DE60121372T2 - Methoden zur modifikation eukaryotischer zellen - Google Patents

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Das Gebiet dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Konstruktion und Nutzung großer DNA-Vektoren, um über die homologe Rekombination endogene Gene und chromosomale Loci in eukaryotischen Zellen anzuzielen und in einer gewünschten Weise zu modifizieren. Diese großen DNA-Targeting-Vektoren für eukaryotische Zellen, bezeichnet als LTVECs, sind von Fragmenten aus klonierter genomischer DNA abgeleitet, die größer als jene sind, die typischerweise bei anderen, zur Durchführung des homologen Targeting in eukaryotischen Zellen vorgesehenen Ansätzen verwendet werden. Das Gebiet der Erfindung bietet außerdem ein schnelles und bequemes Verfahren zum Nachweisen von eukaryotischen Zellen, in denen der LTVEC das/die gewünschte(n) endogene(n) Gen(e) oder chromosomale(n) Locus/Loci korrekt angezielt und modifiziert hat. Das Gebiet umfasst auch die Verwendung dieser Zellen zur Generierung von Organismen, die die genetische Modifikation tragen, die Organismen selbst und die Methoden zu deren Anwendung.
  • Einführung
  • Die Verwendung von LTVECs bietet wesentliche Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Da diese beispielsweise von DNA-Fragmenten abgeleitet sind, die größer als die derzeit zur Konstruktion von Targeting-Vektoren verwendeten sind, können LTVECs schneller und bequemer aus verfügbaren Bibliotheken großer genomischer DNA-Fragmente (wie etwa BAC- und PAC-Bibliotheken) generiert werden als Targeting-Vektoren, die unter Anwendung der aktuellen Technologien konstruiert werden. Außerdem lassen sich sowohl größere Modifikationen als auch größere genomische Regionen durchspannende Modifikationen bequemer vornehmen als unter Anwendung der derzeitigen Technologien.
  • Außerdem zieht die vorliegende Erfindung Nutzen aus langen Homologieregionen, um die Targeting-Frequenz von "schwer anzuzielenden" Loci zu erhöhen, und verringert dabei den potentiellen Nutzen der Verwendung von isogener DNA in diesen Targeting-Vektoren.
  • Die vorliegende Erfindung liefert damit ein schnelles, bequemes und rationelles Verfahren für die systematische Modifikation nahezu aller endogener Gene und chromosomalen Loci eines gegebenen Organismus.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Gen-Targeting mittels der homologen Rekombination zwischen homologer exogener DNA und endogenen chromosomalen Sequenzen hat sich als extrem wertvolle Art und Weise der Schaffung von Deletionen oder Insertionen, der Konstruktion von Mutationen, der Korrektur von Genmutationen, der Einführung von Transgenen oder der Erzeugung anderer genetischer Modifikationen in Mäusen erwiesen. Die derzeitigen Methoden beziehen die Verwendung standardmäßiger Targeting-Vektoren ein, wobei die Homologieregionen zu endogener DNA typischerweise insgesamt weniger als 10–20 kb betragen, zur Einführung der gewünschten genetischen Modifikation in mausembryonale Stamm-(ES)-Zellen, gefolgt von der Injektion der veränderten ES-Zellen in Mäuseembryos, um diese gentechnisch hergestellten Modifikationen in die Maus-Keimbahn zu übertragen (Smithies et al., Nature, 317: 230–234, 1985; Thomas et al., Cell, 51: 503–512, 1987; Koller et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 8927–8931, 1989; Kuhn et al., Science, 254: 707–710, 1991; Thomas et al., Nature, 346: 847–850, 1990; Schwartzberg et al., Science, 246: 799–803, 1989; Doetschman et al., Nature, 330: 576–578, 1987; Thomson et al., Cell, 5: 313–321, 1989; DeChiara et al., Nature, 345: 78–80, 1990; U.S. Patent Nr. 5.789.215, erteilt am 4. August 1998 an GenPharm International). Bei diesen aktuellen Methoden erfordert der Nachweis der raren ES-Zellen, in denen die standardmäßigen Targeting-Vektoren korrekt gezielt und das/die gewünschte(n) endogene(n) Gen(e) oder chromosomale(n) Locus/Loci modifiziert hat/haben, eine Sequenzinformation über die homologen Zielsequenzen hinaus, die innerhalb des Targeting-Vektors enthalten sind. Assays für ein erfolgreiches Targeting beinhalten ein standardmäßiges Southern-Blotting oder eine lange PCR (Cheng et al., Nature, 369: 684–5, 1994; Foord und Rose, PCR Methods Appl, 3: S149–61, 1994; Ponce und Micol, Nucleic Acids Res, 20: 623, U.S. Patent Nr. 5.436.149, erteilt an Takara Shuzo Co., Ltd.) von Sequenzen außerhalb des Targeting-Vektors, die einen gesamten Homologiearm durchspannen (siehe Definitionen); daher ist aufgrund von Größenberücksichtigungen, die diese Methoden beschränken, die Größe der Homologiearme auf weniger als insgesamt 10–20 kb beschränkt (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999).
  • Die Möglichkeit, Targeting-Vektoren mit längeren Homologiearmen als bei den derzeitigen Methoden verwendet nützen zu können, wäre extrem wertvoll. Zum Beispiel könnten solche Targeting-Vektoren schneller und bequemer aus verfügbaren Bibliotheken erzeugt werden, die große genomische Inserte enthalten (z.B. BAC- oder PAC-Bibliotheken), als Targeting-Vektoren, die unter Anwendung der derzeitigen Technologien konstruiert werden und bei denen solche genomischen Inserte vor der Verwendung umfassend charakterisiert und zugeschnitten werden müssen. Außerdem könnten sowohl größere Modifikationen als auch größere genomische Regionen durchspannende Modifikationen in bequemerer Weise und in weniger Schritten erzeugt werden als unter Anwendung der derzeitigen Technologien. Weiterhin könnte die Verwendung langer Homologieregionen die Targeting-Frequenz von "schwer anzielbaren" Loci in eukaryotischen Zellen erhöhen, da das Targeting der homologen Rekombination in eukaryotischen Zellen auf die Gesamthomologie bezogen zu sein scheint, die innerhalb des Targeting-Vektors vorhanden ist (Deng und Capecchi, Mol Cell Biol, 12: 3365–71, 1992). Außerdem könnte die unter Verwendung langer Homologiearme erzielte erhöhte Targeting-Frequenz jeglichen potenziellen Nutzen verringern, der aus der Verwendung von isogener DNA in diesen Targeting-Vektoren gezogen werden kann.
  • Das Problem, präzise Modifikationen in sehr großen genomischen Fragmenten, wie etwa den in BAC-Bibliotheken klonierten Fragmenten, zu konstruieren, wurde größtenteils durch die Anwendung der homologen Rekombination in Bakterien gelöst (Zhang, et al., Nat. Genet. 20: 123–8, 1998, Yang, et al., Nat Biotechnol, 15: 859–65, 1997; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27: e16, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555–7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999), was die Konstruktion von Vektoren erlaubt, die große Homologieregionen zu eukaryotischen endogenen Genen oder chromosomalen Loci enthalten. Einmal erzeugt, sind diese Vektoren jedoch nicht generell nützlich zum Modifizieren von endogenen Genen oder chromosomalen Loci auf dem Wege der homologen Rekombination gewesen, was an der Schwierigkeit des Nachweises der raren korrekten Targeting-Ereignisse liegt, wenn die Homologiearme länger als 10 bis 20 kb sind (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). Folglich müssen Vektoren, die unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination aus BAC-genomischen Fragmenten erzeugt werden, vor ihrer Verwendung als Targeting-Vektoren immer noch umfassend zugeschnitten werden (Hill et al., Genomics, 64: 111–3, 2000). Daher besteht nach wie vor Bedarf an einer schnellen und bequemen Methodologie, die die Verwendung von Targeting-Vektoren möglich macht, die große Homologieregionen enthalten, um endogene Gene oder chromsomale Loci in eukaryotischen Zellen zu modifizieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung stellen die Anmelder neuartige Methoden bereit, die die Verwendung von Targeting-Vektoren ermöglichen, die größere Homologieregionen enthalten, um endogene Gene oder chromsomale Loci in eukaryotischen Zellen über die homologe Rekombination zu modifizieren. Diese Methoden überwinden die oben beschriebenen Beschränkungen der derzeitigen Technologien. Außerdem wird der geübte Fachmann ohne weiteres erkennen, dass die Methoden der Erfindung sich ohne weiteres für die Anwendung mit einer beliebigen genomischen DNA eines beliebigen eukaryotischen Organismus adaptieren lassen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Tiere, wie Mäuse, Ratten, andere Nager, oder Menschen, als auch Pflanzen, wie Soja, Mais und Weizen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Anmelder ein neuartiges, schnelles, rationelles und effizientes Verfahren zur Schaffung und zum Screening von eukaryotischen Zellen entwickelt, die modifizierte endogene Gene oder chromsomale Loci enthalten. Bei diesen neuartigen Verfahren wird erstmalig kombiniert:
    • 1. Die bakterielle homologe Rekombination, um eine gewünschte genetische Modifikation innerhalb eines großen klonierten genomischen Fragments präzise zu konstruieren, wobei ein großer Targeting-Vektor zur Verwendung in eukaryotischen Zellen (LTVECs) geschaffen wird;
    • 2. die direkte Einführung dieser LTVECs in eukaryotische Zellen, um den endogenen chromosomalen Locus von Interesse in diesen Zellen zu modifizieren; und
    • 3. eine Analyse zur Bestimmung der raren eukaryotischen Zellen, in denen das angezielte Allel wie gewünscht modifiziert worden ist, unter Einbeziehung eines Assays für die Modifikation des Allels (MOA) des parentalen Allels, das keine Sequenzinformation außerhalb der Zielsequenz erfordert, wie zum Beispiel die quantitative PCR.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren für die genetische Modifikation eines endogenen Gens oder chromsomalen Locus in eukaryotischen Zellen, umfassend: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in den eukaryotischen Zellen (LTVEC); wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen; c) Einführen der LTVEC aus (b) in die eukaryotischen Zellen zum Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; und d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den eukaryotischen Zellen aus (c), um jene eukaryotischen Zellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren, wobei die genetische Modifikation an dem endogenen Gen oder chromosomalen Locus die Deletion einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements; Alteration einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements; Insertion einer neuen Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Ele ments; Schaffung eines konditionellen Allels; oder Ersetzung einer Codierungssequenz oder Gensegments von einer Spezies durch eine homologe oder orthologe Codierungssequenz von einer unterschiedlichen Spezies umfasst.
  • Eine alternative Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren, wobei die Alteration einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements eine Substitution, Addition oder Fusion umfasst, wobei die Fusion ein Epitop-Tag oder bifunktionelles Protein umfasst.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren, wobei der quantitative Assay die quantitative PCR, vergleichende genomische Hybridisierung, isotherme DNA-Amplifikation, quantitative Hybridisierung an eine immobilisierte Sonde, Invader Probes® oder MMP Assays® umfasst, und wobei die quantitative PCR TaqMan® Molecular Beacon oder Eclipse®-Sondentechnologie umfasst.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren, wobei die eukaryotische Zelle eine nicht-humane säugerembryonale Stammzelle ist, und insbesondere, wobei die embryonale Stammzelle eine Maus-, Ratten- oder andere Nagerembryo-Stammzelle ist.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren, wobei das endogene Gen oder der chromsomale Locus ein Säugergen oder -chromosomaler Locus ist, vorzugsweise ein menschliches Gen oder chromosomaler Locus oder ein Maus-, Ratten- oder anderes Nager-Gen oder chromosomaler Locus.
  • Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist eine solche, bei der der LTVEC zum Beherbergen großer DNA-Fragmente von größer 100 kb fähig ist.
  • Ein nicht-humaner Organismus, der ein genetisch modifiziertes endogenes Gen oder chromosomalen Locus enthält, kann somit mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizie ren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors (LTVEC) zur Verwendung in embryonalen Stammzellen; wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen; c) Einführen der LTVEC aus (b) in die embryonalen Stammzellen zum Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den embryonalen Stammzellen aus (c), um jene embryonalen Stammzellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist; e) Einführen der embryonalen Stammzellen aus (d) in eine Blastozyste; und f) Einführen der Blastozyste aus (e) in eine Surrogat-Mutter für die Gestation.
  • Außerdem kann ein nicht-humaner Organismus, der ein genetisch modifiziertes endogenes Gen oder chromosomalen Locus enthält, mittels eines Verfahrens hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in den eukaryotischen Zellen (LTVEC); wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen; c) Einführen der LTVEC aus (b) in die eukaryotischen Zellen zum genitischen Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den eukaryotischen Zellen aus (c), um jene eukaryotischen Zellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist; e) Entfernen des Kerns aus der eukaryotischen Zelle aus (d); f) Einführen des Kerns aus (e) in eine Eizelle; und g) Einführen der Eizelle aus (f) in eine Surrogat-Mutter für die Gestation.
  • Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein nicht-humaner Organismus, der ein genetisch modifiziertes endogenes Gen oder chromosomalen Locus enthält, mittels eines Verfahrens hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in eukaryotischen Zellen (LTVEC); wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen; c) Einführen der LTVEC aus (b) in die eukaryotischen Zellen zum genetischen Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den eukaryotischen Zellen aus (c), um jene eukaryotischen Zellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist; e) Fusionieren der eukaryotischen Zelle (d) mit einer anderen eukaryotischen Zelle; f) Einführen der fusionierten eukaryotischen Zelle aus (e) in eine Surrogat-Mutter für die Gestation.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der nicht-humane Organismus eine Maus, Ratte oder ein anderer Nager, ist die Blastozyste eine Maus-, Ratten- oder andere Nager-Blastozyste; ist die Eizelle eine Maus-, Ratten- oder andere Nager-Eizelle; und ist die Surrogat-Mutter eine Maus, Ratte oder ein anderer Nager.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine solche, bei der die embryonale Stammzelle eine nicht-humane säugerembryonale Stammzelle ist, vorzugsweise eine Maus-, Ratten- oder andere Nagerembryo-Stammzelle.
  • Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform besteht in der Verwendung der genetisch modifizierten eukaryotischen Zellen der Erfindung für die Schaffung eines nicht-humanen Organismus, und insbesondere die Verwendung der genetisch modifizierten nicht-humanen embryonalen Stammzelle der Erfindung für die Schaffung eines nicht-humanen Organismus.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren für das genetische Modifizieren eines endogenen Gens oder chromsomalen Locus von Interesse in mausembryonalen Stammzellen, umfassend: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält, wobei das große klonierte DNA-Fragment homolog zu dem endogenen Gen oder chromosomalen Locus ist; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in den mausembryonalen Stammzellen, wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen, wobei die genetische Modifikation die Deletion einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements ist; c) Einführen des großen Zielvektors aus (b) in die mausembryonalen Stammzellen zum Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; und d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den mausembryonalen Stammzellen aus (c), um jene mausembryonalen Stammzellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist, wobei der quantitative Assay eine quantitative PCR ist.
  • Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung der oben beschriebenen genetisch modifizierten mausembryonalen Stammzelle für die Schaffung einer Maus.
  • Ebenfalls bevorzugt sind Verfahren, worin etwa 1 bis 5 μg einer großen Targeting-Vektor-DNA in etwa 1 × 107 eukaryotische Zellen eingeführt werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Schematisches Diagramm der Erzeugung eines typischen LTVEC unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination.
    (hb1 = Homologiebox 1; hb2 = Homologiebox 2; RE = Restriktionsenzymstelle).
  • 2: Schematisches Diagramm eines Donorfragments und LTVEC für Maus OCR10.
    (hb1 = Homologiebox 1; lacZ = β-Galactosidase-ORF; SV40 polyA = ein DNA-Fragment, abgeleitet von Affenvirus 40, enthaltend eine Polyadenylierungsstelle und Signal; PGKp = Maus-Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Promotor; EM7 = ein bakterieller Promotor; Neo = Neomycinphosphotransferase; PGK polyA = 3'-untranslatierte Region, abgeleitet vom PGK-Gen und enthaltend eine Polyadenylierungsstelle und Signal; hb2 = Homologiebox 2)
  • 3A–3D: Sequenz der Maus-OCR10-cDNA, Homologiebox 1 (hb1), Homologiebox 2 (hb2) und TaqMan®-Sonden und Primer, verwendet in einem quantitativen PCR-Assay zum Detektieren der Modifikation des Allels (MOA) in unter Verwendung des mOCR10-LTVEC angezielten ES-Zellen.
    hb1: Basenpaare 1 bis 211
    hb2: Basenpaare 1586–1801
    TaqMan®-Sonde und entsprechender PCR-Primersatz, abgeleitet vom mOCR10 Exon 3:
    TaqMan®-Sonde: Nukleotide 413 bis 439 – oberer Strang
    Primer ex3-5': Nukleotide 390 bis 410 – oberer Strang
    Primer ex3-3': Nukleotide 445 bis 461 – unterer Strang
    TaqMan®-Sonde und entsprechender PCR-Primersatz, abgeleitet vom mOCR10 Exon 4:
    TaqMan®-Sonde: Nukleotide 608 bis 639 – oberer Strang
    Primer ex4-5': Nukleotide 586 bis 605 – oberer Strang
    Primer ex4-3': Nukleotide 642 bis 662 – unterer Strang
  • Definitionen
  • Ein "Targeting-Vektor" ist ein DNA-Konstrukt, das "homologe" Sequenzen zu endogenen chromosomalen Nukleinsäuresequenzen enthält, die (eine) gewünschte genetische Modifikation(en) flankieren. Die flankierenden Homologiesequenzen, bezeichnet als "Homologiearme", lenken den Targeting-Vektor zu einer spezifischen chromosomalen Lokalisation innerhalb des Genoms dank der Homologie, die zwischen den Homologiearmen und der entsprechenden endogenen Sequenz vorliegt und bringen die gewünschte genetische Modifikation mittels eines Vorgangs ein, der als "homologe Rekombination" bezeichnet ist.
  • "Homolog" meint zwei oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die entweder identisch oder ähnlich genug sind, um dazu in der Lage zu sein, aneinander zu hybridisieren oder einen intermolekularen Austausch zu vollziehen.
  • "Gen-Targeting" bezeichnet die Modifikation eines endogenen chromosomalen Locus durch die Insertion in, Deletion von oder Ersetzung der endogenen Sequenz über die homologe Rekombination unter Verwendung eines Targeting-Vektors.
  • Ein "Gen-Knockout" ist eine genetische Modifikation, die aus der Zerstörung der genetischen Information, die in einem chromosomalen Locus codiert ist, resultiert.
  • Ein "Gen-Knock-in" ist eine genetische Modifikation, die aus der Ersetzung der genetischen Information, die in einem chromosomalen Locus codiert ist, durch eine unterschiedliche DNA-Sequenz resultiert.
  • Ein "Knockout-Organismus" ist ein Organismus, bei dem ein signifikanter Anteil der Zellen des Organismus ein Gen-Knockout beherbergen.
  • Ein "Knock-in-Organismus" ist ein Organismus, bei dem signifikanter Anteil der Zellen des Organismus ein Gen-Knock-in beherbergen.
  • Ein "Marker" oder ein "selektierbarer Marker" ist ein Selektionsmarker, der die Isolierung rarer transfizierter Zellen, die den Marker exprimieren, von der Mehrheit der behandelten Zellen in der Population erlaubt. Zu solchen Markergenen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Neomycinphosphotransferase und Hygromycin-B-Phosphotransferase, oder fluoreszierende Proteine wie GFP.
  • Eine "ES-Zelle" ist eine embryonale Stammzelle. Diese Zelle ist gewöhnlich aus der inneren Zellmasse eines Embryos im Blastozysten-Stadium abgeleitet.
  • Ein "ES-Zellklon" ist eine Subpopulation von Zellen, die von einer einzelnen Zelle der ES-Zellpopulation nach Einführung von DNA und anschließender Selektion abgeleitet ist.
  • Eine "flankierende DNA" ist ein Segment von DNA, das kolinear mit und angrenzend an einen bestimmten Bezugspunkt ist.
  • "LTVECs" sind große Targeting-Vektoren für eukaryotische Zellen, die von Fragmenten von klonierter genomischer DNA abgeleitet sind, die größer als solche sind, die bei anderen Ansätzen typischerweise verwendet werden, wie sie zur Durchführung des homologen Targeting in eukaryotischen Zellen vorgesehen sind.
  • Ein "nicht-humaner Organismus" ist ein Organismus, der durch die Allgemeinheit normalerweise nicht als human akzeptiert ist.
  • "Modifikation des Allels" (MOA) bezieht sich auf die Modifikation der exakten DNA-Sequenz eines Allels eines/mehrerer Gens/e oder chromosomalen Locus/Loci in einem Genom. Diese Modifikation des Allels (MOA) umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen von lediglich einem einzelnen Nukleotid oder Deletionen von vielen Kilobasen, die ein/mehrere Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse durchspannen, als auch jegliche und alle möglichen Modifikationen zwischen diesen beiden Extremen.
  • "Orthologe" Sequenz bezieht sich auf eine Sequenz von einer Spezies, die das funktionelle Äquivalent jener Sequenz in einer anderen Spezies ist.
  • Die unten angegebene Beschreibung und Beispiele sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Ein Fachmann des Gebiets wird erkennen, dass diese Beispiele lediglich der Veranschaulichung dienen und nicht zum Zwecke einer Beschränkung der Erfindung aufgenommen sind.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Anmelder haben ein neuartiges, schnelles, rationelles und effizientes Verfahren für die Schaffung und das Screening von eukaryotischen Zellen entwickelt, die modifizierte endogene Gene oder chromosomale Loci enthalten. In diesen Zellen können die Modifikation Gen-Knockouts, Knock-ins, Punktmutationen oder große genomische Insertionen oder Deletionen oder andere Modifikationen sein. Anhand eines nicht-beschränkenden Beispiels können diese Zellen embryonale Stammzellen sein, die zur Schaffung von Knockout- oder Knock-in-Organismen, und insbesondere Knockout- oder Knock-in-Mäusen, für den Zweck der Bestimmung der Funktion des/der Gens/e, das/die verändert, deletiert und/oder inseriert worden ist/sind, nützlich sind.
  • Die hierin beschriebenen neuartigen Verfahren kombinieren erstmals:
    • 1. Die bakterielle homologe Rekombination, um eine gewünschte genetische Modifikation innerhalb eines großen klonierten genomischen Fragments präzise zu konstruieren, wobei ein großer Targeting-Vektor zur Verwendung in eukaryotischen Zellen (LTVECs) geschaffen wird;
    • 2. die direkte Einführung dieser LTVECs in eukaryotische Zellen, um das/die entsprechende(n) endogene(n) Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse in diesen Zellen zu modifizieren; und
    • 3. eine Analyse zur Bestimmung der raren eukaryotischen Zellen, in denen das angezielte Allel wie gewünscht modifiziert worden ist, unter Einbeziehung eines quantitativen Assays für die Modifikation des Allels (MOA) des parentalen Allels.
  • Es sollte betont werden, dass vorherige Verfahren zum Nachweisen einer erfolgreichen homologen Rekombination in eukaryotischen Zellen in Verbindung mit den LTVECs der Erfindung der Anmelder aufgrund der in den LTVECs vorhandenen langen Homologiearme nicht angewendet werden können. Die Nutzung eines LTVEC für die wohlüberlegte Modifikation von endogenen Genen oder chromosomalen Loci in eukaryotischen Zellen über die homologe Rekombination wird durch die neue Anwendung eines Assays zur Bestimmung der raren eukaryotischen Zellen, in denen das angezielte Allel wie gewünscht modifiziert worden ist, möglich gemacht, welcher Assay einen quantitativen Assay für die Modifikation des Allels (MOA) eines parentalen Allels durch Anwendung beispielsweise der quantitativen PCR oder anderer geeigneter quantitativer Assays für die MOA einbezieht.
  • Die Verwendbarkeit von Targeting-Vektoren mit längeren Homologiearmen als bei den aktuellen Methoden verwendet ist aus den folgenden Gründen extrem wertvoll:
    • 1. Die Targeting-Vektoren werden schneller und bequemer aus verfügbaren Bibliotheken, die große genomische Inserte enthalten (z.B. BAC- oder PAC-Bibliotheken), erzeugt als Targeting-Vektoren, die unter Anwendung früherer Technologien erzeugt werden, in welchen die genomischen Inserte vor ihrer Verwendung umfassend charakterisiert und "zugeschnitten" werden müssen (nachstehend ausführlich erläutert). Außerdem braucht lediglich eine minimale Sequenzinformation über den Locus von Interesse bekannt zu sein, d.h. es ist lediglich erforderlich, die etwa 80–100 Nukleotide zu kennen, die zur Generierung der Homologieboxen (nachstehend ausführlich beschrieben) und zur Generierung von Sonden, die in quantitativen Assays für MOA verwendet werden können, erforderlich sind (nachstehend ausführlich beschrieben).
    • 2. Sowohl größere Modifikationen als auch größere genomische Regionen durchspannende Modifikationen lassen sich bequemer und in weniger Schritten erzeugen als unter Anwendung der bisherigen Technologien. Zum Beispiel macht das Verfahren der Erfindung die präzise Modifikation großer Loci möglich, die durch traditionelle Plasmid-basierte Targeting-Vektoren aufgrund ihrer Größenbeschränkungen nicht abgedeckt werden können. Es macht auch die Modifikation irgendeines gegebenen Locus an vielfachen Punkten (z.B. die Einführung spezifischer Mutationen an verschiedenen Exons eines Multi-Exon-Gens) in einem Schritt möglich, was das Erfordernis vermindert, vielfache Targeting-Vektoren zu konstruieren und vielfache Runden aus Targeting und Screening für die homologe Rekombination in ES-Zellen durchzuführen.
    • 3. Die Verwendung langer Regionen von Homologie (lange Homologiearme) erhöht die Targeting-Frequenz bei "schwer anzielbaren" Loci in eukaryotischen Zellen, was mit den bisherigen Feststellungen übereinstimmt, dass das Targeting der homologen Rekombination in eukaryotischen Zellen in Bezug zur Gesamthomologie zu stehen scheint, die innerhalb des Targeting-Vektors vorhanden ist.
    • 4. Die unter Verwendung der langen Homologiearme erzielte erhöhte Targeting-Frequenz scheint den potentiellen Nutzen der Verwendung von isogener DNA in diesen Targeting-Vektoren zu verringern.
    • 5. Die Anwendung quantitativer MOA-Assays für das Screening von eukaryotischen Zellen für die homologe Rekombination bestärkt nicht nur die Verwendung der LTVECs als Targeting-Vektoren (oben dargestellte Vorteile), sondern verringert auch die erforderliche Zeit zum Identifizieren von korrekt modifizierten eukaryotischen Zellen von den typischen mehreren Tagen auf nur wenige Stunden. Außerdem erfordert die Anwendung der quantitativen MOA nicht die Verwendung von Sonden, die außerhalb des/der endogenen Gens/e oder chromosomalen Locus/Loci, das/die zu modifizieren ist/sind, lokalisiert sind, wodurch sich das Erfordernis erübrigt, die Sequenz zu kennen, die das/die modifizierte(n) Gen(e) oder Locus/Loci flankiert. Dies stellt eine wesentliche Verbesserung der Art und Weise des Screenings, wie es in der Vergangenheit durchgeführt worden ist, dar und macht es zu einem viel weniger arbeitsintensiven und viel kostenwirksameren Ansatz für das Screening auf homologe Rekombinationsereignissen in eukaryotischen Zellen.
  • Methoden
  • Bei vielen der Techniken, die zur hierin beschriebenen Konstruktion von DNA-Vektoren angewendet werden, handelt es sich um einem Fachmann des Gebiets wohlbekannte standardmäßige molekularbiologische Techniken (siehe z.B. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Die gesamte DNA-Sequenzierung wird mittels standardmäßiger Techniken unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequenzierers und Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit vorgenommen (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
  • Schritt 1. Erhalten eines großen genomischen DNA-Klons, der das/die Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse enthält.
  • Ein/Mehrere Gen(e) oder Locus/Loci von Interesse können auf der Grundlage spezifischer Kriterien ausgewählt werden, wie etwa detaillierter struktureller oder funktioneller Daten, oder kann/können bei Nichtvorhandensein solch detaillierter Information ausgewählt werden, da potenzielle Gene oder Genfragmente aufgrund der Bemühungen verschiedener Genomsequenzierungs-Projekte vorhersagbar werden.
  • Wichtig ist, zur Kenntnis zu nehmen, dass die Kenntnis der kompletten Sequenz und Genstruktur eines/mehrerer Gens/e von Interesse nicht erforderlich ist, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Konstruktion von LTVECs anzuwenden. Tatsächlich betrifft die einzige erforderliche Sequenzinformation etwa 80–100 Nukleotide, um den genomischen Klon von Interesse zu erhalten als auch die Homologieboxen zu generieren, die zur Erzeugung der LTVECs verwendet werden (nachstehend ausführlich beschrieben) und um Sonden für die Anwendung in quantitativen MOA-Assays zu erzeugen.
  • Ist/sind ein/mehrere Gen(e) oder Locus/Loci von Interesse einmal ausgewählt worden, so wird/werden ein/mehrere große(r) genomische(r) Klon(e), der/die diese(s) Gen(e) oder Locus/Loci enthält/enthalten, erhalten. Diese(r) Klon(e) kann/können auf eine von mehreren Weisen erhalten werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf das Screening geeigneter DNA-Bibliotheken (z.B. BAC, PAC, YAC oder Cosmid) mittels standardmäßiger Hybridisations- oder PCR-Techniken, oder mittels jeglichen anderen Methoden, mit denen der Fachmann des Gebiets vertraut ist.
  • Schritt 2. Anhängen der Homologieboxen 1 und 2 an eine Modifikationskassette und Generieren des LTVEC.
  • Homologieboxen markieren die Stellen der bakteriellen homologen Rekombination, die zur Konstruktion der LTVECs aus großen klonierten genomischen Fragmenten genützt werden (1). Homologieboxen stellen kurze Segmente von DNA dar, die im Allgemeinen doppelsträngig und zumindest 40 Nukleotide lang sind, die homolog zu Regionen innerhalb des großen klonierten genomischen Fragments sind, die "die zu modifizierende Region" flankieren. Die Homologieboxen sind an die Modifikationskassette angehängt, so dass nach der homologen Rekombination in Bakterien die Modifikationskassette die zu modifizierende Region ersetzt (1). Die Technik der Schaffung eines Targeting-Vektors unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination kann in einer Vielfalt von Systemen ausgeführt werden (Yang et al., Nat Biotechnol, 15: 859–65, 1997; Muyrers et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555–7, 1999; Angrand et al., Nucleic Acids Res, 27: e16, 1999; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 5978–83, 2000). Ein Beispiel einer favorisierten, derzeit in Anwendung befindlichen Technologie ist das ET-Klonieren (Zhang et al., Nat Genet, 20: 123–8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999) und Variationen dieser Technologie (Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95: 5978–83, 2000). ET bezieht sich auf die recE-(Hall and Kolodner, Proc Natl Acad Sci USA, 91: 3205–9, 1994) und recT-Proteine (Kusano et al., Gene, 138: 17–25, 1994), die die homologe Rekombinationsreaktion ausführen. RecE ist eine Exonuklease, die einen Strang einer linearen doppelsträngigen DNA (im Wesentlichen das unten beschriebene Donor-DNA-Fragment) 5' nach 3' zurückschneidet, wodurch ein lineares doppelsträngiges Fragment mit einem einzelsträngigen 3'-Überhang zurückbleibt. Dieser einzelsträngige Überhang wird von recT-Protein überzogen, welches eine einzelsträngige DNA-(ssDNA)-Bindungsaktivität aufweist (Kovall und Matthews, Science, 277: 1824–7, 1997). Die ET-Klonierung wird unter Verwendung von E. coli durchgeführt, die vorübergehend die E. coli-Genprodukte von recE und recT exprimieren (Hall und Kolodner, Proc Natl Acad Sci USA, 91: 3205–9, 1994; Clark et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49: 453–52, 1984; Noirot und Kolodner, J Biol Chem, 273: 12274–80, 1998; Thresher et al., J Mol Biol, 254: 364–71, 1995; Kolodner et al., Mol Microbiol, 11: 23–30, 1994; Hall et al., J Bacteriol, 175: 277–87, 1993) und das Bakteriophagen-Lambda-(λ)-Protein λgam (Murphy, J Bacteriol, 173: 5808–21, 1991; Poteete et al., J Bacteriol, 170: 2012–21, 1988). Das λgam-Protein ist zum Schutz des Donor-DNA-Fragments vor Abbau durch das recBC-Exonuklease-System erforderlich (Myers und Stahl, Annu Rev Genet, 28: 49–70, 1994) und ist für eine effiziente ET-Klonierung in recBC+-Wirten, wie etwa dem häufig verwendeten E. coli-Stamm DH10b, erforderlich.
  • Die zu modifizierende und unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination zu ersetzende Region kann von null Nukleotiden Länge (Schaffung einer Insertion in den Ursprungslocus) bis zu vielen Zehnfachen von Kilobasen (Schaffung einer Deletion und/oder einer Ersetzung des Ursprungslocus) rangieren. In Abhängigkeit von der Modifikationskassette kann die Modifikation zu folgendem führen:
    • (a) Deletion der Codierungssequenzen, Gensegmente oder regulatorischen Elemente;
    • (b) Alteration(en) der Codierungssequenz, Gensegmente oder regulatorischen Elemente einschließlich Substitutionen, Additionen und Fusionen (z.B. Epitop-Tags oder Schaffung von bifunktionellen Proteinen, wie z.B. denen mit GFP);
    • (c) Insertion neuer Codierungsregionen, Gensegmente oder regulatorischen Elemente, wie etwa solchen für selektierbare Markergene oder Reportergene oder Stellen neuer Gene unter endogene Transkriptionskontrolle;
    • (d) Schaffung konditionaler Allele, z.B. durch Einführung von loxP-Stellen, die die durch Cre-Rekombinase auszuschneidende Region flankieren (Abremski und Hoess, J Biol Chem, 259: 1509–14, 1984) oder FRT-Stellen, die die durch Flp-Rekombinase auszuschneidende Region flankieren (Andrews et al., Cell, 40: 795–803, 1985; Meyer-Leon et al., Cold Spring Harb Symp Ouant Biol, 49: 797–804; 1984; Cox, Proc Natl Acad Sci USA, 80: 4223–7, 1983); oder
    • (e) Ersetzung der Codierungssequenzen oder Gensegmente von einer Spezies durch orthologe Codierungssequenzen von einer unterschiedlichen Spezies, z.B. Ersetzen eines murinen genetischen Locus durch den orthologen humanen genetischen Locus, um gentechnisch eine Maus zu schaffen, bei der jener bestimmte Locus "humanisiert" worden ist.
  • Jegliche oder alle dieser Modifikationen können in einen LTVEC eingebaut werden. Ein spezifisches, nicht-beschränkendes Beispiel, bei dem eine endogene Codierungssequenz gänzlich deletiert und gleichzeitig sowohl durch ein Reportergen als auch einen selektierbaren Marker ersetzt wird, ist nachstehend in Beispiel 1 bereitgestellt, ebenso wie die Vorteile des Verfahrens der Erfindung im Vergleich zu den vorherigen Technologien.
  • Schritt 3 (optional). Verifizieren, dass jeder LTVEC korrekt konstruiert worden ist.
  • Das Verifizieren, dass jeder LTVEC korrekt konstruiert worden ist, erfolgt durch:
    • a. Diagnostische PCR, um die neuartigen Junktionen zu verifizieren, die durch die Einführung des Donorfragments in das/die Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse geschaffen wurden. Die derart erhaltenen PCR-Fragmente können sequenziert werden, um die neuartigen, durch die Einführung des Donorfragments in das/die Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse geschaffenen Junktionen weiter zu verifizieren.
    • b. Diagnostischen Restriktionsenzym-Verdau, um sicherzugehen, dass lediglich die gewünschten Modifikationen in den LTVEC während des bakteriellen homologen Rekombinationsprozesses eingeführt worden sind.
    • c. Direktsequenzierung des LTVEC, insbesondere der Regionen, die den Ort der Modifikation durchspannen, um die durch die Einführung des Donorfragments in das/die Gen(e) oder chromosomalen Locus/Loci von Interesse geschaffenen Junktionen zu verifizieren.
  • Schritt 4. Reinigung, Präparierung und Linearisierung der LTVEC DNA für die Einführung in eukaryotische Zellen.
  • a. Präparierung von LTVEC DNA:
  • Präparieren von Miniprep-DNA (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989; Tillett und Neilan, Biotechniques, 24: 568–70, 572, 1998; http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf) des ausgewählten LTVEC und Retransformieren der Miniprep-LTVEC-DNA in E. coli unter Anwendung der Elektroporation (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989). Dieser Schritt ist erforderlich, um das Plasmid zu beseitigen, das die rekombinogenen Proteine codiert, die für den bakteriellen homologen Rekombinationsschritt genützt werden (Zhang et al., Nat Genet, 20: 123–8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999). Es ist von Nutzen, dieses Plasmid Izu beseitigen, (a) da es ein Plasmid in hoher Kopien zahl ist und die Ausbeuten vermindern kann, die bei den großmaßstäblichen LTVEC-Präparierungen erzielt werden; (b) um die Möglichkeit des Induzierens der Expression der rekombinogenen Proteine auszuschalten; und (c) da es die physikalische Kartierung des LTVEC verschleiern könnte. Vor der Einführung des LTVEC in eukaryotische Zellen werden größere Mengen an LTVEC DNA mittels einer standardmäßigen Methodologie präpariert (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdf; Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989; Tillett und Neilan, Biotechniques, 24: 568–70, 572, 1998). Dieser Schritt kann jedoch umgangen werden, wenn eine bakterielle homologe Rekombinationsmethode, die einen rekombinogenen Prophagen nützt, angewandt wird, d.h. dort, wo die Gene, die die rekombinogenen Proteine codieren, in das bakterielle Chromosom integriert werden (Yu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 97: 5978–83, 2000).
  • b. Linearisieren der LTVEC DNA:
  • Um den LTVEC zur Einführung in eukaryotische Zellen zu präparieren, wird der LTVEC vorzugsweise in einer Weise linearisiert, die die DNA des/r modifizierte(n) endogene(n) Gen(e) oder chromosomale(n) Locus/Loci flankiert mit langen Homologiearmen belässt. Dies kann durch Linearisieren des LTVEC, vorzugsweise im Vektor-Rückgrat, mit jeglichem geeigneten Restriktionsenzym erreicht werden, das lediglich selten verdaut. Zu Beispielen geeigneter Restriktionsenzyme zählen Notl, Pacl, Sfil, Srfl, Swal, Fsel, etc. Die Wahl des Restriktionsenzyms kann experimentell bestimmt werden (d.h. durch Testen mehrerer unterschiedlicher selten schneidender Kandidaten) oder, wenn die Sequenz des LTVEC bekannt ist, durch Analysieren der Sequenz und Auswählen eines geeigneten Restriktionsenzyms basierend auf der Analyse. In Situationen, bei denen der LTVEC ein Vektor-Rückgrat aufweist, das rare Stellen wie die CosN-Stellen enthält, kann es mit Enzymen geschnitten werden, die solche Stellen erkennen, zum Beispiel λ-Terminase (Shizuya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89: 8794–7, 1992; Becker und Gold, Proc Natl Acad Sci USA, 75: 4199–203, 1978; Rackwitz et al., Gene, 40: 259–66, 1985).
  • Schritt 5. Einführung von LTVEC in eukaryotische Zellen und Selektion der Zellen, bei denen eine erfolgreiche Einführung von LTVEC stattgefunden hat.
  • LTVEC DNA kann in eukaryotische Zellen unter Anwendung einer standardmäßigen Methodologie eingeführt werden, wie etwa eine durch Calciumphosphat, Lipide oder Elektroporation vermittelte Transfektion (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989). Die Zellen, in die der LTVEC erfolgreich eingeführt worden ist, können durch Aussetzen an Selektionsagenzien, in Abhängigkeit von dem selektierbaren Markergen, das in den LTVEC eingebaut worden ist, selektioniert werden. Als ein nicht-beschränkendes Beispiel können, wenn der selektierbare Marker das Neomycinphosphotransferase-(Neo)-Gen ist (Beck, et al., Gene, 19: 327–36, 1982), Zellen, die den LTVEC aufgenommen haben, in G418-enthaltenden Medien selektioniert werden; Zellen, die den LTVEC nicht aufgenommen haben, werden absterben, wohingegen Zellen, die den LTVEC aufgenommen haben, überleben werden (Santerre, et al., Gene, 30: 147–56, 1984). Zu weiteren geeigneten selektionierbaren Markern zählen jeglicher Wirkstoff, der eine Aktivität in eukaryotischen Zellen aufweist (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), wie etwa Hygromycin B (Santerre, et al., Gene, 30: 147–56, 1984; Bernard, et al., Exp Cell Res, 158: 237–43, 1985; Giordano und McAllister, Gene, 88: 285–8, 1990), Blasticidin S (Izumi, et al., Exp Cell Res, 197: 229–33, 1991) und andere, mit denen die Fachleute des Gebiets vertraut sind.
  • Schritt 6. Screenen auf homologe Rekombinationsereignisse in eukaryotischen Zellen unter Anwendung eines quantitativen Assays für die Modifikation des Allels (MOA).
  • Eukaryotische Zellen, die durch Targeting des LTVEC in den Locus von Interesse erfolgreich modifiziert worden sind, können unter Anwendung einer Vielzahl von Ansätzen identifiziert werden, die die Modifikation des Allels innerhalb des Locus von Interesse detektieren können und die nicht von Assays abhängen, die den gesamten Homologiearm oder -arme durchspannen. Solche Ansätze können umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt:
    • (a) quantitative PCR unter Verwendung von TaqMan® (Lie und Petropoulus, Curr Opin Biotechnol, 9: 43–8, 1998):
    • (b) quantitativer MOA-Assay unter Verwendung molekularer Beacons („Leuchtfeuer") (Tan, et al., Chemistry, 6: 1107–11, 2000)
    • (c) Fluoreszenz-in situ-Hybridisation – FISH (Laan, et al., Hum Genet, 96: 275–80, 1995) oder vergleichende genomische Hybridisation (CGH (Forozan, et al., Trends Genet, 13: 405–9, 1997; Thompson und Gray, J Cell Biochem Suppl, 139–43, 1993; Houldsworth und Chaganti, Am J Pathol, 145: 1253–60, 1994);
    • (d) isotherme DNA-Amplifikation (Lizardi, et al., Nat Genet, 19: 225–32, 1998; Mitra und Church, Nucleic Acids Res, 27: e34, 1999);
    • (d) quantitative Hybridisation an eine/mehrere immobilisierte Sonde(n) (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Kafatos FC; Jones CW; Efstratiadis A, Nucleic Acids Res 7(6): 1541–52, 1979);
    • (f) Invader Probes® (Third Wave Technologies);
    • (g) EclipseTM und Molecular Beacon-Sonden (Synthetic Genetics); und
    • (h) MMP-Assays (High Throughput Genomics)
  • Die Anmelder stellen hierin ein Beispiel bereit, in welchem TaqMan® quantitative PCR für das Screening auf erfolgreich angezielte eukaryotische Zellen angewendet wird. In diesem nicht-beschränkenden Beispiel wird TaqMan® zum Identifizieren eukaryotischer Zellen verwendet, die eine homologe Rekombination vollzogen haben, wobei ein Abschnitt aus einem von zwei endogenen Allelen in einem diploiden Genom durch eine andere Sequenz ersetzt worden ist. Im Gegensatz zu den traditionellen Methoden, bei denen eine Differenz in der Restriktionsfragment-Länge, das den gesamten Homologiearm oder -arme durchspannt, die Modifikation eines von zwei Allelen anzeigt, detektiert die quantitative TaqMan®-Methode die Modifikation eines Allels durch Messen der Verminderung der Kopienzahl (um die Hälfte) des unmodifizierten Allels. Spezifisch detektiert die Sonde das ummodifizierte Allel und nicht das modifizierte Allel. Daher ist die Methode von der exakten Natur der Modifikation unabhängig und ist nicht auf die in diesem Beispiel beschriebene Sequenzersetzung beschränkt. TaqMan wird zum Quantifizieren der Anzahl von Kopien einer DNA-Template in einer genomischen DNA-Probe verwendet, insbesondere durch Vergleich zu einem Referenzgen (Lie und Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43–8, 1998). Das Referenzgen wird in derselben genomischen DNA wie das/die Zielgen(e) oder Locus/Loci quantifiziert. Daher werden zwei TaqMan®-Amplifikationen (jede mit ihrer jeweiligen Sonde) vorgenommen. Eine TaqMan®-Sonde bestimmt den "Ct" (Grenzwertzyklus) des Referenzgens, wohingegen die andere Sonde den Ct der Region des/der angezielten Gens/e oder Locus/Loci bestimmt, die durch erfolgreiches Targeting ersetzt wird. Der Ct ist eine Quantität, die die Menge an Ausgangs-DNA für jede der TaqMan®-Sonden widerspiegelt, d.h. eine weniger abundante Sequenz erfordert mehr Zyklen der PCR, um den Grenzwertzyklus zu erreichen. Das Herabsetzen um die Hälfte der Anzahl der Kopien der Templatesequenz für eine TaqMan®-Reaktion wird zu einem Anstieg um etwa eine Ct-Einheit führen. TaqMan®-Reaktionen in Zellen, in denen ein Allel des/der Zielgens/e oder Locus/Loci durch homologe Rekombination ersetzt worden ist, wird zu einem Anstieg von einem Ct für die Ziel-TaqMan®-Reaktion ohne gleichzeitigem Anstieg des Ct für das Referenzgen führen, verglichen zu der DNA von nicht-angezielten Zellen. Dies erlaubt einen leichten Nachweis der Modifikation eines Allels des/der Gens/e von Interesse in eukaryotischen Zellen unter Verwendung von LTVECs.
  • Wie oben angegeben, besteht das Screening der Modifikation des Allels (MOA) in der Anwendung irgendeiner Methode, die die Modifikation eines Allels nachweist, um Zellen zu identifizieren, die eine homologe Rekombination vollzogen haben. Es stellt keine Anforderung dar, dass die angezielten Allele identisch (homolog) zueinander sind, und sie können in der Tat Polymorphismen enthalten, wie es bei der Nachkommenschaft, die aus der Kreuzung zweier unterschiedlicher Mäusestämme hervorgeht, der Fall ist. Außerdem besteht eine spezielle Situation, die ebenfalls durch das MOA-Screening abgedeckt ist, im Targeting von Genen, die normalerweise als einer Einzelkopie in Zellen vorhanden sind, wie etwa einige der auf den Geschlechtschromosomen, und insbesondere dem Y-Chromosom, lokalisierten Gene. In diesem Fall können Methoden, die die Modifikation des einzelnen angezielten Allels detektieren, wie etwa die quantitative PCR, Southern Blottings etc., zum Nachweis des Targeting-Ereignisses angewendet werden. Es ist klar, dass das Verfahren der Erfindung zur Schaffung modifizierter eukaryotischer Zellen selbst dann angewendet werden kann, wenn Allele polymorph sind oder wenn sie in einer einzelnen Kopie in den angezielten Zellen vorhanden sind.
  • Schritt 8. Anwendungen der genetisch modifizierten eukaryotischen Zellen.
    • (a) Die genetisch modifizierten eukaryotischen Zellen, die mittels der in Schritten 1 bis 7 beschriebenen Methoden generiert wurden, können in jeglichem in vitro- oder in vivo-Assay verwendet werden, bei dem eine Veränderung des Phänotyps der Zelle erwünscht ist.
    • (b) Die genetisch modifizierten eukaryotischen Zellen, die mittels der in Schritten 1 bis 7 beschriebenen Methoden generiert wurden, können auch zur Schaffung eines Organismus verwendet werden, der die genetische Modifikation trägt. Die genetisch modifizierten Organismen können mittels mehrerer verschiedener Techniken erzeugt werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf:
    • 1. Modifizierte embryonale Stammzellen (ES), wie z.B. die häufig verwendeten Ratten- und Mäuse-ES-Zellen. ES-Zellen können zur Schaffung genetisch modifizierter Ratten oder Mäuse mittels einer standardmäßigen Blastozysten-Injektionstechnologie oder Aggregationstechniken (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Wood, et al., Nature, 365: 87–9, 1993; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), tetraploide Blastozysten-Injektion (Wang, et al., Mech Dev, 62: 137–45, 1997) oder Nukleartransfer und Klonierung (Wakayama, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96: 14984–9, 1999) verwendet werden. ES-Zellen, die von anderen Organismen wie Kaninchen (Wang et al., Mech Dev, 62: 137–45, 1997; Schoonjans, et al., Mol Reprod Dev, 45: 439–43, 1996) oder Hühnern (Pain, et al., Development, 122: 2339–48, 1996) oder anderen Spezies abgeleitet sind, sollten ebenfalls für die genetische(n) Modifikation(en) unter Anwendung der Methoden der Erfindung zugänglich sein.
    • 2. Modifizierte Protoplasten können zur Generierung genetisch modifizierter Pflanzen verwendet werden (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.350.689 "Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells", und US-Patent Nr. 5.508.189 "Reneration of plants from cultured guard cell protoplasts" und die darin genannten Literaturstellen).
    • 3. Nukleartransfer von modifizierten eukaryotischen Zellen zu Eizellen zur Generierung klonierter Organismen mit modifiziertem Allel (Wakayama, et al., Proc Natl. Acad Sci USA, 96: 14984–9, 1999; Baguisi, et al., Nat Biotechnol, 17: 456–61, 1999; Wilmut et al., Reprod Fertil Dev, 10: 639–43, 1998, Wilmut, et al., Nature, 385: 810–3, 1997; Wakayama, et al., Nat Genet, 24: 108–9, 2000; Wakamaya, et al., Nature, 394: 369–74, 1998, Rideout, et al., Nat Genet, 24: 109–10, 2000, Campbell, et al., Nature, 380: 64–6, 1996).
    • 4. Zellfusion zum Transfer des modifizierten Allels zu einer anderen Zelle, einschließlich des Transfers von gentechnisch konstruierten Chromosomen, und Verwendung solcher Zellen zur Generierung von Organismen, die das modifizierte Allel oder gentechnisch konstruierte Chromosom tragen (Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 18: 1086–1090, 2000).
    • 5. Das Verfahren der Erfindung ist auch für jegliche anderen Ansätze zugänglich, die angewendet worden oder noch zu entdecken sind.
  • Zwar sind viele der Techniken, die in der Ausführung der einzelnen Schritte der Verfahren der Erfindung angewendet werden, einem Fachmann des Gebiets vertraut, doch behaupten die Anmelder, dass die Neuartigkeit des Verfahrens der Erfindung in der einzigartigen Kombination jener Schritte und Techniken, gekoppelt mit der niemals zuvor beschriebenen Methode der Einführung eines LTVEC direkt in eukaryotische Zellen zur Modifikation eines chromosomalen Locus und der Anwendung quantitativer MOA-Assays zum Identifizieren eukaryotischer Zellen, die entsprechend modifiziert worden sind, liegt. Diese neuartige Kombination stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber den bisherigen Technologien zur Schaffung von Organismen, die Modifikationen von endogenen Genen oder chromosomalen Loci aufweisen, dar.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Konstruieren von Maus-ES-Zellen, die eine Deletion des OCR10-Gens tragen
  • a. Auswahl eines großen genomischen DNA-Klons, der mOCR10 enthält.
  • Ein Bacterial Artificial Chromosome-(BAC)-Klon, der ein großes genomisches DNA-Fragment trägt, das die Codierungssequenz des Maus-OCR10-(mOCR10)-Gens enthielt, wurde durch Screening einer arrayed Mausgenom-DNA BAC-Bibliothek (Incyte Genomics) unter Anwendung der PCR erhalten. Die zum Screening dieser Bibliothek verwendeten Primer waren von der mOCR10-Gen-cDNA-Sequenz abgeleitet.
  • Zwei Primerpaare wurden verwendet:
    • (a) OCR10.RAA (5-AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG-3') und OCR10.PVIrc (5'-CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAAGATGACG-3'), welcher eine 102 bp-DNA amplifiziert; und
    • (b) OCR10.TDY (5'-GACCTCACTTGCTACACTGACTAC-3') und OCR10.QETrc (5'-ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG-3'), welcher eine 1500 bp-DNA amplifiziert.
  • Dieses mOCR10 BAC enthielt etwa 180 kb der genomischen DNA, einschließlich der kompletten mOCR10-Codierungssequenz. Dieser BAC-Klon wurde zur Erzeugung eines LTVEC verwendet, welcher anschließend zum Deletieren eines Abschnitts der Codierungsregion von mOCR10 bei gleichzeitiger Einführung eines Reportergens, dessen Initiationskodon präzise das Initiationskodon von OCR10 ersetzte, als auch der Insertion eines selektierbaren Markergens, das für die Selektion sowohl in E coli als auch Säugerzellen nützlich war, nach dem Reportergen, verwendet wurde (2). Das Reportergen (in diesem nicht-beschränkenden Beispiel LacZ, dessen Sequenz für den Fachmann ohne weiteres verfügbar ist) codiert das E. coli β-Galactosidase-Enzym. Da die Position der Insertion des LacZ (sein Initiationskodon ist an derselben Position wie das Initiationskodon von mOCR10), sollte die Expressi on von LacZ die von MOCR10 nachahmen, wie in anderen Beispielen beobachtet worden ist, bei denen ähnliche Ersetzungen durch LacZ unter Anwendung früherer Technologien durchgeführt wurden (siehe "Gene trap strategies in ES cells", von W. Wurst und A. Gossler, in Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). Das LacZ-Gen ermöglicht die Durchführung eines einfachen und standardmäßigen enzymatischen Assays, der seine Expressionsmuster in situ aufzeigen kann, wodurch ein Surrogat-Assay zur Verfügung steht, der die normalen Expressionsmuster des/der ersetzten Gens/e oder chromosomalen Locus/Loci wiederspiegelt.
  • b. Konstruktion des Donorfragments und Erzeugung von LTVEC.
  • Die bei der Konstruktion des mOCR10 LTVEC verwendete Modifikationskassette ist die LacZ-SV40-polyA-PGKp-EM7-Neo-PGK-polyA-Kassette, worin LacZ ein Markergen ist, wie oben beschrieben, SV40 polyA ein Fragment ist, das von Affenvirus 40 abgeleitet ist (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19: 157–64; 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem, 253: 1613–8, 1978; Dhar, et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 71: 371–5, 1974; Reddy, et al., Science, 200: 494–502, 1978) und das eine Polyadenylierungsstelle und Signal enthält (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19: 157–64, 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem, 253: 1613–8, 1978, Dhar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 71: 371–5, 1974; Reddy, et al., Science, 200: 494–502, 1978), PGKp der Maus-Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Promotor ist (Adra, et al., Gene, 60: 65–74, 1987) (der umfangreich verwendet worden ist, um die Expression der Wirkstoffresistenz-Gene in Säugerzellen zu steuern), EM7 ein starker bakterieller Promotor ist, der den Vorteil aufweist, die positive Selektion in Bakterien des vollständigen LTVEC-Konstrukts durch Steuern der Expression des Neomycinphosphotransferase-(Neo)-Gens zu ermöglichen, Neo ein selektierbarer Marker ist, der eine Kanamycinresistenz in prokaryotischen Zellen und G418-Resistenz in eukaryotischen Zellen verleiht (Beck, et al., Gene, 19: 327–36, 1982), und PGK polyA eine 3'-untranslatierte Region ist, die von dem PGK-Gen abgeleitet ist und eine Polyadenylierungsstelle und Signal enthält (Boer et al., Biochem Genet, 28: 299–308, 1990).
  • Um den mOCR10 LTVEC zu konstruieren, wurde zunächst ein Donorfragment erzeugt, bestehend aus einer mOCR10-Homologiebox 1 (hb1), die stromaufwärts vom LacZ-Gen in der Modifikationskassette angelagert war, und eine mOCR10-Homologiebox 2 (hb2), die stromabwärts von der Neo-PGK polyA-Sequenz in der Modifikationskassette angelagert war (2), unter Anwendung einer standardmäßigen rekombinanten Gentechnologie. Die Homologiebox 1 (hb1) besteht aus 211 bp einer untranslatierten Sequenz unmittelbar stromaufwärts des initiierenden Methionins des mOCR10-offenen Leserahmens (mOCR10 ORF) (3A–3D). Die Homologiebox 2 (hb2) besteht aus den letzten 216 bp der mOCR10 ORF, endend am Stoppkodon (3A–3D).
  • Unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination (Zhang et al., Nat. Genet, 20: 123–8, 1998; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27: e16, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555–7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 5978–83, 2000) wurde dieses Donorfragment anschließend verwendet, um die mOCR10-Codierungsregion (vom Initiations-Methionin zum Stoppkodon) mit der Insertionskassette präzise zu ersetzen, was zur Konstruktion des mOCR10 LTVEC führte (2). Somit wurde in diesem mOCR10 LTVEC die mOCR10-Codierungssequenz durch die Insertionskassette ersetzt, was eine Deletion von etwa 20 kb im mOCR10-Locus schuf, wobei etwa 130 kb der Stromaufwärts-Homologie (Stromaufwärts-Homologiearm) und 32 kb der Stromabwärts-Homologie (Stromabwärts-Homologiearm) verblieben.
  • Es ist wichtig, zur Kenntnis zu nehmen, dass LTVECs leichter und bequemer aus verfügbaren BAC-Bibliotheken generiert werden können als Targeting-Vektoren, die unter Anwendung der bisherigen Technologien erzeugt werden, da lediglich ein einziger bakterieller homologer Rekombinationsschritt erforderlich ist und die einzige erforderliche Sequenzinformation die ist, die zur Generierung der Homologieboxen erforderlich ist. Im Gegensatz dazu erfordern die bisherigen Ansätze zur Schaffung der Targeting-Vektoren unter Anwendung der bakteriellen homologen Rekombination, dass große Targeting-Vektoren vor ihrer Einführung in ES-Zellen "zugeschnitten" werden müssen (Hill et al., Genomics, 64: 111–3, 2000). Dieses Zuschneiden ist aufgrund des Erfordernisses notwendig, Homologiearme zu erzeugen, die kurz genug sind, um die durch die bisherigen Ansätze genützten Screeningmethoden unterzubringen. Ein Hauptnachteil der Methode von Hill et al. ist der, dass zwei zusätzliche homologe Rekombinationsschritte einfach zum Zuschneiden (einen zum Zuschneiden der Region stromaufwärts des modifizierten Locus und einen zum Zuschneiden der Region stromabwärts des modifizierten Locus) erforderlich sind. Um dies zu tun, ist beträchtlich mehr Sequenzinformation erforderlich, einschließlich der Sequenzinformation über die zugeschnittenen Stellen.
  • Außerdem ist ein weiterer offensichtlicher Vorteil, wie durch obiges Beispiel veranschaulicht, das eine sehr große Deletion, die das mOCR10-Gen durchspannt (etwa 20 kb) ohne weiteres in einem einzigen Schritt erzeugt werden kann. Im Gegensatz dazu können zur Erfüllung derselben Aufgabe unter Anwendung der früheren Technologien mehrere Schritte erforderlich sein und können diese das Markieren der Regionen stromaufwärts und stromabwärts der Codierungssequenzen mit loxP-Stellen beinhalten, um die Cre-Rekombinase zur Entfernung der durch diese Stellen flankierten Sequenz nach Einführung des modifizierten Locus in eukaryotische Zellen anwenden zu können. Dies kann möglicherweise nicht in einem Schritt erreichbar sein und kann somit die Konstruktion zweier Targeting-Vektoren unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker und zwei sequenzielle Targeting-Ereignisse in ES-Zellen erfordern, eines zur Einführung der loxP-Stelle an der Region stromaufwärts der Codierungssequenz und ein anderes zur Einführung der loxP-Stelle an der Region stromabwärts der Codierungssequenz. Es sollte weiter zur Kenntnis genommen werden, dass die Schaffung großer Deletionen in eukaryotischen Zellen unter Anwendung der bisherigen Targeting-Technologien oftmals bei geringer Effizienz erfolgte, da die Häufigkeit der Erzielung einer homologen Rekombination gering sein kann, wenn Targeting-Vektoren verwendet werden, die eine durch relativ kurze Homologiearme flankierte große Deletion enthalten. Die unter Anwendung der Methode der Erfindung (siehe unten) erzielte hohe Effizienz liegt an den sehr langen Homologiearmen, die im LTVEC vorhanden sind, indem sie die Rate der homologen Rekombination in eukaryotischen Zellen erhöhen.
  • c. Verifizierung, Präparierung und Einführung von mOCR10 LTVEC DNA in ES-Zellen.
  • Die die Junktion der Insertionskassette umgebende Sequenz und die Homologiesequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Größe des mOCR10 LTVEC wurde durch Restriktionsanalyse, gefolgt von Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) verifiziert (Cantor, et al., Annu Rev Biophys Biophys Chem, 17: 287–304, 1988; Schwartz und Cantor, Cell, 37: 67–75, 1984). Ein standardmäßiges großmaßstäbliches Plasmid-Präparat des mOCR10 LTVEC wurde erzeugt, die Plasmid-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Notl verdaut, welches in das Vektor-Rückgrat des mOCR10 LTVEC schneidet, um lineare DNA zu erzeugen. Anschließend wurde die linearisierte DNA in Maus-ES-Zellen durch Elektroporation eingeführt (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999; Sambrook, et al., Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989). Für mit dem mOCR10 LTVEC erfolgreich transfizierte ES-Zellen wurde in G418-enthaltenden Medien unter Anwendung standardmäßiger Selektionsmethoden selektioniert (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999).
  • d. Identifizierung der angezielten ES-Zellklone unter Anwendung eines quantitativen Modifikation des Allels(MOA)-Assays
  • Um ES-Zellen zu identifizieren, in denen eines der beiden endogenen mOCR10-Gene durch die Modifikationskassettensequenz ersetzt worden ist, wurde die DNA aus individuellen ES-Zellklonen mittels quantitativer PCR unter Anwendung der standardmäßigen TaqMan®-Methodologie wie beschrieben analysiert (Applied Biosystems, TaqMan® Universal PCR Master Mix, Katalog-Nummer P/N 4304437; siehe auch http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04304449.pdf). Die verwendeten Primer und TaqMan®-Sonden sind wie in 3A–3D beschrieben. Ingesamt 69 unabhängige ES-Zellklone wurden gescreent, und 3 wurden als positiv identifiziert, d.h. als Klone, in denen eine der endogenen mOCR10-Codierungssequenzen durch die oben beschriebene Modifikationskassette ersetzt worden war.
  • Verschiedene Vorteile des MOA-Ansatzes sind offensichtlich:
    • (i) Er macht die Verwendung einer Sonde außerhalb des zu modifizierenden Locus überflüssig, wodurch sich das Erfordernis erübrigt, die Sequenz zu kennen, die den modifizierten Locus flankiert.
    • (ii) Er benötigt sehr wenig Zeit zu seiner Durchführung im Vergleich zur herkömmlichen Southern-Blot-Methodologie, die die bisherige Methode der Wahl darstellte (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), was die Zeit zur Identifizierung der korrekt modifizierten Zellen von den typischerweise mehreren Tagen auf lediglich einige wenige Stunden reduziert.
  • Dies stellt eine signifikante Verbesserung der Art und Weise dar, in der das Screening in der Vergangenheit durchgeführt worden ist, und macht es zu einem viel weniger arbeitsintensiven und kostenwirksameren Ansatz für das Screening auf homologe Rekombinationsereignisse in eukaryotischen Zellen.
  • Noch ein weiterer Vorteil der Methode der Erfindung ist der, dass sie auch den bisherigen Technologien aufgrund ihrer Zielbarkeit auf schwierige Loci überlegen ist. Unter Anwendung der bisherigen Technologien ist gezeigt worden, dass für bestimmte Loci die Frequenz des erfolgreichen Targetings lediglich 1 aus 2000 Integrationsereignissen betragen kann und vielleicht sogar weniger. Unter Anwendung der Methode der Erfindung haben die Anmelder gezeigt, dass solch schwierige Loci unter Verwendung von LTVECs, die lange Homologiearme enthalten (d.h. größer als die durch die bisherigen Technologien gestatteten Arme), wesentlich effizienter angezielt werden können. Wie das oben beschriebene nicht-beschränkende Beispiel zeigt, haben die Anmelder den OCR10-Locus angezielt, einen Locus, der zuvor als widerspenstig gegenüber dem Targeting unter Anwendung einer herkömmlichen Technologie nachgewiesen worden ist. Unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung haben die Anmelder gezeigt, dass sie ein erfolgreiches Targeting bei drei von 69 ES-Zellklonen, in die sich der mOCR10 LTVEC (enthaltend mehr als 160 kb an Homologiearmen und eine 20 kb-Deletion einführend) integriert hatte, wohingegen unter Anwendung der bisherigen Technologie für das ES-Zell-Targeting (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) unter Verwendung eines Plasmid-basierten Vektors mit Homologiearmen von kürzer als 10–20 kb, bei der ebenfalls eine Deletion von weniger als 15 kb eingeführt wird, keine Targeting-Ereignisse unter mehr als 600 Integranten des Vektors identifiziert wurden. Diese Daten weisen eindeutig die Überlegenheit des Verfahrens der Erfindung gegenüber der bisherigen Technologien nach.
  • Beispiel 2: Erhöhte Targeting-Frequenz und Aufhebung des Erfordernisses der Verwendung von isogener DNA, wenn LTVECs als den Targeting-Vektoren verwendet werden.
  • Wie oben angemerkt, sollte die erhöhte Targeting-Frequenz, die unter Verwendung langer Homologiearme erzielt wird, den potenziellen Nutzen vermindern, der sich aus der Verwendung von genomischer DNA in der Konstruktion von LTVECs ableitet, die isogen mit (d.h. hinsichtlich der Sequenz identisch zu) der DNA der angezielten eukaryotischen Zelle ist. Um diese Hypothese zu testen, haben die Anmelder mehrere LTVECs unter Verwendung einer genomischen DNA konstruiert, die von demselben Maus-Substamm wie die anzuzielende eukaryotische Zelle (wahrscheinlich isogen) stammte, und eine große Zahl weiterer LTVECs unter Verwendung einer von Maus-Substämmen stammenden genomischen DNA konstruiert, die von der der anzuzielenden eukaryotischen Zelle abwich (wahrscheinlich nicht-isogen). Die nicht-isogenen LTVECs zeigten eine mittlere Targeting-Frequenz von 6% (rangierend von 1–20%, Tabelle 1), während die isogenen LTVECs eine mittlere Targeting-Frequenz von 3% zeigten (rangierend von 2–5%), was darauf hinwies, dass die Rate eines erfolgreichen Targetings unter Verwendung von LTVECs nicht von der Isogenität abhängt.
  • Figure 00330001
  • Beispiel 3: Ausführliche Beschreibung des TaqMan®-basierten MOA zur Identifizierung von angezielten ES-Klonen
  • ES-Zellklone, die den LTVEC aufgenommen und in das Genom am angezielten Locus durch homologe Rekombination aufgenommen haben, werden durch einen Modifikation des Allels(MOA)-Assay identifiziert, der eine quantitative Realzeit-PCR anwendet, um den Unterschied zwischen angezielten ES-Zellklonen, in denen eines der beiden angezielten Allele modifiziert ist, und nicht-angezielten ES-Zellklonen, in denen beide Allele unmodifiziert bleiben, zu erkennen. Der MOA-Assay besteht aus einem Primär- und einem Sekundärscreen. Der Primärscreen umfasst die folgenden Schritte: (1) Anzucht von LTVEC-transfizierten ES-Zellklonen auf Gelatine-beschichteten 96-Lochplatten; (2) Isolierung von genomischer DNA aus jedem ES-Zellklon; (3) Verwendung jeder genomischen DNA-Probe als einer Template in 8 separaten quantitativen PCRs auf zwei 384-Lochplatten, in denen 2 der PCRs einen Ziel-Locus-spezifischen Primersatz verwenden, der an DNA-Sequenzen an einem Ende des für die Deletion angezielten genomischen Fragments hybridisiert ("Stromaufwärts-PCR"), 2 der PCRs einen Ziel-Locus-spezifischen Primersatz verwenden, der an DNA-Sequenzen am anderen Ende des für die Deletion angezielten genomischen Fragments hybridisiert ("Stromabwärts-PCR"), 4 der PCRs Primersätze verwenden, die vier nicht-angezielte Referenz-Loci erkennen ("Referenz-PCRs") und jede PCR eine fluoreszierende Sonde einbezieht (zum Beispiel eine TaqMan®[ABI], EclipseTM oder Molecular Beacon-Sonde [Synthetic Genetics]), die die amplifizierte Sequenz erkennt und deren Fluoreszenzsignal direkt proportional zur Menge des PCR-Produkts ist; (4) Ablaufen lassen der PCRs in einer Vorrichtung, die einen Thermocyclierer mit einem Fluoreszenzdetektor (zum Beispiel dem ABI 7900HT), der die Anhäufung von Amplifikationsprodukten während der PCR quantifiziert und den Grenzwertzyklus (CT) bestimmt, den Punkt während der PCR, an dem das Fluoreszenzsignal oberhalb des Hintergrundrauschen detektierbar ist, kombiniert; (5) für jede DNA-Probe der ES-Zellklone eine Berechnung der Differenz bei den CT-Werten (ΔCT) zwischen den Stromaufwärts-PCRs und jeder der vier Referenz-PCRs und zwischen den Stromabwärts-PCRs und jeder der vier Referenz-PCRs, um acht Tabellen mit 96 ΔCT-Werten zu schaffen; (6) Normalisierung der ΔCT-Werte zu positiven Werten; (7) Berechnung des mittleren ΔCT-Werts für jede Ziel-Referenz- Vergleichstabelle; (8) Bestimmung eines Konfidenzwerts unter Verwendung eines Computerprogramms, das die acht ΔCT-Tabellen untersucht und die Anzahl der Male berechnet, die eine gegebene DNA-Probe der ES-Zellklone einen ΔCT-Wert innerhalb der Toleranzbereiche 0,5 bis 1,5, 0,25 bis 1,5, 0,5 bis 2,0, 0,25 bis 2,0, 0,5 bis 3,0 und 0,25 bis 3,0 Zyklen von größer als dem mittleren ΔCT produziert (zu Beispielen der Computerprogrammiersprachen, die zum Erstellen oder Schreiben solch eines Programms geeignet sind, zählen Visual Basics, Java oder irgendeine andere Computerprogrammiersprache, die dem Fachmann vertraut ist); (9) Auftragen der Werte und ihrer Mittelwerte für jede der acht ΔCT-Tabellen als Histogramme; und (10) Identifizierung der korrekt angezielten ES-Zellklon-Kandidaten aus einer Überprüfung der Konfidenzwerte und der ΔCT-Histogramme. In einem bevorzugten Beispiel fällt der ΔCT-Wert für den angezielten Kandidaten-Klon in einen Bereich von 0,5 bis 1,5 Zyklen größer als der Mittelwert aus 8 von 8 Referenzvergleichen.
  • Durch den Primärscreen des MOA-Assays identifizierte Kandidaten-Klone werden bestätigt oder in einen Sekundärscreen zurückgeschickt, weicher die folgenden Schritte umfasst: (1) Verwenden der genomischen DNA von jedem der positiven Kandidaten-ES-Zellklone, von einer größeren Anzahl negativer Klone und von genomischen DNA-Kopienzahl-Standards von Mäusen, die ein oder zwei Kopien der LTVEC LacZ-Neo-Kassette pro diploidem Genom als Template in 8 separaten quantitativen PCRs auf zwei 384-Lochplatten tragen, bei denen 1 Reaktion eine Stromaufwärts-PCR ist (wie im Primärscreen), eine Reaktion eine Stromabwärts-PCR ist (wie im Primärscreen), 4 Reaktionen Referenz-PCR mit zwei Referenz-Loci sind, die verschieden von denen sind, die im Primärscreen verwendet werden, eine Reaktion eine PCR mit Primern und einer Sonde ist, die für das LacZ-Gen des LTVEC spezifisch sind, und eine Reaktion eine PCR mit Primern und einer Sonde ist, die für das Neo-Gen des LTVEC spezifisch sind; (2) Ablaufen lassen der PCRs in einer quantitativen PCR-Vorrichtung, wie bei dem Primärscreen; (3) Berechnen, wie im Primärscreen, der ΔCT-Werte zwischen der Stromaufwärts-PCR und jeder der beiden Referenz-PCRs, zwischen der Stromabwärts-PCR und jeder der beiden Referenz-PCRs, zwischen der LacZ-PCR und jeder der beiden Referenz-PCRs, und zwischen der Neo-PCR und jeder der beiden Referenz-PCRs, um acht ΔCT-Tabellen zu schaffen; (4) Normalisieren der ΔCT-Werte zu positiven Werten; (5) Berechnen des Mittelwerts für jede ΔCT-Tabelle; (6) Berechnen der Konfidenzwerte wie im Primärscreen; und (7) Auftragen der Werte und ihrer Mittelwerte für jede der acht ΔCT-Tabellen als Histogramme.
  • Aus einer Überprüfung der Konfidenzwerte und der ΔCT-Histogramme sowohl für den Primär- als auch den Sekundärscreen werden korrekt angezielte ES-Klon-Kandidaten entweder bestätigt oder zurückverwiesen. in einem bevorzugten Beispiel fällt der ΔCT-Wert für den angezielten Kandidaten-Klon in einen Bereich von 0,5 bis 1,5 Zyklen größer als der Mittelwert aus 12 von 12 Referenzvergleichen aus den kombinierten Primär- und Sekundärscreens.
  • Um die Anzahl der Kopien des LTVEC pro diploidem Genom in den bestätigten, korrekt angezielten ES-Klonen mit Punkten zu bewerten, werden die ΔCT-Werte aus den Vergleichen der LacZ- und Neo-PCRs mit den beiden Referenz-PCRs mit den ΔCT-Werten für die LacZ-Neo-Kopienzahl-Standards verglichen. Jeder ES-Zellklon wird als 1, 2 oder größer als 2 Kopien des LTVEC aufweisend bewertet. Für jedes modifizierte Allel-Projekt werden die ES-Zellklone in Gruppen von 96 (gewöhnlich weniger als insgesamt 288 Klone) gescreent, bis 3 Klone, die im MOA-Assay positiv bewertet werden und eine einzelne Kopie der LacZ-Neo-Kassette aufweisen, identifiziert sind.
  • Beispiel 4: Anwendung der FISH zur Identifizierung korrekter gezielter LTVECs in ES-Zellen
  • Unter Anwendung der hierin beschriebenen LTVEC-Technologie nahmen die Anmelder ein Knockout des SM22alpha-Gens in ES-Zellen vor. SM22alpha ist ein auf die glatte Muskelzell-(SMC)-Linie beschränktes 22-kDA-Protein, das physikalisch mit cytoskelettalen Actinfilamentbündeln in kontraktilen SMCs assoziiert. Die angezielten ES-Zellen wurden dann einer standardmäßigen Fluoreszenz-in situ-Hybridisation (FISH) auf Ausstrichen von Metaphasen-Chromosomen unterzogen, um zu verifizieren, dass das Gen entsprechend angezielt war. Das Experiment wurde mit zwei Sonden vorgenommen: 1) einer SM22alpha-Gen-Sonde, bestehend aus dem unmodifizierten SM22alpha BAC-Klon, der zur Erzeugung von LTVEC verwendet wird, und 2) einer LacZ- und Neomycin-DNA-Sonde, welche lediglich die Genmodifikation detektiert, die durch das Targeting-Ereignis (Insertion von LacZ und Neo-Genkassetten) erfolgt ist. Metaphasen-Chromosomen-Ausstriche wurden aus Zellen präpariert und die Hybridisation gleichzeitig mit beiden Sonden vorgenommen, die mit unterschiedlich gefärbten Fluorophoren markiert waren, um den Nachweis der Hybridisation einer jeden Sonde mit demselben Ausstrich zu ermöglichen. Eine nicht-angezielte ES-Zelllinie wurde parallel dazu als einer Kontrolle analysiert. Wie erwartet, wurden in den Kontroll-Ausstrichen zwei Allele von SM22alpha auf homologen Chromosomenarmen nachgewiesen, doch lag keine Hybridisation der LacZ-Neo-Sonde vor. Wie bei den Kontrollen wurden in den angezielten ES-Zell-Ausstrichen ebenfalls zwei Allele an derselben chromosomalen Lokalisation und auf homologen Chromosomen nachgewiesen, doch war eine Doppelmarkierung mit der LacZ-Neo-Sonde auf einem der beiden Chromosomen erkennbar, was auf eine Co-Lokalisation der SM22alpha- und LacZ-Neo-DNA-Sequenzen auf jenem Allel von SM22alpha hinweist. Bedeutsamerweise wurden keine SM22alpha- oder LacZ-Neo-Gensequenzen an ungeeigneten Lokalisationen in den Ausstrichen nachgewiesen. Das Fehlen der zusätzlichen Integration von SM22alpha-Gensequenzen und die Co-Lokalisation von LacZ-Neo mit SM22alpha in einem Chromosom eines homologen Paars legt in starkem Maße nahe, dass das korrekte Targeting von LacZ-Neo auf eines der SM22alpha-Allele über die homologe Rekombination erfolgt war.
  • Beispiel 5: Herabsetzen der Menge an DNA, die zum Elektroporieren von ES-Zellen verwendet wird, verbessert die Targeting-Effizienz
  • Standardmäßige Methoden für die gezielte Modifikation von Genen in mausembryonalen Stammzellen (ES) verwenden typischerweise 20 bis 40 μg an Targeting-Vektor im Elektroporations-Verfahren. Die Anmelder haben entdeckt, dass mit LTVECs die Elektroporation mit viel geringeren Mengen an DNA – im Bereich von etwa 1 bis 5 μg pro 1 × 107 Zellen – die Frequenz der korrekt angezielten homologen Rekombinationsereignisse verdoppelt und zugleich die Zahl an sekundären, nicht-homologen Insertionsereignissen stark vermindert. Diese eindeutige Verbesserung der Targeting- Effizienz ist bedeutsam, da sie die Zahl der ES-Zellklone signifikant reduziert, die gescreent werden müssen, um mehrere positive Klone mit einer korrekt angezielten Einzelkopie-Modifikation zu finden. Die damit verbundenen Vorteile sind eine Kostensenkung und ein erhöhter Durchsatz.
  • Beispiel 6: Anwendung des Verfahrens der Erfindung zur Schaffung von MA61-Knockout-Mäusen zur Untersuchung der Muskelatrophie
  • MA61, auch bezeichnet als MAFbx, ist eine vor kurzem entdeckte Ubiquitinligase, die bei verschiedenen Bedingungen der Muskelatrophie heraufreguliert ist (siehe vorläufige US-Anmeldung Nr. 60/264,926, eingereicht am 30. Januar 2001, vorläufige US-Anmeldung Nr. 60/311,697, eingereicht am 10. August 2001 und vorläufige US-Anmeldung (laufende Nummer noch nicht bekannt), eingereicht am 22. Oktober 2001, alle abgetreten an Regeneron Pharmaceuticals, Inc., von denen jede in ihrer Gesamtheit hierin durch Verweis aufgenommen ist). Um die biologische Signifikanz dieses Gens bei der Muskelatrophie weiter zu untersuchen, wurden Knockout-Mäuse unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung wie folgt geschaffen.
  • Um zunächst ein großes kloniertes genomisches Fragment zu erhalten, das das MA61-Gen enthält, wurde eine Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Bibliothek mit Primern gescreent, die von der MA61 cDNA-Sequenz abgeleitet waren. Der derart erhaltene BAC-Klon wurde dann zur Schaffung eines Large Targeting Vector for Eukaryotic Cells (LTVEC) wie folgt verwendet. Eine Modifikationskassette, die eine 5'-Homologiebox/lacZ-Gen/polyA/PGK-Promotor/Neo/polyA/3'Homologiebox enthielt, wurde konstruiert. Die Homologieboxen wurden angehängt, um die Stellen der bakteriellen homologen Rekombination während der Generierung des LTVEC zu markieren. LacZ ist ein Reportergen, das so positioniert wurde, dass sein Initiationskodon an derselben Position wie das Initiationskodon von MA61 war. Nach der homologen Rekombination in Bakterien ersetzte die Modifikationskassette das MA61-Gen. Damit wurde ein MA61 LTVEC geschaffen, worin die MA61-Codierungssequenzen im BAC-Klon durch die wie oben beschrieben konstruierte Modifikationskassette ersetzt wurden. LTVEC DNA wurde dann präpariert, gereinigt und zur Einführung in eukaryotische Zellen linearisiert, wie unten beschrieben.
  • Ein MA61 LTVEC DNA-Miniprep wurde präpariert (Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989; Tillett und Neilan, Biotechniques, 24: 568–70, 572, 1998; http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf) und in E. coli unter Anwendung der Elektroporation retransformiert (Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989), um das Plasmid zu beseitigen, das die rekombinogenen Proteine kodiert, die für den bakteriellen homologen Rekombinationsschritt genützt werden (Zhang et al., Nat Genet, 20: 123–8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442–7, 1999). Vor Einführung des MA61 LTVEC in eukaroytische Zellen wurden größere Mengen an MA61 LTVEC mittels einer standardmäßigen Methodologie präpariert (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf; Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989; Tillett und Neilan, Biotechniques, 24: 568–70, 572, 1998).
  • Als nächstes wurde, um den MA61 LTVEC zur Einführung in eukaryotische Zellen zu präparieren, der MA61 LTVEC linearisiert. Dies wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym Notl erreicht, welches die DNA mit dem/den modifizierten endogenen Gen(en) oder chromosomalen Locus/Loci flankiert mit langen Homologiearmen zurücklässt.
  • Der MA61 LTVEC wurde dann in eukaryotische Zellen unter Anwendung einer standardmäßigen Elektroporations-Methodologie eingeführt (Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bände 1, 2 und 3, 1989). Die Zellen, in die der MA61 LTVEC erfolgreich eingeführt war, wurden durch Aussetzen an ein Selektionsagens selektioniert. Da der in der Modifikationskassette verwendete selektierbare Marker das Neomycinphosphotransferase-(Neo)-Gen war (Beck, et al., Gene, 19: 327–36, 1982), wurden die Zellen, die den MA61 LTVEC aufgenommen hatten, in einem Medium selektioniert, das G418 enthielt; Zellen, die den MA61 LTVEC nicht aufwiesen, starben ab, wohingegen Zellen, die den MA61 LTVEC aufgenommen haben, überlebten (Santerre, et al., Gene, 30: 147–56, 1984).
  • Eukaryotische Zellen, die durch Targeting des MA61 LTVEC in den MA61-Locus erfolgreich modifiziert worden sind, wurden mittels der quantitativen PCR-Methode TaqMan® identifiziert (Lie und Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43–8, 1998).
  • Schließlich wurden die genetisch modifizierten ES-Zellen zur Schaffung genetisch modifizierter, in diesem Fall Knockout-Mäuse mittels einer standardmäßigen Blastozysten-Injektionstechnologie verwendet. Auf diese Weise geschaffen, handelte es sich bei den MA61-Knockouts um Mäuse, in denen das MA61-Gen deletiert worden war.
  • Sowohl die Knockout-Mäuse als auch die Wildtyp-(WT)-Mäuse wurden Atrophie-induzierenden Bedingungen ausgesetzt, die zur Denervierung der Mäuse geschaffen waren, und die Grade der Atrophie verglichen. Zunächst wurde der Ischiasnerv in der mittleren Hüftregion des rechten Hinterbeins isoliert und in den Mäusen durchgeschnitten. Die Transektion des Ischiasnervs führt zu Denervierung, und über einen Zeitraum von vierzehn Tagen zur Atrophie in den Muskeln des Hinterbeins, insbesondere des Tibialis anterior und Gastrocnemius-Muskels, über einen Zeitraum von 14 Tagen. Am Tag 7 und 14 nach der Denervierung wurden die Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation geopfert. Dann wurde der Tibialis anterior (TA) und der Gastrocnemius-Komplex (GA) von den rechten (denervierten) und linken (intakten) Hinterbeinen entfernt, gewogen und bei einer fixierten Länge in Flüssigstickstoff-gekühltem Isopentan eingefroren. Der Umfang der Atrophie wurde durch Vergleichen des Gewichts der Muskeln von dem denervierten Bein mit dem Gewicht der Muskeln von dem nicht-denervierten Bein ausgewertet.
  • Die Muskelatrophie wurde 7 und 14 Tage nach der Transektion des rechten Ischiasnerv ausgewertet. Die Nassgewichte der rechten, denervierten Muskeln wurden zu den Nassgewichten der linken, nicht-denenrierten Muskeln verglichen. Die Rechts:Links-Vergleiche sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Figure 00410001
  • An Tagen 7 und 14 zeigten die Muskeln der Knockout-Mäuse signifikant weniger Atrophie (p < 0,001) als die Muskeln der Wildtyp-Mäuse. Die Differenz zwischen den Knockout- und den Wildtyp-Mäusen war an Tag 14 größer als an Tag 7. Während die Wildtyp-Mäuse zwischen Tagen 7 und 14 weiterhin atrophierten, zeigten die Knockout-Mäuse keine zusätzliche Atrophie.
  • Zusammengefasst schafft der Ansatz, LTVECs zu generieren und diese direkt als Targeting-Vektoren zu verwenden, in Kombination mit dem MOA-Screening auf homologe Rekombinationsereignisse in ES-Zellen, ein neuartiges Verfahren zur Erzeugung gentechnisch modifizierter Loci, das schnell und preiswert ist und eine signifikante Verbesserung gegenüber den bisher in Anwendung befindlichen ermüdenden, zeitraubenden Verfahren ist. Es eröffnet somit die Möglichkeit einer schnellen, großmaßstäblichen in vivo-funktionalen Genom-Analyse von im Wesentlichen jeglichem und allen Genen im Genom eines Organismus bei einem Bruchteil der Zeit und der Kosten, die für die bisherigen Methodologien erforderlich waren.
  • Obschon die vorangegangene Erfindung in einiger Ausführlichkeit anhand von Veranschaulichung und Beispielen beschrieben worden ist, wird es für Fachleute des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis ohne weiteres erkennbar sein, dass gewisse Veränderungen und Abwandlungen an den Lehren der Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Geiste oder Rahmen der anhängenden Ansprüche abzuweichen.

Claims (14)

  1. Verfahren für die genetische Modifikation eines endogenen Gens oder chromosomalen Locus von Interesse in eukaryotischen Zellen, umfassend: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in den eukaryotischen Zellen (LTVEC); wobei die LTVEC Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen; c) Einführen der LTVEC aus (b) in die eukaryotischen Zellen zum Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; und d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den eukaryotischen Zellen aus (c), um jene eukaryotischen Zellen zu identifizieren, in welchen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das große klonierte genomische Fragment, enthaltend eine DNA-Sequenz, homolog zu dem endogenen Gen oder chromosomalen Locus von Interesse ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die genetische Modifikation an dem endogenen Gen oder chromosomalen Locus die Deletion einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements; Alteration einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements; Insertion einer neuen Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements; Schaffung eines konditionellen Allels; oder Ersetzung einer Codierungssequenz oder Gensegments von einer Spezies durch eine homologe oder orthologe Codierungssequenz von derselben oder einer unterschiedlichen Spezies umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Alteration einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements eine Substitution, Addition oder Fusion umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Fusion ein Epitop-Tag oder bifunktionelles Protein umfasst.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der quantitative Assay die quantitative PCR, FISH, vergleichende genomische Hybridisierung, isotherme DNA-Amplifikation oder quantitative Hybridisierung an eine immobilisierte Sonde umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eukaryotische Zelle eine nicht-humane säugerembryonale Stammzelle ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die embryonale Stammzelle eine Mäuse-, Ratten- oder andere Nagerembryo-Stammzelle ist.
  9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das endogene Gen oder der chromosomale Locus ein Säuger-Gen oder -chromosomaler Locus ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das endogene Gen oder der chromosomale Locus ein menschliches Gen oder chromosomaler Locus ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das endogene Gen oder der chromosomale Locus ein Mäuse-, Ratten- oder anderes Nager-Gen oder -chromosomaler Locus ist.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die LTVEC zum Beherbergen großer DNA-Fragmente von größer 100 kb fähig ist.
  13. Verfahren für die genetische Modifikation eines endogenen Gens oder chromosomalen Locus von Interesse in Mäuseembryo-Stammzellen, umfassend: a) Erhalten eines großen klonierten genomischen Fragments von größer 20 kb, das eine DNA-Sequenz von Interesse enthält, wobei das große klonierte DNA-Fragment homolog zum endogenen Gen oder chromosomalen Locus ist; b) Anwenden der bakteriellen homologen Rekombination zum genetischen Modifizieren des großen klonierten genomischen Fragments aus (a) zur Schaffung eines großen Zielvektors zur Verwendung in den Mäuseembryo-Stammzellen, wobei der große Zielvektor Homologiearme aufweisen, die insgesamt größer 20 kb betragen, wobei die genetische Modifikation eine Deletion einer Codierungssequenz, Gensegments oder regulatorischen Elements ist; c) Einführen des großen Zielvektors aus (b) in die Mäuseembryo-Stammzellen zum Modifizieren durch homologe Rekombination des endogenen Gens oder chromosomalen Locus in den Zellen; und d) Anwenden eines quantitativen Assays zum Nachweisen einer Modifikation des Allels (MOA) in den Mäuseembryo-Stammzellen aus (c), um jene Mäuseembryo-Stammzellen zu identifizieren, in denen das endogene Gen oder der chromosomale Locus genetisch modifiziert worden ist, wobei der quantitative Assay eine quantitative PCR ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei etwa 1–5 μg des großen Zielvektors aus (c) zu etwa 1 × 107 Zellen eingebracht wird.
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