CN100497642C - 修饰真核细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于工程改造和应用大的DNA载体通过同源重组打靶并且以任何理想的方式修饰非人胚胎干细胞的真核细胞中的内源基因和染色体座位的方法。这些可供非人胚胎干细胞的真核细胞用的DNA大打靶载体(称为LTVEC)来源于比那些通过其它方法计划在真核细胞中进行同源打靶常用的DNA片段要大的克隆化基因组DNA片段。也提供检测其中LTVEC准确击中并修饰所需内源基因或染色体座位的非人胚胎干细胞的真核细胞的快速而简便的方法以及应用这些细胞产生带有所述遗传修饰的生物体。
Description
本申请要求于2000年12月7日申请的美国专利申请第09/732,234号和于2000年10月31日申请的美国临时申请第60/244,665号的优先权。在本申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用全部结合到本申请中。
发明领域
本发明的领域是通过同源重组工程改造和应用大的DNA载体打靶并且以任何理想的方式修饰真核细胞中的内源基因和染色体座位的方法。这些可供真核细胞用的DNA大打靶载体(large targeting vector foruse in eukaryotic cells)(称为LTVEC)来源于比通过其它方法计划在真核细胞中进行同源打靶的通常使用的那些DNA片段要大的克隆化基因组DNA的片段。本发明的领域还提供检测LTVEC已经准确打靶并修饰其中的所需内源基因或染色体座位的真核细胞的快速而简便的方法。所述领域也包括应用这些细胞产生带有所述遗传修饰的生物体、所述生物体本身及其使用方法。
引言
LTVEC的应用提供了优于目前方法的显著优势。例如，由于这些来源于比目前用来产生打靶载体的那些DNA片段要大的DNA片段，因此，LTVEC可以比采用现有技术制备的打靶载体更加快速而方便地从大基因组DNA片段的可利用文库(例如BAC和PAC文库)产生。另外，较大的修饰以及跨越较大基因组区的修饰可比采用现有技术更加方便地产生。
此外，本发明利用长同源区来提高“难以打靶(hard to target)”基因座的中靶频率(targeting frequency)，也减少在这些打靶载体中使用等基因DNA的益处(如果有的话)。
因此，本发明提供一种用于系统地修饰给定生物体内实际上所有的内源基因和染色体座位的快速、简便的精简方法。
发明背景
已经证明，通过在同源外源DNA和内源染色体序列之间同源重组的基因打靶，是一种在小鼠体内产生缺失、插入、设计突变、校正基因突变、导入转基因或者产生其它遗传修饰的极其有价值的方法。目前的方法包括使用其中与内源DNA同源性的区通常总计小于10-20kb的标准打靶载体，将所需的遗传修饰导入小鼠胚胎干(ES)细胞中，接着将经改变的ES细胞注射到小鼠胚胎中，以将这些工程遗传修饰传递至小鼠生殖系(Smithies等，Nature，317：230-234，1985；Thomas等，Cell，51：503-512，1987；Koller等，Proc Natl Acad Sci USA，86：8927-8931，1989；Kuhn等，Science，254：707-710，1991；Thomas等，Nature，346：847-850，1990；Schwartzberg等，Science，246：799-803，1989；Doetschman等，Nature，330：576-578，1987；Thomson等，Cell，5：313-321，1989；DeChiara等，Nature，345：78-80，1990；于1998年8月4日授予GenPharmInternational的美国专利第5,789,215号)。在这些现有方法中，检测标准打靶载体准确打靶并修饰其中的所需内源基因或染色体座位的稀有ES细胞，需要在所述打靶载体中含有的同源打靶序列之外的序列信息。对于成功打靶的分析，包括对在打靶载体之外的且跨越整个同源臂(参见定义)的序列进行标准DNA印迹法或长距离PCR(long PCR)(Cheng等，Nature，369：684-5，1994；Foord和Rose，PCR Methods Appl，3：S149-61，1994；Ponce和Micol，Nucleic Acids Res，20：623，1992；授予Takara Shuzo Co.，Ltd.的美国专利第5,436,149号)；因此由于从限制这些方法的大小考虑，同源臂的大小限于总计小于10-20kb(Joyner，ThePractical Approach Series，293，1999)。
使用比现有方法中所用的打靶载体要大的具有同源臂的打靶载体的能力将会是极其有价值的。例如，这样的打靶载体可以比采用现有技术制备的打靶载体更加快速而方便地从含有大的基因组插入片段的可利用文库(例如BAC或PAC文库)产生，在现有技术中这样的基因组插入片段必须在使用之前进行充分地表征和修剪(trimmed)。另外，较大的修饰以及跨越较大基因组区的修饰可以比采用现有技术更加方便地产生并且步骤更少。此外，使用长同源区可以提高真核细胞中“难以打靶”基因座的中靶频率，因为在真核细胞中的同源重组打靶似乎与打靶载体内所含有的总同源性有关(Deng和Capecchi，Mol Cell Biol，12：3365-71，1992)。另外，使用长同源臂所达到的提高的中靶频率，可以减少在这些打靶载体中使用等基因DNA可能带来的任何潜在益处。
在非常大的基因组片段例如在BAC文库中克隆的基因组片段中工程精修的问题已经通过在细菌中应用同源重组基本上得到解决(Zhang等，Nat Genet，20：123-8，1998；Yang等，Nat Biotechnol，15：859-65，1997；Angrand等，Nucleic Acids Res，27：e16，1999；Muyrers等，NucleicAcids Res，27：1555-7，1999；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999)，使得可以构建含有与真核内源基因或染色体座位同源的大同源区的载体。然而，一旦构建成功，则这些载体一般不可用于通过同源重组来修饰内源基因或染色体座位，因为当同源臂大于10-20kb时难以检测出稀有的准确打靶事件(Joyner，The Practical Approach Series，293，1999)。因此，采用细菌同源重组从BAC基因组片段产生的载体在作为打靶载体使用之前仍旧必须大范围地修剪(Hill等，Genomics，64：111-3，2000)。因此，仍然需要使得有可能使用含有大同源区的打靶载体以修饰真核细胞中的内源基因或染色体座位的快速而简便的方法。
按照本发明，本申请人提供能够应用含有大同源区的打靶载体以便通过同源重组修饰真核细胞中的内源基因或染色体座位的新方法。这样的方法克服了现有技术的上述限制。另外，技术人员将会容易地认识到，本发明的方法非常适合于供任何真核生物的任何基因组DNA使用，所述真核生物包括但不限于诸如小鼠、大鼠、其它啮齿动物或人的动物以及诸如大豆、玉米和小麦的植物。
发明概述
按照本发明，申请人开发出一种用来构建和筛选含有经修饰的内源基因或染色体座位的非人胚胎干细胞的真核细胞的快速、精简且有效的新方法。这种新方法首次综合了：
1.细菌同源重组，以精确工程改造克隆化基因组大片段内的所需遗传修饰，从而构建可供非人胚胎干细胞的真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；
2.将这些LTVEC直接导入所述真核细胞中，以修饰这些细胞中的目标内源染色体座位；和
3.进行分析，以确定靶等位基因已经根据需要被修饰的稀有真核细胞，包括不需要打靶序列之外序列信息而对亲代等位基因的等位基因修饰(modification of allele)(MOA)的分析，例如定量PCR。
本发明的一个优选实施方案是一种遗传修饰非人胚胎干细胞的真核细胞中的内源基因或染色体座位的方法，所述方法包括：a)获得含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段；b)应用细菌同源重组来遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供非人胚胎干细胞的真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；c)将(b)的LTVEC导入所述真核细胞中，以修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；和d)应用定量分析来检测(c)的真核细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些真核细胞。
本发明的另一个实施方案是这样的一种方法，其中对所述内源基因或染色体座位的遗传修饰包括：编码序列、基因区段或调节元件的缺失；编码序列、基因区段或调节元件的改变；新的编码序列、基因区段或调节元件的插入；条件等位基因的创建；或者来自一个物种的编码序列或基因区段被来自不同物种的同源或直向同源编码序列取代。
本发明的一个替代实施方案是这样的一种方法，其中所述编码序列、基因区段或调节元件的改变包括取代、添加或融合，其中所述融合体包含一个附加表位或双官能蛋白。
本发明的再一个实施方案是这样的一种方法，其中所述定量分析包括定量PCR、比较基因组杂交、DNA等温扩增或与固定化探针的定量杂交、Invader 
或MMP 其中所述定量PCR包括
Molecular Beacon(分子信标)或EclipseTM探针技术。
本发明的另一个优选实施方案是这样的一种方法，其中所述真核细胞是哺乳动物胚胎干细胞，具体地说其中所述胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞、大鼠胚胎干细胞或其它啮齿动物胚胎干细胞。
本发明的另一个优选实施方案是这样的一种方法，其中所述内源基因或染色体座位是哺乳动物基因或染色体座位，最好是人类基因或染色体座位或者是小鼠基因或染色体座位、大鼠基因或染色体座位或其它啮齿动物基因或染色体座位。
再一个优选的实施方案是其中所述LTVEC能够容纳大于20kb的DNA大片段，尤其是大于100kb的DNA大片段的方法。
另一个优选的实施方案是通过本发明方法产生的经遗传修饰的内源基因或染色体座位。
又一个优选的实施方案是通过本发明方法产生的经遗传修饰的真核细胞。
本发明的一个优选实施方案是含有通过本发明方法产生的经遗传修饰的内源基因或染色体座位的非人类生物体。
也优选从通过本发明方法产生的经遗传修饰的真核细胞或胚胎干细胞产生的非人类生物体。
一个优选的实施方案是通过包括下述步骤的方法产生的含有经遗传修饰的内源基因或染色体座位的非人类生物体：a)获得含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段；b)应用细菌同源重组遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供胚胎干细胞用的大打靶载体(LTVEC)；c)将(b)的LTVEC导入胚胎干细胞中，以修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；d)应用定量分析来检测(c)的胚胎干细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些胚胎干细胞；e)将(d)的胚胎干细胞导入胚泡中；且f)将(e)的胚泡导入代理母亲体内而让其妊娠。
本发明的另一个优选实施方案是通过包括下述步骤的方法产生的含有经遗传修饰的内源基因或染色体座位的非人类生物体：a)获得含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段；b)应用细菌同源重组遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；c)将(b)的LTVEC导入真核细胞中，以遗传修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；d)应用定量分析来检测(c)的真核细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些真核细胞；e)取出(d)的真核细胞的细胞核；f)将(e)的细胞核导入卵母细胞中，且g)将f)的卵母细胞导入可供妊娠的代理母亲体内。
再一个优选实施方案是通过包括下述步骤的方法产生的含有经遗传修饰的内源基因或染色体座位的非人类生物体：a)获得含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段；b)应用细菌同源重组遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；c)将(b)的LTVEC导入真核细胞中，以遗传修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；d)应用定量分析来检测(c)的真核细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些真核细胞；e)将(d)的真核细胞与另一种真核细胞融合；f)将(e)的经融合的真核细胞导入可供妊娠的代理母亲体内。
在优选的实施方案中，所述非人类生物体是小鼠、大鼠或其它啮齿动物；所述胚泡是小鼠胚泡、大鼠胚泡或其它啮齿动物胚泡；所述卵母细胞是小鼠卵母细胞、大鼠卵母细胞或其它啮齿动物卵母细胞；而所述代理母亲是小鼠、大鼠或其它啮齿动物。
另一个优选的实施方案是其中所述胚胎干细胞是哺乳动物胚胎干细胞，最好是小鼠胚胎干细胞、大鼠胚胎干细胞或其它啮齿动物胚胎干细胞的方法。
另一个优选的实施方案是应用本发明经遗传修饰的真核细胞产生非人类生物体，具体地说是应用本发明经遗传修饰的胚胎干细胞产生非人类生物体。
本发明的一个优选实施方案是一种用来遗传修饰小鼠胚胎干细胞中的目标内源基因或染色体座位的方法，所述方法包括：a)获得大于20kb、含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段，其中所述克隆化DNA大片段与所述内源基因或染色体座位同源；b)应用细菌同源重组来遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供所述小鼠胚胎干细胞用的大打靶载体，其中所述遗传修饰是编码序列、基因区段或调节元件的缺失；c)将(b)的大打靶载体导入所述小鼠胚胎干细胞中，以修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；且d)应用定量分析来检测(c)的小鼠胚胎干细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些小鼠胚胎干细胞，其中所述定量分析是定量PCR。也优选通过该方法产生的经遗传修饰的小鼠胚胎干细胞；含有通过该方法产生的经遗传修饰的内源基因或染色体座位的小鼠；以及从所述经遗传修饰的小鼠胚胎干细胞产生的小鼠。
另一个优选的实施方案是通过包括下述步骤的方法产生的含有经遗传修饰的目标内源基因或染色体座位的小鼠：a)获得大于20kb、含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段，其中所述克隆化DNA大片段与所述内源基因或染色体座位同源；b)应用细菌同源重组遗传修饰(a)的克隆化基因组大片段，以构建可供所述小鼠胚胎干细胞用的大打靶载体，其中所述遗传修饰是缺失编码序列、基因区段或调节元件；c)将(b)的大打靶载体导入所述小鼠胚胎干细胞中，以修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；且d)应用定量分析来检测(c)的小鼠胚胎干细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些小鼠胚胎干细胞，其中所述定量分析是定量PCR；e)将(d)的小鼠胚胎干细胞导入胚泡中；且f)将(e)的胚泡导入可供妊娠的代理母亲体内。
也优选使用上述经遗传修饰的小鼠胚胎干细胞产生小鼠。
也优选这样的方法，其中将约1-5μg大打靶载体DNA导入约1 x107真核细胞中。
附图简述
图1：应用细菌同源重组产生典型LTVEC的示意图。
(hb1＝同源框1；hb2＝同源框2；RE＝限制性酶切位点)。
图2：可供小鼠OCR10用的供体片段和LTVEC的示意图。
(hb1＝同源框1；lacZ＝β-半乳糖苷酶ORF；SV40 polyA＝来源于猿猴病毒40、含有聚腺苷酸化位点和信号的DNA片段；PGKp＝小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；EM7＝一种细菌启动子；neo＝新霉素磷酸转移酶；PGK polyA＝来源于PGK基因并且含有聚腺苷酸化位点和信号的3′非翻译区；hb2＝同源框2)。
图3A-3D：在用来检测采用mOCR10 LTVEC打靶的ES细胞中的等位基因修饰(MOA)的定量PCR测定中所使用的小鼠OCR10 cDNA序列、同源框1(hb1)、同源框2(hb2)以及
深针和引物。
hb1：碱基对1-211
hb2：碱基对1586-1801
衍生于mOCR10外显子3的探针和相应的PCR引物组：
引物ex3-5′：核苷酸390-410-上方的链
引物ex3-3′：核苷酸445-461-下方的链
衍生于mOCR10外显子4的
探针和相应的PCR引物组：
引物ex4-5′：核苷酸586-605-上方的链
引物ex4-3′：核苷酸642-662-下方的链
定义
“打靶载体”是含有邻接所需遗传修饰的、与内源染色体核酸序列“同源的”序列的DNA构建体。所述侧翼同源序列(称为“同源臂”)借助所述同源臂和相应的内源序列之间存在的同源性，指导所述打靶载体定位于所述基因组中的特定染色体位置，并且通过称为“同源重组”的过程引入所述所需的遗传修饰。
“同源的”是指两个或两个以上的核酸序列相同或足够相似，致使它们能够相互杂交或者经历分子间交换。
“基因打靶”是使用打靶载体通过同源重组而插入、缺失或取代内源序列而对内源染色体座位进行修饰。
“基因敲除(gene knockout)”是由于染色体座位中所编码的遗传信息被破坏所致的遗传修饰。
“基因敲入(gene knockin)”是由于用不同的DNA序列取代染色体座位中所编码的遗传信息所致的遗传修饰。
“敲除生物体”是其中相当大比例的生物体细胞带有基因敲除的生物体。
“敲入生物体”是其中相当大比例的生物体细胞带有基因敲入的生物体。
“标记”或“选择标记”是便于从群体的大多数经处理的细胞中分离出表达所述标记的稀有转染细胞的选择标记。这样的标记基因包括但不限于新霉素磷酸转移酶基因和潮霉素B磷酸转移酶基因或发荧光蛋白(诸如GFP)基因。
“ES细胞”是胚胎干细胞。这种细胞常常来源于胚泡期胚胎的内部细胞团。
“ES细胞克隆”是来源于导入DNA和后续选择后的ES细胞群的单个细胞的细胞亚群。
“侧翼DNA”是与特定参比点在同一直线上并且与之相邻的DNA区段。
“LTVEC”是用于真核细胞、来源于比计划通过其它方法在真核细胞中进行同源打靶的通常使用的那些DNA片段要大的克隆基因组DNA片段的大打靶载体。
“非人类生物体”是公众一般不认为是人类的生物体。
“等位基因修饰”(MOA)是指对基因组中的基因或染色体座位的一个等位基因的实际DNA序列的修饰。该等位基因修饰(MOA)包括但不限于少至单个核苷酸的缺失、取代或插入或者跨越目标的基因或染色体座位的数千碱基的缺失以及这些两种极端情况之间的任何和所有可能的修饰。
“直向同源”序列是指来自一个物种的作为另一个物种中该序列的功能等同物的序列。
提供下文所述的描述和实施例用以说明本发明。本领域技术人员将会认识到，提供这些实施例仅仅为了说明，并不包括用来限制本发明的实施例。
发明详述
本申请人开发了一种用于构建和筛选含有经修饰的内源基因或染色体座位的真核细胞的快速、合理化并且有效的新方法。在这些细胞中，所述修饰可以是基因敲除、基因敲入、点突变或大基因组插入或缺失或其它修饰。作为非限制性的实例，这些细胞可以是可用于产生敲除生物体或敲入生物体、尤其是敲除小鼠或敲入小鼠的胚胎干细胞，所述生物体用来测定已被改变、缺失和/或插入的基因的功能。
本文所述的新方法首次综合了：
1.细菌同源重组，以精确工程改造克隆化基因组大片段内的所需遗传修饰，从而构建可供真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；
2.将这些LTVEC直接导入真核细胞中，以修饰这些细胞中目标的相应内源基因或染色体座位；和
3.进行分析，以确定靶等位基因已经根据需要被修饰的稀有真核细胞，包括对亲代等位基因的等位基因修饰(MOA)的定量分析。
应该强调的是，检测真核细胞中成功同源重组的现有方法不能结合本申请人的LTVEC使用，因为在所述LTVEC中存在长同源臂。应用LTVEC通过同源重组有意修饰真核细胞中的内源基因或染色体座位，通过一种分析在确定其中的靶等位基因已经根据需要被修饰的稀有真核细胞方面的新应用而成为可能，这样的分析包括一种通过应用例如定量PCR或用于MOA的其它合适定量分析来定量分析亲代等位基因的等位基因修饰(MOA)的定量分析。
使用比现有方法中所使用的那些打靶载体要大的具有同源臂的打靶载体的能力因下述原因而极其有价值：
1.打靶载体比用现有技术制备的打靶载体更快、更方便地从含有大基因组插入片段的可利用文库(例如BAC或PAC文库)产生，而在现有技术中所述基因组插入片段在使用之前必须进行充分地表征和“修剪”(下文有详细解释)。另外，需要了解有关目标的基因座的最小序列信息，即只需要了解产生所述同源框(下文有详细解释)以及产生可以用于MOA的定量分析的探针(下文有详细解释)所需的大约80-100个核苷酸。
2.较大的修饰以及跨越较大基因组区的修饰可以比采用现有技术更加方便地产生并且步骤更少。例如，本发明的方法使得有可能精确修饰传统基于质粒的打靶载体因为其大小限制所不能容纳的大基因座。也使得有可能在一个步骤中修饰多个点上的任何特定基因座(例如在多外显子基因的不同外显子上引入特定突变)，减少对工程改造多个打靶载体并且进行多轮打靶和筛选ES细胞中的同源重组的需求。
3.应用长同源性区(长同源臂)提高真核细胞中“难以打靶”基因座的中靶频率，这与先前的发现一致：在真核细胞中同源重组的打靶似乎与打靶载体内所含有的总同源性有关。
4.使用长同源臂获得的提高的中靶频率，明显减少在这些打靶载体中从使用等基因DNA产生的益处(如果有的话)。
5.应用定量MOA分析筛选同源重组的真核细胞，不仅准许LTVEC作为打靶载体的应用(以上概述的优点)，而且减少鉴定正确修饰真核细胞所用的时间，从通常的数天减少至几小时。另外，定量MOA的应用不需要应用位于待修饰内源基因或染色体座位之外的探针，因而消除了解邻接所述经修饰的基因或基因座的序列的要求。这是一个对过去进行筛选的方法显著的改进，并且使该方法成为用于筛选真核细胞中的同源重组事件的、劳动强度大大降低而经济效益大大提高的方法。
方法
本文描述的构建DNA载体所使用的许多技术是技术人员熟知的标准分子生物学技术(参见例如Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，Greene Publ.Assoc.，Wiley Interscience，NY)。采用ABI 373A DNA测序仪和TaqDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Taq双脱氧终止循环测序试剂盒)(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)，通过标准技术对所有的DNA进行测序。
步骤1.获得一个含有目标基因或染色体座位的大基因组DNA克隆。
目标基因或基因座可以根据具体标准例如详细的结构或功能数据进行选择，或者可以在没有这样的详细信息的情况下对其进行选择，因为潜在的基因或基因片段可通过各种基因组测序计划的工作进行预测。
重要的是，应该注意到，应用本发明的方法产生LTVEC，不必了解目标基因的完整序列和基因结构。事实上，所需要的唯一序列信息约为80-100个核苷酸，以便获得目标基因组克隆以及产生在制备LTVEC中所使用的同源框(下文有详细的描述)和制备可供定量MOA分析用的探针。
一旦选择出目标基因或基因座，则获得含有所述基因或基因座的大基因组克隆。所述克隆可以用数种方法中的任一种来获得，所述方法包括但不限于通过标准杂交或PCR技术或者通过技术人员熟悉的任何其它方法来筛选合适的DNA文库(例如BAC、PAC、YAC或粘粒)。
步骤2.在修饰盒上附加同源框1和2以及LTVEC的产生。
同源框标记了用来从克隆化基因组大片段产生LTVEC的细菌同源重组位点(图1)。同源框是短的DNA区段，一般为双链，至少长40个核苷酸，与邻接“待修饰区”的克隆化基因组大片段内的区域同源。将所述同源框附加到修饰盒上，致使在细菌中进行同源重组后，所述修饰盒可取代待修饰区(图1)。采用细菌同源重组创建打靶载体的技术可以在各种各样的系统中进行(Yang等，Nat Biotechnol，15：859-65，1997；Muyrers等，Nucleic Acids Res，27：1555-7，1999；Angrand等，NucleicAcids Res，27：e16，1999；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999；Yu等，Proc Natl Acad Sci USA，97：5978-83，2000)。目前正在使用的受欢迎的技术的一个实例是ET克隆(Zhang等，Nat Genet，20：123-8，1998；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999)和该技术的各种改良技术(Yu等，Proc Natl Acad Sci USA，97：5978-83，2000)。ET是指进行同源重组反应的recE蛋白(Hall和Kolodner，Proc Natl Acad Sci USA，91：3205-9，1994)和recT蛋白(Kusano等，Gene，138：17-25，1994)。RecE是一种外切核酸酶，它以5′→3′修剪线性双链DNA中的一条链(基本上是下文所述的供体DNA片段)，因而在线性双链片段之后留下3′单链突出端。该单链突出端被具有单链DNA(ssDNA)结合活性的recT蛋白所覆盖(Kovall和Matthews，Science，277：1824-7，1997)。使用瞬时表达recE和recT的大肠杆菌(E.coli)基因产物(Hall和Kolodner，Proc Natl Acad SciUSA，91：3205-9，1994；Clark等，Cold Spring Harb Symp Quant Biol，49：453-62，1984；Noirot和Kolodner，J Biol Chem，273：12274-80，1998；Thresher等，J Mol Biol，254：364-71，1995；Kolodner等，Mol Microbiol，11：23-30，1994；Hall等，J Bacteriol，175：277-87，1993)和噬菌体λ蛋白λgam(Murphy，J Bacteriol，173：5808-21，1991；Poteete等，J Bacteriol，170：2012-21，1988)的大肠杆菌，进行ET克隆。λgam蛋白是保护供体DNA片段避免被recBC外切核酸酶系统降解(Myers和Stahl，Annu RevGenet，28：49-70，1994)所需的，也是在recBC+宿主例如常用的大肠杆菌菌株DH10b中进行有效的ET-克隆所需的。
待采用细菌同源重组修饰和取代的区域可以在长度为零个核苷酸(在原始基因座中创建插入)至数十个千碱基(创建原始基因座的缺失体和/或取代体)的范围内。根据所述修饰盒，所述修饰可以导致下述情况：
(a)编码序列、基因区段或调节元件的缺失；
(b)编码序列、基因区段或调节元件的改变，包括取代、添加和融合(例如附加表位或者产生双官能蛋白，例如具有GFP的双官能蛋白)；
(c)新的编码序列、基因区段或调节元件的插入，例如选择标记基因或报道基因的插入或者将新基因置于内源转录控制之下；
(d)条件等位基因的创建，例如通过在将要被Cre重组酶所切除的区域侧翼引入loxP位点(Abremski和Hoess，J Biol Chem，259：1509-14，1984)或在将要被Flp重组酶所切除的区域侧翼引入FRT位点(Andrews等，Cell，40：795-803，1985；Meyer-Leon等，Cold Spring Harb Symp QuantBiol，49：797-804，1984；Cox，Proc Natl Acad Sci USA，80：4223-7，1983)；或
(e)一个物种的编码序列或基因区段被来自不同物种的直向同源编码序列取代，例如鼠类基因座被人直向同源基因座取代，以工程改造小鼠，其中该特定基因座已被“人源化”。
可以将这些修饰中的任何或所有修饰掺入到LTVEC中。以下在实施例1中提供一个具体的非限制性实例，其中一个内源编码序列被完全缺失并且被报道基因和选择标记两者所取代，这也是本发明方法与现有技术相比的优点。
步骤3(任选的).证实每种LTVEC已被正确工程改造。
通过下述方法证实每种LTVEC已被正确工程改造：
a.鉴定性PCR，以证实通过将供体片段导入目标基因或染色体座位中创建的新接点。可以对如此获得的PCR片段测序，以进一步证实通过将供体片段导入目标基因或染色体座位中创建的新接点。
b.诊断性限制酶消化，以确保在细菌同源重组过程中在LTVEC中只引入所需的修饰。
c.LTVEC、尤其是跨越修饰位点的区域的直接测序，以证实通过将供体片段导入目标基因或染色体座位中创建的新接点。
步骤4.供导入真核细胞中用的LTVEC DNA的纯化、制备和线性化。
a.LTVEC DNA的制备：
制备所选LTVEC的小量制备DNA(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989；Tillett和Neilan，Biotechniques，24：568-70，572，1998；http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm 399.pdf)，然后采用电穿孔将所述小量制备LTVEC DNA再转化到大肠杆菌中(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989)。该步骤是除去编码可用于细菌同源重组步骤的诱重组性蛋白的质粒所必需的(Zhang等，Nat Genet，20：123-8，1998；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999)。该步骤对于除去该质粒有用处：(a)因为该质粒是高拷贝数质粒并且可能降低在大规模LTVEC制备中达到的产率；(b)以消除诱导诱重组性蛋白表达的可能性；和(c)因为它可能妨碍LTVEC的物理作图。在将LTVEC导入真核细胞之前，通过标准方法制备大量的LTVEC DNA(http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdf；Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989；Tillett和Neilan，Biotechniques，24：568-70，572，1998)。然而，如果使用利用诱重组性原噬菌体的细菌同源重组方法，即在将编码该诱重组性蛋白的基因整合到细菌染色体(Yu等，ProcNatl Acad Sci USA，97：5978-83，2000)中的情况下，则可以绕过该步骤。
b.将LTVEC DNA线性化：
为了制备用于导入到真核细胞中的LTVEC，优选以留下邻接长同源臂的经修饰的内源基因或染色体座位DNA的方式将LTVEC线性化。通过用仅作稀有消化的任何合适的限制性酶将LTVEC优选在载体骨架中线性化，可以做到这一点。合适限制性酶的实例包括NotI、PacI、SfiI、SrfI、SwaI、FseI等。限制性酶的选择可以通过实验来确定(即通过试验数种不同的候选稀有切割酶)，或者如果LTVEC的序列是已知的，则对所述序列进行分析，然后根据该分析选择合适的限制性酶。在LTVEC具有含诸如CosN位点的稀有位点的载体骨架时，则它可以被识别这样的位点的酶例如λ末端酶所切割(Shizuya等，ProcNatl Acad Sci USA，89：8794-7，1992；Becker和Gold，Proc Natl Acad SciUSA，75：4199-203，1978；Rackwitz等，Gene，40：259-66，1985)。
步骤5.将LTVEC导入真核细胞中并且选择发生LTVEC成功导入的细胞。
采用标准方法，例如磷酸钙、脂质或电穿孔介导的转染(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989)，可以将LTVEC DNA导入真核细胞中。其中成功地导入LTVEC的细胞可以根据已被工程化到LTVEC中的选择标记基因、通过暴露于选择试剂进行选择。作为一个非限制性的实例，如果选择标记是新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Beck等，Gene，19：327-36，1982)，则可以在含G418的培养基中选择吸收LTVEC的细胞；不具有LTVEC的细胞将会死亡，而吸收LTVEC的细胞将存活下来(Santerre等，Gene，30：147-56，1984)。其它合适的选择标记包括在真核细胞中具有活性的任何药物(Joyner，The Practical Approach Series，293，1999)，例如潮霉素B(Santerre等，Gene，30：147-56，1984；Bernard等，Exp Cell Res，158：237-43，1985；Giordano和McAllister，Gene，88：285-8，1990)、杀稻瘟素S(Izumi等，Exp Cell Res，197：229-33，1991)和其它本领域技术人员所熟悉的药物。
步骤6.采用对等位基因修饰(MOA)的定量分析筛选真核细胞中的同源重组事件。
通过用LTVEC打入目标基因座而被成功修饰的真核细胞，可以采用各种各样的可以检测目标基因座内等位基因修饰并且不依赖于对跨越整个同源臂的分析的方法进行鉴定。这样的方法可以包括但不限于：
(a)定量PCR，使用(Lie和Petropoulos，Curr OpinBiotechnol，9：43-8，1998)；
(b)定量MOA分析，使用分子信标(Tan等，Chemistry，6：1107-11，2000)
(c)荧光原位杂交FISH(Laan等，Hum Genet，96：275-80，1995)或比较基因组杂交(CGH)(Forozan等，Trends Genet，13：405-9，1997；Thompson和Gray，J Cell Biochem Suppl，139-43，1993；Houldsworth和Chaganti，Am J Pathol，145：1253-60，1994)；
(d)DNA等温扩增(Lizardi等，Nat Genet，19：225-32，1998；Mitra和Church，Nucleic Acids Res，27：e34，1999)；
(e)与固定化探针的定量杂交(Southern，J.Mol.Biol.98：503，1975；Kafatos FC；Jones CW；Efstratiadis A，Nucleic Acids Res 7(6)：1541-52，1979)；
(f)Invader 
(Third Wave Technologies)；
(g)EclipseTM和分子信标探针(Synthetic Genetics)；和
(h)MMP分析(High Throughput Genomics)
申请人在本文中提供一个实施例，在该实施例中，用
定量PCR来筛选经成功打靶的真核细胞。在这一非限制性实例中，用鉴定经历了同源重组的真核细胞，其中二倍体基因组中的两个内源等位基因之一的一部分已被另一个序列取代。与其中在跨越整个同源臂的限制片段长度方面的差异指示两个等位基因的其中一个被修饰的传统方法相对比，所述定量
方法将通过测量未经修饰的等位基因的拷贝数的减少(一半)而检测出一个等位基因修饰。具体地说，所述探针检测未经修饰的等位基因，而不是检测经修饰的等位基因。因此，所述方法不依赖于修饰的实际性质并且不限于在该实施例中描述的序列取代。TaqMan可用来定量基因组DNA样品中DNA模板的拷贝数，尤其是可与参比基因相比较(Lie和Petropoulos，CurrOpin Biotechnol，9：43-8，1998)。所述参比基因在与靶基因或基因座相同的基因组DNA中进行定量。因此，进行两次扩增(每次用其相应的探针)。一种
探针测定参比基因的＂Ct＂(Threshold Cycle(阈循环))，而另一种探针测定为成功打靶所取代的经打靶的基因或基因座区的Ct。对于每种
探针而言，Ct是反映起始DNA量的量，即丰度较低的序列需要更多的PCR循环以达到阈循环。将
反应的模板序列的拷贝数减少一半，将导致增加约一个Ct单位。当与来自未经打靶细胞的DNA相比时，在靶基因或基因座的一个等位基因已经通过同源重组被取代的细胞中的
反应，将会导致靶
反应增加一个Ct，而参比基因的Ct不增加。这使得可以容易地检测出真核细胞中使用LTVEC对目标基因中的一个等位基因的修饰。
如上所述，等位基因修饰(MOA)筛选是应用检测一个等位基因的修饰的任何方法鉴定经历了同源重组的细胞。并不要求靶等位基因相互相同(同源)，事实上，它们可以含有多态性，从两个不同小鼠品系杂交产生的子代的情况正是如此。另外，MOA筛选也包括的一个特殊情况是靶向在细胞中正常作为单拷贝存在的基因，例如位于性染色体上、尤其是位于Y染色体上的某些基因。在这种情况下，检测单个靶等位基因的修饰的方法例如定量PCR、DNA印迹法等可以用来检测打中靶的事件。显然，甚至当等位基因有多态性或当它们在靶细胞中以单拷贝存在时，本发明的方法可以用来产生经修饰的真核细胞。
步骤8.经遗传修饰的真核细胞的应用。
(a)通过步骤1-7描述的方法产生的经遗传修饰的真核细胞可以用于其中想要改变所述细胞的表型的任何体外或体内测定中。
(b)通过步骤1-7描述的方法产生的经遗传修饰的真核细胞可以用来产生携带所述遗传修饰的生物体。所述经遗传修饰的生物体可以通过若干不同的技术来产生，所述技术包括但不限于：
1.经修饰的胚胎干(ES)细胞，例如常用的大鼠ES细胞和小鼠ES细胞。可以通过标准胚泡注射技术或聚集技术(Robertson，PracticalApproach Series，254，1987；Wood等，Nature，365：87-9，1993；Joyner，ThePractical Approach Series，293，1999)、四倍体胚泡注射(Wang等，MechDev，62：137-45，1997)或者核移植和克隆(Wakayama等，Proc Natl AcadSci USA，96：14984-9，1999)，用ES细胞产生经遗传修饰的大鼠或小鼠。来源于其它生物体例如兔子(Wang等，Mech Dev，62：137-45，1997；Schoonjans等，Mol Reprod Dev，45：439-43，1996)或鸡(Pain等，Development，122：2339-48，1996)或其它物种的ES细胞也适合于采用本发明的方法进行遗传修饰。
2.经修饰的原生质体可以用来产生经遗传修饰的植物(例如参见美国专利5,350,689＂Zea mays plants and transgenic Zea mays plantsregenerated from protoplasts or protoplast-deriVed cells(从原生质体或原生质体衍生细胞再生的玉蜀黍植株和转基因玉蜀黍植株)＂和美国专利5,508,189＂Regeneration of plants from cultured guard cell protoplasts(从培养的保卫细胞原生质体再生植株)＂和其中的参考文献)。
3.将经修饰的真核细胞的核转移到卵母细胞中，产生具经修饰的等位基因的克隆生物(Wakayama等，Proc Natl Acad Sci USA，96：14984-9，1999；Baguisi等，Nat Biotechnol，17：456-61，1999；Wilmut等，ReprodFertil Dev，10：639-43，1998；Wilmut等，Nature，385：810-3，1997；Wakayama等，Nat Genet，24：108-9，2000；Wakayama等，Nature，394：369-74，1998；Rideout等，Nat Genet，24：109-10，2000；Campbell等，Nature，380：64-6，1996)。
4.细胞融合，将经修饰的等位基因转移至另一细胞中，包括转移工程染色体，并且应用这样的细胞产生携带经修饰的等位基因或工程染色体的生物体(Kuroiwa等，Nat Biotechnol，18：1086-1090，2000)。
5.本发明的方法也适合于已经使用的或尚待发现的任何其它方法中。
尽管在实施本发明方法的各个步骤中所使用的多种技术是技术人员熟悉的，但是申请人满意的是，本发明方法的新颖性在于与以前从来没有描述过的将LTVEC直接导入真核细胞中以修饰染色体座位的方法以及应用定量MOA分析来鉴定经过适当修饰的真核细胞所相关的那些步骤和技术的独特组合。这一新组合代表了对产生具有内源基因或染色体座位修饰的生物体的现有技术的显著改进。
实施例
实施例1：工程改造带有OCR10基因缺失的小鼠ES细胞
a.含有mOCR10的大基因组DNA克隆的选择
通过用PCR筛选阵列化小鼠基因组DNA BAC文库(IncyteGenomics)，获得携带含有小鼠OCR10(mOCR10)基因编码序列的基因组DNA大片段的细菌人工染色体(BAC)克隆。筛选该文库所使用的引物衍生于mOCR10基因cDNA序列。
其中使用的两种引物对如下：
(a)OCR10.RAA(5′-AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG-3′)和OCR10.PVIrc(5′-CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAAGATGACG-3′)，该引物扩增一种102bp DNA；和
(b)OCR10.TDY(5′-GACCTCACTTGCTACACTGACTAC-3′)和OCR10.QETrc(5′-ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG-3′)，该引物扩增一种1500bp DNA。
该mOCR10BAC含有包括完整的mOCR10编码序列在内的大约180kb基因组DNA。该BAC克隆用来产生LTVEC，随后LTVEC用来缺失mOCR10编码区的一部分而同时导入报道基因，其起始密码子准确取代OCR10的起始密码子，以及在报道基因之后插入可用来在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行选择的选择标记基因(图2)。所述报道基因(在该非限制性的实施例中为LacZ，其序列对于技术人员而言是容易得到的)编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶。因为LacZ插入的位置(其起始密码子位于与mOCR10的起始密码子相同的位置)，所以lacZ的表达应该模拟mOCR10的表达，正如在其中采用现有技术(参见w Wurst和A.Gossler的＂Gene trap strategies in ES cells＂，载于Joyner，ThePractical Approach Series，293，1999)用LacZ进行相似取代的其它实施例中所观察到的一样。LacZ基因使得可以进行一种可以揭示其原位表达模式的简单的标准酶测定，从而提供反映被取代基因或染色体座位的正常表达模式的替代分析。
b.供体片段的构建和LTVEC的产生
在mOCR10 LTVEC构建中所使用的修饰盒是lacZ-SV40 polyA-PGKp-EM7-neo-PGK polyA盒，其中lacZ是如上所述的标记基因，SV40polyA是来源于猿猴病毒40(Subramanian等，Prog Nucleic Acid Res MolBiol，19：157-64，1976；Thimmappaya等，J Biol Chem，253：1613-8，1978；Dhar等，Proc Natl Acad Sci USA，71：371-5，1974；Reddy等，Science，200：494-502，1978)并且含有聚腺苷酸化位点和信号的片段(Subramanian等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，19：157-64，1976；Thimmappaya等，J Biol Chem，253：1613-8，1978；Dhar等，Proc Natl AcadSci USA，71：371-5，1974；Reddy等，Science，200：494-502，1978)，PGKp是小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子(Adra等，Gene，60：65-74，1987)(所述启动子广泛地用来驱动抗药性基因在哺乳动物细胞中的表达)，EM7是一种强细菌启动子，其优点是便于通过驱动新霉素磷酸转移酶(neo)基因的表达，在细菌中正选择已完成的LTVEC构建体，neo是在原核细胞中赋予卡那霉素抗性而在真核细胞中赋予G418抗性的选择标记(Beck等，Gene，19：327-36，1982)，PGK polyA是来源于PGK基因并且含有聚腺苷酸化位点和信号的3′非翻译区(Boer等，Biochem Genet，28：299-308，1990)。
为了构建mOCR10 LTVEC，首先采用标准重组基因工程技术，产生一种由连接于修饰盒中的LacZ基因上游的mOCR10同源框1(hb1)和连接于修饰盒中的neo-PGK polyA序列下游的mOCR10同源框2(hb2)构成的供体片段(图2)。同源框1(hb1)由紧接mOCR10可读框(mOCR10 ORF)的起始甲硫氨酸上游的211bp非翻译序列构成(图3A-3D)。同源框2(hb2)由终止于终止密码子的mOCR10 ORF的最后216bp构成(图3A-3D)。
其次，应用细菌同源重组(Zhang等，Nat Genet，20：123-8，1998；Angrand等，Nucleic Acids Res，27：e16，1999；Muyrers等，Nucleic AcidsRes，27：1555-7，1999；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999；Yu等，Proc Natl Acad Sci USA，97：5978-83，2000)，使用该供体片段，用所述插入盒准确取代mOCR10编码区(从起始甲硫氨酸至终止密码子)，从而构建mOCR10 LTVEC(图2)。因此，在该mOCR10 LTVEC中，mOCR10编码序列被插入盒取代，从而在mOCR10基因座中产生大约20kb缺失，同时留下大约130kb的上游同源性序列(上游同源臂)和32kb的下游同源性序列(下游同源臂)。
重要的是注意到，LTVEC可以比采用现有技术制备的打靶载体更快更方便地从可利用的BAC文库产生，因为只需要一个细菌同源重组步骤并且仅需要产生所述同源框所需的序列信息。相比之下，产生应用细菌同源重组的打靶载体的现有方法，要求大打靶载体在将其导入ES细胞之前被“修剪”(Hill等，Genomics，64：111-3，2000)。这种修剪是必需的，因为需要产生足够短的同源臂，以适应现有方法所使用的筛选方法。Hill等的方法的一个主要缺点是单单对于修剪而言就需要两个额外的同源重组步骤(一个用以修剪所修饰基因座上游区，另一个用以修剪所修饰基因座下游区)。为此，需要相当多的序列信息，包括跨越修剪位点的序列信息。
另外，以上实施例说明的另一明显的优点是跨越mOCR10基因的非常大的缺失(大约20kb)可以在一个步骤中容易地产生。相比之下，采用现有技术完成同样任务，可能需要几个步骤并且可能涉及用loxP位点标记编码序列的上游区和下游区，以便在将所修饰基因座导入真核细胞中之后，应用Cre重组酶除去这些位点所邻接的序列。这不可能在一个步骤中完成，因而可能需要采用不同的选择标记构建两个打靶载体，并且在ES细胞中需要两个顺序打靶事件，一个在编码序列上游区导入loxP位点，另一个在编码序列下游区导入loxP位点。还应该注意到，采用现有的打靶技术，大缺失的构建在真核细胞中通常以低频率发生，因为实现同源重组的频率当采用含有相对短的同源臂所邻接的大缺失的打靶载体时可能是低的。采用本发明方法所获得的高效率(参见下文)是由于在LTVEC中存在的提高真核细胞中同源重组率的非常长的同源臂所致。
c.mOCR10 LTVEC DNA的鉴定、制备并且将其导入ES细胞中
所述插入盒和同源序列的接点周围的序列通过DNA测序得到证实。mOCR10 LTVEC的大小通过限制性酶切分析、后接脉冲场凝胶电泳(PFGE)(Cantor等，Annu Rev Biophys Biophys Chem，17：287-304，1988；Schwartz和Cantor，Cell，37：67-75，1984)得到证实。进行mOCR10LTVEC的标准大规模质粒制备，该质粒DNA用限制性酶NotI消化，所述酶切割mOCR10 LTVEC的载体骨架，产生线性DNA。接下来，将线性化DNA通过电穿孔导入小鼠ES细胞中(Robertson，PracticalApproach Series，254，1987；Joyner，The Practical Approach Series，293，1999；Sambrook等，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989)。采用标准选择方法(Robertson，Practical Approach Series，254，1987；Joyner，ThePractical Approach Series，293，1999)，在含有G418的培养基中选择用mOCR10 LTVEC成功转染的ES细胞。
d.应用定量等位基因修饰(MOA)分析鉴定被击中靶的ES细胞克隆
为了鉴定其中两个内源mOCR10基因的其中一个已被修饰盒序列取代的ES细胞，将得自各个ES细胞克隆的DNA采用文献中所述的标准
方法(Applied Biosystems， Universal PCRMaster Mix，目录号P/N 4304437；也参见http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04304449.pdf)，通过定量PCR进行分析。所使用的引物和探针如图3A-3D中所述。筛选了总共69个独立的ES细胞克隆，其中3个鉴定为阳性克隆，即鉴定为内源mOCR10编码序列之一已被上述修饰盒取代的克隆。
所述MOA方法的几个优点是显而易见的：
(i)它不需要应用在待修饰基因座之外的探针，从而避免了需要知道邻接所修饰基因座的序列。
(ii)与一直是现有选择方法的常规DNA印迹法(Robertson，Practical Approach Series，254，1987，Joyner，The Practical ApproachSeries，293，1999)相比，所需的时间少得多，从而减少了鉴定正确修饰细胞的时间，从通常的数天减少至仅仅几小时。
这是对过去一直在使用的筛选方法的显著改进，并且使该方法为用于筛选真核细胞中的同源重组事件的、劳动强度大大降低、经济效益大大提高的方法。
本发明方法的再一个优点是本发明方法也因其能够靶向困难基因座也优于现有技术。采用现有技术，已经显示对于某些基因座，成功打靶的频率可能低至1/2000整合事件，也许甚至更低。采用本发明的方法，申请人已经证明，这样的困难基因座可以采用含有长同源臂的LTVEC(即大于现有技术允许的那些)更有效地打靶。正如上述非限制性实施例所证明的，本申请人已经击中了所述OCR10基因座，该基因座采用常规技术先前已经证明抗拒打靶。采用本发明的方法，本申请人已经说明，他们在69个ES细胞克隆中的3中已经达到成功打靶，其中mOCR10 LTVEC(含有超过160kb的同源臂，并且引入20kb缺失)已经整合，而采用ES细胞打靶的现有技术(Joyner，The PracticalApproach Series，293，1999)，使用基于具有同源臂短于10-20kb、同时也引入小于15kb的缺失的质粒的载体，在所述载体的600多个整合子中没有鉴定出靶被击中的事件。这些数据清楚地表明，本发明的方法优于现有技术。
实施例2：当将LTVEC用作打靶载体时中靶频率提高并且不需要使
用等基因DNA
如上所述，使用长同源臂达到的提高的中靶频率，应该减少在构建LTVEC时使用与靶真核细胞DNA等基因(即在序列方面与其相同)的基因组DNA所得的益处(如果有的话)。为了检验这一假说，本申请人采用来源于与靶真核细胞相同的小鼠亚株的基因组DNA构建若干LTVEC(假定是等基因的)，并且使用来源于与靶真核细胞不同的小鼠亚株的基因组DNA构建许多其它的LTVEC(假定是非等基因的)。所述非等基因LTVEC表现出的平均中靶频率为6％(在1-20％的范围内，表1)，而等基因LTVEC表现出的平均中靶频率为3％(在2-5％的范围内)，表明使用LTVEC的成功打靶率不于纯质遗传。
实施例3：用于鉴定被击中靶的ES克隆的、基于
的MOA
的详细描述
通过应用实时定量PCR的等位基因修饰(MOA)分析辨别被击中靶的ES细胞克隆和未被击中靶的ES细胞克隆之间的差异，鉴定通过同源重组吸收LTVEC并且将其掺入到基因组靶基因座中的ES细胞克隆，在被击中靶的ES细胞克隆中，两个靶等位基因的其中一个被修饰，而在未被击中靶的ES细胞克隆中，两个等位基因仍是未经修饰的。所述MOA分析由初次筛选和再次筛选构成。所述初次筛选包括下述步骤：(1)让LTVEC转染ES细胞克隆在明胶包被的96孔板上生长；(2)从每个ES细胞克隆分离基因组DNA；(3)用每个基因组DNA样品作为两个384孔板上8个独立定量PCR中的模板，其中2个PCR使用与作为缺失目标的基因组片段的一个末端的DNA序列杂交的靶基因座特异性引物组(“上游PCR”)，2个PCR使用与作为缺失目标的基因组片段另一个末端的DNA序列杂交的靶-基因座-特异性引物组(“下游PCR”)，4个PCR使用识别4个非靶向参比基因座的引物组(“参比PCR”)，并且每个PCR包括一种识别所扩增序列的荧光探针(例如
[ABI]、EclipseTM或Molecular Beacon(分子信标)探针[Synthetic Genetics])，其荧光信号与PCR产物的量成正比；(4)在热循环仪和荧光检测器组合在一起的装置(例如ABI 7900HT)中进行PCR，荧光检测器定量测定在PCR期间扩增产物的累积并且测定阈循环(CT)，即在PCR中可检测到的高于背景噪声的荧光信号点；(5)对于每个ES细胞克隆DNA样品而言，计算上游PCR和4个参比PCR中的每个之间CT值之差(ΔCT)以及下游PCR和4个参比PCR中的每个之间CT值之差(ΔCT)，以绘制96个ΔCT值的8个表；(6)将ΔCT值相对于阳性值归一化；(7)计算每个靶参比比较表的中位ΔCT值；(8)运用一种计算机程序测定置信分值，所述计算机程序检查8个ΔCT表，并且计算给定ES细胞克隆DNA样品产生在高于中位ΔCT值0.5-1.5、0.25-1.5、0.5-2.0、0.25-2.0、0.5-3.0和0.25-3.0个循环容许范围内的ΔCT值的次数(适合于创建或写入这种程序的计算机编程语言的实例包括visualbasics、Java或技术人员熟悉的任何其它计算机编程语言)；(9)将8个ΔCT表中的每个表的所述值及其中位值作图为直方图；且(10)根据对置信分值和ΔCT直方图的检查，鉴定被准确击中靶的ES细胞克隆候选物。在一个优选的实例中，候选的被击中靶的克隆的ΔCT值落在高于8个参比比较中的8个的中位值0.5-1.5个循环之内。
对通过MOA分析初次筛选鉴定的候选克隆在再次筛选中加以证实或排除，所述再次筛选包括下述步骤：(1)使用每个阳性候选ES细胞克隆的基因组DNA、较大数目标阴性克隆的基因组DNA和每个二倍体基因组携带一个或两个拷贝的LTVEC LacZ-Neo盒的小鼠的基因组DNA拷贝数标准品，作为两个384孔板上8个独立定量PCR中的模板，其中1个反应是上游PCR(如在初次筛选中)，1个反应是下游PCR(如在初次筛选中)，4个反应是具有与在初次筛选中所使用的基因座不同的两个参比基因座的参比PCR，1个反应是使用对LTVEC的LacZ基因特异性的引物和探针的PCR，1个反应是使用对LTVEC的Neo基因特异性的引物和探针的PCR；(2)如同在初次筛选中一样，在定量PCR装置中进行PCR；(3)如同在初次筛选中一样，计算上游PCR和2个参比PCR中的每个之间的ΔCT值、下游PCR和2个参比PCR中的每个之间的ΔCT值、LacZ PCR和2个参比PCR中的每个之间的ΔCT值以及Neo PCR和2个参比PCR中的每个之间的ΔCT值，以绘制8个ΔCT表；(4)将ΔCT值相对于阳性值归一化；(5)计算每个ΔCT表的中位值；(6)如同在初次筛选中一样，计算置信分值；且(7)将8个ΔCT表中的每个表的所述值及其中位值作图为直方图。
根据对初次筛选和再次筛选的置信分值和ΔCT直方图的检查，对被准确击中靶的ES克隆候选物或者证实或者排除。在一个优选的实施例中，从综合的初次筛选和再次筛选来看，候选的被击中靶的克隆的ΔCT值落在高于12个参比比较中的12个的中位值0.5-1.5个循环之内。
为了评价经证实的、被准确击中靶的ES克隆中每个二倍体基因组的LTVEC的拷贝数，将得自LacZ PCR和Neo PCR与2个参比PCR的比较的ΔCT值与LacZ-Neo PCR拷贝数标准品的ΔCT值进行比较。每个ES细胞克隆被评价为具有1个、2个或者多于2个拷贝的LTVEC。对于每个修饰等位基因计划，在分别有96个克隆的多个组中筛选ES细胞克隆(通常总克隆数少于288个)；直至鉴定出在MOA分析中被评价为阳性并且具有单拷贝的LacZ-Neo盒的3个克隆。
实施例4：应用FISH鉴定ES细胞中准确打靶的LTVEC
采用本文所述的LTVEC技术，本申请人敲除了ES细胞中的SM22α基因。SM22α是一种22kDa平滑肌细胞(SMC)谱系局限性蛋白，它与收缩性SMC中的细胞骨架肌动蛋白丝束物理缔合。然后在中期染色体涂片上对被击中靶的ES细胞进行标准荧光原位杂交(FISH)，以证实所述基因被恰当地击中。用两种探针进行该实验：1)SM22α基因探针，由未经修饰的用来产生所述LTVEC的SM22α BAC克隆构成，2)LacZ和新霉素DNA探针，仅仅检测由于打靶事件(插入LacZ和Neo基因盒)产生的基因修饰。从细胞中制备中期染色体涂片，同时用两种以不同颜色的荧光团标记的探针进行杂交，使得可以检测出同一涂片内的每种探针的杂交。平行分析作为对照的未经打靶的ES细胞系。正如所预期的，在对照涂片中，在同源染色体臂上检测出SM22α的两个等位基因，但没有LacZ-Neo探针的杂交。如同在对照中一样，在被击中靶的ES细胞涂片中，在同一染色体位置和同源染色体上也检测出两个等位基因，但在两条染色体的其中一条上明显被LacZ-Neo探针双标记，表明SM22α和LacZ-Neo DNA序列的共定位在SM22α的等位基因上。重要的是，在所述涂片中的不恰当位置既没有检测出SM22α基因序列，也没有检测出LacZ-Neo基因序列。在同源对的一条染色体中缺乏SM22α基因序列的外整合以及LacZ-Neo与SM22α的共定位，强烈地表明已经发生LacZ-Neo通过同源重组准确击中SM22α等位基因的其中一个。
实施例5：减少电穿孔ES细胞所使用的DNA量提高打靶效率
在电穿孔方法中，在小鼠胚胎干(ES)细胞内，用于基因靶向修饰的标准方法通常使用20-40μg打靶载体。本申请人发现，用LTVEC，使用低得多的DNA量(范围为约1-5μg/1 x 107细胞)进行电穿孔，使准确打靶同源重组事件的频率加倍，而大大降低了再次非同源插入事件数。在打靶效率方面的这一显著的改进是重要的，因为它显著减少需要筛选以发现具有已被准确击中的单拷贝修饰的若干阳性克隆的ES细胞克隆的数目。相关的益处是降低成本，提高通量。
实施例6：应用本发明的方法产生MA61敲除小鼠以研究肌肉萎缩
MA61，也称为MAFbx，是一种最近发现的、在各种肌肉萎缩病症中被正调节的遍在蛋白连接酶(参见于2001年1月30日申请的美国临时专利申请号60/264,926、于2001年8月10日申请的美国临时专利申请号60/311,697和于2001年10月22日申请的美国临时专利申请(顺序号仍未知)，所有所述临时专利申请都转让给RegeneronPharmaceuticals，Inc.，每个所述临时专利申请都通过引用全部结合到本文中)。为了进一步研究该基因在肌肉萎缩中的生物学重要性，采用本发明的方法如下产生敲除小鼠。
首先，为了获得含有MA61基因的克隆化基因组大片段，用来源于MA61cDNA序列的引物对细菌人工染色体(BAC)进行筛选。然后用如此获得的BAC克隆如下创建供真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)。对含有5′同源框/lacZ基因/polyA/PGK启动子/neo/polyA/3′同源框的修饰盒进行工程改造。附加所述同源框以便标记在LTVEC产生期间细菌同源重组的位点。LacZ是报道基因，其定位致使其起始密码子位于与MA61的起始密码子相同的位置。在细菌中进行同源重组后，所述修饰盒取代了MA61基因。因此，创建了其中所述BAC克隆中MA61编码序列为如上文所述工程改造的修饰盒所取代的MA61 LTVEC。然后如下文所述，制备、纯化和线性化供导入真核细胞中用的LTVECDNA。
制备MA61 LTVEC DNA的小量制备物(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989；Tillett和Neilan，Biotechniques，24：568-70，572，1998；http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm 399.pdf)，然后采用电穿孔再转化到大肠杆菌中(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989)，以便除去编码可用于细菌同源重组步骤的诱重组性蛋白的质粒(Zhang等，Nat Genet，20：123-8，1998；Narayanan等，Gene Ther，6：442-7，1999)。在将MA61 LTVEC导入真核细胞之前，通过标准方法(http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdf；Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular℃loning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989；Tillett和Neilan，Biotechniques，24：568-70，572，1998)，制备大量的MA61 LTVEC。
其次，为了制备供导入到真核细胞中用的MA61 LTVEC，将MA61LTVEC线性化。通过用限制性酶NotI消化，留下邻接长同源臂的经修饰的内源基因或染色体座位DNA，完成这一步。
然后采用标准电穿孔方法(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1、2和3卷，1989)，将MA61 LTVEC导入真核细胞中。成功导入MA61 LTVEC的细胞可以通过暴露于选择试剂进行选择。因为在所述修饰盒中所使用的选择标记是新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Beck等，Gene，19：327-36，1982)，所以在含G418的培养基中选择已吸收了MA61 LTVEC的细胞；不具有MA61 LTVEC的细胞死亡，而吸收了MA61 LTVEC的细胞存活下来(Santerre等，Gene，30：147-56，1984)。
通过用MA61 LTVEC击中MA61基因座而被成功修饰的真核细胞用定量PCR方法
(Lie和Petropoulos，Curr Opin Biotechnol，9：43-8，1998)进行鉴定。
最后，通过标准胚泡注射技术，用经遗传修饰的ES细胞产生经遗传修饰的小鼠，在这种情况下为敲除小鼠。如此产生的是已经缺失MA61基因的MA61敲除小鼠。
将这些敲除小鼠和野生型(WT)小鼠都暴露于通过除去小鼠神经产生的诱发萎缩的条件下，并且比较萎缩水平。首先，在小鼠右后肢大腿中部分离坐骨神经并将其横切。坐骨神经的横切导致去神经，并且在14天内，导致肢体下部肌肉萎缩，具体地讲在14天内导致胫骨前肌和腓肠肌萎缩。去神经后第7天和第14天，通过二氧化碳吸入处死动物。然后从在右后肢(去神经的)和左后肢(未去神经的)中取出胫骨前肌(TA)和腓肠肌复合体(GA)，称重，在液氮冷却的异戊烷中以固定长度冷冻。通过将来自去神经肢体的肌肉重量与来自未去神经肢体的肌肉重量进行比较，评价萎缩的量。
在右坐骨神经横切后7天和14天评价肌肉萎缩。将右侧去神经肌肉的净重与左侧未去神经肌肉的净重进行比较。右侧与左侧的比较结果在表2中给出。
7天 腓肠肌复合体 胫骨前肌
| 基因型 | 样品数 | 平均值 | SE | 样品数 | 平均值 | SE |
| WT | 7 | 0.76 | 0.016 | 11 | 0.68 | 0.033 |
| KO | 6 | 0.84 | 0.022 | 11 | 0.80 | 0.015 |
14天 腓肠肌复合体 胫骨前肌
| 基因型 | 样品数 | 平均值 | SE | 样品数 | 平均值 | SE |
| WT | 5 | 0.55 | 0.024 | 5 | 0.62 | 0.023 |
| KO | 5 | 0.80 | 0.019 | 5 | 0.80 | 0.015 |
在第7天和第14天，显示敲除小鼠的肌肉比野生型小鼠的肌肉的萎缩显著(p<.001)减少。敲除小鼠和野生型小鼠之间的差别为第14天时大于第7天的差别。尽管在7-14天内野生型小鼠继续萎缩，但是敲除小鼠显示不再萎缩。
总之，创建LTVEC以及直接使用LTVEC作为打靶载体连同对ES细胞中同源重组事件的MOA筛选的方法，创建了一种工程改造经遗传修饰的基因座的新方法，所述新方法是一种快速、便宜的方法，代表对先前一直使用的冗长费时方法的显著改进。因此为以现有方法所需时间和成本的几分之一对生物基因组中的基本上任何和所有基因进行快速大规模体内功能性基因组学分析提供了可能性。
虽然通过说明和实施例在某些细节中描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的公开内容进行某些变化和修改。
Claims (14)
1.一种用于遗传修饰非人胚胎干细胞的真核细胞中的目标内源基因或染色体座位的方法，所述方法包括：
a)获得含有目标DNA序列的大于20kb的克隆化基因组大片段；
b)应用细菌同源重组遗传修饰a)的克隆化基因组大片段，以构建可供所述真核细胞用的大打靶载体(LTVEC)；所述LTVEC具有同源臂而且同源臂总长度大于20kb；
c)将b)的LTVEC导入所述真核细胞中，以通过同源重组修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；且
d)应用定量分析来检测c)的真核细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些真核细胞。
2.权利要求1的方法，其中含有目标DNA序列的所述克隆化基因组大片段与所述目标内源基因或染色体座位同源。
3.权利要求1或2的方法，其中对所述内源基因或染色体座位的遗传修饰包括：编码序列、基因区段或调节元件的缺失；编码序列、基因区段或调节元件的改变；新的编码序列、基因区段或调节元件的插入；条件等位基因的创建；或者来自一个物种的编码序列或基因区段被来自相同或不同物种的同源或直向同源编码序列取代。
4.权利要求3的方法，其中所述编码序列、基因区段或调节元件的改变包括取代、添加或融合。
5.权利要求4的方法，其中所述融合包含一个附加表位或双官能蛋白。
6.权利要求1或2的方法，其中所述定量分析包括定量PCR、FISH、比较基因组杂交、DNA等温扩增或者与固定化探针定量杂交。
7.权利要求1或2的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物胚胎干细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞、大鼠胚胎干细胞或其它啮齿动物胚胎干细胞。
9.权利要求1或2的方法，其中所述内源基因或染色体座位是哺乳动物基因或染色体座位。
10.权利要求9的方法，其中所述内源基因或染色体座位是人类基因或染色体座位。
11.权利要求9的方法，其中所述内源基因或染色体座位是小鼠基因或染色体座位、大鼠基因或染色体座位或其它啮齿动物基因或染色体座位。
12.权利要求1或2的方法，其中所述LTVEC能够容纳大于100kb的DNA大片段。
13.一种用于遗传修饰小鼠胚胎干细胞中的目标内源基因或染色体座位的方法，所述方法包括：
a)获得大于20kb、含有目标DNA序列的克隆化基因组大片段，其中所述克隆化DNA大片段与所述内源基因或染色体座位同源；
b)应用细菌同源重组遗传修饰a)的克隆化基因组大片段，以构建可供所述小鼠胚胎干细胞用的大打靶载体，所述大打靶载体具有同源臂而且同源臂总长度大于20kb，其中所述遗传修饰是编码序列、基因区段或调节元件的缺失；
c)将b)的大打靶载体导入所述小鼠胚胎干细胞中，以通过同源重组修饰所述细胞中的所述内源基因或染色体座位；且
d)应用定量分析来检测c)的小鼠胚胎干细胞中的等位基因修饰(MOA)，以鉴定其中所述内源基因或染色体座位已被遗传修饰的那些小鼠胚胎干细胞，其中所述定量分析是定量PCR。
14.权利要求1-2和13中任一项的方法，其中将约1-5μg c)的大打靶载体导入约1 x 107细胞中。
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