JP2009536023A - 内在性キャリブレーターを用いるアナライトの連結された酵素−免疫化学的検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生物学的液体試料又は他の液体試料中の多数のアナライト、例えば代謝物及び抗原を、分析エレメントを用いて、特にラテラルフロー試験ストリップ、フロースルー−膜システム(フロースルー試験)、マイクロタイタープレートのウェル/キャビティ又は試験用チューブを用いて検出する方法に関し、その際、前記方法は相互に連結した酵素反応及びアフィニティ反応に基づきかつ内在性キャリブレーター、つまり試料マトリックスの希釈度を修正することができる内在的に生成される物質(例えばクレアチニン、グルコース、グルコース−6−ホスファート、ラクタート、グルタマート、アスパルテート、コレステロール、ピルバート、尿素及びトリグリセリド)を用いて実現される。本発明の適用分野は、特に医学的診断、製剤工業及び環境保護である。有利には、本発明は抗原及び代謝物の同時検出又は順次検出に関する。これは本発明の範囲内においては、特に高分子の抗原、例えばタンパク質、又は低分子のハプテン、例えば殺虫剤、ネオプテリン、有害物質又はホルモンであり、代謝物、例えばグルコース又はクレアチニンである。この結果は、ノモグラム、コンパレーター(参照ストリップ)、読み取り装置を用いるか又は肉眼で視覚的な比較により前記アッセイから直接測定することができる。
Description
本発明は、生物学的液体試料又は他の液体試料中の多数のアナライト、例えば代謝産物及び抗原を、分析エレメント、特にラテラルフロー試験ストリップ、フロースルー−膜システム(フロースルー試験)、マイクロタイタープレートのウェル/キャビティ又は試験用チューブを用いて検出する方法に関する。本発明の適用分野は、特に医学的診断、製剤工業及び環境保護である。
生物学的液体中の多数のアナライトを検出するため又は環境試料中の有害物質を検出するための分析エレメント、例えば免疫クロマトグラフィー試験システムは数年来公知であり、かつ実際に極めて有効であることが実証されている。前記分析エレメントは、特にサンドウィッチ原理又は競合原理(小さなアナライトの場合)により機能する。アフィニティアッセイ、例えばイムノアッセイ、レセプターアッセイ及びDNAアッセイの使用は、臨床的用途及び多くの他の用途のために次第に重要になってきている。この場合、多様な試料マトリックス(例えば、尿、唾液、涙、汗、髄液又は血液)中に極めて多様なアナライトが検出される。この場合、現在ではまだ、前記マトリックス(例えば尿)の少なくとも一部はその希釈度において一定ではなく、日々の経過において明らかな濃度変動が生じ、それに応じてアナライト測定値に影響を及ぼすという問題がある。しかしながら、個々の身体マトリックスについては内在的に生成される物質が指摘されていて、前記物質を用いてその都度の希釈度を修正することができる。従って、このシステムは校正可能となる(非特許文献1、非特許文献2)。この内在性キャリブレーターとして機能する物質の例は、試料マトリックスの尿中ではクレアチニンである。健康な被験者の自発的−尿試料の場合に、尿1リットルあたり4〜28mmolのクレアチニンの濃度変動は全く通常である(Fundamentals of Laboratory Testing: Urine, Roche Diagnostics GmbH, マンハイム、ドイツ国)。この値を24時間の尿の平均値(15mmol/l)と比較する場合、3.5倍の希釈度が通常範囲であることが明らかであるが、この尿は2倍にも濃縮され得る。試料マトリックスの尿中で測定されるべきアナライトに関して、つまりこの測定された値は相応して修正しなければならず、これはつまり二重測定(内在性キャリブレーター及びアナライト)及びそれに続く計算が必要である。実際にこれは、2つの別個の試験の実施を意味する。尿の場合には、酵素によるカスケードを介してまずクレアチニン濃度が測定され、第2段階でアナライトの量(たいていは免疫化学的に)が測定される。この取り組み方法は時間がかかりかつ作業の手間がかかる。
Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 5 2005; Norpoth K, Heger M (1984) Kreatinin als Bezugsgroesse bei der Angabe von Stoffkonzentrationen im Harn Hentschler D, Lehnert G (Hrsg) Biologische Arbeitsstoff-Toleranz-Werte (BAT-Werte) Arbeitsmedizinischtoxikologische Begruendungen, Bd. 1. Kommission zur Pruefung gesundheitsschaedlicher Arbeitsstoffe der DFG
Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 5 2005; Norpoth K, Heger M (1984) Kreatinin als Bezugsgroesse bei der Angabe von Stoffkonzentrationen im Harn Hentschler D, Lehnert G (Hrsg) Biologische Arbeitsstoff-Toleranz-Werte (BAT-Werte) Arbeitsmedizinischtoxikologische Begruendungen, Bd. 1. Kommission zur Pruefung gesundheitsschaedlicher Arbeitsstoffe der DFG
従って、本発明の課題は、一定ではない濃度での試料マトリックス中の多様なアナライトを測定する試験システムのために新規の解決策を見出すことであった。
本発明は、請求項によって実現される。本発明は、生物学的液体試料又は他の液体試料中の多数のアナライト、例えば代謝産物及び抗原を、分析エレメントを用いて、特にラテラルフロー試験ストリップ、フロースルー−膜システム(フロースルー試験)、マイクロタイタープレートのウェル/キャビティ又は試験用チューブを用いて検出する方法に関し、その際、前記方法は相互に連結した酵素反応及びアフィニティ反応に基づきかつ内在性キャリブレーターを用いて実現される。
この基本思想は、酵素による方法と免疫化学による方法とを連結し、それぞれの試料マトリックスの内在性キャリブレーターの濃度を全体の結果に導入することにあり、その際、測定すべきアナライト濃度がこの実現されたシステムにより自動的に修正される。この組み合わせられた酵素/免疫化学よる試験システムの場合には、体液を酵素ミックスと共にインキュベーションし(反応1)、その際、前記インキュベーションの際に内在性キャリブレーターの変換により生じる過酸化水素(H2O2)を、部分的に又は完全に第2の免疫反応(反応2)において、同じ体液と共にマーカー酵素によるシグナル形成のために利用する。このシグナルを検知し、第1の反応において生じるH2O2のシグナルと比較するか又はこれを差し引いて考慮する。
この方法の両方の反応は同時に又は順次に実施することができ、さらにこれらの反応は1つのコンパートメント又は2つの相互に別個のコンパートメント中で実施することができる。コンパートメントとして、有利にラテラルフロー試験ストリップ、フロースルー−膜システム(フロースルー試験)、マイクロタイタープレートのウェル/キャビティ又は試験用チューブが利用される。このシグナル検知は、本発明の場合には、視覚的(肉眼)、比色分析、蛍光により又は電気化学的に行われる。
この評価は、ノモグラム、コンパレーター(参照ストリップ)、読み取り装置又は肉眼での視覚的比較により行われ、その際、後者の場合には、キャリブレーターを用いて酵素により生成されたシグナル(例えば試験ライン又は試験点(ドット))の数を、アナライトを用いて免疫化学的に生成されたシグナル(例えば試験ライン又は試験点(ドット))の数と対比する。
この新規の方法を用いて、体液、例えば尿、唾液、涙、汗、髄液又は血液が試験される。内在性キャリブレーターとして、特にクレアチニン、グルコース、グルコース−6−ホスフェート、ラクテート、グルタメート、アスパルテート、コレステロール、ピルベート、尿素及びトリグリセリドが用いられる。マーカー酵素は、好ましくはペルオキシダーゼ及びオキシダーゼである。好ましくは酵素ミックスが使用され、この酵素ミックスはそれぞれの体液中に存在する内在性キャリブレーターと反応してH2O2を形成させる。体液が尿である場合に、内在性キャリブレーターとしてクレアチニンを利用する際には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼからなるミックスが使用される。しかしながら、同じ試料マトリックス中でグルコースを内在性キャリブレーターとして利用する場合には、H2O2の生成のためにグルコースオキシダーゼを使用する。
意外にも、この種の組み合わせられたシステムを用いて、試料マトリックス中で、一定ではない濃度の非常に多様なアナライトを、直接、つまり相応する希釈補正を用いて確実に測定できることが確認された。本発明を、次に、図面によって詳細に説明する。
実施例1: サンプルマトリックスの尿中における、ラテラルフロー試験システムでの内在性キャリブレーター(クレアチニン)による同時補正を用いた心臓特異的な脂肪酸結合タンパク質(FABP)の検出(図1、3、4及び6を参照)
尿試料(200μl)を2つの同じ分量(A及びB)に分けた。分量Aを試験用チューブ内へ注ぎ込んだ(図3参照)。これは次の凍結乾燥された酵素ミックス(それぞれ20μl)を含有する:クレアチニナーゼ(18.8U/ml)、クレアチナーゼ(7.5U/ml)及びサルコシンオキシダーゼ(11.3U/ml)。この試験用チューブを混合し、20分間室温(20〜25℃)でインキュベーションした。こうして再構成された酵素ミックスにより、尿中の内在性のクレアチニンを特に過酸化水素(H2O2)に変換した(図1参照)。分量Bをまず市販のタンパク質安定剤で1:4に希釈し、引き続き50μlを試験ストリップ上にのせた(図4;試料用開口部1)。試料用開口部1の下に固定された抗−FABP/ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ抱合体がそのマトリックスから溶け出し、アナライトと複合体(FABP−抗−FABP/ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ)を形成し、他の抗−FABP抗体がキャッチャーとして固定されている試験フィールド上を流れる。後者はFABPの存在により前記複合体とアナライト濃度に依存して結合する。分量Bをのせた20分後に、予めインキュベーションした分量A100μlを試料用開口部2に注ぎ込む。それにより、この試験ストリップ上に存在する固定された、H2O2不含でかつ局所的に狭く限定的に沈積するペルオキシダーゼ基質が溶解し、H2O2(クレアチニンの変換から生じる)と一緒にテストフィールドの上を流れる。キャッチャーラインの位置に達すると、液状の無色の基質が青/紫の沈積物に変換される。沈積物の量、つまり生成されたシグナルは、アナライト濃度及び内在性キャリブレーターの量に依存し、前記内在性キャリブレーターは反応のために必要なH2O2の生成のために利用される。多量の内在性キャリブレーター(濃縮された早朝尿(Morgenurin))は、同じアナライト濃度の場合に平均的なキャリブレーター濃度(日中の尿(Tagesurin))を有する試料よりも強いシグナルを生じる。この記載された試験システムでは、この効果がその機能的に補正され、コンパレータカード(図6参照)を用いて本当のアナライト濃度を検知することができる。
尿試料(200μl)を2つの同じ分量(A及びB)に分けた。分量Aを試験用チューブ内へ注ぎ込んだ(図3参照)。これは次の凍結乾燥された酵素ミックス(それぞれ20μl)を含有する:クレアチニナーゼ(18.8U/ml)、クレアチナーゼ(7.5U/ml)及びサルコシンオキシダーゼ(11.3U/ml)。この試験用チューブを混合し、20分間室温(20〜25℃)でインキュベーションした。こうして再構成された酵素ミックスにより、尿中の内在性のクレアチニンを特に過酸化水素(H2O2)に変換した(図1参照)。分量Bをまず市販のタンパク質安定剤で1:4に希釈し、引き続き50μlを試験ストリップ上にのせた(図4;試料用開口部1)。試料用開口部1の下に固定された抗−FABP/ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ抱合体がそのマトリックスから溶け出し、アナライトと複合体(FABP−抗−FABP/ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ)を形成し、他の抗−FABP抗体がキャッチャーとして固定されている試験フィールド上を流れる。後者はFABPの存在により前記複合体とアナライト濃度に依存して結合する。分量Bをのせた20分後に、予めインキュベーションした分量A100μlを試料用開口部2に注ぎ込む。それにより、この試験ストリップ上に存在する固定された、H2O2不含でかつ局所的に狭く限定的に沈積するペルオキシダーゼ基質が溶解し、H2O2(クレアチニンの変換から生じる)と一緒にテストフィールドの上を流れる。キャッチャーラインの位置に達すると、液状の無色の基質が青/紫の沈積物に変換される。沈積物の量、つまり生成されたシグナルは、アナライト濃度及び内在性キャリブレーターの量に依存し、前記内在性キャリブレーターは反応のために必要なH2O2の生成のために利用される。多量の内在性キャリブレーター(濃縮された早朝尿(Morgenurin))は、同じアナライト濃度の場合に平均的なキャリブレーター濃度(日中の尿(Tagesurin))を有する試料よりも強いシグナルを生じる。この記載された試験システムでは、この効果がその機能的に補正され、コンパレータカード(図6参照)を用いて本当のアナライト濃度を検知することができる。
実施例2: サンプルマトリックスの尿中のマイクロタイタープレートに基づくマクロドットアッセイの場合の内在性キャリブレーター(グルコース)による同時補正を用いたFABPの検出(図2及び5を参照)
マクロドットアッセイのために、市販の膜被覆されたマイクロタイタープレート(96ウェル)を使用する(図5/1)。この膜材料は有利にはPVDF又はニトロセルロースからなる。使用される点−(ドット−)パターンは、それぞれの用途に依存し;例は図5/2に示されている。有利には、5個のドットで作業され(図5/3)、この場合、中央の点−ドットは原則として対照として機能する。外側のドットは、多様なアナライトの検出のために、並びに個々のアナライト濃度の希釈補正のために利用することができる。記載の実施例では、使用したサンプルマトリックス(尿)の希釈度の同時補正を用いた個々のアナライト(FABP)の検出にフォーカスする。ここでは、4個のドットで作業され(図5、中央参照)、これらのドットは多様な濃度の抗−FABP抗体(キャッチャー)を含有する。尿試料(400μl)を2つの同じ分量(A及びB)に分ける。分量Aは、グルコースオキシダーゼ6.5U及びグルコース0.5mMを含有する試験用チューブ内に注ぎ込む。少量かつ固定量のグルコースのこの別々の添加は、H2O2のベースレベルの生成のために必要である。この試験用チューブを混合し、60分間室温(20〜25℃)でインキュベーションする。それにより、尿中の内在的に存在するグルコースが、特に過酸化水素(H2O2)に変換される(図2参照)。分量Bを、まず市販のタンパク質安定剤で1:10に希釈する。引き続き次の反応バッチを製造する(表1):
マクロドットアッセイのために、市販の膜被覆されたマイクロタイタープレート(96ウェル)を使用する(図5/1)。この膜材料は有利にはPVDF又はニトロセルロースからなる。使用される点−(ドット−)パターンは、それぞれの用途に依存し;例は図5/2に示されている。有利には、5個のドットで作業され(図5/3)、この場合、中央の点−ドットは原則として対照として機能する。外側のドットは、多様なアナライトの検出のために、並びに個々のアナライト濃度の希釈補正のために利用することができる。記載の実施例では、使用したサンプルマトリックス(尿)の希釈度の同時補正を用いた個々のアナライト(FABP)の検出にフォーカスする。ここでは、4個のドットで作業され(図5、中央参照)、これらのドットは多様な濃度の抗−FABP抗体(キャッチャー)を含有する。尿試料(400μl)を2つの同じ分量(A及びB)に分ける。分量Aは、グルコースオキシダーゼ6.5U及びグルコース0.5mMを含有する試験用チューブ内に注ぎ込む。少量かつ固定量のグルコースのこの別々の添加は、H2O2のベースレベルの生成のために必要である。この試験用チューブを混合し、60分間室温(20〜25℃)でインキュベーションする。それにより、尿中の内在的に存在するグルコースが、特に過酸化水素(H2O2)に変換される(図2参照)。分量Bを、まず市販のタンパク質安定剤で1:10に希釈する。引き続き次の反応バッチを製造する(表1):
それぞれのウェルに反応バッチ100μlを添加し、全て室温(20〜25℃)で60分間インキュベーションする。記載されるべき効果をより明らかに示すために、FABPの添加を行う。FABPの存在の場合にだけ、複合体のキャッチャー抗体:キャッチャー抗体/FABP/抗−FABP−抗体−ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ抱合体が形成されることができる。その後で、このプレートを4回洗浄(0.1M Na−P緩衝液、pH7.2)し、それぞれのウェルに次のバッチ50μlを添加する:
分量A 1部
H2O2不含の、局所的に狭く限定的に沈着するペルオキシダーゼ基質 1部
分量A 1部
H2O2不含の、局所的に狭く限定的に沈着するペルオキシダーゼ基質 1部
室温で、少なくとも5分間のインキュベーションを行う。この場合、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼが結合している位置で、液状でかつ無色の基質が、青色の沈着物に変換され、その際、沈着物の量、つまり生成されるシグナルは、アナライト濃度及びこの反応のために必要なH2O2の生成のために利用される内在性キャリブレーター(グルコース)の量に依存する。引き続き、前記プレートを再び4回洗浄する(上記と同様)。乾燥後に、例えばイメージング法を用いた評価を行う。図5は、FABP添加なしのRGB画像(4)及びFABP添加ありのRGB画像(5)並びに評価のために用いられるFABP添加なしのグレースケール画像(6)及びFABP添加ありのグレースケール画像(7)を示す。後者の画像に基づき定量化が行われ、その定量化のデータが表1に示されている。この自己校正されるアッセイの効果は、両方の尿試料にFABP 100ng/mlを添加することにより明らかとなる。最後の行から、使用された早朝尿が日中の尿と比較して1.74倍濃縮されていることが明らかである。使用されたパターンによりキャッチャー抗体(1;2;4及び8ng/ml)で生成されたシグナルが、その動力学に関して評価される。1ng/mlのキャッチャー抗体についてのそれぞれ強いシグナルの後に、2ng/mlのキャッチャー抗体から連続的なシグナルの上昇が飽和に至るまで生じる。この飽和は、同じアナライト濃度の場合には日中の尿において極めて早くに達成され、それというのもこの濃縮されていない試料は内在性キャリブレーター(この場合グルコース)をあまり含んでおらず、それにより少量のH2O2が形成できるにすぎないためである。診断的に重要な濃度範囲のための飽和曲線は数学的に記載することができ、これは評価ソフトウェアで実施することができる。試料中のアナライトの補正された濃度測定は、次に飽和曲線の比較によって行われる。
実施例3: 種々のサンプルマトリックスのための内在性キャリブレーターによる同時補正を用いたアナライトの検出のためのフロースルー・マクロドットアッセイ(図7)
実施例3は種々のサンプルマトリックスのための内在性キャリブレーターによる同時補正を用いたアナライトの検出のためのフロースルー・マクロドットアッセイの評価を記載する。この場合、フロースルー−膜システム(フロースルーデバイス)上にまず7つの点(ドット)をプロットする(図7参照)。点「1」〜「4」はそれぞれ増加する濃度で抗−アナライト抗体を含有する。点「K」は対照として機能し、有利には抗−マウス−免疫グロブリンG又はプロテインAを含有する。点「EK」はそれぞれの内在性キャリブレーターの検出のために利用され、つまり有利には単一の酵素又は酵素混合物並びにペルオキシダーゼからなる。点「EK−U」は任意であり、使用の際にそれぞれのキャリブレーター(例えばクレアチニン又はグルコース)を適用のために最適の濃度で含有し、そして前記キャリブレーターが例えばH2O2に変換されるために必要である成分を含有する。全ての点は、局所的に狭く限定的に沈着するペルオキシダーゼ基質が混合されている。
実施例3は種々のサンプルマトリックスのための内在性キャリブレーターによる同時補正を用いたアナライトの検出のためのフロースルー・マクロドットアッセイの評価を記載する。この場合、フロースルー−膜システム(フロースルーデバイス)上にまず7つの点(ドット)をプロットする(図7参照)。点「1」〜「4」はそれぞれ増加する濃度で抗−アナライト抗体を含有する。点「K」は対照として機能し、有利には抗−マウス−免疫グロブリンG又はプロテインAを含有する。点「EK」はそれぞれの内在性キャリブレーターの検出のために利用され、つまり有利には単一の酵素又は酵素混合物並びにペルオキシダーゼからなる。点「EK−U」は任意であり、使用の際にそれぞれのキャリブレーター(例えばクレアチニン又はグルコース)を適用のために最適の濃度で含有し、そして前記キャリブレーターが例えばH2O2に変換されるために必要である成分を含有する。全ての点は、局所的に狭く限定的に沈着するペルオキシダーゼ基質が混合されている。
この試験システムの評価の場合には、前記試料をまず、それぞれの内在性キャリブレーターの変換のために必要な酵素ミックス又は相応する単一酵素並びにホースラディッシュ−ペルオキシダーゼを結合する抗−アナライト抗体を含有する試験用チューブ中で予備インキュベーションする。引き続き、この反応ミックスをフロースルー−膜システムの試験フィールド上にのせる。アナライトが試料中に存在している場合には、複合体のアナライト−ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼを結合する抗−アナライト抗体がそれぞれのキャッチャー抗体に結合する(点「1」〜「4」)。異なるキャッチャー抗体濃度に基づき、点「4」の方向に向かって飽和が生じる。反応ミックス中での内在性キャリブレーターの変換によって形成される生成物(有利にはH2O2)は、それぞれのドットにおいて予め固定されたH2O2不含の、局所的に狭く限定的に沈着するペルオキシダーゼ基質がその無色の前駆体から青紫色の沈着物への変換することを開始させる。この場合、沈着物量は局所的に存在するペルオキシダーゼ及び例えばH2O2濃度に依存する。
Claims (12)
- 体液を酵素ミックスと一緒にインキュベーションし(反応1)、その際、前記インキュベーションにおいて内在性キャリブレーターの酵素による変換によって生じる生成物(例えば過酸化水素(H2O2))を部分的に、第2の免疫反応(反応2)において、同じ体液とともにマーカー酵素によるシグナル形成のために利用し、このシグナルを検知し、第1の反応において生じる生成物のシグナル(例えばH2O2)と比較するか又は前記シグナルを差し引いて考慮することを特徴とする、組み合わせられた酵素的/免疫学的試験方法。
- 前記の2つの反応を同時並行的に又は順次に実施することを特徴とする、請求項1記載の試験方法。
- 前記の2つの反応を1つのコンパートメント又は2つの相互に別個のコンパートメント中で実施することを特徴とする、請求項1又は2記載の試験方法。
- 前記コンパートメントが、特にラテラルフロー試験ストリップ、フロースルー−膜システム(フロースルー試験)、マイクロタイタープレートのウェル/キャビティ又は試験用チューブであることを特徴とする、請求項3記載の試験方法。
- シグナルの検知を視覚的(肉眼)に、比色分析的に、濁度測定的に、蛍光を用いて又は電気化学的に行うことを特徴とする、請求項1から4までのいずれか一項記載の試験方法。
- ノモグラム、コンパレーター(参照ストリップ)、読み取り装置又は肉眼での視覚的比較により評価を行い、その際、後者の肉眼での視覚的比較の場合には、キャリブレーターを用いて酵素により生成されたシグナル(例えば試験ライン又は試験点(ドット))の数を、アナライトを用いて免疫化学的に生成されたシグナル(例えば試験ライン又は試験点(ドット))の数と対比することを特徴とする、請求項5記載の試験方法。
- 体液として、特に尿、唾液、涙、汗、髄液、血清、血漿又は血液を使用することを特徴とする、請求項1から6までのいずれか一項記載の試験方法。
- 内在性キャリブレーターとして、特にクレアチニン、グルコース、グルコース−6−ホスフェート、ラクテート、グルタメート、アスパルテート、コレステロール、ピルベート、尿素及びトリグリセリド、並びに酵素、例えばアルファ−アミラーゼ、及びイオン、例えばカルシウムイオン、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを使用することを特徴とする、請求項1から7までのいずれか一項記載の試験方法。
- マーカー酵素としてペルオキシダーゼ及びオキシダーゼを使用することを特徴とする、請求項1から8までのいずれか一項記載の試験方法。
- 好ましくは酵素ミックスを使用し、前記酵素ミックスがそれぞれの体液中に存在する内在性キャリブレーターと反応してH2O2を形成させることを特徴とする、請求項1から9までのいずれか一項記載の試験方法。
- それぞれの内在性キャリブレーターを、それぞれの適用のために最適な一定の濃度で反応ミックスにも添加することを特徴とする、請求項1から10までのいずれか一項記載の試験方法。
- 体液が尿の場合に、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼからなる混合物を、内在性キャリブレーターとしてクレアチンを使用する場合に使用するか、又は酵素のグルコースオキシダーゼを、内在性キャリブレーターとしてグルコースを使用する場合に使用することを特徴とする、請求項11記載の試験方法。
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