JP2014039567A - 真核生物細胞を改変する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、相同組換えを介して標的化し、任意の望ましい様式において、真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体遺伝子座を改変するための、大きなDNAベクターを設計し、利用するための方法である。本発明は、さらに、真核生物細胞を検出する迅速で簡便な方法を提供し、この方法において、真核生物細胞に対する大きな標的化ベクター(LTVEC)は、正しく標的化され、そして所望の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する。本発明はまた、遺伝的改変を有する生物、生物自体を生成するためのこれらの細胞の使用およびその使用の方法を含む。
【選択図】なし
Description
本発明の分野は、相同組換えを介して標的化し、任意の望ましい様式において、真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体遺伝子座を改変するための、大きなDNAベクターを設計し、利用するための方法である。真核生物細胞に対するこれらの大きなDNA標的ベクターは、LTVECと命名され、クローン化ゲノムDNAのフラグメントから誘導され、このDNAのフラグメントは、真核生物細胞において相同的に標的化を行うために意図される他のアプローチによって典型的に使用されるフラグメントより大きい。本発明の分野は、さらに、真核生物細胞を検出する迅速で簡便な方法を提供し、この方法において、LTVECは、正しく標的化され、そして所望の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する。本発明の分野はまた、遺伝的改変を有する生物、生物自体を生成するためのこれらの細胞の使用およびその使用の方法を含む。
LTVECの使用は、現行の方法を上回る実質的な利点を提供する。例えば、標的ベクターを生成するために従来使用されたDNAフラグメントよりも大きなDNAフラグメントから誘導されるため、LTVECは、大きなゲノムDNAフラグメントの利用可能なライブラリー(例えば、BACライブラリーおよびPACライブラリー)から、現行の技術を用いて作製した標的ベクターよりも迅速かつ簡便に生成し得る。それに加えて、より大きな改変およびより大きなゲノム領域にわたる改変は、従来の技術を用いるよりも、簡便に生成し得る。
相同な外因性DNAと内因性染色体配列との間の相同組換えを用いる標的遺伝子は、欠失、挿入を作製し、変異を設計し、遺伝子変異を補正し、導入遺伝子を導入し、またはマウスにおける他の遺伝的改変を行うために、非常に価値ある方法であることがわかっている。現行の方法は、内因性DNAに対する相同性領域が、典型的に10〜20kb未満となる状態で、標準的な標的ベクターを用い、マウス胚幹(ES)細胞へと所望の遺伝的改変を導入し、その後、改変されたES細胞を、マウスの胚へと注入し、マウスの生殖細胞系列へと設計された遺伝子改変を伝える工程を包含する(Smithiesら,Nature,317:230−234,1985;Thomasら,Cell,51:503−512,1987;Kollerら,Proc Natl Acad Sci USA,86:8927−8931,1989;Kuhnら,Science,254:707−710,1991;Thomasら,Nature,346:847−850,1990
;Schwartzbergら,Science,246:799−803,1989;Doetschmanら,Nature,330:576−578,1987;Thomsonら,Cell,5:313−321,1989;DeChiaraら,Nature,345:78−80,1990;GenPharm Internationalの出願人名の、米国特許第5,789,215号(1998年8月4日発行))。これらの現行の方法において、標準的な標的ベクターが、所望の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を正しく標的化され、改変された、まれなES細胞を検出することは、標的ベクター内に含まれる相同な標的配列以外の配列情報を必要とする。首尾よい標的化のためのアッセイは、標準的なサザンブロッティングまたは標的ベクター以外の配列および全体の相同性アームにわたる配列からの長鎖PCRを含み(Chengら,Nature,369:684−5,1994;FoordおよびRose,PCR Methods Appl,3:S149−61,1994;PonceおよびMicol,Nucleic Acids Res,20:623,1992;米国特許第5,436,149号(Takara Shuzo Co.,Ltd.に対して発行された))(定義を参照のこと);従って、これらの方法を限定する大きさの考慮のため、相同性アームの大きさは、全体で10〜20kb未満に限定される(Joyner,The Practical Approach Series,293,1999)。
迅速かつ簡便な方法論がなお必要とされている。
本発明に従って、本出願人は、改変した内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む真核生物細胞を作製し、スクリーニングするための、新規で、迅速で、合理化された、効率的な方法を開発した。この新規な方法は、初めて、以下を組み合わせる:
1.大きなクローン化ゲノムフラグメント内の所望の遺伝的改変を正確に設計するための細菌の相同組換えであって、これによって、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター(LTVEC)を作製すること;
2.これらのLTVECを真核生物細胞に直接導入し、これらの細胞における目的の内因性染色体遺伝子座を改変すること;および
3.まれな真核生物細胞を決定するための分析であって、ここで、標的対立遺伝子は、所望のように改変され、標的配列以外の配列情報を必要としない親の対立遺伝子の対立遺伝子の改変(MOA)のためのアッセイ(例えば、定量的PCR)を含むこと。
EclipseTMプローブ技術を使用する定量的PCRを含む、方法である。
エレメントの欠失である、工程;c)(b)の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、この細胞において内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する工程;およびd)定量アッセイを使用して、(c)のマウス胚性幹細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞を同定する工程であって、ここで、この定量アッセイは、定量PCRである、工程;e)(d)のマウス胚性幹細胞を、胚盤胞に導入する工程;ならびにf)(e)の胚盤胞を、妊娠のための代理母に導入する工程。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1) 真核生物細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変するための方法であって、以下:
a)目的のDNA配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター(LTVEC)を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程;
c)(b)の該LTVECを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;および
d)(c)の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程、
を包含する、方法。
(項目2) 項目1に記載の方法であって、DNA配列を含む、上記大きなクローン化遺伝子フラグメントが、目的の上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、方法。
(項目3) 項目1に記載の方法であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失;コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更;新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入;条件付き対立遺伝子の作製;あるいは1つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、方法。
(項目4) 項目3に記載の方法であって、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、方法。
(項目5) 項目4に記載の方法であって、上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、方法。
(項目6) 項目1に記載の方法であって、上記定量的アッセイが、定量的PCR、FISH、競合的ゲノムハイブリダイゼーション、等温DNA増幅、固定化したプローブもしくはInvader Probes(登録商標)に対する定量的ハイブリダイゼーション、またはMMPアッセイ(登録商標)を含む、方法。
(項目7) 上記定量的PCRが、TaqMan(登録商標)、Molecular
Beacon、またはEclipseTMプローブ技術を含む、項目6に記載の方法。
(項目8) 上記真核生物細胞が、哺乳動物の胚幹細胞である、項目1に記載の方法。
(項目9) 上記胚幹細胞が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の胚幹細胞である、項目8に記載の方法。
(項目10) 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、哺乳動物の遺伝子または
染色体遺伝子座である、項目1に記載の方法。
(項目11) 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、ヒトの遺伝子または染色体遺伝子座である、項目10に記載の方法。
(項目12) 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の遺伝子または染色体遺伝子座である、項目10に記載の方法。
(項目13) 上記LTVECが、20kbより大きなDNAフラグメントに適応し得る、項目1に記載の方法。
(項目14) 上記LTVECが、100kbより大きなDNAフラグメントに適応し得る、項目13に記載の方法。
(項目15) マウス胚幹細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する方法であって、以下:
a)目的のDNA配列を含む、20kbより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化DNAフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程;
c)(b)の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;ならびに
d)(c)の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的PCRである、工程、
を包含する、方法。
(項目16) 項目1または15のいずれか1項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
(項目17) 項目16に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失;コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更;新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入;条件付き対立遺伝子の作製;あるいは1つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
(項目18) コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目17に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
(項目19) 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目18に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
(項目20) 項目1に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された真核生物。
(項目21) 項目15に記載された方法によって産生された、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞。
(項目22) 項目20に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失;コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更;新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入;条件付き対立遺伝子の作製;あるいは1つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された真核生物細胞。
(項目23) コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目22に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞細胞。
(項目24) 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目23に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞。
(項目25) 項目1に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物。
(項目26) 項目15に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウス。
(項目27) 項目20、22、23、または24のいずれか1項に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞から産生された、非ヒト生物。
(項目28) 項目21に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞から産生された、マウス。
(項目29) 項目1に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された胚幹細胞。
(項目30) 項目29に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失;コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更;新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入;条件付き対立遺伝子の作製;あるいは1つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された胚幹細胞。
(項目31) コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目30に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞。
(項目32) 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目31に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞。
(項目33) 遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程:
a)目的のDNA配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクター(LTVEC)を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程;
c)(b)の該LTVECを該胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;
d)(c)の該胚幹細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程;
e)(d)の該胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程;ならびに
f)(e)の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
(項目34) 遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウスであって、該マウスは、以下の工程:
a)目的のDNA配列を含む、20kbより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化DNAフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程;
c)(b)の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因
性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;
d)(c)の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的PCRである、工程;
e)(d)の該マウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程;ならびに
f)(e)の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、マウス。
(項目35) 遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程:
a)目的のDNA配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター(LTVEC)を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程;
c)(b)の該LTVECを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;
d)(c)の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程;
e)(d)の該真核生物細胞から核を取り除く、工程;
f)(e)の該核を卵母細胞に導入する、工程;ならびに
g)(f)の該卵母細胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
(項目36) 遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程:
a)目的のDNA配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程;
b)(a)の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター(LTVEC)を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程;
c)(b)の該LTVECを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程;
d)(c)の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変(MOA)を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程;
e)(d)の該真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する、工程;ならびに
f)(e)の融合した該真核生物細胞を妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
(項目37) DNA配列を含む、上記大きなクローン化ゲノムフラグメントが、目的の上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、項目33、35、または36のいずれか1項に記載の非ヒト生物。
(項目38) 上記非ヒト生物が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類である、項目25、33、35、または36のいずれか1項に記載の非ヒト生物。
(項目39) 上記胚盤胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の胚盤胞である、項目33に記載の非ヒト生物。
(項目40) 上記卵母細胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の卵母細胞である、項目35に記載の非ヒト生物。
(項目41) 上記代理母が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類である、項目33、35、または36のいずれか1項に記載の非ヒト生物。
(項目42) 上記胚幹細胞が、哺乳動物の胚幹細胞である、項目33に記載の非ヒト生物。
(項目43) 上記哺乳動物の胚幹細胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の胚幹細胞である、項目42に記載の非ヒト生物。
(項目44) 項目33、35、または36のいずれか1項に記載の非ヒト生物であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失;コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更;新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入;条件付き対立遺伝子の作製;あるいは1つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、非ヒト生物。
(項目45) コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目44に記載の非ヒト生物。
(項目46) 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目45に記載の非ヒト生物。
(項目47) 項目33、35、または36のいずれか1項に記載の非ヒト生物であって、上記定量的アッセイが、定量的PCR、FISH、競合的ゲノムハイブリダイゼーション、等温DNA増幅、固定化したプローブもしくはInvader Probes(登録商標)に対する定量的ハイブリダイゼーション、またはMMPアッセイ(登録商標)を含む、非ヒト生物。
(項目48) 上記定量的PCRが、TaqMan(登録商標)、Molecular Beacon、またはEclipseTMプローブ技術を含む、項目47に記載の非ヒト生物。
(項目49) 非ヒト生物の産生のための、項目20に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞の使用。
(項目50) 上記マウスの産生のための、項目21に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞の使用。
(項目51) 非ヒト生物の産生のための、項目29に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞の使用。
(項目52) (c)の上記大きな標的ベクターの約1〜5μgが、約1×107細胞に導入される、項目1または15に記載の方法。
(項目53) (c)の上記大きな標的ベクターの約1〜5μgが、約1×107細胞に導入される、項目34に記載のマウス。
(項目54) (c)の上記大きな標的ベクターの約1〜5μgが、約1×107細胞に導入される、項目33、35、または36に記載の非ヒト生物。
「標的化ベクター」とは、所望の遺伝子的改変に隣接する内因性染色体核酸配列に「相同な」配列を含む、DNA構築物である。この隣接相同配列は、「相同性アーム」と称され、この相同アームと対応する内因性配列との間に存在する相同性を利用して、標的化ベクターを、ゲノム内の特定の染色体遺伝子座に指向し、そして所望の遺伝子改変を、「相同組換え」と称されるプロセスによって導入する。
マーカーを発現する稀なトランスフェクトされた細胞の単離を可能にする、選択マーカーである。このようなマーカーの遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、またはGFPのような蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本出願人らは、改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む真核生物細胞を作製およびスクリーニングするための、新規な、迅速な、能率的な、そして効率的な方法を開発した。これらの細胞において、改変は、遺伝子のノックアウト、ノックイン、点変異、または大きなゲノムの挿入もしくは欠失あるいは他の改変であり得る。非限定的な例として、これらの細胞は、変更され、欠失され、そして/または挿入された遺伝子の機能を決定する目的で、ノックアウト生物またはノックイン生物、および特に、ノックアウトマウスまたはノックインマウスを、作製するために有用な胚性幹細胞であり得る。
1.所望の遺伝子改変を、大きなクローニングされたゲノムDNAフラグメントにおいて正確に操作し、これによって、真核生物細胞において使用するための大きな標的化ベクター(LTVEC)を作製するための、細菌相同組換え;
2.これらのLTVECを真核生物細胞に直接導入して、これらの細胞において目的の対応する内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変すること;ならびに
3.標的された対立遺伝子が所望のように改変された、希少な真核生物細胞を決定する
ための分析であって、親対立遺伝子の対立遺伝子の改変(MOA)のための定量アッセイを包含する、分析。
1.先行技術を使用して作製される標的化ベクターより迅速に、かつ好都合に、標的化ベクターが、大きなゲノム挿入物を含む利用可能なライブラリー(例えば、BACライブラリーまたはPACライブラリー)から生成され、ここで、このゲノム挿入物は、使用の前に広範囲にわたって特徴付けられ、そして「トリミング」されなければならない(以下に詳細に説明される)。さらに、目的の遺伝子座についての最小の配列情報が知られる必要がある。すなわち、相同性ボックスを作製するため(以下に詳細に記載される)、およびMOAについての定量アッセイにおいて使用され得るプローブを作製するため(以下に詳細に記載される)に必要とされる、約80〜100ヌクレオチドを知ることのみが、必要である。
に費用効果的なアプローチにする。
本明細書中に記載される、DNAベクターを構築するために使用される技術の多くは、当業者に周知の標準的な分子生物学技術である(例えば、Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版、第1、2、および3巻、1989;Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編、Greene Publ.Assoc.,Wiley Interscience,NYを参照のこと)。全てのDNA配列決定は、ABI373A DNAシークエンサーおよびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、Inc.,Foster City,CA)を使用して、標準的な技術によってなされる。
ホモロジー(相同性)ボックスは、大きなクローン化ゲノムフラグメント(図1)からLTVECを産生するのに用いられる細菌相同組換えの部位をマークする。ホモロジーボックスはDNAの短いセグメント(一般に二重鎖で、長さが少なくとも40ヌクレオチド)であり、大きなクローン化ゲノムフラグメント内の、「改変される領域」に隣接する領域と相同である。このホモロジーボックスが改変カセットに付加され、その結果、細菌内での相同組換えに続いて、この改変カセットが、改変される領域を置き換える(図1)。細菌相同組換えを用いて標的化ベクターを作製する技術は、種々の系(Yangら、Nat Biotechnol,15:859−65,1997;Muyrersら、Nucleic Acids Res,27:1555−7,1999;Angrandら、Nucleic Acids Res,27:e16,1999;Narayananら、Gene Ther,6:442−7,1999;Yuら、Proc Natl Acad Sci USA,97:5978−83,2000)において行われ得る。現在用い
られる好ましい技術の一例は、ETクローニング(Zhangら、Nat Genet,20:123−8,1998;Narayananら、Gene Ther,6:442−7,1999)およびこの技術の変法(Yuら、Proc Natl Acad Sci USA,97:5978−83,2000)である。ETとは、相同組換え反応を行うrecEタンパク質(HallおよびKolodner、Proc Natl Acad Sci USA,91:3205−9,1994)およびrecTタンパク質(Kusanoら、Gene,138:17−25,1994)をいう。recEは直鎖状の二重鎖DNA(本質的に、以下で記述される、ドナーDNAフラグメント)のうち1本の鎖を5’→3’で切り取るエキソヌクレアーゼであり、従って、3’一本鎖オーバーハングを直鎖状の二重鎖フラグメントに残す。この一本鎖オーバーハングは、recTタンパク質によってコーティングされ、このrecTタンパク質は、一本鎖DNA(ssDNA)結合活性を有する(KovallおよびMatthews、Science,277:1824−7,1997)。ETクローニングは、recEおよびrecTのE.coli遺伝子産物を過渡的に発現するE.coli(HallおよびKolodner、Proc Natl Acad Sci USA,91:3205−9,1994;Clarkら、Cold Spring Harb Symp Quant Biol,49:453−62,1984;NoirotおよびKolodner、J Biol Chem,273:12274−80,1998;Thresherら、J Mol Biol,254:364−71,1995;Kolodnerら、Mol Microbiol,11:23−30,1994;Hallら、J Bacteriol,175:277−87,1993)およびバクテリオファージラムダ(λ)タンパク質λgam(Murphy,J Bacteriol,173:5808−21,1991;Poteeteら、J Bacteriol,170:2012−21,1988)を用いて行われる。このλgamタンパク質は、recBCエキソヌクレアーゼ系(MyersおよびStahl、Annu Rev Genet,28:49−70,1994)による分解からの、ドナーDNAフラグメントの保護に必要であり、そしてrecBC+宿主(例えば、頻繁に用いられるE.coli株DH10b)における効率的なETクローニングに必要である。
(a)コード配列、遺伝子セグメントまたは調節エレメントの欠失;
(b)置換、付加、および融合(例えば、エピトープタグまたは二機能性タンパク質(例えば、GFPを有するタンパク質)の作製)を含む、コード配列、遺伝子セグメントまたは調節エレメントの変化;
(c)新しいコード領域、遺伝子セグメントまたは調節エレメント(例えば、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子に対するもの)の挿入あるいは内因性転写制御下への新しい遺伝子の配置;
(d)条件的対立遺伝子の作製(例えば、Creリコンビナーゼ(AbremskiおよびHoess、J Biol Chem,259:1509−14,1984)によって切除される領域に隣接するloxP部位、または、Flpリコンビナーゼ(Andrewsら、Cell,40:795−803,1985;Meyer−Leonら、Cold Spring Harb Symp Quant Biol,49:797−804,1984;Cox,Proc Natl Acad Sci USA,80:4223−7,1983)によって切除される領域に隣接するFRT部位の導入による);あるいは
(e)ある種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、異なる種由来のオルソログ(orthologous)コード配列による置換(例えば、特定の遺伝子座が「ヒト化
」されたマウスを操作するための、マウスの遺伝子座の、オルソログヒト遺伝子座による置換)。
(工程3(任意).各LTVECが正しく操作されたことを検証する。)
以下により、各LTVECが正しく操作されたことを検証する:
a.目的の遺伝子または染色体座へのドナーフラグメントの導入によって作製された新規の接合を検証するための、診断的PCR。従って、得られるPCRフラグメントは、目的の遺伝子または染色体座へのドナーフラグメントの導入によって作製された新規の接合部をさらに検証するために配列決定され得る。
(a.LTVEC DNAの調製:)
選択されたLTVECのミニプレップDNAの調製(Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1巻,2巻,および3巻,1989;TillettおよびNeilan、Biotechniques,24:568−70,572,1998;http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf)および、エレクトロポレーションを用いる、ミニプレップLTVEC DNAのE.coliへの再形質転換(Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1巻,2巻,および3巻,1989)。この工程は、細菌相同組換えの工程に利用される遺伝子組換えタンパク質をコードするプラスミドを除去するために必要である(Zhangら、Nat Genet,20:123−8,1998;Narayananら、Gene Ther,6:442−7,1999)。このプラスミドの除去は、(a)このプラスミドが高コピー数プラスミドであり、大規模LTVECプレップにおいて得られる収率を減少させ得るので;(b)遺伝子組換えタンパク質の発現を誘導する可能性を排除するために;そして(c)このプラスミドがこのLTVECの物理的マッピングを不明瞭化し得るので、有用である。真核生物細胞へのこのLTVECの導入の前に、標準的方法論(http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdf;Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis.Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,第2版,第1巻,2巻,および3巻,1989;TillettおよびNeilan、Biotechniques,24:568−70,572,1998)によって、より大量のLTVEC DNAが調製される。しかし、この工程は、遺伝子組換えプロファージを利用する細菌相同組換えの方法が用いられる場合(すなわち、遺伝子組換えタンパク質をコードする遺伝子が、細菌染色体へと組み込まれる細菌相同組換えの方法(Yuら、Proc Natl Acad Sci USA
,97:5978−83,2000)が用いられる場合)、回避され得る。
真核生物細胞への導入のためのLTVECを調製するために、このLTVECは、長いホモロジーアーム(homology arm)に隣接する改変された内因性遺伝子または染色体座DNAを残す様式で、好ましくは直鎖化される。これは、希にのみ消化する、任意の適切な制限酵素を用いて、好ましくはベクター骨格において、このLTVECを直鎖化することによって達成され得る。適切な制限酵素の例としては、NotI、PacI、SfiI、SrfI、SwaI、FseIなどが挙げられる。制限酵素の選択は、実験的に(すなわち、いくつかの異なる候補の希なカッター(rare cutter)を試験することによって)決定され得るか、または、このLTVECの配列が公知である場合、この配列を分析し、そしてこの分析に基づいて適切な制限酵素の選択することによって決定され得る。このLTVECが希な部位(例えば、CosN部位)を含むベクター骨格を有する状況において、このLTVECは、このような部位を認識する酵素(例えば、λターミナーゼ(Shizuyaら、Proc Natl Acad Sci USA,89:8794−7,1992;BeckerおよびGold,Proc Natl Acad Sci USA,75:4199−203,1978;Rackwitzら、Gene,40:259−66,1985))によって切断され得る。
LTVEC DNAは、標準的方法論(例えば、リン酸カルシウム、脂質によって媒介されるトランスフェクトまたはエレクトロポレーション(Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1巻,2巻,および3巻,1989))を用いて、真核生物細胞に導入され得る。このLTVECが首尾よく導入された細胞は、このLTVECへ操作された選択可能なマーカー遺伝子に依存して、選択薬剤に対する曝露によって選択され得る。非限定的な例として、この選択可能なマーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオ)遺伝子(Beckら、Gene,19:327−36,1982)である場合、このLTVECを取り込んだ細胞は、G418含有培地において選択され得る;このLTVECを有さない細胞は死滅するが、このLTVECを取り込んだ細胞は生存する(Santerreら、Gene,30:147−56,1984)。他の適切な選択可能なマーカーとしては、真核生物細胞において活性を有する任意の薬物(Joyner,The Practical Approach Series,293,1999)(例えば、ハイグロマイシンB(Santerreら、Gene,30:147−56,1984;Bernardら、Exp Cell Res,158:237−43,1985;GiordanoおよびMcAllister、Gene,88:285−8,1990)、ブラスチシジンS(Blasticidin S)(Izumiら、Exp Cell Res,197:229−33,1991))、および、当業者に公知の他の薬物が挙げられる。
このLTVECを目的の遺伝子座に標的化することによって首尾よく改変された真核生物細胞は、目的の遺伝子座内における対立遺伝子の改変を検出し得、そしてホモロジーアームにわたるアッセイに依存しない、種々のアプローチを用いて同定され得る。このようなアプローチとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない:
(a)TaqMan(登録商標)を用いる定量的PCR(LieおよびPetropoulos、Curr Opin Biotechnol,9:43−8,1998);
(b)分子ビーコンを用いる定量的MOAアッセイ(Tanら、Chemistry,
6:1107−11,2000)
(c)蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISH(Laanら、Hum Genet,96:275−80,1995)または比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)(Forozanら、Trends Genet,13:405−9,1997;ThompsonおよびGray、J Cell Biochem Suppl,139−43,1993;HouldsworthおよびChaganti、Am J Pathol,145:1253−60,1994);
(d)等温DNA増幅(Lizardiら、Nat Genet,19:225−32,1998;MitraおよびChurch、Nucleic Acids Res,27:e34,1999);
(e)固定プローブへの定量的ハイブリダイゼーション(Southern,J.Mol.Biol.98:503,1975;Kafatos FC;Jones CW;Efstratiadis A,Nucleic Acids Res 7(6):1541−52,1979);
(f)Invader Probes(登録商標)(Third Wave Technologies);
(g)EclipseTMおよび分子ビーコンプローブ(Synthetic Genetics);ならびに
(h)MMPアッセイ(High Throughput Genomics)
本出願人らは、本明細書中において、TaqMan(登録商標)定量的PCRを用いて、首尾よく標的化された真核生物細胞についてスクリーニングをする例を提供する。この非限定的な例において、TaqMan(登録商標)は、二倍体ゲノムにおいて、2つの内因性対立遺伝子のうちの1つの一部が、別の配列によって置き換えられた相同組換えを起こしている、真核生物細胞を同定するために用いられる。ホモロジーアーム全体にわたる制限フラグメントの長さの差異が、2つの対立遺伝子のうちの1つの改変を示す従来の方法とは対照的に、この定量的TaqMan(登録商標)法は、未改変の対立遺伝子のコピー数の減少(半分まで)の測定によって、1つの対立遺伝子の改変を検出する。特に、このプローブは、未改変の対立遺伝子を検出し、そして改変された対立遺伝子を検出しない。従って、本方法は改変の厳密な性質から独立しており、そして本実施例に記述される配列置換に限定されない。TaqManは、ゲノムDNAサンプル中のDNAテンプレートのコピー数を、特に参照遺伝子(LieおよびPetropoulos、Curr Opin Biotechnol,9:43−8,1998)に対する比較によって、数量化するために用いられる。この参照遺伝子は、同一のゲノムDNAにおいて、標的遺伝子または遺伝子座として定量化される。従って、(各々がそれぞれのプローブを用いる)2つのTaqMan(登録商標)増幅が行われる。一方のTaqMan(登録商標)プローブは参照遺伝子の「Ct」(許容限界サイクル)を決定するが、他方のプローブは、首尾よい標的化によって置き換えられる標的化遺伝子または遺伝子座の領域のCtを決定する。このCtは、各TaqMan(登録商標)プローブに対する開始DNAの量を反映する量である(すなわち、配列の量がより少なくなれば、許容限界サイクルに達するまでに、より多くのPCRのサイクルを必要とする)。TaqMan(登録商標)反応に対する、テンプレート配列のコピー数の半分までの減少は、約1Ct単位の増加を生じる。標的遺伝子または標的遺伝子座の1つの対立遺伝子が相同組換えによって置き換えられた細胞における、TaqMan(登録商標)反応は、非標的化細胞由来のDNAと比較した場合、参照遺伝子に対するCtの増加を伴わない標的TaqMan(登録商標)反応について、1Ctの増加を生じる。このことにより、LTVECを用いる真核生物細胞における目的の遺伝子の1つの対立遺伝子の改変の検出が可能となる。
なる2つの系統の交配に起因する子孫の場合と同様に、多型を含み得る。さらに、MOAスクリーニングによっても網羅される、ある特殊な状況は、通常は細胞において単一のコピーとして存在する遺伝子(例えば、性染色体、および、特にY染色体に位置するいくつか)の標的化である。この場合、単一の標的化対立遺伝子の改変を検出する方法(例えば、定量的PCR、サザンブロットなど)を、標的化事象を検出するために用い得る。本発明の方法は、対立遺伝子が多型である場合でさえ、または対立遺伝子が標的化細胞内の単一コピー中に存在する場合でさえ、改変された真核生物細胞を作製するために用いられ得ることが明らかである。
(a)工程1〜7で記述された方法によって作製された、遺伝的に改変された真核生物細胞は、この細胞の表現型を変化させることが望ましいインビトロまたはインビボでの任意のアッセイにおいて用いられ得る。
1.改変された胚幹(ES)細胞(例えば、頻繁に用いられるラットおよびマウスのES細胞)。ES細胞は、標準的な胚盤胞注入技術または凝集技術(Robertson,Practical Approach Series,254,1987;Woodら、Nature,365:87−9,1993;Joyner,The Practical Approach Series,293,1999)、四倍体胚盤胞注入(Wangら、Mech Dev,62:137−45,1997)、あるいは核移入およびクローニング(Wakayamaら、Proc Natl Acad Sci USA,96:14984−9,1999)によって、遺伝的に改変されたラットまたはマウスを作製するために用いられ得る。他の生物体(例えば、ウサギ(Wangら、Mech Dev,62:137−45,1997;Schoonjansら、Mol Reprod Dev,45:439−43,1996)またはニワトリ(Painら、Development,122:2339−48,1996)または他の種)に由来するES細胞もまた、本発明の方法を用いる遺伝的な改変に受け入れられるべきである。
生するためのこのような細胞の使用(Kuroiwaら、Nat Biotechnol,18:1086−1090,2000)。
(実施例1:OCR10遺伝子の欠失を有するマウスES細胞の操作)
(a.mOCR10遺伝子を含む大きいゲノムDNAクローンの選択)
マウスOCR10(mOCR10)遺伝子のコード配列を含む大きいゲノムDNAフラグメントを保持する細菌人工染色体(BAC)クローンを、PCRを使用して、整列されたマウスゲノムDNAのBACライブラリー(Incyte Genomics)をスクリーニングすることによって獲得した。このライブラリーをスクリーニングするために使用したプライマーは、mOCR10遺伝子のcDNA配列に由来した。
(a)OCR10.RAA(5’−AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG−3’)およびOCR10.PVIrc(5’−CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAAGATGACG−3’)、これらは、102bpのDNAを増幅する;ならびに
(b)OCR10.TDY(5’−GACCTCACTTGCTACACTGACTAC−3’)およびOCR10.QETrc(5’−ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG−3’)、これらは、1500bpのDNAを増幅する。
mOCR10 LTVECの構築において使用される改変カセットは、lacZ−SV40ポリA−PGKp−EM7−neo−PGKポリAカセットであり、ここでlacZは、上記のようなマーカー遺伝子であり、SV40ポリAは、シミアンウイルス40由来のフラグメントであり(Subramanianら、Prog Nucleic Acid Res Mol Biol、19:157−64、1976;Thimmappayaら、J Biol Chem、253:1613−8、1978;Dharら、Proc Natl Acad Sci U S A、71:371−5、1974;Reddyら、Science,200:494−502、1978)、そしてポリアデニル化部位およびシグナルを含み(Subramanianら、Prog Nucleic Acid Res Mol Biol、19:157−64、1976;Thimmappayaら、J Biol Chem、253:1613−8、1978;Dharら、Proc Natl Acad Sci U S A、71:371−5、1974;Reddyら、Science,200:494−502、1978)、PGKpは、マウスホスホグリセレリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターであり(Adraら、Gene、60:65−74、1987)(これは、哺乳動物細胞における薬物耐性遺伝子の発現を駆動するために広く使用されてきた)、EM7は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子の発現を駆動することによって、細菌中の、完成したLTVEC構築物のポジティブ選択を可能にする利点を有する、強力な細菌プロモーターであり、neoは、原核生物細胞におけるカナマイシン耐性および真核生物細胞におけるG418耐性を付与する選択マーカーであり(Beckら、Gene、19:327−36、1982)、そしてPGKポリAは、PGK遺伝子由来の3’非翻訳領域であり、ポリアデニル化部位およびシグナルを含む(Boerら、Biochem Genet、28:299−308、1990)。
換えを使用して標的化ベクターを作製するための先行技術のアプローチは、ES細胞への導入の前に、大きい標的化ベクターが「トリミング」される必要がある(Hillら、Genomics、64:111−3、2000)。先行技術のアプローチによって利用されるスクリーニング方法に対応するために、十分短い相同性アームを作製することが必要なので、このトリミングは必要とされる。Hillらの方法の1つの主要な欠点は、2つのさらなる相同組換え工程が、単にトリミングのために必要とされることである(1つの工程は、改変された遺伝子座の上流領域をトリミングし、1つの工程は、改変された遺伝子座の下流領域をトリミングする)。これを行うために、実質的により多くの配列情報(トリミング部位にわたる配列情報を含む)が必要である。
挿入カセットおよび相同性配列の連結部の周辺の配列を、DNA配列決定によって確認した。mOCR10 LTVECのサイズを、制限分析、その後のパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)によって確認した(Cantorら、Annu Rev Biophys Chem、17:287−304、1988;SchwartzおよびCantor、Cell、37:67−75、1984)。mOCR10 LTVECの標準的なラージスケールのプラスミド調製を行って、プラスミドDNAを制限酵素NotI(これは、mOCR10 LTVECのベクター骨格を切断する)で消化して、直線状DNAを作製した。続いて、直線化されたDNAを、エレクトロポレーションによって、マウスES細胞に導入した(Robertson、Practical Approach Series、254、1987;Joyner、The Practical Approach Series、293、1999;Sambrookら、Sambrook,J.、E.F.FritschおよびT.Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第二版、1巻、2巻および3巻、1989)。mOCR10 LTVECで首尾よくトランスフェクトされたES細胞を、標準的な選択方法を使用して、G418含有培地中で選択した(Robertson、Practical Approach Series、254、1987;Joyner、The Practical Approach Series、293、1999)。
2つの内因性mOCR10遺伝子のうち1つが改変カセット配列によって置換されたES細胞を同定するため、個々のES細胞クローン由来のDNAを、標準的なTaqMan
(登録商標)方法論を、記載されたように使用する定量的PCRによって分析した(Applied Biosystems、TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix、カタログ番号P/N4304437;http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04304449.pdfもまた参照のこと)。使用したプライマーおよびTaqMan(登録商標)プローブは、図3A〜3Dに記載の通りである。合計69個の個々のES細胞クローンをスクリーニングし、そして3個のクローンが陽性として、すなわち、内因性mOCR10コード配列の1つが、上記の改変カセットによって置換されたクローンとして、同定された。
(i)改変されている遺伝子座の外側のプローブの使用を必要としない。従って、改変された遺伝子座に隣接する配列を知る必要を排除する。
上記のように、長い相同性アームを使用して得られた増大した標的化頻度は、存在する場合、LTVECを構築する際の、標的化される真核生物細胞のDNAと同質遺伝子の(すなわち、このDNAの配列と同一の)ゲノムDNAを使用することに由来する利点を低減するはずである。この仮説を試験するため、本出願人は、標的化されるべき真核生物細胞と同じマウス亜系に由来するゲノムDNA(おそらく同質遺伝子)を使用して、いくつかのLTVECを、そして標的化されるべき真核生物細胞と異なるマウス亜系に由来するゲノムDNA(おそらく非同質遺伝子)を使用して、多数の他のLTVECを構築した。この非同質遺伝子LTVECは、6%(1〜20%の範囲、表1)の平均標的化頻度を示
し、一方、同質遺伝子LTVECは、3%(2〜5%の範囲)の平均標的化頻度を示した。このことは、LTVECを使用した首尾よい標的化の割合が、遺伝子同質性に依存しないことを示す。
LTVECを取り、相同組換えによって標的化遺伝子座のゲノム中にLTVECを組み込んだES細胞クローンは、標的ES細胞クローン(ここで、2つの標的化対立遺伝子の1つが改変される)と非標的ES細胞クローン(ここで、両方の対立遺伝子は、改変されないままである)との間の差異を区別するためのリアルタイム定量的PCRを使用する、
対立遺伝子の改変(MOA)アッセイによって同定される。MOAアッセイは、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなる。一次スクリーニングは、以下の工程を包含する:(1)ゼラチンコーティングした96ウェルプレート上での、LTVECでトランスフェクトしたES細胞クローンの増殖;(2)各ES細胞クローンからのゲノムDNAの単離;(3)2つの384ウェルプレート上での8回の別々の定量的PCRにおける鋳型としての各ゲノムDNAサンプルの使用であって、ここで、2回のPCRは、欠失について標的化されたゲノムフラグメントの1つの末端のDNA配列にハイブリダイズする標的−遺伝子座特異的プライマーセットを使用し(「上流PCR」)、2回のPCRは、欠失について標的化されたゲノムフラグメントの他の末端のDNA配列にハイブリダイズする標的−遺伝子座特異的プライマーセットを使用し(「下流PCR」)、4回のPCRは、4つの非標的参照遺伝子座を認識するプライマーセットを使用し(「参照PCR」)、そして各PCRは、蛍光プローブ(例えば、TaqMan(登録商標)[ABI]、EclipseTM、またはMoleculr Beaconプローブ[Synthetic Genetics])(これは、増幅配列を認識し、そしてその蛍光シグナルがPCR産物の量に直接比例する)を含む;(4)サーモサイクラーを蛍光検出器と組み合わせるデバイス(例えば、ABI7900HT)(これは、PCRの間に増幅産物の蓄積を定量し、そして閾値サイクル(CT)(蛍光シグナルがバックグラウンドノイズを超えて検出可能であるPCRにおける地点)を決定する)中で、PCRを実行する工程;(5)各ES細胞クローンDNAサンプルについて、上流PCRと4つの参照PCRの各々との間で、そして下流PCRと4つの参照PCRの各々との間で、CT値における差異(ΔCT)を計算して96個のΔCT値の8つの表を作製する工程;(6)ΔCT値を正の値に対して正規化する工程;(7)各標的−参照比較表についてのメジアンΔCT値の計算;(8)8つのΔCT表を調査し、メジアンΔCTよりも0.5〜1.5、0.25〜1.5、0.5〜2.0、0.25〜2.0、0.5〜3.0および0.25〜3.0サイクル大きい許容範囲内でΔCT値を生じる、所定のES細胞クローンDNAサンプルを数回計算するコンピュータプログラムの使用による信頼スコアの決定(このようなプログラムを作製または書き込むのに適したコンピュータプログラミング言語の例としては、ビジュアルベーシック、Java(登録商標)、または当業者によく知られた任意の他のコンピュータプログラミング言語が挙げられる);(9)ヒストグラムとして8つのΔCT表の各々についての値およびそれらのメジアンをプロットする工程;ならびに(10)信頼スコアおよびΔCTヒストグラムの検査からの正確に標的化されたES細胞クローン候補の同定。好ましい例において、候補標的化クローンについてのΔCT値は、8つの参照比較のうちの8つにおいてのメジアンよりも0.5〜1.5サイクル大きい範囲である。
の間で、ΔCT値を計算して、8つのΔCT表を作製する工程;(4)ΔCT値を正の値に正規化する工程;(5)各ΔCT表についてのメジアンの計算;(6)一次スクリーニングにおけるような信頼スコアの計算;ならびに(7)ヒストグラムとして8つのΔCT表の各々についての値およびそれらのメジアンをプロットする工程。
本明細書中に記載されるLTVEC技術を使用して、出願人らは、ES細胞中のSM22α遺伝子をノックアウトした。SM22αは、22kDaの平滑筋細胞(SMC)系統に限定されたタンパク質であり、これは、収縮性SMCにおいて細胞骨格アクチンフィラメント束と物理的に会合する。次いで、標的化ES細胞を、遺伝子が適切に標的化されたことを確認するために、中期染色体スプレッド上で標準的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)に供した。実験を以下の2つのプローブで実施した:1)LTVECを生成するために使用される未改変のSM22α BACクローンからなるSM22α遺伝子プローブ、および2)標的化事象(LacZおよびNeo遺伝子カセットの挿入)によって行なわれる遺伝子改変のみを検出するLacZおよびネオマイシンDNAプローブ。中期染色体スプレッドを、細胞から調製し、そしてハイブリダイゼーションを両方のプローブを用いて同時に実施した。これらのプローブは、異なる色のフルオロフォアで標識され、同じスプレッド中の各プローブのハイブリダイゼーションの検出を可能にする。非標的化ES細胞株を、コントロールとして並行して分析した。予期されるように、コントロールスプレッドにおいて、SM22αの2つの対立遺伝子が、相同な染色体アーム上で検出されたが、LacZ−Neoプローブのハイブリダイゼーションは存在しなかった。コントロールにおけるように、標的化ES細胞スプレッドにおいて、2つの対立遺伝子がまた、同じ染色体遺伝子座および相同な染色体において検出されたが、LacZ−Neoプローブでの二重標識は、2つの染色体中の1つで明らかであり、SM22αの対立遺伝子におけるSM22αおよびLacZ−Neo DNA配列の同時局在を示す。重要なことに、スプレッド中の不適切な遺伝子座において、SM22αの遺伝子配列もLacZ−Neoの遺伝子配列も検出されなかった。SM22α遺伝子配列の余分な組み込みの欠如、および1つの染色体の相同な対におけるLacZ−NeoのSM22αとの同時局在は、相同組換えを介するLacZ−Neoの、SM22α対立遺伝子の1つに対する正確な標的化が生じたことを強力に示唆する。
マウス胚性幹(ES)細胞における遺伝子の標的化改変のための標準的な方法は、代表
的に、エレクトロポレーション手順において20〜40μgの標的化ベクターを利用する。出願人らは、LTVECを用いて、はるかに低量のDNA(1×107細胞当り約1〜5μgの範囲)でのエレクトロポレーションは、正確に標的化された相同組換え事象の頻度を2倍にするが、二次的な非相同性挿入事象の数を非常に減少させることを発見した。標的化効率におけるこの明らかな改善は、重要である。なぜなら、これは、正確に標的化された単一コピーの改変を有するいくつかのポジティブクローンを見出するためにスクリーニングされる必要のあるESクローン細胞数を有意に減少させるためである。関連した利益は、減少した費用および増加したスループットである。
MA61(MAFbxとも呼ばれる)は、筋萎縮症の種々の状態においてアップレギュレートされる、近年発見されたユビキチンリガーゼである(米国仮出願番号60/264,926(2001年1月30日出願)、米国仮出願番号60/311,697(2001年8月10日出願)、および米国仮出願(番号はまだ知られていない)(2001年10月22日出願)(これらは全て、Regeneron,Pharmaceuticals,Inc.に割り当てられ、これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと)。筋萎縮症におけるこの遺伝子の生物学的重要性をさらに研究するために、以下の通りに本発明の方法を使用して、ノックアウトマウスを作製した。
Targeting Vector for Eukaryotic Cells(LTVEC)を作製した。5’相同性ボックス/lacZ遺伝子/ポリA/PGKプロモーター/neo/ポリA/3’相同性ボックスを含む改変カセットを設計した。相同性ボックスを、LTVECの生成の間に細菌の相同組換えの部位を標識するために付加した。LacZは、その開始コドンが、MA61の開始コドンと同じ位置に存在するように配置されたレポーター遺伝子である。細菌における相同組換え後、改変カセットは、MA61遺伝子を置換した。このようにして、MA61 LTVECを作製し、ここで、BACクローンにおけるMA61コード配列は、上記のように設計された改変カセットによって置換された。次いで、LTVEC DNAを調製し、精製し、そして以下に記載されるように、真核生物細胞への導入のために直鎖状にした。
ow.pdf; Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版、第1、2、および3巻、1989;TillettおよびNeilan,Biotechniques,24:568−70,572,1998)。
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