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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Erkennungssequenzen für
ortsspezifische Rekombinasen zur Aktivierung eines Zielgens in einem
genetischen System sowie ein entsprechendes Verfahren hierfür.
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Als
Transkription wird das Umschreiben eines Gens von DNA in RNA verstanden.
Mit anderen Worten wird durch die Transkription ein Gen abgelesen.
Das Ergebnis des Transkriptionsvorganges ist eine zu einem abgelesenen
DNA-Matrizenstrang komplementäre Messenger-RNA (mRNA).
Durch Translation der mRNA, sowie sich gegebenenfalls daran anschließende
posttranslationale Modifikationen, wird in der Regel ein funktionsfähiges
Genprodukt, ein Protein, erhalten.
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Die
künstliche Genregulation in bakteriellen Systemen basiert
derzeit hauptsächlich auf der Kontrolle der Transkription.
In den meisten Fällen beruht die künstliche Genregulation
dabei auf der Regulation der Transkriptionsinitiation. Hierzu ist
dem zu exprimierenden Gen in der Regel ein regulierbarer Promotor
vorgeschaltet, der eine Bindestelle für einen Repressor
aufweist. Durch die Bindung des Repressors an den Promotor wird
das zu exprimierende Gen inaktiviert. Durch Zugabe eines geeigneten
Induktors löst sich der Repressor vom Promotor ab, wodurch die
Transkription initiiert wird. Problematisch bei dieser Art der Genregulation
ist, dass in manchen Fällen bei einer Inaktivierung eines
Gens in der in diesem Abschnitt beschriebenen Art und Weise eine
gewisse Hintergrund- bzw. Basalaktivität des Gens oftmals nicht
vollständig verhindert werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt sich deswegen die Aufgabe, eine alternative
Möglichkeit der Genregulation, insbesondere Genaktivierung,
bereitzustellen, welche insbesondere die aus dem Stand der Technik
bekannten Probleme vermeidet.
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Diese
Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Erkennungssequenzen
mit den Merkmalen gemäß unabhängigem
Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand
der abhängigen Ansprüche 2 bis 18. Ein Verfahren
zur Regulierung, insbesondere Aktivierung, eines Zielgens in einem genetischen
System ist Gegenstand des unabhängigen Anspruchs 19. Bevorzugte
Ausführungsformen des Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen
Ansprüche 20 bis 22.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Erkennungssequenzen
für ortsspezifische bzw. sequenzspezifische Rekombinasen
zur Regulierung, insbesondere Aktivierung, eines Zielgens in einem
genetischen System. Die Erkennungssequenzen enthalten vorzugsweise
jeweils zwei Rekombinase-Bindungssequenzen, die vorzugsweise durch
eine Abstandssequenz voneinander getrennt sind.
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Die
erfindungsgemäß verwendeten Erkennungssequenzen
werden in ein Zielgen inseriert, wodurch dessen offener Leseraster
bzw. Leserahmen unterbrochen bzw. disruptiert wird. Dadurch wird
die im Anschluss an die Transkription ablaufende Translation in
der Regel kein sinnvolles Proteinprodukt liefern. Im Ergebnis wird
das Zielgen daher durch die Insertion der Erkennungssequenzen selektiv
in- bzw. deaktiviert, ohne dass eine Basalaktivität beobachtet werden
dürfte. Soll das Zielgen wieder aktiviert werden, werden
die Erkennungssequenzen mit Hilfe hierfür geeigneter ortsspezifischer
Rekombinasen aus dem Zielgen herausgeschnitten, wobei in der Regel
eine Erkennungssequenz in dem Zielgen verbleibt. Die im Zielgen
verbleibende Erkennungssequenz und die disruptierten Sequenzabschnitte
des Zielgens werden dabei unter dem Einfluss der Rekombinasen zu
einem zielgenartigen, offenen Leseraster zusammengefügt
(assembliert). Damit kann das Zielgen unter Umständen wieder
zu einem funktionsfähigen Zielprotein translatiert werden.
Auf diese Weise ist daher auch eine selektive Aktivierung des Zielgens
möglich.
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In
der Regel liegen die erfindungsgemäß vorgesehenen
Erkennungssequenzen in Form von DNA-Doppelsträngen vor.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind für die
Aktivierung des Zielgens insgesamt zwei Erkennungssequenzen vorgesehen.
Hierbei kann es sich um zwei identische Erkennungssequenzen oder um
zwei unterschiedliche Erkennungssequenzen handeln.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform sind zur Aktivierung
des Zielgens Erkennungssequenzen, insbesondere zwei Erkennungssequenzen,
vorgesehen, welche durch eine DNA-Sequenz voneinander getrennt sind.
Bevorzugt handelt es sich bei der DNA-Sequenz um eine Gen- oder
Genkassettensequenz. Unter einer Genkassette wird gewöhnlich
eine genetische Funktionseinheit aus Promotor, Gen und Transkriptionsterminator
verstanden. Bevorzugt handelt es sich bei der DNA-Sequenz um die
Sequenz für ein Reporter- oder Marker-Gen. Insbesondere
kann eine zum Einsatz kommende Genkassette ein entsprechendes Reporter- oder
Markergen enthalten. Bei den Marker-Genen kann es sich um positive
und/oder negative Selektionsmarker handeln. Unter negativen Selektionsmarker
sollen im Sinne der vorliegenden Erfindung Markergene verstanden
werden, deren Genprodukte einer Zelle unter bestimmten Bedingungen
kein Überleben erlauben.
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Als
Reporter- oder Markergene werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung
Gene bezeichnet, die für Proteine kodieren, die einen qualitativen und/oder
quantitativen Nachweis ihrer Expression ermöglichen. Derartige
Reportergene sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben und
umfassen unter anderem die für β-Galaktosidase,
Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase oder die für
diverse Antibiotikaresistenzen, insbesondere gegen Ampicillin, Erythromycin,
Tetracyclin, Kanamycin oder Spectinomycin, kodierenden Gene. Zum
Nachweis einer erfolgreichen Rekombination können Zellen
aufgeschlossen und/oder zusätzliche Substanzen hinzugegeben
werden, deren biochemische Umsetzung durch das Genprodukt eines
Reportergens erfassbar ist. Die Expression der β-Galaktosidase lässt
sich beispielsweise sowohl kolorimetrisch (mittels einer Anfärbung
der Zelle) durch Umsetzung des Substrats ortho-Nitrophenyl-β-D-galactosid
(ONPG) oder X-Gal, fluorometrisch durch Umsetzung einer 4-Methylumbelliferyl-β-galactopyranosid-Verbindung
oder durch Chemolumineszenz anhand der Umsetzung eines 1,2-Dioxetan-Galactopyranosid-Derivates
nachweisen. Zur Überprüfung einer exprimierten
Anbiotikaresistenz werden Zellen in der Regel in Nährmedien überführt,
welche die entsprechenden Antibiotika enthalten.
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Erfindungsgemäß kann
es sich bei den Erkennungssequenzen um Wildtypsequenzen handeln. Bevorzugt
handelt es sich bei den Erkennungssequenzen jedoch um Sequenzmutanten.
Unter Sequenzmutanten im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen
Erkennungssequenzen verstanden werden, welche Mutationen aufweisen.
Bei den Mutationen kann es sich um zumindest eine Mutation aus der Gruppe
Punktmutationen eines Nukleotids oder weniger benachbarter Nukleotide,
mehrere Nukleotide betreffende Mutationen, Deletionen, Insertionen
und Substitutionen handeln. Grundsätzlich kann die Abstandssequenz
Mutationen aufweisen. Bevorzugt weist jedoch zumindest eine der
beiden Bindungssequenzen Mutationen der zuvor beschriebenen Art auf.
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Die
Erkennungssequenzen weisen in einer weiteren Ausführungsform
jeweils eine gleiche Länge an Basenpaaren (bp) auf. Vorzugsweise
weisen die Erkennungssequenzen eine Länge von 34 Basenpaaren
(bp) auf. Die Bindungssequenzen für die Rekombinasen besitzen
bevorzugt jeweils eine Länge von 13 Basenpaaren (bp). Erfindungsgemäß ist
es besonders bevorzugt, wenn es sich bei den Bindungssequenzen um
palindromische Sequenzen handelt. Die Abstandssequenz besitzt vorzugsweise eine
Länge von 8 Basenpaaren (bp).
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Wie
bereits erwähnt, handelt es sich bei den erfindungsgemäß vorgesehenen
Erkennungssequenzen um Erkennungssequenzen für Rekombinasen.
Hierunter sollen im Sinne der vorliegenden Erfindung Proteine oder
Polypeptide verstanden werden, welche eine DNA-Rekombination katalysieren.
Unter einer DNA-Rekombination soll im Sinne der vorliegenden Erfindung
ein Vorgang bezeichnet werden, der zu einem Austausch von DNA-Bereichen
zwischen zwei verschiedenen DNA-Molekülen oder zwei verschiedenen
Bereichen eines einzelnen DNA-Moleküls und damit zu einer
Neuordnung des genetischen Ausgangsmaterials führt. Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt sind Erkennungssequenzen für λ-Integrasen
bzw. Tyrosin-Rekombinasen oder aber Serinre kombinasen. Diese Rekombinasen
erkennen spezifische DNA-Sequenzen und katalysieren den gegenseitigen
(reziproken) Austausch der DNA-Abschnitte zwischen diesen Erkennungssequenzen.
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Bei
den Erkennungssequenzen handelt es sich daher in einer weitergehenden
Ausführungsform um Erkennungssequenzen für Rekombinasen
aus der Gruppe Cre-Rekombinasen, Flp-Rekombinasen, Fre-Rekombinasen,
Tre-Rekombinasen und Mutanten davon, wobei Erkennungssequenzen für
Rekombinasen aus der Gruppe Cre-Rekombinasen, Flp-Rekombinasen und
Mutanten davon besonders bevorzugt sind.
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Bei
den Erkennungssequenzen handelt es sich in einer geeigneten Ausführungsform
um lox-Sequenzen, bevorzugt lox-Sequenzmutanten. Besonders bevorzugt
sind dabei Erkennungssequenzen, bei denen es sich um loxP-Sequenzmutanten
handelt.
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Erfindungsgemäß kann
es sich bei den in Frage kommenden Erkennungssequenzen für
ortsspezifische Rekombinasen insbesondere um zumindest eine Erkennungssequenz
aus der Gruppe SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 176 gemäß beiliegendem Sequenzprotokoll
handeln.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es
sich bei den Erkennungssequenzen um lox-Sequenzen und bei den ortsspezifischen
Rekombinasen um Cre-Rekombinasen. Ein hierfür geeignetes
ortsspezifisches Rekombinationssystem ist das Crellox-System aus
dem Bakteriophagen P1 oder davon abgeleitete Systeme. Die Rekombinase
Cre des Bakteriophagen P1 ist eine ortsspezifische Rekombinase,
die eine DNA-Neuordnung über eine DNA-Zielsequenz, nämlich
die sogenannte loxP-Sequenz, vermittelt. Die loxP-Sequenzen bestehen
jeweils aus zwei Rekombinase-Bindungselementen von 13 Basenpaaren
(bp), welche als „inverted repeats” eine zentrale
Sequenz von 8 Basenpaaren (bp) flankieren. Die zentrale 8 bp-Sequenz,
bei der es sich um eine Abstands- bzw. Spacersequenz handelt, bestimmt
die Orientierung der 34 bp loxP-Sequenz. Kommt es zwischen zwei
gleichgerichteten Erkennungssequenzen zu einer Rekombination, so
wird ein zwischen den Erkennungssequenzen liegender DNA-Abschnitt
zusammen mit einer der Erkennungssequenzen als kreisförmiges
Molekül herausgeschnitten (Exzision). Aufgrund der ursprünglichen
räumlichen Nähe beider Erkennungssequenzen ist
dieser Prozess überaus effizient.
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Ein
weiteres, geeignetes Rekombinationssystem ist das Flp-FRT-System
bzw. davon abgeleitete Systeme. Die Rekombinase Flp (benannt nach der
Flippase-Aktivität, durch die Hefensequenzabschnitte invertieren)
hat als Zielsequenz die sogenannte FRT-Sequenz (FRT: Flp-recombinased
target). Diese Zielsequenz ist im Wesentlichen gleich aufgebaut
wie die loxP-Sequenz der Cre-Rekombinase.
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Bei
dem genetischen System kann es sich um eine prokaryontische oder
eukaryontische Zelle, beispielsweise eine Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-,
Insekten- oder Säugetierzelle, oder auch um einen Tier-
oder Pflanzenorganismus handeln. Bevorzugt handelt es sich bei dem
genetischen System um ein prokaryontisches System, vorzugsweise
um eine Bakterienzelle. Als Bakterienzelle kommen insbesondere Zellen
von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus oder
Staphylococcus carnosus in Frage.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch die Verwendung eines
ortsspezifischen Rekombinationssystems, welches die erfindungsgemäß vorgesehenen
Erkennungssequenzen sowie hierfür geeignete Rekombinasen
aufweist, zur Regulation, insbesondere Aktivierung, eines Zielgens
in einem genetischen System. Die in Frage kommenden Rekombinationssysteme
werden dabei bevorzugt zur Exzision, Inversion oder Insertion von
erkennungssequenz-flankierten DNA-Sequenzen verwendet.
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Im
Folgenden wird die Funktionsweise eines ortsspezifischen Rekombinasesystems
am Beispiel des Cre-loxP-Systems näher erläutert.
Zunächst wird ein DNA-Segment, welches auf beiden Seiten
von einer loxP-Sequenz flankiert wird („floxiertes DNA-Segment)
in das Zielgen inseriert. Wie bereits eingangs erwähnt,
wird der offene Leseraster des Zielgens hierdurch unterbrochen und
das Zielgen damit inaktiviert. Zur Insertion des „floxierten” DNA-Segments
kommen die üblichen homologen Rekombinationstechniken in
Frage, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind, so dass hierauf
nicht näher eingegangen werden soll. In der Regel weist das „floxierte” DNA-Segment
einen genetischen Marker zur Selektion von erfolgreichen Rekombinationsereignissen
auf. Die in das Zielgen eingebauten loxP-Sequenzen erlauben eine
effiziente Exzision des lox-flankierten DNA-Segments unter Katalyse der
Cre-Rekombinase. Das ausgeschnittene Fragment, welches die flankierte
DNA-Sequenz sowie eine der flankierenden loxP-Sequenzen enthält,
wird zirkularisiert und geht durch Abbau verloren. Die andere loxP-Sequenz
verbleibt dagegen im Zielgen.
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Bezüglich
weiterer Merkmale und Einzelheiten zu den erfindungsgemäß verwendbaren
Rekombinationssystemen, insbesondere im Hinblick auf die verwendbaren
Erkennungssequenzen und Rekombinasen, wird vollständig
auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch ein Verfahren zur
Regulierung, insbesondere Aktivierung, eines Zielgens in einem genetischen System,
umfassend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen
von zwei Erkennungssequenzen für ortsspezifische Rekombinasen,
wobei die Erkennungssequenzen jeweils zwei Re kombinase-Bindungssequenzen
enthalten, die durch eine Abstandssequenz voneinander getrennt sind,
- b) Inserieren der beiden Erkennungssequenzen in das Zielgen
unter Disruption des offenen Leserasters des Zielgens,
- c) Exprimieren einer ortsspezifischen Rekombinase zur Durchführung
eines Rekombinationsereignisses, wobei eine Erkennungssequenz in
dem Zielgen zurückbleibt und die zurückgebliebene
Erkennungssequenz zusammen mit dem Zielgen ein offenes Leseraster
zur Expression eines im Wesentlichen aktiven Zielgenprodukts bildet.
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Im
Falle des Zielgenprodukts handelt es sich in der Regel um ein Protein.
Erfindungsgemäß kann es sich bei dem Zielgenprodukt
aber auch um ein Polypeptid handeln.
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Für
das Bereitstellen von geeigneten Erkennungssequenzen stehen grundsätzlich
unterschiedliche Möglichkeiten zur Verfügung.
Diese Möglichkeiten werden im Folgenden beispielhaft anhand
von Erkennungssequenzen mit einer Länge von 34 Basenpaaren
(bp) näher erläutert. Eine derartige Erkennungssequenz,
beispielsweise in Form einer lox-Sequenz oder FRT-Sequenz, kodiert
zusammen mit zwei weiteren Basenpaaren theoretisch einen sequenzspezifischen
Abschnitt von 12 Aminosäuren, ein sogenanntes Dodecapeptid.
Bei der Transkription einer doppelsträngigen DNA sind grundsätzlich sechs
verschiedene Leseraster möglich, da die Transkription von
beiden Strängen möglich ist. Entsprechend kann
eine Erkennungssequenz mit 34 Basenpaaren zusammen mit zwei weiteren
Basenpaaren theoretisch sechs verschiedene Dodecapeptide kodieren.
Da es insgesamt 20 verschiedene proteinogene Aminosäuren
gibt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Zielprotein innerhalb
seiner natürlichen Sequenz eine Sequenz aufweist, welches
eines dieser Dodecapeptide kodiert, als eher gering anzusehen. Würde
man zudem in einem Zielprotein in ungerichteter Weise einen Abschnitt
aus zwölf der im Zielprotein natürlich vorkommenden
Aminosäuren etwa gegen ein lox-kodiertes Dodecapeptid ersetzen
(was gewöhnlich der Situation nach dem Ausschneiden aus
dem Zielgen entspräche), so wäre das modifizierte
Protein wahrscheinlich weniger aktiv oder gänzlich inaktiv.
Erfindungsgemäß haben sich daher die im Folgenden
näher beschriebenen Maßnahmen als besonders vorteilhaft
erwiesen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform werden die Erkennungssequenzen
in Form einer erkennungssequenz-flankierten DNA-Sequenz, vorzugsweise
in Form einer erkennungssequenz-flankierten Genkassettensequenz,
in das Zielgen insertiert. Erfindungsgemäß ist
es hierbei besonders bevorzugt, wenn die Erkennungssequenzen in
einen Abschnitt des Zielgens insertiert werden, der für
einen permissiven Bereich des Zielgenprodukts kodiert. Unter einem
permissiven Bereich soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein
Bereich des Zielgenprodukts verstanden werden, der gegenüber
einem Austausch von einer, zwei, drei oder mehreren Aminosäuren
tolerabel ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte dies
erfolgreich anhand des Tetracyclin-Repressor-Proteins (TetR) verifiziert
werden. Hierbei wurde eine lox-Sequenz-flankierte Genkassette in
einen Abschnitt des tetR-Gens insertiert, der für eine permissive
Schlaufenregion des tetR-Proteins kodiert. Eine anschliessend durchgeführte
Rekombination, vermittelt durch die Cre-Rekombinase, lieferte ein
tetR-Gen, welches noch eine der flankierenden lox-Sequenzen aufwies.
Die Expression dieses modifizierten bzw. mutierten tetR-Gens ergab
ein TetR-Protein, welches vollständig aktiv war. Die Sequenz
SEQ ID NO 177 steht für die Gensequenz von tetR mit einer
FRT-Sequenz. Die Sequenz SEQ ID NO 178 steht für die Sequenz
von tetR mit einer lox72/1-Sequenz. Die Sequenz SEQ ID NO 179 steht für
die Sequenz des Wildtyp-tetR-Gen.
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Für
den Fall, dass lediglich die Primärsequenz des Zielgenprodukts
bekannt ist, kann die Primärsequenz gezielt auf Aminosäureabfolgen
hin untersucht werden, welche im Wesentlichen durch Erkennungssequenzen
für Rekombinasen kodierbar sind. Je größer
hierbei eine Übereinstimmung zwischen einer Aminosäureabfolge
in dem Zielgenprodukt und einem durch die Erkennungssequenz kodierten
Peptid herbeigeführt werden kann, umso wahrscheinlicher
ist auch, dass das modifizierte bzw. mutierte Zielgenprodukt eine
vollständige Aktivität aufweist. Alternativ oder
in Kombination dazu kann die Primärsequenz eines Zielproteins
auch daraufhin untersucht werden, ob eine Abfolge von Aminosäuren
funktionell den durch die Erkennungssequenzen kodierten Aminosäuren
entsprechen. In beiden Fällen ist es besonders vorteilhaft,
wenn auf eine ausreichende Anzahl an Erkennungssequenzen für
ortsspezifische Rekombinasen, insbesondere in Form einer Sequenzbibliothek,
zurückgegriffen werden kann, da sich auf diese Weise die
Wahrscheinlichkeit eines „Treffers” deutlich erhöhen
lässt. Erfindungsgemäß ist es daher besonders
bevorzugt, wenn die Erkennungssequenzen durch Auswahl aus einer
Bibliothek von Erkennungssequenzen, insbesondere durch Auswahl aus
einer Bibliothek, umfassend die Erkennungssequenzen SEQ ID NO: 1
bis SEQ ID NO: 176 gemäß beiliegendem Sequenzprotokoll,
bereitgestellt werden. Bei den außerdem erforderlichen Rekombinasen
kann es sich um Wildtyp-Rekombinasen oder um Mutanten von Rekombinasen
handeln. Bezüglich der in Frage kommenden Rekombinasen wird
auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen.
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Die
Expression der ortsspezifischen Rekombinase wird in einer bevorzugten
Ausführungsform durch Transformation oder Transfektion
des genetischen Systems mit einem Vektor, kodierend für
die Rekombinase, erreicht. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid
oder einen Bakteriophagen handeln.
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Daneben
existieren noch weitere Möglichkeiten zur Expression der
ortsspezifischen Rekombinase. So kann die Rekombinase beispielsweise
als RNA-Molekül zu einem gewünschten Zeitpunkt
in das genetische System eingeschleust werden. Weiterhin kann die
Rekombinase bereits innerhalb des genetischen Systems kodiert und
mittels Transkriptionskontrolle oder niedermolekularer Substanzen
zu einem gewünschten Zeitpunkt induziert werden. Insbesondere
können die Rekombinasen auch innerhalb der auszuschneidenden
Sequenz kodiert sein.
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Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebene Genregulation
auf Basis von Erkennungssequenzen für ortsspezifische Rekombinasen bzw.
darauf entsprechenden ortsspezifischen Rekombinationssystemen hat
gegenüber der herkömmlichen Genregulation auf
der Basis von Transkriptionskontrollsystemen die folgenden Vorteile:
- – Die natürliche Genregulationsstruktur,
insbesondere Promotor und Terminator des Zielgens, bleibt erhalten.
- – Befindet sich das Zielgen in einer Transkriptionseinheit
mit weiteren Genen (Operon), so wird die Beeinflussung „stromabwärts” liegender
Gene (polarer Effekt) nach dem Rekombinationsereignis minimiert.
- – Weiterhin ist das Gen vor dem Ausschneiden durch
eine ortsspezifische Rekombinase komplett inaktiv, d. h. es wird
auch keine Hintergrund- bzw. Basalaktivität beobachtet.
- – Die Aktivierung kann zudem mit einer positiven oder
negativen Selektierbarkeit korreliert werden. Denkbar ist insbesondere
eine mit der Aktivierung einhergehende Phänotypveränderung,
etwa durch Ausschneiden eines Fluoreszenzproteingens.
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Weitere
Merkmale der Erfindung ergeben sich durch die nachfolgende Beschreibung
von bevorzugten Ausführungsformen in Form von Beispielen
und Figurenbeschreibungen in Verbindung mit dem beigefügten
Sequenzprotokoll sowie den Merkmalen aus den Unteransprüchen.
Hierbei können einzelne Merkmale der Erfindung allein oder
in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die beschriebenen
Ausführungsfor men dienen lediglich zur Erläuterung
und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in
keiner Weise einschränkend zu verstehen.
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1. Material und Methoden
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1.1 Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen
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Das
Klonieren wurde in Escherichia coli (E. coli) DH5α durchgeführt
(Hanahan, D. 1983. Studies an transformation of Escherichia
coli with plasmids. J. Mol Biol 166: 577-80). Genetische
Manipulationen von tetR wurden in vivo in Bacillus subtilis WH558 (Bertram,
R., M. Köstner, J. Müller, J. Vazquez Ramos, and
W. Hillen. 2005. Integrative elements for Bacillus subtilis yielding
tetracycline-dependent growth phenotypes. Nucleic Acids Res 33:e153)
und Derivaten davon, wie in Tabelle 1 gezeigt, durchgeführt.
Die Zellen wurden allgemein entweder in einem flüssigen
(unter Schütteln) oder auf einem festen Nährmedium
LB oder BM gezüchtet (Bera, A., S. Herbert, A.
Jakob, W. Vollmer, and F. Götz. 2005. Why are pathogenic
staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase
OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus
aureus. Mol Microbiol 55: 778-787). Sofern erforderlich,
wurden die Nährmedien mit Ampicillin (Ap; 100 mg/l für
E. coli) Kanamycin (Km; 30 mg/l für E. coli oder 15 mg/l
für B. subtilis), Chloramphenicol (Cm; 25 mg/l für
E. coli, oder 5 oder 10 mg/l für B. subtilis) oder mit
Erythromycin (Em, 2.5 mg/l für B. subtilis) ergänzt.
Für das Klonieren wurden die E. coli-Stämme kompetent
gemacht und mit Hilfe von Standardtechniken transformiert (Hanahan,
D. 1983. Studies an transformation of Escherichia coli with plasmids.
J. Mol Biol 166: 557-80). Natürlich kompetente
B. subtilis-Zellen wurden durch ein Standardprotokoll erhalten (Kraus,
A., C. Hueck, D. Gärtner, and W. Hillen. 1994. Catabolite
repression of the Bacillus subtilis xyl operon involves a cis element
functional in the context of an unrelated sequence, and glucose
exerts additional xylR-dependent repression. J Bacteriol 176: 1738-45).
Alle im Rahmen der Erfindung verwendeten Bakterienstämme
sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.
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1.2 DNA-Isolation und Modifikation
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Es
wurde eine Plasmid-DNA von E. coli gemäß den Herstellerprotokollen
unter Verwendung des E. Z. N. A. Plasmidminiprepkit (Peqlab, Erlangen, Deutschland),
eines Nukleospinplasmids (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
oder des Plasmidmidikits (Qiagen, Hilden, Deutschland) hergestellt.
Zur Amplifikation chromosomaler DNA von B. subtilis wurden Bakterienkolonien
aus einem festen Medium direkt in eine PCR-Reaktionsmischung eingeimpft, welche
die Verwendung von PuReTaq Ready-To-Go PCR beads (GE Healthcare,
München, Deutschland) vorsah. Die Sequenzierung der Plasmide
oder PCR-Produkte wurde mit einem ABI PRISM 310 genetischen Analysegerät
(Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) oder auf einem GATC
(Konstanz, Deutschland) durchgeführt. Die Primer wurden
von Biomers (Ulm, Deutschland) oder MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland)
gekauft. Längere Oligonukleotide wurden von TIB-MOLBIOL
(Berlin, Deutschland) bezogen. Die verwendeten Primersequenzen sind
in der Tabelle 2 dargestellt.
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1.3 Herstellung eines Plasmids zur Expression
von tetR-Allelen mit Erkennungssequenzen für eine ortsspezifische
Rekombination
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Es
wurde ein chimäres TetR-Protein, welches eine TetR(B)-Sequenz
mit den Aminosäureresten 1 bis 50 und eine TetR(D)-Sequenz
mit den Aminosäureresten 51 bis 208 aufwies, verwendet (Schnappinger,
D., P. Schubert, K. Pfleiderer, and W. Hillen. 1998. Determinants
of proteinprotein recognition by four helix bundles: changing the
dimerization specificity of Tet repressor. Embo J 17: 535-43.; Schubert,
P., D. Schnappinger, K. Pfleiderer, and W. Hillen. 2001. Identification
of a stability determinant an the edge of the Tet repressor four-helix
bundle dimerization motif. Biochemistry 40: 3257-3263).
Im Folgenden wird das chimäre TetR(BD)-Protein als TetR
bezeichnet. Für eine Insertion in das tetR-Gen wurden komplimentäre
Oligonukleotide, enthaltend eine FRT- oder eine lox-Sequenz, in
ihrem 5'-Ende mit Hilfe einer T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert (New
England Biolabs, Frankfurt/Main, Deutschland). Anschließend
wurden zwei komplimentäre Oligonukleotide durch Mischen
zweier wässriger Lösungen, welche jeweils 37.5
pmol von jedem Oligonukleotid enthielten, hybridisiert, auf 90°C
erhitzt und anschließend innerhalb einer Stunde auf Raumtemperatur
abgekühlt. Die hybridisierten Oligonukleotide wiesen 3'-Überhänge
auf, welche kompatibel oder identisch zu denen von Pstl geschnittener
DNA waren. Außerdem enthielten die hybridisierten Oligonukleotide
die folgenden Erkennungssequenzen für eine ortsspezifische
Rekombination: FRT innerhalb flp_fw/flp_rev, und lox72 in zwei verschiedenen
Leserahmen innerhalb lockP/Pkcol und lockP_fw/lockP_rev. Nach Insertion
von Pstl geschnittenem pWH1926 (Kamionka, A., M. Majewski, K.
Roth, R. Bertram, C. Kraft, and W. Hillen. 2006. Induction of single
chain tetracycline repressor requires the binding of two inducers.
Nucleic Acids Res 34: 3834-3841) in das tetR-Gen wurden
die folgenden erwünschten Konstrukte erhalten: pWH1926-F
mit FRT in 5'→3' Leserahmen 2, pWH1926-L1 (lox72 in 3'→5' Leserahmen
1) und pWH1926-L2 lox72 (3'→45' Rahmen 2). In allen Konstrukten
waren in dem offenen Leserahmen des TetR-Gens Erkennungssequenzen für
die ortsspezifische Rekombination eingebettet. Plasmide, in welchen
die Fragmente in entgegengesetzter Orientierung inseriert waren,
wurden entsprechend bestimmt und werden im Folgenden mit „-inv” bezeichnet.
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1.4.
Klonieren eines B. subtilis Integrationsvektors zur Ermöglichung
einer Cre vermittelten tetR-Gen-Aktivierung
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Zur
Disruption des tetR-Gens mit einem „floxierten” Kanamycin-Resistenzmarker
wurde eine aphAIII-Kassette aus dem Plasmid pDG792 durch PCR unter
Verwendung der Primer Km_66_inv und Km_71_inv amplifiziert (Guérot-Fleury,
A. M., K. Shazand., N. Frandsen, and P. Stragier. 1995. Antibiotic-resistance
cassettes for Bacillus subtilis. Gene 167: 335-336). Das
PCR-Produkt wurde in pWH1926 via Pstl insertiert. Von den zwei möglichen,
resultierenden Plasmiden wurde das mit aphAIII in entgegengesetzter
Orientierung zu dem disruptierten tetR-Gen verwendet und im Folgenden
als pWH1926-TLKLT (tetR'-lox66-aphAIII-lox71-'tetR) bezeichnet.
Der Zielstamm B. subtilis WH558 trug chromosomale DNA von pUC19
und war der Vorgänger von pWH1926-Derivaten. Um eine mögliche,
unerwünschte ektopische Insertion nach Transformation mit
pWH1926-TLKLT zu umgehen, wurde die Sequenz tetR'-lox66-aphAIII-lox71-'tetR
in pWH1411BD mittels BglII und Ncol kloniert (Scholz, O.,
M. Kästner, M. Reich, S. Gastiger, and W. Hillen. 2003.
Tesching TetR to recognize a new inducer. J Mol Biol 329: 217-227)
und ergab pWH1411-TLKLT. Um eine größere Region
mit einer Sequenzidentität für die genomische
Integration bereitzustellen, wurde ein Teil der chromosomalen Sequenz
innerhalb und stromabwärts von tetR aus B. subtilis RAB100
DNA amplifiziert (vgl. hierzu Tabelle 1). Hierbei wurden die Primer DP8neu
und IacA_extd verwendet (vgl. hierzu Tabelle 2). Dieses Fragment
wurde in pWH1411-TLKLT via Ncol und Pael insertiert, um den Integrationsvektor pWH1411-TLKLTextd
zu erhalten. Dieser Vektor wurde durch Nhel vor der Transformation
von B. subtilis linearisiert.
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1.5 Verwendete Techniken zur Genommodifikation von
B. subtilis-Stämmen
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Die
Elimination von „floxierter” aphAIII-Kassettten
von B. subtilis Chromosomen wurde durch Behandlung der entsprechenden
Zellen mit pCrePA erreicht, einem Plasmid, welches für
die Cre-Expression in B. anthracis hergestellt wurde (Pomerantsev, A.
P., R. Sitaraman, C. R. Galloway, V. Kivovich, and S. H. Leppla.
2006. Genome engineering in Bacillus anthracis using Cre recombinase.
Infect Immun 74: 682-693). Im Allgemeinen wurde 1 μg
dieses Plasmids verwendet, um B. subtilis zu transformieren. Die Transformanten
wurden zuerst bei 30°C auf einem Medium, welches 2.5 μg/ml
EM (Erythromycin) aber kein Km (Kanamycin) enthielten, kultiviert,
da beabsichtigt war, den Resistenzmarker aphAIII zu eliminieren.
EM-resistente Kolonien wurden ohne EM ausplattiert und bei 37°C
inkubiert, einer Temperatur, welche für pCrePA nicht permissiv
ist. Die Kandidatenklone wurden ausplattiert und bei 37°C über Nacht
ein zweites Mal inkubiert. Klone, welche sowohl eine Sensitivität
gegenüber EM als auch gegenüber Km zeigten, wurden
nach dieser Behandlung durch PCR-Analyse überprüft
und zeigten einen Markerverlust sowie einen Verlust von pCrePA.
-
1.6 Quantifizierungen der β-Galaktosidase-Aktivität
-
Die
in vivo Expression und Induktionskapazitäten von TetR-Varianten
wurde β-Galaktosidase (β-gal)-Assays von mid-log-Kulturen
von E. coli WH207 λtet50 (Smith, L. D., and K.
P. Bertrand. 1988. Mutations in the Tn 10 tet repressor that infere with
induction. Location of the tetracyclinebinding domain. J Mol Biol
203: 949-959; Wissmann, A., L. V. Wray, Jr., U.
Somaggio, R. Baumeister, M. Geissendörfer, and W. Hilfen.
1991. Selection for Tn 10 tet repressor binding to tet Operator
in Escherichia coli: isolation of temperature-sensitive mutants
and combinatorial mutagenesis in the DNA binding motif. Genetics
128: 225-232) oder verschiedenen B. subtilis-Stammen bestimmt
(Kamionka, A., R. Bertram, and W. Hillen. 2005. Tetracycline-dependent
conditional gene knockout in Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol
71: 728-733; Scholz, O., E. M. Henssler, J. Bail,
P. Schubert, J. Bogdanska-Urbaniak, S. Sopp, M. Reich, S. Wisshak,
M. Kästner, R. Bertram, and W. Hillen. 2004. Activity reversal
of Tet repressor caused by single amino acid exchanges. Mol Microbiol
53: 777-89). Die Zellen wurden in LB ohne Zusätze
(repressive Konditionen) oder ergänzt mit 0.4 μm ATc
(zur Induktion von TetR) gezüchtet. Es wurden drei unabhängige
Kulturen einem Assay unterworfen, wobei die Messungen zumindest
zweimal durchgeführt wurden. Die Werte, welche für
E. coli-Zellen erhalten wurden, welche das Plasmid pWH1925Δ trugen
(Plasmid ohne tetR, Bertram, R., C. Kraft, S. Wisshak, J.
Mueller, O. Scholz, and W. Hillen. 2004. Phenotypes of combined
tet repressor mutants for effector and operator recognition and
allostery. J Mol Microbiol Biotechnol 8: 104-110), wurden
auf 100% gesetzt, da sie vollständige Induktion von TetR
widerspiegeln. Die Standardabweichungen dieser Messungen waren unter
10%.
-
1.7 Western Blot Analyse
-
Die
Immundetektion des TetR-Proteins in löslichen B. subtilis-Extrakten
wurde mit 75 μg des gesamten Proteins durchgeführt.
die Immundetektion beruhte entweder auf der Verwendung eines Serums von
TOP19 monoklonalem Antikörper, der gegen TetR(B) gerichtet
war (Pook, E., S. Grimm, A. Bonin, T. Winkler, and W. Hillen.
1998. Affinities of mAbs to Tet repressor complexed with operator
or tetracycline suggest conformational changes associated with induktion.
Eur J Biochem 258: 915-922) oder auf der Verwendung einer
1:20.000 Verdünnung von polyklonalen Kaninchenantikörpern,
welche TetR-Protein erkennen. Des weiteren wurden ECL Plus Western Blotting
Detektionsreagenzien (GE Healthca re, München, Deutschland)
in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise verwendet (Kamionka,
A., R. Bertram, and W. Hillen. 2005. Tetracycline-dependent conditional
gene knockout in Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 71: 728-733).
-
2. Ergebnisse
-
2.1 In vivo Aktivität von TetR-Varianten,
teilweise kodiert durch Erkennungssequenzen für eine ortsspezifische
Rekombination
-
Die
Schleifenregion zwischen den Helices α8 und α9
(1A) im TetR-Protein besteht aus 15 Aminosäureresten
(Positionen 152 bis 167) und ist identisch zu der von TetR(D). Frühere
Studien haben gezeigt, dass Längen und Sequenzvariationen
dieser Region zu einem gewissen Grad toleriert werden. Das erste
Ziel war daher, die Codons 161 bis 167 gegen verschiedene Erkennungssequenzen
für eine ortsspezifische Rekombination zu ersetzen und
dabei ein offenes Leseraster aufrecht zu erhalten. Hierzu wurden
FRT oder lox72 enthaltene Sequenzen in den das tetR-Gen exprimierenden
Vektor pWH1926 kloniert. Man erhielt die gewünschten Konstrukte pWH1926-F1,
pWH1926-L1 und pWH1926-L2. Ebenso erhielt man die Konstrukte pWH1926-F1-inv, pWH1926-L1-inv
und pWH1926-L2-inv. In den drei letztgenannten Vektorkonstrukten
wurden die Fragmente mit entgegengesetzter Orientierung inseriert. Aufgrund
der Position der zwei Pstl-Stellen, welche für die Klonierung
innerhalb des TetR-Gens verwendet wurden, zeigten die von den „inv”-Plasmidkonstrukten
abgeleiteten Proteine Sequenzalterationen, welche nicht nur die
Schleifenregion beeinflussten, sondern auch die Region der Helix α9.
Bei dem Konstrukt L2-inv wurde hierdurch eine vorzeitige Termination
durch das ochre Stop Codon verursacht. Daher kodierte dieses Konstrukt,
bezeichnet als tetRlox72/2-inv, lediglich
ein trunkiertes TetR-proteinartiges Polypeptid von 170 Aminosäuren.
Alle anderen offene Leserahmen kodierten für vollständige
TetR-Monomere mit 214 oder 215 Aminosäureresten, welche
im Folgenden folgendermaßen bezeichnet werden: TetRFRT (FRT-Sequenz), TetRlox72/1 (lox72, erster
Leserahmen), TetRlox72/2 (lox72, zweiter
Leserahmen), TetRFRT-inv und TetRlox72/1-inv. Die geänderten Sequenzabschnitte
der Varianten und ihre in vivo-Aktivitäten in E. coli sind
in 1B dargestellt. Interessanterweise zeigten alle
drei TetR-Varianten, in welchen lediglich die Schlaufenregion geändert
wurde, vollständige Induzierbarkeit mit ATc. Ebenso waren die
Repressionskapazitäten von TetRFRT und TetRlox72/1 nahezu identisch mit denen des Wildtyp-TetR-Proteins.
Allerdings waren die Repressionskapazitäten im Falle von
TetRlog72/2 vermindert. Dies steht in deutlichem
Gegensatz zu dem Verhalten der „-inv”-Konstrukte,
von denen keines regulatorische Eigenschaften besaß. Das
trunkierte TetRlox72/2-in war inaktiv, wohingegen
TetRFRT und TetRlox72/1 anscheinend
an tetO banden, jedoch keine Induktion zuließen.
-
2.2 Vektor zur chromosomalen Integration
einer gesplitteten tetR-artigen Sequenz in B. subtilis
-
Das
nächste Ziel bestand darin, ein Modellsystem bereitzustellen,
durch welches eine künstlich disruptierte tetR-Genvariante
durch Cre-Rekombinase-Behandlung aktiviert werden konnte. Ausgehend von
den bisher beschriebenen Ergebnissen sollte eine lox66-(Markergen)-lox71-Kassette
zwischen zwei Abschnitten des tetR-Gens in vivo herausgeschnitten
werden können, um TetRlox72/1 als
Endprodukt zu erhalten. Aus verschiedenen Gründen wurden
die entsprechenden Manipulationen innerhalb des Chromosoms von B.
subtilis unter Verwendung des Cre/lox-Systems durchgeführt.
So ist B. subtilis einer Transformation und Integration von Fremd-DNA
in das Chromosom durch eine doppelte homologe Rekombination zugänglich
(Fernandez, S., S. Ayora, and J. C. Alonso. 2000. Bacillus
subtilis homologous recombination: genes and products. Res Microbiol
151: 481-6). Außerdem sind Stämme dieser Spezies
erhältlich, um die in vivo-Aktivität von TetR-Varianten
quantifizieren zu können (Bertram, R., M. Köstner,
J. Müller, J. Vazquez Ramos, and W. Hillen. 2005. Integrative
elements for Bacillus subtilis yielding tetracycline-dependent growth
phenotypes. Nucleic Acids Res 33: e153; Kamionka, A., R. Bertram,
and W. Hillen. 2005. Tetracyclinedependent conditional gene knockout
in Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 71: 728-733).
Schließlich ist die Verwendung des Crellox-Systems für
diese Art beschrieben (Pomerantsev, A. P., R. Sitaraman,
c. R. Galloway, V. Kivovich, and S. H. Leppla. 2006. Genome engineering
n Bacillus anthracis using Cre recombinase. Infect Immun 74: 682-693).
Um einen Integrationsvektor zu klonieren, wurde eine aphAIII-Kassette,
welche eine Kanamycin-Resistenz verlieh, amplifiziert und durch
PCR modifiziert. Dadurch wurde die Kassette stromaufwärts
durch lox66-Sequenz und sieben Codons, welche den Positionen 168–174 der
Helix α9 des TetR-Proteins entsprachen, und stromabwärts
von einer lox71-Sequenz flankiert. Dieses Produkt wurde zwischen
die PstI-Stellen von tetR inseriert. Auf diese Weise erhielt man
eine tetR'-lox66-aphAIII-lox71-'tetR-Sequenz, im Folgenden als tlklt
bezeichnet. Nach Subklonieren und kleineren Modifikationen (vgl.
hierzu den Abschnitt „Material und Methoden”)
wurde der finale B. subitilis-Integrationsvektor pWH1411-TLKLTextd
erhalten.
-
2.3 Multiple Modifikationen des B. subtilis-Genoms und
Cre-vermittelte Aktivierung von TetRlox72/1
-
B.
subtilis WH558 (2A) wurde als anfänglicher
Wirtsstamm verwendet (Bertram, R., M. Köstner,
J. Müller, J. Vazquez Ramos, and W. Hillen. 2005. Integrative
elements for Bacillus subtilis yielding tetracyclinedependent growth
phenotypes. Nucleic Acids Res 33: e153). Der Stamm trug
das Wildtyp-tetR-Gen, welches durch einen konstitutiven Promotor,
integriert im lacA-Locus, reguliert wurde, sowie lacZ, stromabwärts
eines Pxyl/tet-Promotors mit zwei tet-Operatoren
innerhalb amyE (Geissendörfer, M., and W. Hillen.
1990. Regulated expression of heterologous genes in Bacillus subtilis
using the Tn10 encoded tet regulatory elements. Appl Microbiol Biotechnol
33: 657-663). Zuerst musste ein aphAl-ll-Gen in dem WH558-Genom
entfernt werden. Die Wiederherstellung der Sensitivität
für Kanamycin innerhalb des Stamms war Voraussetzung für
eine spätere Selektion der tlklt-Kassette. Die zur Selektion
von WH558 verwendete aphAIII-Resistenzkassette wurde mit lox66 und
lox71 flankiert (Bertram, R., M. Köstner, J. Müller,
J. Vazquez Ramos, and W. Hillen. 2005. Integrative elements for
Bacillus subtilis yielding tetracycline-dependent growth phenotypes.
Nucleic Acids Res 33: e153). Nach Behandlung mit dem Plasmid
pCrePA, hergestellt für die Expression der Cre-Rekombinase
in B. anthracis, wurde ein gegenüber Kanamycin sensitiver
Abkömmling von WH558, im Folgenden als RAB100 bezeichnet,
erhalten (Pomerantsev, A. P., R. Sitaraman, C. R. Galloway,
V. Kivovich, and S. H. Leppla. 2006. Genome engineering in Bacillus
anthracis using Cre recombinase. Infect Immun 74: 682-693).
Die beobachtete Größenreduktion der Region stromabwärts
des tetR-Gens in dem Chromosom korrespondierte mit der Länge
des „floxierten” Markergens. Dies belegte das
Cre vermittelte Herausschneiden der aphAIII-Kassette. RAB100 wurde
mit pWH1411BD-TLKLTextd transformiert. Die Integration des tlklt-Fragments
in das tetR-Gen von RAB100 ergab den Stamm RAB101. Dies wurde anhand
von PCR bestätigt. Um tetRlox72/1 zu
assemblieren und zu aktivieren, wurden kompetente RAB101-Zellen
mit pCrePA behandelt. Eine durchgeführte PCR-Analyse der
Kanamycin sensitiver Kandidaten bestätigte die Abwesenheit
der „floxierten” Resistenzkasette. Einer der positiven
Kandidaten, bei welchem die Region des tetR-Gens durch Sequenzierung
bestätigt wurde, wurde als RAB102 bezeichnet. Erwartungsgemäß hatte
eine Behandlung mit Cre die zwei Hälften der tetR-genartigen
Sequenz zu tetRlox72/1 assembliert, wobei
eine lox72-Sequenz innerhalb der α8 bis α9 Schleifencodons
zurückblieb. Die beschriebene Stammmanipulation ist sche matisch
in 2B zusammengefasst. Die hierzu korrespondierenden
PCR-Analysen sind in der 2C dargestellt.
Die regulatorischen Kapazitäten der neu hergestellten B.
subtilis WH558-Derivate wurden durch Messung der β-Galaktosidase-Aktivität
untersucht. Die hieraus erhaltenen Ergebnisse sind in dem oberen
Teil von 3 dargestellt. Dabei wurden
keine Unterschiede in der β-Galaktosidase-Aktivität
zwischen WH558 und RAB100, welche sich lediglich in dem aphAIII-Selektionsmarker
stromabwärts des tetR-Gens unterschieden, beobachtet. RAB101
zeigte keine lacZ-Repression, was durch ein Stop-Codon unmittelbar
stromabwärts von lox71 in tlklt erklärt werden
kann. Das Konstrukt tetRlox72/2-inv führte
nicht zu der Expression eines funktionalen Repressors. Bezüglich
RAB102 (tetRlox72/1) wurde ein nahezu identisches
Aktivitätsprofil zu dem von WH558 oder RAB100 beobachtet.
Dies stimmt mit den in E. coli erhaltenen Ergebnissen überein
(1B). Um die Mengen des TetR-Proteins (oder die
Mengen der verkürzten tlklt kodierten Produkte) der betreffenden
Bacillus-Stämme zu bestimmen, wurden Western Blot Analysen
durchgeführt. 3 (oberer Teil) zeigt die Ergebnisse,
welche mit dem monoklonalen Antikörper TOP19 erhalten wurden,
dessen Epitop zu dem „helix-turn-helix”-Motiv
von TetR(B) passt, welches identisch zu dem von TetR ist (Pook,
E., S. Grimm, A. Bonin, T. Winkler, and W. Hillen. 1998. Affinities
of mAbs to Tet repressor complexed with Operator or tetracycline
suggest conformational changes associated with induction. Eur J
Biochem 258: 915-922). Die ungefähr gleich starken
Signale, welche mit löslichen Proteinextrakten von WH557,
WH558 und RAB100 erhalten wurden, heben sich von der schwächeren Bande
im Falle von RAB102 ab. Kein Signal wurde dagegen im Falle von RAB101
beobachtet, welches das vorzeitig terminierte TLKLT-Produkt kodierte, welches
den Aminosäureresten 1-161 des TetR-Proteins entsprach,
allerdings mit zusätzlichen 11 Aminosäuren am
C-Terminus. Zusätzliche Western Blot Analysen unter Verwendung
von gegen das TetR-Protein gerichteten polyklonalen Antikörpern
ergaben eine stärkere Reduktion der Signalintensität bei
RAB102 im Ver gleich zu WH558 und RAB100. Dies kann durch weniger
Antikörpererkennungsepitope in der veränderten
Schlaufenregion von TetRlox72/1 im Vergleich
zum Wildtyp-TetR-Protein erklärt werden. Trotzdem waren
die reduzierten Regulatormengen von RAB102 ausreichend, um eine
sehr effiziente Tet-Regulation in dem B. subtilis-Modell-System
zu erreichen.
-
3. Figurenbeschreibung
-
1A zeigt
die Struktur von TetR(D). Die für diese Methode ausgewählte
Zielregion des TetR-Proteins ist dabei die von den Pfeilen eingeschlossene
Region.
-
1B zeigt
die Orientierung von Aminosäuresequenzen verschiedener α8-α9-Schleifenregionen.
Dargestellt sind die Aminosäuresequenzen von den fünf
C-terminalen Resten der Helix α8 bis zu dem Ende der Helix α9
von TetR-Varianten oder TetR-artigen Polypeptiden. Identische Positionen
sind dabei schwarz oder grau hinterlegt. Das C-terminale Ende von
TetRlox72/2-inv wird mit einem schwarzen
Karo abgeschlossen. Die Positionen der zwei Pstl-Stellen, welche
zum Klonieren innerhalb der entsprechenden tetR-Allele verwendet
wurden, sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die β-Galaktosidase-Aktivitäten
der entsprechenden Konstrukte, welche in E. coli (in %) bestimmt
wurden, sind auf der rechten Seite angegeben.
-
2A zeigt
eine schematische Darstellung von Genregionen im Stamm WH558. Die
Regionen des tetR-Gens und der Pxyl/tet-lacZ-Fusion
sind schematisch dargestellt. Die offenen geknickten Pfeile bezeichnen
den Promotor Pt17 (für tetR-Expression) und Pxyl/tet (tet-regulierbar,
stromaufwärts von lacZ). Die schwarzen Trapezoide zeigen
verschiedene lox-Sequenzen, welche die Kanamycin-Resistenz-Kassette
(aphAIII) flankieren, und deren Orientierung an. Die mit einem „O” markierten
Kästchen geben den tet-Operator wieder. Ein transkriptioneller Terminator
ist als Haarnadel dargestellt. Die sich anschließenden
Stop-Codons sind durch ein fett markiertes „S” symbolisiert.
-
2B zeigt
schematisch die multiplen Veränderungen der tetR-Region.
In einem ersten Schritt wurde das aphAIII-Gen durch die Cre-Rekombinase herausgeschnitten.
Dies führte zu dem markerfreien Stamm RAB100. In einem
zweiten Schritt wurde das tetR-Gen durch eine doppelte homologe
Rekombination gegen eine tetR'-lox66-aphAIII-lox71-tetR-Sequenz
(tlklt) ersetzt. Dies lieferte den B. subtilis-Stamm RAB101. In
einem dritten Schritt wurde das aphAIII-Gen erneut durch Cre eliminiert.
Dies ergab das finale Konstrukt RAB102, welches tetRlox72/1 aufwies.
Die für die analytischen PCR-Reaktionen verwendeten Primer
sind als schmale Pfeile und mit einer römischen Nummerierung
dargestellt und bedeuten: I) lox_test_fw, II) DP3, III) DP8neu,
IV) Km1, V) Km2, VI) lox_test_rev.
-
2C zeigt
die Ergebnisse der analytischen PCR. Die PCR-Produkte der vier dargestellten B.
subtilis-Stämme wurden mit den folgenden Primerkombinationen
erhalten (vgl. 2B zur ungefähren Primerlokalisation):
Bahn 1: I) + VI), Bahn 2: III) + VI), Bahn 3: I) + II) und Bahn
4: IV) + V) (von links nach rechts). Des weiteren sind die Größen
von selektierten Referenzbanden (in bp) dargestellt.
-
3 zeigt
die regulatorischen Kapazitäten und Regulatormengen von
verschiedene B. subtilis-Stämmen. Die Ergebnisse der Messungen
der β-Galaktosidase-Aktivität sind in der oberen
Abbildung dargestellt. Die y-Achse gibt dabei die Miller-Einheiten
wieder. Als Kontrollstämme wurden WH557, welcher tetR aber
nicht lacZ kodierte, und WH560, welcher Pxyl/tet-lacZ
aber nicht tetR aufwies. Die offenen Balken zeigen dabei die Werte,
welche ohne ATc-erhalten wurden, wohingegen die geschlossenen Balken
0.4 μM ATc-Bedingungen widerspiegeln. Die Ergebnisse von
Western Blot Analysen für die entsprechenden Stämme,
welche unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers
erhalten wurden, sind in der unteren Abbildung von 3 dargestellt.
Hierbei wurden 80 ng gereinigten TetR-Proteins als Kontrolle verwendet.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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