CZ304856B6 - Způsob pro modifikování endogenního nebo chromosomálního lokusu - Google Patents
Způsob pro modifikování endogenního nebo chromosomálního lokusu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304856B6 CZ304856B6 CZ2003-1197A CZ20031197A CZ304856B6 CZ 304856 B6 CZ304856 B6 CZ 304856B6 CZ 20031197 A CZ20031197 A CZ 20031197A CZ 304856 B6 CZ304856 B6 CZ 304856B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- chromosomal locus
- cells
- ltvec
- endogenous gene
- Prior art date
Links
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 title claims abstract description 97
- 238000002715 modification method Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 184
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 155
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 99
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 99
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 71
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 69
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 57
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 57
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 78
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 75
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 39
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 33
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 32
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 32
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 22
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 22
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 16
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 15
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 15
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 12
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 45
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 20
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 7
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 7
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 6
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 3
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101100356230 Escherichia coli (strain K12) recT gene Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241001136792 Alle Species 0.000 description 1
- 101100355997 Bacillus subtilis (strain 168) recA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100301301 Escherichia coli (strain K12) recE gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100040669 F-box only protein 32 Human genes 0.000 description 1
- 101710191029 F-box only protein 32 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Micol Nucleic Acids Chemical class 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- JWOLLWQJKQOEOL-UHFFFAOYSA-N OOOOOOOOOOOOO Chemical compound OOOOOOOOOOOOO JWOLLWQJKQOEOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000555 contractile cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150061231 recE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087770 recT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012899 standard injection Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 108010040614 terminase Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Je popsán způsob pro modifikování endogenního genu nebo vybraného chromosomálního lokusu v non-lidské eukaryotické buňce, který zahrnuje použití bakteriální homologní rekombinace pro modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru (LTVEC); použití LTVEC pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu velkým klonovaným genomovým fragmentem za vytvoření modifikované alely; a detekování modifikované alely pro modifikování endogenního genu nebo vybraného chromosomálního lokusu v non-lidské eukaryotické buňce.
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu pro modifikování endogenního genu nebo vybraného chromosomálního lokusu v non-lidské eukaryotické buňce.
Dosavadní stav techniky
Specifické zaměření genů pomocí homologní rekombinace mezi homologní exogenní DNA a endogenní chromosomálními sekvencemi má mimořádný význam jako způsob pro generování deleci, insercí, plánování mutací, opravy mutací, vkládání transgenů nebo provádění jiných modifikací u myší. Současné metody zahrnují použití standardních specifických vektorů, s regiony homologie k endogenní DNA, typicky menšími než 10 až 20 kb, k vkládání požadovaných genetických modifikací do myších embryonálních kmenových buněk (IES), a potom injekci alterovaných ES buněk do myších embryí pro přenos provedené genetické modifikace do myší zárodečné buněčné linie (Smithies a kol., Nátuře, 317: 230 až 234, 1985; Thomas a kol., Cell, 51: 503 až 512, 1987; Koller a kol., Proč Nati Acad Sci USA, 86: 8927 až 8931, 1989; Kuhn a kol., Science, 254: 707 až 710, 1991; Thomas a kol., Nátuře, 346: 847 až 850, 1990; Schwartzberg a kol., Science, 246: 799 až 803, 1989; Doetschman a kol., Nátuře, 330: 576 až 578, 1987; Thomson a kol., Cell, 5: 313 až 321, 1989; DeChiara a kol., Nátuře, 345: 78 až 80, 1990; US patent č. 5 789 215, udělený 4.8.1998 pro GenPharm International).
V současných metodách vyžaduje detekování vzácných ES buněk, ve kterých standardní specifické vektory správně zacílily a modifikovaly požadovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus další sekvenci mimo homologní specifické sekvence obsažené v specifickém vektoru. Testy na úspěšné zacílení zahrnují standardní Southemovu hybridizaci nebo long PCR (Cheng, a kol., Nátuře, 369: 684 až 685, 1994; Foord a Rose, PCR Methods Appl., 3: S149-161, 1994; Ponce a Micol Nucleic Acids Res, 20: 623, 1992; patent US 5 436 149 udělený pro Takara Shuzo Co., Ltd.) ze sekvencí mimo specifický vektor a přesahujících celý region homologie (viz definice); vzhledem k tomu, že velikost sekvence omezuje tyto metody, tak je velikost regionu homologie omezena na méně než celkově 10 až 20 kb (Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999).
Možnost využívat specifické vektory s regiony homologie většími než v současných metodách je mimořádně hodnotná. Například, takové specifické vektory mohou být rychleji a snadněji připraveny z dostupných knihoven obsahujících velké genomové inserty (např. BAC nebo PAC knihoven) než specifické vektory připravené za použití současných technik, ve kterých musí být takové genomové inserty před použitím rozsáhle charakterizovány a upraveny. Dále, větší modifikace, stejně jako modifikace překlenuj ící větší genomové regiony, mohou být připraveny snáze a za použití menšího počtu kroků než při použití současných technologií. Dále, použití delších regionů homologie může zvýšit frekvenci specifického zacílení obtížně zacílitelných lokusů eukaryotické buňky, protože zacílení homologní rekombinace v eukaryotických buňkách patrně souvisí s celkovou homologií obsaženou v specifickém vektoru (Deng a Capecchi, Mol Cell Biol, 12: 3365 až 3371, 1992). Dále, zvýšená frekvence zacílení při použití delších regionů homologie může snížit potenciální přínos použití isogenní DNA v těchto specifických vektorech.
Problém provádění přesných modifikací ve velmi velkých genomových fragmentech, jako jsou fragmenty klonované v BAC knihovnách, byl do značné míry vyřešen použitím homologní rekombinace v bakteriích (Zhang, a kol., Nat Genet, 20: 123 až 128, 1998; Yang, a kol., Nat Biotechnol, 15: 859 až 865, 1997; Angrartd a kol., Nucleic Acids Res, 27: el6, 1999; Muyrers a kol., Nucleic Acids Res, 27: 1555 až 1557, 1999; Narayanan a kol., Gene Ther, 6: 442 až 447, 1999), která umožnila konstrukci vektorů obsahujících velké regiony homologie k eukaryotickým endogenním genům nebo chromosomálním lokusům. Nicméně, po přípravě nejsou tyto vektory vše-1 CZ 304856 B6 obecně použitelné pro modifikování endogenních genů nebo chromosomálních lokusů pomocí homologní rekombinace z důvodu obtíží v detekování vzácných správných zacílení, jsou-li regiony homologie větší než 10 až 20 kb (Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999).
Proto musí být vektory připravené za použití bakteriální homologní rekombinace z BAC genomových fragmentů před použitím jako specifické vektory ještě důkladně upraveny (Hill a kol., Genomics, 64: 111 až 113, 2000). Proto stále existuje potřeba rychlé a snadné metody umožňující použití specifických vektorů obsahujících velké regiony homologie tak, aby modifikovaly endogenní geny nebo chromosomální lokusy v eukaryotických buňkách.
V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje nové metody, které umožňují použití specifických vektorů obsahujících velké regiony homologie pro modifikování endogenních genů nebo chromosomálních lokusů v eukaryotických buňkách pomocí homologní rekombinace. Tyto metody překonávají výše popsaná omezení současných technik. Dále bude odborníkům v oboru jasné, že způsoby podle předkládaného vynálezu jsou upravitelné pro použití s jakoukoliv genomovou DNA jakéhokoliv eukaryotického organismu, jako jsou například zvířata, jako je myš, krysa, jiný hlodavec nebo člověk, stejně jako rostliny, například sója, kukuřice a pšenice.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob pro modifikování endogenního genu nebo vybraného chromosomálního lokusu v non-lidské eukaryotické buňce, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
a) použití bakteriální homologní rekombinace pro modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru (LTVEC);
b) použití LTVEC pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu velkým klonovaným genomovým fragmentem za vytvoření modifikované alely; a
c) detekování modifikovaní alely.
Výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu popsaný způsob, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
- získání velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, obsahujícího požadovanou DNA sekvenci;
- použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC);
- vložení LTVEC do eukaryotických buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a
- detekování modifikace alely (MOA) v eukaryotických buňkách pro identifikování těch eukaryotických buněk, ve kteiých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován.
Výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že velký klonovaný genomový fragment obsahuje DNA sekvenci, která je homologní k vybranému endogennímu genu nebo chromosomálnímu lokusu. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá vtom, že DNA sekvencí je humanizovaná DNA sekvence.
-2CZ 304856 B6
Výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že LTVEC nahrazuje endogenní gen nebo chromosomální lokus s velkým klonovaným genomovým fragmentem.
Výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že modifikace endogenního genu nebo chromosomálního lokusu zahrnuje deleci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; alteraci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; inserci nové kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; vytvoření podmíněné alely; nebo nahrazení kódující sekvence nebo genového segmentu zjednoho druhu homologní nebo ortologní kódující sekvencí ze stejného nebo jiného druhu. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá v tom, že alterace kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku zahrnuje substituci, adici nebo fúzi, zvláště výhodně fúze zahrnuje epitopovou koncovku nebo bifunkční protein.
Výhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu popsaný způsob, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje použití kvantitativního testu pro detekování modifikované alely. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá v tom, že kvantitativní test zahrnuje kvantitativní PCR, FISH, komparativní genomovou hybridizaci, isotermní DNA amplifikaci nebo kvantitativní hybridizaci na imobilizovanou sondu. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá v tom, že kvantitativní PCR zahrnuje použití Molecular Beacon sond.
Výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že eukaryotickou buňkou je non-lidská savčí embryonální kmenová buňka. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá v tom, že embryonální kmenová buňka je myší, krysí nebo jiná hlodavčí embryonální kmenová buňka.
Výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že endogenním genem nebo chromosomálním lokusem je nonlidský savčí gen nebo chromosomální lokus. Výhodné provedení takovéhoto způsobu spočívá vtom, že endogenním genem nebo chromosomálním lokusem je myší, krysí nebo jiný hlodavčí gen nebo chromosomální lokus.
Výhodným provedením tohoto vynálezu je vpředu popsaný způsob pro genetické modifikování vybraného endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v myší embryonální kmenové buňce, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
- získání velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, který obsahuje požadovanou DNA sekvenci, kde velký klonovaný DNA fragment je homologní s endogenním genem nebo chromosomálním lokusem;
- použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v myších embryonálních kmenových buňkách, kde genetickou modifikací je delece kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku;
- vložení velkého specificky cíleného vektoru do myší embryonální kmenové buňky pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a
- použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v myší embryonální kmenové buňce pro identifikování těch myších embryonálních kmenových buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován, kde kvantitativním testem je kvantitativní PCR.
-3 CZ 304856 B6
Výhodným provedením kteréhokoli zvýše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že LTVEC je schopen upravovat velké DNA fragmenty, větší než 100 kb.
Ještě jiným výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spoěívá v tom, že LTVEC má homologní ramena, která jsou větší než 20 kb.
Ještě jiným výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že LTVEC má homologní ramena, která jsou non-isogenní s non-lidskými eukaryotickými buňkami, které mají být modifikovány.
Ještě jiným výhodným provedením kteréhokoli z výše uvedených způsobů podle tohoto vynálezu je způsob, jehož podstata spočívá v tom, že 1 až 5 pg velkého specificky cíleného vektoru (c) je vloženo do přibližně 1 x 107 buněk.
Dále jsou uvedeny detailní údaje k předmětnému vynálezu. Ve snaze umožnit plné pochopení vynálezu přihlašovatel uvádí také údaje, které ukazují na celou šíři nalezeného řešení.
Byl nalezen způsob pro upravování a využívání velkých DNA vektorů pro specifické zacílení, pomocí homologní rekombinace, a modifikování, jakýmkoliv požadovaným způsobem, endogenních genů a chromosomálních lokusů v eukaryotických buňkách. Tyto velké vektory cílené na DNA pro eukaryotické buňky, označované jako LTVEC, jsou odvozeny od fragmentů klonované genomové DNA, které jsou větší než fragmenty obvykle využívané v jiných postupech pro provádění homologního zaměření v eukaryotických buňkách. Nalezené řešení se dále týká rychlé ajednoduché metody pro detekování eukaryotických buněk, ve které obsahuje LTVEC správně zacílený a modifikovaný vybraný endogenní gen nebo chromosomální lokus. Nalezené řešení též zahrnuje použití těchto buněk pro generování organismů s genetickou modifikací, organismy jako takové a způsoby jejich použití.
Použití LTVEC má významné výhody ve srovnání s dosud používanými způsoby. Například, protože jsou tyto vektory odvozeny od DNA fragmentů větších, než jsou současné vektory používané pro generování specifických vektorů, mohou být LTVEC rychleji a snadněji generovány z dostupných knihoven velkých genomových DNA fragmentů (jako je BAC a PAC knihovna) než specifické vektory připravované za použití současných technologií. Dále mohou být připraveny větší modifikace, stejně jako modifikace překlenující větší genomové regiony, než za použití dosud používaných technik.
Dále nalezené řešení využívá výhodu dlouhých regionů homologie pro zvýšení frekvence zacílení obtížně zacílitelných lokusů, a též snižuje přínos, pokud nějaký je, použití isogenní DNA v těchto cílených vektorech.
Nalezené řešení tak poskytuje rychlou, snadnou a jednoduchou metodu pro systematické modifikování v podstatě všech endogenních genů a chromosomálních lokusů v daném organismu.
Nalezené řešení je založeno na nové, rychlé, přímé a účinné metodě pro přípravu a skríning eukaryotických buněk, které obsahují modifikované endogenní geny nebo chromosomální lokusy. Tyto nalezené metody kombinují, poprvé:
1. Bakteriální homologní rekombinaci pro přesné vložení požadované genetické modifikace do velkého klonovaného genomového fragmentu, čímž se získá velký specifický vektor pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC);
2. Přímé vložení tohoto LTVEC do eukaryotické buňky pro modifikování vybraného endogenního chromosomálního lokusu v těchto buňkách; a
-4CZ 304856 B6
3. Analyzování za účelem stanovení vzácných eukaryotických buněk, ve kterých byla cílová alela modifikována tak, jak bylo požadováno, což zahrnuje testování za účelem modifikace alely (MOA) původní alely, které nevyžaduje informaci o sekvenci mimo cílové sekvence, jako je například kvantitativní PCR.
Výhodným provedením nalezeného řešení je způsob pro genetické modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v eukaryotických buňkách, který zahrnuje: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu obsahujícího požadovanou DNA sekvenci; (b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu (a) pro vytvoření velkého specifického vektoru pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC); (c) vložení LTVEC z bodu (b) do eukaryotických buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v eukaryotických buňkách z bodu (c) pro identifikování těch eukaryotických buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován.
Jiným provedením nalezeného řešení je způsob, ve kterém genetická modifikace endogenního genu nebo chromosomálního lokusu zahrnuje deleci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního elementu; alteraci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; insercí nové kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; vytvoření podmíněné alely; nebo nahrazení kódující sekvence nebo genového segmentu z jednoho druhu homologní nebo ortologní kódující sekvencí zjiného druhu.
Alternativním provedením nalezeného řešení je způsob, ve kterém alterace kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku zahrnuje substituování, adici nebo fúzi, kde fúze obsahuje epitopovou koncovku nebo bifunkční protein.
Ještě jiným provedením nalezeného řešení je způsob, kde kvantitativní test zahrnuje kvantitativní PCR, komparativní genomovou hybridizaci, isotermální DNA amplifikací, kvantitativní hybridizaci na imobilizovanou sondu, Invader Probes®, nebo MMP assays®, a kde kvantitativní PCR zahrnuje TaqMan® Molecular Beacon nebo Eclipse™ technologii.
Jiným výhodným provedením nalezeného řešení je způsob, kde eukaryotickou buňkou je savčí embryonální kmenová buňka a zejména myší, krysí nebo jiná hlodavci embryonální kmenová buňka.
Jiným výhodným provedením nalezeného řešení je způsob, kde endogenní gen nebo chromosomální lokus je savčí gen nebo chromosomální lokus, výhodně lidský gen nebo chromosomální lokus nebo myší, krysí nebo jiný hlodavčí gen nebo chromosomální lokus.
Dalším výhodným provedením je provedení, ve kterém je LTVEC schopný upravovat velké DNA fragmenty větší než 20 kb, zejména velké DNA fragmenty, větší než 100 kb.
Dalším výhodným provedením je geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus, kteiý je připraven způsobem podle nalezeného řešení.
Ještě dalším výhodným provedením je geneticky modifikovaná eukaryotická buňka, která je připravená způsobem podle nalezeného řešení.
Výhodnou možností provedení nalezeného řešení je non-lidský organismus obsahující geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus připravený způsobem podle nalezeného řešení.
-5CZ 304856 B6
Též výhodný je non-lidský organismus připravený z geneticky modifikované eukaryotické buňky nebo embryonálních kmenových buněk připravených způsobem zmíněným výše.
Výhodnou možností provedení nalezeného řešení je non-lidský organismus obsahující geneticky modifikovaný endogenní gene nebo chromosomální lokus, připravený způsobem zahrnujícím kroky: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu obsahujícího požadované DNA sekvence; (b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu z kroku (a) pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru (LTVEC) pro použití v embryonálních kmenových buňkách; (c) vložení LTVEC z kroku (b) do embryonálních kmenových buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v embryonálních kmenových buňkách z kroku (c) pro identifikování těch embryonálních kmenových buňkách, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován; (e) vložení embryonální kmenové buňky z kroku (d) do blastocysty; a (f) vložení blastocysty z kroku (e) do náhradní matky pro gestaci.
Další výhodnou možností provedení nalezeného řešení je non-lidský organismus obsahující geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus, připravený způsobem zahrnujícím kroky: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu obsahujícího požadované DNA sekvence; (b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu z kroku (a) pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC); (c) vložení LTVEC z kroku (b) do eukaryotické buňky pro genetické modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v eukaryotických buňkách z kroku (c) pro identifikování těch eukaryotických buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován; (e) odstranění jádra z eukaryotické buňky z kroku (d); (f) vložení jádra z kroku (e) do oocytu; a (g) vložení oocytu z kroku (f) do náhradní matky pro gestaci.
Ještě další výhodnou možností provedení je non-lidský organismus obsahující geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus, připravený způsobem zahrnujícím kroky: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu obsahujícího požadované DNA sekvence;
(b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu z kroku (a) pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC); (c) vložení LTVEC z kroku (b) do eukaryotické buňky pro genetické modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v eukaryotických buňkách z kroku (c) pro identifikování té eukaryotické buňky, ve které byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován; (e) fúzování eukaryotické buňky z kroku (d) s jinou eukaryotickou buňkou; (f) vložení fúzované eukaryotické buňky z kroku (e) do náhradní matky pro gestaci.
Výhodným řešením non-lidského organismu je myš, krysa nebo jiný hlodavec; blastocysta je myší, krysí nebo od jiného hlodavce; oocyt je myší, krysí nebo od jiného hlodavce; a náhradní matkou je myš, krysa nebo jiný hlodavec.
Jiným výhodným provedením je provedení, ve kterém je embryonální kmenovou buňkou savčí embryonální kmenová buňka, výhodně myší, krysí nebo jiná hlodavci embryonální kmenová buňka.
Dalším výhodným provedením je použití geneticky modifikované eukaryotické buňky předkládaného vynálezu pro produkci non-lidského organismu, zejména použití geneticky modifikované embryonální kmenové buňky předkládaného vynálezu pro produkci non-lidského organismu.
Výhodným provedením nalezeného řešení je způsob pro genetické modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v myších embryonálních kmenových buňkách, který zahmu-6CZ 304856 B6 je: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu většího než 20 kb, který obsahuje požadované DNA sekvence, kde velký klonovaný DNA fragment je homologní k endogennímu genu nebo chromosomálnímu lokusu; (b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu z kroku (a) pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v myších embryonálních kmenových buňkách, kde genetická modifikace je delece kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; (c) vložení velkého specificky cíleného vektoru z kroku (b) do myších embryonálních kmenových buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v myších embryonálních kmenových buňkách z kroku (c) pro identifikování těch myších embryonálních kmenových buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován, kde kvantitativním testem je kvantitativní PCR. Též výhodná je geneticky modifikovaná myší embryonální kmenová buňka připravená tímto způsobem; myš obsahující geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus připravený tímto způsobem; myš produkovaná z geneticky modifikované myší embryonální kmenové buňky.
Jinou výhodnou možností provedení je myš obsahující geneticky modifikovaný endogenní gen nebo chromosomální lokus, připravený způsobem zahrnujícím kroky: (a) získání velkého klonovaného genomového fragmentu většího než 20 kb, který obsahuje požadované DNA sekvence, kde velký klonovaný DNA fragment je homologní k endogennímu genu nebo chromosomálnímu lokusu; (b) použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu z kroku (a) pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v myších embryonálních kmenových buňkách, kde genetickou modifikací je delece kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; (c) vložení velkého specificky cíleného vektoru z kroku (b) do myších embryonálních kmenových buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomální lokus v buňkách; a (d) použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v myších embryonálních kmenových buňkách z kroku (c) pro identifikování těch myších embryonálních kmenových buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován, kde kvantitativním testem je kvantitativní PCR; (e) vložení myší embryonální kmenové buňky z kroku (d) do blastocysty; a (í) vložení blastocysty z kroku (e) do náhradní matky pro gestaci.
Též výhodné je použití geneticky modifikované myší embryonální kmenové buňky popsané výše pro produkci myši.
Též výhodné jsou metody, ve kterých je přibližně 1 až 5 pg velké specificky cílené vektorové DNA vloženo do přibližně 1 χ 107 eukaryotických buněk.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Schematický diagram přípravy typických LTVEC za použití bakteriální homologní rekombinace. (hbl = homologický box 1; hb2 = homologický box 2; RE = místo pro restrikční enzym).
Obr. 2: Schématický diagram donorového fragmentu LTVEC pro myší OCR10. (hbl = homologický box 1; lacZ = -galaktosidasový ORF; SV40 polyA = DNA fragment odvozený od Simian Virus 40, obsahující polyadenylační místo a signál; PGKp = myší fosfoglycerát kinasový (PGK) promotor; EM7 = bakteriální promotor; neo = neomycin fosfotransferasa; PGK polyA = 3' netranslatovaný region odvozený od PGK genu a obsahující polyadenylační místo a signál; hb2 = homologický box 2).
Obr. 3A až 3D: Sekvence myší OCR10 a cDNA, homologického boxu 1 (hbl), homologického boxu 2 (hb2) a TaqMan® sond a primerů použitých v kvantitativním PCR textu pro detekování modifikace alely (MOA) v ES buňkách zacílených pomocí mOCRlO LTVEC.
-7CZ 304856 B6 hb 1: páry bází 1 až 211 hb2: páry bází 1586 až 1801
TaqMan® sonda a příslušná sada PCR primerů odvozená od exonu 3 mOCRlO: TaqMan® sonda: nukleotidy 413 až 439 - horní řetězec.
Primer ex3-5': nukleotidy 390 až 410 - horní řetězec.
Primer ex3-3': nukleotidy 445 až 461 - dolní řetězec.
TaqMaxt® sonda a příslušná sada PCR primerů odvozených od mOCRlO exonu 4: TaqMan® sonda: nukleotidy 608 až 639 - horní řetězec.
Primer ex4-5': nukleotidy 586 až 605 - horní řetězec.
Primer ex4-3': nukleotidy 642 až 662 - dolní řetězec.
Definice „Specificky cílený vektor“ je DNA konstrukt, který obsahuje sekvence homologní k endogenním chromosomálním sekvencím nukleové kyseliny sousedícím s požadovanou genetickou modifikací. Sousedící homologní sekvence, označované jako „homologní ramena“, směrují specificky cílený vektor do specifického místa na chromosomu v genomu prostřednictvím homologie, která existuje mezi homologními rameny a příslušnou endogenní sekvencí a vkládají požadované genetické modifikace procesem označovaným jako „homologní rekombinace“.
„Homologní“ jsou dvě nebo více sekvencí nukleové kyseliny, které jsou dostatečně identické nebo podobné pro to, aby byly schopny hybridizovat jedna na druhou nebo aby mezi nimi mohla proběhnout intermolekulová výměna.
„Genové zacílení“ je modifikace endogenního chromosomálního lokusu insercí, deleci nebo nahrazením endogenní sekvence pomocí homologní rekombinace za použití specificky cíleného vektoru.
„Genové vyřazení (knockout)“ je genetická modifikace vznikající v důsledku narušení genetické informace kódované v chromosomálním lokusu.
„Genové zapnutí“ je genetická modifikace vznikající v důsledku nahrazení genetické informace kódované v chromosomálním lokusu jinou DNA sekvencí.
„Knockoutovaný organismus“ je organismus, ve kterém značná část buněk organismu obsahuje knock-outovaný gen.
„Knock-in organismus“ je organismus, ve kterém značná část buněk organismu obsahuje spuštěný (knock-in) gen.
„Markér“ nebo „selektovatelný markér“ je selekční markér, který umožňuje izolování vzácných transfektovaných buněk exprimujících markér z mnoha zpracovaných buněk v populaci. Mezi takové markéry patří, například, neomycin fosfotransferasa a hygromycin B fosfotransferasa, nebo fluorescenční proteiny, jako je GFP.
„ES buňka“ je embryonální kmenová buňka. Tato buňka je obvykle získána z vnitřních buněk embrya ve stadiu blastocysty.
„ES buněčný klon“ je subpopulace buněk odvozených od jedné buňky populace ES buněk po vložení DNA a následující selekci.
-8CZ 304856 B6 „Sousední DNA“ je segment DNA, který je kolineámí a sousedící s konkrétním referenčním místem.
„LTVEC“ jsou velké specifické vektory pro eukaryotické buňky, které jsou odvozeny od fragmentů klonované genomové DNA větších, než jsou fragmenty obvykle užívané pro provádění homologní cílené modifikace v eukaryotických buňkách.
„Non-lidský organismus“ je organismus, který není považován za lidskou bytost.
„Modifikace alely“ (MOA) označuje modifikaci konkrétní DNA sekvence jedné alely genu nebo chromosomálního lokusu (lokusů) v genomu. Tato modifikace alely (MOA) zahrnuje, ale není omezena na, delece, substituce nebo inserce i pouze jednoho nukleotidu nebo delece mnoha kilobází genu nebo chromosomálního lokusu, stejně jako všechny možné modifikace mezi těmito extrémy.
„Orthologní“ sekvence je sekvence od jednoho druhu, která je funkčně rovnocenná sekvenci z jiného druhu.
Následující popis a příklady provedení vynálezu jsou uvedeny pro ilustrování předkládaného vynálezu. Odborníkům v oboru bude jasné, že tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Podrobný popis předkládaného vynálezu
Předkladatelé vynálezu vyvinuly nový, rychlý, přímý a účinný způsob pro přípravu a skríning eukaryotických buněk, které obsahují modifikované endogenní geny nebo chromosomální lokusy. V těchto buňkách může být modifikací vyřazení genu, zařízení genu, bodová mutace nebo velké genomové inserce nebo delece nebo jiné modifikace. Těmito buňkami mohou být například embryonální kmenové buňky, které jsou použitelné pro přípravu knock-out nebo knockin organismů a zejména knock-out nebo knock-in myší, za účelem určení funkce genu, který byl alterován, deletován a/nebo insertován.
Nové způsoby podle předkládaného vynálezu poprvé kombinují:
1. Bakteriální homologní rekombinaci pro přesné zapracování požadované genetické modifikace ve velkém klonovaném genomovém DNA fragmentu, čímž se získá velký specifický cílený vektor pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC);
2. Přímé vložení těchto LTVEC do eukaryotické buňky pro modifikování příslušného endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v těchto buňkách; a
3. Analyzování pro určení těch vzácných eukaryotických buněk, ve kterých byla cílová alela modifikovaný požadovaným způsobem, což zahrnuje kvantitativní test na modifikaci původní alely (MOA).
Je třeba zdůraznit, že dřívější způsoby pro detekování úspěšné homologní rekombinace v eukaryotických buňkách nemohou být použity v souvislosti s LTVEC podle předkládaného vynálezu v důsledku dlouhých homologních ramen na LTVEC. Použití LTVEC pro libovolné modifikování endogenních genů nebo chromosomálních lokusů v eukaryotických buňkách pomocí homologní rekombinace je možné díky novému použití testu pro stanovení vzácných eukaryotických buněk, ve kterých byla cílová alela modifikována požadovaným způsobem, jako je test zahrnující kvantitativní test na modifikaci původní alely (MQA) využívající, například, kvantitativní PCR nebo jiné vhodné kvantitativní testy na MOA.
-9CZ 304856 B6
Schopnost používat specifické vektory s homologními rameny většími než v dřívějších metodách je mimořádně hodnotná z následujících důvodů:
1. Specifické vektory jsou rychleji a lépe generovány z dostupných knihoven obsahujících velké genomové inserty (např. BAC nebo PAC knihoven) než specifické vektory připravované za použití dřívějších postupů, ve kterých byly genomové inserty důkladně charakterizovány a „upraveny“ před tím, než byly použity (jak je podrobněji vysvětleno dále). Dále, o daném lokusu jsou potřeba minimální informace o sekvenci, tj. je třeba znát přibližně 80 až 100 nukleotidů, které jsou nutné pro generování homologických boxů (podrobně popsaných dále) a pro generování sond, které mohou být použity ve kvantitativních testech pro MOA (podrobně popsaných dále).
2. Větší modifikace, stejně jako modifikace zabírající větší genomové regiony, jsou prováděny snáze a v méně krocích než při použití dřívějších technik. Například, způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje přesnou modifikaci velkého lokusu, která nemohla být provedena tradičními plasmidovými specifickými vektory v důsledku omezení jejich velikost. Nový způsob též umožňuje modifikace jakéhokoliv daného lokusu v mnoha místech (např. vkládání specifických mutací v různých exonech multi-exonového genu) v jednom kroku, což zmírňuje potřebu upravovat více specifických vektorů a provádět opakované cílené upravování a vyhledávání homologní rekombinace v ES buňkách.
3. Použití dlouhých regionů homologie (dlouhých homologních ramen) zvyšuje frekvenci zacílení obtížně zacílitelných lokusů v eukaryotických buňkách, což je v souladu s předchozími objevy, že cílené provedení homologní rekombinace v eukaryotických buňkách souvisí s celkovou homologií obsaženou ve specificky cíleném vektoru.
4. Zvýšená frekvence cíleného zaměření při použití dlouhých homologních ramen významně snižuje přínos, pokud nějaký existuje, použití isogenní DNA v těchto specifických vektorech.
5. Použití kvantitativních MOA testů pro skríning eukaryotických buněk na homologní rekombinaci nejen opravňuje použití LTVEC jako specifických vektorů (výhody byly načrtnuty výše), ale též redukuje dobu nutnou pro identifikaci správně modifikovaných eukaryotických buněk z několika dnů na několik hodin. Dále, použití kvantitativní MOA nevyžaduje použití sondy umístěné mimo endogenní gen nebo chromosomální lokus, který se modifikuje, což odstraňuje potřebu znát sekvence sousedící s modifikovaným genem nebo lokusem. Toto je významné vylepšení oproti skríningu prováděnému v minulosti a jedná se o mnohem méně pracný a mnohem levněji přístup pro skríning na homologní rekombinace v eukaryotických buňkách.
Způsoby
Mnoho technik použitých pro konstrukci DNA vektorů jsou standardní techniky molekulární biologie známé odborníkům v oboru (viz např., Sambrook, I., E. F. Fritsch and I. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, a 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Veškeré sekvenování DNA se provedlo standardními technikami za použití ABI 3 73A DNA sekvenátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA).
Krok 1. Získání velkého genomového DNA klonu obsahujícího vybraný gen nebo chromosomální lokus
Požadovaný gen nebo lokus může být vybrán podle specifických kritérií, jako je podrobná struktura nebo funkční data, nebo může být vybrán i bez takových podrobných informací, jak budou potenciální geny nebo genové fragmenty určovány z genového sekvencování.
Je třeba uvést, že není nutné znát kompletní sekvenci genu a strukturu genu pro to, aby bylo možné použít způsob podle předkládaného vynálezu pro produkci LTVEC. Jediná informace o sek- 10CZ 304856 B6 věnci, která je skutečně potřeba, je informace o sekvenci přibližně 80 až 100 nukleotidů, která je nutná pro získání požadovaného genomového klonu a pro generování homologických boxů použitých pro přípravu LTVEC (jak je podrobněji popsáno dále) a pro výrobu sond pro použití ve kvantitativních MOA testech.
Jakmile je gen nebo lokus vybrán, je získán velký genomový klon obsahující tento gen nebo lokus. Tento klon může být získán různými způsoby, včetně například testování vhodných DNA knihoven (např. BAC, PAC, YAC nebo kosmidové knihovny) pomocí standardních hybridizačních nebo PCR technik, nebo pomocí jakýchkoliv metod známých odborníkům v oboru.
Krok 2. Připojení homologických boxů 1 a 2 na modifikační kazetu a generování LTVEC.
Homologní boxy označují místa bakteriální homologní rekombinace, která jsou použita pro generování LTVEC z velkých klonovaných genomových fragmentů (obr. 1). Homologní boxy jsou krátké segmenty DNA, obvykle dvouřetězcové a délky alespoň 40 nukleotidů, které jsou homologní k regionům ve velkém klonovaném genomovém fragmentu sousedícím s regionem, který má být modifikován. Homologní boxy se připojí na modifikační kazetu tak, že po homologní rekombinací v bakterii modifikační kazeta nahrazuje region, který má být modifikován (obr. 1). Technika vytváření specificky cíleného vektoru za použití bakteriální homologní rekombinace může být prováděna v různých systémech (Yang et al., Nat Biotechnol, 15:859-65, 1997; Muyrers et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555-7, 1999; Angrand et al., Nucleic Acids Res, 27:el6, 1999; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999; Yu, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 97:597883, 2000). Jedním příkladem výhodné v současnosti používané techniky je ET klonování (Zhang et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Narayanan et al., Gen Ther, 6:442-7, 1999) a varianty této techniky (Yu, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000). ET se týká recE (Halí a Kolodner, Proč Nati Acad Sci USA, 9 1:3205-9, 1994) a recT proteinů (Kusano et al., Gene, 138:17-25, 1994), které provádějí reakci homologní rekombinace. RecE je exonukleasa, která sestřihuje jeden řetězec lineární dvouřetězcové DNA (v podstatě donorový DNA fragment popsaný dále) ve směru 5' - 3', což zanechává za lineárním dvouřetězcovým fragmentem 3' jednořetězcový přesah. Tento jednořetězcový přesah je potažen recT proteinem, který má vazebnou aktivitu na jednořetězcovou DNA (ssDNA) (Kovali a Matthews, Science, 277:1824-7, 1997). ET klonování se provede za použití E. coli, která dočasně exprimuje E. coli genové produkty recE a recT (Halí and Kolodner, Proč Nat Acad Sci USA, 91:3205-9, 1994; Clark et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49:453-62, 1984; Noirot and Kolodxier, J Biol Chem, 273:12274-80, 1998; Thresher et al., J Mol Biol, 254:364-71, 1995; Kolodner et al., Mol Microbiol, 11:23-30, 1994; Halí et la., J Bacteriol, 175:277-87, 1993) a proteinu gam bakteriofágu lambda (X) (Murphy, J Bacteriol, 173:5808-21, 1991; Poteete et al., J. Bacteriol, 170:2012-21, 1988). gam protein je nutný pro chránění donorového DNA fragmentu před degradací recBC exonukleasovým systémem (Myers a Stáhl, Annu Rev Genet, 28:49-70, 1994) a je nutný pro účinné ET-klonování v recBC+ hostitelích, jako je často používaný kmen E. coli DHlOb.
Region, který má být modifikovaný a nahrazený za použití bakteriální homologní rekombinace, může mít délku od 0 nukleotidů (tehdy jde o vložení inserce do původního lokusu) do mnoha desítek kilobází (pro vytvoření delece a/nebo nahrazení původního lokusu). Podle modifikační kazety může modifikace vést k:
(a) deleci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku;
(b) alteraci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku včetně substitucí, adicí a fůzí (např. epitopových koncovek nebo vytvoření bifunkčních proteinů, jako jsou fúze s GFP);
(c) inserci nových kódujících regionů, genových segmentů nebo regulačních prvků, jako jsou geny pro selektovatelný markér nebo jakékoliv reportérové geny nebo přesunutí nových genů pod endogenní transkripční kontrolu;
-11 CZ 304856 B6 (d) vytvoření podmíněných alel, např. vložením loxP míst sousedících s regionem, který má být excidován Cre rekombinasou (Abremski a Hoess, J Biol Chem, 259:1509-14, 1984), nebo FRT míst sousedících s regionem, který má být excidován Ftp rekombinasou (Andrews et al., Cell, 40:795-803, 1985; Mayer-Leon et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49:797-804, 1984; Cox, Proč Nati Acad Sd. USA, 80:4223-7, 1983); nebo (e) nahrazení kódujících sekvencí nebo genových segmentů z jednoho druhu ortologními kódujícími sekvencemi z jiného druhu, například nahrazení myšího genetického lokusu ortologním lidským genetickým lokusem za účelem upravení myši, u které je daný lokus „humanizován“.
Jakákoliv nebo všechny tyto modifikace mohou být inkorporovány do LTVEC. Specifický, nelimitující příklad, ve kterém je endogenní kódující sekvence zcela deletována a simultánně nahrazena jak reportérovým genem, tak selektovatelným markérem, je uveden v příkladu 1, ve kterém jsou výhody způsobu podle předkládaného vynálezu srovnávány s předešlými technikami.
Krok 3 (volitelný). Ověření toho, že každý LTVEC byl upraven správným způsobem.
Ověření toho, že každý LTVEC byl upraven správným způsobem pomocí:
a. Diagnostické PCR pro ověření nových spojení vzniklých vložením donorových fragmentů do požadovaného genu nebo chromosomálního lokusu. Takto získané PCR fragmenty mohou být sekvenovány pro další ověření nových spojení vzniklých vložením donorových fragmentů do požadovaného genu nebo chromosomálního lokusu.
b. Diagnostické trávení restrikčním enzymem pro zjištění toho, že pouze požadované modifikace byly vloženy do LTVEC během procesu bakteriální homologní rekombinace.
c. Přímé sekvenování LTVEC, zejména regionů překlenujících místa modifikace, pro ověření nových spojení vzniklých vložením donorových fragmentů do požadovaného genu nebo chromosomálního lokusu.
Krok 4. Přečištění, příprava a linearizace LTVEC DNA pro vložení do eukaryotické buňky,
a. Příprava LTVEC DNA:
Příprava miniprep DNA (Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1,2, a 3, 1989; Tilett and Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998; http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm.399.pdf) vybraných LTVEC a retransformace miniprep LTVEC DNA do E. coli za použití elektroporace (Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1,2, a 3, 1989). Tento krok je nutný pro odstranění plasmidu kódujícího rekombinogenní proteiny, které jsou nutné pro krok bakteriální homologní rekombinace (Zhang et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999). Odstranění tohoto plasmidu je nutné z těchto důvodů: (a) velké množství kopií plasmidu může redukovat výtěžek při použití velkoobjemových LTVEC přípravků; (b) aby se eliminovala možnost indukce exprese rekombinogenních proteinů; a (c) protože může být obtížné fyzikální mapování LTVEC. Před vložením LTVEC do eukaryotické buňky se větší množství LTVEC DNA připraví za použití standardních technik (http://www.qiagen.eoin/literature/handbookS/plk/plklow.pdf Sambrook, J„ E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Tilett a Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998). Nicméně, tento krok může být obejit použitím metody bakteriální homologní rekombinace, která využívá rekombinantního profága, tj. takového, kde jsou geny kódující rekombinantní proteiny integrovány do bakteriálního chromosomu (Yu, et a., Proč Nati Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000).
-12CZ 304856 B6
b. Linearizování LTVEC DNA:
Pro přípravu LTVEC pro vložení do eukaryotické buňky se LTVEC výhodně linearizuje takovým způsobem, který ponechává DNA modifikovaného endogenního genu nebo chromosomálního lokusu obklopenou dlouhými homologními rameny. Toto může být provedeno linearizováním LTVEC, výhodně ve vektorovém skeletu, s jakýmkoliv vhodným restrikčním enzymem, který tráví pouze vzácně. Příklady vhodných restrikčních enzymů jsou Notl, Pad, Sfil, Srfl, Swal, Fsel, atd. Výběr restrikčního enzymu může být proveden experimentálně (tj. testováním několika různých kandidátů, které štěpí na vzácných místech), nebo - pokud je sekvence LTVEC známá, analyzováním sekvence a výběrem vhodných restrikčních enzymů podle této analýzy. V situacích, kde má LTVEC vektorový skelet obsahující vzácná místa, jako je CosN místo, může být štěpen enzymy rozpoznávajícími taková místa, například terminasou (Shizttya et al., Proč Nati Acad Sci USA, 89:8794-7, 1992; Becker and Gold, Proč Nati Acad Sci USA, 75:4199-203, 1978; Rackwitz et al., Gene, 40:259-66, 1985).
Krok 5. Vkládání LTVEC do eukaryotické buňky a selekce buněk, ve kterých proběhlo úspěšné vložení LTVEC.
LTVEC DNA může být vložena do eukaryotické buňky za použití standardní techniky, jako je transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým, lipidy nebo elektroporace (Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1,2, a 3, 1989). Buňka, do které byl úspěšně vložen LTVEC, může být selektována expozicí selekčním činidlům, jejichž typ závisí na selektovatelném markerovém genu, který byl vpraven do LTVEC. Například, pokud je selektovatelným markérem neomycin-fosfotransferasa (neo) gen (Beck, et al., Gene, 19:327-36, 1982), tak mohou být buňky, které vychytaly LTVEC, selektovány v G418-obsahujícím médiu; buňky, které nemají LTVEC, budou umírat, zatímco buňky, které vychytaly LTVEC, budou přežívat (Santerre, et al., Gene, 30:147-56, 1984). Mezi další vhodné selektovatelné markéry patří léky, které mají aktivitu v eukaryotických buňkách (Joyrter, Practical Approach Series, 293, 1999), jako je hygromycin B (Santerre, et al., Gene, 30:147-54, 1984; Bernard, et al., Exp Cell Res, 158:237-43, 1985; Giordano a McAllister, Gene, 88:285-8, 1990), Blasticidin S (Izumi, et al., Exp Cell Res, 197:229-33, 1991), a další, které jsou známé odborníkům v oboru.
Krok 6. Testování na proběhlé homologní rekombinace v eukaryotických buňkách za použití kvantitativního testu na modifikaci alely (MOA).
Eukaryotické buňky, které byly úspěšně modifikovány cíleným vložením LTVEC do požadovaného lokusu, mohou být identifikovány za použití různých způsobů, které detekují modifikace alely v daném lokusu a které nespočívají v testování celých homologních ramen. Mezi takové způsoby patří:
(a) kvantitativní PCR za použití TaqMan® (Lie and Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9:43-8, 1998);
(b) kvantitativní MOA test za použití molekulárních signálů (Tan, et al., Chemistry, 6:1107-11, 2000) (c) fluorescence in šitu hybridizace FISH (Laan, et al, Ham Genet, 96:275-80, 1995) nebo komparativní genomová hybridizace (CGH) (Forozan, et al., Trends Genet, 13:405-9, 1997; Thompson a Gray, J Cell Biochem Suppl, 139—43, 1993; Houldsworth a Chaganti, Am J Pathol, 145:1253-60, 1994);
(d) isotermní DNA amplifikace (Lizardi, et al., Nat Genet, 19:225-32, 1998; Mitra a Church, Nucleic Adds Res, 27:e34, 1999);
- 13CZ 304856 B6 (e) kvantitativní hybridizace na imobilizovanou sondu (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Kafatos FC; Jones CW; Efstratiadis A, Nucleic Acids Res 7(6):1541-52, 1979);
(f) Invader Sondy® (Third Wave Technologies);
(g) Eclipse™ a Molecular Beacon sondy (Synthetic Genetics);
(h) MMP testy (High Throughput Genomics).
Vynálezci zde uvádějí příklad, ve kterém je TaqMan® kvantitativní PCR použita pro vyhledávání úspěšně upravených eukaryotických buněk. V tomto příkladu je TaqMan® použita pro identifikování eukaryotických buněk, ve kterých proběhla homologní rekombinace, kde část jedné ze dvou endogenních alel v diploidním genomu byla nahrazena jinou sekvencí. Oproti tradičním metodám, ve kterých rozdílnost v délce restrikčních fragmentů v celém homologickém ramenu modifikuje jednu ze dvou alle, kvantitativní TaqMan® metoda detekuje modifikace jedné alely tím, že měří redukci počtu kopií (o polovinu) nemodifikované alely. Konkrétně, sonda detekuje nemodifikovanou alelu a ne modifikovanou alelu. Proto je tato metoda nezávislá na přesném charakteru modifikace a není omezena na substituce sekvence popsané v tomto příkladu. TaqMan® metoda se použila pro kvantifikaci počtu kopií DNA templátu ve vzorku genomové DNA, konkrétně srovnáním s referenčním genem (Lie and Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9:43-8, 1998). Referenční gen byl kvantifikován ve stejné genomové DNA jako cílový gen nebo lokus. Proto se provedly dvě TaqMan® amplifikace (každá s příslušnou sondou). Jedna TaqMan® sonda určuje „Ct (prahový cyklus) referenčního genu, zatímco druhá sonda určuje Ct regionu cílového genu nebo lokusu, který byl úspěšně nahrazen. Ct je kvantita, která ukazuje množství výchozí DNA pro každou z TaqMan® sond, tj. méně častá sekvence vyžaduje více cyklů PCR pro dosažení prahového cyklu. Snížením počtu kopií templátové sekvence o polovinu povede v TaqMan® reakci ke zvýšení o přibližně jednu Ct jednotku. TaqMan® reakce v buňkách, ve kterých byla pouze jedna alela cílového genu nebo lokusu nahrazena homologní rekombinací povede ke zvýšení Ct pro cílovou TaqMan® reakci bez zvýšení Ct pro referenční gen, když se srovnává s DNA z neúspěšných buněk. Toto umožňuje snadnou detekci modifikace jedné alely požadovaného genu v eukaryotických buňkách při použití LTVEC.
Jak bylo uvedeno výše, testování modifikace alely (MOA) je použitím jakékoliv metody, která detekuje modifikaci alely pro identifikaci buněk, ve kterých proběhla homologní rekombinace. Není nutné, aby cílové alely byly navzájem identické (homologní) a ve skutečnosti mohou obsahovat polymorfismy, jak je tomu v případě potomstva vzešlého ze křížení dvou různých kmenů myší. Dále, jednou speciální situací, která je také pokryta MOA skríningem, je cílená modifikace genů, které jsou normálně přítomny v buňkách vjedné kopii, jako jsou geny lokalizované na pohlavních chromosomech, zejména na chromosomu Υ. V těchto případech může být metoda detekující modifikace jedné cíleně modifikované alely, jako je kvantitativní PCR, Southemova hybridizace atd., použita pro detekci cílené modifikace. Je jasné, že způsob podle předkládaného vynálezu může být použit pro generování modifikovaných eukaryotických buněk, i když jsou alely polymorfní nebo když jsou přítomné v cíleně modifikovaných buňkách v jedné kopii.
Krok 8. Použití geneticky modifikovaných eukaryotických buněk (a) Geneticky modifikované eukaryotické buňky připravené způsobem popsaným v krocích 1 až 7 mohou být použity v testech in vitro nebo in vivo, kde je žádoucí změna fenotypu buněk.
(b) Geneticky modifikované eukaryotické buňky připravené způsobem popsaným v krocích 1 až 7 mohou být použity také pro přípravu organismu nesoucího genetické modifikace. Geneticky modifikovaný organismus může být připravený několika různými technikami, včetně:
1. Modifikovaných embryonálních kmenových (ES) buněk, jako jsou často používané krysí a myší ES buňky. ES buňky mohou být použity pro vytvoření geneticky modifikovaných krys
- 14CZ 304856 B6 nebo myší za použití standardních injekcí do blastocyty nebo agregačních technik (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Wood, et al., Nátuře, 365:87-9, 1993; Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999), injekce do tetraploidní blastocysty (Wang, et al., Mech Dev, 62:137—45, 1997), nebo jaderného přenosu a klonování (Wakayama, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 96:14984-9, 1999). ES buňky získané z jiného organismu, jako je králík (Wang, et al., Mech Dev, 62:137-45, 1997; Schoonjans, et al., Mol Reprod Dev, 45:439-43, 1996) nebo kuře (Pain, et al., Development, 122:2339—48, 1996) nebo jiný druh, mohou být také vhodné pro genetické modifikování způsobem podle předkládaného vynálezu.
2. Modifikované protoplasty mohou být použity pro přípravu geneticky modifikovaných rostlin (například viz patent US 5 350 689 „Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells“, a patent US 5 508 189 „Regeneration of plants from cultured guard cell protoplasts“ a odkazy uvedené v těchto patentech).
3. Jaderného přenosu z modifikovaných eukaryotických buněk do oocytů pro generování klonovaných organismů s modifikovanou alelou (Wakayama, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 96:14984-9, 1999; Baguisi, et al., Nat Biotechnol, 17:456-61, 1999; Wilmut, et al., Reprod Fertil Dev, 10:639-43, 1998; Wilinut, et al., Nátuře, 385:810-3, 1997;
Wakayama, et al., Nat Genet, 24:108-9, 2000; Wakayama, et al., Nátuře, 394:369-74, 1998; Rideout, et al., Nat Genet, 24:109-10, 2000; Campbell, et al., Nátuře, 380:64-6, 1996).
4. Fúze buněk pro přenos modifikované alely do jiné buňky, včetně přenosu upraveného chromosomu, a použití takových buněk pro generování organismu nesoucího modifikovanou alelu nebo upravený chromosom (Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 18:1086-1090, 2000).
5. Způsob podle předkládaného vynálezu je také vhodný pro jakýkoliv jiný způsob, který bude objeven v budoucnu.
Ačkoliv mnoho metod použitých při provádění jednotlivých kroků ve způsobu podle předkládaného vynálezu je známých odborníkům v oboru, objevnost způsobu podle předkládaného vynálezu spočívá v jedinečné kombinaci těchto kroků a technik s dříve nepopsanou metodou vkládání LTVEC přímo do eukaryotických buněk pro modifikování chromosomálního lokusu a použití kvantitativních MOA testů pro identifikování eukaryotických buněk, které byly správně modifikované. Tato nová kombinace představuje významně zlepšení oproti dřívějším postupům. Pro přípravu organismů majících modifikace endogenních genů nebo chromosomálních lokusů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Úprava myších ES buněk nesoucích deleci OCR10 genu
a. Selekce velkého genomového DNA klonu obsahujícího mOCRlO.
Bakteriální Artificiální Chromosomální (BAC) klon obsahujíc velký genomový DNA fragment, který obsahuje kódující sekvence myšího OCR10 (mOCRlO) genu, se získal skríningem uspořádané myší genomové DNA BAC knihovny (Incyte Genomics) za použití PCR. Primery použití pro testování této knihovny byly odvozeny od cDNA sekvence mOCRlO genu.
Použily se dva páry primerů:
(a) OCR10.RAA (5-AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG-3') a OCRlO.PVIrc (5'CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAAGATGACG-3'), který amplifikuje 102 bp DNA; a
-15 CZ 304856 B6 (b) OCRIO.TDY (5-GACCTCACTTGCTACACTGACTAC-3') a OCRlO.QETrc (5ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG-3), který amplifikuje 1509 bp DNA.
Tento mOCRlO BAC obsahoval přibližně 180 kb genomové DNA včetně kompletní mOCRlO kódující sekvence. Tento BAC klon byl použit pro přípravu LTVEC, které se potom použily pro deletování části kódujícího regionu mOCRlO za současného vložení reporterového genu, jeho iniciační kodon přesně nahradil iniciační kodon OCR10, stejně jako pro inserci selektovatelného markerového genu použitelného pro selekci jak v E. coli, tak v savčích buňkách (obr. 2). Reporterový gen (v tomto příkladu LacZ, jehož sekvence je dostupná odborníkům v oboru), kóduje E.coli -galaktosidasu. V důsledku pozice inserce LacZ (jeho iniciační kodon je ve stejné pozici jako iniciační kodon mOCRlO) bude exprese LacZ napodobovat expresi mOCRlO, jak bylo pozorováno v jiných příkladech, kde byla podobná nahrazení LacZ provedena za použití dřívějších technik (viz „Gene trap strategies in ES buněk“, W. Wurst a A. Gossler, in Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999). LacZ gen umožňuje provedení jednoduchých a standardních enzymatických testů, které ukáží charakter jeho exprese in šitu, což poskytuje náhradní test, který ukazuje na normální charakter exprese nahrazeného genu nebo chromosomálního lokusu. b. Konstrukce donorového fragmentu a příprava LTVEC.
Modifikační kazeta použitá v konstrukci mOCRlO LTVEC je lacZ-SV40 polyA-PGKp-EM7neo-PGK polyA kazeta, kde lacZ je markerový gen popsaný výše, SV40 polyA je fragment odvozený od Simian Virus 40 (Subramanian, et al., ProgNucleic Acid Res Mol Biol, 19:157-64, 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem., 253:1613-8, 1978; Dhar, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 71:371-5, 1974; Reddy, et al., Science, 200:494-502, 1978) a obsahující polyadenylační místo a signál (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19:157-64, 1976; Thinunappaya, et al., J Biol Chem, 253:1613-8, 1978; Dhar, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 71: 371— 5, 1974; Reddy, et al., Science, 200:494-502, 1978), PGKp je myší fosfoglycerát kinasový (PGK) promotor (Adra. et al., Gene, 60:65-74, 1987) (který se používá pro řízení exprese genů resistence na léky v savčích buňkách), EM7 je silný bakteriální promotor, který má výhodu v tom, že umožňuje pozitivní selekci kompletního LTVEC konstruktu v bakteriích tím, že řídí expresi genu pro neomycin- fosfotransferasu (neo), neo je selektovatelným markér, který udílí resistenci na kanamycin v prokaryotických buňkách a resistenci na G418 v eukaryotických buňkách (Beck, et al., Gene, 19:327-36, 1982), a PGK polyA je 3' netranslatovaný region odvozený od PGK genu a obsahující polyadenylační místo a signál (Boer, et al., Biochem Genet, 28:299308, 1990).
Pro konstrukci mOCRlO LTVEC se nejprve připraví donorový fragment skládající se z mOCRlO homologního boxu 1 (hbl), kterýje navázán před LacZ gen v modifikační kazetě a mOCRlO homologního boxu 2 (hb2) navázaného za neo-PGK polyA sekvenci v modifikační kazetě (Obr. 2), za použití standardní techniky rekombinantního genetického inženýrství. Homologní box 1 (hbl) se skládá z 211 bp netranslatované sekvence bezprostředně před iniciačním methioninem mOCRlO otevřeného čtecího rámce (mOCRlO ORF) (obr. 3A-3D). Homologní box 2 (hb2) se skládá z posledních 216 bp mOCRlO ORF, a končí stop kodonem (Obr. 3A-3D).
Potom se za použití bakteriální homologní rekombinace (Zhang, et al,, Nat Genet, 20:123-8, 1998; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27:el6, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999; Yu, et al., Proč Nati Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000) tento donorový fragment použil pro přesné nahrazení mOCRlO kódujícího regionu (od iniciačního methioninu po sto kodon) inserční kazetou, což vedlo k zisku mOCRlO LTVEC (obr. 2). Tak byla v tomto mOCRlO LTVEC, mOCRlO kódující sekvence nahrazena inserční kazetou za vzniku přibližně 20 kb delece v mOCRlO lokusu za ponechání přibližně 130 kb homologního regionu před (předcházející homologní rameno) a 32 kb homologii za (následné homologní rameno).
-16CZ 304856 B6
Je důležité zmínit, že LTVEC mohou být rychleji a snáze generovány z dostupných BAC knihoven než specifické vektory připravené za použití dřívějších technik, protože je potřeba pouze jeden krok bakteriální homologní rekombinace a jediná informace o sekvenci, která je potřeba, je informace o sekvenci, která je potřeba pro generování homologních boxů. Naopak, dřívější postupy pro přípravu cílených vektorů za použití bakteriální homologní rekombinace vyžadovaly, aby byly velké cílené vektory „upraveny“ před jejich vložením do ES buněk (Hill et al., Genomics, 64:111-3, 20.00). Toto upravení je nutné v důsledku potřeby generovat homologní ramena dostatečně krátká, aby vyhovovala skríningovým metodám využívaným dřívějšími postupy. Jednou z hlavních nevýhod způsobu podle Hill et al. Je to, že další kroky homologní rekombinace jsou nutné pouze pro upravení (jeden pro upravení regionu před modifikovaným lokusem a jeden pro upravení regionu za modifikovaným lokusem a jeden pro upravení regionu za modifikovaným lokusem). Pro provedení tohoto je potřeba více informací o sekvenci, včetně informace o sekvenci mezi upravovanými místy.
Další výraznou výhodou, ilustrovanou ve výše uvedeném příkladu, je to, že v jednom kroku může být snadno připravena velmi velká delece v mOCRlO genu (přibližně 20 kb). Naopak při použití dřívějších technik je pro provedení stejné modifikace potřeba několika kroků a tyto mohou vyžadovat označení regionů před a za kódující sekvencí loxP místy pro použití Cre rekombinasy pro odstranění sekvence mezi těmito místy po vložení modifikovaného lokusu do eukaryotických buněk. Toto může být neproveditelné v jednom stupni, a proto může být nutné konstruovat dva specifické vektory za použití různých selekčních markérů a provést dvě sekvenční cílené modifikace v ES buňkách, jednu pro vložení loxP místa do regionu před kódující sekvencí a druhou pro vložení loxP místa do regionu za kódující sekvencí. Dále je třeba uvést, že vytvoření velkých delecí je při použití dřívějších specifických technik v eukaryotických buňkách málo časté, protože frekvence homologní rekombinace může být nízká při použití specifických vektorů obsahujících velké delece obklopené relativně krátkými homologními rameny. Vysoká účinnost dosažená při použití způsobu podle předkládaného vynálezu (viz dále) je způsobena velmi dlouhými homologními rameny přítomnými na LTVEC, které zvyšují stupeň homologní rekombinace v eukaryotických buňkách.
c. Ověření, příprava a vložení mOCRlO LTVEC DNA do ES buněk.
Sekvence obklopující spojení mezi inserční kazetou a homologní sekvencí se ověřily sekvenováním DNA. Velikost mOCRlO LTVEC se ověřila restrikční analýzou následovanou gelovou elektroforesou s pulzním polem (PFGE) (Cantor, et al., Annu Rev Biophys Biophys Chem, 17:287-304, 1988; Schwartz and Cantor, Cell, 37:67-75, 1984). Provedla se standardní velkoobjemová plasmidová příprava mOCRlO LTVEC, plasmidová DNA se trávila restrikčním enzymem Notl, který tráví vektorový skelet mOCRlO LTVEC, za zisku lineární DNA. Následně se linearizovaná DNA vložila do myších ES buněk elektroporací (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999; Sambrook et al., Sambrook, J., E. F. Fritséh and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1,2, a 3, 1989). ES buňky úspěšně transfektované mOCRlO LTVEC se selektovaly na G418obsahujícím médiu za použití standardních selekce (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999).
d. Identifikace cíleně modifikovaných ES buněčných klonů za použití testu kvantitativní modifikace alely (MOA).
Pro identifikování ES buněk, ve kterých byl jeden ze dvou endogenních mOCRlO genů nahrazen sekvencí modifikační kazety, se DNA z jednotlivých ES klonů analyzovala kvantitativní PCR za použití standardní TaqMan® metody, jak je popsána v literatuře (Applied Biosystems, TaqMan® Universal PCR Master Mix, katalogové č. P/N 4304437; viz též http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04304449.pdf). Použité primery a TaqMan® sondy jsou stejné, jako na obr. 3A až 3D. Celkově 69 nezávislých ES buněčných klonů se testovalo a 3 se
- 17CZ 304856 B6 identifikovaly jako pozitivní, tj. jako klony, ve kterých byla endogenní mOCRlO kódující sekvence nahrazena modifikační kazetou popsanou výše.
MOA technika má několik výhod:
(i) Nevyžaduje použití sondy mimo lokus, který má být modifikován, což eliminuje potřebu znát sekvenci sousedící s modifikovaným lokusem.
(ii) Je potřeba velmi málo času pro provedení testu ve srovnání s běžnou Southemovou hybridizaci, která byla dříve metodou volby (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner, Practical Approach Series, 293, 1999), což redukuje čas pro identifikování správně modifikovaných buněk z obvyklých několika dnů na několik hodin.
Toto znamená významné zlepšení oproti skríningu prováděnému v minulosti a jedná se o mnohem méně pracný a levnější metodu pro skríning na události homologní rekombinace v eukaryotických buňkách.
Ještě další výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je to, že je také lepší ve srovnání s dřívějšími technikami ve schopnosti cíleně ovlivnit obtížně modifikovatelné lokusy. Bylo prokázáno, že při použití dřívějších technik může být frekvence úspěšného zacílení i pouze 1 až 2000 integračních událostí, a snad i ještě nižší. Při použití způsobu podle předkládaného vynálezu bylo prokázáno, že takové obtížně zacílitelné lokusy jsou mnohem účinnější zacíleny při použití LTVEC, které obsahují dlouhá homologní ramena (tj. lépe než při použití dřívějších technik). Jak ukazuje výše uvedený příklad, předkladatelé vynálezu zacílily OCR10 lokus, což je lokus, který byl obtížně ovlivnitelný při použití běžných technik. Při použití způsobu podle předkládaného vynálezu bylo prokázáno, že je možné dosáhnout úspěšného zacílení ve 3 z 69 ES buněčných klonů, ve kterých byl mOCRlO LTVEC (obsahující více než 160 kb homologní ramena a vkládající 20 kb deleci) integrován, zatímco za použití dřívějších technik pro ovlivnění ES buněk (Joymer, Practical Approach Series, 293, 1999) za použití plasmidových vektorů s homologními rameny kratšími než 10 až 20 kb a také vkládajícími deleci menší než 15 kb, nebyly mezi 600 integranty vektor detekovány žádné cílené modifikace. Tato data jasně demonstrují zlepšení, které přináší způsob podle předkládaného vynálezu ve srovnání s předchozími způsoby.
Příklad 2: Vyšší frekvence cílené modifikace a eliminace potřeby použití isogenní DNA při použití LTVEC jako specifických vektorů.
Jak bylo uvedeno výše, vyšší frekvence cílené modifikace dosažení při použití dlouhých homologních ramen by měla snížit přínos, pokud je nějaký, použití genomové DNA při konstrukci LTVEC, která je isogenní s (tj. má identickou sekvenci s) DNA eukaryotických buněk. Pro testování této hypotézy vynálezci připravili několik LTVEC za použití genomové DNA od stejného myšího podkmene jako jsou eukaryotické buňky, které mají být cíleně modifikovány (předpokládané isogenní), a velký počet dalších LTVEC, za použití genomové DNA odvozené od myších podkmenů lišících se od eukaryotické buňky, která má být cíleně modifikována (předpokládané non-isogenní). Non-isogenní LTVEC měly průměrnou frekvenci zacílení 6 % (v rozmezí od 1 do 20 %, tabulka 1), zatímco isogenní LTVEC měly průměrnou frekvenci zacílení 3 % (v rozmezí od 2 až 5 %), což ukazuje, že stupeň úspěšného zacílení při použití LTVEC nezávisí na isogenicitě.
-18CZ 304856 B6
Tabulka “g
I r
I '§
CL s
o t*
O co \© r-< co co
O
CN
O o
CN CO uo o
CN
O σ\
O vj oo co > > 00 CZJ cn cn cq co Μ· r~
CN to
CN
UO CN CN
V) CN CN © © <q <N CN o cn Ρ A cn σ co g g co σ <n tn © cn © cn tt
XJ» r± CN
O
CO ^ © v>
co <o o © © © oo »n Tj- co
Ι/Ί
O\
O O \O CN <50 CO o
r· © o © o o © Ό CN CO OO
CN *-* v-* i-H wo vj m uo UO Ν' r* r- r- c^ r· rK-j J-“i »—i >—5 »—| F-i h“»
U U U U U U 0
CZJ co co czj r- r~- γο 5 o
Γ* > >
►•n h» ί-Λ
U U CJ cn cn cn cn cn cn cn r* r* r» >—} >-“S F-J
O u u
OOOOOOOOOOOOO í—( £_< C_t L··^ L·—i C-< Cm< í—i í-^ C3 3 3 3 3 3 3^'^ cti co cd <α α ta
1—I l-J l-J 3 3 3
ffi o
o s β © © g g o o
tó Pí PS o o o rtutí
- 19CZ 304856 B6
Příklad 3: Podrobný popis TaqMan® MOA pro identifikaci cíleně ovlivněných ES klonů
ES buněčné klony, které vychytaly LTVEC a inkorporovaly je do genomu v cílovém lokusu homologní rekombinaci, se identifikovaly testem modifikace alely (MOA), který využívá realtime kvantitativní PCR pro zjištění rozdílů mezi cíleně ovlivněnými ES buněčnými klony, ve kterých je jedna ze dvou alel modifikovaná, a cíleně neovlivněnými ES buněčnými klony, ve kterých zůstávají obě alely nemodifikované. MOA test se skládá z primárního a sekundárního testu. Primární test zahrnuje následující kroky: (1) kultivaci LTVEC transfektovaných ES buněčných klonů na želatinou potažených 96-jamkových plotnách; (2) izolaci genomové DNA z každého ES buněčného klonu; (3) použití každého vzorku genomové DNA jako templátu v 8 samostatných kvantitativních PCR ve dvou 384-jamkových plotnách, ve kterých 2 z PCR využívají pro cílový lokus specifickou sadu primerů, které hybridizují na DNA sekvence na jednom konci genomového fragmentu určeného pro deleci („upstream PCR“), 2 z PCR využívají pro cílový lokus specifickou sadu primerů, které hybridizují na DNA sekvence na druhém konci genomového fragmentu určeného pro deleci („downstream PCR“), 4 z PCR využívají sady primerů, která rozpoznává čtyři necílené referenční lokusy („referenční PCR“), a každá PCR obsahuje fluorescenční sondu (například TaqMan® [ABI], Eclipse™ nebo Molecular Beacon sondu [Synthetic Genetics]), která rozpoznává amplifikované sekvence a jejíž fluorescenční signál je přímo úměrný množství PCR produktu; (4) provedení PCR v přístroji, který kombinuje termocyklér s fluorescenčním detektorem (například ABI 7900HT), který kvantifikuje produkty amplifikace během PCR a určuje prahový cyklus (CT), stav při PCR, kdy je fluorescenční signál detekovatelný vůči pozadí; (5) výpočet - pro každý ES buněčný klon - rozdílu CT hodnot (CT) mezi upstream PCR a každou ze čtyř referenčních PCR a mezi downstream PCR a každou ze čtyř referenčních PCR a vytvoření 8 tabulek 96 CT hodnot; (6) normalizace CT hodnot na pozitivní hodnoty; (7) výpočet mediánu CT hodnot pro každou srovnávací tabulku mezi cílem-referencí; (8) stanovení intervalu spolehlivosti za použití počítačového programu, který testuje 8 tabulek a vypočítává počet jevů, kdy daný vzorek DNA z ES buněčného klonu produkuje CT hodnotu v tolerančním rozsahu 0,5 až 1,5, 0,25 až 1,5, 0,5 až 2,0, 0,25 až 2,0, 0,5 až 3,0 a 0,25 až 3,0 cyklů vyšším než medián CT (příklady programovacích jazyků vhodných pro vytvoření takových programů jsou basic, Java, nebo jakýkoliv jiný počítačový program známý odborníkům v oboru); (9) zanesení hodnot a jejich mediánů do grafu pro každou z osmi CT tabulek ve formě histogramů; a (10) identifikaci správně modifikovaných ES buněčných klonů podle intervalů spolehlivosti a CT histogramů. Ve výhodném příkladu jsou hodnoty pro potenciální klon v rozmezí o 0,5 až 1,5 cyklů vyšším než je medián v 8 z 8 referenčních srovnání.
Potenciální klony identifikované MOA primárním testem se potvrdí nebo vyloučí v sekundárním testu, který zahrnuje následující kroky: (1) použití genomové DNA z každého pozitivního ES buněčného klonu, z většího počtu negativních klonů a z genomových standardů počtu kopií DNA od myší, které nesou jednu nebo dvě kopie LTVEC LacZ—Neo kazety na diploidní genom, jako templátů v 8 samostatných kvantitativních PCR na dvou 384-jamkových plotnách, ve kterých je jedna reakce upstream PCR (jako v primárním testu), jedna reakce je downstream PCR (jako v primárním testu), 4 reakce jsou referenční PCR se dvěma referenčními lokusy, které se liší od lokusů používaných v primárním testu, jedna reakce je PCR s primery a sondami, které jsou specifické pro LacZ gen LTVEC, a jedna reakce je PCR s primery a sondami, které jsou specifické pro Neo gen LTVEC; (2) provedení PCR v kvantitativním PCR přístroji, stejně jako v primárních testech; (3) vypočtení, jako v primárním testu, hodnot CT mezi upstream PCR a každou ze dvou referenčních PCR, mezi downstream PCR a každou ze dvou referenčních PCR, mezi LadZ PCR a každou ze dvou referenčních PCR, a mezi Neo PCR a každou ze dvou referenčních PCR, za zisku 8 CT tabulek; (4) normalizaci hodnot CT na pozitivní hodnoty; (5) výpočet mediánu hodnoty pro každou CT tabulku; (6) vypočtení intervalů spolehlivosti jako v primárních testech; a (7) zanesení hodnot a jejich mediánů do grafu pro každou z osmi CT tabulek ve formě histogramů. Z prohlídky intervalů spolehlivosti a histogramů CT pro primární a sekundární testy jsou potenciální ES klony buď potvrzeny, nebo odmítnuty. Ve výhodném příkladu jsou hodnoty pro poten-20CZ 304856 B6 ciální klon v rozmezí o 0,5 až 1,5 cyklů vyšším než je medián ve 12 z 12 referenčních srovnání z kombinace primárního a sekundárního testu.
Pro skórování počtu kopií TVEC na diploidní genom v potvrzených, správně cíleně modifikovaných ES klonech, se jejich hodnoty CT ze srovnání LacZ a Neo PCR se dvěma referenčními PCr srovnávaly s hodnotami CT pro standardy LacZ-Neo počet kopií. Každému ES klonu se přiřadilo skóre 1, 2 nebo více než 2 podle počtu kopií LTVEC. Pro každou modifikovanou alelu se ES buněčné klony testovaly ve skupinách po 96 (obvykle celkově méně než 288 klonů) do té doby, než se identifikovaly 3 klony, které měly pozitivní skóre v MOA testu a měly jedinou kopii LacZ-Neo kazety.
Příklad 4: Použití FISH pro identifikování správně cílených LTVEC v ES buňkách
Za použití LTVEC technologie podle předkládaného vynálezu vynálezci vyřadili SM22alfagen v ES buňkách. SM22alfa je protein omezený na buňky hladkého svalu velikosti 22-kDa, který se íyzikálně asociuje s cytoskeletálními vlákny aktinu v kontraktilních buňkách hladkého svalu. Cíleně modifikované ES buňky se zpracovaly standardní fluorescenční hybridizací in šitu (FISH) na nátěru chromosomů v metafázi pro ověření toho, že gen byl správně upraven. Pokus se provedl se dvěma sondami:
1) sondou pro SM22alfa gen, která se skládala z nemodifikovaného SM22alfa BAC klonu použitého pro generování LTVEC a 2) LacZ a Neomycin DNA sondou, která detekuje pouze modifikaci genu způsobenou cílenou modifikací (insercí LacZ a Neo genových kazet). Z buněk se připravil nátěr chromosomů v metafázi a provedla se simultánní hybridizace s oběma sondami, které byly značeny různě barevnými fluorofory, aby byla umožněna detekce hybridizace každou sondou ve stejném nátěru. Cíleně nemodifikovaná ES buněčná linie se analyzovala paralelně jako kontrola. Jak se předpokládalo, v kontrolních nátěrech se detekovaly dvě alely SM22alfa na homologních chromosomálních ramenech, ale nebyla patrná hybridizace LacZ-Neosondy. Jako u kontrol se v nátěrech cíleně modifikovaných ES buněk také detekovaly dvě alely ve stejné chromosomální pozici na homologních chromosomech, ale dvojité značení s LacZ-Neo sondou bylo patrné na jednom ze dvou chromosomů, což ukazuje na kolokalizaci SM22alfa a LacZ-Neo DNA sekvencí v této alele SM22alfa. Významné je to, že žádné SM22alfa nebo LacZNeo genové sekvence nebyly detekovány v nátěrech v nevhodných lokalizacích. Chybění extra-integrace SM22alfa genových sekvencí a ko-lokalizace LacZ-Neo s SM22alfa v jednom chromosomů homologního páru silně ukazuje na to, že proběhlo správné zacílení LacZ-Neo na jednu z SM22alfa alel pomocí homologní rekombinace.
Příklad 5: Snížení množství DNA použité pro elektroporaci ES buněk zlepšuje účinnost cílené modifikace
Standardní metody pro cílenou modifikaci genů v myších embryonálních kmenových (ES) buňkách typicky využívá v procesu elektroporace 20 až 40 g specificky cíleného vektoru. Vynálezci objevily, že při použití LTVEC elektroporace s mnohem nižšími množstvími DNA - rozmezí od přibližně 1 do 5 g na 1 χ 107 buněk - zdvojuje frekvenci správně provedené homologní rekombinace za současného snížení počtu sekundárních, nehomologních insercí. Toto jasné zlepšení v účinnosti cílené modifikace je významné proto, že významně redukuje počet ES buněčných klonů, které je nutné testovat pro nalezení několika pozitivních klonů se správně cílenou modifikací v jedné kopii. Asociovanými výhodami jsou redukované náklady a vyšší výtěžnost.
-21 CZ 304856 B6
Příklad 6: použití způsobu podle předkládaného vynálezu pro přípravu MA61 knock-outovaných myší pro studium svalové atrofie
MA61, též označovaná jako MAFbx, je nedávno objevená ubiquitin ligasa, jejíž exprese se zvyšuje při svalových atrofiích. Pro další studium biologického významu tohoto genu při svalové atrofii se za použití metod svrchu popsaných připravily následujícím způsobem knock-outované myši.
Nejprve se pro získání velkého klonovaného genomového fragmentu obsahujícího MA61 gen a bakteriální artificiální chromosomální (BAC) knihovna testovala s primery odvozenými od MA61 cDNA sekvence. Takto získaný BAC klon se potom použil pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro eukaryotické buňky (LTVEC). Připravila se modifikační kazeta obsahující 5' homologní box/lacZ gen/polyA/PGK promotor/neo/polyA/3' homologní box. Homologní boxy se připojily na označená místa bakteriální homologní rekombinace během přípravy LTVEC. LacZ je reporterový gen, který je umístěn tak, že jeho iniciační kodon je ve stejné pozici jako iniciační kodon MA61. Po homologní rekombinací v bakterii se modifikační kazeta nahradila MA61 genem. Tak se vytvořily MA61 LTVEC, ve kterých byly MA61 kódující sekvence v BAC klonu nahrazeny modifikační kazetou upravenou způsobem popsaných výše. Potom se připravila LTVEC DNA, ta se přečistila a linearizovala se pro vložení do eukaryotické buňky způsobem popsaným dále.
Připravil se MA61 LTVEC DNA miniprep (Sambrook, J., E. F. Fitsch a T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1, 2 a 3, 1989; Trillett aNeilan, Biotechniques, 24: 568 až 570, 572, 1998; http://www.qiagen.eom/literature/handbooks/plkmi n i/pim_ 399.pdf) a re-transformoval se do E. coli za použití elektroporace (Sambrook, I., E. F. Fritsch a T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1, 2 a 3, 1989) pro eliminaci plasmidu kódujícího rekombinogenní proteiny, které jsou používány pro krok bakteriální homologní rekombinace (Zhang a kol., Nat Genet, 20: 123 až 128, 1998; Narayanan a kol., Gene Ther, 6: 422 až 447, 1999). Před vložením MA61 LTVEC do eukaryotické buňky se větší množství MA61 LTVEC připravilo za použití standardních postupů (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdf; Sambrook, J., E. F. Fritsch a T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1, 2 a 3, 1989; Tillett aNeflan, Biotechniques, 24: 568 až 570, 572, 1998).
Potom se pro přípravu MA61 LTVEC pro vložení do eukaryotické buňky MA61 LTVEC linearizoval. Toto se provedlo trávením restrikčním enzymem Notl, který ponechává DNA modifikovaného endogenního genu nebo chromosomálního lokusu obklopenou homologními rameny.
MA61 LTVEC se potom vložil do eukaryotické buňky za použití standardních metod elektroporace (Sambrook, J., E. F. Fritsch a T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1, 2 a 3, 1989)). Buňky, do kterých byl MA61 LTVEC úspěšně vložen, se selektovaly expozicí selekčnímu činidlu. Protože selektovatelným markérem použitým v modifikační kazetě byl gen neomycin - fosfotransferasy (nec) gen (Beck a kol., Gene, 19: 327 až 336, 1982), byly buňky, které vychytaly MA61 LTVEC, selektovány v médiu obsahující G418; buňky neobsahující MA61 LTVEC umíraly, zatímco buňky obsahující MA61 LTVEC přežívaly (Santerre a kol., Gene, 30: 147 až 156, 1984).
Eukaryotické buňky, které byly úspěšně modifikovány cíleným vložením MA61 LTVEC do MA61 lokusu, se identifikovaly kvantitativní PCR TaqMan® (Lie a Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43 až 48, 1998).
Nakonec se geneticky modifikované ES buňky použily pro přípravu geneticky modifikovaných, v tomto případě knock-outovaných, myší, za použití standardní techniky injikování do blasto-22CZ 304856 B6 cysty. Takto připravené myši byly MA61 knock-outované, tj. myši, ve kterých byl MA61 gen deletován.
Jak tyto knock-outované, tak normální (WT) myši, byly vystaveny podmínkám indukujícím atrofii, které byly vytvořeny denervováním myší, a potom se srovnávala úroveň atrofie. Nejprve se izoloval sedací nerv v oblasti středního stehna pravé přední tlapky a tento nerv se přetnul. Přerušení sedacího nervu vedlo kdenervaci a během 14-dnů k atrofii svalů dolní končetiny, konkrétně musculus tibialis anterior a m. gastrocnemius. V den 7 a 14 po denervaci se zvířata utratila pomocí inhalace oxidu uhličitého. Potom se odebral přední tibiální komplex (TA) a gastronemický komplex (GA) z pravé/denervované) a levé (intaktní) přední tlapky, provedlo se zvážení vzorků a vzorky se zmrazily při fixní délce v kapalném dusíku chlazeném isopentanem. Úroveň svalové atrofie se hodnotila srovnáním hmotnosti svalů z denervované končetiny s hmotností svalů z nedenervované končetiny.
Svalová atrofie se hodnotila 7. a 14. den po přetnutí pravého sedacího nervu. Surová hmotnost pravého, denervovaného svalu se srovnávala se surovou hmotností levého, nedenervovaného svalu. Srovnání levé a pravé tlapky je uvedeno v tabulce 2.
dnů Gastroknemický komplex Tibialis anterior
| Genotyp | VeBkost vzorku | Průměr | SE | VeBkost vzorku | Průměr | SE |
| WT | 7 | 0,76 | 0,016 | 11 | 0,68 | 0,033 |
| KO | 6 | 0,84 | 0,022 | 11 | 0,80 | 0,15 |
| 14 dnů | Gastroknemický komplex | Tibialis anterior | ||||
| Genotyp | VeBkost vzorku | Průměr | SE | Velikost vzorku | Průměr | SE |
| WT | 5 | 0,55 | 0,24 | 5 | 0,62 | 0,023 |
| KO | 5 | 0,80 | 0,019 | 5 | 0,80 | 0,012 |
V 7 a 14 dnech vykazovaly svaly od knock-outovaných myší významně (p<0,001) menší svalovou atrofii než svaly od normálních myší. Rozdíl mezi knock-outovanými a normálními myšmi byl větší ve 14 dnech než v 7 dnech. U normálních myší pokračovala atrofie mezi 7 a 14 dnem, zatímco u knock-outovaných myší nikoliv.
Závěrem, vytvoření LTVEC ajejich přímé použití jako specifických vektorů v kombinaci s MOA skríningem pro události homologní rekombinace v ES buňkách tvoří novou metodu pro upravení geneticky modifikovaných lokusů, kde tato metoda je rychlá, levná a představuje významné zlepšení proti únavným, časově náročným metodám používaným dříve. Tento způsob otevírá možnost rychlé rozsáhlé funkční genomové analýzy in vivo v podstatě pro všechny geny v organismu genomu ve zlomku doby nutné pro předešlé metody.
Ačkoliv byl uvedený vynález popsán na určitých konkrétních provedeních, bude odborníkům v oboru jasné, že existují změny a modifikace způsobu podle předkládaného vynálezu, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je vymezen připojenými patentovými nároky.
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob pro modifikování endogenního genu nebo vybraného chromosomálního lokusu v non-lidské eukaryotické buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje:a) použití bakteriální homologní rekombinace pro modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru (LTVEC);b) použití LTVEC pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu velkým klonovaným genomovým fragmentem za vytvoření modifikované alely; ac) detekování modifikované alely.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje:- získání velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, obsahujícího požadovanou DNA sekvenci;- použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v eukaryotických buňkách (LTVEC);- vložení LTVEC do eukaryotických buněk pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a- detekování modifikace alely (MOA) v eukaryotických buňkách pro identifikování těch eukaryotických buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že velký klonovaný genomový fragment obsahuje DNA sekvenci, která je homologní k vybranému endogennímu genu nebo chromosomálnímu lokusu.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že DNA sekvencí je humanizovaná DNA sekvence.
- 5. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že LTVEC nahrazuje endogenní gen nebo chromosomální lokus s velkým klonovaným genomovým fragmentem.
- 6. Způsob podle jakéhokoli z nároků laž4, vyznačující se tím, že modifikace endogenního genu nebo chromosomálního lokusu zahrnuje deleci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; alteraci kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; inserci nové kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku; vytvoření podmíněné alely; nebo nahrazení kódující sekvence nebo genového segmentu z jednoho druhu homologní nebo ortologní kódující sekvencí ze stejného nebo jiného druhu.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že alterace kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku zahrnuje substituci, adici nebo fúzi.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že fuze zahrnuje epitopovou koncovku nebo bifunkční protein.-24CZ 304856 B6
- 9. Způsob podle jakéhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje použití kvantitativního testu pro detekování modifikované alely.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že kvantitativní test zahrnuje kvantitativní PCR, FISH, komparativní genomovou hybridizací, isotermní DNA amplifikací nebo kvantitativní hybridizací na imobilizovanou sondu.
- 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že kvantitativní PCR zahrnuje použití Molecular Beacon sond.
- 12. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že eukaryotickou buňkou je non-lidská savčí embryonální kmenová buňka.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že embryonální kmenová buňka je myší, krysí nebo jiná hlodavčí embryonální kmenová buňka.
- 14. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že endogenním genem nebo chromosomálním lokusem je non-lidský savčí gen nebo chromosomální lokus.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že endogenním genem nebo chromosomálním lokusem je myší, krysí nebo jiný hlodavčí gen nebo chromosomální lokus.
- 16. Způsob podle nároku 2, pro genetické modifikování vybraného endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v myší embryonální kmenové buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje:- získání velkého klonovaného genomového fragmentu, většího než 20 kb, který obsahuje požadovanou DNA sekvenci, kde velký klonovaný DNA fragment je homologní s endogenním genem nebo chromosomálním lokusem;- použití bakteriální homologní rekombinace pro genetické modifikování velkého klonovaného genomového fragmentu pro vytvoření velkého specificky cíleného vektoru pro použití v myších embryonálních kmenových buňkách, kde genetickou modifikací je delece kódující sekvence, genového segmentu nebo regulačního prvku;- vložení velkého specificky cíleného vektoru do myší embryonální kmenové buňky pro modifikování endogenního genu nebo chromosomálního lokusu v buňkách; a- použití kvantitativního testu pro detekování modifikace alely (MOA) v myší embryonální kmenové buňce pro identifikování těch myších embryonálních kmenových buněk, ve kterých byl endogenní gen nebo chromosomální lokus geneticky modifikován, kde kvantitativním testem je kvantitativní PCR.
- 17. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že LTVEC je schopen upravovat velké DNA fragmenty, větší než 100 kb.
- 18. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že LTVEC má homologní ramena, kterájsou větší než 20 kb.-25CZ 304856 B6
- 19. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že LTVEC má homologní ramena, která jsou non-isogenní s non-lidskými eukaryotickými buňkami, které mají být modifikovány.
- 20. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, želaž 5 pg velkého specificky cíleného vektoru (c) je vloženo do přibližně 1 x 107 buněk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24466500P | 2000-10-31 | 2000-10-31 | |
| US09/732,234 US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2000-12-07 | Methods of modifying eukaryotic cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031197A3 CZ20031197A3 (cs) | 2003-11-12 |
| CZ304856B6 true CZ304856B6 (cs) | 2014-12-10 |
Family
ID=26936709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-1197A CZ304856B6 (cs) | 2000-10-31 | 2001-10-31 | Způsob pro modifikování endogenního nebo chromosomálního lokusu |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6586251B2 (cs) |
| EP (1) | EP1399575B1 (cs) |
| JP (7) | JP5339566B2 (cs) |
| KR (1) | KR100833136B1 (cs) |
| CN (1) | CN100497642C (cs) |
| AT (1) | ATE332388T1 (cs) |
| AU (2) | AU2004802A (cs) |
| BR (1) | BRPI0115096B1 (cs) |
| CA (1) | CA2426398C (cs) |
| CZ (1) | CZ304856B6 (cs) |
| DE (1) | DE60121372T2 (cs) |
| HU (1) | HU227639B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03003797A (cs) |
| NO (1) | NO332300B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ525511A (cs) |
| PL (1) | PL204759B1 (cs) |
| RU (1) | RU2290441C2 (cs) |
| WO (1) | WO2002036789A2 (cs) |
Families Citing this family (214)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6908744B1 (en) * | 2000-03-14 | 2005-06-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of stimulating cartilage formation |
| AU8337701A (en) * | 2000-08-14 | 2002-02-25 | Us Health | Enhanced homologous recombination mediated by lambda recombination proteins |
| US6586251B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
| US7763466B2 (en) | 2002-05-17 | 2010-07-27 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| ES2442615T5 (es) | 2002-07-18 | 2023-03-16 | Merus Nv | Producción recombinante de mezclas de anticuerpos |
| AU2003278790A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-29 | California Institute Of Technology | Methods and compositions for the generation of humanized mice |
| WO2004067725A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying modulators of nmur2-mediated activity |
| US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| EP2395016A3 (en) | 2003-05-30 | 2012-12-19 | Merus B.V. | Design and use of paired variable regions of specific binding molecules |
| DK2767161T3 (en) | 2004-10-19 | 2018-05-07 | Regeneron Pharma | Method of generating an animal homozygous for genetic modification |
| US20060117396A1 (en) * | 2004-11-30 | 2006-06-01 | Murphy Andrew J | Assay methods for identifying modulators of OPSDL3 and transgenic knockouts |
| MY166021A (en) | 2007-03-22 | 2018-05-21 | Biogen Ma Inc | Binding proteins,including antibodies,antibody derivatives and antibody fragments,that specifically bind cd154 and uses thereof |
| PL2152880T3 (pl) | 2007-06-01 | 2012-03-30 | Omt Inc | Kompozycje i sposoby hamowania endogennych genów immunoglobuliny i wytwarzania transgenicznych ludzkich idiotypowych przeciwciał |
| AU2008335178A1 (en) * | 2007-12-10 | 2009-06-18 | Ablexis Llc | Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination |
| AU2009238629C1 (en) * | 2008-04-14 | 2015-04-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
| US20090328240A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-31 | Sing George L | Genetically modified mice as predictors of immune response |
| DE102008002715A1 (de) * | 2008-06-27 | 2009-12-31 | Evonik Röhm Gmbh | 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle |
| WO2010039900A2 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Aliva Biopharmaceuticals, Inc. | Non-human mammals for the production of chimeric antibodies |
| EP4014729B1 (en) | 2009-07-08 | 2024-08-07 | Kymab Limited | Rodent models and therapeutic antibodies |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| EP3056082B1 (en) | 2009-10-06 | 2018-09-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice and engraftment |
| CN106191126B (zh) | 2009-10-29 | 2020-04-14 | 瑞泽恩制药公司 | 多功能等位基因 |
| PL2509409T3 (pl) | 2009-12-10 | 2017-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Myszy wytwarzające przeciwciała ciężkołańcuchowe |
| CN102762590B (zh) | 2009-12-21 | 2015-11-25 | 瑞泽恩制药公司 | 人源化的FcγR小鼠 |
| MX350983B (es) | 2010-02-08 | 2017-09-27 | Regeneron Pharma | Raton de cadena ligera comun. |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| US20120021409A1 (en) | 2010-02-08 | 2012-01-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common Light Chain Mouse |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| AU2011234988B2 (en) | 2010-03-31 | 2014-10-30 | Ablexis, Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
| WO2011159847A2 (en) | 2010-06-15 | 2011-12-22 | The Regents Of The University Of California | Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof |
| KR101934852B1 (ko) | 2010-06-22 | 2019-01-04 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 하이브리드 경쇄 마우스 |
| US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| WO2012018610A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Trianni, Inc. | Transgenic animals and methods of use |
| CN103154255B (zh) | 2010-08-02 | 2016-04-06 | 瑞泽恩制药公司 | 制造包含vl结构域的结合蛋白的小鼠 |
| WO2012063048A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Kymab Limited | Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination |
| US9217040B2 (en) | 2011-01-14 | 2015-12-22 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic antibodies against ROR-1 protein and methods for use of same |
| SG10201601067WA (en) | 2011-02-15 | 2016-03-30 | Regeneron Pharma | Humanized m-csf mice |
| PL2550363T3 (pl) | 2011-02-25 | 2015-05-29 | Regeneron Pharma | Myszy adam6 |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| EP2527842B1 (en) | 2011-05-12 | 2013-06-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Neuropeptide release assay for sodium channels |
| AU2012294624B2 (en) | 2011-08-05 | 2015-08-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized universal light chain mice |
| EP3741862A1 (en) | 2011-09-19 | 2020-11-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies |
| CN103945689B (zh) | 2011-09-19 | 2016-10-19 | 科马布有限公司 | 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 |
| WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| HUE057680T2 (hu) | 2011-10-17 | 2022-06-28 | Regeneron Pharma | Korlátozott immunglobulin-nehézlánccal rendelkezõ egerek |
| PT3590332T (pt) | 2011-10-28 | 2022-05-27 | Regeneron Pharma | Ratinhos geneticamente modificados que expressam moléculas quiméricas de complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ii |
| GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
| SMT201700576T1 (it) | 2011-10-28 | 2018-01-11 | Regeneron Pharma | Topi con complesso maggiore di istocompatibilità geneticamente modificati |
| KR102148387B1 (ko) | 2011-10-28 | 2020-08-26 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 유전자 변형된 ｔ 세포 수용체 마우스 |
| US9043996B2 (en) | 2011-10-28 | 2015-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
| US9591835B2 (en) | 2011-10-28 | 2017-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
| WO2013066735A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Nano-suspension process |
| GB201122047D0 (en) | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| BR112014015238B1 (pt) | 2011-12-20 | 2022-11-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método ex vivo para preparar um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse compreendendo identificar sequências de ácido nucleico a partir de linfócitos b de camundongo geneticamente modificado pela colocação de um gene adam6 |
| HUE055610T2 (hu) | 2012-02-01 | 2021-12-28 | Regeneron Pharma | VL doméneket tartalmazó nehézláncokat expresszáló, humanizált rágcsálók |
| MX353278B (es) | 2012-03-06 | 2018-01-05 | Regeneron Pharma | Raton con cadena ligera comun. |
| CN107840890A (zh) | 2012-03-16 | 2018-03-27 | 瑞泽恩制药公司 | 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物 |
| CA2865644A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics |
| US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
| SG11201405171WA (en) | 2012-03-16 | 2014-10-30 | Regeneron Pharma | Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| WO2013144567A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies |
| MX362523B (es) | 2012-04-25 | 2019-01-22 | Regeneron Pharma | Direccion transmitida por nucleasa con vectores de direccion grandes. |
| KR102381716B1 (ko) | 2012-06-12 | 2022-04-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물 |
| AR091482A1 (es) * | 2012-06-21 | 2015-02-04 | Recombinetics Inc | Celulas modificadas geneticamente y metodos par su obtencion |
| AR092219A1 (es) | 2012-08-23 | 2015-04-08 | Seattle Genetics Inc | Conjugados anticuerpo-farmaco (adc) que se unen a proteinas 158p1d7 |
| EP2888283B1 (en) | 2012-08-24 | 2018-09-19 | The Regents of The University of California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
| UA118090C2 (uk) * | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
| AU2013312359B8 (en) | 2012-09-07 | 2019-08-15 | Institute For Research In Biomedicine (Irb) | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
| DK3939423T3 (da) | 2012-11-05 | 2024-05-06 | Regeneron Pharma | Genetisk modificerede ikke-humane dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| PL2958938T3 (pl) | 2013-02-20 | 2019-11-29 | Regeneron Pharma | Myszy eksprymujące humanizowane ko-receptory komórek t |
| ES2904803T3 (es) | 2013-02-20 | 2022-04-06 | Regeneron Pharma | Modificación genética de ratas |
| EP2840892B1 (en) | 2013-02-20 | 2018-04-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
| US20150342163A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
| US10154658B2 (en) | 2013-02-22 | 2018-12-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
| EP2967015B9 (en) | 2013-03-11 | 2023-08-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transgenic mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) class ii molecules |
| AU2014249150B2 (en) | 2013-03-11 | 2020-04-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transgenic mice expressing chimeric major histocompatibility complex (MHC) class I molecules |
| PL3501272T3 (pl) | 2013-03-13 | 2023-07-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mysz eksprymująca ograniczony repertuar lekkiego łańcucha immunoglobuliny |
| HK1218550A1 (zh) | 2013-03-13 | 2017-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | 常見輕鏈小鼠 |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| HUE056903T2 (hu) * | 2013-04-16 | 2022-04-28 | Regeneron Pharma | Patkány genom célzott módosítása |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| HK1225621A1 (zh) | 2013-08-01 | 2017-09-15 | Agensys, Inc. | 结合cd37蛋白的抗体药物偶联物(adc) |
| BR112016002385A2 (pt) | 2013-08-07 | 2017-09-12 | Harvard College | animal não humano, célula, tecido ou embrião, vetor de alvejamento, constructo de vetor de alvejamento, e, métodos para produzir um animal não humano e para modificar um lócus de incrna em uma célula pluripotente |
| PL3046412T3 (pl) | 2013-09-18 | 2019-11-29 | Regeneron Pharma | Przekształcone histydyną łańcuchy lekkie przeciwciał i genetycznie zmodyfikowane zwierzęta inne niż człowiek do ich wytwarzania |
| RS64573B1 (sr) | 2013-09-23 | 2023-10-31 | Regeneron Pharma | Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom |
| CN105683365A (zh) | 2013-10-01 | 2016-06-15 | 科马布有限公司 | 动物模型及治疗分子 |
| SG10201900003WA (en) | 2013-11-19 | 2019-02-27 | Regeneron Pharma | Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene |
| KR102173297B1 (ko) | 2013-11-19 | 2020-11-03 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화된 증식-유도 리간드 유전자를 가지고 있는 비-인간 동물 |
| SMT201800653T1 (it) | 2013-12-11 | 2019-01-11 | Regeneron Pharma | Metodi e composizioni per la modificazione indirizzata a bersaglio di un genoma |
| MX388127B (es) | 2013-12-11 | 2025-03-19 | Regeneron Pharma | Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma. |
| WO2015108102A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 国立大学法人 群馬大学 | Ａｔｐ可視化動物およびその用途 |
| TWI681969B (zh) * | 2014-01-23 | 2020-01-11 | 美商再生元醫藥公司 | 針對ｐｄ-１的人類抗體 |
| SG11201607015VA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS |
| SG11201607203XA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals that make single domain binding proteins |
| PT3482629T (pt) | 2014-05-19 | 2021-02-18 | Univ Yale | Animais não humanos geneticamente modificados que expressam epo humana |
| AU2015266841C1 (en) | 2014-05-30 | 2018-06-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized dipeptidyl peptidase IV (DPP4) animals |
| ES3019688T3 (en) | 2014-06-06 | 2025-05-21 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for modifying a targeted locus |
| CA2951278A1 (en) | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene |
| ES2666179T3 (es) | 2014-06-23 | 2018-05-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Montaje de ADN mediado por nucleasas |
| ES2901074T3 (es) | 2014-06-26 | 2022-03-21 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso |
| AU2015317370A1 (en) | 2014-09-19 | 2017-03-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric antigen receptors |
| BR112017007770A2 (pt) | 2014-10-15 | 2018-01-16 | Regeneron Pharma | cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc. |
| SG11201703747RA (en) | 2014-11-21 | 2017-06-29 | Regeneron Pharma | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED GENETIC MODIFICATION USING PAIRED GUIDE RNAs |
| MX2017006802A (es) | 2014-11-24 | 2018-01-30 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que expresan el complejo cd3 humanizado. |
| WO2016089692A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene |
| BR112017011982A2 (pt) | 2014-12-09 | 2018-01-16 | Regeneron Pharma | roedor, polipeptídeo pd-l1, célula ou tecido isolado de roedor, célula-tronco embrionária de roedor, embrião de roedor, e, métodos para produção de um roedor, para reduzir o crescimento do tumor em um roedor, para matar células tumorais em um roedor, para avaliar as propriedades farmacocinéticas de um fármaco e para avaliar a eficácia de um fármaco. |
| EP3232774B1 (en) * | 2014-12-19 | 2019-10-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
| ES2884844T3 (es) | 2015-03-09 | 2021-12-13 | Agensys Inc | Conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que se unen a proteínas FLT3 |
| AU2016233250C1 (en) | 2015-03-16 | 2022-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception |
| JP2018508224A (ja) | 2015-03-19 | 2018-03-29 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物 |
| EP4248744A3 (en) | 2015-04-06 | 2023-12-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals |
| RU2730599C2 (ru) | 2015-04-13 | 2020-08-24 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Гуманизированные мыши с нокином sirpa-il15 и способы их использования |
| US10787517B2 (en) | 2015-05-18 | 2020-09-29 | Agensys, Inc. | Antibodies that bind to AXL proteins |
| WO2016187354A1 (en) | 2015-05-18 | 2016-11-24 | Agensys, Inc. | Antibodies that bind to axl proteins |
| US10395759B2 (en) | 2015-05-18 | 2019-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for copy number variant detection |
| ES3009538T3 (en) | 2015-05-29 | 2025-03-27 | Regeneron Pharma | Rodent cells having a disruption in a c9orf72 locus |
| WO2017040738A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of prostate cancer |
| TW202417497A (zh) | 2015-10-12 | 2024-05-01 | 美商再生元醫藥公司 | 活化瘦素受體的抗原結合蛋白 |
| DK3376857T3 (da) | 2015-11-20 | 2021-05-25 | Regeneron Pharma | Ikke-humane dyr, der har et humaniseret lymfocyt-aktiveringsgen 3 |
| AU2016360763B2 (en) * | 2015-11-24 | 2020-11-05 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Stable cell lines for retroviral production |
| DE102016122317A1 (de) * | 2015-11-24 | 2017-05-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Transientes transfektionsverfahren für retrovirale produktion |
| EP3384030A4 (en) | 2015-12-03 | 2019-07-03 | Trianni, Inc. | IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY |
| KR20230006929A (ko) | 2016-01-13 | 2023-01-11 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류 |
| US20170218398A1 (en) * | 2016-01-30 | 2017-08-03 | Markus Alexander Brown | Method to selectively target cancerous cells for genetic manipulation |
| JP6843872B2 (ja) | 2016-02-04 | 2021-03-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 操作されたａｎｇｐｔｌ８遺伝子を有する非ヒト動物 |
| AU2017213633B2 (en) | 2016-02-04 | 2023-08-03 | Trianni, Inc. | Enhanced production of immunoglobulins |
| CN109074426B (zh) | 2016-02-12 | 2022-07-26 | 瑞泽恩制药公司 | 用于检测异常核型的方法和系统 |
| US20170247436A1 (en) | 2016-02-16 | 2017-08-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a mutant kynureninase gene |
| SG10202001578RA (en) | 2016-02-29 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Rodents having a humanized tmprss gene |
| EP3437001A1 (en) | 2016-03-29 | 2019-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetic variant-phenotype analysis system and methods of use |
| KR102356542B1 (ko) | 2016-05-20 | 2022-01-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 다중 가이드 RNAs를 이용한 면역학적 내성 파괴 방법 |
| US10980221B2 (en) | 2016-06-03 | 2021-04-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase |
| WO2018005519A2 (en) | 2016-06-27 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Cancer treatment combinations |
| DK3476865T5 (da) | 2016-06-28 | 2024-09-09 | Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd | Fremgangsmåde til konstruktion af pd-1-gen-modificeret humaniseret dyremodel og anvendelse deraf |
| CN109803530A (zh) | 2016-07-29 | 2019-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠 |
| KR102294755B1 (ko) | 2016-09-30 | 2021-08-31 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | C9orf72 유전자좌에서 헥사뉴클레오티드 반복 확장을 갖는 비인간 동물 |
| DK3407709T3 (da) | 2016-11-04 | 2020-08-31 | Regeneron Pharma | Ikke-humane dyr med et manipuleret immunoglobulin lambda-letkædelocus |
| AU2018210420B2 (en) | 2017-01-19 | 2024-08-01 | Omniab Operations, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
| JP2020508073A (ja) | 2017-02-27 | 2020-03-19 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 網膜分離症の非ヒト動物モデル |
| WO2019028023A2 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVALUATING CRISPR / CAS MEDIATED DISRUPTION OR EXCISION AND CRISPR / CAS INDUCED RECOMBINATION USING IN VIVO EXOGENIC DONOR NUCLEIC ACID |
| ES3033963T3 (en) | 2017-07-31 | 2025-08-11 | Regeneron Pharma | Method of testing the ability of a crispr/cas9 nuclease to modify a target genomic locus in vivo, by making use of a cas-transgenic mouse or rat which comprises a cas9 expression cassette in its genome |
| CA3071712C (en) | 2017-09-29 | 2023-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus and methods of use |
| WO2019067706A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | NON-HUMAN ANIMALS EXPRESSING A HUMANIZED C1Q COMPLEX |
| CN109666701B (zh) * | 2017-10-13 | 2021-08-24 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| WO2019072241A1 (en) * | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC |
| CN116064611A (zh) | 2017-11-30 | 2023-05-05 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化trkb基因座的非人动物 |
| SMT202200448T1 (it) | 2017-12-05 | 2023-01-13 | Regeneron Pharma | Topi aventi una catena leggera lambda di immunoglobuline ingegnerizzata e loro usi |
| EP3592140A1 (en) | 2018-03-19 | 2020-01-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| CN112105260B (zh) | 2018-03-26 | 2023-04-28 | 瑞泽恩制药公司 | 用于测试治疗剂的人源化啮齿动物 |
| LT3773713T (lt) | 2018-04-06 | 2025-08-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Leptino receptoriaus agonistinis antikūnas, skirtas kaulų masės didinimui subjektui, kuriam pasireiškia medžiagų apykaitos sutrikimas arba hipoleptinemija |
| SG11202011778QA (en) | 2018-06-01 | 2020-12-30 | Regeneron Pharma | Methods and systems for sparse vector-based matrix transformations |
| IL318469A (en) | 2018-06-14 | 2025-03-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses |
| FI3823443T3 (fi) | 2018-07-16 | 2024-07-25 | Regeneron Pharma | Ditra-taudin jyrsijämallit ja niiden käyttö |
| CN109504708A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-03-22 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法 |
| CN116064550A (zh) | 2018-12-20 | 2023-05-05 | 瑞泽恩制药公司 | 核酸酶介导的重复扩增 |
| US20220104468A1 (en) | 2019-01-22 | 2022-04-07 | St. Jude Children's Research Hospital | Modulation of lc3-associated endocytosis pathway and genetically modified non-human animals as a model of neuroinflammation and neurodegeneration |
| WO2020169022A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus |
| EP3927153A1 (en) | 2019-02-22 | 2021-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof |
| EP3772929B1 (en) | 2019-04-04 | 2023-11-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
| US11111504B2 (en) | 2019-04-04 | 2021-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
| US11136353B2 (en) | 2019-04-15 | 2021-10-05 | Qwixel Therapeutics Llc | Fusion protein composition(s) comprising masked type I interferons (IFNA and IFNB) for use in the treatment of cancer and methods thereof |
| KR20220016869A (ko) | 2019-06-04 | 2022-02-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 베타-슬립 돌연변이를 갖는 인간화 ttr 좌위를 포함하는 비-인간 동물 및 사용 방법 |
| EP3979790A1 (en) | 2019-06-05 | 2022-04-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof |
| SG11202111256XA (en) | 2019-06-07 | 2021-11-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals comprising a humanized albumin locus |
| US20200404890A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modeling tdp-43 proteinopathy |
| HUE069680T2 (hu) | 2019-07-01 | 2025-04-28 | Tonix Pharma Ltd | Anti-CD154 antitestek és felhasználásuk |
| AU2020357550A1 (en) | 2019-10-04 | 2022-05-05 | Tae Life Sciences, Llc | Antibody compositions comprising Fc mutations and site-specific conjugation properties |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| KR20220133248A (ko) | 2020-01-28 | 2022-10-04 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 pnpla3 좌위를 포함하는 비-인간 동물 및 사용 방법 |
| EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
| WO2021195079A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| IL297315A (en) | 2020-04-21 | 2022-12-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals that have a human cxcl13 gene |
| JP2023529846A (ja) | 2020-06-02 | 2023-07-12 | バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド | 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物 |
| RU2751237C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-07-12 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| WO2021261620A1 (ko) | 2020-06-25 | 2021-12-30 | 주식회사 휴맵 | 이형접합성 형질전환 동물 |
| KR20230066386A (ko) | 2020-09-11 | 2023-05-15 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 항원 특이적 항체의 확인 및 제조 |
| CA3191836A1 (en) | 2020-10-01 | 2022-04-07 | Andrew J. Murphy | Rodent animals expressing human cr1 |
| US12012441B2 (en) | 2020-10-26 | 2024-06-18 | Neptune Biosciences Llc | Engineered human IL-21 cytokines and methods for using the same |
| JP2024500399A (ja) | 2020-12-16 | 2024-01-09 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化Ｆｃアルファ受容体を発現するマウス |
| IL303724A (en) | 2020-12-21 | 2023-08-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals with a humanized TSLP gene, a humanized TSLP receptor gene, and/or a humanized IL7RA gene |
| KR20230125236A (ko) | 2020-12-23 | 2023-08-29 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 앵커 변형된 항체를 암호화하는 핵산 및 이의 사용 |
| CN116963750A (zh) | 2021-01-06 | 2023-10-27 | 通尼克斯制药有限公司 | 用经修饰的抗-cd154抗体诱导免疫耐受的方法 |
| AU2022249328A1 (en) | 2021-03-31 | 2023-09-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice comprising humanized cellular immune system components with improved diversity of tcrβ repertoire |
| EP4324848A4 (en) | 2021-04-16 | 2025-09-10 | Univ Korea Res & Bus Found | HUMAN ANTIBODY TARGETING THE COVID-19 VIRUS |
| WO2022265679A2 (en) | 2021-06-18 | 2022-12-22 | Nammi Therapeutics, Inc. | FUSION PROTEIN COMPOSITION(S) COMPRISING MASKED TYPE I INTERFERONS (IFNα AND IFNβ) FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER AND METHODS THEREOF |
| US20240415980A1 (en) | 2021-10-28 | 2024-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5 |
| KR20240117571A (ko) | 2021-12-08 | 2024-08-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도 |
| US20250049006A1 (en) | 2021-12-20 | 2025-02-13 | C/O Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
| US20250194571A1 (en) | 2022-02-07 | 2025-06-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
| CN118613498A (zh) | 2022-02-11 | 2024-09-06 | 瑞泽恩制药公司 | 用于筛选4R Tau靶向剂的组合物和方法 |
| WO2023212560A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
| WO2023235677A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animal model of tdp-43 proteinopathy |
| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| US20230417899A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Oshkosh Corporation | Position tracking for a lift device |
| US20240102045A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
| AU2023347224A1 (en) | 2022-09-22 | 2025-03-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice expressing components of human cellular immune system |
| US20240224964A9 (en) | 2022-09-29 | 2024-07-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
| WO2024163650A1 (en) | 2023-02-01 | 2024-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animals comprising a modified klhdc7b locus |
| WO2024258743A1 (en) | 2023-06-13 | 2024-12-19 | Adcentrx Therapeutics, Inc. | Methods and compositions related to antibodies and antibody drug conjugates (adcs) that bind nectin-4 proteins |
| WO2024259354A1 (en) | 2023-06-16 | 2024-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
| WO2025122669A1 (en) | 2023-12-05 | 2025-06-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized complement factor b gene |
| US20250255282A1 (en) | 2024-02-08 | 2025-08-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
| WO2025212991A1 (en) | 2024-04-05 | 2025-10-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent models of disease |
| WO2025235388A1 (en) | 2024-05-06 | 2025-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1994025585A1 (en) * | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| NZ255101A (en) * | 1992-07-24 | 1997-08-22 | Cell Genesys Inc | A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor |
| DE4228162C1 (de) * | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
| US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
| DK1151010T3 (da) * | 1999-02-05 | 2006-01-09 | Therapeutic Human Polyclonals | Humane polyklonale antistoffer fra antigene ikke-humane dyr |
| US6586251B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
-
2000
- 2000-12-07 US US09/732,234 patent/US6586251B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-31 AU AU2004802A patent/AU2004802A/xx active Pending
- 2001-10-31 RU RU2003116125/13A patent/RU2290441C2/ru active
- 2001-10-31 WO PCT/US2001/045375 patent/WO2002036789A2/en not_active Ceased
- 2001-10-31 JP JP2002539535A patent/JP5339566B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 DE DE60121372T patent/DE60121372T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 CZ CZ2003-1197A patent/CZ304856B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 NZ NZ525511A patent/NZ525511A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 AT AT01992495T patent/ATE332388T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 KR KR1020037005885A patent/KR100833136B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 CA CA2426398A patent/CA2426398C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 HU HU0301575A patent/HU227639B1/hu unknown
- 2001-10-31 MX MXPA03003797A patent/MXPA03003797A/es active IP Right Grant
- 2001-10-31 AU AU2002220048A patent/AU2002220048B2/en not_active Expired
- 2001-10-31 BR BRPI0115096A patent/BRPI0115096B1/pt active IP Right Grant
- 2001-10-31 PL PL361927A patent/PL204759B1/pl unknown
- 2001-10-31 EP EP01992495A patent/EP1399575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 CN CNB018216609A patent/CN100497642C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-04-28 NO NO20031897A patent/NO332300B1/no not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-06-15 JP JP2010136321A patent/JP2010220628A/ja active Pending
-
2013
- 2013-05-23 JP JP2013108631A patent/JP5892975B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-11-29 JP JP2013247817A patent/JP5945263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-12-26 JP JP2014265082A patent/JP2015062432A/ja not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-02-14 JP JP2017024802A patent/JP2017123855A/ja not_active Withdrawn
- 2017-02-14 JP JP2017024803A patent/JP6486979B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Angrand P.O. et al.: "Simplified generation of targeting constructs using ET recombination", Nucleic Acids Res., Vol. 27(17), page e 16, 1999 * |
| Xiangdong W. Yang et al.: "Homologous recombination based modification in Esherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromsome", Nature Biotechnology 15, 859-865, 1997 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ304856B6 (cs) | Způsob pro modifikování endogenního nebo chromosomálního lokusu | |
| US10344299B2 (en) | Compositions and methods for modifying cells | |
| EP3085779B2 (en) | Method of modifying eukaryotic cells | |
| AU2002220048A1 (en) | Methods of modifying eukaryotic cells | |
| HK1059802B (en) | Methods of modifying eukaryotic cells | |
| IL155580A (en) | Ex vivo method for modifying endogenous gene or chromosomal locus in eukaryotic cells | |
| HK1198260B (en) | Rodent capable of producing hybrid antibodies containing human variable regions and rodent constant regions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20211031 |