JP2002503448A - 新規dnaクローニング方法 - Google Patents
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- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
Abstract
Description
子をクローニングするための新規な方法に関する。さらに、DNAクローニングに 好適な新規な試薬キットが提供される。
来DNA断片をin vitroで挿入するステップを含む。次に、生成した組換えベクタ ーを使用して細菌を形質転換する。こうしたクローニング方法は約20年間使用さ
れて成功しているが、これにはいくつかの欠点がある。これらの欠点として、特
に、ベクター中に外来DNAを挿入するために必要とされるin vitroステップが、 その外来DNA上またはベクター上で好適な制限部位が利用できない場合、非常に 複雑で時間がかかることが多い点である。
2つの制限を与えることになる。第1に、外来DNA断片はベクター中で通常1個 または複数のこうした制限部位の位置にしか挿入することができない。したがっ
て、クローニング産物は好適な制限部位の配置によって限定され、また好適な制
限部位がないベクターの領域中へのクローニングは困難であり、不正確なことが
多い。第2に、制限部位は典型的には長さが4から8塩基対であるので、使用す
るDNA分子のサイズが増加するにつれて、多大な倍数で出現する。これは、大部 分の現行のクローニング技術によって操作することができるDNA分子のサイズの 実用上の制限を意味している。特に、コスミド、BAC、PACおよびP1などのベクタ
ー中にクローン化された比較的大きなサイズのDNAを、制限酵素に基づく技術に よって直接操作するのは通常実現不能である。したがって、先行技術の欠点が少
なくとも部分的に除去された新しいクローニング方法を提供する必要性がある。
はファージP22組換え系などの機能的に関連する遺伝子の産物を発現する能力が ある細菌宿主細胞中で、2つのDNA分子間での効果的な相同組換え機構が使用可 能な頻度で生じることが発見された(Kolodnerら、Mol.Microbiol.11(1994)23-3
0;Fenton,A.C.and Poteete,A.R.,Virology 134(1984) 148-160;Poteete,A.R.a
nd Fenton,A.C.,Virology 134(1984) 161-167)。DNA断片のクローニングのこの
新規な方法を「ETクローニング」と命名する。
.Bacteriol.145(1981),521-532)およびHallら(J.Bacteriol.175(1993),277-28
7)が記載している。HallおよびKolodner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994),3
205-3209)は、RecTタンパク質によって推進される、線状2本鎖DNAおよび相同 性環状1本鎖DNAのin vitro相同的対形成および鎖交換を開示している。細胞中 でのDNA分子のクローニングのためのこの方法の使用に対する引用はその中に見 出だすことができない。
4),上記;Gillenら(1981),上記)。この経路は2つの遺伝子、recEおよびrecTの
発現を必要とする。これらの遺伝子のDNA配列は公開されている(Hallら、上記 )。RecEタンパク質はλエクソまたはλRedαなどのバクテリオファージタンパ ク質に類似している(Gillenら、J.Mol.Biol.113(1977),27-41;Little,J.Biol.
Chem.242(1967),679-686;Radding and Carter,J.Biol.Chem.246(1971),2513-25
18;Joseph and Kolodner,J.Biol.Chem.258(1983),10418-10424)。RecTタンパ ク質はλβタンパク質またはλRedβなどのバクテリオファージタンパク質に類 似している(Hallら、(1993),上記;Muniyappa and Radding,J.Biol.Chem.261(1
986),7472-7478;Kmiec and Hollomon,J.Biol.Chem.256(1981),12636-12639)。
上記の報文の内容を参照により、本明細書に組み入れる。
プラスミドベクター間の分子間相同組換えによる、大腸菌中のPCR産物のin vivo
クローニングについて記載している。原核生物中での相同組換えに基づく新規な
クローニング方法を開発するためのその他の従来の手法もまた、ベクターを線状
化するための制限酵素の使用(Bubeckら、Nucleic Acids Res.21(1993),3601-36
02;Olinerら、Nucleic Acids Res.21(1993),5192-5197;Degryse,Gene 170(199
6),45-50)または宿主特異的recA依存組換え系(Hamiltonら、J.Bacteriol.171(
1989),4617-4622;Yangら、Nature Biotech.15(1997),859-865;Dabert and Smi
th,Genetics 145(1997),877-889)に依拠していた。これらの方法は適用性が非 常に限定されており、実際上はほとんど使用されていない。
るin vitro処理を必要とせず、したがってDNAクローニングの標準的な方法論と は基本的に差異がある。この方法はrecEおよびrecT遺伝子産物、またはredαお よびredβ遺伝子産物、あるいは機能的に等価な遺伝子産物が関与する、大腸菌 中の相同組換えの経路に依拠している。この方法はクローン化しようとするDNA 断片である、好ましくは線状でかつ好ましくは染色体外DNA断片1個をエピソー ムまたは内在性宿主染色体若しくは染色体群のいずれかである第2の好ましくは
環状DNAベクター分子と共有結合させるものである。したがって、これは2つの 線状DNA断片または異なる組換え経路のいずれかの使用に依拠する相同組換えに よる大腸菌中のクローニングについての従来の記載とは差異がある。
を工学操作するための相同組換えを使用する、適応力がある方法を提供する。す
なわち、ターゲットの選択について、サイズまたは部位のいずれについても現実
的に制限がない。したがって、高コピープラスミドからゲノムまで、宿主細胞中
のどんなレシピエントDNAでも正確な変更を受けやすい。大きなDNA分子の工学操
作の他に、本発明はDNA設計のための新規な、制限酵素に依存しない手法を大要 とする。例えば、オリゴヌクレオチドの相同なアームを選択することによって、
ターゲットエピソーム中の任意の2つの選択された塩基対間の欠失させることが
できる。同様に、選択されたDNA配列を選択された塩基対の位置に挿入して、例 えば変更したタンパク質リーディングフレームを作製することができる。挿入お
よび欠失の協奏的組合せならびにポイント突然変異もまた可能である。これらの
戦略の適用は複雑で困難なDNAの構築、例えば真核細胞、例えばマウス胚性幹細 胞中の相同組換えを意図する場合に特に適切である。さらに、本発明は所望のタ
ーゲット部位に正確に部位特異的組換え位置を定める簡単な方法を提供する。こ
れは植物およびマウスなどのその他の生体系中の部位特異的組換えへの適用を単
純化することとなる。
し、b)該宿主細胞中で複製され得る第1DNA分子と、第1DNA分子上の領域と配
列相同な領域を少なくとも2個含む第2DNA分子とを、該第1および第2DNA分子
間の相同組換えに好適な条件下で接触させ、そしてc)該第1および第2DNA分 子間の相同組換えが生じた宿主細胞を選択する、ステップを含む、細胞中でのDN
A分子のクローニング方法である。
recEおよびrecT遺伝子、またはファージλredαおよびredβ遺伝子などの機能的
に関連する遺伝子の遺伝子産物によって仲介される。
細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞はSalmonella、KlebsiellaまたはEsch
erichiaなどの腸内細菌細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞で ある。しかし、本発明のクローニング方法は菌類、植物または動物細胞などの真
核細胞についても好適であることに留意すべきである。
物が発現される再菌株などのあらゆる細胞とすることができる。宿主細胞はrecE
およびrecT遺伝子をその宿主細胞の染色体上、または非染色体DNA、好ましくは ベクター、例えばプラスミド上に位置させて含むことができる。好ましい事例に
おいて、RecEおよびRecT、またはRedαおよびRedβ遺伝子産物は2つの別の調節
性プロモーター、アラビノース誘導性BADプロモーター若しくはlacプロモーター
など、または非調節性プロモーターから発現される。あるいは、recEおよびrecT
、またはredαおよびredβ遺伝子は1個の調節性または非調節性プロモーターか
らのポリシストロン性mRNA上で発現される。好ましくは、その発現は調節性プロ
モーターによって制御される。
誘発され、その他の時点では可能な所望しない組換え反応が制限される。他方に
おいて、recTまたはredβ遺伝子はrecEまたはredαに対して過剰発現されるのが
好ましい。これは強力な構成性プロモーター、例えばEM7プロモーターの使用、 および/またはrecE若しくはredα遺伝子よりも高コピー数のrecT若しくはredβ
の使用によって達成することができる。
ンスフェクトした細胞109中で1個よりも多い細胞中に組換え産物をもたらすの
に十分な効力を持つ限り、どんなrecEおよびrecT遺伝子でも適している。recEお
よびrecT遺伝子はあらゆる細菌株またはバクテリオファージから誘導することが
でき、あるいはそれらの突然変異体または変異型でもよい。好ましいのは大腸菌
または大腸菌バクテリオファージから誘導されるrecEおよびrecT遺伝子であり、
ラムダ型ファージ、例えばバクテリオファージλからのredαおよびredβ遺伝子
などである。
列、ならびに/または (d)(a)、(b)および/若しくは(c)からの核酸配列とストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸配列。
列、ならびに/または (d)(a)、(b)および/若しくは(c)からの核酸配列とストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸配列。
異体および変異型、または遺伝子工学操作によって取得される突然変異体および
変異型をも包含することに留意すべきである。さらに、図7Bに示すrecE遺伝子
は天然タンパク質のアミノ酸位置588-866をコードする、すでに切断された遺伝 子であることに留意すべきである。突然変異体および変異型は、好ましくは図7
Bおよび13Bに示すrecEおよびrecT配列、ならびに図14Bに示すredαおよ びredβ配列に少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは 少なくとも80%の核酸配列相同性を有する。
しくは下記のSambrookら(1989)にしたがって定義されるもので、0.1xSSC、0.
5%SDS中、55℃、好ましくは62℃、そしてさらに好ましくは68℃で30分の洗浄後
、検出し得るハイブリダイゼーションシグナルを含む。
される。特に、sbcA突然変異を保有する株が好適である。こうした菌株の例はJC
8679およびJC9604である(Gillenら(1981)、上記)。あるいは、相当する遺伝子
をラムダ型ファージまたはファージP22などのその他のコリファージから取得し てもよい。
679は以下の突然変異を含む:recBC21,recC22,sbcA23,thr-1,ara-14,leuB6,DE(g
pt-proA)62,lacY1,tsx-33,gluV44(AS),galK2(Oc),LAM-,his-60,relA1,rpsL31(st
rR),xylA5,mtl-1,argE3(Oc)およびthi-1。JC9604は同一の突然変異およびさらに
突然変異recA56を含む。
例えばドナー細菌細胞から単離して、第2の受容体源、例えば受容体細菌若しく
は真核細胞中に形質転換し、そこで組換えDNA手法によって発現させることがで きることも留意すべきである。
株、例えば上記の大腸菌株JC8679およびJC9604の1つである。しかし、本発明の
方法はsbcA突然変異を有する宿主細胞または類似の細胞に限定されるものではな
い。驚くべきことに、本発明のクローニング方法がsbcA突然変異を持たないrecB
C+またはrecBC-細胞中、例えば大腸菌recBC+細胞などの原核recBC+宿主細胞中で
も機能することが発見された。この事例において、好ましくはその中でrecBC型 エキソヌクレアーゼインヒビター遺伝子の産物が発現する宿主細胞を使用する。
好ましくは、そのエキソヌクレアーゼインヒビターは宿主のrecBCシステムまた はその等価物を阻害する能力があるものである。こうしたエキソヌクレアーゼイ
ンヒビター遺伝子の好適な例はλredγ遺伝子(Murphy,J.Bacteriol.173(1991),
5808-5821)およびそれぞれその機能的等価物、例えばファージP22(Murphy,J.B
iol.Chem.269(1994),22507-22516)などの別のコリファージから取得することが
できるものである。
む核酸分子から選択される: (a)図14Aに記載の位置3588(ATG)から4002(GTA)までの核酸配列、 (b)遺伝コードの縮重範囲内にある、同一のポリペプチドをコードする核酸配
列、ならびに/または (d)(a)および/若しくは(b)からの核酸配列と(上記の定義の)ストリ
ンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列。
ター遺伝子の発現の結果、クローニング効率が顕著に改善することが発見された
。
えを利用する。第1DNA分子は宿主細胞中で機能し得る複製起点、例えば大腸菌 複製起点を保有するあらゆるDNA分子が可能である。さらに、第1DNA分子は宿主
細胞中で複製される得る形態で存在する。この第1DNA分子、すなわちベクター はその宿主細胞中で機能し得る複製起点を含有するあらゆる染色体外DNA分子が 可能であり、例えば単一の、低、中若しくは高コピープラスミドを含むプラスミ
ド、またはコスミド、P1、BAC若しくはPACベクター技術を基礎とするその他の染
色体外環状DNA分子である。こうしたベクターの例は例えばSambrook ら(Molecu
lar Cloning,Laboratory Manual,2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Labor
atory Press)およびLoannouら(Nature Genet.6(1994),84-89)またはそれらの
中に引用された参照中に記載されている。第1DNA分子は宿主細胞染色体、特に 大腸菌染色体でも可能である。好ましくは、第1DNA分子は2本鎖DNA分子である
。
域はそれぞれ好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくと
も20ヌクレオチド、最も好ましくはそれぞれ少なくとも30ヌクレオチドである。
長さが約40またはそれ以上、例えば60またはそれ以上のヌクレオチドの配列相同
領域を使用した場合、特に良好な結果が得られた。2つの配列相同領域は線状DN
A分子上に1つが一方の末端、そしてもう1つが他方の末端になるように配置す ることができるが、内部に配置することもできる。好ましくは、第2DNA分子も 2本鎖DNA分子である。
ている限り、配列相同領域が非同一配列領域によって遮断されていてもよい。タ
ーゲット部位に対して非相同配列領域を有する配列相同アームを使用することに
よって、置換、例えばポイント突然変異、挿入および/または欠失などの突然変
異をETクローニングによってターゲット部位に導入することができる。
合成してもよい。この場合、増幅のためのプライマーとして作用する3'末端の配
列の他に、増幅を開始させるために使用するDNAオリゴヌクレオチドの両方が2 つの相同領域の一方または他方を含有する。この設計のオリゴヌクレオチドを使
用する場合、DNA増幅産物は増幅に好適な任意のDNA配列が可能であり、この他に
各末端に配列相同領域の1つを有することになる。
形として、PCRプライマー配列および配列相同領域の他に別の配列を含むオリゴ ヌクレオチドの使用を含む。また別の単純な変法は増幅産物を作製するための増
幅プライマーの3以上の使用である。また別の単純な変法は増幅産物を作製する
ための増幅反応の2以上の使用である。さらに別の変法はPCR以外の方法によっ て、例えばエンドヌクレアーゼまたは制限酵素切断によって任意のDNA起源から の断片を線状化して取得されるDNA断片の使用である。
きである。異種集団の第2DNA分子の使用、例えばゲノムなどのDNAライブラリー
またはcDNAライブラリーの作製ももちろん可能である。
本発明の1実施形態において、あらかじめ第1ベクターDNA分子を保有させてあ る細菌株中に第2DNA断片を形質転換させる。別の実施形態において、第2DNA分
子および第1DNA分子を細菌宿主中に同時形質転換する前に in vitroで混合する
。本発明のこの2つの実施形態を図1に図式的に示す。その形質転換の方法は当
技術分野で知られている任意の方法とすることができる(例えばSambrookら、上
記)。しかし、好ましい形質転換または同時形質転換の方法はエレクトロポレー
ション法である。
相同組換えが生じた宿主細胞を選択する。この選択操作はいくつかの異なる方法
で実施することができる。次の3つの好ましい選択方法を図2に示し、以下に詳
細に記載する。
めの遺伝子を保有する第2DNA断片を利用し、そのマーカー遺伝子の発現によっ て相同組換えを検出可能にする。マーカー遺伝子は宿主中または第1DNA分子か ら発現されない表現型マーカーのための遺伝子とすることができる。ETクローニ
ングによる組換えに際し、第2DNA断片の確実な獲得によって与えられる宿主株 の表現型における変化からETクローニング産物を同定する。
子、特にカナマイシン、アンピリシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリ
ン、または使用する細菌株に対して殺菌または静菌効果を示すあらゆるその他の
物質に耐性を与える遺伝子である。
用である。例えば、宿主株がある代謝補充物がないと増殖できないように突然変
異させる。この補充物が存在しないとき、第2DNA断片上の1遺伝子が突然変異 による欠損を補足して増殖を可能にする。ETクローニングステップの結果、この
目的のDNA再編成を有するエピソームを含有する細胞のみが増殖することになる 。
切断する停止コドンとなるように突然変異させた表現型マーカー遺伝子を保有す
る。この表現型マーカー遺伝子からの全長タンパク質の発現には、発現されると
その停止コドンを認識して全オープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
、サプレッサーtRNA遺伝子の導入を必要とする。ETクローニングステップによっ
てこのサプレッサーtRNA遺伝子が導入され、その表現型マーカー遺伝子の発現に
ついての選択または同定によって、成功した組換え体を同定する。これらの場合
、ETクローニングステップの結果、この目的のDNA再編成を有する細胞のみが増 殖することになる。
与えるリポーター遺伝子の使用である。好ましい1事例において、緑色蛍光タン
パク質(GFP)を使用して、GFPの蛍光放出によってETクローニング産物を保有す
るコロニーを同定することができる。別の好ましい事例において、lacZ遺伝子を
使用して、培地にX-galを添加したときのコロニーの青色の発色によってETクロ ーニング産物を保有するコロニーを同定することができる。
への挿入が第1DNA分子上に存在するマーカーの発現を変更する。この実施形態 において、第1DNA分子は配列相同な2つの領域の間に少なくとも1個のマーカ ー遺伝子を含有し、変更された発現、例えばそのマーカー遺伝子の発現の欠如に
よって相同組換えを検出することができる。
場合、第2DNA断片による形質転換または第2DNA断片および第1DNA分子の同時 形質転換後、ETクローニングによって改変されなかった第1DNA分子を保有する 細菌細胞を培地上に接種したとき、対抗選択性マーカーの発現が宿主に対して毒
性または静菌性効果をもたらす。ETクローニングステップの結果、この目的のDN
A再編成を有する第1DNA分子を含有する細菌細胞のみが増殖することになる。
て、第1DNA分子上に緑色蛍光タンパク質(GFP)を存在させて、GFPの蛍光放出 の差異によって、ETクローニング産物を持つかまたは持たない第1DNA分子を保 有するコロニーを識別することができる。別の好ましい事例において、lacZ遺伝
子を第1DNA分子上に存在させて、培地にX-galを添加したときの青色または白色
といったコロニーの色によってETクローニング産物を持つかまたは持たない第1
DNA分子を保有するコロニーを識別することができる。
組み込みにより、部位特異的なリコンビナーゼに対する標的部位が取り除かれる
。本明細書中では該標的部位をRT(リコンビナーゼの標的の意)と言い、該部位
は配列が相同的な二つの領域間の第1DNA分子上に存在する。相同組換え事象は 、標的部位の除去によって検出され得る。
よる使用のために利用できる。このRTが存在するかしないかの差はETクローニン
グ産物の選択における基盤となる。このRTおよび対応する部位特異的リコンビナ
ーゼの存在下では、部位特異的リコンビナーゼはこのRTにおける組換えを媒介し
て宿主の表現型を変化させ、容易に観察できる表現型が増殖または存在できない
ようにする。このRTの非存在下では、対応する部位特異的リコンビナーゼは組換
えを媒介できない。
含む。そのうちの1つは抗生物質耐性遺伝子に隣接するがその一部ではない。第
2DNA断片は、このRTを取り除くように設計される。対応する部位特異的リコン ビナーゼにさらされると、ETクローニング産物を担持しない第1DNA分子は、抗 生物質耐性遺伝子を取り除くRT間での部位特異的組換え反応を受ける。そのため
第1DNA分子は、対応する抗生物質に対する耐性を伝達できない。ETクローニン グ産物を含む第1DNA分子、または他の原因で部位特異的組換えを受けなかった 第1DNA分子のみが、抗生物質耐性を伝達する。
しい事例では、第2DNA断片のETクローニングによって取り除かれるRTは、コロ ニーの色または形態における容易に検出可能な程度の変化を伝達するレポーター
遺伝子に隣接する。
この場合、宿主ゲノムは第2のRTを担持しており、そのRTは対応する部位特異的
リコンビナーゼが宿主ゲノム中に位置するRTにそのRTを介してエピソームを組み
込み得るような突然変異を受けたRTであってもそうでなくてもよい。その他の好
ましいRTとして、リゾルベース/トランスポザーゼ・クラスの部位特異的リコン ビナーゼに対するRTが挙げられる。RTには、部位特異的組換えの従来の実施例に
記載されたもの、それらの天然のまたは突然変異を受けた変種も含む。
クラスのいかなる部位特異的リコンビナーゼをも含む。その他の好ましい部位特
異的リコンビナーゼには、リゾルベース/トランスポザーゼ・クラスの部位特異 的リコンビナーゼがある。
方法では、部位特異的リコンビナーゼの発現を、ETクローニング効率の最適化に
従って発現が誘導および停止されるように調節する。この場合、部位特異的リコ
ンビナーゼ遺伝子を、宿主ゲノムに組み込むかまたはエピソーム上に担持させて
もよい。別の好ましい事例では、宿主細胞から除去されるように部位特異的リコ
ンビナーゼを条件的複製起点を持つエピソームから発現させる。
。特に好ましい事例は、上記の第1の選択方法の2工程に続いて第2の選択方法
を使用するものである。この組合せの使用においては最も簡単なことだが、クロ
ーニングされるDNA断片が、表現型変化の獲得によって正確なETクローニング産 物を第1工程において同定できるような遺伝子または遺伝子群を含む必要がある
。第2工程では、第2周期のETクローニング産物が同定可能なように、第1工程
で導入された遺伝子また遺伝子群の発現を変化させる。好ましい実施例では、使
用する遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子であり、第1工程のETクローニング
産物はテトラサイクリン耐性の獲得によって同定される。第2工程では、テトラ
サイクリン遺伝子発現の減失は、塩化ニッケル、フザリン酸またはテトラサイク
リン遺伝子が発現したときに宿主細胞に対して毒性を有する他のあらゆる薬剤に
対する感応性の減失によって同定される。この2工程の工程は、第1に宿主の表
現型変化をもたらす遺伝子の組み込みにより、第2に関連する表現型の変化の減
失により、もっとも単純には第1工程で組み込まれたいくつかのDNA配列の除去 により、ETクローニング産物の同定を可能にする。この方法によって、ETクロー
ニング産物の同定のために使用する遺伝子は挿入され、続いて取り除かれ、これ
らの遺伝子を含まないETクローニング産物が残る。
え法に用いてもよい。すなわちa)RecEおよびRecTまたはRedαおよびRedβタン
パク質の供給源の提供、b)適当な宿主細胞中で複製され得る第1DNA分子と該 第1DNA分子上の領域と配列相同性を持つ領域を少なくとも二つ含む第2DNA分子
との、該第1および第2DNA分子間の相同組換えに好ましい条件下での接触、そ してc)該第1および第2DNA分子間で相同組換えがなされたDNA分子の選択、で
ある。
または部分的に精製されたRecEおよびRecTもしくはRedαおよびRedβタンパク質
、またはRecEおよびRecTもしくはRedαおよびRedβタンパク質を含む細胞抽出物
のいずれかでよい。
換え事象に必要な他の成分を含む細胞抽出物を提供するときである。しかしなが
ら相同組換えはin vivoでも起こり得る。例えば、RecEおよびRecTもしくはRedα
およびRedβタンパク質、または抽出物を宿主細胞(recET陽性であってもなくて
もよく、またredαβ陽性であってもなくてもよい)中に導入し、宿主細胞中のD
NA分子に接触させることによる。組換えがin vitroで生じるとき、DNA分子の選 択は、組換え混合物を適した宿主細胞中に形質転換し、陽性クローンを前記のよ
うに選択することにより達成される。組換えがin vivoで生じるとき、上記選択 法を直接利用できる。
して、細胞、好ましくは細菌細胞、最も好ましくはrecEおよびrecTまたはredα およびredβ遺伝子を発現し得る大腸菌細胞の使用である。
えばλredγ遺伝子などへのエキソヌクレアーゼ阻害遺伝子をも発現し得る。該 ベクター系は少なくとも一つのベクターを含みうる。recEおよびrecTまたはred αおよびredβ遺伝子は、好ましくは単一ベクター上に位置し、より好ましくは 両方の遺伝子と同一であり得る調節可能なプロモーター、またはそれぞれの遺伝
子に対する単一のプロモーターの制御下にある。特に好ましいのは、recEまたは
redα遺伝子に対してrecTまたはredβ遺伝子を過剰に発現し得るベクター系であ
る。
RecEおよびRecTまたはRedαおよびRedβタンパク質の供給源の使用である。
態でも存在し得る。
の部位特異的リコンビナーゼ標的部位を有するときに、宿主細胞中で部位特異的
リコンビナーゼを発現する手段を含むことが好ましい。さらに、試薬キットはET
クローニングに使用する線状DNA断片の供給源としての使用に適したDNA分子を含
んでいても良い。好ましくは、該DNA分子は、線状断片のPCR増殖のための鋳型と
して、また制限酵素分解により線状DNA断片を放出する特別に設計されたDNAベク
ターとして、また陽性対照またはその他の役割で使用するためにキット中に含ま
れる調製された線状断片として提供される。さらに試薬キットは、前記ベクター
に相同的な領域を含む核酸増幅プライマーを含んでいてもよい。好ましくは、こ
の相同的な領域は核酸増幅プライマーの5'末端に位置する。
ncated)recE遺伝子(t-recE)の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
酸配列およびアミノ酸配列を示す。
鎖上に存在するaraC遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
3403〜3819)をコードする領域と同様に、プラスミドpBAD-αβγ(図14)の核酸
配列を示す。
それぞれ示す。redγ配列はpBAD-ETγ(図13)およびpBAD-αβγ(図14)のそれ ぞれに存在する。
伝子が、オリゴペアであるa/bとc/dを用いて増幅された。pMAK705(Hashimoto-Go
toh and Sekiguchi, J.Bacteriol.131(1977), 405-412)由来のクロラムフェニコ
ール(cm)耐性遺伝子が、プライマーペアであるe/fとn/pを用いて増幅された。FR
TまたはloxP部位にはさまれたTn5-新遺伝子はpKaZまたはpKaX(http://www.embl-
heidelberg.de/ExternalInfo/stewart)からオリゴペアi/h, g/h,およびj/kを用 いて増幅されたものである。pIB279(Blomfield et al., Mol.Microbiol.5(1991)
,1447-1457)由来のsacB-neoカセットはオリゴペアl/mを用いて増幅された。pSVp
aZ11(Buchholz et al., Nucleic Acids Res.24(1996), 4234-4262)由来のlacZ遺
伝子断片はオリゴペアl*/m*を用いて増幅された。PCR産物は、QIAGEN PCR Purif
ication Kitを用いて精製し、H2O2にて溶出した後に、Dpn Iにより残りの鋳型DN
Aをすべて消化した。消化後、PCR産物をフェノール:CHCl3により一度抽出し、 そしてエタノール沈殿後、H2O中に約0.5μg/μlの濃度で再懸濁した。
まで増殖させ、氷中で15分間冷却した。細菌細胞を0℃、7000rpmで10分間遠心 した。ペレットを氷冷10%グリセロール中に再懸濁し、再度遠心した(7000rpm 、-5℃で10分)。この操作をさらに2回繰り返し、細胞ペレットを等量の氷冷1
0%グリセロールに懸濁した。50μlのアリコートを液体窒素中で冷凍し、-80℃で
保存した。細胞を氷上で解凍し、1μlDNA溶液(同時形質転換のために、0.3μg のプラスミドと0.2μgのPCR産物;または形質転換のために、0.2μgのPCR産物を
含む)を添加した。エレクトロポレーションは、氷冷したキュベットとBio-Rad
Gene Pulserを200オームに設定したPulse Controllerとともに25μFD、2.3kVの 設定で用いて行った。エレクトロポレーションののち、LB培地(1ml)を添加した
。細胞を37℃にて1時間振とうしながらインキュベートし、抗生物質プレート上
に塗布した。
うしながら4時間インキュベートし、回収の3, 2, 1, または1/2時間前に0.1%L-
アラビノースを添加し、続いて前述のように処理した。回収の直前に、100μlを
採取し、10%SDS-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。回収の90分前に、Hox
a-P1とpBAD-ETγを保有する大腸菌NS3145を0.1%L-アラビノースにより誘導した 。
る705-Creおよび705-FLP(Buchholz et al, Nucleic Acids Res. 24(1996), 3118
-3119)を、塩化ルビジウムコンピテント細菌細胞中に形質転換した。細胞を、25
μg/mlクロラムフェニコールプレート上に塗布し、30℃で2日間増殖させた。そ
こから、コロニーを採り、抗生物質を含まないL-アガープレートに再度塗布し、
40℃で一晩インキュベートした。単一コロニーについて、さまざまな抗生物質プ
レート上で分析したところ、そのすべてが期待どおりクロラムフェニコールおよ
びカナマイシン耐性を欠失していた。
)により同時形質転換した。100μg/mlアンピシリン、50μg/mlカナマイシンプ レート上で選択した後、pSVpaX-sacB-neoプラスミドを単離し、pSVpaX1からプラ
イマーl*/m*を用いて増幅されたPCR断片とともに、新鮮なJC9604lacZ細胞に同時
形質転換した。オリゴm*はBamH1部位を生じるサイレントな点突然変異を保持し ていた。細胞を、7%スクロース、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-galを含
むプレート上に塗布し、28℃で2日間インキュベートした。スクロースプレート
上で増殖させた青色コロニーと白色コロニーを計数し、さらに制限酵素による分
析を行った。
, lacZ遺伝子(pSVpaX1由来のEcoR1およびBamH1断片)、cm遺伝子(pMAK705由来の
BstB1断片)およびP1ベクター断片(P1ベクター由来の2.2kb EcoR1断片)より単
離された断片のランダムなプライミングにより作製した。
PCR増幅に用いられたオリゴヌクレオチドは、5'末端にプラスミド中の選択した 領域と相同の42ヌクレオチドを、3'末端にPCRプライマーとして提供するための1
8ヌクレオチドを有する60量体であった。直鎖DNAおよび環状DNAは等モルの比で 混合し、さまざまな大腸菌宿主に同時形質転換した。相同組換えはsbcA大腸菌宿
主のなかでのみ検出された。アンピシリン/カナマイシン両耐性のコロニー(図3
b)の95%以上が期待された相同組換えプラスミドを含んでいることが、制限酵素 消化と塩基配列決定によって示された。neo遺伝子のゲノムへの組み込みによる 、カナマイシン耐性の低いバックグラウンドのみがみられた(結果示さず)。
長さと組換え効率の関係は単純であり、長さが長いほど効率が良かった(図3c) 。効率は、試した範囲内で、60bpまで増加した。レシピエント側のプラスミド中
の二つの選択された相同部位間の距離の効率を調べた(図3d)。同一の左相同的 アームをさまざまな右相同的アームと組ませることで8つのPCR断片のセットを 作製した。右相同的アームは、プラスミド塩基配列から、左から0-3100bpとなる
ように選択した。挿入産物(0)はほとんど有効でないが、あとはすべてのケース から、4倍未満の差異はあるものの、正しい産物が容易に得られた。相同的アー
ムが片方しかないPCR断片は反応しないので、正しい産物をえるには相同的アー ムの両方が存在することも必要であった。
欠損した大腸菌株の一覧を利用してさらに系統的に調べた(表2)。
必要ではなかった。sbcA株では、RecEとRecTの発現は活性化されている。JC867
9とJC8691の比較から、recEへの依存性が推論される。特筆すべきことに、JC938
7中では組換え産物が見出されず、これは、sbcBCバックグラウンドでは、50ヌク
レオチドの相同的アームに基づく相同組換えを起こすには至らないことを示唆す
る。
Eの最初の588アミノ酸は無くてもよいので、recE遺伝子のN末端を切断した。rec
BC株、JC5547をpBAD24-recETで形質転換し、コンピテント細胞の回収の前に、培
地に、種々の時点でアラビノースを加えてRecE/RecTの誘導を経時的に行った。 回収されたコンピテント細胞のバッチは、ゲル電気泳動によりタンパク質発現に
ついて評価し(図6c)、直鎖DNA断片と内因性pBAD24-recETプラスミドとの間 の組換えについて評価した。RecE/RecT発現の増加に従って組換えも増加したが 、RecE/RecTの誘導がなければ、組換え産物は見出されなかった。この実験はま た、直鎖DNAおよび環状DNAの同時形質転換は必ずしも必要でなく、環状のレシピ
エントは宿主中に内在するものでもよいことを示した。図3、6および表2に示
された結果から我々はRecEおよびRecTがrecBC大腸菌において、とても有用な相 同組換え反応を、有用な頻度で仲介するとの結論を導いた。RecEとRecTが含まれ
るので、我々は、この直鎖DNAおよび環状DNAの組換え法を"ETクローニング”と 呼ぶ。
もつ大腸菌株(JC9604)に導入し、2周期の”ETクローニング”に供した。第一周
期では、P1ベクター上のTn903カナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝 子に置き換えた(図4)。第2周期では、Hoxa3とa4遺伝子間を標的とし、これ は、Hoxa3の近位配列プロモーターの上流の2塩基対間にneo遺伝子を挿入するか
、Hoxa3とa4遺伝子の間の6203bpを削除することによって行った(図8a)。挿入 および削除を行ったETクローニング産物は容易に得られ(図8b, レーン2, 3およ
び5)、2周期のETクローニングが、この大型大腸菌エピソームにおいて、明瞭 な予想外の組換えを起こすことなく、正確に行われたことを示した。
の比がβ-ガラクトシダーゼ発現を評価することにより決定できるように、JC960
4のβガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を選択した。標準的条件(0.2μg PCR断片 ;50μlコンンピテント細胞)で、24個の1次コロニーができ、β-ガラクトシダ
ーゼ発現(図9b)とDNA分析(図9c, レーン3-6)によりそのうちの20個が正しか
った。
ないという点で、制約がある。この制約を取り除くためのさらなる組換え工程を
利用する2つの異なる方法を開発した。第一の方法では、FlpまたはCreリコンビ
ナーゼにより仲介される、部位特異的組換えを採用した。図8および9の実験で
、Flp組換え標的部位(FRT)またはCre組換え標的部位(loxP)が、直鎖基質中のneo
遺伝子をはさむように包含された。FRTまたはloxP間の組換えは、部位特異的組 換えののち、温度を変えることでプラスミドの単純な消去ができるように、pSC1
01温度感受性複製起点(Hashimoto-Gotoh and Sekiguchi, J.Bacteriol.131(1977
), 405-412)をもつプラスドにより発現される、FlpまたはCreを用いてなされた 。ETおよびFlp組換えののち、正しく組み換えられたHoxa P1ベクターを、他の組
換え産物の出現をみずに回収した(図8, レーン4および6)。同様に、Creリコ
ンビナーゼも標的となったlacZ対立遺伝子(図9、レーン7〜10)を正しく組
換えた。このように部位特異的組換えは、容易にETクローニングと組み合わせる
ことができ、これにより、操作上の一連の過程を省略することができ、またDNA 操作の点において、34bpの部位特異的組換え標的部位を残すことが可能である。
選択マーカー遺伝子を除去する第2の方法では、いかなる操作上の過程をも経て
いないDNA産物を残すために、ポジティブおよび対抗選択の過程組み合わせた2 周期のETクローニングを用いた。
突然変異などの小規模の突然変異を促進するかどうかを、β-ガラクトシダーゼ 活性にもとづく機能テストによって評価できるように設計した。第1の周期で、
pSVpaX1のlacZ遺伝子は、neoおよびB. subtilis sacB(Blomfieldら, Mol. Micr
obiol. 5 (1991), 1447-1457)遺伝子を含む3.3kbのPCR断片により分断されたこ とが、カナマイシン耐性に対する選択によって確かめられた(図10a)。他のポ ジティブに選択された組換え産物に対して上に記載したように、現実に、選択さ
れたコロニーはすべて白色であって(図10b)、LacZの分断に成功していること を示しており、DNA分析によって、17個中17個が正しい組換え体であることが確 かめられた。第2周期ではlacZを修復するように設計された1.5kb PCR断片がsac
B遺伝子に対する対抗選択により導入された。lacZの修復はBamH1制限部位を生じ
るサイレントな点突然変異を含んでいた。スクロース耐性コロニーのうち約4分
の1がβ-ガラクトシダーゼを発現し、分析された(17個中17個;図10c)すべて
がBamH1点突然変異とともに、修復されたlacZ遺伝子を保有していた。スクロー ス耐性コロニーの残りの4分の3はβ-ガラクトシダーゼ発現せず、分析された すべて(17個中17個;図10c)がさまざまな大規模な突然変異を起こしていて、 そのうちには、ETクローニング産物に類似のものはみられなかった。このように
2周期の、lacZ遺伝子を標的とするETクローニングにおいて、小規模の突然変異
によるβ-ガラクトシダーゼ活性の阻害はみられず、RecE/RecT 組換えが高度な 正確さをもって進行することが示唆された。対抗選択の工程でみられた不正確な
産物の有意な存在は、対抗選択遺伝子の発現を阻止するいかなる突然変異をも選
択されてしまうことによる、対抗選択の利用に随伴する限界であるといえる。周
知の通り、すべての不正確な産物は広範囲の突然変異によるものであるから、正
確なET産物とはDNA解析により容易に区別できた。またべつの実験で(図5)我 々は、ccdB遺伝子に対する対抗選択による、pZero2.1(In Vitro Gen)へのETクロ
ーニングにより、バックグラウンドの少ない不正確な産物(8%)が得られるこ
とを観察しており、これはETクローニング効率に影響するものとは異なる要因に
より、対抗選択のバックグラウンドがばらつくことを示唆していた。
cs 78(1974), 259-271)、recBC大腸菌宿主中で行った。しかしながら、多くの有
用な大腸菌株はP1, BAC,またはPACエピソームの増殖に通常使用される株も含め たrecBC+である。recBC+株へのETクローニングの転用を行うために、我々は、pB
AD-ETγおよびpBAD-αβγを開発した(図13, 14)。これらのプラスミドはETク
ローニングの可動性に重要な3つの特徴を有する。第一は、RecBCが大腸菌の主 要なエクソヌクレアーゼであり、導入された直鎖状の断片を分解する。それゆえ
にRecBC阻害剤のRedγ(Murphy, J.Bacteriol. 173(1991), 5808-5821)を保有さ せた。第2に誘導可能なプロモーターのもとにrecEまたはredαを配置すること で、RecE/RecTまたはRedα/Redβの組換え能力を制御した。その結果、必要なと
きに、ETクローニングを誘導でき、他のときには、望まない組換え現象は制限さ
れる。第3にrecEまたはRedαではみられないが、RecTまたはRedβが過剰に発現
されるときに、ETクローニング効率が上昇することを観察した。それゆえに我々
はrecTまたはredβを強力な構成要素であるEM7プロモーターの下流に配置した。
換した(図11a)。P1ベクター主鎖中の領域はnおよびp相同的アームにはさまれた クロラムフェニコール耐性遺伝子(cm)のPCR増幅標的とされた。ポジティブに選 択されたETクローニング反応について上述したように、ほとんど(>90%)のク
ロラムフェニコール耐性コロニーが正確であった。周知のように、形質転換され
た直鎖状のDNAに関しては、sbcA宿主JC9604中の同じエピソームを標的とする類 似の単純な実験に比べた場合、pBAD-ETγを利用したETクローニング全体の効率 は、3倍近く上昇した。これは、RecTの過剰発現によりETクローニング効率が上
昇するという我々の観察と一致する。
よびpBAD-αβγから発現されたRedα/Redβに仲介されたETクローニング効率を
比較した(図12)。pBAD-ETγまたはpBAD-αβγによる大腸菌DK1の形質転換 ののち、図6a, c,に示したと同様、pBADベクターのbla遺伝子をクロラムフェニ コール遺伝子と入れ替えるための実験を行った。pBAD-ETγまたはpBAD-αβγは
いずれも、RecEおよびRedαのアラビノースによる誘導に対する反応、および目 的とされた多くの事象に関して、同様のETクローニング効率を示した。
る線状DNA断片を、レシピエントエピソーム中の配列およびPCR反応のプライミン
グのための配列、にマッチする(match)ように選んだ左の相同的アーム、ならび にレシピエントエピソーム中の別の配列およびPCR反応のプライミングのための 配列にマッチするように選択した右の相同的アームを含むオリゴムクレオチドプ
ライマーを用いるPCRで合成する。PCR反応の産物は、本明細書中では選択マーカ
ー遺伝子(sm1)であるが、結果として左右の相同的アームに隣接し、同時形質転 換の前にin vitroでエピソームと混合し得る。また、標的エピソームを持ってい
る宿主細胞中に形質転換し得る。宿主細胞はrecEおよびrecT遺伝子の産物を含む
。ETクローニング産物はレシピエントエピソーム上の2つの選択マーカーsm1お よびsm2の組み合わせによって同定する。
ングによる、宿主に表現型の違いをもたらす遺伝子の獲得を示す。該遺伝子は、
ここでは選択マーカー遺伝子(sm)である。2つ目は(図の中央)、ETクローニ
ングによる宿主に表現型の違いをもたらす遺伝子の欠失を示す。該遺伝子はここ
では、対抗選択マーカー遺伝子(counter-sm)である。3つ目はETクローニングに
よる部位特異的リコンビナーゼ(SSR)に対する標的部位(RT、環状エピソーム 上に三角形で示す)の欠失を示す。この場合、正しいETクローニング産物は、SS
Rが選択マーカー遺伝子(sm)を欠失させるのに必要な標的部位の1つを欠失する 。SSRが該sm遺伝子を欠失できなかったことにより、正確なETクローニング産物 を同定する。
びレシピエントベクターに存在する相同的アームに隣接するように図1に記載の
とおりに設計されたオリゴヌクレオチドから合成されたPCR産物(左レーン)をi
n vitroでレシピエントベクター(第2レーン)と混合し、recET + 大腸菌宿主 中に同時形質転換した。レシピエントベクターはアンピシリン耐性遺伝子を担持
する。(b)PCR産物単独(0.2μg)またはベクター単独(0.3μg)によるsbcA大腸菌
株JC9604の形質転換はアンピシリンおよびカナマイシンによる2重選択(amp+kan
)に対する耐性を伝達しない。しかしながら、PCR産物とベクターの両方を同時 形質転換すると、2重耐性コロニーが産生される。これらのコロニーの95%より
多くが、相同的アームの選択によりカナマイシン遺伝子がレシピエントベクター
に正確に導入されている正確なETクローニング産物を含む。(a)の右側の2レーン
は、ETクローニング前後のレシピエントベクターのPvu II制限酵素消化を示す。
(c)bと同様、ただし6つのPCR産物(それぞれ0.2μg)を、pSVpaZ11(それぞれ0
.3μg)でJC9604中に同時形質転換し、Amp+KanプレートまたはAmpプレート上に プレーティングしたことを除く。結果を、組換え産物を表すAmp+Kan耐性コロニ ー数をコンピテント細胞調製物のプラスミド形質転換率を表すAmp-耐性コロニー
数で割って106をかけてプロットした。PCR産物は、相同的アームの長さが異なる
ことを除いてa-b PCR産物と同じであった。結果は、コンピテント細胞およびDNA
の同じ群を用いた5回の実験から得られたものである。エラーバーは標準偏差を 示す。(d)50bpの相同的アームに隣接する8つの産物を、pSVpaZ11とともにJC9604
中に同時形質転換した。8つのPCR産物のすべてが、同一の左相同的アームおよび
増幅されたneo遺伝子を含有していた。右の相同的アームは、(O)に隣接するpSVp
aZ11配列から、またはより離れた(7〜3100bp)左の相同的アームから選択した 。4回の実験から結果を得た。
Hox a遺伝子クラスターを含むP1クローンを使用した。ETクローニングの前に、 このエピソームはカナマイシン耐性(上のパネル、左上)をアンピシリン感受性
の(上のパネル、右上)宿主大腸菌に伝達する。カナマイシン耐性遺伝子をアン
ピシリン耐性遺伝子に置き換えるように設計した線状DNA断片を図1で概要を示 したようにPCRで作製し、レシピエントHox a/P1ベクターが常在する大腸菌宿主 細胞中に形質転換した。ETクローニングの結果、カナマイシン耐性遺伝子は欠失
し、カナマイシン感受性は回復した(上のパネル、左下)。そして、アンピシリ
ン耐性を獲得した(上のパネル、右下)。DNA組換えが正確になされたことは、E
Tクローニング前後で単離されたDNAを制限酵素分解、およびサザンブロット分析
することよって確認した(下のパネル)。
した PCR断片(上のパネル、左、第3レーン)はその選択された相同的アームに よって、ベクターpZero-2.1に存在する対抗選択ccdB遺伝子を欠失させるように 指令される。recE/recT+大腸菌宿主中に形質転換する前に、PCR産物とpZeroベ クターをin vitroで混合した(上のパネル、左、第1レーン)。pZero-2.1単独で
形質転換しカナマイシン選択培地上にプレーティングすると、コロニーは殆ど増
殖しなかった(下のパネル、左)。pZero-2.1とPCR産物を同時形質転換すると、
PvuII消化(上のパネル、右)によって視覚化したとき、意図した分子事象が起 こったことを示すETクローニング産物が現われた(下のパネル、右)。
アラビノースを示した回数加えることによってRecE/RecT発現を誘導した後、コ ンピテント細胞群を調製した。PCR産物をオリゴヌクレオチドeおよびfを用いて
pMAK705のクロラムフェニコール耐性遺伝子(cm)およびpBAD24-recETのアンピ シリン耐性遺伝子(bla)と隣接するように選択された50bp相同的アームを含む ように作製し、続いて形質転換し、組換え体をクロラムフェニコールプレートで
同定した。(b)アラビノースを、pBAD24-recETで形質転換したJC5547の培養物に 、コンピテント細胞調製のために回収する直前に、種々の回数で直接加えた。タ
ンパク質発現の総量はSDS-PAGEおよびクマシーブルー染色で分析した。(c)形質 転換およびアリコートのKanプレートへのプレーティングの際に、5pgのpZero2.
1を含むこと、カナマイシン耐性を伝達することにより決定される形質転換率に つて、PCR産物1μgあたりのクロラムフェニコール耐性コロニーの数を対照に対 して規準化した。
びaraC遺伝子を含む。 Bには、pBAD24-recETの核酸配列およびタンパク質をコードする部分を示す。
2工程では、neo遺伝子がFRT間のFlp組み換えによって、温度感受性起点(ts or
i)pSC101をベースとするFlp発現プラスミドの一時的な形質転換によって、取り
除かれた。b上のパネル;各工程における3つの独立したコロニーから得たP1 DN
A調製物のEcoR1による消化を示すエチジウムブロミドで染色したアガロースゲル
。真ん中のパネル;neo遺伝子プローブにハイブリダイズした上のパネルのサザ ンブロット。下のパネル;組換え部位を視覚化するためにHoxa3プローブにハイ ブリダイズした上のパネルのサザンブロット。レーン1;大腸菌株NS3145中で増
殖した起源(original)Hoxa3P1クローン。レーン2;該P1ベクターに常在するTn90
3カナマイシン耐性遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子との置換により、8.1kbバン
ド(レーン1)が9.0kbに増加した。レーン3;Tn5-neo遺伝子をHoxa3の上流のg-h
相同的アームと共に挿入すると、6.7kbのバンド(レーン1,2)が、9.0kbに増加 した。レーン4、Flpリコンビナーゼはg-h neo遺伝子を欠失させ、9.0kbのバンド
(レーン3)が6.7kbのバンドまで減少した。レーン5、Hoxa3-4遺伝子間の6kbの
DNAをi-hneo遺伝子と置き換えることで欠失させると、6.7kbバンド(レーン2) が4.5kbに減少した。レーン6、Flpリコンビナーゼがi-h neo遺伝子を欠失させ、
4.5kbバンドが2.3kbバンドに減少した。
隣接するneo遺伝子を含むPCR断片の標的となった。neo遺伝子を組み込むとAvaI 部位を含むほとんどのlacZ遺伝子が取り除かれ、1443および3027bpバンドが3277
bpバンドに変化した。第2工程では、pSC101温度感受性起点(ts ori)に基づくC
re発現プラスミドの一時的な形質転換によるloxP間のCre組換えによって、neo遺
伝子が取り除かれた。Creリコンビナーゼによるneo遺伝子の除去によって3277バ
ンドが2111bpに減少した。b. βガラクトシダーゼ発現をX-Galプレート上の線 条接種コロニーによって評価した。最上列の3つの条班は宿主JC9604株内のβ-ガ
ラクトシダーゼ発現を示し(w.t.)、下の3つの条班は(Km)は24の独立した最 初のコロニーを示す。そのなかの20は意図した組換え事象を表すβ-ガラクトシ ダーゼ発現の減失を表す。c. AvaIで消化した大腸菌染色体DNAの、全lacZコー ド領域から作製したランダムプライムプローブを用いたサザン分析;レーン1,2 、 w.t.;レーン3〜6、j-k neo遺伝子挿入後の独立した4つの白色コロニー;レ
ーン7〜10、Cre発現プラスミドで一時的に形質転換した後の同一の4つのコロニ ー。
04lacZ中で分断し、plB279に対するPCRによって合成されかつlおよびm相同的 アームに隣接するsacB-neo遺伝子カセットによって、内因性lacZ遺伝子の発現を
除去し、競合する配列を取り除いた。pSV-sacB-neoと称する組換え体をAmp+Kan プレート上で選択した。そして、pSV-sacB-neoのlacZ遺伝子を、完全なlacZ遺伝
子から作製したPCR断片によりl*およびm*相同的アームを用いて修復した。m*相 同的アームは、BamH1部位を創るCからGへのサイレント変化を含有した。pSVpaX
1*と称する組換え体を7%スクロースを用いてsacB遺伝子に対する対抗選択によ
って同定した。b. pSVpaX1からのβ-ガラクトシダーゼの発現はpSV-sacB-neo中
では中断し、pSVpaX1*中では復活した。発現をX-galプレート上で分析した。pSV
-sacB-neoおよびpSVpaX1*それぞれの3つの独立したコロニーを示す。c スクロ
ースによる対抗選択後に採取した独立コロニーから調製したDNAをBamH1で消化し
たもののエチジウムブロミド染色アガロースゲル。すべてのβ-ガラクトシダー ゼ発現コロニー(青色)は、導入されたBamH1制限部位を有した(上のパネル) 。すべての白色コロニーは大規模な再配列(rearrangement)を表し、特徴的な1.5
kbのBamH1制限断片を有する産物はなかった(下のパネル)。
cE遺伝子(t-recE)、(ii)EM7プロモーター下のrecT遺伝子、および(iii)Tn5プロ モーター下のredγ遺伝子、を含む。pBAD-ETγはHoxa P1エピソームを含むrecA 大腸菌株、NS3145中に形質転換された。アラビノース誘導後、コンピテント細胞
を調製し、nおよびp相同的アームに隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子(c
m)を有するPCR産物で形質転換した。nおよびpは、P1ベクターのセグメントと組 換えられるように選択した。b. 組換え標的部位を視覚化するためにP1ベクター
から作製したプローブ(上のパネル)およびクロラムフェニコール耐性遺伝子か
ら作製したプローブ(下のパネル)、とハイブリダイズしたDNAをPvu IIで消化 したもののサザンブロット。レーン1、ETクローニングの前にHoxaP1エピソーム を有する細胞から調製したDNA。レーン2〜17、16個のクロラムフェニコール耐性
コロニーから調製したDNA。
K1中に形質転換し、図6に記載のようにクロラムフェニコール遺伝子の標的とし て、ETクローニング効率を評価した。アラビノースによるタンパク質発現誘導は
1時間だった。
ecEおよびrecT遺伝子がredαおよびredβ遺伝子に置き換わっていることを除い て図13に示すプラスミドと実質的に一致する。 Bは、pBAD-αβγの核酸配列およびタンパク質コード部分を示す。
Claims (50)
- 【請求項1】 a)相同組換えを実行する能力を有する宿主細胞を準備する
工程、 b)該宿主細胞中で複製され得る第1DNA分子と、第1DNA分子上の領域と配列相
同な領域を少なくとも2個含む第2DNA分子とを、該第1および第2DNA分子間の
相同組換えに好適な条件下で該宿主細胞中で接触させる工程、ならびに c)該第1および第2DNA分子間の相同組換えが生じた宿主細胞を選択する工程 を含む、細胞中でDNA分子をクローニングする方法。 - 【請求項2】 相同組換えがrecETクローニング機構を介して生じる、請求 項1に記載の方法。
- 【請求項3】 宿主細胞がrecEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有する、
請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 recEおよびrecT遺伝子が大腸菌recEおよびrecT遺伝子から、
またはλredαおよびredβ遺伝子から選択される、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 recEおよび/またはrecT遺伝子を発現する能力を有する少な
くとも1種のベクターで宿主細胞が形質転換されている、請求項3または4に記
載の方法。 - 【請求項6】 recEおよび/またはrecT遺伝子の発現が調節性プロモーター
の制御下にある、請求項3、4または5に記載の方法。 - 【請求項7】 recT遺伝子がrecE遺伝子に比較して過剰発現される、請求項
5または6に記載の方法。 - 【請求項8】 recE遺伝子が、 (a)図7Bに記載の位置1320(ATG)から2159(GAC)までの核酸配列、 (b)図13Bに記載の位置1320(ATG)から1998(CGA)までの核酸配列、 (c)遺伝コードの縮重範囲内にある、同ポリペプチドをコードする核酸配列、
ならびに/または (d)(a)、(b)および/若しくは(c)からの核酸配列とストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸配列 を含む核酸分子から選択される、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 recT遺伝子が、 (a)図7Bに記載の位置2155(ATG)から2961(GAA)までの核酸配列、 (b)図13Bに記載の位置2086(ATG)から2868(GCA)までの核酸配列、 (c)遺伝コードの縮重範囲内にある、同ポリペプチドをコードする核酸配列、
ならびに/または (d)(a)、(b)および/若しくは(c)からの核酸配列とストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸配列 を含む核酸分子から選択される、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】 宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項1〜9のい
ずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項10に記載の方法。
- 【請求項12】 宿主細胞が大腸菌K12株である、請求項11に記載の方法 。
- 【請求項13】 大腸菌株がJC8679およびJC9604から選択される、請求項1
2に記載の方法。 - 【請求項14】 宿主細胞がさらにrecBCインヒビター遺伝子を発現する能 力を有する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 【請求項15】 宿主細胞がrecBCインヒビター遺伝子を発現するベクター
で形質転換されている、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 recBCインヒビター遺伝子が、 (a)図13Bに記載の位置3588(ATG)から4002(GTA)までの核酸配列、 (b)遺伝コードの縮重範囲内にある、同ポリペプチドをコードする核酸配列、
ならびに/または (c)(a)および/若しくは(b)からの核酸配列と(上記の定義の)ストリ
ンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列 を含む核酸分子から選択される、請求項14または15に記載の方法。 - 【請求項17】 宿主細胞が原核recBC+細胞である、請求項13〜16の いずれか1項に記載の方法。
- 【請求項18】 第1DNA分子が環状である、請求項1〜17のいずれか1 項に記載の方法。
- 【請求項19】 第1DNA分子が、宿主細胞中で機能し得る複製起点を含有 す る染色体外DNA分子である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 【請求項20】 第1DNA分子がプラスミド、コスミド、P1ベクター、BACベ
クターおよびPACベクターから選択される、請求項18または19に記載の方法 。 - 【請求項21】 第1DNA分子が宿主細胞染色体である、請求項1〜18の いずれか1項に記載の方法。
- 【請求項22】 第2DNA分子が線状である、請求項1〜21のいずれか1 項に記載の方法。
- 【請求項23】 配列相同領域がそれぞれ少なくとも15ヌクレオチドである
、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項24】 第2DNA分子が増幅反応によって取得される、請求項1〜 16のいずれか1項に記載の方法。
- 【請求項25】 第1および/または第2DNA分子が形質転換によって宿主 細胞中に導入される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 【請求項26】 形質転換法がエレクトロポレーション法である、請求項2
5に記載の方法。 - 【請求項27】 第1および第2DNA分子が同時形質転換によって同時に宿 主細胞中に導入される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 【請求項28】 第1DNA分子がすでに存在する宿主細胞中に第2DNA分子が
導入される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項29】 第2DNA分子が、2つの配列相同性領域の間に配置された マーカー遺伝子を少なくとも1つ含有し、かつ、該マーカー遺伝子の発現によっ
て相同組換えを検出する、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項30】 存在させる遺伝子が抗生物質耐性遺伝子、欠失相補性遺伝
子およびリポーター遺伝子から選択される、請求項29に記載の方法。 - 【請求項31】 第1DNA分子が、2つの配列相同性領域の間にマーカー遺 伝子を少なくとも1個含有し、かつ、該マーカー遺伝子の発現の欠損によって相
同組換えを検出する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項32】 マーカー遺伝子が、選択された条件下で細胞に毒性または
静菌効果を伝達する遺伝子、およびリポーター遺伝子から選択される、請求項1
〜31のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項33】 第1DNA分子が、2つの配列相同性領域の間に部位特異的 リコンビナーゼのためのターゲット部位を少なくとも1個含有し、かつ、該ター
ゲット部位の除去によって相同組換えを検出する、請求項1〜32のいずれか1
項に記載の方法。 - 【請求項34】 (a)RecEおよびRecTタンパク質の供給源を準備する工程
、 (b)好適な宿主細胞中で複製され得る第1DNA分子と、第1DNA分子上の領域と
配列相同な領域を少なくとも2個含む第2DNA分子とを、該第1および第2DNA分
子間の相同組換えに好適な条件下で接触させる工程、ならびに (c)該第1および第2DNA分子間の相同組換えが生じたDNA分子を選択する工程
を含む、DNA分子をクローニングする方法。 - 【請求項35】 RecEおよびRecTタンパク質が大腸菌RecEおよびRecTタンパ
ク質から、またはファージλRedαおよびRedβタンパク質から選択される、請求
項34に記載の方法。 - 【請求項36】 組換えがin vitroで生じる、請求項34または35に記載
の方法。 - 【請求項37】 組換えがin vivoで生じる、請求項34または35に記載 の方法。
- 【請求項38】 相同組換えが関与するクローニング方法のための宿主細胞
としての、recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有する細胞の使用。 - 【請求項39】 相同組換えが関与するクローニング方法のための、宿主細
胞中での、recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有するベクター系の使用。 - 【請求項40】 recEおよびrecT遺伝子が大腸菌recEおよびrecT遺伝子から
、またはλredαおよびredβ遺伝子から選択される、請求項38または39に記
載の使用。 - 【請求項41】 相同組換えが関与するクローニング方法のための、RecEお
よびRecTタンパク質の供給源の使用。 - 【請求項42】 RecEおよびRecTタンパク質が大腸菌RecEおよびRecTタンパ
ク質から、またはファージλRedαおよびRedβタンパク質から選択される、請求
項41に記載の使用。 - 【請求項43】 (a)宿主細胞、 (b)該宿主細胞中でのrecEおよびrecT遺伝子の発現のための手段、ならびに (c)該細胞中で複製され得るレシピエントクローニングビヒクル を含む、クローニングのための試薬キット。
- 【請求項44】 手段(b)が該宿主細胞中でrecEおよびrecT遺伝子を発現
する能力を有するベクター系を含む、請求項43に記載の試薬キット。 - 【請求項45】 recEおよびrecT遺伝子が大腸菌recEおよびrecT遺伝子から
、またはλredαおよびredβ遺伝子から選択される、請求項43または44に記
載の試薬キット。 - 【請求項46】 (a)RecEおよびRecTタンパク質の供給源、ならびに (b)宿主細胞中で増殖する能力を有するレシピエントクローニングビヒクル を含む、クローニングのための試薬キット。
- 【請求項47】 前記レシピエントクローニングビヒクルの増殖のために好
適な宿主細胞をさらに含む、請求項46に記載の試薬キット。 - 【請求項48】 RecEおよびRecTタンパク質が大腸菌RecEおよびRecTタンパ
ク質から、またはファージλRedαおよびRedβタンパク質から選択される、請求
項46または47に記載の試薬キット。 - 【請求項49】 宿主細胞中で部位特異的リコンビナーゼを発現させるため
の手段をさらに含む、請求項43〜48のいずれか1項に記載の試薬キット。 - 【請求項50】 レシピエントクローニングビヒクルに相同な領域を含む核
酸増幅プライマーをさらに含む、請求項43〜49のいずれか1項に記載の試薬 キット。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007151542A (ja) * | 2005-12-02 | 2007-06-21 | Korea Research Inst Of Bioscience & Biotechnology | 相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法 |
Families Citing this family (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6156574A (en) | 1997-06-23 | 2000-12-05 | The Rockefeller University | Methods of performing gene trapping in bacterial and bacteriophage-derived artificial chromosomes and use thereof |
US6821759B1 (en) | 1997-06-23 | 2004-11-23 | The Rockefeller University | Methods of performing homologous recombination based modification of nucleic acids in recombination deficient cells and use of the modified nucleic acid products thereof |
CA2307016A1 (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Life Technologies, Inc. | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
CA2312474C (en) * | 1997-12-05 | 2012-07-03 | Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie | Novel dna cloning method |
AUPP684998A0 (en) * | 1998-10-30 | 1998-11-26 | Murdoch Institute for Research into Birth Defects Limited, The | A method of recombination and agents useful for same |
US6720139B1 (en) | 1999-01-27 | 2004-04-13 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli |
US6709852B1 (en) | 1999-06-22 | 2004-03-23 | Invitrogen Corporation | Rapid growing microorganisms for biotechnology applications |
DK1192242T3 (da) * | 1999-06-25 | 2010-07-26 | Wyeth Corp | Fremstilling af den lipiderede form af de peptidgylcan-associerede lipoproteiner af gramnegative bakterier |
US6355412B1 (en) * | 1999-07-09 | 2002-03-12 | The European Molecular Biology Laboratory | Methods and compositions for directed cloning and subcloning using homologous recombination |
WO2001005962A1 (en) * | 1999-07-20 | 2001-01-25 | The Rockefeller University | Conditional homologous recombination of large genomic vector inserts |
US6589738B1 (en) | 1999-11-09 | 2003-07-08 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Genes essential for microbial proliferation and antisense thereto |
AU2001283377B2 (en) * | 2000-08-14 | 2007-09-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Enhanced homologous recombination mediated by lambda recombination proteins |
US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
WO2002062988A2 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-15 | Gene Bridges Gmbh | Recombination method |
US20020165175A1 (en) * | 2001-04-17 | 2002-11-07 | Xiaowu Liang | Fast and enzymeless cloning of nucleic acid fragments |
WO2003010322A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-02-06 | Youming Zhang | Improved rect or recet cloning and subcloning method |
WO2003010333A2 (en) * | 2001-07-24 | 2003-02-06 | Affinium Pharmaceuticals Inc. | Methods for gene disruption and uses thereof |
US7338800B2 (en) * | 2002-01-16 | 2008-03-04 | Baylor College Of Medicine | In vivo gene transfer |
CA2473741C (en) * | 2002-01-18 | 2015-12-22 | Morphotek, Inc. | A method for generating engineered cells for locus specific gene regulation and analysis |
US8119365B2 (en) * | 2002-01-23 | 2012-02-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Insertion sequence-free bacteria |
US8765408B2 (en) | 2002-01-23 | 2014-07-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Prophage element-free bacteria |
US6989265B2 (en) * | 2002-01-23 | 2006-01-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Bacteria with reduced genome |
US8039243B2 (en) * | 2002-01-23 | 2011-10-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Insertion sequence-free bacteria |
US20060270043A1 (en) * | 2002-01-23 | 2006-11-30 | Blattner Frederick R | Bacteria with reduced genome |
WO2003089587A2 (en) * | 2002-04-16 | 2003-10-30 | Promega Corporation | Method to enhance homologous recombination |
AU2003257155A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-23 | The General Hospital Corporation | Methods for the production of cells and mammals with desired genetic modifications |
DE10236001A1 (de) | 2002-08-06 | 2004-02-19 | Icon Genetics Ag | Transformation von Plastiden unter Verwendung modularer Vektoren |
US7303906B2 (en) * | 2002-09-06 | 2007-12-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Competent bacteria |
US7563600B2 (en) | 2002-09-12 | 2009-07-21 | Combimatrix Corporation | Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides |
US20040209370A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-10-21 | Wonchul Suh | Method for chromosomal engineering |
US7521242B2 (en) | 2003-05-09 | 2009-04-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Host cells deficient for mismatch repair and their use in methods for inducing homologous recombination using single-stranded nucleic acids |
WO2005014796A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for seamless cloning of nucleic acid molecules |
ATE469984T1 (de) * | 2003-12-01 | 2010-06-15 | Life Technologies Corp | Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon |
WO2005089110A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Polynucleotide synthesis |
JP2005245320A (ja) * | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Aisin Seiki Co Ltd | 核酸組換え方法、宿主細胞、及び、発現ベクター |
US7674621B2 (en) * | 2004-05-21 | 2010-03-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Plasmids and phages for homologous recombination and methods of use |
US20070122817A1 (en) * | 2005-02-28 | 2007-05-31 | George Church | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides |
CA2584984A1 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Codon Devices, Inc. | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides |
GB0423755D0 (en) * | 2004-10-26 | 2004-11-24 | Gene Bridges Gmbh | Methods for heterologus expression of secondary metabolites |
US20080051326A1 (en) * | 2004-11-12 | 2008-02-28 | Alexander Dylan C | Antiinfective Lipopeptides |
WO2006127423A2 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-30 | Codon Devices, Inc. | Methods of producing polynucleotide libraries using scarless ligation |
US20070004041A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-04 | Codon Devices, Inc. | Heirarchical assembly methods for genome engineering |
EP1948803A4 (en) * | 2005-10-13 | 2009-11-25 | Bc Cancer Agency | MODULAR GENOME FOR SYNTHETIC BIOLOGY AND METABOLISM MANIPULATION |
WO2007136834A2 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Codon Devices, Inc. | Combined extension and ligation for nucleic acid assembly |
WO2007139982A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for gene inactivation |
WO2008027558A2 (en) * | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Codon Devices, Inc. | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
JP5837747B2 (ja) | 2007-05-17 | 2015-12-24 | ベーリンガー インゲルハイム エルツェーファウ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト | 組換えタンパク質を工業規模で製造する方法 |
GB0803109D0 (en) * | 2008-02-20 | 2008-03-26 | Gene Bridges Gmbh | Method of nucleic acid recombination |
WO2009110606A1 (ja) | 2008-03-07 | 2009-09-11 | 国立大学法人富山大学 | 相同組換え方法およびクローニング方法並びにキット |
US20100062495A1 (en) * | 2008-09-10 | 2010-03-11 | Genscript Corporation | Homologous recombination-based DNA cloning methods and compositions |
GB0909660D0 (en) | 2009-06-04 | 2009-07-22 | Gene Bridges Gmbh | Method of altering nucleic acids |
ES2965212T3 (es) | 2009-07-08 | 2024-04-11 | Kymab Ltd | Modelos de animales y moléculas terapéuticas |
WO2011053957A2 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for the regulation of multiple genes of interest in a cell |
WO2011063363A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
GB0922108D0 (en) | 2009-12-17 | 2010-02-03 | Gene Bridges Gmbh | Heterologous hosts |
WO2011080505A2 (en) | 2009-12-28 | 2011-07-07 | Bigdna Ltd | Method of growing phage for commercial use |
JP2011217736A (ja) * | 2010-03-26 | 2011-11-04 | Aichi Medical Univ | 組換えクラミジア及びその製造方法 |
NZ603816A (en) | 2010-05-27 | 2014-06-27 | Pharmazell Gmbh | Novel 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase knockout mutants and use thereof |
GB201009732D0 (en) | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Gene Bridges Gmbh | Direct cloning |
EP2582230A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-04-24 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
ES2548400T3 (es) | 2010-11-12 | 2015-10-16 | Gen9, Inc. | Métodos y dispositivos para la síntesis de ácidos nucleicos |
WO2012064975A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
CA2868113A1 (en) | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems |
EP2944693B1 (en) | 2011-08-26 | 2019-04-24 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for high fidelity assembly of nucleic acids |
CA2846322A1 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
WO2014153188A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | High efficiency, small volume nucleic acid synthesis |
EP2768607B1 (en) | 2011-09-26 | 2021-08-18 | Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH | Multiwell plate for high efficiency, small volume nucleic acid synthesis |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CN103160495A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 张力军 | 一种非连接依赖性的快速克隆方法 |
US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
CN102634534A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-08-15 | 深圳市中联生物科技开发有限公司 | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 |
EP4001427A1 (en) | 2012-04-24 | 2022-05-25 | Gen9, Inc. | Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning |
US20130288320A1 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Bioamber Inc. | Methods and microorganisms for increasing the biological synthesis of difunctional alkanes |
CN102676470B (zh) * | 2012-05-29 | 2014-04-16 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒 |
JP6509727B2 (ja) | 2012-06-25 | 2019-05-15 | ギンゴー バイオワークス, インコーポレイテッド | 核酸アセンブリおよび高処理シークエンシングのための方法 |
US20150353940A1 (en) * | 2013-08-05 | 2015-12-10 | Absci, Llc | Vectors for use in an inducible coexpression system |
CN109182238A (zh) | 2012-08-10 | 2019-01-11 | 嘉吉有限公司 | 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 |
JP6412509B2 (ja) | 2013-02-22 | 2018-10-24 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ポリペプチドの組換え生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用 |
WO2014146026A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Bioproduction of chemicals |
WO2015010103A2 (en) | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
AU2015324564B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-07-01 | Duke University | Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
CN107532129B (zh) | 2014-12-09 | 2022-09-13 | 生命技术公司 | 高效小体积核酸合成 |
CN104630178A (zh) * | 2015-01-28 | 2015-05-20 | 苏州神洲基因有限公司 | 一种混合蛋白酶体系、包含该混合蛋白酶体系的试剂盒及其使用方法 |
EP3280808B1 (en) | 2015-04-09 | 2020-09-16 | Genomatica, Inc. | Genetically engineered e. coli and methods for improved crotyl alcohol production |
CN110494566A (zh) | 2017-02-02 | 2019-11-22 | 嘉吉公司 | 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞 |
EP3848459A1 (en) | 2017-06-30 | 2021-07-14 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments and systems |
US10738327B2 (en) | 2017-08-28 | 2020-08-11 | Inscripta, Inc. | Electroporation cuvettes for automation |
CN111372650A (zh) | 2017-09-30 | 2020-07-03 | 因思科瑞普特公司 | 流通式电穿孔仪器 |
WO2019190874A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Inscripta, Inc. | Automated control of cell growth rates for induction and transformation |
WO2019200004A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
US10526598B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-01-07 | Inscripta, Inc. | Methods for identifying T-cell receptor antigens |
US10501738B2 (en) | 2018-04-24 | 2019-12-10 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of peptide libraries |
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US11142740B2 (en) | 2018-08-14 | 2021-10-12 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
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EP3986909A4 (en) | 2019-06-21 | 2023-08-02 | Inscripta, Inc. | GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI |
US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4963487A (en) * | 1985-01-03 | 1990-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for deletion of a gene from a bacteria |
US5286632A (en) * | 1991-01-09 | 1994-02-15 | Jones Douglas H | Method for in vivo recombination and mutagenesis |
US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
CA2312474C (en) * | 1997-12-05 | 2012-07-03 | Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie | Novel dna cloning method |
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-
2012
- 2012-01-03 US US13/342,621 patent/US20120208277A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007151542A (ja) * | 2005-12-02 | 2007-06-21 | Korea Research Inst Of Bioscience & Biotechnology | 相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法 |
JP4575338B2 (ja) * | 2005-12-02 | 2010-11-04 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法 |
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