemische Methoden gekoppelt werden und die Konzentration endogener Kalibratoren der jeweiligen Probenmatrix in das Gesamtergebnis mit einfließt, wobei die zu bestimmende Analytkonzentration durch das realisierte System automatisch korrigiert wird. Bei diesem kombinierten enzymatischen / immunologischen Testsystem, werden Körperflüssigkeiten mit einem Enzymmix inkubiert (Reaktion 1 ), wobei das bei der Inkubation durch Umwandlung des endogenen Kalibrators entstandene Wasserstoffperoxid (H2O2) teilweise oder vollständig in einer zweiten, jetzt Immunreaktion (Reaktion 2), mit der gleichen Körperflüssigkeit durch ein Markerenzym zur Signalbildung genutzt wird. Dieses Signal wird erfasst und mit dem Signal des in der 1. Reaktion entstandenen H2O2 verglichen oder verrechnet. Die beiden Reaktionen des Verfahrens können simultan oder sequentiell durchgeführt werden, ferner können sie in einem oder in 2 von einander getrennten Kompartiments durchgeführt werden. Als Kompartiments dienen bevorzugt lateral- flow Teststreifen, Durchfluss-Membransysteme (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen. Die Signalerfassung erfolgt gemäß der
Erfindung visuell (bloßes Auge), kolorimetrisch, durch Fluoreszenz oder elektrochemisch.
Die Auswertung wird mittels Nomogramm, Komparator (Referenzstreifen), Lesegerät oder bloßem visuellen Vergleich vorgenommen, wobei bei letzterem die Anzahl der mittels Kalibrator enzymatisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) in das Verhältnis zu der Anzahl mittels Analyt immunologisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) gesetzt wird. Mit dem neuen Verfahren lassen sich Körperflüssigkeiten, u. a. Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Liquor oder Blut untersuchen. Als endogene Kalibratoren dienen insbesondere Kreatinin, Glucose, Glucose-6-Phosphat, Lactat, Glutamat, Aspartat, Cholesterol, Pyruvat, Harnstoff und Triglyceride. Markerenzyme sind bevorzugt Peroxidasen und Oxidasen. Es wird bevorzugt ein Enzymmix verwendet, der mit dem in der jeweiligen Körperflüssigkeit vorhandenen endogenen Kalibrator unter Bildung von H2O2 reagiert. So wird im Falle der Körperflüssigkeit Urin bei Nutzung von Kreatinin als endogenem Kalibrator ein Mix aus Creatininase, Creatinase und Sarcosin Oxidase eingesetzt. Dient jedoch in der gleichen Probenmatrix Glucose als endogener Kalibrator, wird Glucose Oxidase zur Generierung des H2O2 verwendet.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass mit einem derartigen kombinierten System in Probenmatrices mit nicht konstanten Konzentrationen verschiedenste Analyte direkt, also mit der entsprechenden Verdünnungskorrektur, zuverlässig bestimmt werden können. Die Erfindung soll nachstehend durch Abbildungen näher erläutert werden.
Beispiele:
Beispiel 1 : Nachweis von Herz-spezifischem Fettsäure Bindungsprotein (FABP) bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator (Kreatinin) bei lateral-flow Testsystemen in der Samplematrix Urin (siehe Abbildungen 1 , 3, 4 und 6).
Die Urinprobe (200 μl) wird in 2 gleiche Teile (A und B) portioniert. Teil A wird in ein Röhrchen gegeben (siehe Abbildung 3), welches folgenden Enzymmix lyophilisiert (je 20 μl) enthält: Creatininase (18,8 U/ml), Creatinase (7,5 U/ml) und Sarcosin Oxidase (11.3 U/ml). Das Röhrchen wird gemixt und 20 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 0C) inkubiert. Durch den so rekonstituierten Enzymmix wird das im Urin endogen vorhandene Kreatinin u.a. zu Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt (siehe Abbildung 1 ). Teil B wird zunächst 1 :4 mit einem kommerziellen Proteinstabilisator verdünnt und anschließend werden 50 μl auf den Teststreifen aufgebracht (Abbildung 4; Probenöffnung 1). Das unter Probenöffnung 1 immobilisierte Anti- FABP / Meerrettich-Peroxidase Konjugat wird so aus seiner Matrix herausgelöst, bildet mit dem Analyten einen Komplex (FABP - Anti-FABP / Meerrettich- Peroxidase) und überströmt so das Testfeld, auf dem ein weiterer Anti-FABP Antikörper als Fänger immobilisiert ist. Letzterer bindet bei Vorhandensein von FABP den erwähnten Komplex in Abhängigkeit von der Analytkonzentration. 20 Minuten nach dem Aufbringen von Teil B werden 100 μl vorinkubierter Teil A in die Probenöffnung 2 gegeben. Damit wird das auf dem Teststreifen vorhandene immobilisierte, H2θ2-freie und lokal eng begrenzt päzipitierende Peroxidase Substrat in Lösung gebracht und überströmt zusammen mit dem H2O2 (resultierend aus der Umwandlung des Kreatinin) das Testfeld. Wird die Position der Fängerlinie erreicht kommt es jetzt zur Umwandlung des flüssigen und farblosen Substrates in ein blau/violettes Präzipitat. Die Menge des Präzipitates, also das generierte Signal, ist abhängig von der Analytkonzentration und der Menge an endogenem Kalibrator, welcher zur Generierung des für die Reaktion notwendigen H2O2 genutzt wird. Viel endogener Kalibrator (konzentrierter Morgenurin) erzeugt bei gleicher Analytkonzentration ein stärkeres Signal als eine Probe mit einer durchschnittlichen Kalibratorkonzentration (Tagesurin). Das beschriebene Testsystem korrigiert diesen Effekt durch seine Funktionsweise und erlaubt in diesem Fall mit Hilfe einer Komparatorkarte (siehe Abbildung 6) die wahre Analytkonzentration zu erfassen.
Beispiel 2: Nachweis von FABP bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem
Kalibrator (Glucose) bei Mikrotiterplatten-basierten Makro-Dot-Assays in der Samplematrix Urin (siehe Abbildungen 2 und 5). Für die Makro-Dot-Assays werden handelsübliche Membran-beschichtete Mikrotiterplatten (96 Wells) verwendet (Abbildung 5 / 1 ). Das Membranmaterial besteht vorzugsweise aus PVDF oder Nitrocellulose. Das verwendete Punkt- (Dot-) Schema hängt von der jeweiligen Applikation ab; Beispiele sind in Abbildung 5 / 2 dargestellt. Vorzugsweise wird mit 5 Dots gearbeitet (Abbildung 5 / 3), wobei der Mittelpunkts-Dot in der Regel als Kontrolle fungiert. Die äußeren Dots können sowohl für den Nachweis verschiedener Analyte als auch für Verdünnungskorrekturen einzelner Analytkonzentration genutzt werden. Im zu beschreibenden Beispiel wurde auf den Nachweis eines einzelnen Analyten (FABP) bei gleichzeitiger Korrektur der Verdünnung der verwendeten Samplematrix (Urin) fokussiert. Dazu wurde mit 4 Dots gearbeitet (siehe Abbildung 5, Mittelteil), die unterschiedliche Konzentrationen von Anti-FABP Antikörpern (Fänger) enthalten. Die Uhnprobe (400 μl) wird in 2 gleiche Teile (A und B) portioniert. Teil A wird in ein Röhrchen gegeben welches 6,5 U Glucose Oxidase und 0,5 mM Glucose enthält. Die separate Zugabe einer geringen und fixen Glucosemenge ist für die Erzeugung eines Basislevels an H2O2 notwendig. Das Röhrchen wird gemixt und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 CC) inkubiert. Dadurch wird die im Urin endogen vorhandene Glucose u.a. zu Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt (siehe Abbildung 2). Teil B wird zunächst 1 :10 mit einem kommerziellen Proteinstabilisator verdünnt. Anschließend werden folgende Reaktionsansätze hergestellt (Tabelle 1 ):
Tabelle 1
Je Well werden 100 μl Reaktionsansatz zugegeben und alles 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 0C) inkubiert. Die Zugabe von FABP erfolgte, um die zu beschreibenden Effekte deutlicher darstellen zu können. Nur bei Vorhandensein von FABP kann sich am Fänger-Antikörper der Komplex: Fänger-Antikörper / FABP / Anti-FABP-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase Konjugat bilden. Danach wird die Platte 4 x gewaschen (0,1 M Na-P Puffer, pH 7.2) und jedem Well 50 μl folgenden Ansatzes zugegeben: 1 Teil Teil A
1 Teil H2θ2-freies, lokal eng begrenzt päzipitierendes Peroxidase-Substrat. Es folgt eine mindestens 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Dabei wird an den Positionen, an denen Meerrettich-Peroxidase gebunden ist, das flüssige und farblose Substrat in ein blaues Präzipitat umgewandelt, wobei die Menge des Präzipitates, also das generierte Signal, von der Analytkonzentration und der Menge an endogenem Kalibrator (Glucose), welcher zur Generierung des für die Reaktion notwendigen H2O2 genutzt wird, abhängig ist. Anschließend wird die Platte wiederum 4 x gewaschen (wie oben). Nach dem Trocknen erfolgt die Auswertung beispielsweise mit einem Bildgebenden Verfahren. Abbildung 5 zeigt sowohl die RGB-Bilder ohne (4) und mit FABP Zusatz (5) als auch die zur Auswertung
genutzten Graustufen-Bilder ohne (6) und mit FABP Zusatz (7). Auf Basis letzterer Bilder erfolgte die Quantifizierung, deren Daten in Tabelle 1 dargestellt sind. Die Effekte dieses selbst-kalibrierenden Assays werden bei Zusatz von 100 ng/ml FABP zu beiden Urinproben deutlich. Aus der letzten Zeile ist ersichtlich, dass der verwendete Morgenurin im Vergleich zum Tagesurin 1 , 74-fach konzentriert ist. Die durch das verwendete Schema bei den Fängerantikörpern (1 ; 2; 4 und 8 ng/ml) generierten Signale werden hinsichtlich ihrer Dynamik bewertet. Nach jeweils starken Signalen für 1 ng/ml Fängerantikörper erfolgt ab 2 ng/ml Fängerantikörper ein kontinuierlicher Signalanstieg bis zur Sättigung. Diese Sättigung ist bei gleichen Analytkonzentration im Tagesurin sehr viel eher erreicht, da diese nicht-konzentrierte Probe weniger endogenen Kalibrator (hier Glukose) enthält und somit nur eine geringere Menge an H2O2 gebildet werden kann. So können die Sättigungsverläufe für diagnostisch relevante Konzentrationsbereiche mathematisch beschrieben und in die Auswertungssoftware implementiert werden. Die korrigierte Konzentrationsermittlung von Analyten in Proben erfolgt dann durch den Vergleich der Sättigungsverläufe.
Tabelle 2: Quantifizierung der in Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse
Messwerte entsprechen dem Pixel-Durchschnittswert des zur Auswertung jeweils ausgewählten Bereiches
Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices (Abbildung 7).
Beispiel 3 beschreibt die Anwendung von Durchfluss- (flow-through) Makro-Dot- Assays zum Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices. Dabei werden auf einem Durchfluss- Membransystem (flow-through-device) zunächst 7 Punkte (Dots) aufgetragen (vgl. Abbildung 7). Die Punkte „1" bis „4" enthalten jeweilige Anti-Analytantikörper in steigenden Konzentrationen. Punkt „K" fungiert als Kontrolle und enthält vorzugsweise Anti-Maus-Immunglobulin G oder Protein A. Punkt „EK" dient zum Nachweis des jeweiligen endogenen Kalibrators, besteht also vorzugsweise aus Einzelenzymen oder Enzymgemischen sowie Peroxidase. Punkt „EK-Ü" ist optional und enthält bei Anwendung den jeweiligen Kalibrator (z.B. Kreatinin oder Glucose) in der für die Applikation optimalen Konzentration sowie die Komponenten, die zur Umwandlung des Kalibrators in beispielsweise H2O2 notwendig sind. Allen Punkten ist ein lokal eng begrenzt päzipitierendes Peroxidase-Substrat zugemischt. Bei Anwendung dieses Testsystems wird die Probe zunächst in einem Röhrchen, welches den zur Umwandlung des jeweiligen endogenen Kalibrators notwendigen Enzymmix oder das entsprechende Einzelenzym sowie Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Anti-Analytantikörper enthält, vorinkubiert. Anschließend wird dieser Reaktionsmix auf das Testfeld des Durchfluss-Membransystems aufgetragen. Wenn Analyt in der Probe vorhanden ist, bindet der Komplex Analyt - Meerrettich- Peroxidase gekoppelter Anti-Analytantikörper an den jeweiligen Fängerantikörpern (Punkte „1" bis „4"). Aufgrund der unterschiedlichen Fängerantikörper Konzentrationen erfolgt eine Sättigung in Richtung Punkt „4". Das durch Umwandlung des endogenen Kalibrators im Reaktionsmix gebildete Produkt (vorzugsweise H2O2) initiiert nun die Umwandlung des in jedem Dot vorab immobilisierten H2O2-freien, lokal eng begrenzt päzipitierenden Peroxidase- Substrates von seiner farblosen Vorstufe zu einem blau-violetten Präzipitat. Dabei hängt die Präzipitatmenge von der lokal vorhandenen Peroxidase und beispielsweise der H2O2 Konzentration ab.
Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1 : Komplettes Reaktionsschema für die Probenmatrix Urin und den endogenen Kalibrator Kreatinin
Abbildung 2: Komplettes Reaktionsschema für den endogen Kalibrator Glucose
Abbildung 3: Schema der „Reaktion 1" für die Probenmatrix Urin (endogener Kalibrator: Kreatinin)
Abbildung 4: Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator bei lateral-flow Testsystemen (schematische Darstellung)
Abbildung 5: Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator bei Mikrotiterplatten-basierten Makro-Dot- Assays
Abbildung 6: Komparatorkarte für den Nachweis von FABP bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator (Kreatinin) bei lateral- flow Testsystemen in der Samplematrix Urin
Abbildung 7: Durchfluss- (flow-through) Makro-Dot-Assays zum Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices
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Claims
1. Kombiniertes enzymatisches / immunologisches Testverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass Körperflüssigkeiten mit einem Enzymmix inkubiert werden (Reaktion 1 ), wobei das bei der Inkubation durch enzymatische Umwandlung des endogenen Kalibrators entstandene Produkt (beispielsweise Wasserstoffperoxid (H2O2)) teilweise in einer zweiten, jetzt Immunreaktion (Reaktion 2), mit der gleichen Körperflüssigkeit durch ein Markerenzym zur Signalbildung genutzt wird, dieses Signal erfasst und mit dem Signal des in der 1. Reaktion entstandenen Produktes (z.B H2O2) verglichen bzw. verrechnet wird.
2. Testverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Reaktionen simultan parallel oder sequentiell durchgeführt werden.
3. Testverfahren nach Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Reaktionen in einem oder in 2 von einander getrennten Kompartiments durchgeführt werden.
4. Testverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompartiments insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss- Membransysteme (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen sind.
5. Testverfahren nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalerfassung visuell (bloßes Auge), kolorimetrisch, turbidimetrisch, durch Fluoreszenz oder elektrochemisch erfolgt.
6. Testverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung mittels Nomogramm, Komparator (Referenzstreifen), Lesegerät oder bloßen visuellen Vergleich erfolgt, wobei bei letzterem die Anzahl der mittels Kalibrator enzymatisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) in das Verhältnis zu der Anzahl mittels Analyt immunologisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) gesetzt wird.
7. Testverfahren nach Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass als Körperflüssigkeiten insbesondere Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Liquor, Serum, Plasma oder Blut eingesetzt werden.
8. Testverfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als endogene Kalibratoren insbesondere Kreatinin, Glucose, Glucose-6- Phosphat, Lactat, Glutamat, Aspartat, Cholesterol, Pyruvat, Harnstoff und Triglyceride sowie Enzyme, wie alpha-Amylase, und Ionen, wie Kalzium-, Kalium- und Magnesiumionen, dienen.
9. Testverfahren nach Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass als Markerenzyme Peroxidasen und Oxidasen eingesetzt werden.
10. Testverfahren nach Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise ein Enzymmix verwendet wird, der mit dem in der jeweiligen Körperflüssigkeit vorhandenen endogenen Kalibrator unter Bildung von H2O2 reagiert.
11. Testverfahren nach Ansprüchen 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass der jeweilige endogene Kalibrator in einer konstanten, für die jeweilige Applikation optimalen Konzentration dem Reaktionsmix auch zugesetzt wird.
12. Testverfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass im Falle der Körperflüssigkeit Urin ein Mix aus Creatininase, Creatinase, Sarcosin Oxidase bei Nutzung von Kreatinin als endogenem Kalibrator eingesetzt wird bzw. das Enzym Glucose Oxidase bei Nutzung von Glucose als endogenem Kalibrator eingesetzt wird.
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