JP2003116551A - １つの遺伝系における組換え酵素による多重連続組換えのための、認識配列変異体の使用 - Google Patents
１つの遺伝系における組換え酵素による多重連続組換えのための、認識配列変異体の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多重の連続的な相同組換え、且つ組換え酵素
仲介性の組換えの過程において１の遺伝系内における多
重の且つターゲッティングされた変異を可能にするため
の、改良された組換え方法を創り出すこと。 【解決手段】 単一の遺伝系において配列特異的な組換
え酵素によって２つ又は３つ以上の組換えを起こさせる
ための、配列特異的な組換え酵素のための２つの同一で
ない認識配列変異体の使用であって、該認識配列変異体
の各々が、スペーサー配列で分離された２つの認識配列
を含み、そして変異体の各々が、互い同士逆方向に反復
しているそれら認識配列のうちの一方に変異を有し且つ
他方の認識配列は野生型認識配列に対応しているもので
ある、認識配列変異体の使用
仲介性の組換えの過程において１の遺伝系内における多
重の且つターゲッティングされた変異を可能にするため
の、改良された組換え方法を創り出すこと。 【解決手段】 単一の遺伝系において配列特異的な組換
え酵素によって２つ又は３つ以上の組換えを起こさせる
ための、配列特異的な組換え酵素のための２つの同一で
ない認識配列変異体の使用であって、該認識配列変異体
の各々が、スペーサー配列で分離された２つの認識配列
を含み、そして変異体の各々が、互い同士逆方向に反復
しているそれら認識配列のうちの一方に変異を有し且つ
他方の認識配列は野生型認識配列に対応しているもので
ある、認識配列変異体の使用
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変位した認識配列
を用いた部位特異的組換えのための、改良された組換え
方法に関する。
を用いた部位特異的組換えのための、改良された組換え
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】部位特的組換えは、遺伝系の操作のため
の魅力的な道具である。残念なことに、組換え酵素の各
々が１度しか使用できず且つ既知の部位特異的組換え酵
素の数が限られているため、１個の細胞又は１個の遺伝
系内で起こり得る組換え反応の数は限られている。
の魅力的な道具である。残念なことに、組換え酵素の各
々が１度しか使用できず且つ既知の部位特異的組換え酵
素の数が限られているため、１個の細胞又は１個の遺伝
系内で起こり得る組換え反応の数は限られている。
【０００３】それらの１つは、例えば、E. coliバクテ
リオファージＰ１の組換え酵素Creであり、それは、分
子内又は分子間で２個の同一のloxPモチーフの間の部位
特異的組換えを仲介する。E. coliバクテリオファージ
Ｐ１の組換え酵素Creは、そのＤＮＡ標的配列であるlox
Pを介してＤＮＡ再配列を仲介する部位特異的組換え酵
素である（１）。loxP配列は、ＤＮＡにCreが結合する
ための認識配列として働く２個の13ｂｐの逆方向反復配
列に両側を挟まれた８ｂｐのスペーサー領域からなる
（２、３）。組換えは、これら２個の構成要素のみに依
存しており、絶対的な信頼性を以って行われる。S. cer
evisiae のF1p-FRT系と類似して、Cre-loxP系は、原核
細胞及び酵母、植物、昆虫及び哺乳類を含む真核細胞の
両方において組換えを効果的に触媒することが見出され
ている。部位特的組換えは、単一の細胞及び動物におい
て、条件的付きの遺伝的改変のために広く用いられてい
る道具である（より最近の総説については、（４、５）
及びここに引用する参考文献を参照）。
リオファージＰ１の組換え酵素Creであり、それは、分
子内又は分子間で２個の同一のloxPモチーフの間の部位
特異的組換えを仲介する。E. coliバクテリオファージ
Ｐ１の組換え酵素Creは、そのＤＮＡ標的配列であるlox
Pを介してＤＮＡ再配列を仲介する部位特異的組換え酵
素である（１）。loxP配列は、ＤＮＡにCreが結合する
ための認識配列として働く２個の13ｂｐの逆方向反復配
列に両側を挟まれた８ｂｐのスペーサー領域からなる
（２、３）。組換えは、これら２個の構成要素のみに依
存しており、絶対的な信頼性を以って行われる。S. cer
evisiae のF1p-FRT系と類似して、Cre-loxP系は、原核
細胞及び酵母、植物、昆虫及び哺乳類を含む真核細胞の
両方において組換えを効果的に触媒することが見出され
ている。部位特的組換えは、単一の細胞及び動物におい
て、条件的付きの遺伝的改変のために広く用いられてい
る道具である（より最近の総説については、（４、５）
及びここに引用する参考文献を参照）。
【０００４】他の部位特的組換え系が複数存在し、それ
らは２成分系に基づいている。それらの系全ては、特異
的な反復ＤＮＡ配列を含む点において共通している。こ
れらの配列は、各場合において、スペーサーで分離され
た２個の認識配列よりなり、該認識配列は、互い同士逆
方向に反復している。この点において、それら２つの構
成要素は、同一である。上述の例のほかに、Zygosaccha
romyces rouxii pSR1、レソルバーゼ−rfsF及びファー
ジMu Gin組換え酵素系も知られている。
らは２成分系に基づいている。それらの系全ては、特異
的な反復ＤＮＡ配列を含む点において共通している。こ
れらの配列は、各場合において、スペーサーで分離され
た２個の認識配列よりなり、該認識配列は、互い同士逆
方向に反復している。この点において、それら２つの構
成要素は、同一である。上述の例のほかに、Zygosaccha
romyces rouxii pSR1、レソルバーゼ−rfsF及びファー
ジMu Gin組換え酵素系も知られている。
【０００５】例えばCre-loxP系等のような組換え酵素系
を、認識配列に挟まれたＤＮＡセグメントの切断、反転
又は挿入のために使用してよい。それらの組換え酵素
は、分子内（切除又は反転）組換え並びに分子間（挿
入）組換えを仲介するからである。切除に際して、２個
の認識配列の間のＤＮＡ配列の領域が切除される。同様
に、例えば、loxP配列を含んだ環状ＤＮＡを、やはりlo
xP配列を含んだ遺伝子配座に挿入することが可能であ
る。しかしながら、これら全ての場合において、所望の
反応が起こるのみならず、常に逆反応が伴う。
を、認識配列に挟まれたＤＮＡセグメントの切断、反転
又は挿入のために使用してよい。それらの組換え酵素
は、分子内（切除又は反転）組換え並びに分子間（挿
入）組換えを仲介するからである。切除に際して、２個
の認識配列の間のＤＮＡ配列の領域が切除される。同様
に、例えば、loxP配列を含んだ環状ＤＮＡを、やはりlo
xP配列を含んだ遺伝子配座に挿入することが可能であ
る。しかしながら、これら全ての場合において、所望の
反応が起こるのみならず、常に逆反応が伴う。
【０００６】組換え系例えばCre系の性質は、種々の慣
用な遺伝子ターゲッティング戦略（４、５）及び組換え
戦略と組み合わせることができる（４、５）。一般に、
慣用の遺伝子改変は、改変したアレルを標的を定めて組
込むことに基づくものである。真核細胞及び原核細胞に
おいて、組み込みは、問題のアレルの両側を挟んでいる
領域との相同組換えによって達成される。殆どの遺伝系
において低い頻度でしか生じない相同組換え体の選択の
ために、正の遺伝子マーカーが必須である。従って、次
のステップで、好ましくは残存の野生型アレルと関連付
けて、このマーカーを除去することが望ましいことがし
ばしばである。マーカー遺伝子（すなわち、除去すべき
ＤＮＡセグメント）の除去のためには、導入されたloxP
配列が、厳格にCre依存性の仕方で、loxPに挟まれたＤ
ＮＡセグメントの効果的切除を可能にする。切除された
断片は環状化されそして分解によって失われるが、その
一方で、単一のloxP配列がその改変された遺伝子配座に
残る。後のステップにおいて、このloxP配列は第２のlo
xP配列と一緒に、Cre組換え酵素のための更なる部位と
して働き、それによって望まない組換えが起こり得る。
用な遺伝子ターゲッティング戦略（４、５）及び組換え
戦略と組み合わせることができる（４、５）。一般に、
慣用の遺伝子改変は、改変したアレルを標的を定めて組
込むことに基づくものである。真核細胞及び原核細胞に
おいて、組み込みは、問題のアレルの両側を挟んでいる
領域との相同組換えによって達成される。殆どの遺伝系
において低い頻度でしか生じない相同組換え体の選択の
ために、正の遺伝子マーカーが必須である。従って、次
のステップで、好ましくは残存の野生型アレルと関連付
けて、このマーカーを除去することが望ましいことがし
ばしばである。マーカー遺伝子（すなわち、除去すべき
ＤＮＡセグメント）の除去のためには、導入されたloxP
配列が、厳格にCre依存性の仕方で、loxPに挟まれたＤ
ＮＡセグメントの効果的切除を可能にする。切除された
断片は環状化されそして分解によって失われるが、その
一方で、単一のloxP配列がその改変された遺伝子配座に
残る。後のステップにおいて、このloxP配列は第２のlo
xP配列と一緒に、Cre組換え酵素のための更なる部位と
して働き、それによって望まない組換えが起こり得る。
【０００７】100ｋｂｐを超える挿入断片を担持したE.
coliプラスミドの遺伝子操作は、ＢＡＣ及びＰＡＣプラ
スミドと呼ばれる、それぞれＦ因子又はバクテリオファ
ージＰ１レプリコンに基づきE. coliプラスミドの単一
コピー中への大きい染色体断片のクローニングによって
もたらされた、かなり新しいアプローチである（６−
８）。このサイズのE. coliプラスミドの合成的構築
（９、10）並びに250ｋｂｐを超えるサイズがあり200を
超える異なった遺伝子をコードしているヘルペスウイル
スの完全ゲノムの分子クローニングも可能となっている
（より最近の総説については、参考文献11を参照）。Ｂ
ＡＣ及びＰＡＣの遺伝子操作は、一般に、E.coliにおけ
る種々の相同組換えプロトコールを用いて達成され、そ
れは選択可能なマーカー遺伝子の使用を必要とする（1
1、12）。単一のプラスミドにおける多数の独立した改
変には、選択可能マーカーを即時除去するか又はそれ以
後異なったマーカー遺伝子を使用することが必要とな
る。数通りの異なった抗生物質耐性遺伝子（及び、より
多くの数の栄養素要求マーカー）が入手可能であるが、
それらの除去は、比較的少数の部位特異的組換え系によ
ってのみ達成でき、それらのうち、Cre-loxP、F1p-FR
T、レソルバーゼ−rfsFという組み合わせが、もっとも
よく研究されている。その結果、単一のＤＮＡ分子内に
おいて行われる独立した改変の数は、比較的限定され
る。
coliプラスミドの遺伝子操作は、ＢＡＣ及びＰＡＣプラ
スミドと呼ばれる、それぞれＦ因子又はバクテリオファ
ージＰ１レプリコンに基づきE. coliプラスミドの単一
コピー中への大きい染色体断片のクローニングによって
もたらされた、かなり新しいアプローチである（６−
８）。このサイズのE. coliプラスミドの合成的構築
（９、10）並びに250ｋｂｐを超えるサイズがあり200を
超える異なった遺伝子をコードしているヘルペスウイル
スの完全ゲノムの分子クローニングも可能となっている
（より最近の総説については、参考文献11を参照）。Ｂ
ＡＣ及びＰＡＣの遺伝子操作は、一般に、E.coliにおけ
る種々の相同組換えプロトコールを用いて達成され、そ
れは選択可能なマーカー遺伝子の使用を必要とする（1
1、12）。単一のプラスミドにおける多数の独立した改
変には、選択可能マーカーを即時除去するか又はそれ以
後異なったマーカー遺伝子を使用することが必要とな
る。数通りの異なった抗生物質耐性遺伝子（及び、より
多くの数の栄養素要求マーカー）が入手可能であるが、
それらの除去は、比較的少数の部位特異的組換え系によ
ってのみ達成でき、それらのうち、Cre-loxP、F1p-FR
T、レソルバーゼ−rfsFという組み合わせが、もっとも
よく研究されている。その結果、単一のＤＮＡ分子内に
おいて行われる独立した改変の数は、比較的限定され
る。
【０００８】単一細胞中における組換え系を用いた組換
え遺伝子操作の選択肢を増やすために、例えば、Cre-lo
xP系のスペーサー領域内（13）又は逆方向反復配列（1
4）内に変位が誘発され、loxP配列の性質が改変されて
いる。スペーサー領域に改変を加えたloxP配列の一つ
は、同一の又は対を成すloxP配列とのみ組換え可能であ
り、野生型loxP配座や別のloxP変種とは、Cre仲介性の
組換えを受けることができない（15）。Cre仲介性の組
替えの後、得られるloxP配列は、Creによって依然認識
される。その結果、変更されたスペーサー領域を有する
loxP配列は、同じ遺伝系内の以後の連続した組換えに用
いることができない。
え遺伝子操作の選択肢を増やすために、例えば、Cre-lo
xP系のスペーサー領域内（13）又は逆方向反復配列（1
4）内に変位が誘発され、loxP配列の性質が改変されて
いる。スペーサー領域に改変を加えたloxP配列の一つ
は、同一の又は対を成すloxP配列とのみ組換え可能であ
り、野生型loxP配座や別のloxP変種とは、Cre仲介性の
組換えを受けることができない（15）。Cre仲介性の組
替えの後、得られるloxP配列は、Creによって依然認識
される。その結果、変更されたスペーサー領域を有する
loxP配列は、同じ遺伝系内の以後の連続した組換えに用
いることができない。
【０００９】改変された逆方向反復領域を有するloxP変
種が、植物染色体内の個別の予め存在するloxP配座内へ
の、loxPに挟まれたＤＮＡセグメントの安定な組み込み
を促進するということが報告されている（14）。この組
換えは、両方の逆方向反復配列における改変を含んだ変
異型loxP配列と、野生型である第２のloxP部位との生成
をもたらす（14）。変異を含んだloxP配列はCre組換え
酵素に対する基質としての性質が乏しいとされているが
（14）、この系は全体として不安定（16）、すなわち、
このloxP変異体は、Cre組換え酵素によって標的配列と
して依然認識されることが報告されている。
種が、植物染色体内の個別の予め存在するloxP配座内へ
の、loxPに挟まれたＤＮＡセグメントの安定な組み込み
を促進するということが報告されている（14）。この組
換えは、両方の逆方向反復配列における改変を含んだ変
異型loxP配列と、野生型である第２のloxP部位との生成
をもたらす（14）。変異を含んだloxP配列はCre組換え
酵素に対する基質としての性質が乏しいとされているが
（14）、この系は全体として不安定（16）、すなわち、
このloxP変異体は、Cre組換え酵素によって標的配列と
して依然認識されることが報告されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、多重の連続的な相同組換え、且つ組換え酵素仲介性
の組換えの過程において１の遺伝系内における多重の且
つターゲッティングされた変異を可能にするための、改
良された組換え方法を創り出すことである。この目的
は、独立の請求項に提示されている特徴によって達成さ
れた。本発明の一層好ましい具体例及び改変は、従属請
求項に提示されている。
は、多重の連続的な相同組換え、且つ組換え酵素仲介性
の組換えの過程において１の遺伝系内における多重の且
つターゲッティングされた変異を可能にするための、改
良された組換え方法を創り出すことである。この目的
は、独立の請求項に提示されている特徴によって達成さ
れた。本発明の一層好ましい具体例及び改変は、従属請
求項に提示されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記課題は、認識配列変
異体の同一でないペアを利用する本発明の組換え方法に
よって解決された。該認識配列変異体の各々は、スペー
サーで分離された２個の認識配列からなる。認識配列の
うち一方に変異が導入されており、他方は、野生型に対
応している。配列特異的組換え酵素による組換えの後、
認識配列変異体が生み出され、これは認識配列の両方に
変異を含んでおり、従って組換え酵素によってもはや認
識されない。こうして、それは、更なる組換え酵素仲介
性の組換えには使用できない。この事実の故に、順方向
の反応との平衡状態において通常起こるものである逆反
応（上記）が除去される。従って、この反応は、一方向
である。更には、最初に提供された認識配列変異体（各
々、１個のみの変異配列を有する）が、同一の遺伝系に
おいて数回使用することができる。何故なら、導入され
る他の認識配列（変異配列であろうと野生型であろう
と）と競合可能な配列が、組換えが起こった後には存在
していないからである。
異体の同一でないペアを利用する本発明の組換え方法に
よって解決された。該認識配列変異体の各々は、スペー
サーで分離された２個の認識配列からなる。認識配列の
うち一方に変異が導入されており、他方は、野生型に対
応している。配列特異的組換え酵素による組換えの後、
認識配列変異体が生み出され、これは認識配列の両方に
変異を含んでおり、従って組換え酵素によってもはや認
識されない。こうして、それは、更なる組換え酵素仲介
性の組換えには使用できない。この事実の故に、順方向
の反応との平衡状態において通常起こるものである逆反
応（上記）が除去される。従って、この反応は、一方向
である。更には、最初に提供された認識配列変異体（各
々、１個のみの変異配列を有する）が、同一の遺伝系に
おいて数回使用することができる。何故なら、導入され
る他の認識配列（変異配列であろうと野生型であろう
と）と競合可能な配列が、組換えが起こった後には存在
していないからである。
【００１２】これは、これまで達成されたより高い効率
でＤＮＡ断片を遺伝系に導入する、又は遺伝系における
無数のセグメントを組替える可能性を創り出す。
でＤＮＡ断片を遺伝系に導入する、又は遺伝系における
無数のセグメントを組替える可能性を創り出す。
【００１３】本発明によれば、単一の遺伝系において組
換えによって２又は３回以上の連続的組換えを実行する
ために、２個の同一でない認識配列変異体が使用され、
各々は、互いに同士逆方向に反復するものである認識配
列の一方に変異を含み、他方の認識配列は、野生型認識
配列に対応する。
換えによって２又は３回以上の連続的組換えを実行する
ために、２個の同一でない認識配列変異体が使用され、
各々は、互いに同士逆方向に反復するものである認識配
列の一方に変異を含み、他方の認識配列は、野生型認識
配列に対応する。
【００１４】本発明の文脈において用いられる「認識配
列変異体」の語は、野生型配列内に起こる次のタイプの
変異を含む。すなわち、１個のヌクレオチド又は２個以
上のの近隣のヌクレオチドの点変異、又は数個のヌクレ
オチドに影響する変異、ヌクレオチドの欠失、付加及び
置換。
列変異体」の語は、野生型配列内に起こる次のタイプの
変異を含む。すなわち、１個のヌクレオチド又は２個以
上のの近隣のヌクレオチドの点変異、又は数個のヌクレ
オチドに影響する変異、ヌクレオチドの欠失、付加及び
置換。
【００１５】好ましい一具体例によれば、それら２個の
同一でない認識配列は、loxPの変異体、すなわち、配列
番号１及び６にそれぞれ対応する２個のloxP変異体であ
るlox66及びlox71である。その他のloxPの認識配列変異
体は、配列番号２〜５及び７〜１０に示されている。
同一でない認識配列は、loxPの変異体、すなわち、配列
番号１及び６にそれぞれ対応する２個のloxP変異体であ
るlox66及びlox71である。その他のloxPの認識配列変異
体は、配列番号２〜５及び７〜１０に示されている。
【００１６】特に、単一の遺伝系内で組換え酵素によっ
て多重の組換えを実施するための本発明の方法による組
換え方法は、次のステップを含む：
て多重の組換えを実施するための本発明の方法による組
換え方法は、次のステップを含む：
【００１７】第１に、２種の同一でない認識配列変異体
が、遺伝系に与えられる。ここにいう「遺伝系」とは、
例えば、原核細胞又は真核細胞、更にはまた、動物又は
植物をも意味する。原核細胞系の例は、E. coli, Salmo
nellaの各種、Bacillusの各種、及びバクテリオファー
ジが挙げられる。真核細胞系としては、例えば、ヒト及
び動物の細胞及び体細胞起源の細胞株、マウス、ゼブラ
フィッシュ、ショウジョウバエ、Saccharomyces cerevi
siae、及びアフリカツメガエルが挙げられる。
が、遺伝系に与えられる。ここにいう「遺伝系」とは、
例えば、原核細胞又は真核細胞、更にはまた、動物又は
植物をも意味する。原核細胞系の例は、E. coli, Salmo
nellaの各種、Bacillusの各種、及びバクテリオファー
ジが挙げられる。真核細胞系としては、例えば、ヒト及
び動物の細胞及び体細胞起源の細胞株、マウス、ゼブラ
フィッシュ、ショウジョウバエ、Saccharomyces cerevi
siae、及びアフリカツメガエルが挙げられる。
【００１８】これら２種の同一でない認識配列は、各
々、認識配列（野生型においては「逆方向反復配列」と
いう。）の一方に変異を有し、それらは、互い同士逆方
向に反復したものである。言い換えれば、ある認識配列
変異体の一方の変異した認識配列は、もう１つの認識配
列変異体の変異した認識配列に対して逆方向に反復した
ものである。逆方向に反復している配列とは、一般に、
互いに直接に又は直接的にではなく隣り合い、反転した
相補的な又はほぼ相補的な配列を有するＤＮＡ及びＲＮ
Ａの配列要素をいう。その結果、それらの配列は、所謂
逆方向反復配列を形成する。
々、認識配列（野生型においては「逆方向反復配列」と
いう。）の一方に変異を有し、それらは、互い同士逆方
向に反復したものである。言い換えれば、ある認識配列
変異体の一方の変異した認識配列は、もう１つの認識配
列変異体の変異した認識配列に対して逆方向に反復した
ものである。逆方向に反復している配列とは、一般に、
互いに直接に又は直接的にではなく隣り合い、反転した
相補的な又はほぼ相補的な配列を有するＤＮＡ及びＲＮ
Ａの配列要素をいう。その結果、それらの配列は、所謂
逆方向反復配列を形成する。
【００１９】該変異体に含まれる他方の配列は、野生型
配列に対応している。例えば、両loxP変異体において、
他方の認識配列はそれぞれ、変異していないloxP野生型
に対応する。これら２個のloxP変異体は、組換え部位に
面した側に野生型配列を有するように並べられなければ
ならない。対応するＤＮＡ配列との組換えの過程におい
て、これらの配列は、切り出されて、２個の変異した認
識配列よりなる１つのloxP変異体をもたらす。本発明に
よれば、この変異体は、もはや、Cre組換え酵素によっ
ては認識されず、従って、他のCre仲介性の組換えには
もやは関与しない。
配列に対応している。例えば、両loxP変異体において、
他方の認識配列はそれぞれ、変異していないloxP野生型
に対応する。これら２個のloxP変異体は、組換え部位に
面した側に野生型配列を有するように並べられなければ
ならない。対応するＤＮＡ配列との組換えの過程におい
て、これらの配列は、切り出されて、２個の変異した認
識配列よりなる１つのloxP変異体をもたらす。本発明に
よれば、この変異体は、もはや、Cre組換え酵素によっ
ては認識されず、従って、他のCre仲介性の組換えには
もやは関与しない。
【００２０】本発明による組換え方法の次のステップ
は、上述のように、改変された核酸配列を有する認識配
列変異体を残す組換えを実施するための、配列特異的認
識酵素の誘導を伴ない、この認識配列変異体は、組換え
酵素によってはもはや認識されない。この方法は、更な
る組換えを行うために、所望により何回でも繰り返すこ
とができる。
は、上述のように、改変された核酸配列を有する認識配
列変異体を残す組換えを実施するための、配列特異的認
識酵素の誘導を伴ない、この認識配列変異体は、組換え
酵素によってはもはや認識されない。この方法は、更な
る組換えを行うために、所望により何回でも繰り返すこ
とができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】好ましい一具体例によれば、２個
のloxP変異体であるlox66及びlox71が、本発明の組換え
方法において利用される。これらの方向、及びまた本発
明の他の全ての認識配列変異体の方向（順方向又は逆方
向）は、２個の認識配列の間に位置するスペーサー配列
によって一義的に決定される。通常、組換えは、２個の
認識配列変異体が互い同士順方向に配向している場合に
のみ起こり得る。それぞれの野生型配列が組換え部位に
面した側に位置していることが重要である。すなわち、
例えば、これらのloxP変異体の場合は、次の順序で並ん
でいる必要がある：変異型lox66配列→野生型lox66配列
→野生型lox71配列→変異型lox71配列（又は、この
逆）。ここに開示した核酸配列は、常に、５’→３’方
向に並べたものである。
のloxP変異体であるlox66及びlox71が、本発明の組換え
方法において利用される。これらの方向、及びまた本発
明の他の全ての認識配列変異体の方向（順方向又は逆方
向）は、２個の認識配列の間に位置するスペーサー配列
によって一義的に決定される。通常、組換えは、２個の
認識配列変異体が互い同士順方向に配向している場合に
のみ起こり得る。それぞれの野生型配列が組換え部位に
面した側に位置していることが重要である。すなわち、
例えば、これらのloxP変異体の場合は、次の順序で並ん
でいる必要がある：変異型lox66配列→野生型lox66配列
→野生型lox71配列→変異型lox71配列（又は、この
逆）。ここに開示した核酸配列は、常に、５’→３’方
向に並べたものである。
【００２２】一具体例によれば、本発明の組換え方法に
おいて、配列番号１〜５の認識配列変異体は、５’→
３’方向で、配列ATTCC及びTCTCGに挟まれており、配列
番号６〜１０の認識配列変異体は、５’→３’方向で、
配列GCTTC及びCTCTTに挟まれている。
おいて、配列番号１〜５の認識配列変異体は、５’→
３’方向で、配列ATTCC及びTCTCGに挟まれており、配列
番号６〜１０の認識配列変異体は、５’→３’方向で、
配列GCTTC及びCTCTTに挟まれている。
【００２３】Cre組換え酵素は、例えば、Cre組換え酵素
をコードするベクターによる等の遺伝系における発現に
よって産生することができる。
をコードするベクターによる等の遺伝系における発現に
よって産生することができる。
【００２４】上述のように、本発明の遺伝系は、例え
ば、細菌、酵母、植物又は哺乳類細胞等のような、原核
細胞でも真核細胞でもよい。同様に、該遺伝系は、プラ
スミド等のような定義され単離された核酸よりなるもの
であってもよい。
ば、細菌、酵母、植物又は哺乳類細胞等のような、原核
細胞でも真核細胞でもよい。同様に、該遺伝系は、プラ
スミド等のような定義され単離された核酸よりなるもの
であってもよい。
【００２５】本発明による組換え方法の過程において起
こる組換えは、あるＤＮＡ配列の挿入又は切除を含むこ
とができる。
こる組換えは、あるＤＮＡ配列の挿入又は切除を含むこ
とができる。
【００２６】例えば、切除の過程においては、マーカー
遺伝子を含んだＤＮＡ配列を切除してよい。このましく
は、これらのマーカー遺伝子は、例えば、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する
耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子であってよい。
遺伝子を含んだＤＮＡ配列を切除してよい。このましく
は、これらのマーカー遺伝子は、例えば、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する
耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子であってよい。
【００２７】染色体外のプラスミド等のような可動性の
遺伝要素上に存在するＤＮＡセグメントの挿入のために
は、開始時の状況は例えば次の通りである：該ＤＮＡセ
グメントの左側をlox66認識配列で、右側をlox71認識配
列で、挟むことができる。これら２個のloxP変種の配向
は、同一方向とする。挿入すべきＤＮＡセグメントは、
問題の遺伝子又は遺伝要素に隣接した位置にある適当な
マーカー遺伝子を更に含む。好ましくは、更に、単一の
lox66認識配列が細胞の染色体上に存在し、標的配列と
して働く。Creの発現の後、次の構造（左から右）が形
成される。すなわち、lockP−挿入されたＤＮＡセグメ
ント−lox66。この仕方で、逆反応、すなわち挿入ＤＮ
Ａの切除は、lockP認識配列が封鎖されているため、不
可能である。依然存在するlox66認識配列は、更なる挿
入に使用してよい。
遺伝要素上に存在するＤＮＡセグメントの挿入のために
は、開始時の状況は例えば次の通りである：該ＤＮＡセ
グメントの左側をlox66認識配列で、右側をlox71認識配
列で、挟むことができる。これら２個のloxP変種の配向
は、同一方向とする。挿入すべきＤＮＡセグメントは、
問題の遺伝子又は遺伝要素に隣接した位置にある適当な
マーカー遺伝子を更に含む。好ましくは、更に、単一の
lox66認識配列が細胞の染色体上に存在し、標的配列と
して働く。Creの発現の後、次の構造（左から右）が形
成される。すなわち、lockP−挿入されたＤＮＡセグメ
ント−lox66。この仕方で、逆反応、すなわち挿入ＤＮ
Ａの切除は、lockP認識配列が封鎖されているため、不
可能である。依然存在するlox66認識配列は、更なる挿
入に使用してよい。
【００２８】本発明の組換え方法は、更なる組換えの間
に、最初の組換えによって作り出されたloxP変異体が、
更なる組換えによって提供されるloxP変異体と同じ方向
を持っている場合に、すなわち、スペーサーに対して順
方向（同じ方向）である場合に、最も信頼性が高い。
「方向」の語に関して上記の説明は、lox66及びlox77に
ついても同様に当てはまる。
に、最初の組換えによって作り出されたloxP変異体が、
更なる組換えによって提供されるloxP変異体と同じ方向
を持っている場合に、すなわち、スペーサーに対して順
方向（同じ方向）である場合に、最も信頼性が高い。
「方向」の語に関して上記の説明は、lox66及びlox77に
ついても同様に当てはまる。
【００２９】以下に、本発明が、実施例並びに添付の図
面により、更に詳細に記述されよう。図面は以下を示し
ている。
面により、更に詳細に記述されよう。図面は以下を示し
ている。
【００３０】図１： 野生型（loxP）及び変異型loxP
（lox66／lox71）配列のターゲティングされたヌクレオ
チド配列。両側を挟む領域、逆方向反復配列及びスペー
サー領域が、空白で分離されている。数字は、それら逆
方向反復配列の内部のヌクレオチドの位置を示す。変異
を起こしたヌクレオチドは、小文字で表されている。
（lox66／lox71）配列のターゲティングされたヌクレオ
チド配列。両側を挟む領域、逆方向反復配列及びスペー
サー領域が、空白で分離されている。数字は、それら逆
方向反復配列の内部のヌクレオチドの位置を示す。変異
を起こしたヌクレオチドは、小文字で表されている。
【００３１】図２： Cre仲介性の組換えの頻度。組換
え酵素Creは、プラスミドp2724又はp2725を含んだE. co
li中、30℃終夜の条件で一過性に発現される。細胞が収
穫され、プラスミドが標準的な方法によって単離され
た。アンピシリンを含むＬＢアガープレートに播いたE.
coli中に、各プラスミド調製物10ｐｇをトランスフォ
ームした。アンピシリン（Amp）又はクロラムフェニコ
ール（Cm）又はテトラサイクリン（Tc）を含有するＬＢ
プレート上へ、コロニーをレプリカ平板法で移した。３
種の抗生物質のこの組み合わせで増殖するのは、組換え
が起こらなかったことを示していた。アンピシリン及び
クロラムフェニコールに対して耐性だがテトラサイクリ
ンに対し感受性であるのは、lockPではなく、lox66とlo
x71との間におけるCre仲介性の組換えに対応している。
他の何れの表現型も、望んだものとは異なった組換えを
示している。種々の抗生物質の存在下における、レプリ
カ平板法により移したコロニーの表現型の頻度が示され
ている。全部で208個のコロニーが、各試験プラスミド
について評価された。
え酵素Creは、プラスミドp2724又はp2725を含んだE. co
li中、30℃終夜の条件で一過性に発現される。細胞が収
穫され、プラスミドが標準的な方法によって単離され
た。アンピシリンを含むＬＢアガープレートに播いたE.
coli中に、各プラスミド調製物10ｐｇをトランスフォ
ームした。アンピシリン（Amp）又はクロラムフェニコ
ール（Cm）又はテトラサイクリン（Tc）を含有するＬＢ
プレート上へ、コロニーをレプリカ平板法で移した。３
種の抗生物質のこの組み合わせで増殖するのは、組換え
が起こらなかったことを示していた。アンピシリン及び
クロラムフェニコールに対して耐性だがテトラサイクリ
ンに対し感受性であるのは、lockPではなく、lox66とlo
x71との間におけるCre仲介性の組換えに対応している。
他の何れの表現型も、望んだものとは異なった組換えを
示している。種々の抗生物質の存在下における、レプリ
カ平板法により移したコロニーの表現型の頻度が示され
ている。全部で208個のコロニーが、各試験プラスミド
について評価された。
【００３２】
【実施例】以下の試験系は、loxPの逆方向反復配列内の
特定の変異が、効果的に組換えを起こすがしかし１回の
Cre仲介性の組換えの後は全く抵抗性のloxP部位を与え
る、変異したloxP配列をもたらすことを示している。
特定の変異が、効果的に組換えを起こすがしかし１回の
Cre仲介性の組換えの後は全く抵抗性のloxP部位を与え
る、変異したloxP配列をもたらすことを示している。
【００３３】loxP試験系のクローニングは、pACYC184に
基づいている。テトラサイクリン耐性遺伝子が、HindII
I及びAvaIで切り出され、続いて２つの変異したloxP配
列であるlox66及びlox71（図１）を含んだ断片の挿入が
行われた。lox66及びlox71を含んだこのＤＮＡ断片は、
２個の重複部分を有するオリゴヌクレオチドのアニーリ
ング（5'-GGGAAGCTTCTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGT
TATCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCC-3' （配列番号１１）及
び 5'-CCCCCGAGATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATG
GAATGGACGATATCCCGCAAGAG-3' （配列番号１２））、ク
レノウ酵素による二本鎖ＤＮＡ断片の合成、及びHindII
I及びAvaIによる消化によって作り出した。このプラス
ミドをp2627と名づけた。
基づいている。テトラサイクリン耐性遺伝子が、HindII
I及びAvaIで切り出され、続いて２つの変異したloxP配
列であるlox66及びlox71（図１）を含んだ断片の挿入が
行われた。lox66及びlox71を含んだこのＤＮＡ断片は、
２個の重複部分を有するオリゴヌクレオチドのアニーリ
ング（5'-GGGAAGCTTCTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGT
TATCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCC-3' （配列番号１１）及
び 5'-CCCCCGAGATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATG
GAATGGACGATATCCCGCAAGAG-3' （配列番号１２））、ク
レノウ酵素による二本鎖ＤＮＡ断片の合成、及びHindII
I及びAvaIによる消化によって作り出した。このプラス
ミドをp2627と名づけた。
【００３４】次のステップにおいて、プラスミドpACYC1
84のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだEco47III断片
が、p2627の２個の変異型loxP配列の間にある唯一のEco
RV認識配列中に挿入されたp2632を生じた。このプラス
ミドを、AseIで切断しそして部分的にPvuIIで切断し
た。２個の変異型loxP部位によって挟まれたテトラサイ
クリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と
共に含んだ断片が、NdeI及びSmaIで消化したpUC19中に
挿入された。得られたプラスミドはp2722と名づけら
れ、これは３種の抗生物質耐性遺伝子を含み、それらの
１つが変異型loxP配座に挟まれている。
84のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだEco47III断片
が、p2627の２個の変異型loxP配列の間にある唯一のEco
RV認識配列中に挿入されたp2632を生じた。このプラス
ミドを、AseIで切断しそして部分的にPvuIIで切断し
た。２個の変異型loxP部位によって挟まれたテトラサイ
クリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と
共に含んだ断片が、NdeI及びSmaIで消化したpUC19中に
挿入された。得られたプラスミドはp2722と名づけら
れ、これは３種の抗生物質耐性遺伝子を含み、それらの
１つが変異型loxP配座に挟まれている。
【００３５】p2722を含んだE. coli細胞が、第２のプラ
スミドp2676でトランスフェクトされた。このプラスミ
ドは、pSC101（17）の温度感受性起点を介して複製し、
Cre並びにカナマイシン耐性遺伝子をコードする。カナ
マイシン存在下における30℃終夜での該細胞の増殖は、
Creによる常在性プラスミドp2722中のテトラサイクリン
耐性遺伝子の除去をもたらし、続いて、テトラサイクリ
ン感受性コロニーの42℃における増殖が行われ、これは
p2676の喪失をもたらす。得られるプラスミドp2723は、
今や、組換えられた変異型loxP配座（lockPと呼ばれ
る）を有しており、そのことはＤＮＡ配列決定によって
確認された。
スミドp2676でトランスフェクトされた。このプラスミ
ドは、pSC101（17）の温度感受性起点を介して複製し、
Cre並びにカナマイシン耐性遺伝子をコードする。カナ
マイシン存在下における30℃終夜での該細胞の増殖は、
Creによる常在性プラスミドp2722中のテトラサイクリン
耐性遺伝子の除去をもたらし、続いて、テトラサイクリ
ン感受性コロニーの42℃における増殖が行われ、これは
p2676の喪失をもたらす。得られるプラスミドp2723は、
今や、組換えられた変異型loxP配座（lockPと呼ばれ
る）を有しており、そのことはＤＮＡ配列決定によって
確認された。
【００３６】最後の２つの試験プラスミドは、クレノウ
酵素で平滑末端としたAseI／AvaI断片を、同じ仕方で変
更したp2723のBamHI部位に挿入することによって作成さ
れた。ここに該断片は、p2632由来のものである。このp
2632由来AseI／AvaI断片は、pACYC184のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を挟んでいる２個の変異型loxP配列である
lox26及びlox71を含んでいる。最後の２つのプラスミド
p2724及びp2725（図２）は、lockP部位に対して、両方
のあり得る方向でテトラサイクリン耐性遺伝子を挟んで
いるlox66／lox71を有し、クロラムフェニコール及びア
ンピシリンに対する耐性をコードする配座を有している
（図２）。両方の試験プラスミド、p2724及びp2725（図
２）は、３種の抗生物質耐性遺伝子の同一の組を有する
が、３個のloxP変種であるlox66、lox71及びlockPの方
向に関しては異なっている。p2724においては３つのlox
P配座の全てが同じ方向に並んでおり、一方、p2725にお
いてはlox66及びlox71配座及びそれらの間のテトラサイ
クリン耐性遺伝子が、lockP配座に対して、それらの８
ｂｐのスペーサー配列に関して逆方向になっている（図
１）。p2724又はp2725を有するE. coli細胞を、Creをコ
ードしておりカナマイシン耐性を提供し且つ温度感受性
のＤＮＡ複製起点を介して複製するものである発現プラ
スミド（p2676）で形質転換した。ＤＮＡ形質転換及び3
0℃（p2676に許容される温度）での表現型発現の１時間
後、カナマイシン及びアンピシリンが液状の培養物に加
えられ、細胞が16時間連続培養された。細胞質のＤＮＡ
を調製し、10ｐｇを、標準の手順を用いて（18）E. col
i株DH5αにトランスフェクトした。アンピシリン含有の
ＬＢプレートに細胞を播き、37℃にて終夜おいた。37℃
終夜インキュベーションの後、アンピシリン、アンピシ
リン／テトラサイクリン、アンピシリン／クロラムフェ
ニコール、及びアンピシリン／テトラサイクリン／クロ
ラムフェニコールの組み合わせを含有したレプリカプレ
ート上でアンピシリン耐性細胞を検査した。異なった抗
生物質の存在下におけるこれら異なったレプリカプレー
ト上のコロニーの数は、Creによって組換えられたloxP
部位の有用性に関する最初の指標を与えた（図２）。
酵素で平滑末端としたAseI／AvaI断片を、同じ仕方で変
更したp2723のBamHI部位に挿入することによって作成さ
れた。ここに該断片は、p2632由来のものである。このp
2632由来AseI／AvaI断片は、pACYC184のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を挟んでいる２個の変異型loxP配列である
lox26及びlox71を含んでいる。最後の２つのプラスミド
p2724及びp2725（図２）は、lockP部位に対して、両方
のあり得る方向でテトラサイクリン耐性遺伝子を挟んで
いるlox66／lox71を有し、クロラムフェニコール及びア
ンピシリンに対する耐性をコードする配座を有している
（図２）。両方の試験プラスミド、p2724及びp2725（図
２）は、３種の抗生物質耐性遺伝子の同一の組を有する
が、３個のloxP変種であるlox66、lox71及びlockPの方
向に関しては異なっている。p2724においては３つのlox
P配座の全てが同じ方向に並んでおり、一方、p2725にお
いてはlox66及びlox71配座及びそれらの間のテトラサイ
クリン耐性遺伝子が、lockP配座に対して、それらの８
ｂｐのスペーサー配列に関して逆方向になっている（図
１）。p2724又はp2725を有するE. coli細胞を、Creをコ
ードしておりカナマイシン耐性を提供し且つ温度感受性
のＤＮＡ複製起点を介して複製するものである発現プラ
スミド（p2676）で形質転換した。ＤＮＡ形質転換及び3
0℃（p2676に許容される温度）での表現型発現の１時間
後、カナマイシン及びアンピシリンが液状の培養物に加
えられ、細胞が16時間連続培養された。細胞質のＤＮＡ
を調製し、10ｐｇを、標準の手順を用いて（18）E. col
i株DH5αにトランスフェクトした。アンピシリン含有の
ＬＢプレートに細胞を播き、37℃にて終夜おいた。37℃
終夜インキュベーションの後、アンピシリン、アンピシ
リン／テトラサイクリン、アンピシリン／クロラムフェ
ニコール、及びアンピシリン／テトラサイクリン／クロ
ラムフェニコールの組み合わせを含有したレプリカプレ
ート上でアンピシリン耐性細胞を検査した。異なった抗
生物質の存在下におけるこれら異なったレプリカプレー
ト上のコロニーの数は、Creによって組換えられたloxP
部位の有用性に関する最初の指標を与えた（図２）。
【００３７】両方の試験プラスミドの場合、３種の抗生
物質全ての存在下に増殖するコロニーは、何らの組換え
も起こらなかったものであろう。代りとして、それらの
コロニーは、異なったloxP部位の間に逆方向のＤＮＡセ
グメントを有する改変された試験プラスミドを含む可能
性がある。アンピシリン及びクロラムフェニコールの存
在下に増殖するがテトラサイクリンの存在下には増殖し
ないコロニーは、予期されるように、lox66及びlox71の
間で、しかしlockPを介さずに組換えが起こったものと
推定される。クロラムフェニコール耐性の喪失又はクロ
ラムフェニコール及びテトラサイクリンの両方の耐性喪
失は、Creによる組換えにおいてlockP配座が関与し所望
の組換えが起こったことを示すであろう（図２）。
物質全ての存在下に増殖するコロニーは、何らの組換え
も起こらなかったものであろう。代りとして、それらの
コロニーは、異なったloxP部位の間に逆方向のＤＮＡセ
グメントを有する改変された試験プラスミドを含む可能
性がある。アンピシリン及びクロラムフェニコールの存
在下に増殖するがテトラサイクリンの存在下には増殖し
ないコロニーは、予期されるように、lox66及びlox71の
間で、しかしlockPを介さずに組換えが起こったものと
推定される。クロラムフェニコール耐性の喪失又はクロ
ラムフェニコール及びテトラサイクリンの両方の耐性喪
失は、Creによる組換えにおいてlockP配座が関与し所望
の組換えが起こったことを示すであろう（図２）。
【００３８】期待された表現型のパターン（クロラムフ
ェニコール及びアンピシリン耐性、テトラサイクリン感
受性）を示した、試験プラスミドp2724及びp2725の何れ
かを用いて実験で得られた８つのコロニー、及び、表現
型（クロラムフェニコール、アンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性）が示すところでは如何なる組換えも起
こらなかったプラスミド2725からの48のコロニーを、制
限酵素分析により更に検討した。独立のコロニーからの
全てのプラスミドＤＮＡは、レプリカ平板培養によって
決定された表現型から期待された予想通りの制限酵素パ
ターンを示した（データ示さず）。異なったloxP配座に
間にＤＮＡセグメントの反転が起こっていたものは１例
も見出せなかった。予期せぬ制限パターンを示した試験
プラスミドp2725からの５つのクローンは、p2725の完全
な再配列を受けており、これは、変異したloxP配列のCr
eを介した何れの使用によっても説明できなかった（デ
ータ示さず）。変異したlockP配列がCreの基質として働
いたものは１例もなかった。
ェニコール及びアンピシリン耐性、テトラサイクリン感
受性）を示した、試験プラスミドp2724及びp2725の何れ
かを用いて実験で得られた８つのコロニー、及び、表現
型（クロラムフェニコール、アンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性）が示すところでは如何なる組換えも起
こらなかったプラスミド2725からの48のコロニーを、制
限酵素分析により更に検討した。独立のコロニーからの
全てのプラスミドＤＮＡは、レプリカ平板培養によって
決定された表現型から期待された予想通りの制限酵素パ
ターンを示した（データ示さず）。異なったloxP配座に
間にＤＮＡセグメントの反転が起こっていたものは１例
も見出せなかった。予期せぬ制限パターンを示した試験
プラスミドp2725からの５つのクローンは、p2725の完全
な再配列を受けており、これは、変異したloxP配列のCr
eを介した何れの使用によっても説明できなかった（デ
ータ示さず）。変異したlockP配列がCreの基質として働
いたものは１例もなかった。
【００３９】要約すると、我々の分析は、２個の変異型
loxP配座lox66及びlox71の間におけるCre仲介性の組換
えが、これらのloxP配座がp2724におけるように順方向
に並んでいる場合に効率よく起こることを示している。
試験プラスミドp2725でのCre仲介性の組換えの効率が低
い理由は明らかでない。このプラスミドは、loxP配列を
２つの方向で含み、これがCreの組換え活性を妨害して
いるのかも知れない。しかしながら、全ての例におい
て、得られるlockP配列がCreによる組換えに対し完全に
抵抗性であることは一層重要なことであり、これは先行
する部位特異的Cre組換えの結果としてのlockPの機能的
不活性化を示している。
loxP配座lox66及びlox71の間におけるCre仲介性の組換
えが、これらのloxP配座がp2724におけるように順方向
に並んでいる場合に効率よく起こることを示している。
試験プラスミドp2725でのCre仲介性の組換えの効率が低
い理由は明らかでない。このプラスミドは、loxP配列を
２つの方向で含み、これがCreの組換え活性を妨害して
いるのかも知れない。しかしながら、全ての例におい
て、得られるlockP配列がCreによる組換えに対し完全に
抵抗性であることは一層重要なことであり、これは先行
する部位特異的Cre組換えの結果としてのlockPの機能的
不活性化を示している。
【００４０】この結果は、２つの理由から驚くべきこと
である。第１に、同じコア部位であるlox66とlox71（lo
xPモチーフを挟む異なったヌクレオチドを含んだ図１）
につき、野生型loxPに比べて効率が低いものの、Creの
基質であることが報告されている。にも拘わらず、lox6
6及びlox71配座は、lockPモチーフが形成された後、組
換え活性の約１／５を保持していた（14）。第２に、Cr
eのタンパク質構造は、生化学的結合の実験結果と共
に、loxPの２、３、６及び７位（図１）が、loxPへのCr
eの結合に最も重要であり、これに対して、９位を超え
る位置は、標的モチーフへのCreの結合に余り重要でな
いように思われた（19、20）。
である。第１に、同じコア部位であるlox66とlox71（lo
xPモチーフを挟む異なったヌクレオチドを含んだ図１）
につき、野生型loxPに比べて効率が低いものの、Creの
基質であることが報告されている。にも拘わらず、lox6
6及びlox71配座は、lockPモチーフが形成された後、組
換え活性の約１／５を保持していた（14）。第２に、Cr
eのタンパク質構造は、生化学的結合の実験結果と共
に、loxPの２、３、６及び７位（図１）が、loxPへのCr
eの結合に最も重要であり、これに対して、９位を超え
る位置は、標的モチーフへのCreの結合に余り重要でな
いように思われた（19、20）。
【００４１】この実施例で試験したこれら２つのloxP配
列は、部位特異的組換えの後には、それらの組換え効率
が完全に失われていた。この理由により、loxP−Creに
よる多重の連続的組換えを、単一の細胞内において又は
単一のＤＮＡ分子内においてさえ、行うことができる。
列は、部位特異的組換えの後には、それらの組換え効率
が完全に失われていた。この理由により、loxP−Creに
よる多重の連続的組換えを、単一の細胞内において又は
単一のＤＮＡ分子内においてさえ、行うことができる。
【００４２】参考文献
1. Sternberg, N., Austin, S., Hamilton, D. and Ya
rmolinsky, M. (1978) Analysis of bacteriophage P1
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ecombinase resides in the 25 kDa carboxyl domain o
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targeting - a practical approach. 2nd Ed. Oxford U
niversity Press, Oxford, pp. 37-99. 5. ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・ess, Oxford. 6. Shizuya, H., Birren, B., Kim, U.J., Mancino,
V., Slepak, T., Tachiiri, Y. and Simon, M. (1992)
Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pai
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sel, P.M., Shizuya, H., Chen, C., Batzer, M.A. and
de Jong, P.J. (1994) A new bacteriophage P1-deriv
ed vector for the propagation of large human DNA f
ragments. Nat Genet, 6, 84-89. 8. Shepherd, N.S., Pfrogner, B.D., Coulby, J.N.,
Ackerman, S.L., Vaidyanathan, G., Sauer, R.H., Bal
kenhol, T.C. and Sternberg, N. (1994) Preparation
and screening of an arrayed human genomic library
generated with the P1 cloning system. Proc Natl Ac
ad Sci U S A, 91, 2629-2633. 9. O'Connor, M., Peifer, M. and Bender, W. (1989)
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coli. Science, 244,1307-1312. 10. Kempkes, B., Pich, D., Zeidler, R. and Hammer
schmidt, W. (1995) Immortalization of human primar
y B-lymphocytes in vitro with DNA. Proc NatlAcad S
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(2000) Forward with BACs: new tools for herpesvir
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ificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic A
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de sequences of loxP spacer region in Cre-mediated
recombination. Gene, 216, 55-65. 14. Albert, H., Dale, E.C., Lee, E. and Ow, D.W.
(1995) Site-specific integration of DNA into wild-
type and mutant lox sites placed in the plant geno
me. Plant J, 7, 649-659. 15. Sauer, B. (1996) Multiplex Cre/lox recombinat
ion permits selectivesite-specific DNA targeting t
o both a natural and an engineered site inthe yeas
t genome. Nucleic Acids Res, 24, 4608-4613. 16. Araki, K., Araki, M. and Yamamura, K. (1997)
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in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res,25, 86
8-872. 17. Chung, C.T., Niemela, S.L. and Miller, R.H.
(1989) One-step preparation of competent Escherich
ia coli: transformation and storage of bacterial c
ells in the same solution. Proc Natl Acad Sci U S
A, 86, 2172-2175. 18. Hanahan, D. (1985) Techniques for transformat
ion of E. coli. In Glover, D. (ed.), DNA cloning.
A practical approach. IRL Press, Oxford, Vol. 11 p
p. 109-135. 19. Hartung, M. and Kisters-Woike, B. (1998) Cre
mutants with altered DNA binding properties. J Bio
l Chem, 273, 22884-22891. 20. Guo, F., Gopaul, D.N., and van Duyne, G.D. (1
997) Structure of Crerecombinase complexed with DN
A in
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d to the lox recombining site. Nucleic AcidsRes, 2
0, 4451-4455. 3. Hoess, R., Abremski, K., Irwin, S., Kendall,
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ecombinase resides in the 25 kDa carboxyl domain o
f the protein. J Mol Biol, 216, 873-882. 4. Dymecki, S.M. (2000) Site-specific recombinati
on in cells and mice.In Joyner, A. L. (ed.), Gene
targeting - a practical approach. 2nd Ed. Oxford U
niversity Press, Oxford, pp. 37-99. 5. ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・ess, Oxford. 6. Shizuya, H., Birren, B., Kim, U.J., Mancino,
V., Slepak, T., Tachiiri, Y. and Simon, M. (1992)
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r fragments of human DNA in Escherichia coli using
an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S
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ed vector for the propagation of large human DNA f
ragments. Nat Genet, 6, 84-89. 8. Shepherd, N.S., Pfrogner, B.D., Coulby, J.N.,
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Construction of largeDNA segments in Escherichia
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type and mutant lox sites placed in the plant geno
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ion permits selectivesite-specific DNA targeting t
o both a natural and an engineered site inthe yeas
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Targeted integration of DNA using mutant lox sites
in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res,25, 86
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mutants with altered DNA binding properties. J Bio
l Chem, 273, 22884-22891. 20. Guo, F., Gopaul, D.N., and van Duyne, G.D. (1
997) Structure of Crerecombinase complexed with DN
A in
【００４３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundheit GmbH
<120> The use of mutated recognition sequences for multiple consecutive
recombinase-mediated recombinations in a genetic system
<130> P173-02
<150> DE 101 40 030.6
<151> 2001-08-16
<160> 15
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide lox 66 without flanks
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgcac ggta 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 3
ataacttcgt atagcataca ttatacgccc ggta 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 4
ataacttcgt atagcataca ttataggtac cgta 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 5
ataacttcgt atagcataca ttatacgtac cggg 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide lox 71 without flanks
<400> 6
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 7
tagcgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 8
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 9
taccgggcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 10
aatgcatgct atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 11
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 11
gggaagcttc taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttatctcttg cgggatatcg 60
tccattcc 68
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide
<400> 12
cccccgagat accgttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatggaatgg acgatatccc 60
gcaagag 67
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide loxP
<400> 13
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide lox 66 with flanks
<400> 14
attccataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtat ctcg 44
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Description of artificial sequence:
Oligonucleotide lox 71 with flanks
<400> 15
gcttctaccg ttcgtatagc atacattata cgaagttatc tctt 44
【図１】 野生型（loxP）及び変異型loxP（lox66／lox
71）配列のターゲティングされたヌクレオチド配列の比
較。
71）配列のターゲティングされたヌクレオチド配列の比
較。
【図２】 Cre仲介性の組換えの頻度を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ベルンハルト ノイヒール
ドイツ連邦共和国Ｄ−80689ミュンヘン、
ヴァストル・ヴィット・シュトラーセ56
(72)発明者 ヴォルフガンク ハンマーシュミット
ドイツ連邦共和国Ｄ−80686ミュンヘン、
エンデルハウザーシュトラーセ３ａ
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA06 DA06
EA04 FA01 FA10 FA11 GA11
HA01 HA08
Claims (19)
- 【請求項１】単一の遺伝系において配列特異的な組換え
酵素によって２つ又は３つ以上の組換えを行うための、
配列特異的な組換え酵素のための２つの同一でない認識
配列変異体の使用であって、該認識配列変異体の各々
が、スペーサー配列で分離された２つの認識配列を含
み、そして変異体の各々が、互い同士逆方向に反復して
いるそれら認識配列のうちの一方に変異を有し且つ他方
の認識配列は野生型認識配列に対応しているものであ
る、認識配列変異体の使用。 - 【請求項２】該認識配列変異体が、Cre／loxP系におい
て使用されるものである、請求項１の使用。 - 【請求項３】配列番号１及び配列番号６の２つのloxP変
異体であるlox66及びlox71が用いられるものである、請
求項２の使用。 - 【請求項４】認識配列として配列番号２ないし５及び配
列番号７ないし１０に示した配列の何れかが使用される
ものである、請求項２又は３の使用。 - 【請求項５】配列番号１ないし５の何れかの認識配列変
異体が、５’→３’方向に、配列ATTCC及びTCTCGによっ
て挟まれており、且つ、配列番号６ないし１０の何れか
の認識配列変異体が、配列GCTTC及びCTCTTによって挟ま
れているものである、請求項３又は４の使用。 - 【請求項６】該認識配列変異体が、Saccharomyces cere
visiae F1p-FRT、Zygosaccharomyces rouxii pSR1、レ
ソルバーゼ−rfsF又はファージMu Gin組換え酵素系との
関連において使用されるものである、請求項１の使用。 - 【請求項７】単一の遺伝系において組換え酵素によって
多重組換えを行うための組換えの方法であって、（ａ）
配列特異的な組換え酵素のための２つの同一でない認識
配列変異体であって、該認識配列変異体の各々が、スペ
ーサー配列で分離された２つの認識配列を含み、そして
変異体の各々が、互い同士逆方向に反復しているそれら
認識配列のうちの一方に変異を有し且つ他方の認識配列
は野生型認識配列に対応しており、該２つの認識配列変
異体が、それらの野生型配列を組換え部位に面した有す
る側に並べられているものである認識配列変異体を準備
するステップと、（ｂ）組換えを行うために配列特異的
な組換え酵素を誘導して、該組換え酵素によってはもは
や認識されない認識配列変異体を残すステップと、
（ｃ）上記ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）を、更な
る組換えを行うために反復するステップと、を含む方
法。 - 【請求項８】Cre組換え酵素が使用され、該２つのloxP
変異体が配列番号１及び６のlox66及びlox71である、請
求項７の方法。 - 【請求項９】Cre組換え酵素が使用され、且つ、認識配
列変異体として、配列番号２ないし５及び配列番号７な
いし１０に示した配列の何れかが使用されるものであ
る、請求項７の方法。 - 【請求項１０】配列番号１ないし５の認識配列変異体が
５’→３’方向に、配列ATTCC及びTCTCGによって挟まれ
ており、且つ、配列番号６ないし１０の該認識配列変異
体が配列GCTTC及びCTCTTによって挟まれているものであ
る、請求項８又は９の方法。 - 【請求項１１】Cre組換え酵素が該遺伝系内において発
現されるベクターにコードされているものである、請求
項８ないし１０の何れかの方法。 - 【請求項１２】該認識配列変異体が、Saccharomyces ce
revisiae F1p-FRT、Zygosaccharomyces rouxii pSR1、
レソルバーゼ−rfsF又はファージMu Gin組換え酵素系と
の関連において使用されるものである、請求項７の方
法。 - 【請求項１３】該組換えがＤＮＡ配列の挿入を含むもの
である、請求項７ないし１２の何れかの組換え方法。 - 【請求項１４】該組換えがＤＮＡ配列の切除を含むもの
である、請求項７ないし１２の何れかの組換え方法。 - 【請求項１５】該ＤＮＡ配列がマーカー遺伝子である、
請求項１４の組換え方法。 - 【請求項１６】該マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子
である、請求項１５の組換え方法。 - 【請求項１７】該抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する
耐性を与えるものである、請求項１６の組換え方法。 - 【請求項１８】最初の組換えで作り出された該loxP変異
体が、更なる組換えを行うために提供されるloxP変異体
と同じ方向を有するものである、請求項８ないし１１の
何れかの方法。 - 【請求項１９】配列番号２ないし５及び配列番号７ない
し１０の核酸配列の何れかによって特徴付けられるもの
である認識配列変異体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10140030A DE10140030C1 (de) | 2001-08-16 | 2001-08-16 | Einsatz mutierter Erkennungssequenzen für mehrfache aufeinander folgende Rekombinase-vermittelte Rekombinationen in einem genetischen System |
| DE10140030:6 | 2001-08-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116551A true JP2003116551A (ja) | 2003-04-22 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002235346A Withdrawn JP2003116551A (ja) | 2001-08-16 | 2002-08-13 | １つの遺伝系における組換え酵素による多重連続組換えのための、認識配列変異体の使用 |
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| JP (1) | JP2003116551A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2007110695A2 (en) * | 2005-10-13 | 2007-10-04 | Bc Cancer Agency | Modular genomes for synthetic biology and metabolic engineering |
| DE102008051708A1 (de) * | 2008-10-06 | 2010-04-08 | Universität Tübingen | Ortsspezifische Rekombination zur Genaktivierung in genetischen Systemen |
| CN110914414A (zh) | 2017-06-14 | 2020-03-24 | 德累斯顿工业大学 | 利用设计dna重组酶遗传改变基因组的方法与手段 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE460492T1 (de) * | 1999-07-14 | 2010-03-15 | Transgenic Inc | ßGEN-FALLEN-VEKTORß UND VERFAHREN ZUM ßEINFANGENß VON GENEN MITTELS DIESES VEKTORS |
| EP1092768A1 (en) * | 1999-10-16 | 2001-04-18 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Conditional gene trapping construct for the disruption of genes |
-
2001
- 2001-08-16 DE DE10140030A patent/DE10140030C1/de not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-31 EP EP02016913A patent/EP1288295A3/de not_active Withdrawn
- 2002-08-07 US US10/214,722 patent/US20030082723A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-13 JP JP2002235346A patent/JP2003116551A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1288295A2 (de) | 2003-03-05 |
| US20030082723A1 (en) | 2003-05-01 |
| DE10140030C1 (de) | 2002-12-19 |
| EP1288295A3 (de) | 2003-03-12 |
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