JPH08504564A - 内生の選択しうる残余配列を有しない遺伝子のターゲティング置換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非ヒト哺乳動物の生殖系列中の遺伝子または遺伝子断片を他の哺乳動物の相同遺伝子または相同遺伝子断片で置換するための方法が開示される。この方法は、以下の工程からなる：（i）選択的にマーキングした組換えビヒクルで胚性幹細胞株をトランスフェクションする；（ii）安定にトランスフェクションされた細胞クローンをマーカー遺伝子の存在に基づいて選択する；（iii）これらをＰＣＲおよび／またはサザーンブロットによりターゲティング選択する；（iv）これらを非ヒト哺乳動物の胞胚中に注入する；ついで（v）これら胞胚を代理母に移す。この方法は、選択的にマーキングした組換えビヒクルにより、組換えの間に内生遺伝子または内生遺伝子断片が相同遺伝子または相同遺伝子断片により単一の工程で機能的に置換されることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 内生の選択しうる残余配列を有しない遺伝子のターゲティング置換 本発明は、相同的組換えによる、非ヒト哺乳動物の生殖系列における哺乳動物 からの相同な遺伝子断片の置換方法に関する。 本発明はまた、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法、並びに遺伝子 産物の発現のためのおよび薬物および治療モデルの試験のためのその使用に関す る。 加えて、相同的組換えのための組換えビヒクル、安定にトランスフェクション された細胞クローンおよびトランスジェニック非ヒト哺乳動物が開示される。 染色体中に存在するＤＮＡ配列と新たな付加されクローニングされたＤＮＡ配 列との間の相同的組換え（以下、遺伝子ターゲティングと呼ぶ）により、生きた 細胞のゲノム中へクローニングされた遺伝子を挿入することが可能になる。所望 の変異についてホモ接合である動物は、胚生殖細胞を用いキメラを経て該方法で 得ることができる（カペッチ（M．R．Capecchi）、Science、２４４、１２８８ （１９８９））。遺伝子を不活化するための（遺伝子破壊）および遺伝子修正の ための遺伝子ターゲティングの使用（すなわち以前は存在していなかった遺伝子 断片の挿入）は、カメリニーオテロ（R．D．Camerini−Otero）、クッチェルラ パチ（R．Kucherlapati）、The New Biologist、２（４）、３３４〜３４１（１ ９９０）に記載されている。 ＷＯ９０／１１３５４およびＷＯ９１／１９７９６に記載されている、所望の 遺伝子断片を相同的組換えにより細胞のゲノム中に導入する挿入法も、遺伝子修 正法に含まれる。後者の方法において、依然として機能性の内生遺伝子が第二工 程において除去され、かくして内生遺伝子断片が相同遺伝子断片と置換される。 さらに、ＷＯ９１／１９７９６には実質的に１工程の方法、すなわちコトランス フェクションが開示されており、その際、導入しようとする遺伝子断片中には耐 性マーカーは位置していないが別に導入される。しかしながら、この文献に引用 された実施例では、ごくわずかに変化させた相同遺伝子断片（最大２×２塩基の 変異）が導入されているにすぎず、相同性の低下につれて選択しうる組換え事象 がどの程度までなお確立しうるかについて問題を投げかけている（２工程法の組 換え頻度が限られていると仮定して）。 この文献ではまた、胚性幹細胞で生じた変異が細胞株へ移行されるか否かにつ いても示されていない。 さらに、ラジュースキー（K．Rajewsky）（Science、２５６、４８３（１９９ ２））は、たとえば新たに発見された遺伝子の機能を同定するため、遺伝子置換 のために相同的組換えを使用することを示唆している。 この意味で、本発明の課題は、他の哺乳動物からの相同遺伝子断片を含有する 遺伝子工学的に作製した非ヒト哺乳動物を相同的組換えにより１工程で直接首尾 よく製造するための方法を利用できるようにすることにあった。 哺乳動物の生殖系列中の個々の遺伝子断片を他の種の遺伝子断片で１工程にて ターゲティング置換することを可能にする方法が本出願人によって見いだされた 。 それゆえ、本発明は、非ヒト哺乳動物の生殖系列中の遺伝子または遺伝子断片 を他の哺乳動物の相同遺伝子または相同遺伝子断片で置換する方法に関するもの であり、その際、 （i）選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルで胚性幹細胞株をトラン スフェクションし； （ii）安定にトランスフェクションされた細胞クローンをマーカー遺伝子の存在 について選択し； （iii）これら細胞クローンをＰＣＲおよび／またはサザーンブロットによるタ ーゲティング選択に供し； （iv）該細胞クローンを非ヒト哺乳動物の胞胚中に注入し； （v）該胞胚を代理母に移行させる方法であって、 該方法は、選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルにより、組換え事象 において内生遺伝子または内生遺伝子断片が相同遺伝子または相同遺伝子断片に よって１工程で機能的に置換されるという事実を特徴とする。 本発明によれば、導入する遺伝子または導入する遺伝子断片はヒト由来であり 、 非ヒト哺乳動物は齧歯類、とりわけマウスであるのが好ましい。 本発明による方法において、とりわけ、免疫系、神経系、とりわけシグナル媒 体分子および接着性（adhesion）分子、ウイルスレセプター、造血系および支持 組織、とりわけ筋肉、腱および骨をコードする遺伝子または遺伝子断片を置換す る。免疫系をコードする遺伝子および遺伝子断片が特に好ましく、とりわけ、抗 体遺伝子、Ｔ細胞レセプター遺伝子、サイトカイン、サイトカインレセプター遺 伝子、ＭＨＣ遺伝子、接着性分子遺伝子およびシグナル媒体分子の遺伝子が好ま しい。本発明によれば、抗体遺伝子、サイトカインおよびＭＨＣ遺伝子が特に好 ましい。 本発明の特別の態様において、マウスの抗体遺伝子断片がヒトの抗体遺伝子断 片によって置換される。 本発明による選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルは置換ベクター であり、導入しようとする遺伝子または遺伝子断片、置換されるべき内生ＤＮＡ 断片の両側に位置する配列に相補的な配列、およびマーカー遺伝子、とりわけネ オマイシンまたはハイグロマイシン（ネオマイシンが好ましい）を含有する。さ らに、組換えビヒクルはまた、ウイルス認識配列（たとえば、ＳＶ４０）、遺伝 子発現を増幅させるための付加配列、原核および真核組換え系のための標的配列 を含んでいてもよい。後者の配列、とりわけＣｒｅ認識配列ＬｏｘＰまたはｆｌ ｉｐ認識配列Ｆｒｔは、マーカー遺伝子並びになお依然として残留する非機能性 の標的遺伝子断片のターゲティング除去に使用することができる。このやり方に おいて、第一の工程において内生遺伝子断片を他の哺乳動物の相同遺伝子断片で 置換し、ついで第二の工程において残留する残基を選択的に機能するリコンビナ ーゼにより除去することができる（グー（H．Gu）ら、Cell、７３、１１５５〜 １１６４（１９９３））。この方法において残留する残基は選択的に除去され、 ＷＯ９１／１９７９６に記載された「ヒットアンドラン（hit and run）」法と は対照的に所望の組換えのみを起こさせることができる。 本発明の好ましい態様における選択可能なようにマーキングした組換えビヒク ルは、プラスミドｐＴＺ₂−ＣｋＮ（ＰＡ^-）（ＤＳＭ７２１１）である。 本発明の他の目的は、置換すべき遺伝子または置換すべき遺伝子断片および選 択可能なマーカー遺伝子を含有する相同的組換えのための組換えビヒクルである 。組換えビヒクルにはまた、すでに言及した認識配列、増幅配列および／または 標的配列標的配列が含まれていてよい。 本発明の他の目的は、本発明による方法によって製造された安定にトランスフ ェクションされた細胞クローン、並びにトランスフェクションされた非ヒト哺乳 動物の製造方法である。後者の方法によれば、本発明による安定にトランスフェ クションされた細胞クローンをマウスの胞胚中に注入し、これら胞胚を代理母に 移し、生まれたキメラ動物を交配させ、その子孫を変異の存在について選択する 。 この方法において得ることのできるトランスジェニック非ヒト哺乳動物もまた 本発明の目的である。 本発明の他の目的は、もともとの遺伝子断片によってコードされた産物の代わ りに他の哺乳動物の遺伝子産物を発現させるため、および薬物および治療モデル を試験するための、選択的に変異されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使 用である。ヒト化モノクローナル抗体を産生させるためおよびウイルス産生のた めのこれら遺伝子の使用は、本発明の意味において特に好ましい。 本発明を以下の図面によりさらに説明する。 図１：マウスカッパ鎖（ｍＣ_κ）とヒトカッパ鎖（ＨＣ_κ）との交換となる相 同的組換えの概観。上の列はマウスカッパ鎖の定常領域のもともとの遺伝子断片 を示し、中央の列はターゲティング変更のために導入するベクターを示し、下の 列は遺伝子断片ｍＣ_κ（薄く陰影をつけた箱）がその機能において遺伝子断片Ｈ Ｃ_κ（黒く塗りつぶした箱）によって置換された新たに形成された遺伝子構造を 示す。さらに、ベクターの構築または変化させた遺伝子断片の検出のいずれかの ために用いた制限酵素開裂部位（Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、Ｈｐａ ｌ；Ｍ、ＭｓｔII；Ｂｇ、Ｂｇ１II；Ｋ、ＫｐｎＩ）も示す。サザーンブロット 分析に使用したＤＮＡプローブ（プローブＡおよびプローブＢ）もまた、野性型 のためおよび変異遺伝子のために得た断片とともに示してある。下の列は、所望 の相同的組換えが起こった細胞を探すために用いた複製連鎖反応のプライマーを 示す。 図２：マウス変異体（ＨＣ_κ／ＨＣ_κ）における、マウスのカッパ鎖の代わり のヒトのカッパ鎖の発現の検出。野性型のマウス（ＷＴ／ＷＴ；左側）の脾臓細 胞およびホモ接合マウス変異体（ＨＣ_κ／ＨＣ_κ；右側）の脾臓細胞を、Ｂ細胞 特異的抗原ＣＤ４５Ｒ［Ｂ２２０］に対する赤い蛍光抗体、並びにマウスのカッ パ鎖（上側）かまたはヒトのカッパ鎖（下側）のいずれかに対する緑色の蛍光抗 体で染色した。これら細胞をフロースルーサイトメトリーで分析した。分析結果 を二次元点図表で示す。一つの点は一つの細胞の蛍光を示す。細胞がマーキング されていない場合は、この図表の左下に現れる。赤色の蛍光のみを発する細胞は 左上に現れ、緑色の蛍光のみを発する細胞は右下に現れ、両方の蛍光を有する細 胞は右上に現れる。 図３：第二の反応工程でリコンビナーゼ（ＣＲＥ）を用いた、ＩｇＧ１遺伝子 の定常領域をコードするマウス遺伝子と対応ヒト遺伝子断片との交換となる相同 的組換えの概観。 ａ：計画している変更の前のマウスＩｇＧ１遺伝子の領域を示す。黒い箱はマウ スＩｇＧ１遺伝子のエキソンを示す。ＢおよびＸの記号は制限酵素開裂部位Ｂａ ｍＨＩおよびＸＢａＩを意味する。 ｂ：ここでは、マウスＩｇＧ１領域をヒトの対応遺伝子断片（薄いグレーの箱） で機能的に置換した後の状態を示す。黒い三角形は、選択マーカーｎｅｏおよび ＨＳＶ−ｔｋ並びにマウスＩｇＧ１遺伝子残基の側面に位置する（flank）Ｌｏ ｘＰ認識配列を示す。 ｃ：ここでは、ＬｏｘＰの側面に位置する領域をリコンビナーゼＣｒｅで除去し た後の状態を示す。 本発明による方法によれば、非ヒト哺乳動物の細胞株中の遺伝子または遺伝子 断片を他の哺乳動物の相同遺伝子または相同遺伝子断片で１工程にて置換するこ とが可能となる。所望の変異についてホモ接合である動物がキメラを経て得られ 、内生遺伝子の代わりに他の動物の遺伝子産物を発現させるためまたは薬物およ び治療モデルの試験のために用いることができる。 本発明を以下の実施例によりさらに説明する。実施例 実施例Ｉ：遺伝子置換ベクターの構築 １）プラスミドｐＴｚ−１９（Ｒ）（ファルマシアＬＫＢ、カタログＮｏ．２ ７−５９８６−０１、ファルマシアＬＫＢＧｍｂＨ、ＰＯボックス５４８０、ム ンツィンガーシュトラーセ９、７８００フライブルク）のポリリンカーのＳｐｈ ＩおよびＰｓｔＩ開裂部位の間に、ベクターｐＣ−２（クロベック（H．−G．Kl obeck）ら、２つのヒトリンパ細胞株からのＬ鎖タイプの免疫グロブリン遺伝子 は密接に関連する、Nucleic Acids Research、１２、６９９５〜７００６（１９ ８４））からのＣ_κ−エキソンを含有する７２７塩基対の長さのＳｐｈＩ−Ｈｈ ａＩ断片を挿入したプラスミドｐＴＺ−ＨＣ_κを構築した。 ２）プラスミドｐＴＺ−ＨＣ_κのＨｉｎｄIIIおよびＳａ１Ｉ開裂部位の間に 、イントロンエンハンサー要素を含有するベクターｐＨＢＣ_κルイス(S.Lewis) ら、アベルソン(Abelson)マウス白血病ウイルスによって形質転換された細胞株 における連続カッパー遺伝子再配列；Cell、３０、８０７〜８１６（１９８２） ）の１．２ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＭｓｔII断片を挿入したプラスミドｐＴＺ−ＨＣ_κ −ｍＣ_κ５’を構築した。 ３）ベクターｐＴＺ−ＨＣ_κ−ｍＣ_κ５’のＳａ１ＩおよびＢａｍＨＩ開裂部 位の間に、プラスミドｐＭＣＩＮｅｏ（ストラタジーン、カタログＮｏ．２１３ ２０１、ストラタジーンＧｍｂＨ、ＰＯボックス１０５４６６、イン・バイアー １２、６９００ハイデルベルグ）からのネオマイシン耐性遺伝子を含有する１． １ｋｂＸＨＯＩ−ＢａｍＨＩ断片が挿入されたプラスミドｐＴＺ−５’ＨＣ_κＮ ｅｏを構築した。 ４）プラスミドｐＴＺ−５’ＨＣ_κＮｅｏのＨｉｎｄIII開裂部位に、Ｊ１〜 ５要素を含有するプラスミドｐＨＪ_κ（ルイスら、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）の２．８ ｋｇ長のＨｉｎｄIII断片を挿入したプラスミドｐＴＺ−５’ＨＲＣ_κＮｅｏを 構築した。 ５）プラスミドｐＴＺ₂−ＣｋＮ（ＰＡ−）（ＤＳＭ７２１１）（遺伝子置換 に用いた）は、プラスミドｐＴＺ−５’−ＨＲＣ_κＮｅｏのＢａｍＨＩおよびＫ ｐｎＩ開裂部位の間に４２７ｂｐ長の断片をさらに含有しており、これを複製 連鎖反応によりマウス生殖系列ＤＮＡから増幅させた。この断片をマウス生殖系 列ＤＮＡから増幅させるために以下のプライマーを用いた： はＣ_κ−エキソンの開始の後の１２塩基対とハイブリダイズし； は該Ｃ_κエキソンの終止コドンＴＡＧの後の１３７塩基対とハイブリダイズする 。相同的組換え 本出願人の研究所で用いられたような置換ベクターによる相同的組換え法は、 何度も記載されている（キタムラ（Kitamura）ら、Nature、１９９１；クーン（ Kuhn）ら、Science、１９９１；キタムラら、Cell、１９９２）。相同的組換え に用いたベクターは、マウスカッパ遺伝子（ｍＣ_κ）のゲノムＤＮＡの４．５ｋ ｂ断片を含有する。この部分には、ポリＡ部位を含有することなく、ｍＣ_κ遺伝 子に存在する遺伝子断片Ｊｋ１〜５、カッパ−イントロン−エンハンサーおよび ３’非翻訳領域が含まれる。ヒトカッパ遺伝子（ＨＣ_κ）およびそれ自体のポリ Ａ部位なしで選択するのに必要なネオマイシン遺伝子がＭｓｔIIおよびＨｐａＩ 制限開裂部位の間に挿入され、ＭｓｔIIとＨｐａＩとの間に存在するｍＣ_κのス プライスドナー部位は除去した（図１）。ネオマイシン遺伝子はポリＡ部位をベ クター上に有していないので、相同的組換え事象を選択した（ゲノム中のポリＡ 部位の前にベクターが組み込まれた場合にはネオマイシン耐性細胞クローンのみ が生成しうる。このことは、たとえば、想定したようにベクターが相同に組み込 まれた場合に起こり得る）。該ベクターを線状にし、マウスの胚親細胞（ＥＳ） 中に電気穿孔法により導入し、相同的組換え事象を有するネオマイシン耐性ＥＳ 細胞を複製連鎖反応（図１）およびその後のサザーンブロット（図１）により同 定した。２×１０⁷のＥＳ細胞が１回の実験でトランスフェクションされた。４ ８０のネオマイシン耐性ＥＳ細胞のうち一つが想定した変異を有していた（図１ ）。 想定した変化の発現を調べるため、ＥＳ細胞クローンによりキメラマウスを作 製した。これらキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。変異を有する マウスを次世代で交配した。２つの変化しないマウスカッパ遺伝子座を有するマ ウス（ＷＴ）（２５％）、２つの変異した遺伝子座を有するマウス（ＨＣ_κ）（ ２５％）並びに一つの変化しないマウスカッパ遺伝子座と一つの変異した遺伝子 座を有するマウス（５０％）が次の世代で生まれた。野性型のマウス（ＷＴ／Ｗ Ｔ）と該変異についてホモ接合であるマウス（ＨＣ_κ／ＨＣ_κ）との比較を以下 に示す。 ホモ接合マウス変異体において抗体生成にＨＣ_κ遺伝子が用いられることを示 すため、ヒトカッパ遺伝子の定常領域を有する抗体の濃度をマウスの血清におい て血清学により測定した。このタイプの抗体は野性型のマウスにおいては検出で きない。検出限界は２５０ｎｇ／ｍＬである。ＨＣ_κを有するマウスの血清では １７８μｇ／ｍＬの濃度が認められたが、この変異についてホモ接合であるマウ スでは２８６０μｇ／ｍＬの濃度が認められた。比較のため：正常なヒト血清は 約１５，０００μｇ／ｍＬを含有する。 ＨＣ_κ遺伝子がｍＣ_κ遺伝子を機能的に置換していることの直接の証拠は、マ ウスにおいて抗体産生細胞（Ｂ−リンパ球）を分析することにより得られる。静 止しているＢ−リンパ球は、遺伝子再配列後にゲノム中に発現する抗体をその表 面に有する。これら抗体は、Ｌ鎖に特異的な標識抗体により検出することができ る。マウスのカッパ鎖かまたはヒトのカッパ鎖のいずれかに特異的な抗体を用い た実験を図２に示す。Ｂ−リンパ球を標識するため、すべてのＢ−細胞を認識す る赤色蛍光抗体（抗ＣＤ４５Ｒ［Ｂ２２０］）で該細胞を標識した。同時に、カ ッパ−Ｌ鎖の定常領域に特異的な緑色蛍光抗体でも細胞を標識した。マウス変異 体中のＢ−リンパ球はヒトカッパ鎖を有する抗体を発現し、マウスのカッパ鎖は もはや用いられないことが明らかである。 実施例II：遺伝子置換ベクターの構築 １）ベクターｐＧ１を構築するため、ＩｇＧ１の短アームの相同領域をコード するプラスミドｐＧ１Ａ（マウスγ₁−遺伝子およびその両側の領域を含有する ）をまずＰＣＲにより単離した。この目的のため、以下のプライマー（１０ピコ モル）： および 並びにマトリックスとしてのプラスミドＤＮＡ（１０ｎｇ）の混合物を、９４℃ （１分）、６９℃（１．５分）および７４℃（２分）にて２５サイクルに供した 。ｐ５’ＨＲＯＧＮＴベクターを構築するため、かくして単離された相同領域を 、５’末端にＦｒｔ部位（オゴーマン（O’Gorman）ら、Science、２５１、１３ ５１（１９９１））を有するｎｅｏ^r−ｔｋカセット（グーら、Cell、７３、１ １５５〜１１６４（１９９３））中にクローニングした。このｐ５’ＨＲＯＧＮ ＴベクターをＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで部分分解した。５’末端にｌｏｘＰ部 位を有するｎｅｏ^r遺伝子を含有する１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を プラスミドｐＧＨ１（グーら、Cell、７３、１１５５〜１１６４（１９９３）） から単離し、上記分解したｐ５’ＨＲＯＧＮＴベクター中にクローニングしてベ クターｐＧ１を生成した。 ２）ベクターｐＧ２を製造するため、分泌形態のヒトＩｇＧ１をコードするヒ トγ₁遺伝子を上記ｐＧ１ベクター中にサブクローニングした。この目的のため 、ヒトγ₁遺伝子を含有する２．１ｋｂのＨｉｎｄIII−ＰｖｕII断片をプラスミ ドｐＴＪ１Ｂ（クドー（A．Kudo）ら、Gene、３３、１８１（１９８５））から 単離した。ＸｈｏＩ分解、その後のＴ₄ポリメラーゼ充填およびＢｇIIIを用いた 分解により、ｎｅｏ^r遺伝子および一部のｔｋ遺伝子を含有する別の断片をプラ スミドｐＧ１から単離した。ｐＧ１ベクターはまたＨｉｎｄIIIついでＸｈｏＩ −ＢｇIIIで部分分解した。これら３つの断片をライゲートしてｐＧ２ベクター を構築した。 ３）ベクターｐＧ３を構築するため、ｌｏｘＰ部位をマウスγ１膜エキソンの 前にサブクローニングした。この目的のため、プラスミドｐＴＺ−３’γ₁（４ ．３）およびプラスミドｐＧＥＭ３０（グーら、Cell、７３、１１５５〜１１６ ４（１９９３））をＥｃｏＲＩついでＳａｌＩで部分分解し、一緒にライゲート した。プラスミドｐＴＺ−３’γ₁（４．３）（マウスγ１遺伝子の２つの膜エ キ ソンを含有する）は、プラスミドｐＧＡの１．５ｋｂＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片 およびバクテリオファージｃｈγ_1-3の２．８ｋｂＥｃｏＲＩ断片（シミズ（A． Schimizu）ら、Cell、２８、４９９（１９８２））から製造した。 ４）遺伝子置換ベクターの全３’相同領域を構築するため、ベクターｐＧＨ２ （ゲノム６．３−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ断片を含有する、分泌およ び膜形態のマウスγ₁遺伝子を含む）をＳａｃＩで分解し、Ｔ₄ポリメラーゼで充 填し、ついでＢｇｌIIで分解した。ｐＧ３ベクターをＸｈｏＩで開裂し、Ｔ₄ポ リメラーゼで充填し、ついでＢｇｌIIおよびＳｐｈＩで開裂した。ベクターｐＧ ４を構築するため、かくして得られたこれら２つの断片をライゲートした。 ５）遺伝子置換ベクターｐＧ５を構築するため、ベクターｐＧ４をＣｌａＩお よびＸｈｏＩで開裂し、ベクターｐＧ２をＣｌａＩおよびＳａｌＩで開裂し、こ れらを一緒にライゲートした。相同的組換え 相同的組換えのため、ベクターｐＧ５をＣｌａＩ分解により線状にし、実施例 １に記載したようにして電気穿孔法によりマウスの胚性幹細胞中に導入した。 別の工程において、胚性幹細胞でリコンビナーゼを一過的に発現させた（グー ら、Cell、７３、１１５５〜１１６４（１９９３））。ついで、リコンビナーゼ は、認識配列によってマーキングされた領域を高効率で除去する（図３）。つい で、実施例１と同様にしてキメラマウスを経て変異についてホモ接合のマウス変 異体を生成した。 ＩｇＧ１遺伝子の定常領域をコードするマウス遺伝子がヒト遺伝子の対応領域 によって置換されたことの証拠は、対応キメラマウスのＢ−細胞の培養液中での ヒトＩｇＧ１の検出により確かめられた：３匹のマウスからの培養液で２μｇ／ ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１が測定され、一方、コントロールの培養液では０．１ μｇ／ｍＬの検出限界よりも値が低かった。 これら実施例は、相同的組換えにより、非ヒト哺乳動物（ここではマウス）の 生殖系列中で哺乳動物（ここではヒト）からの相同遺伝子または遺伝子断片を置 換することが１工程で可能であることを示している。加えて、実施例Ｉのマウス を実施例IIのマウスと交配することにより、ヒトのκ遺伝子およびγ₁遺伝子の 両者が由来するマウス変異体が得られる。それゆえ、そのようなマウス変異体は 、ヒト化モノクローナル抗体を製造するのに適している。 遺伝子置換に用いたプラスミド（ｐＴＺ₂−ＣｋＮ（ＰＡ−））は、ドイチェ ン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレ ン（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）ＧｍｂＨ（ マショルダーベーク１ｂ、Ｗ−３３００ブラウンシュバイク）に大腸菌株ＤＳＭ ７２１１として寄託してある。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（Genomic） 配列： 配列番号：２ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（Genomic） 配列： 配列番号：３ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（Genomic） 配列： 配列番号：４ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（Genomic） 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非ヒト哺乳動物の生殖系列中の遺伝子または遺伝子断片を他の哺乳動物の 相同遺伝子または相同遺伝子断片で置換する方法であって、その際、 （i）選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルで胚性幹細胞株をトラン スフェクションし； （ii）安定にトランスフェクションされた細胞クローンをマーカー遺伝子の存在 について選択し； （iii）これら細胞クローンをＰＣＲおよび／またはサザーンブロットによるタ ーゲティング選択に供し； （iv）該細胞クローンを非ヒト哺乳動物の胞胚中に注入し； （v）該胞胚を代理母に移行させ、 選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルにより、組換え事象において内 生遺伝子または内生遺伝子断片が相同遺伝子または相同遺伝子断片によって１工 程で機能的に置換されることを特徴とする方法。 ２．導入した遺伝子または導入した遺伝子断片がヒト由来であり、非ヒト哺乳 動物が齧歯類、とりわけマウスである、請求項１に記載の方法。 ３．相同遺伝子または相同遺伝子断片が、免疫系；神経系、とりわけシグナル 媒体分子および接着性分子；ウイルスレセプター；造血系；および支持組織、と りわけ筋肉、腱および骨をコードする、請求項１または２に記載の方法。 ４．置換された遺伝子断片が、免疫系をコードするものであり、とりわけ、抗 体遺伝子、Ｔ細胞レセプター遺伝子、サイトカイン、サイトカインレセプター遺 伝子、ＭＨＣ遺伝子、接着性分子遺伝子およびシグナル媒体分子である（抗体遺 伝子、サイトカインおよびＭＨＣ遺伝子が好ましい）請求項１〜３のいずれか１ または２以上に記載の方法。 ５．マウスの抗体遺伝子または抗体遺伝子断片がヒトの抗体遺伝子または抗体 遺伝子断片で置換される請求項１〜４のいずれか１または２以上に記載の方法。 ６．選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルが置換ベクターであり、 導入しようとする遺伝子断片または導入しようとする遺伝子；置換されるべき内 生ＤＮＡ断片の両側に位置する配列に相補的な配列；ネオマイシンおよびハイグ ロマイシンから選択されたマーカー遺伝子；並びに、別の機能性の遺伝子配列、 とりわけウイルス認識配列、遺伝子発現を増幅させるための配列、および原核お よび真核組換え系のための標的配列、とりわけＣｒｅ認識配列ＬｏｘＰおよびｆ ｌｉｐ認識配列Ｆｒｔを含有する、請求項１〜５のいずれか１または２以上に記 載の方法。 ７．マーカー遺伝子がネオマイシンである請求項６に記載の方法。 ８．選択可能なようにマーキングした組換えビヒクルがｐＴＺ₂−ＣｋＮ（Ｐ Ａ−）（ＤＳＭ７２１１）である請求項１〜７のいずれか１または２以上に記載 の方法。 ９．マーカー遺伝子および依然として存在する標的遺伝子断片を標的配列によ り第二の反応工程で除去する、請求項６に記載の方法。 １０．請求項１〜９のいずれか１または２以上に記載の、相同的組換えのため の選択可能なようにマーキングした組換えビヒクル。 １１．請求項１〜９のいずれか１または２以上に記載の安定にトランスフェク ションした細胞クローン。 １２．請求項１１に記載の安定にトランスフェクションした細胞クローンを胞 胚中に注入し、これら胞胚を代理母に移し、生まれたキメラ非ヒト哺乳動物を交 配させ、ついでその子孫を変異の存在について選択することを特徴とする、トラ ンスジェニック非ヒト哺乳動物の製造方法。 １３．キメラ非ヒト哺乳動物が齧歯類、とりわけマウスである請求項１２に記 載の方法。 １４．請求項１２または１３に記載の方法によって得られるトランスジェニッ ク非ヒト哺乳動物。 １５．もともとの遺伝子断片によってコードされた産物の代わりに他の種の遺 伝子産物を発現させるための請求項１４に記載の選択的に変異された非ヒト哺乳 動物の使用。 １６．該遺伝子産物をヒト化モノクローナル抗体を産生させるのに使用する、 請求項１５に記載の使用。 １７．該遺伝子産物をウイルスを産生させるのに使用する、請求項１５に記載 の使用。 １８．薬物および治療モデルを試験するための請求項１４に記載の選択的に変 異された非ヒト哺乳動物の使用。