CN115356410B - 一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：(1)将尿样酶解处理；(2)HPLC分离纯化获得肌酸组分和尿酸组分；(3)将肌酸组分和尿酸组分采用LC‑IRMS分析，获得肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值；(4)根据尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值进行阳性判别。上述方法可以用于阿卡地新兴奋剂的检测，具有简便准确灵敏、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域领域，尤其涉及一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法。
背景技术
阿卡地新5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，别名:Acadesine，AICAR，结构如式1所示。
AICAR可以激活AMPK蛋白激酶，增加运动耐力，提高运动员运动能力。世界反兴奋剂机构(WADA)于2009年将AICAR确定为兴奋剂。AICAR属于内源性兴奋剂，此类兴奋剂的特点是，它既是人体的内源性物质又可以是合成药物。
对于内源性物质的检测可以采用同位素比值(IRMS)法，其原理是药用物质和内源性物质的碳元素同位素比(13C/12C，以δ13C值表示，单位：‰)不同。δ13C值被定义为：δ13C＝(R样品-R标品)/R标品，其中R＝13C/12C。其阳性判定标准为：目标物质(可以是药物原型，也可以是其代谢物)δ13C值与参照物(参照物δ13C不因服用兴奋剂而改变)δ13C值的差值大于4‰，即为阳性。目前，药物原型和代谢物δ13C值的测定均采用气相色谱-燃烧-同位素比值(GC-C-IRMS)法。由于AICAR不易气化,不适于气相分析，对于AICAR的检测成为难点。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，可以用于阿卡地新兴奋剂的检测，具有简便准确灵敏、重复性好等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：
(1)将尿样酶解处理；
(2)HPLC分离纯化获得肌酸组分和尿酸组分；
(3)将肌酸组分和尿酸组分采用LC-IRMS分析，获得肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值；
(4)根据尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值进行阳性判别。
LC-IRMS中文名称为液相色谱-同位素比质谱(LC-IRMS)。
采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法可以用于阿卡地新兴奋剂的检测，具有简便准确灵敏、重复性好等优点。
发明人在研究中意外的发现检测尿样中尿酸δ13C值，可以检测是否服用了外源的阿卡地新兴奋剂。
本发明选择肌酸为参照物，相比其他参照物，具有简化检测流程的优点。对于内源性兴奋剂检测除了测定目标物质，还需测定参照物δ13C值。在LC-IRMS检测中，如果选用孕烷二醇等非水溶性参照物，需要采用“气相色谱-燃烧-同位素比质谱仪”测定δ13C值，因此，检测步骤繁琐。本发明选用尿中肌酸作为参照物，在LC-IRMS中检测，使检测流程简化。
本发明对尿样进行酶解处理,去除了肌肝，可以避免肌肝干扰导致检测结果不准确的问题，从而利于后续的检测分析。本发明通过高效液相色谱(HPLC)纯化制备出肌酸组分和尿酸组分，同时去除了其它杂质，避免因其它杂质导致的检测结果不准确等问题。采用LC-IRMS分析，有利于获得肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值，从而方便根据差值进行判断是否阳性。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤(1)中，将尿样酶解处理，包括以下步骤：取尿样，加入肌肝酶溶液，混匀，处理，过滤。
进一步，混匀后的处理的条件为35℃处理1h。
进一步，尿样与肌肝酶溶液的体积比为1mL：50μL；肌肝酶溶液中肌肝酶含量为1kU/100μL。
采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述的处理条件有利于采用肌肝酶对肌肝降解以去除干扰。酶解去除干扰方法比使用仪器(如HPLC制备液相色谱)方法简便，环保。更主要的是HPLC制备液相色谱方法很难去除肌肝干扰(见图1)。此种酶解方法可以使干扰物降解而除干扰的方法也可以用于其它分析中。此种去除干扰的方法较为巧妙。
进一步，步骤(2)中，HPLC分离纯化获得肌酸组分和尿酸组分，分离纯化方法包括：色谱柱为XBridge Shield RP18色谱柱，柱温35℃,pH7.4的20mM磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min至1mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测，选择收集含有肌酸组分的流出液和含有尿酸组分的流出液。
采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述条件有利于分离纯化过程的精准和自动化，以满足后续LC-IRMS分析的要求。
进一步，在获得含有肌酸组分的流出液和含有尿酸组分的流出液后，还包括将流出液挥干溶剂、水复溶后离心取上清液的步骤。
进一步，步骤(3)的LC-IRMS分析中，质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。
进一步，步骤(3)的LC-IRMS分析中，色谱柱采用Zorbax SB-Aq,柱温35℃至40℃。
进一步，步骤(3)的LC-IRMS分析中，进样体积为10μL至20μL；流动相为0.5％至1％硫酸水溶液，流速200μL/min至400μL/min,氧化泵流速30μL/min至40μL/min，样品反应温度99.9℃。
采用上述技术方案的有益效果包括：此操作条件可以使得测定物尿酸和肌酸更好的分离，并获得满意的测定结果。
进一步，步骤(4)中，阳性判别的方法包括：若尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值大于4‰，判断为阳性；否则，为阴性。
采用上述技术方案的有益效果包括：通过上述方法可以判断出是否服用了阿卡地新兴奋剂，具有简便准确灵敏、重复性好等优点。
附图说明
图1为实施例4中采用第一种HPLC分离方法获得色谱图，其中，肌酸(1)、尿酸(2)、肌肝(3)。
图2为实施例4中采用第二种HPLC分离方法获得的肌酸的色谱图。
图3为实施例4中采用第二种HPLC分离方法获得的尿酸的色谱图。
图4为实施例4中采用第二种HPLC分离方法获得的肌肝的色谱图。
图5为实施例4中采用第三种HPLC分离方法获得色谱图。
图6为实施例5中采用第一种处理方法获得的尿酸的色谱图。
图7为实施例5中采用第一种处理方法获得的肌酸的色谱图。
图8为实施例5中采用第二种处理方法获得的色谱图。
图9为实施例6中采用第二种方法获得的尿酸的色谱峰。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供一种检测人尿中阿卡地新(AICAR)兴奋剂的方法，包括：取尿样,酶解除干扰，HPLC分离组分，挥干洗脱液，加水复溶，离心。上清液注入液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)，液相色谱柱为Zorbax SB-Aq柱，流动相为硫酸水溶液，测定尿酸的δ13C值与参照物肌酸的δ13C值的差值用于阳性判别。本方法可以用于竞技体育的兴奋剂检测，简便易行，准确度高，灵敏性好、重复性好。
本发明以肌酸(creatine)作为参照物，通过检测尿中尿酸而检测AICAR。尿酸(uric acid，UA)和肌酸(creatine)均为水溶性，采用LC-IRMS测定尿酸的δ13C值和肌酸的δ13C值，两者δ13C值的差值用于AICAR的检测结果的判定。
本发明提供一种检测人尿中阿卡地新(AICAR)兴奋剂的方法，可以包括以下步骤：
(1)取尿样1mL,加50μL肌肝酶溶液(1kU/100μL)，混匀，于35℃水浴1h。取出，经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridge Shield RP18色谱柱，柱温35℃,20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.5mL/min至1mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置分段收集流出液，分别为肌酸组分和尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，离心(10000r/min)10分钟，备用。
(2)取上述离心后的上清液10μL至20μL，进行LC-IRMS分析，分别测定肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值。质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。测定的尿酸的δ13C值与参照物肌酸的δ13C值的差值用于阳性判别，若尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值大于4‰，判断为阳性(即阿卡地新兴奋剂的检测结果为阳性)；否则，为阴性(即阿卡地新兴奋剂的检测结果为阴性)。
LC-IRMS的分离的条件可以包括：色谱柱采用Zorbax SB-Aq(250mm×4.6mm,5μm),柱温35℃至40℃，流动相为0.5％至1％硫酸水溶液(均为体积百分比)，流速200μL/min至400μL/min,进样体积为10μL至20μL，氧化泵流速30μL/min至40μL/min，样品反应温度99.9℃。
本发明提供的一种检测人尿中阿卡地新兴奋剂的方法，主要是采用液相色谱-同位素比质谱(LC-IRMS)测定尿酸δ13C值，以肌酸为参照物，利用特异性酶去除干扰物的干扰。本方法简便易行、准确灵敏、重复性好。
本发明中涉及的试验设备和材料：
HPLC色谱仪：Waters公司。
Milli-Q超纯水制备仪：MILLIPORE公司。
离心机：Thermo Scientific公司。
各实施例中，采用的液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)为液相色谱-氧化接口-同位素比值测定仪，购自Thermo Fisher公司(型号为Accela 600)。
肌肝酶购自Sigma-Aldrich公司。
20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)的配制方法，可以包括以下步骤：配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合，即为20mM的磷酸盐缓冲液(pH为7.4)。
标品可以为蔗糖IAEA-CH6(δ13CVPDB＝－10.449‰±0.033‰)购自InternationalAtomic Energy Agency公司。
各实施例中，同位素比值测定仪在测定样品之前,可以用已知δ13C值的标品进行δ13C值校正，包括以下方法：将0.1mg/ml的蔗糖IAEA-CH6(δ13CVPDB＝－10.449‰±0.033‰)水溶液以与检测样品相同的操作条件进行测定，进样10ul，测得的δ13C值在－10.45‰±0.5‰即可进行后续样品测定。如果不在此范围内，需调节仪器参数，以使标品δ13C值在此范围内，完成仪器δ13C值校正。
若未经特殊说明，本发明中涉及的实验材料可以通过常规方法制备或市购获得。
若未经特殊说明，本发明中采用的实验方法均为本领域常规的实验方法。
下面通过具体的实施例进行介绍。
实施例1
一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：
(1)取阴性尿样(采集自30岁健康男性志愿者未服用阿卡地新兴奋剂的尿样)1mL,加50μL肌肝酶溶液(1kU/100μL)，混匀，于35℃水浴1h。取出，经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridge ShieldRP18色谱柱，柱温35℃,20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.8mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置分段收集流出液，分别为肌酸组分和尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，离心(10000r/min)10分钟，分别获得含有肌酸的上清液和含有尿酸的上清液，备用。
(2)取上述离心后的上清液20μL，进行液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)分析，分别测定肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值。
液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)操作条件可以包括：液相色谱柱为ZorbaxSB-Aq(250mm×4.6mm,5μm),柱温40℃，流动相为0.5％硫酸水溶液，流速300μL/min,进样体积为20μL，氧化泵流速40μL/min，样品反应温度99.9℃。质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。
(3)经测定，尿酸的δ13C值与参照物肌酸的δ13C值的差值为1.6‰，由于差值小于4‰，判定此样本为阴性。检测结果与实际情况一致，说明采用本发明提供的方法准确性好。
实施例2
2.1验证本发明提供的基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法的重复性
取6份阴性尿样(采集自30岁健康男性志愿者未服用阿卡地新兴奋剂的尿样)，在实施例1相同的操作条件下测定尿酸的δ13C值和肌酸的δ13C值，计算标准偏差。尿酸的δ13C值的标准偏差为0.81‰，肌酸的δ13C值的标准偏差为0.77‰。说明本发明提供的基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法的重复性好。
2.2验证本发明提供的基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法的的灵敏性
取阴性尿样6份(每个样本中均含有20μg/mL尿酸和48μg/mL肌酸，采集样本的志愿者未服用阿卡地新兴奋剂),采用实施例1记载的方法在相同的操作条件下测定每个样本的尿酸的δ13C值和肌酸的δ13C值，并计算其标准偏差，结果表明尿酸和肌酸的标准偏差分别为0.61‰和0.45‰。说明采用本发明提供的方法可检测到浓度低至20μg/mL的尿酸和48μg/mL的肌酸，采用本发明提供的方法进行检测灵敏性比较好。
实施例3
一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：
(1)取服用AICAR后的尿样(采集自30岁健康男性志愿者服用AICAR后的尿样)1mL,加50μL肌肝酶溶液(1kU/100μL)，混匀，于35℃水浴1h。取出，经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridge Shield RP18色谱柱，柱温35℃,20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.8mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置分段收集流出液，分别为肌酸组分和尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，离心(10000r/min)10分钟，备用。
(2)取上述离心后的上清液20μL，进行LC-IRMS分析，分别测定肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值。
液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)操作条件：液相色谱柱为Zorbax SB-Aq(250mm×4.6mm,5μm),柱温40℃，流动相为0.5％硫酸水溶液，流速300μL/min,进样体积为20μL，氧化泵流速40μL/min，样品反应温度99.9℃。质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。
(3)测定尿酸的δ13C值与参照物肌酸的δ13C值的差值为6.8‰，由于差值大于4‰，判定此样本为阳性。检测结果与实际情况一致，说明采用本发明提供的方法准确性好。
实施例4
筛选HPLC分离纯化条件，使样品经高效液相色谱(HPLC)纯化制备出肌酸组分和尿酸组分。利用HPLC分离肌酸、尿酸、肌肝,其中肌酸和尿酸为待测物,肌肝为干扰物。
第一种HPLC分离方法：将肌酸、尿酸、肌肝标品经HPLC分析，色谱柱为XBridgeShield RP18(5μm，4.6×250mm)；柱温为35℃；流动相：20mM磷酸盐溶液(pH7.4)，流速为0.8ml/min；紫外检测，波长：230nm和215nm。
分离情况如图1所示，从左到右，出峰顺序分别为肌酸(峰1，5.6min-6.5min流出液为肌酸组分)、尿酸(峰2，7min-8min的流出液为尿酸组分)、肌肝(峰3)，结果表明，采用此分离条件可以分离肌酸，但不能将尿酸和肌肝分离。
第二种HPLC分离方法：柱温为35℃，流动相：20mM磷酸盐溶液(pH7.4)与甲醇体积比为98：2，流速为0.8ml/min，除检测波长和上述条件外，其他条件与第一种HPLC分离方法相同。
分离情况如图2至图4所示。
图2为肌酸色谱图，检测波长：270nm和215nm。保留时间3.8min，色谱图中270nm信号弱，肌酸检测波长以215nm为佳。
图3为尿酸的色谱图，检测波长：230nm和270nm。保留时间4.5min，较低峰为230nm。
图4为肌肝色谱图，检测波长：230nm和270nm。保留时间4.6min，较高峰为230nm。
实验结果表明，检测波长选择230nm和215nm可以满足肌酸、尿酸、肌肝的紫外检测。采用第二种HPLC分离方法可以分离肌酸，但是不能将尿酸和肌肝分离。
第三种HPLC分离方法：柱温为35℃，流动相：20mM磷酸盐溶液(pH7.8)，流速为0.8ml/min，波长：230nm和215nm，其他条件均与第一种HPLC分离方法相同。
分离情况如图5所示，从左到右，出峰顺序分别为肌酸、尿酸、肌肝，结果表明，采用该条件可以分离肌酸，但不能将尿酸和肌肝分离。
本发明研究发现尿酸组分中含有干扰物肌肝(creatinine)。肌肝是分析尿中尿酸时的主要干扰物。从上述筛选HPLC分离纯化条件的结果可以看出，单纯通过HPLC，无论如何调整参数都无法将肌酸、尿酸、肌肝三者完全分离。HPLC可以分离肌酸，但不能将尿酸和肌肝分离，采用第一种HPLC分离方法，可以得到肌酸组分、尿酸与肌肝混合组分。
第二种HPLC分离方法中，在流动相中含有有机溶剂的情况下考察能否分离尿酸和肌肝,结果表明,有机溶剂的加入不能将尿酸与肌肝很好的分离,而在后续的操作中,需要务必确保将流出组分中的有机溶剂去除干净,否则将影响LC-IRMS的测定。因此第二种方法存在带入不良影响的可能。
第三种HPLC分离方法中，根据色谱图看出，pH为7.8时尿酸与肌肝的色谱峰重叠情况比pH为7.4时的严重，在收集的尿酸流出组分中，肌肝的含量会更多，为确保肌肝酶酶解完全，应尽量减少肌肝的含量。
基于本发明的上述研究，为了去除肌肝的干扰，在本发明中，将干扰物肌肝采用肌肝酶酶解方法消除，从而实现可以很好地去除肌酐的干扰的目的。
实施例5
一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：
(1)取服用AICAR后的尿样(采集自30岁健康男性志愿者服用AICAR后的尿样)1mL,分别用两种方法处理样本。
第一种方法：加50μL肌肝酶溶液(1kU/100μL)，混匀，于35℃水浴1h。取出，经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridge Shield RP18色谱柱，柱温35℃,20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.8mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置分段收集流出液，分别为肌酸组分和尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，离心(10000r/min)10分钟，取离心后的上清液20μL，进行LC-IRMS分析，观察色谱峰(图6、图7)。图6为尿酸色谱峰,保留时间2076秒，图7为肌酸色谱峰,保留时间887秒。
第二种方法：将尿样经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridgeShield RP18色谱柱，20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.8mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置分段收集尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，离心(10000r/min)10分钟，取离心后的上清液10μL，进行LC-IRMS分析，观察尿酸色谱峰(图8)。
在上述两种处理样本的方法中，液相色谱-同位素比质谱仪(LC-IRMS)操作条件：液相色谱柱为Zorbax SB-Aq(250mm×4.6mm,5μm),柱温40℃，流动相为0.5％硫酸水溶液，流速300μL/min,进样体积为20μL，氧化泵流速40μL/min，样品反应温度99.9℃。质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。
图6至图8的结果表明，第一种方法去除了肌肝的干扰，尿酸色谱峰较好，而第二种方法没有去除肌肝的干扰，尿酸组分色谱峰受到干扰严重。
实施例6
一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，包括以下步骤：
取服用AICAR后的尿样(采集自30岁健康男性志愿者服用AICAR后的尿样)1mL,加50μL肌肝酶溶液(1kU/100μL)，混匀，于35℃水浴1h。取出，经0.45μm滤膜过滤，注入HPLC分离纯化，HPLC采用XBridge ShieldRP18色谱柱，柱温35℃,20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.8mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测。依据实际色谱峰位置收集尿酸组分。于60℃加热挥干溶剂，残留物用100μL超纯水复溶，10000r/min离心10分钟，取离心后的上清液20μL，分别用两种方法进行LC-IRMS分析。
第一种方法：进行LC-IRMS分析方法包括，液相色谱柱为ZorbaxSB-Aq(250mm×4.6mm,5μm)，柱温40℃，流动相为0.5％硫酸水溶液，流速300μL/min，氧化泵流速40μL/min，样品反应温度99.9℃。质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。观察色谱峰(图6)。图6为尿酸色谱峰,保留时间2076秒。
第二种方法：进行LC-IRMS分析方法包括，柱温25℃，流动相为10％硫酸水溶液。其他条件与第一种方法相同。观察色谱峰(图9)。图9为尿酸色谱峰,保留时间2000秒。
图6和图9的结果表明，采用第一种方法尿酸色谱峰较好，而第二种方法尿酸色谱峰受到干扰,并且峰强度相对低。说明本发明选择的LC-IRMS分析方法更有利于阿卡地新兴奋剂的检测。
实施例7
在实施例1的基础上，HPLC分离纯化过程中的流速为0.5mL/min，液相色谱-同位素比质谱仪操作条件中：柱温35℃，流动相为0.8％硫酸水溶液，流速200μL/min,进样体积为15μL，氧化泵流速30μL/min。其他均与实施例1相同。
实施例8
在实施例1的基础上，HPLC分离纯化过程中的流速为1mL/min，液相色谱-同位素比质谱仪操作条件中：柱温38℃，流动相为1％硫酸水溶液，流速400μL/min,进样体积为10μL，氧化泵流速35μL/min。其他均与实施例1相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将尿样酶解处理，包括以下步骤：取尿样，加入肌酐酶溶液，混匀，处理，过滤；
(2)HPLC分离纯化，获得肌酸组分和尿酸组分；
(3)将肌酸组分和尿酸组分采用LC-IRMS分析，获得肌酸的δ13C值和尿酸的δ13C值；LC-IRMS分析中，色谱柱采用Zorbax SB-Aq,柱温35℃至40℃；进样体积为10μL至20μL；流动相为0.5％至1％硫酸水溶液，流速200μL/min至400μL/min,氧化泵流速30μL/min至40μL/min，样品反应温度99.9℃；
(4)根据尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值进行阳性判别。
2.根据权利要求1所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，混匀后的处理的条件为35℃处理1h。
3.根据权利要求1所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，尿样与肌酐酶溶液的体积比为1mL：50μL；肌酐酶溶液中肌酐酶含量为1kU/100μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，步骤(2)中，HPLC分离纯化获得肌酸组分和尿酸组分，分离纯化方法包括：色谱柱为XBridge Shield RP18色谱柱，柱温35℃,pH7.4的20mM磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min至1mL/min，紫外检测器于215nm和230nm检测，选择收集含有肌酸的流出液和含有尿酸的流出液。
5.根据权利要求4所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，在获得含有肌酸的流出液和含有尿酸的流出液后，还包括将流出液挥干溶剂、水复溶后离心取上清液的步骤。
6.根据权利要求1-3任一项所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，步骤(3)的LC-IRMS分析中，质谱离子源为电子轰击离子源，离子源电压3.0kv,灯丝电流1.5mA。
7.根据权利要求1-3任一项所述一种基于尿酸检测阿卡地新兴奋剂的方法，其特征在于，步骤(4)中，阳性判别的方法包括：若尿酸的δ13C值与肌酸的δ13C值的差值大于4‰，判断为阳性；否则，为阴性。
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