JP2022515545A - 標的タンパク質への検出可能なタグのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ制御組み込みに基づく細胞の選択方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質に由来する融合タンパク質を発現する細胞を提供する方法であって、ａ）細胞に、ｉ）第１の選択試薬に耐性のある核酸を追加的に含む、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、ｉｉ）第２の選択試薬に対する耐性を付与する第１の核酸と、マーカータンパク質をコードしかつ細胞内の組み込み部位に相同な核酸が３’および５’に隣接する第２の核酸とを含む、環状ドナープラスミド、ｉｉｉ）適切な合成ｃｒＲＮＡ、ならびにｉｖ）適切な合成ｔｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションする工程、ｂ）第１および第２の選択試薬の存在下で細胞を培養する工程、ならびにｃ）工程ｂ）の条件下で細胞分裂を行う細胞を選択し、それにより、マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を提供／生成する工程からなる方法が報告される。

Description

本発明は、内在性タンパク質を標識された形態で発現する細胞を生成するための、細胞ＤＮＡへの核酸の非治療的（インビトロ）標的組み込み、およびその応用の技術分野にある。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、近年、自然科学者の間で急速に人気が高まっている（１）。１９８７年に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発見されたが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の機能は、２００７年のずっと後になるまで説明されなかった（２，３）。２０１２年に、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ ＤｏｕｄｎａとＥｍｍａｎｕｅｌｌｅ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒによって完全な機構が解読され、既存の遺伝子工学ツール（４）の優れた代替手段として提示された。ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集に関する最初の論文は、２０１３年にＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇ（５）によって開示された。

新規および／または未知の抗原の研究における一般的な問題は、市場から入手可能な特異的抗体がないことである。このことは、発現または細胞局在の観点から特徴付けを複雑にする。

通常、調査対象の抗原にはタグが付与されており、細胞内で組換え生成されている。発現はウイルスプロモーターの制御下で発生し、抗原の過剰発現につながるため、実験では歪んだデータや不正確なデータがしばしば生ずる。

本発明の目的は、細胞を提供するための新しい方法であり、これは、例えば、薬理学的に興味深い細胞タンパク質をマーカータンパク質との融合タンパク質、すなわち、タンパク質の検出可能なラベルとして発現する。このような細胞により、この細胞タンパク質の研究、ならびにこのタンパク質が細胞内または細胞表面、すなわち、その自然環境で直接関与する代謝プロセスの研究が可能となる。したがって、標識されたタンパク質は、タンパク質がマーカーとの融合タンパク質として細胞中に組換え導入される場合に一般的に発生する、自然条件下でその本来の遺伝子座から発現される、すなわち、タンパク質の自然発現レベルに関して過剰発現または過小発現はない。

本発明による方法によって得られた細胞は、とりわけ、内在性標的タンパク質の生物活性を修飾する抗体の同定および選択に使用することができる。

したがって、本発明の目的は、細胞内または細胞表面上で直接薬学的に興味深いタンパク質を研究するための新しい方法であり、タンパク質は、マーカータンパク質への融合によって、細胞内でその内在性遺伝子座で修飾されている。

本明細書に記載されている発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用することにより、細胞内で直接的に、タンパク質の内在性遺伝子座において直接的に、タンパク質を検出可能なラベルまたはタグにコンジュゲートさせることが可能であり、それにより、改変細胞においてタンパク質の天然の発現レベルが得られる／得ることができる、という発見に少なくとも部分的に基づいている。

本明細書に記載されている発明は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびドナープラスミドの抗生物質媒介二重選択が、マーカータンパク質（タグ）のノックインに最も適しているという発見に少なくとも部分的に基づいている。

本明細書に記載されている発明は、線状化形態のドナープラスミドを使用する場合よりも、環状構造のドナープラスミドを使用することにより、著しく高い編集率が達成できるという発見に少なくとも部分的に基づいている。

本発明による方法において、第１の耐性カセット（例えば、ピューロマイシン耐性カセット）を含むＣａｓ９をコードするプラスミドは、修復テンプレートとしての第２の耐性カセット（例えば、ハイグロマイシンＢ耐性カセット）を含む環状ドナープラスミド、ならびに適切な合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと共にトランスフェクトされる。選択は、両方の耐性に対する二重選択であり、例えば、ドナープラスミドに対する耐性にはハイグロマイシンＢを、Ｃａｓ９プラスミドへの耐性にはピューロマイシンを使用した。

本発明の一態様は、マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を当該標的タンパク質の細胞内在性遺伝子座から発現する細胞を提供／生成するための（インビトロの）方法であり、方法は、次の手順で構成される。
ａ）ｉ）第１の選択試薬に対する耐性を付与する核酸を含む、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、ｉｉ）ａ）第２の選択試薬に対する耐性を付与する第１の核酸と、ｂ）マーカータンパク質をコードする第２の核酸とを含む、環状ドナープラスミドであって、細胞内の組込み部位に相同な核酸が該第２の核酸の３’側および５’側に隣接しており、該隣接する相同な核酸のうちの１つが標的タンパク質の末端コード配列に相同である、環状ドナープラスミド、ｉｉｉ）ｃｒＲＮＡ、ならびにｉｖ）ｔｒａｃｒＲＮＡを、細胞にトランスフェクトする工程、
ｂ）第１および第２の選択試薬の存在下で細胞を培養する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）の条件下で細胞分裂／増殖を行う細胞を選択し、それによりマーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を提供／生成する工程
を含む。

本発明のさらなる態様は、抗体がその標的分子に関してアゴニスト性またはアンタゴニスト性（または不活性）であるかどうかを決定／特徴付けるための（インビトロの）方法であり、方法は、
－ 任意選択的に、標的タンパク質の生物活性を測定する工程と、
－ マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する、本発明による方法によって得られた細胞を、試験する抗体とインキュベートする工程と、
－ 試験される抗体の存在下で内在性標的タンパク質の生物活性がどのように変化するかを決定し、抗体とのインキュベーションにより生物活性が増加する場合、その抗体をアゴニスト性として、および／または抗体とのインキュベーション時に生物活性が減少する場合、アンタゴニスト性（および／または抗体とのインキュベーション時に生物活性が変化しない場合は不活性）として特徴付ける工程と、を含む。

本発明の別の態様は、標的分子に特異的に結合する抗体を選択するための（インビトロの）方法であり、方法は、
－ マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する、本発明による方法によって得られた細胞を、試験される１つまたは別々に２つ以上の抗体とインキュベートする工程と、
－ 試験される抗体の存在下で、内在性標的タンパク質の生物活性が変化するかどうかを決定し、抗体とのインキュベーションによって生物活性が変化する場合は抗体を選択する工程と、を含む。

好ましい実施形態において、細胞は、すべてのプラスミドおよび核酸を同時にトランスフェクトされる。

一実施形態では、工程ｃ）において、細胞分裂を行いかつ融合タンパク質が検出された細胞が選択される。

好ましい一実施形態において、工程ｂ）およびｃ）は、次の工程：
ｂ）１）第１の選択試薬のみの存在下または第２の選択試薬のみの存在下で細胞を培養する工程、
２）工程１）の条件下で分裂／増殖する細胞を選択する工程、
３）工程２）で選択された細胞を、工程１）で使用しなかった選択試薬の存在下で培養する工程、
ｃ）工程ｂ）３）の条件下で細胞分裂／増殖を行う細胞を選択し、それによりマーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を提供／生成する工程、
である。

一実施形態において、第１および第２の選択試薬は、ネオマイシン／Ｇ４１８（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ヒスチジノール（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）、ハイグロマイシンＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ゼオシン、およびミコフェノール酸からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、第１および第２の選択試薬はピューロマイシンおよびハイグロマイシンＢであるか、あるいはその逆である。

好ましい一実施形態において、ハイグロマイシンＢの最終濃度は５０μｇ／ｍＬである。

好ましい一実施形態において、ピューロマイシンの最終濃度は２μｇ／ｍＬである。

一実施形態において、細胞内在性標的タンパク質は可溶性タンパク質または膜結合性タンパク質である。

一実施形態において、マーカータンパク質（タグ）の挿入可能部位が複数存在する場合、マーカータンパク質をコードする核酸は、より多くのかつ／またはより特異的なｇＤＮＡ結合部位を含む部位に挿入される。

好ましい一実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。

一実施形態において、マーカータンパク質は、内在性標的タンパク質のＣ末端またはＮ末端に導入される。好ましい一実施形態において、核酸がコードするマーカータンパク質は、細胞内在性タンパク質の開始コドンの直後のＮ末端に挿入される。

一実施形態において、
ｉ）マーカータンパク質が、標的タンパク質のＮ末端に挿入され、
ｉｉ）マーカータンパク質をコードする核酸が、それが融合タンパク質のｍＲＮＡにおいて標的タンパク質の最初のコドンの直前（３’側）に位置するように、内在性遺伝子座に挿入され、かつ
ｉｉｉ）３’側に隣接する核酸が、標的タンパク質をコードする核酸の開始コドンを含み、または／かつ５’側に隣接する核酸が、標的タンパク質のＮ末端と相同である。

一実施形態において、最大２５アミノ酸長のリンカータンパク質が、マーカータンパク質と標的タンパク質との間に挿入される。好ましい一実施形態において、リンカータンパク質は、４～１０個のアミノ酸残基を含む。

一実施形態において、核酸がコードするマーカータンパク質は、細胞内在性タンパク質の開始コドンの直後のＮ末端に挿入される。この実施形態において、３’隣接核酸が、標的タンパク質をコードする核酸の開始コドンを含み、かつ５’隣接核酸が、標的タンパク質のＮ末端と相同であるか、またはその逆である。

好ましい一実施形態において、マーカータンパク質をコードする核酸は、開始コドンを含まない。

一実施形態において、マーカータンパク質は蛍光マーカータンパク質である。一実施形態において、蛍光マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ （Ｈ９－４０）、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ （ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＳＣＦＰ３Ａ）、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、およびＵｎａＧからなる群から選択される。一実施形態において、蛍光マーカータンパク質はＧＦＰである。好ましい一実施形態において、蛍光マーカータンパク質はｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）である。

一実施形態において、マーカータンパク質はＭｙｃタグである。

好ましい一実施形態において、３’および５’に隣接する相同核酸は、約１０００ヌクレオチドの長さを有する（５’に隣接する相同核酸は挿入部位の上流の配列の約１０００ヌクレオチドを含み、３’に隣接する相同核酸は挿入部位の下流の配列の約１０００ヌクレオチドを含む。）。

本発明の特定の態様の説明
定義
ＣＲＩＳＰＲ：クラスタ化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）；一定の間隔でグループ化された短いパリンドローム反復。

ＣＡＳタンパク質：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質；リボヌクレアーゼ活性を有し、特定のＲＮＡ配列に結合できる。

ＣＡＳ９： エンドヌクレアーゼＣａｓ９；ＲＮＡ配列

（ｃｒＲＮＡ反復）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）に結合し、そこでＤＮＡを切断する。

ｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ反復配列と、ｃｒＲＮＡスペーサー配列とからなり；特定の二次構造を有し；ｃｒＲＮＡはＣａｓ９に結合し、Ｃａｓ９の構造変化を誘導し、それにより、標的ＤＮＡは、ｃｒＲＮＡスペーサー（標的ＤＮＡに相補的）によって結合でき；ｃｒＲＮＡスペーサー配列を交換することにより、標的ＤＮＡを変更することができ（標的ＤＮＡの相補的ＲＮＡ配列に）；ｃｒＲＮＡ反復は２０ヌクレオチドで構成され；ＰＡＭモチーフに隣接する１２ヌクレオチドは、結合特異性に極めて重要である。

ＰＡＭモチーフ：プロトスペーサー隣接モチーフ；プロトスペーサーに隣接するモチーフ；配列ＮＧＧ；標的ＤＮＡ内；標的ＤＮＡの切断は、ＰＡＭの３ヌクレオチド前に行われる。

ｔｒａｃｒＲＮＡ：トランス作用ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ；ｃｒＲＮＡに部分的に相補的であり；ＲＮＡ二重らせんを形成し；ＲＮａｓｅＩＩＩによる活性化；標的ＤＮＡに結合し；結合部位の近くでエンドヌクレアーゼ機能が切断される。

ｓｇＲＮＡ：シングルガイドＲＮＡ；ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｅｒＲＮＡとを含む単一のＲＮＡ鎖。

遺伝子座：染色体上の遺伝子の位置；ゲノムにおける遺伝子の位置；遺伝子の位置。

内在性：細胞内で自然に発生し；細胞によって自然に生成され；内在性遺伝子座／細胞内在性遺伝子座：細胞内に自然に発生する遺伝子座。

３’隣接配列：塩基配列の３’末端（下流、下方）に位置する配列。

５’隣接配列：塩基配列の５’末端（下流、下方）に位置する配列。

ドナー配列：５’隣接配列－標的配列－３’隣接配列。

ドナープラスミド：ドナー配列を含むプラスミド。

隣接するヌクレオチド配列：挿入される配列の前後にある核酸の配列セグメント（＝標的配列）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術
天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ウイルスの侵入者（１，６）に対する適応免疫防御の一部として、細菌の約４０％と古細菌の９０％に見られる。ＣＲＩＳＰＲ （クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、特定のスペーサー配列によって定期的に中断される配列の短い繰り返しである。ゲノムでは、この遺伝子座はＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（略してＣａｓ）に隣接している。これらは、とりわけヘリカーゼとヌクレアーゼ（１，７）をコードする。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した防御機構は、化膿連鎖球菌の例を使用して次のように説明できる：侵入する外来性ＤＮＡのプロトスペーサー配列は、天然ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に統合される。この領域が翻訳されるとプレ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）が生成され、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ）との塩基対形成によって複合体を形成する。これは、とりわけＲＮａｓｅ ＩＩＩによってさらに処理され、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として機能するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖がもたらされる。ｇＲＮＡは、侵入する外来性ＤＮＡに相補的であり、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの動員および活性化によってアニールし、ＤＮＡ切断に影響を与える。これには、ＲｕｖＣとＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインがあり、それぞれがＤＮＡの両方の鎖に切断を生じさせ、二本鎖切断断が結果として生ずる。この機構の前提条件は、短く、保存された配列、ＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）が、ｇＲＮＡ標的配列（３，８）の下方（下流）に位置することである。これは、Ｃａｓ９のための結合信号であるため、ＤＮＡ切断に不可欠である。化膿連鎖球菌の場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは特定のＰＡＭ５’－ＮＧＧ－３’配列の上流３塩基を切断する。ｇＲＮＡおよびＤＮＡ遺伝子座の完全に相補的な配列相同性であっても、これはＰＡＭ配列の不存在下ではヌクレアーゼによってスキップされる。これにより、免疫システムは自身のＤＮＡと外来性ＤＮＡを区別できるようになる。細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の標的配列にはＰＡＭ配列が含まれていないため、ヌクレアーゼ消化（６，９）から保護される。

一般に、さまざまなＣＲＩＳＰＲシステムを分類することができ、それらはＰＡＭ配列、および関与するＣａｓタンパク質の数および種類が異なる。化膿連鎖球菌由来のＩＩ型は、最も良好に特徴付けられ、遺伝子工学研究所で最も頻繁に使用されている（８，１０，１１）。遺伝子工学ツールとしてのこの天然システムの可能性は、ＤｏｕｄｎａとＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒによって２０１２年に認識された。彼らはまた、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡのシングル－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）への融合が、天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの二本鎖と同程度に効率的にＤＮＡ切断を生成することを示した。その結果、分子生物学的な、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の二成分システムが実現し、非常に簡単にゲノム修飾を生成することができる（４，１２）。

ＤＮＡ二本鎖切断の生成は、細胞内の修復メカニズムの活性化につながる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、インデルおよびフレームシフト突然変異の形成、および遺伝子のノックアウトにつながる可能性があるため、非常にエラーが発生しやすいという特徴がある。頻度はより低いが、修復は相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して行われる。したがって、修復テンプレートの存在下で遺伝子座の定義された変更を実行でき、配列ブロック全体でさえ特定のゲノム領域に組み込むことができる（１３，１４）。

本発明の例示的な特定の態様
例えば、治療用抗体の抗原としての新規および／または未知のタンパク質の研究においてしばしば発生する問題は、当該タンパク質に対する市場から入手可能な特異的抗体の欠如である。これは、例えば、発現または細胞局在に関して、タンパク質の特徴付けを複雑にする。

これまで、検査対象のタンパク質／抗原は、ｅｘ－ｖｉｖｏでマーカータンパク質にコンジュゲートされ、次に細胞中に再導入され、組換えによって生成されていた。人工の、すなわち、外在性の融合タンパク質は組換えによって細胞に導入されるため、発現はウイルスプロモーターの制御下で行われ、これは、内在性発現レベルと比較して融合タンパク質の過剰発現につながる。その結果、それに基づいた実験では、歪んだデータや正しくないデータが生成されることがよくある。

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって、タンパク質／抗原をマーカータンパク質と内因的に融合すること、すなわち、検出可能なタグを提供することが可能であり、それによって融合タンパク質は内在性遺伝子座で発現され、それによって天然遺伝子発現率／レベルが維持されるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。

細胞のゲノムＤＮＡへの配列のいわゆる「ノックイン」は、重要であることが証明されている。

本発明は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを有する第１のプラスミドと、標的配列を有する第２のドナープラスミドでの抗生物質を介した二重選択が、マーカータンパク質のノックインに最適である、という発見に、少なくとも部分的に基づいている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを個別に選択して正確にノックインしたクローンを取得することは可能であったが、効率は大幅に低下した。抗生物質による選択と組み合わせた、追加的に導入されたＣＤ４マーカーによる選択は、ドナープラスミド上で完全に失敗することが証明された。

本明細書にて開示される発明は、環状構造のドナープラスミドを使用すると、線状化形態のドナープラスミドを使用する場合よりも、大幅に高い取り込み率／編集率／効率を達成できる、という発見に、少なくとも部分的に基づいている。

本発明による方法は、標的細胞の任意の内在性遺伝子を用いて実施できることに留意すべきである。この遺伝子の自然な発現が強ければ強いほど、融合マーカータンパク質を介して達成できる検出可能な信号もより強くなる。

内在性タンパク質の性質、すなわちそれが可溶性、膜結合性または膜性であるかどうかは、本発明による方法において何の役割も果たさないことにも注意すべきである。

マーカータンパク質が導入される位置も完全に可変である。これは、Ｎ末端、内部（結果としてタンパク質の生物学的機能が破壊されない場合のみ）、またはＣ末端に融合／導入することができる。それにもかかわらず、内在性タンパク質のＮ末端およびＣ末端が融合にとって好ましい。

任意の検出可能なマーカータンパク質を使用できることにも注意すべきである。蛍光マーカータンパク質が特に好ましい。しかしながら、コンフォメーションマーカータンパク質を使用することもできる。検出は、標識された二次抗体を介して行われる。

本発明による方法は、任意の細胞で実行できることに留意されたい。哺乳動物細胞が好ましい。ヒト細胞がより好ましい。

内在性遺伝子としてのアルファチューブリン１ベータ（ＴＵＢＡ１Ｂ）
タンパク質／潜在的抗原の非限定的な例として、内在性α－チューブリン１β鎖（ＴＵＢＡ１Ｂ）を選択した。このタンパク質のＮ末端に、検出可能なラベルとしてのｅＧＦＰマーカータンパク質をタグ付けした。

アルファチューブリン１ベータ（ＴＵＢＡ１Ｂ）は、アルファチューブリンのサブタイプであり、５つのチューブリンアイソフォームのうちの１つであり、細胞型、組織、および発生段階によって発現が異なる（１５）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって、接着成長ＨＥＫ２９３Ａ細胞内で、内在性ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子を、そのＮ末端において、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）マーカータンパク質／タグ／検出可能なラベル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：３２）と融合させた。この目的のために、ｅＧＦＰのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を、それがｍＲＮＡレベルで内在性ＴＵＢＡ１Ｂ開始コドンの直後に続くように、細胞のゲノムに挿入した。

標的遺伝子をゲノムレベルで解析した場合、開始コドンＡＴＧはエキソン１の最後のトリプレットであった。これにより、以下の２つの可能なタグ挿入部位が得られた：エキソン１の３’末端にあるＡＴＧの直後、またはエキソン２の前の５’末端。これらの２つの遺伝子座を、可能なｇＲＮＡ結合部位について調べた。明らかに、より特異的なｇＲＮＡ結合部位が、エキソン１のＡＴＧの後ろよりも、エキソン２の５’末端の近くに存在することが判明した。

したがって、本発明の方法の一実施形態において、挿入可能部位が複数存在する場合、マーカータンパク質をコードする核酸は、細胞内の標的タンパク質の内在性遺伝子座の、より多くのかつ／またはより特異的なｇＤＮＡ結合部位を含む部位に挿入される。

これに基づいて、３つの特定のｇＲＮＡを使用して、エキソン２の前でノックインを行った（図１および図２）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員することにより、これらは挿入部位から２３～８０塩基離れた二本鎖切断を生成した。ドナープラスミドまたは短いドナーとも呼ばれる修復テンプレートとの同時トランスフェクションにより、ｅＧＦＰタグが相同組換えによって正確に組み込まれた。この目的のために、組み込まれるべき配列、正確には、内部ＡＴＧを有さず、両側に１ｋｂの長さの相同配列（アーム）が隣接し、Ｃ末端Ｇ４Ｓリンカーを有する、ｅＧＦＰ配列を、ドナープラスミド上に配置した。５’側の相同配列は、挿入部位からの上部／上流配列の約１ｋｂを含み、３’側の相同配列は、挿入部位からの下部／下流配列の約１ｋｂを含んでいた（図３）。

３つのノックイン戦略が実行され、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、特定のｇＲＮＡ、およびドナープラスミドは、すべての戦略に必要であった。戦略は、使用される構成と選択方法が異なる。

ノックイン戦略Ｖ１では、ピューロマイシン耐性カセットを含むＣａｓ９をコードするプラスミドを、選択マーカーのない環状ドナープラスミド、ならびに特定の合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用い、同時トランスフェクトした。選択は、Ｃａｓ９をコードするプラスミド上でピューロマイシンのみを使用して行った。

ノックイン戦略Ｖ２では、ピューロマイシン耐性カセットを含むＣａｓ９をコードするプラスミドを、環状ドナープラスミドを用い、ハイグロマイシンＢ耐性カセットならびに特定の合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用い同時トランスフェクトした。選択は、ドナープラスミドにはハイグロマイシンＢ、Ｃａｓ９をコードするプラスミドにはピューロマイシンを用いた二重選択として行った。

ノックイン戦略Ｖ３では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｓｇＲＮＡが単一のプラスミド上で結合された。これには、選択のためのＣＤ４マーカーが追加的に含まれていた。ドナープラスミドは戦略Ｖ２のプラスミドに対応していた。したがって、ドナープラスミドについてはハイグロマイシンＢを介して、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡプラスミドについてはＣＤ４を介して二重選択を行った。

Ｖ２およびＶ３戦略のために、さらに２つの異なるアプローチ（トランスフェクションの前にドナープラスミドの線状化を行う場合と行わない場合）が使用された。

修復テンプレートは、相同組換えによってｅＧＦＰマーカータンパク質の特異的なノックインのために生成され：ある場合は選択マーカーのないドナープラスミドであり、他の場合はハイグロマイシンＢ耐性カセットを有するドナープラスミドである。

複製起点（ｏｒｉ）に加えて、選択マーカーのないドナープラスミドには、アンピシリン耐性カセット、相同な３’および５’隣接配列が導入されるｅＧＦＰ配列が含まれている。３’－相同配列は、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅された。ゲル抽出後、これを３’－相同配列に特異的なプライマーを用いた第２のＰＣＲのテンプレートとして使用した。すべてのＰＣＲサンプルは、アガロースゲルで予想されるサイズのきれいなバンドを示し、ゲルから精製された。ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞からのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲは、５’相同配列を生成するために、ＴＵＢＡ１Ｂ特異的プライマーＤ＿５’ＨＡ ｆｗｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）およびＤ＿５’ＨＡ ｒｅｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を用いて行った。ＴＵＢＡ１Ｂ特異的プライマーＤ＿３’ＨＡ－Ｚ ｆｗｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）およびＤ＿３’ＨＡ－Ｚ ｒｅｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を用いたＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞からのゲノムＤＮＡのＰＣＲは、中間生成物を生成するために行われた。そこから、プライマーＤ＿３’ＨＡ ｆｗｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：１６）およびＤ＿３’ＨＡ ｒｅｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：１７）を用いたＰＣＲによって、ｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２結合部位の点突然変異を伴う３’－相同配列が生成された。４つのフラグメント、バックボーン、５’ＨＡ、ｅＧＦＰ、および３’ＨＡ（ＨＡ＝相同アーム／配列）は、その端に重複する配列を有していたことにより、シームレスなクローニングによって正しい順序と方向で同時ライゲーションを実行できた。正しいクローニングは、配列決定によって確認された。ドナープラスミドは、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを使用して最終構築物から生成された。これは、完全な５’ＨＡ－ｅＧＦＰ－３’ＨＡフラグメントを増幅するためのＰＣＲのテンプレートとして機能した。ＰＣＲ生成物を直接精製し、制限酵素で消化し、プラスミドｐＡＨ－０１６３のバックボーンにライゲートした。ｏｒｉに加えて、アンピシリン耐性カセットとハイグロマイシンＢ耐性カセットが含まれている。消化したサンプルをアガロースゲルで分離し、切り出し、精製した。正しい方向でのライゲーションは、制限消化によって形成された相補的な末端を介して達成された。ハイグロマイシンＢ耐性カセットを持つドナープラスミドの正確性は、配列決定によっても確認された。

ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞を、さまざまな濃度の抗生物質（ａ）ハイグロマイシンＢおよび（ｂ）ピューロマイシンでそれぞれ７２時間処理した。細胞生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイで測定した。

２０μｇ／ｍＬの濃度で、ＨＥＫ２９３Ａ（野生型）細胞の細胞生存率は２０％未満に減少した。さらに濃度を３００μｇ／ｍＬまで上昇させると、細胞生存率は１０％と３０％との間で変化した。選択には、５０μｇ／ｍＬの最終的なハイグロマイシンＢ濃度を使用した。この濃度では、約１２％の生存率が期待される。

ピューロマイシンの場合、細胞生存率は最低濃度でゆっくりと減少し、２μｇ／ｍＬピューロマイシンの濃度では１５％未満であった。選択のために、２μｇ／ｍＬの最終ピューロマイシン濃度が使用され、この濃度では、約１２％の生存率が期待される。

１）ノックイン戦略Ｖ１：抗生物質による、Ｃａｓ９をコードするプラスミドの単一選択
Ｃａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミド
環状ドナープラスミド
ｃｒＲＮＡ１又はｃｒＲＮＡ２
ｔｒａｃｒＲＮＡ

第１のノックイン戦略では、Ｃａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミド、環状ドナープラスミド、ならびに特定の合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。選択は、ピューロマイシンを使用して１０日間、Ｃａｓ９プラスミドについてのみ行った。その後、ｃｒＲＮＡ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：０７）またはｃｒＲＮＡ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：０８）のそれぞれでトランスフェクトした細胞の単一細胞を、１０個の９６ウェルプレートに置いた。各ｃｒＲＮＡについて、ゲートＰ３からの生存可能な単一細胞を含む９つのプレートと、ゲートＰ４からのＦＩＴＣ陽性の生存可能な単一細胞を含む１つのプレートを置いた（図８および図９、ヒストグラムにおいて、サンプル（青）のＦＩＴＣ信号は、野生型（黒）と共に正規化され、表示（拡大）されている。）。細胞に組み込まれたｅＧＦＰは、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）によってＦＩＴＣチャネルを介して検出できる。拡大図では、ＦＩＴＣ信号のヒストグラムは、細胞集団のごく一部がＦＩＴＣ信号の変化を示していることを示した（図８および図９）。増加したＦＩＴＣ信号は、ｅＧＦＰの発現に起因する可能性があり、これは、開始コドンが欠落しているため、ドナープラスミドからのｅＧＦＰ配列がゲノムの翻訳領域にインフレームで導入されている場合にのみ、可能である。

置かれた単一細胞の増殖率は、３週間後に顕微鏡で測定したところ、合計６３％であった。その後、ＦＡＣＳによる細胞のＦＩＴＣ信号の分析を行った（結果は表１）。

（表１）各ｃｒＲＮＡおよび各ゲートについて、単一細胞が置かれた後に、潜在的に陽性のクローンの数が同定された。検査したクローンの総数を括弧内に示す。効率は、検査したクローンの数に対する潜在的に陽性のクローンの数の比率から得られた。

ＦＩＴＣ信号が、野生型よりも有意に高かったクローンをさらに拡張し、特徴付けた。合計９８３個の分析されたクローンから、合計２３個の潜在的に陽性のクローンが検出された（表１を参照）。最初のＦＡＣＳスクリーニングにおいて、すべてのクローンが、約１ログステップのＦＩＴＣ陽性領域中へのシフトを示した。

クローンは、連続培養中の信号の安定性をチェックするために、ＦＡＣＳスクリーニングによって定期的に分析された。１７継代培養後のＦＡＣＳデータは、クローン間でいくつかの違いを示した。多くのクローンは、最初のＦＡＣＳスクリーニングに匹敵する信号を示した。２個のクローンは、ＦＩＴＣ信号強度の大幅な低下を示した（図１０、表２）。

（表２）成長したクローンのＦＡＣＳによるｅＧＦＰ信号の分析。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。ＦＩＴＣ－陽性領域中へのシフトによるクローンは拡張され、さらに分析された。連続培養後、１７継代目にＦＩＴＣ信号の安定性を再度確認した。＋＋＝変化なし；＋＝信号におけるわずかな減少；ｏ＝信号における強い減少；－＝信号なし

ＦＡＣＳデータは、同定されたクローンの多くが安定したｅＧＦＰ信号を有することを示している。

ノックインはゲノムレベルで検証された。この目的のために、クローンのｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。全ＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲは、ｅＧＦＰ領域に結合するフォワードプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）と、ＴＵＢＡ１Ｂのエキソン４に結合するリバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）を用いて行った。プライマーは、ＴＵＢＡ１Ｂのエキソン２の前にｅＧＦＰ配列が正確に導入された場合にのみ特定の生成物が増幅されるように選択された。野生型細胞では、リバースプライマーのみが結合できた。リバースプライマーの結合部位が３’－相同配列の、配列の外側にあるため、フォワードプライマーのみがドナープラスミドに結合できる。したがって、プラスミドが細胞のゲノムにランダムに組み込まれる可能性がある場合でも、増幅生成物は発生しない（図１０）。

ＰＣＲにより、アガロースゲルで目立った副生成物のないきれいなバンドが得られた（図１１）。ノックインは、ＰＣＲおよび配列決定によってＤＮＡレベルで検証された（データは示さず）。バンドを切り出し、精製し、配列決定した。その結果、すべてのクローンのＤＮＡに存在する３つの配列の差は、タンパク質の配列に変化を引き起こさないサイレント突然変異である。

タンパク質の機能、すなわちｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ融合タンパク質がベータチューブリンヘテロ二量体およびそこから微小管を形成する能力は、顕微鏡的に検証された。このために、細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗－ＧＦＰ 抗体で染色した。また、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。共焦点顕微鏡画像は、Ｏｐｅｒｅｔｔａで撮影された。図１２は、クローン１、２、および１６の代表的な画像を示している。

すべてのクローンについて、内在性ｅＧＦＰ信号は顕微鏡検査に十分ではなかったため、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗－ＧＦＰ抗体を使用したｅＧＦＰの追加染色を実施した。この染色により、チューブリン細胞骨格の明確に認識可能な構造が明らかになり、フィラメントといくつかの細胞突起が明らかになった（図１２）。

クローン３および４では、一部の細胞は抗体染色の助けを借りて弱いＧＦＰ信号を示したが、ＧＦＰが検出されない細胞も見られた。一般に、クローン３と４はすべての実験で不明瞭な結果を示した。配列決定では、多様な混合配列を同定することができた。さらに、顕微鏡分析により、ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂは一部の細胞にのみ存在することが示された。これは、両方のクローンが混合クローンであることを示唆している。

クローン２３の細胞は、内在性でも、ＧＦＰ抗体による染色でも、顕微鏡でＧＦＰ信号を示さなかった。クローン２３の細胞ではｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ融合タンパク質を検出できなかった。ただし、ｅＧＦＰ配列の正しい挿入は、ＤＮＡレベルで数回検出された。これは、遺伝子が細胞内でシャットダウンされていることを示唆している。このクローンでは、明らかにノックインが正しく行われていた。しかしながら、修飾タンパク質の発現がないと使用できなかった。

ノックイン戦略Ｖ１の概要：
ノックイン戦略Ｖ１は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミドでのピューロマイシンによる単一選択に基づいている。単一細胞が置かれた後、ＦＡＣＳ、イメージング分析、ＰＣＲおよび配列決定によって特徴付けられた２３個のクローンを同定することができた。これらの分析により、２０個のクローンにおいてゲノムレベルでノックインが発生したことが示された。所望のｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ融合タンパク質は細胞内で発現し、機能の有意な損失は見られなかった。２３個のクローンの特性を表３にまとめる。

（表３）ノックイン戦略Ｖ１のすべてのクローンと要約された結果のリスト。

２）ノックイン戦略Ｖ２：抗生物質によるＣａｓ９とドナープラスミドの二重選択
Ｃａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミド
ハイグロマイシンＢ耐性カセットｃｒＲＮＡ１またはｃｒＲＮＡ２またはｃｒＲＮＡ３を有する環状および線状化ドナープラスミド
ｔｒａｃｒＲＮＡ

ノックイン戦略Ｖ２では、ノックイン戦略Ｖ１と同じｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＣａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミドを用いて細胞をトランスフェクトした。３つのｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：０７－０９）のそれぞれを、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを有する線状化または環状ドナープラスミドと組み合わせた。Ｃａｓ９プラスミドにはピューロマイシン、ドナープラスミドにはハイグロマイシンＢを介して合計１０日間、選択を行った。その後、ＦＩＴＣ陽性の生存可能な単一細胞を含む４つの９６ウェルプレートが、各トランスフェクションから置かれた。野生型細胞とトランスフェクト細胞との間のＦＩＴＣ信号の差は、ヒストグラムの拡大図で明らかであった。ＦＩＴＣ陽性細胞の割合は０．４％と３．８％との間であった。線状および環状ドナープラスミドからのサンプルを比較すると、環状ドナープラスミドを用いたトランスフェクションにおけるＦＩＴＣ陽性細胞の割合は、線状化ドナープラスミドを用いたトランスフェクションよりも、３つすべてのｃｒＲＮＡについて高いことがわかった。最も強い信号は、ｃｒＲＮＡ３および環状ドナープラスミドのサンプルで見つかった（図１３）。

インキュベーター内で３週間インキュベートした後、置かれた単一細胞の増殖速度を顕微鏡で測定した。平均３４．３％であった。増殖したすべてのクローンを、それらのＦＩＴＣ信号について、ＦＡＣＳによって分析した。細胞におけるｅＧＦＰ発現は、野生型、すなわち非形質移入細胞と比較して増加したＦＩＴＣ信号の検出につながる。合計４９６の分析されたクローンから、合計１１８の潜在的に陽性のクローンが同定された。これは、２４．３％の全体的な効率に相当する。環状ドナープラスミドを含むサンプル中の潜在的に陽性のクローンの割合は３３．３％であり、線状化ドナープラスミドの場合の１５．３％の２倍より高かった（表４）。

（表４）単一細胞が置かれた後のＦＡＣＳを使用したノックイン戦略Ｖ２からの潜在的に陽性のクローンの同定。単一細胞が置かれた後に同定された潜在的に陽性のクローンの数は、線状または環状のドナープラスミドを持つ各ｃｒＲＮＡについて示されている。検査したクローンの総数を括弧内に示す。効率は、検査したクローンの数に対する潜在的に陽性クローンの数の比率から得られた。

１１８の潜在的に陽性のクローンのうち、４０のクローンがランダムに選択され、さらなる検証のために拡張された。連続培養中、ＦＩＴＣ信号の安定性はＦＡＣＳによって定期的にチェックされた。培養１２継代後のスクリーニングでは、４０クローン中３２クローンで野生型と比較してＦＩＴＣ信号が増加していた。例えば、クローンＶ２ ３Ｚ Ｐ１ Ｂ５およびＶ２ ３Ｚ Ｐ２ Ｄ１０の場合、これは最初のＦＡＣＳスクリーニングの結果に匹敵した。いくつかのクローンは、最初のＦＡＣＳスクリーニングと比較して、連続培養中にＦＩＴＣ信号の減少を示した。それにもかかわらず、それは野生型と比較して高かった。３つのクローンについてのみ、１２継代後にＦＩＴＣ信号を検出できなかった。

（表５）成長したクローンのＦＡＣＳによるｅＧＦＰ信号の分析。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。ＦＩＴＣ－陽性領域中へのシフトによるクローンは拡張され、さらに分析された。継代数１２で連続培養した後、ＦＩＴＣ信号の安定性を再度確認した。＋＋＝変化なし；＋＝信号におけるわずかな減少；ｏ＝信号における強い減少；－＝信号なし

ＦＡＣＳ分析に加えて、４０クローンは、ＰＣＲ分析と配列決定だけでなく、イメージングによってさらに特徴付けられた。

ゲノムレベルでのノックインを確認するために、クローンの細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡ上で、ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂの完全なコード配列を増幅できるＰＣＲを設定した。ｅＧＦＰ配列の挿入がＴＵＢＡ１Ｂの前にある場合にのみ、両方のプライマーが結合できた（図１０）。ＰＣＲをアガロースゲルで分析したところ、予想されるサイズのきれいなバンドが示された。予想通り、野生型のテストでは、リバースプライマーのみが結合できたため、生成物は生成されなかった（図１４）。

バンドを切り出し、精製し、配列決定した。ＤＮＡで検出された２つの配列の差は、タンパク質配列に変化を引き起こさないサイレント突然変異である。両方の配列バリアントは、予想されるタンパク質に対応していた。ＴＵＢＡ１Ｂの部分は野生型と同一であった。

３つの陰性クローンのＰＣＲおよび配列決定によって、正しいＤＮＡ配列を決定することができた。例えば、クローン１Ｌ Ｐ２ Ｆ５はすべての分析で陽性の結果を示したが、顕微鏡検査で陽性の信号を示したのは約半分の細胞だけであった。

ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ融合タンパク質の機能を顕微鏡で分析した。タグ付けされたタンパク質がクローンの微小管の形成に引き続き関与しているかどうかを確認するために、Ｏｐｅｒｅｔｔａシステムを使用して調査を行った。このために、細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗－ＧＦＰ抗体で染色した。また、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。例えば、クローン１０は、抗－ＧＦＰ抗体を使用して染色した場合でも、信号を示さなかった。クローン４１では、抗－ＧＦＰ抗体による信号は弱く、非常に拡散していた。一方、クローン２８は、すべての細胞で抗体染色による明確な信号を示した。細胞突起は良好な信号を示している（図１５）。

ノックイン戦略Ｖ２の概要：
ノックイン戦略Ｖ２では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミド、ならびにハイグロマイシンＢ耐性カセットを有するドナープラスミドを細胞にトランスフェクトした。３つのｃｒＲＮＡのそれぞれを、それぞれの線状または環状ドナープラスミドと組み合わせて使用した。Ｃａｓ９プラスミドにはピューロマイシン、ドナープラスミドにはハイグロマイシンＢを介して選択を行った。スクリーニングされた４９６のクローンのうち、１１８の陽性クローンが同定された。さらに分析するために、４０のクローンをランダムに選択して拡張した。ＦＡＣＳ分析、シーケンシング、およびイメージングの結果は、正確なｅＧＦＰノックインが２９クローンで達成されたことを明らかにした。

選択された４０クローンの特性を表６にまとめる。

（表６）ノックイン戦略Ｖ２のすべてのクローンと要約された結果のリスト。

３）ノックイン戦略Ｖ３：抗生物質およびＣＤ４マーカーを使用したＣａｓ９およびドナープラスミドの二重選択
ｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミド
ハイグロマイシンＢ耐性カセットを備えた環状および線状化ドナープラスミド
ｃｒＲＮＡ１またはｃｒＲＮＡ２またはｃｒＲＮＡ３
ｔｒａｃｒＲＮＡ

ノックイン戦略Ｖ３では、環状または線状ドナープラスミドおよびｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドを細胞にトランスフェクトした。「オールインワン」と呼ばれるこのプラスミドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよびＣＤ４をコードする。この戦略では、ドナープラスミドにはハイグロマイシンＢを使用し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｇＲＮＡにはＣＤ４を使用して選択を行った。３つの異なるｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドが使用され、それぞれが３つのｇＲＮＡの１つをコードしている。これにより、このアプローチでは６つのトランスフェクションが行われ：３つの異なるｇＲＮＡがそれぞれ環状または線状化ドナープラスミドと組み合わされている。トランスフェクションの約４８時間後、細胞はＡＰＣ－コンジュゲート抗－ＣＤ４抗体で染色した。ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞はＣＤ４を自然に発現しないため、これらの細胞はＡＰＣネガティブゲートを画定した。ｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドを取り込んだ細胞のみが細胞表面にＣＤ４を発現し、抗体で染色した後、ＡＰＣ信号の上昇を介してＦＡＣＳで検出できた。サンプルはすべて、ＡＰＣ信号が大幅に増加したことを示している。トランスフェクトされた細胞は、ＡＰＣポジティブゲートで６３％と８６％との間である。各ｇＲＮＡからの線状および環状ドナープラスミドを含むサンプルを比較すると、比例して多くのＡＰＣ、したがってＣＤ４陽性細胞が環状ドナープラスミドによるサンプルで検出されることがわかった。各トランスフェクションから、ＦＡＣＳソーティングを使用して、約５×１０^５個のＣＤ４陽性細胞が細胞プールとして置かれた（図１６）。

６－ウェルプレートで２４時間プールソーティング後、細胞を培養した。次に、ドナープラスミドをハイグロマイシンＢで１０日間選択した。その後、各トランスフェクションからの単一細胞を４つの９６ウェルプレートに置いた。野生型細胞とトランスフェクトサンプルとの間のＦＩＴＣ信号の差は、ヒストグラムの拡大図で明らかであった。サンプル１Ｌ、１Ｚ、および２Ｌは、非常に弱いＦＩＴＣ陽性信号のみを示し、１％を十分に下回っていた。サンプル２Ｚおよび３Ｚは、野生型と比較してＦＩＴＣ信号に差はなかった。サンプル３Ｌは、野生型よりもさらに弱いＦＩＴＣ信号を示した。したがって、ＦＩＴＣ陽性細胞のゲーティングはほとんど不可能であった。可能な範囲で、生存可能な単一細胞がＦＩＴＣ陽性ゲートから置かれた（図１７）。

単一細胞が置かれてから３週間後、ＦＩＴＣ信号についてクローンの最初のスクリーニングが行われ、ＦＡＣＳにおけるｅＧＦＰの存在が確認された。以前は、４３％の平均成長率が顕微鏡的に決定されていた。合計９５２個のクローンがスクリーニングされ、そのうち３３個が潜在的に陽性のクローンとして同定された。これは、３．４％の効率に相当する。３つのサンプル１Ｌ、３Ｌ、および３Ｚでは、クローンを同定できなかった。繰り返すが、環状ドナープラスミドサンプルは、線状化ドナープラスミドを含むサンプルよりも潜在的に陽性のクローンを生成することがわかった（表７）。

（表７）単一細胞が置かれた後のＦＡＣＳを使用したノックイン戦略Ｖ３からの潜在的に陽性のクローンの同定。単一細胞が置かれた後に同定された潜在的に陽性のクローンの数は、各ｇＲＮＡおよびゲートについて規定されている。検査したクローンの総数を括弧内に示す。効率は、検査したクローンの数に対する潜在的なクローンの数の比率から得られた。

最初のＦＡＣＳスクリーニングからのＦＩＴＣヒストグラムは、野生型に対する信号の差が非常に小さいことを示した。一部のクローンはＦＩＴＣ陽性領域で比較的強いシフトを示したが、これはログステップ未満であった。

合計で、ＦＩＴＣ信号が上昇した３３個のクローンを同定し、さらに分析するために拡張することができた。培養中、ｅＧＦＰ信号の安定性はＦＡＣＳによって定期的にチェックされた。数回の継代後、ほとんどのクローンが以前は低かったＦＩＴＣ信号を完全に失っていることが判明した。オーバーレイでは、それらの信号は野生型の信号と同一であった。

クローンのｃＤＮＡでのＰＣＲにより、ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂの完全なコード領域を増幅できる。この目的のために、全ＲＮＡをクローンから単離し、ｃＤＮＡに転写した。ＰＣＲのプライマーは、ｅＧＦＰの正確な挿入が発生した場合にのみ特定の生成物が形成されるように選択された。ＰＣＲはアガロースゲルで分析した。予想通り、野生型サンプルでは生成物を増幅できなかった。予想通り、野生型サンプルでは生成物を増幅できなかった。ノックイン戦略Ｖ１のクローン１をＰＣＲの陽性コントロールとして使用し、２０８５ｂｐの特定の生成物を生成した。ＤＮＡレベルでは、分析したどのクローンについてもｅＧＦＰの特異的なノックインは示されなかた（図１８）。

いくつかのクローンを顕微鏡で検査した。固定および透過処理した細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗－ＧＦＰ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。いずれのクローンにおいてもｅＧＦＰは検出できなかった。同様に、ＧＦＰ信号、したがってｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ融合タンパク質を伴うフィラメント状チューブリン構造は、抗体染色によって検出できなかった。

ハイグロマイシンＢによる選択にもかかわらずクローンが生き残った理由は、ｅＧＦＰまたはハイグロマイシンＢ耐性カセットの特異的プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：：２６および２７）を使用したクローンのｃＤＮＡのＰＣＲによって決定された。予想通り、野生型試験では、ハイグロマイシンＢ特異的プライマーでは生成物を増幅できなかった。ドナープラスミドはハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んでおり、したがって陽性コントロールとして機能した。特定のバンドは、すべてのクローンのハイグロマイシンＢ耐性カセットのプライマーを使用したＰＣＲで増幅できた（図１９）。クローンのｃＤＮＡに対するｅＧＦＰ特異的プライマーを用いたＰＣＲも、野生型の生成物を示さなかった。ドナープラスミドには、開始コドンＡＴＧのないｅＧＦＰ配列が含まれており、選択したプライマーを使用した陽性コントロールとして機能する。いくつかのクローン、例えば、クローン４、７、１４および１９では、アガロースゲルに予想される高さで顕著なバンドが現れた。クローン１または１２などの他のクローンは、弱い強度の１つのバンドのみを示した。クローン２、３、５、８、および２７については、このＰＣＲではアガロースゲルで特定の生成物は検出されなかった（図２０）。

ノックイン戦略Ｖ３の概要：
ノックイン戦略Ｖ３では、細胞を２つのプラスミドでトランスフェクトした。ドナープラスミドは、挿入部位周辺の相同配列に囲まれた、導入されるｅＧＦＰ配列を含んでいた。オールインワンプラスミドと呼ばれる第２のプラスミドｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４もまた、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに加えてｇＲＮＡをコードする。さらに、プラスミド上にはＣＤ４マーカーが存在していた。選択は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのＣＤ４プールソーティングに基づいており、続いてドナープラスミドのハイグロマイシンＢ選択が行われた。合計、スクリーニングされた９５２個のクローンのうち、３３個の陽性クローンが同定された。次の実験は、すべてのクローンが陰性クローンであることを示した。目的の遺伝子座での正確なノックインは、ＰＣＲによってＤＮＡレベルで検出できなかった。

３３個のクローンの特性を表８にまとめる。

（表８）ノックイン戦略Ｖ３のすべてのクローンと要約された結果のリスト。

４）考察
内在性タンパク質の正確な修飾のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による特異的なノックインの生成は、重要であることが証明された。例として、これは、ＨＥＫ２９３Ａ細胞のＴＵＢＡ１Ｂモデル遺伝子へのｅＧＦＰのＮ末端ノックインによって実証された。

このようなＴＵＢＡ１ＢへのＧＦＰノックインは、例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼを使用するＵ２Ｏ２骨肉腫細胞（１６）や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（１７）など、いくつかのグループによってすでに実現されている。Ｒｏｂｅｒｔｓ等は、生細胞タイムラプスイメージングで直接ＧＦＰタグを介して、ヒトｉＰＳＣにおける、Ｎ末端にタグを付加されたＴＵＢＡ１Ｂの構造を分析した。

ここで例示したノックインは、同じ基本戦略に基づいており、３つの異なるバリアントで実行された。Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３を含む。

ノックイン戦略Ｖ２では、クローンのＦＡＣＳスクリーニングにより、ｅＧＦＰ信号の強度が明らかにさらに不均一であることが示された。特に、ｃｒＲＮＡ３と環状ドナープラスミドを有するクローンは、ＦＩＴＣ陽性範囲の細胞の８７％以上で長期培養した後、非常に強いｅＧＦＰ信号の安定性を示した。ｃｒＲＮＡ１と環状ドナープラスミドを有するクローンは、ＦＡＣＳによって幅広い多様性を示し、これは、細胞の２１％と７５％との間がＦＩＴＣ陽性範囲にあったためである。

ノックイン戦略Ｖ３では、陽性のクローンを生成することはまったくできなかった。最初のＦＡＣＳスクリーニングでは、検出可能なｅＧＦＰ信号を有する少ない割合の細胞（５％より多くの細胞がＦＩＴＣ陽性範囲にある）によって、クローンが選択された。これらのクローンでは、細胞集団全体のＦＩＴＣ陽性領域へのシフトは見られなかった。連続培養中の分析では、数回継代した後、ｅＧＦＰ信号が検出されなくなったことが示された。ＤＮＡレベルでは、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子の前にｅＧＦＰ配列のノックインは検出されなかった。最初のＦＡＣＳスクリーニングでこれらの細胞で偽陽性信号が測定された可能性がある。ハイグロマイシンＢ特異的プライマーを使用したＰＣＲは、すべてのクローンで肯定的な結果をもたらし、クローンが抗生物質選択を生き残ることができたことを示している。また、ＰＣＲにより多くのクローンでｅＧＦＰ配列の一部が検出された。これらの結果は、同定された潜在的に陽性のクローンがドナープラスミドをゲノムにランダムに組み込んだことを示唆している。ｅＧＦＰ配列は、ドナープラスミド上に独自のプロモーターまたは開始コドンを担持していなかった。したがって、転写された遺伝子座の正しいリーディングフレームにランダムにｅＧＦＰが組み込まれる可能性は低い。いずれのクローンでも正確なノックインは検出されなかった。

ノックイン戦略Ｖ１およびＶ２からのいくつかのクローンでは、ｃＤＮＡ上のＰＣＲによってモノ対立遺伝子ノックインが検出された（データは示さず）（１７も参照）。

テストした３つのノックイン戦略Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３の有効性を比較すると、ハイグロマイシンＢとピューロマイシンによる二重選択が最も高い効率を示したことがわかった。４０個の潜在的に陽性のクローンのうち２９個について、正しいｅＧＦＰノックインを確認できた。したがって、潜在的に陽性と同定されたクローンの１７．５％が偽陽性であり、７２．５％が実際に陽性であった。これを、最初に同定された１１８個の潜在的に陽性のクローンに適用すると、４９６個の分析されたクローンのうち８６個の陽性クローンが予想されることになる。これは、１７．３％の全体的な効率に相当する。文献では、０．１％～５％の範囲で相同組換えの効率が大きく変化することがわかっている。最適化された条件下で、それぞれの遺伝子座に応じて、最大２４％の効率も示されている（１７、１８）。

相同組換えの効率にとって最も重要な要因の１つは、ドナーテンプレートである。テストされた戦略では、使用されたプラスミドは、ＮｏｔＩによる制限によって環状または線状化された。結果は、環状プラスミドよりも線状化ドナープラスミドの方がノックイン効率が低いことを示した。さまざまなドナーバリアントがテストされ、多数の記事で比較された。Ｓｔｉｅｇｅｒ等は、５’－オーバーハングを有する環状または線状ドナーよりも、３’－オーバーハング線状ドナーを使用した標的遺伝子座で、より多くのインデル変異を特定できることを示した。同様の調査結果は、Ｌｉａｎｇ等によって説明されている。彼らは、３０ヌクレオチドのオーバーハングを有する線状二本鎖ドナーでは、オーバーハングのないドナーよりも大幅に優れたＨＤＲ効率を達成できることを示した（１９）。Ｚｈａｎｇ等は、プラスミドバックボーンが完全に除去されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、環状およびダブルカットドナーを使用した。環状ドナーでは５％のＨＤＲ効率が達成され、線状ダブルカットドナーでは２１％でさえあった。ダブルカットドナーはノックイン率を大幅に高め、環状ドナープラスミドよりも大幅に短い相同配列を必要とする（２０）。Ｃｈｕ等のワーキンググループは、ＨＥＫ２９３細胞において、１ｋｂの相同配列をテンプレートとして有する、生成されたＰＣＲ生成物用いて、最良のノックイン結果を達成した（２１）。

ノックインに成功した細胞を得るためには、編集されていない野生型細胞を正確に選択する必要がある。使用したバリアントでは、両方のプラスミドで行った場合に抗生物質の選択が最も効率的であった。

ＰＣＲ分析は、戦略Ｖ１では、２３個のクローンのうちの２個だけがＣａｓ９配列を示さなかったことを示した。

ＣＤ４選択はトランスフェクトされた細胞を分離するためだけに機能したため、オールインワンｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４から利益が期待された。ＣＤ４ソーティングでは、細胞が生き残るために人為的にプラスミドを保持することはなく、約７日後に細胞はプラスミドを失った。

Ｒｏｂｅｒｔｓ等の研究では、選択はＦＡＣＳによるＧＦＰ信号のみを介して行われ、抗生物質が存在しないにもかかわらず、使用したｃｒＲＮＡに応じて、４５％のクローンでドナープラスミドの偶発的な組み込みが検出された（１７）。

ｅＧＦＰタグの利点は、抗体でさらに染色しなくても信号を提供できることであり、これは、例えば、クローンのＦＡＣＳスクリーニングで時間とコストの面でより経済的である。あるいはまた、より小さいＭｙｃタグが使用できる。

Ｎ末端ｅＧＦＰタグを挿入する前の、ゲノム内のヒトＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座と、それぞれの転写されたｍＲＮＡおよびそこから翻訳されたタンパク質の概略図。コード配列（濃い青）には、非翻訳領域（水色）とイントロン配列（灰色）とが隣接している。 Ｎ末端ｅＧＦＰタグを挿入した後の、ゲノム内のヒトＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座と、転写されたｍＲＮＡおよびそこから翻訳されたタンパク質の概略図。コード配列（濃い青）には、非翻訳領域（水色）とイントロン配列（灰色）とが隣接している。 ゲノムＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座のエキソン２の上流にｅＧＦＰ配列を導入するためのノックイン戦略。３つの特定のｇＲＮＡは、エキソン２の開始部に結合し、Ｃａｓ９との二本鎖切断を生成する。ドナープラスミドは、挿入されるｅＧＦＰ配列を含み、当該配列は、相同組換えのための１ｋｂの相同配列に囲まれている。ドナープラスミドの３’－相同配列上のアスタリスク（＊）は、ｇＲＮＡ結合部位の点突然変異領域を識別表示する。 Ｃａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のプラスミドマップ。 ｐＣａｓ９－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）のプラスミドマップ ハイグロマイシンＢ耐性カセットを有するドナープラスミドのプラスミドマップ ドナープラスミドの調製に使用されたプラスミドマップｅＧＦＰハイグロマイシンＢプラスミド。 ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞を、２つのＴＵＢＡ１Ｂ特異的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、環状ドナープラスミド、およびＣａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミドでトランスフェクトした。ピューロマイシンで選択した後、単一細胞を９６ウェルフォーマットで置いた。ここに示されているのは、ｃｒＲＮＡ１サンプルのゲーティング戦略である。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。サンプル（青）のＦＩＴＣ信号は、野生型（黒）と一緒にヒストグラムで正規化され、拡大表示されている。単一細胞は、標識されたゲートＰ３およびＰ４から置かれた。 ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞を、２つのＴＵＢＡ１Ｂ特異的ｃｒＲＮＡ、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ、環状ドナープラスミド、およびＣａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミドでトランスフェクトした。ピューロマイシンで選択した後、単一細胞を９６ウェルフォーマットで置いた。ｃｒＲＮＡ２サンプルのゲーティング戦略が示されている。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。サンプル（青）のＦＩＴＣ信号は、野生型（黒）と一緒にヒストグラムで正規化され、拡大表示されている。単一細胞は、標識されたゲートＰ３およびＰ４から置かれた。 ノックイン戦略Ｖ１のクローンのｃＤＮＡでＰＣＲを行い、ゲノムレベルでのノックインを確認する。ＴＵＢＡ１ＢおよびｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１ＢのｃＤＮＡ、およびドナープラスミドの一部の概略図。矢印は、使用するプライマーの結合部位を示している。両方のプライマーは、ＴＵＢＡ１Ｂの前でｅＧＦＰの正確なノックインが発生した場合にのみ結合できる。コード配列は水色で、非翻訳領域は灰色で示されている。 ノックイン戦略Ｖ１のクローンのｃＤＮＡでＰＣＲを行い、ゲノムレベルでのノックインを確認する。クローン（１～２３）および野生型（ＷＴ）のｃＤＮＡで、プライマーｅＧＦＰ ｆｗｄおよびＴＵＢＡ１Ｂ Ｅｘｏｎ４ ｒｅｖを使用したＰＣＲをアガロースゲルに適用した。正確なノックインの場合、９９９ｂｐの生成物が増幅されるべきである。 イメージングによるノックイン戦略Ｖ１からのクローンにおけるｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂタンパク質の機能の分析。細胞を固定し、透過処理し、ＧＦＰ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体で染色した。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。内在性ｅＧＦＰは４８８ｎｍで、ＧＦＰ抗体からのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７は６４７ｎｍで、結合したＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染料は３５５ｎｍで刺激された。各クローンから、４０倍の対物レンズで４０ピクセルを記録した。代表的な画像断面をそれぞれの場合に示す。 ノックイン戦略Ｖ２からのトランスフェクトされたサンプルを単一細胞として置くこと。ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞を、３つのＴＵＢＡ１Ｂ特異的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、環状または線状化ドナープラスミド、およびＣａｓ９－ＰｕｒｏＲプラスミドでトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢとピューロマイシンによる二重選択の後、単一細胞を９６ウェルフォーマットに置いた。ｃｒＲＮＡ１サンプル１Ｌ、ｃｒＲＮＡ２サンプル２Ｌ、ｃｒＲＮＡ３サンプル３ＬのＦＩＴＣヒストグラムが示されており、それぞれ線状化ドナープラスミドであり、ならびにｃｒＲＮＡ１サンプル１Ｚ、ｃｒＲＮＡ２サンプル２ＺおよびｃｒＲＮＡ３サンプル３Ｚは、それぞれ環状ドナープラスミドを有する。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。サンプル（青）のＦＩＴＣ信号は、野生型（黒）と拡大されたオーバーレイのヒストグラムで正規化される。ＦＩＴＣ陽性ゲートからの単一細胞が置かれた。 図１３－１の説明を参照。 ノックインＶ２からのクローンの完全なｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ配列の分析。ｃＤＮＡ ｆｗｄプライマーおよびｃＤＮＡ ｒｅｖプライマーを用いたクローンおよび野生型（ＷＴ）のｃＤＮＡのＰＣＲが、アガロースゲルに供された。このＰＣＲは、ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂのコード領域全体を増幅し、ノックイン時に２０８５ｂｐの生成物をもたらすように設計された。 イメージングによるノックイン戦略Ｖ２のクローンにおけるｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂの機能の分析。細胞を固定し、透過処理し、ＧＦＰ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体で染色した。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。内在性ｅＧＦＰは４８８ｎｍで、ＧＦＰ抗体からのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７は６４７ｎｍで、結合した Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染料は３５５ｎｍで刺激された。各クローンから、２０倍の対物レンズで４０ピクセルを記録した。代表的な画像断面をここに示す。 ノックイン戦略Ｖ３からのトランスフェクトされたサンプルのＣＤ４陽性細胞のプールソーティング。ＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞に、異なるｇＲＮＡ配列を有する３つのｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドのうちの１つと、環状または線状化ドナープラスミドとをトランスフェクトした。４８時間後、ＣＤ４陽性細胞のプールが置かれた。ｇＲＮＡ１／２／３由来の、線状ドナー（１Ｌ／２Ｌ／３Ｌ）がトランスフェクトされたサンプルには、ｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドが含まれており、環状ドナープラスミド（１Ｚ／２Ｚ／３Ｚ）でトランスフェクトされた、ｇＲＮＡ１／２／３由来のものには、ｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４が含まれており、ＡＰＣ－コンジュゲート抗－ＣＤ４抗体で染色した。ヒストグラムは、染色されたサンプル（青）の正規化されたＡＰＣ信号を、染色された野生型（黒）と重ね合わせて示した。ＡＰＣ陽性ゲート由来の細胞は、細胞懸濁液からのプールとして分類された。 ノックイン戦略Ｖ３からのＣＤ４陽性プールサンプルを単一細胞として置くこと。サンプルは、ハイグロマイシンＢによるＣＤ４プールソーティングの２４時間後に選択された。増殖した細胞からの単一細胞が９６ウェルフォーマットで置かれた。ｇＲＮＡ１サンプル１Ｌ、ｇＲＮＡ２サンプル２Ｌ、ｇＲＮＡ３サンプル３ＬのＦＩＴＣヒストグラムが示されており、それぞれ線状化ドナープラスミドであり、およびｇＲＮＡ１サンプル１Ｚ、ｇＲＮＡ２サンプル２ＺおよびｇＲＮＡ３サンプル３Ｚは、それぞれ環状ドナープラスミドを有する。ゲーティングは、ＦＳＣチャネルおよびＳＳＣチャネルを介して実行可能な単一細胞で行われた。ＦＩＴＣチャネルを介してｅＧＦＰの存在を検出することができた。サンプル（青）のＦＩＴＣ信号は、野生型（黒）のオーバーレイのヒストグラムで正規化され、拡大されている。ＦＩＴＣ陽性ゲートから単一細胞が置かれた。 図１７－１の説明を参照。 ノックイン戦略Ｖ３からのクローンの完全なｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂ配列の分析。ｃＤＮＡ ｆｗｄプライマーおよびｃＤＮＡ ｒｅｖプライマーを用いたクローンおよび野生型（ＷＴ）のｃＤＮＡのＰＣＲが、アガロースゲルに供された。このＰＣＲでは、ｅＧＦＰ－ＴＵＢＡ１Ｂのコード領域全体が増幅され、正確なノックインが発生したときに２０８５ｂｐの生成物が得られるべきである。 ノックイン戦略Ｖ３のクローンのＰＣＲ。ハイグロマイシンＢ耐性カセットからの領域を増幅するための、クローン（１～２７）、野生型（ＷＴ）およびドナープラスミド（Ｄ）のｃＤＮＡに対する、プライマー Ｈｙｇｒｏ ｆｗｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）およびＨｙｇｒｏ ｒｅｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を用いたＰＣＲ。特定の生成物のサイズは３２４ｂｐである。 ノックイン戦略Ｖ３のクローンのＰＣＲ。ｅＧＦＰ配列からの領域の増幅のための、プライマーｅＧＦＰ＿２ ｆｗｄおよびｅＧＦＰ＿２ ｒｅｖを用いた、クローン（１～２７）のｃＤＮＡ、野生型（ＷＴ）およびドナープラスミド（Ｄ）に対するＰＣＲ。特定の生成物のサイズは３００ｂｐである。

配列
ｇＲＮＡ１フォワード ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１
ｇＲＮＡ１リバース ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２
ｇＲＮＡ２フォワード ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３
ｇＲＮＡ２リバース ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４
ｇＲＮＡ３フォワード ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５
ｇＲＮＡ３リバース ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６
ｃｒＲＮＡ１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７
ｃｒＲＮＡ２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０８
ｃｒＲＮＡ３ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０９
Ｄ＿Ｈｙｇｒｏ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
Ｄ＿Ｈｙｇｒｏ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
Ｄ＿５’ ＨＡ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
Ｄ＿５’ ＨＡ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
Ｄ＿ｅＧＦＰ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
Ｄ＿ｅＧＦＰ＿ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
Ｄ＿３’ ＨＡ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
Ｄ＿３’ ＨＡ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
Ｄ＿３’ ＨＡ－Ｚ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
Ｄ＿３’ ＨＡ－Ｚ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１
ｅＧＦＰ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２
ＴＵＢＡ１Ｂ、ｅｘｏｎ４ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３
ｃＤＮＡ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４
ｃＤＮＡ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５
Ｈｙｇｒｏ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６
Ｈｙｇｒｏ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
Ｃａｓ９ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８
Ｃａｓ９ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９
ｅＧＦＰ＿２ ｆｗｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０
ｅＧＦＰ＿２ ｒｅｖ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１
ｅＧＦＰタグのアミノ酸配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２
ｅＧＦＰタグの塩基配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３

文献

材料および方法
消耗品

化学品：

プラスミド：
Ｃａｓ９プラスミドは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（図４）およびＯｒｉｇｅｎｅ（図５）から購入した。ドナープラスミドを自己クローニングした（図６（ハイグロマイシンＢ耐性カセットを使用）、図７（ｐＡＨ－０１６３））。すべてのプラスミドを－２０℃で保存した。

酵素：
使用したすべての酵素はＮＥＢから購入し、－２０℃で保存した。

バッファーおよび溶液：

オリゴヌクレオチド：
ＴＵＢＡ１Ｂに特異的なｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡ

プライマー：
すべてのプライマーは、１００μＭの濃度で溶解した形でｍｅｔａｂｉｏｎから購入し、－２０℃で保存した。

細胞株、細胞培養培地、および添加物：
すべての実験は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して実施した。

抗体：
抗体は、製造元の指示に従って４℃または－２０℃で保存した。

キット：

方法：
１．分子生物学的研究
１．１．合成オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
Ｏｒｉｇｅｎｅ由来のオールインワンｐＣａｓ－ＧｕｉｄｅＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドのｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、合成オリゴヌクレオチドとしてオーダーした。それらをベクターにクローン化できるようにするために、最初に相補的な一本鎖をハイブリダイズさせる必要があった。それらは、各５’－オーバーハングが線状化ベクトルの３’－オーバーハングを相補するように設計された。これにより、所望の方向で正確なライゲーションが達成される。

ハイブリダイゼーションの反応は以下のように設定された：

混合物を十分に混合し、以下のプログラムに従ってサーモサイクラーでインキュベートした：

サンプルを水で１：１０に希釈し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。

１．２．ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応、略してＰＣＲは、ＮｏｖａｇｅｎのＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔを使用して実行した。とりわけ、この方法を使用して、ドナープラスミドのクローニングのための相同配列およびｅＧＦＰフラグメントを生成し、後で選択されたクローンを特徴付けた。ドナープラスミドのフラグメントを生成するために、ＰＣＲプライマーを、隣接するフラグメントの末端に短い１５ｂｐの相同配列を生成するように特別に設計した。このマイクロホモロジーを使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを使用して、正しい順序と方向で正確なライゲーションを確保した。

さらに、３’ホモログアームＤ＿３’ＨＡ ｆｗｄを生成するためのフォワードプライマーには、いくつかのサイレントポイント変異が含まれていた。これらは、使用されたｃｒＲＮＡによって結合された配列領域に位置していた。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの前でのトランスフェクションからドナープラスミドを保護するには、ｃｒＲＮＡ結合部位を変異させる必要がある。ＰＡＭ配列にサイレント変異を導入することは、リーディングフレームのために不可能であり、タンパク質配列に変化を引き起こしたであろう。したがって、後でタンパク質配列に変化をもたらさない可能性のあるすべての塩基が交換された。

ＰＣＲ反応は次のアプローチで構成されていた：

ＰＣＲプログラムは、テンプレートの種類、ＰＣＲ生成物の長さ、および使用するプライマーの性質（ＧＣ含量や融解温度など）によって異なる。デフォルトでは、次のＰＣＲプログラムが使用された：

１．３．制限消化
クローニングの１つの要素は、配列特異的な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化である。一方では、クローン化されるＤＮＡフラグメントが調整される。他方、この方法は、クローン化されたプラスミドがその正しい集合について検査される制限分析として使用することができる。ＮＥＢからの最適化された高忠実度制限酵素が好ましく使用された。

一般に、制限混合物は次の成分で構成されていた：

混合物を十分に混合し、サーモブロック内で３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。続いて、制限酵素を不活性化するために、温度を１０分間で７０℃に上げた。

このようにして、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを持つドナープラスミドも、トランスフェクション用のエンドヌクレアーゼＮｏｔＩ－ＨＦで線状化された。次に、１μＬのエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）を制限混合物に直接添加し、３７℃で１時間再度インキュベートした。これによりベクター末端が脱リン酸化され、プラスミドのランダムな再結合が防止される。

異なる温度または異なるバッファーで最大の活性を示す制限酵素を使用する場合、消化は２つの温度工程で行う必要があるか、あるいは、再緩衝の工程を組み込む必要がある。

１．４．アガロースゲル電気泳動とゲル抽出
ゲル電気泳動により、アガロースゲル中のＤＮＡフラグメントの混合物をそのサイズに応じて分離することができる。サンプルを６×ローディングバッファーでこれに加え、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルに適用する。サンプルを適用した後、１００Ｖの電圧を１時間印加した。その結果、負に帯電したＤＮＡはゲルを通ってアノードに向かって移動する。ＤＮＡのサイズと構造は、ゲル内での走行挙動にとって非常に重要である。ゲル電気泳動は、分取制限消化またはＰＣＲの標準である。プラスミドの制限消化では、したがって、所望のＤＮＡフラグメントをプラスミドの残りの部分から分離して、特定のＤＮＡバンドをゲルから切り出すことができる。

ＰＣＲでは、最適には１つの特定のフラグメントのみを増幅する必要がある。ゲル電気泳動は、ＰＣＲがどれほど純粋であり、非特異的な副生成物が形成されているかどうかを明らかにする。この場合も、特定のＤＮＡバンドを予想される高さでゲルから切り取ることができる。

切除したアガロースゲル片から所望のＤＮＡを抽出するために、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを付属のプロトコルに従って使用した。簡単に言うと、ゲル片を５０℃の結合バッファーに溶解し、イソプロパノールで処理してカラムにかけた。ＤＮＡはカラムのシリカ膜に結合し、溶出バッファーでの短い洗浄工程の後にカラムから溶出された。したがって、とりわけ、後に配列決定反応などの使用を妨害する可能性のある塩、酵素または他の不純物を反応混合物から除去することができる。精製したＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ２０００で分析し、－２０℃で保存した。

１．５．Ｅ． ｃｏｌｉでのライゲーションおよび形質転換
ライゲーションでは、相補的な末端を有するＤＮＡフラグメントが、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを使用して結合される。ライゲーション反応には、ＮＥＢのＴ４ＤＮＡリガーゼを使用した。プラスミドバックボーンと挿入フラグメントは、ライゲーションバッチで１：１０のモル比で使用された。

一般的なアプローチは次のとおりである：

混合物を十分に混合し、１６℃のサーモサイクラーで少なくとも１時間インキュベートした。続いて、リガーゼを７０℃で１０分間不活化した。

例外は、ドナープラスミドのフラグメントのライゲーションであった。これらのフラグメントは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｅａｍｌｅｓｓ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを使用して、付属のプロトコルに従ってアセンブルされた。使用したプライマーの結果として、隣接するフラグメントは１５ｂｐの短いマイクロホモロジーを有し、その上でフラグメントが正しい順序と方向でライゲーションされた。

次に、得られたプラスミドを、化学的にコンピテントなＥ． ｃｏｌｉに増殖させるために導入した。形質転換は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０ Ｅ． ｃｏｌｉを使用して実施した。この目的のために、－８０℃で保存された細菌を氷上で解凍し、２μＬのライゲーション混合物と混合し、氷上で少なくとも３０分間インキュベートした次に、熱ショックが発生し、プラスミドがコンピテント細胞に導入された。この目的のために、細胞を４２℃の水浴で３０秒間インキュベートした後、氷上で２分間インキュベートした。２００μＬのＳＯＣ培地を添加した後、細胞をサーモシェーカー内で３７℃、７００ｒｐｍで１時間インキュベートした。５０μＬの形質転換混合物をＬＢ寒天プレートにプレーティングした。耐性カセットに応じて、寒天プレートは、導入されたプラスミド１００μｇ／ｍＬアンピシリンまたは５０μｇ／ｍＬカナマイシン上に含まれていた。一晩、プレートを３７℃でインキュベートし、目的のプラスミドを受容した細菌コロニーのみを増殖させた。

１．６．プラスミドの調製
プラスミド調製は、形質転換されたＥ． ｃｏｌｉからクローン化されたプラスミドＤＮＡを単離するための方法である。このために、個々のコロニーを寒天プレートから選択し、ＬＢ培地に移し、３７℃および２００ｒｐｍで一晩培養した。所望の収量に応じて、異なるサイズのアプローチがＬＢ培地で行われた。２ｍＬのミニ調製物、１５０ｍＬのミディアム調製物、４００ｍＬのマキシ調製物、最大２．５Ｌのギガ調製物を区別した。

すべてのプラスミド調製は、付随するプロトコルに従って、ＱｉａｇｅｎおよびＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌのキットを使用して実施した。原則として、一晩培養物を遠心分離し、細菌ペレットをＲＮａｓｅ含有バッファーで再懸濁した。細胞を溶解緩衝液で５分間溶解し、カラムに置いた。ＤＮＡはカラムのシリカ膜に結合し、溶出バッファーでの洗浄工程後に溶出された。培地およびマキシ調製物において、溶出液中のＤＮＡを再びイソプロパノールで沈殿させ、４，５００ｒｐｍで１時間遠心分離した。７０％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡペレットを室温で１５分間乾燥させ、５００μＬのＴＲＩＳバッファーで再溶解した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００でのサンプルの分析により、ＤＮＡの濃度と純度が明らかになった。このようにして得られたＤＮＡを－２０℃で保存し、後に、ＨＥＫ２９３Ａトランスフェクションに使用した。

２．ヒト細胞の培養
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。完全培地は、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭＬ－グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０で構成されていた。連続培養では、細胞は週に２回分割し、７０％と９０％との間のコンフルエンスに達した。このために、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅで剥離した。新鮮な培地で再懸濁した後、細胞懸濁液の１／１０を新しいＴ７５細胞培養フラスコに移した。２５継代に達したとき、連続培養を廃棄し、内部細胞バンクからの新鮮な細胞を解凍した。

生成されたクローンは、野生型細胞と同じ完全培地で培養され、週に２回１：５に分割した。各クローンから、３×１０^６個の細胞を含む少なくとも３本のクライオチューブをバックアップとして凍結した。この目的のために、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、７．５％ＤＭＳＯを含むＦＣＳからなる１ｍＬの凍結培地に再懸濁した。細胞をクライオチューブに移し、フリーザーボックスで－８０℃で一晩凍結した。翌日、凍結細胞を窒素タンクに移して長期保存した。

３．リポフェクタミンによるトランスフェクション
細胞内で特定のノックインを達成するために、さまざまなプラスミドＤＮＡと部分的に合成されたＲＮＡを細胞に導入する必要があった。導入するサンプルに応じて、Ｄｈａｒｍａｃｏｎの２つのトランスフェクション試薬ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ ＤｕｏおよびＯｒｉｇｅｎｅのＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ ８．０を使用した。

トランスフェクションは、ノックイン実験のために６－ウェルフォーマットで実施し、トランスフェクションプロトコルの最適化は９６ウェルフォーマットで実施した。トランスフェクション時に約７０～８０％のコンフルエンシーに達するように、前日に細胞を播種した。概して、リポフェクタミンによるトランスフェクションでは、ＤＮＡとトランスフェクション試薬を血清を減らしたＯｐｔｉ－ＭＥＭで混合した。バッチは、リポフェクタミンと核酸の複合体を形成するために、室温でしばらくインキュベートしなければならなかった。続いて、トランスフェクション混合物を細胞に滴下して加えた。

トランスフェクション試薬に応じて、次の最適化されたプロトコルが６－ウェルフォーマットで使用された：

４．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを使用して、サンプル中の生細胞の数を測定した。この方法は、代謝的に活性な細胞の指標としてのＡＴＰ量の定量化に基づいている。実験には、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬は、各実験の前に新たに調製した。この目的のために、とりわけルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む基質を、付随するバッファーに溶解した。細胞の培地に直接添加した後、細胞の溶解が最初に起こる。生存能力を有する細胞はミトコンドリアでＡＴＰを生成し、それによって放出される。ＡＴＰの存在下で、ルシフェリンはＵｌｔｒａＧｌｏ ｒ－ルシフェラーゼによって変換される。これにより、存在するＡＴＰの量、したがって生細胞の数に比例する安定した発光信号が生成される。

アッセイを使用して、トランスフェクションを最適化し、トランスフェクション後の選択に最適な抗生物質濃度のハイグロマイシンＢとピューロマイシンを滴定した。すべてのアッセイにおいて、細胞は透明な底を備えた黒い平底９６ウェルプレートに播種された。抗生物質濃度を滴定する際、ウェルあたり７，５００個の細胞を播種した。翌日、細胞をさまざまな濃度の抗生物質で処理した。４８時間後、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬が各ウェルに添加されたアッセイによって細胞の生存率を測定した。続いて、プレートをプレートシェーカー上で２００ｒｐｍで２分間振とうした。暗所で１０分間インキュベートした後、発光信号をルミノメーターで測定した。

５．フローサイトメトリー
５．１．ＦＡＣＳソーティング
ＦＡＣＳは、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇの略で、フローサイトメトリーの特殊な形式である。ＦＡＣＳソーティングを使用すると、細胞懸濁液から目的の細胞をソーティングできる。Ｆａｌｃｏｎの細胞プールとして、または９６ウェルプレートの個々の細胞として、所望の細胞の保存が区別される。実験は、ＢＤのＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩソーターで実施した。

ＦＡＣＳソーティングを使用して、トランスフェクトされ、部分的にすでに選択された細胞がソーティングされた。これらを収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで１×１０^６細胞／ｍＬの細胞数に調整した。所望の細胞集団がゲーティングされ、ソートのためにデバイスですべての設定が行われた後、選択された細胞を破棄することができる。９６ウェルフォーマットで単一細胞を置いた。培地をテンパリングし、細胞のストレスを可能な限り低く保つため、プレートは３７℃でウェルあたり２００μＬの培地で保存された。各ノックイントライアルは、２０個と２４個との間のプレートで置くことを含んでいた。その後、細胞は、３７℃および５％ＣＯ_２のインキュベーター内での増殖が約３週間必要であった。すべてのプレートを顕微鏡で分析して増殖速度を決定し、次にクローンをｅＧＦＰ発現について調べた。

ノックインＶ３では、ｐＣａｓ９－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１α－ＣＤ４プラスミドに選択マーカーとしてＣＤ４カセットが含まれている。ＣＤ４陽性細胞を選択するために、トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を２５０μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５μＬのα－ＣＤ４－Ａｌｅｘａ６４７抗体を添加した。これは、１．５μｇ／ｍＬの最終抗体濃度に相当していた。暗所で氷上で１時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、測定した。プールソーティングのために、サンプルあたり約１．５×１０^５のＣＤ４陽性細胞を、５ｍＬの完全培地がすでに置かれている１５ｍＬＦａｌｃｏｎにソーティングした。続いて、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、３ｍＬの新鮮な完全培地に再懸濁し、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞は再び接着性となり、ドナープラスミド上のハイグロマイシンＢで選択することができた。選択した細胞が成熟すると、９６ウェルフォーマットで単一細胞として置くことが再び実行された。

５．２．分析フローサイトメトリー
分析フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳソーティングと同じ機能原理に基づいている。唯一の違いは、細胞をソートできないことであるが、サイズ、粒度、および場合によっては蛍光特性についてのみ調べることができる。

この方法論は、主に生成されたクローンのスクリーニングに使用された。この目的のために、培地を９６ウェルプレートから完全に除去し、細胞を２５μＬのアキュターゼで剥離し、４０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁した。４０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルコニカルボトムプレートに移し、ＢＤのＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで直接測定した。クローンのｅＧＦＰ信号は、常にＨＥＫ２９３Ａ野生型細胞で参照されていた。評価はＦｌｏｗＪｏｖ１０．０．７ソフトウェアを使用して行った。明確なｅＧＦＰ信号を有する潜在的に陽性のクローンが拡大され、さらに特徴づけられた。

６．総タンパク質抽出およびＢＣＡアッセイ
タンパク質レベルでもｅＧＦＰノックインを検証するために、総タンパク質を細胞から抽出する必要があった。この目的のために、１×１０^６個の細胞を収集し、３００ｇで５分間遠心分離し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。遠心分離工程を繰り返した後、上清を細胞から完全に除去した。細胞ペレットを６０μＬの新たに調製したＲＩＰＡバッファーに再懸濁し、氷上で少なくとも３０分間インキュベートした。次に、溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、細胞破片を除去した。上澄みを新しい反応容器に移し、－２０℃で保存した。

ビシンコニン酸アッセイ、略してＢＣＡアッセイを使用して、溶解物中のタンパク質濃度を定量化した。このアッセイは、ＢＣＡと色の複合体を形成する２価の銅イオンから１価の銅イオンへのタンパク質依存性の還元に依存している。反応による色の変化は、タンパク質濃度に正比例する。アッセイは、関連するプロトコルに従って、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して実行された。タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬ～１２５μｇ／ｍＬの標準シリーズは、２ｍｇ／ｍＬＢＳＡストック溶液から調製した。９６ウェル平底プレートに、１０μＬのＢＳＡ標準または１０μＬの希釈溶解物を提供し、それぞれの場合に重複した測定が行った。次に、ＢＣＡ試薬ＡおよびＢからなる２００μＬのＢＣＡ溶液を５０：１の比率で各ウェルに添加した。プレートをプレートシェーカーで３０秒間振とうした後、３７℃で３０分間インキュベートした。得られた色の変化は、５６２ｎｍの波長で光度計で測定した。標準シリーズの値を使用して検量線を作成し、その関数方程式から溶解物中のタンパク質濃度が計算できた。

７．ＳＤＳページとウエスタンブロット
タンパク質レベルでのｅＧＦＰノックインを検証するために、得られたタンパク質溶解物を使用してＳＤＳ－Ｐａｇｅを製造し、続いてウエスタンブロットを行った。

いずれの場合も、１５μｇの総タンパク質をＰＢＳで１０．８μＬに調整し、６μＬの２．８倍ＬＤＳローディングバッファーを添加した。次に、サンプルを９５℃で１０分間煮沸し、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。サンプルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｕＰＡＧＥ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルに適用し、２２０Ｖおよび１２０ｍＡで５０分間泳動した。ウェットブロットでは、タンパク質を３０Ｖ、２２０ｍＡで１時間ニトロセルロース膜にブロットする。タンパク質移動を成功させるためのコントロールとして、着色タンパク質標準を使用した。膜をシェーカー上の５％ブロック溶液中で室温で少なくとも２時間インキュベートして、タンパク質のエピトープをブロックし、その後の非特異的な抗体結合を減らした。一次抗体を５％ブロッキング溶液で希釈し、ロッキングシェーカー上で４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳＴで１５分間３回洗浄して、結合していない一次抗体を除去した。続いて、膜を、５％ブロック溶液で希釈した二次抗体とともに、シェーカー上で室温で２時間インキュベートした。この場合も、未結合の二次抗体を除去するために、ＴＢＴを１５分間３回洗浄する必要があった。ブロットを現像するために、ＲｏｃｈｅのＬｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用した。ルミノールエンハンサー溶液とペルオキシダーゼ溶液を同じ比率で混合し、膜に添加し、暗所で３分間インキュベートした。二次抗体は、ルミノールの酸化を触媒する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させた。得られた発光信号は、Ｌｕｍｉイメージャーで検出できる。露光時間はバンド強度によって異なる。現像後、膜をＲｅｓｔｏｒｅ ＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで室温で１５分間インキュベートし、結合した抗体を膜から除去した。次に、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、５％ブロック溶液とともに室温で少なくとも２時間再度インキュベートした。次に、膜を５０ｋＤａマーカーバンドのすぐ下で切断した。膜の上部を、５％ブロック溶液で希釈したα－ＧＦＰ ＨＲＰ結合抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。膜の下部を５％ブロック溶液に一晩保存し、翌日、α－β－アクチンＨＲＰ結合抗体とともに室温で１５分間インキュベートした。両方の膜部分をＴＢＳＴで１５分間３回洗浄した。これら２つの一次抗体はＨＲＰ結合しているため、前日と同様に二次抗体とさらにインキュベートすることなく膜を発色させることができる。

８．Ｏｐｅｒｅｔｔａシステムにおける共焦点顕微鏡分析
共焦点顕微鏡分析により、潜在的なクローンのチューブリン細胞骨格を調べた。実験は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによるＯｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで実行された。このシステムでは、多数のクローンを９６ウェルフォーマットで短時間で自動的にスクリーニングできる。Ｏｐｅｒｅｔｔａシステムでの分解のための内在性ｅＧＦＰ信号が非常に弱かったため、α－ＧＦＰ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗体を使用してシグナル増幅のために細胞を染色した。

スクリーニングのために、１．２×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。プレートは、底が透明な黒い平底プレートであり、自家蛍光が低いことに加えて、隣接するウェルへの迷光の侵入も防いだ。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで５分間固定した。使用したα－ＧＦＰ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体をヤギ血清希釈バッファー（ＧＳＤＢ）で１：１，０００に希釈し、最終濃度を１μｇ／ｍＬにした。バッファーは、とりわけＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含み、これは細胞膜の透過性をもたらし、したがって抗体の細胞への浸透を可能にする。暗所で室温で２時間インキュベートした後、抗体を細胞から除去した。細胞核を染色するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２をＰＢＳで１：１０，０００に希釈し、暗所で室温で１０分間インキュベートした。細胞から遊離抗体と未結合のヘキスト色素を除去するために、数回の洗浄を行った。最初に、高塩リン酸ナトリウムバッファーで５分間２回洗浄した。続いて、洗浄工程を低塩リン酸ナトリウム緩衝液で同様に繰り返し、細胞からの遊離抗体の輸送を促進した。Ｏｐｅｒｅｔｔａシステムでの蛍光イメージングでは、２００μＬのＰＢＳで洗浄した後に細胞をオーバーレイした。

Ｏｐｅｒｅｔｔａシステムで必要なすべての設定を最初に行う必要があった。目的とプレートの寸法形状のための一般的な設定の選択に加えて、これには、それぞれの露光時間とシャープニングレベルで必要な蛍光チャネルの選択も含まれていた。デバイスは、マークされた各ウェルで選択されたすべてのピクセルを実行し、チャネルごとに１枚の写真を個別に撮影した。これらは、関連するＨａｒｍｏｎｙ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで処理および評価された。

Claims (13)

1. マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を該標的タンパク質の内在性遺伝子座から発現する細胞を生成または提供するための方法であって、
   ａ）細胞に、
   ｉ）第１の選択試薬に対する耐性を付与する核酸を含む、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、
   ｉｉ）
   ａ）第２の選択試薬に対する耐性を付与する第１の核酸、および
   ｂ）該マーカータンパク質をコードする第２の核酸
   を含む環状ドナープラスミドであって、該細胞内の組込み部位に相同な核酸が該第２の核酸の３’側および５’側に隣接しており、該隣接する相同な核酸のうちの１つが該標的タンパク質の末端コード配列に相同である、環状ドナープラスミド、
   ｉｉｉ）ｃｒＲＮＡ、
   ならびに
   ｉｖ）ｔｒａｃｒＲＮＡ
   をトランスフェクトする工程と、
   ｂ）該第１および第２の選択試薬の存在下で該細胞を培養する工程と、
   ｃ）工程ｂ）の条件下で細胞分裂を行う細胞を選択し、それにより、マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を提供する工程と
   を含む、方法。
2. 工程ａ）の細胞が、すべてのプラスミドおよび核酸を同時にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｃ）において、細胞分裂を行いかつ前記融合タンパク質が検出された細胞が選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程ｂ）およびｃ）が、
   ｂ）１）前記第１の選択試薬のみ、または前記第２の選択試薬のみの存在下で前記細胞を培養する工程、
   ２）工程１）の条件下で細胞分裂を行う細胞を選択する工程、
   ３）工程２）で選択された細胞を、工程１）で使用しなかった選択試薬の存在下で培養する工程、
   ｃ）工程ｂ）３）の条件下で細胞分裂を行いかつ前記融合タンパク質が検出された細胞を選択し、それにより、マーカータンパク質と細胞内在性標的タンパク質との融合タンパク質を該標的タンパク質の内在性遺伝子座から発現する細胞を提供する工程
   である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記選択試薬が、ピューロマイシンおよびハイグロマイシンＢである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程ｂ）または工程ｂ）１）およびｂ）３）において、ハイグロマイシンＢの最終濃度が５０μｇ／ｍＬであり、ピューロマイシンの最終濃度が２μｇ／ｍＬである、請求項５に記載の方法。
7. 前記マーカータンパク質をコードする核酸の挿入可能部位が複数存在する場合、該マーカータンパク質をコードする核酸が、より多くのかつ／またはより特異的なｇＤＮＡ結合部位を含む部位に挿入される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. ｉ）前記マーカータンパク質が、前記標的タンパク質のＮ末端に挿入され、
   ｉｉ）該マーカータンパク質をコードする核酸が、前記融合タンパク質のｍＲＮＡにおいて、該標的タンパク質の最初のコドンの直前（３’側）になるように、前記内在性遺伝子座に挿入され、かつ
   ｉｉｉ）前記３’側に隣接する核酸が、該標的タンパク質をコードする核酸の開始コドンを含む、または／かつ前記５’側に隣接する核酸が、該標的タンパク質のＮ末端と相同である、
   請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記マーカータンパク質をコードする核酸が、開始コドンを含まない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記マーカータンパク質が、蛍光マーカータンパク質である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記蛍光マーカータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記３’側および５’側に隣接する相同な核酸が、約１０００ヌクレオチドのサイズを有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

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