KR20230024822A - 이형접합성 형질전환 동물 - Google Patents

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오경석
박순익
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Abstract

본 발명은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)인 것을 특징으로 한다.

Description

이형접합성 형질전환 동물
본 발명은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)인 것을 특징으로 한다.
우리 몸이 외부 병원균에 노출되었을 때 일어나는 반응 기작 중 하나는 해당 병원균에 특이적인 항체(antibody)의 생산이다. 항체는 B 세포가 만들어내는 단백질로써 일생 동안 노출되는 수많은 병원균으로부터 몸을 방어하기 위해 다양한 항체를 확보하는 것은 필수적이다. 다양성을 확보하는 기작으로써, VDJ 재조합 (recombination), somatic hypermutation (SHM), class switching이 있다. 상기 기작을 통해 V, D, J 세그먼트들이 하나씩 DNA 수준에서 재조합 되면 activation-induced cytidine (AID) deaminase에 의해 somatic mutation이 발생한다. 이렇게 결정된 항체의 가변 영역(variable region)은 다시 면역글로불린(immunoglobulin) M, D, A, G 또는 E 클래스의 불변 영역과 재조합 된다. 이와 같은 다양한 항체의 총체인 항체 레퍼토리는 이론적으로 109 이상의 다양성을 가진다. 우리의 몸이 병원균에 노출이 되면 항체 레퍼토리 중 해당 병원균, 즉, 항원에 높은 특이성을 가지는 극히 일부분의 B 세포가 증폭되어 항체를 생산하여 병원균으로부터 몸을 방어한다. 따라서, 항체 레퍼토리의 다양성 증가는 항원 특이적 B 세포(또는 항체)의 후보군을 확장함과 동시에 높은 특이성을 가지는 B 세포(또는 항체) 생산 및 선별을 가능하게 하므로, 항체생산 형질전환 동물의 개발에서 항체 레퍼토리 다양성을 증가시키기 위한 노력이 필요하다.
본 발명의 일 목적은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제공한다.
인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다를 수 있으며, 이로 인해, 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 유전자좌에서 이형접합성(heterozygous)일 수 있다.
상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 일부 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 일부 영역을 포함할 수 있다. 또는 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 비인간-동물 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 인간 면역글로불린 유전자의 일부 영역은 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역일 수 있다. 상기 가변 영역은 재배열 되지 않은 가변 영역일 수 있다. 이때, 재배열 되지 않은 가변 영역은 V, D 및 J 세그먼트, 또는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다.
이때, 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 일부 영역은 비인간-동물 면역글로불린 유전자(내인성 면역글로불린 유전자)의 불변 영역일 수 있다. 상기 불변 영역은 C 세그먼트를 포함할 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자의 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)일 수 있다.
이때, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자일 수 있다.
이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable region)일 수 있다.
이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 이 경우, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체일 수 있다.
이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 이 경우, 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물은 면역글로불린에대해 서로 다른 두 개의 인종 유래의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 코카서스 인종일 수 있으며, 상기 제2 인종은 니그로일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 코카서스 인종일 수 있으며, 상기 제2 인종은 몽골인일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
또 다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 니그로일 수 있으며, 상기 제2 인종은 몽골인일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci) 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH) 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 마우스 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
또 다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci), 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH), 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제5 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제6 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제5 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제5 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제6 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제6 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제5 재배열되지 않은 가변 영역과 제6 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인간 개체 유래이며, 상기 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제5 인간 개체와 제6 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제5 인종과 제6 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종 중 둘 이상은 동일한 인종일 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 i) 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles); ii) 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles); 및 iii) 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제작하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)일 수 있다. 상기 형질전환 동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 원숭이, 소, 돼지, 낙타 및 닭 등 인간을 제외한 동물일 수 있다.
상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용하여 형질전환 동물을 제작할 수 있다.
상기 형질전환 동물 세포는 인간을 제외한 포유동물 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법 및 염색체 교환(chromosome exchange)을 이용한 방법 등의 공지의 방법을 이용해 제작될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer; SCNT) 방법을 이용할 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 배아를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 상기 둘 이상의 동물 배아를 각각 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산하고, 생산된 형질전환 동물을 교배하여 제작할 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 배아 줄기세포를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 상기 배아 줄기세포를 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산할 수 있다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 이용한 항체 생산 방법을 제공한다. 이때, 상기 방법은 상기 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 항원 주입을 통해, 상기 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 인간화 면역글로불린 유전자좌에서 인간화 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다. 상기 형질전환 동물은 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로서, 상기 항체 생산 방법은 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 항원을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물일 수 있다. 상기 면역글로불린은 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 항체 생산 방법은 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 항원을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물일 수 있다. 상기 면역글로불린은 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 이형 대립 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
본 발명은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
도 1은 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 이형접합성 형질전환 동물의 게놈 중 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하는 상동 염색체를 도식화한 그림이다. 이때, 제1 대립 유전자(first allele) 및 제2 대립 유전자(second allele)는 이형 대립 유전자(heteroalleles)로, 두 대립 유전자는 서로 다른 인종 유래이고, 두 대립 유전자 사이에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
용어 정의
본 명세서에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
상동 염색체(homologous chromosomes)
“상동 염색체”는 세포의 핵 내에 존재하는 모양과 크기가 같은 한 쌍의 염색체를 의미한다. 두 염색체의 같은 위치에는 같은 형질에 관한 유전자가 존재하며, 이 관계를 대립 유전자(allele)라 한다.
대립 유전자(allele)
“대립 유전자 또는 대립인자”는 상동 염색체에서 같은 위치에 있으며, 즉, 유전자 자리(gene locus)가 같은 유전체 내에서 특정 형질을 표현하기 위한 최소의 단위이다. 대립 유전자는 인간과 같이 2n의 유전체를 보유한 이배체 생물의 상염색체(autosome)에는 각 유전자마다 한 쌍씩 존재하며 각 대립 유전자는 모계와 부계에서 하나씩 유래한다. 한 쌍의 두 대립 유전자가 서로 동일한 경우를 동형 대립 유전자(homoallele; homo-allele)라고 하며, 서로 다른 경우를 이형 대립 유전자(heteroallele; hetero-allele)라 한다.
본 명세서에서, 면역글로불린의 대립 유전자는 생식계에 존재하는 대립 유전자로, 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함한다. 재배열된 가변영역, 즉, V, D, J 또는 V, J가 재조합된 가변영역을 포함하는 경우, 재조합 대립 유전자로 지칭한다.
유전자 자리(gene locus(loci))
“유전자 자리 또는 유전자좌”는 특정 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 특정 위치를 의미한다. 반수체 세포의 경우, 특정 유전자에 대해 하나의 유전자 자리를 가진다. 이배체 세포의 경우, 특정 유전자에 대해 두 개의 유전자 자리를 가진다. 이때, 두 개의 유전자 자리는 특정 유전자에 대한 동일한 대립 유전자, 즉, 동형접합성 대립 유전자를 각각 포함할 수 있다. 또는 두 개의 유전자 자리는 특정 유전자에 대한 서로 다른 대립 유전자, 즉, 이형접합성 대립 유전자를 각각 포함할 수 있다.
또한, “유전자 자리 또는 유전자좌”는 특정 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 즉, 엑손, 인트론, 프로모터, 인핸서, 유전자좌 제어 영역(locus control regions; LCR) 등 특정 유전자가 정상적으로 발현되기 위해 필요한 모든 요소를 포함하는 염색체 내 일 영역을 의미한다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus(loci); IGH)는 염색체 내 면역글로불린 중쇄에 대한 유전자가 위치하는 자리를 의미하며, 또한, 면역글로불린 중쇄 유전자가 정상적으로 발현되기 위해 필요한 모든 요소(프로모터, 인핸서, variable region gene, constant region gene 등)을 포함하는 일 영역을 의미한다.
면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))
“면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))”는 V(variable), D(diversity), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))”는 V(variable), D(diversity), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 상기 세그먼트들의 재조합이 발생하여 재조합된 V-D-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, D, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V, D 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트, 다수의 D 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 38 내지 46개의 V 세그먼트, 23개의 D 세그먼트 및 6개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 109개의 V 세그먼트, 19개의 D 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 V 세그먼트는 IGHV로, D 세그먼트는 IGHD로, J 세그먼트는 IGHJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGHC로 지칭한다.
면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))
“면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 람단 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 람단 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 람다 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 재조합이 발생하여 재조합된 V-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 람다 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 람다 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 33개의 V 세그먼트 및 5개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 3 내지 8개의 V 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 람다 유전자좌의 V 세그먼트는 IGLV로, J 세그먼트는 IGLJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 람다 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGLC로 지칭한다.
면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))
“면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 카파 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 카파 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 카파 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 재조합이 발생하여 재조합된 V-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 카파 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 카파 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 34 내지 48개의 V 세그먼트 및 5개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 91개의 V 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 카파 유전자좌의 V 세그먼트는 IGKV로, J 세그먼트는 IGKJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 카파 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGKC로 지칭한다.
인간화된 또는 인간화(humanized 또는 humanization)
“인간화된 또는 인간화(humanized 또는 humanization)”는 대상의 전체 또는 일부가 인간의 것 또는 인간 유래인 것을 의미하는 용어로, 상기 용어를 유전자와 함께 사용하는 경우, 즉, 인간화 유전자는 비인간-동물의 특정 유전자의 전체 또는 일부 핵산 서열이 인간 유전자의 핵산 서열로 교체되거나 인간 유전자와 동일한 핵산 서열을 갖는 상태를 말한다. 예를 들어, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성(endogenous) 면역글로불린 유전자의 가변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 포함하고 있는 유전자일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자의 불변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함하고 있는 유전자일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 있는 것일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(예를 들어, V 세그먼트) 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(V 세그먼트)를 포함하고 있는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 용어를 유전자좌와 함께 사용하는 경우, 즉, 인간화 유전자좌는 비인간-동물의 특정 유전자 자리 내에 인간 유전자의 전체 또는 일부 핵산 서열을 갖는 상태를 말한다. 예를 들어, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 불변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(예를 들어, J 세그먼트) 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(J 세그먼트)를 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다.
인종(race)
“인종(race)”은 인간 가운데 신체적, 사회적, 문화적 특성을 들어, 차이가 있다고 인식되는 인구집단을 임의로 나누어 분류하는 개념으로, 그 분류 방법에 따라 다양하게 구분될 수 있다. 일반적으로, 피부 색 등의 형태적 기준으로 백인, 흑인, 황인으로 구분하는 방식이 가장 널리 이용된다. 본 명세서에서는 인종을 지리적 및 형태적 기준으로 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인((Polynesian, 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race))으로 구분하였다.
코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race))은 유럽 전역, 북아프리카, 아라비아 반도, 아프가니스탄, 북부 인도, 남아메리카, 북아메리카 등에 분포하는 백인으로, 피부는 흰색이나, 일부는 갈색이며, 넓은 이마, 높은 코, 청갈색이나 검은 눈, 많은 체모 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race))은 아시아(동아시아, 남아시아, 서아시아, 소아시아, 중앙아시아), 몽골, 동시베리아, 인도차이나, 헝가리, 핀란드 등에 분포하는 황인으로, 피부는 주로 황색이나, 일부는 담갈색이며, 넓은 이마, 낮은 코, 흑색 직상모(直上毛), 적은 체모 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
흑인(또는 니그로(Negro, Negroid))은 아프리카, 북아메리카 등에 분포하는 흑인으로, 피부는 구리빛이나 흑갈색이며, 입술이 두껍고, 낮은 코, 검은 눈, 적은 체모, 고수 머리 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다. 흑인은 Congoid race(오스트렐리안 등 남태평양상 흑인) 및 Capoid race(아프리카 남부지역 토종 흑인)으로 구분될 수 있다.
말레이 인종(Malay)은 인도네시아, 필리핀, 뉴기니, 멜라네시아 등에 분포하며, 피부는 갈색이며 몽골인과 유사한 특징으로 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
폴리네시아인((Polynesian, 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race))은 하와이, 서사모아, 뉴질랜드, 이스터 섬 등 태평양 도서에 분포하는 인종으로, 피부는 다갈색이며, 큰 신체 및 큰 두개골 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한 되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
항체 레퍼토리(antibody repertoire)
하나의 개체에서 B 세포 라이브러리는 약 109 개를 이루며, 각 클론은 서로 다른 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생산할 수 있다. 항체 다양성의 메커니즘 중에는 면역글로불린 중쇄 유전자에서 V, D 및 J 세그먼트; 및 경쇄 유전자에서 V와 J 세그먼트의 다양한 재조합(또는 재배열)이 포함된다. 또한, 재배열된 중쇄 및 경쇄의 다양한 조합의 페어링도 포함된다. 다른 메커니즘으로는 체세포 돌연변이(somatic mutation), 세그먼트 조합시 세그먼트 접합부(junction)에서의 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입 등이 있다. 항체 레퍼토리는 이러한 다양한 메커니즘에 의해 생성되는 항체 전체 세트로, 일반적으로 한 개체에서 생산되는 항체의 전체 세트를 말한다. 따라서, 항체 레퍼토리의 다양성을 확보하는 것은 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 다양성을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 항체 레퍼토리의 다양성을 확보하는 것은 항원에 대한 특이성을 증가시킨 항체를 확보하는 것일 수 있다. 이러한 항체 레퍼토리의 다양성은 대립 유전자 배제 현상(allelic exclusion) 및 면역글로불린 대립 유전자의 다양화(예를 들어, 개체간, 인종간의 대립 유전자의 차이 등 이용)에 의해 확보될 수 있다. 이를 위해, 면역글로불린 유전자에 대해 동형접합성 형질전환 동물이 아닌 이형접합성 형질전환 동물의 개발이 필요하다.
Homo-allelic immunoglobulin
현재 인간항체를 생산하기 위해 이용되는 형질전환 동물은 대부분 면역글로불린 유전자에 대해 동형 대립 유전자(homo-allele)를 가지는 동형접합성(homozygous) 형질전환 동물이다. 즉, 면역글로불린 유전자에 대한 한 쌍의 대립 유전자가 동일한 대립 유전자를 가지는 형질전환 동물이 인간항체 연구 및 생산을 위해 이용되고 있다. 이와 관련하여 US8,502,018, US9,371,553, US9,379,699, US9,447,177, US10,064,398, US9,504,236, US9,783,593, US9,445,581, US9,938,357 및 US9,788,534 등의 다수의 특허에서 면역글로불린 유전자에 대해 동형접합성(homozygous) 형질전환 마우스의 생산 및 이를 이용한 인간항체 생산 방법에 대해 개시하고 있다. 하지만 이러한 동형접합성 형질전환 마우스의 경우, 면역글로불린 유전자가 동형 대립 유전자로 존재하므로, 이형 대립 유전자에 비해 상대적으로 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)이 낮고, 이로 인해 대립 유전자 배제 현상에 따른 대립 유전자로부터 재조합(재배열)되어 생성될 수 있는 B세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity)이 제한적이다.
면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제(allelic exclusion) 현상
대립 유전자 배제(allelic exclusion)은 이배체(diploid)의 두 대립 유전자 중에서 하나만 배타적으로 발현되어 정상적으로 기능하고 다른 대립 유전자는 발현하지 않는 현상을 말한다. 대립유전자 배제 현상은 두 가지 방식으로 하나의 대립유전자만 작동하도록 할 수 있다. 첫째는 염색질의 재구성(chromatin remodeling)에 의해 두 대립유전자 중 하나만 전사가 일어나도록 조절하는 방법이다. 둘째는 두 대립유전자가 모두 전사되지만 한 대립유전자에서 유래한 mRNA만 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하는 방법이다. 가장 잘 알려진 대립 유전자 배제 현상은 B세포(B cell, B lymphocyte)가 한 종류의 B세포 수용체(B cell receptor, BCR)만을 발현하는 과정이다.
일반적으로 면역글로불린 유전자는 B 세포의 발달 과정 중에 두 개의 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 재배열된다. 실질적으로 발현되는 유전형은 대립 유전자 중 하나로, 하나의 대립 유전자의 재배열이 정상적으로 진행된 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열은 진행되지 않는다. 또는 하나의 대립 유전자의 재배열 정상적으로 진행되지 않을 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열이 진행되게 된다. 이러한 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제 현상은 하나의 B 세포가 하나의 항원에 대해서만 특이성을 가지도록 보장한다.
이러한 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제 현상은 항체 레퍼토리의 다양성을 확보에 있어중요하다. 이는 대립 유전자 배제 과정 중 면역글로불린 유전자의 V, D 및 J 세그먼트 또는 V와 J 세그먼트의 재조합이 발생하고, 이에 따른 다양한 재조합에 의해 항체 레퍼토리의 다양성이 확보된다. 특히, 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)에 따라(동형 대립 유전자 또는 이형 대립 유전자 유무에 따라) 대립 유전자 배제 현상에 의해 형성되는 B 세포 레퍼토리의 다양성에 차이가 발생할 수 있다.
B 세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity) 및 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)
B세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity)은 B 세포의 발달 과정을 통해 면역글로불린 유전자가 재배열 되기 전에 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함된 다수의 V, D 및/또는 J 세그먼트의 다양성에 기인한다. 보다 구체적으로, B세포 레퍼토리 다양성은 일반적으로 부계 및 모계에서 유전된 대립 유전자의 다양성에 기인한다. 생식계 유전자 다양성 (germline gene diversity)은 부계 및 모계에서 유전된 대립 유전자의 다양성, 즉, 일부 V, D 및/또는 J 세그먼트의 차이에 따라 다양성이 발생한다. 이러한 생식계 유전자 다양성은 B 세포 레퍼토리의 다양성에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)은 B 세포의 발달 과정 중 V, D 및/또는 J 세그먼트의 재배열의 경우의 수를 증가시킬 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 면역글로불린 유전자는 대립 유전자 배제 현상에 따라 B 세포의 발달 과정 중에 두 개의 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 재배열된다. 실질적으로 발현되는 유전형은 대립 유전자 중 하나로, 하나의 대립 유전자의 재배열이 정상적으로 진행된 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열은 진행되지 않는다. 또는 하나의 대립 유전자의 재배열 정상적으로 진행되지 않을 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열이 진행되게 된다. 따라서, 대립 유전자가 동형 대립 유전자 또는 이형 대립 유전자 유무에 따라 형성되는 B세포 레퍼토리의 다양성에 차이가 발생할 수 있다. 특히, 대립 유전자가 이형 대립 유전자인 경우, 동형 대립 유전자에 비해 B세포 레퍼토리 다양성이 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자의 경우, 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함된 다수의 V, D 및/또는 J 세그먼트의 다양성이 존재하여 생식계 유전자 다양성을 증가시키기 때문이다. 따라서, 형질전환 동물을 이용한 인간항체 생산시 B세포 레퍼토리의 다양성 확보를 위해 생식계 유전자 다양성을 증가시킬 필요가 있고, 이를 위해 이형 대립 유전자가 유용하게 이용될 수 있다.
Hetero-allelic immunoglobulin
기존 항체 생산용 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 동형 대립 유전자(homo-allele)를 가지는 동형접합성(homozygous) 형질전환 동물로, 항체 레퍼토리의 다양성이 제한적이다. 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물의 개발이 필요하다. 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 형질전환 동물은 생식계 다양성이 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자의 차이에 기인한다. 또한, 이러한 이형 대립 유전자의 차이는 항체 레퍼토리의 다양성에 영향을 줄 수 있다.
- 이형 대립 유전자 간의 차이
일반적으로 포유동물이 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자는 각각 부계 및 모계에서 유전된 것으로 이형 대립 유전자이다. 두 대립 유전자의 차이는 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphism; SNP)에서부터 유전자의 일부 영역의 삭제, 삽입 또는 중복(duplication)에 이르기까지 다양하다(Chimge, N. O. et al. (2005) “Determination of gene organization in the human IGHV region on single chromosomes.” Genes Immun. 6, 186-193; Li, H. et al. (2002) “Genetic diversity of the human immunoglobulin heavy chain VH region.” Immunol. Rev. 190, 53-68; Kidd, M.J. et al. (2012) “The inference of phased haplotypes for the immunoglobulin H chain V region gene loci by analysis of VDJ gene rearrangements.” J. Immunol. 188, 1333-1340; 및 Watson, C.T. et al. (2013) “Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation.” Am. J.Hum.Genet. 92, 530-546).
이러한 차이는 일 개체 내의 두 대립 유전자에서뿐만 아니라 개체 간에서도 보여지며, 개체간의 연관성 또는 관련성에 따라서 그 차이가 더욱 다양할 수 있다(Watson, C.T. et al. (2014) “Sequencing of the human IG light chain loci from a hydatidiform mole BAC library reveals locus-specific signatures of genetic diversity.” Genes Immun. 16, 24-23; Pallares, N. et al. (1999) “The human immunoglobulin heavy variable genes.” Exp. Clin. Immunogenet. 16, 36-60; Lefranc, M.-P. et al. (2014) “IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® 25 years on.” Nucleic Acids Res. 43, D413-D422; Pallares, N. et al. (1998) “The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments.” Exp. Clin. Immunogenet. 15, 8-18; 및 Barbie, V. and Lefranc, M.P. (1998) “The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments.” Exp. Clin. Immunogenet. 15, 171-183).
예를 들어, 서로 다른 두 개체는 항체 레퍼토리의 다양성에 현저한 차이를 보이며, 이는 개체간의 V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation) 및 V 세그먼트 내에 다형성(polymorphism) 등의 차이에 의한 결과이다(Boyd, S.D. et al. (2010) “Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.” J. Immunol. 184, 6986-6992).
또 다른 예를 들면, 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race))에 속하는 일 개체가 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자는 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid))에 속하는 일 개체가 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자와 현저한 차이가 존재함이 확인되었다(Scheepers, C. et al. (2015) “Ability to develop broadly neutralizing HIV-1 antibodies is not restricted by the germline IG gene repertoire.” J. Immunol. 194, 4371-4378; 및 Wang, Y. et al. (2011) “Genomic screening by 454 pyrosequencing identifies a new human IGHV gene and sixteen other new IGHV allelic variants.” Immunogenetics 63, 259-265). 특히, 인종 간의 유전자의 차이는 이미 다수의 논문에서 다양성이 존재함이 보고된 바 있다 (Mallick, Swapan, et al. (2016) "The Simons genome diversity project: 300 genomes from 142 diverse populations." Nature 538, 201-206). 따라서, 서로 다른 인종 유래의 대립 유전자를 이용하는 경우, 대립 유전자의 다양성에 의해 B 세포 레퍼토리 다양성이 증가할 수 있으며, 다양한 신규 항체 도출할 수 있을 것이다.
- 서로 다른 개체 또는 사로 다른 인종 유래 이형 대립 유전자
이형 대립 유전자의 이용은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 가능하게 한다. 특히, 이형 대립 유전자의 차이에 따라, 항체 레퍼토리의 다양성은 달라질 수 있다. 이형 대립 유전자 간의 차이가 클수록 생성되는 항체 레퍼토리의 다양성은 증가할 수 있다. 이를 위해, 서로 다른 개체(인간 개체) 유래의 두 개의 대립 유전자가 항체 생산용 형질전환 동물에 이용될 수 있다. 구체적으로, 제1 인간 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인간 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 형질전환 동물을 이용해 인간항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체일 수 있다. 이 경우, 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)의 차이를 보인다. 이때, 이형 대립 유전자 간의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)은 다음과 같은 차이를 가질 수 있다(Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38(7), 459-470):
i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및/또는
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또는, 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자가 항체 생산용 형질전환 동물에 이용될 수 있다. 구체적으로, 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 형질전환 동물을 이용해 인간항체를 생산할 수 있다. 이 경우, 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)의 차이를 보인다. 이때, 이형 대립 유전자 간의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)은 다음과 같은 차이를 가질 수 있다(Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38(7), 459-470):
i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및/또는
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기와 같은 이형 대립 유전자간의 차이는 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)을 확보하여 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다.
i) 단일염기 다형성(SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation)
단일염기 다형성(SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이로, 보통 게놈에서 1000개의 염기서열 마다 1개 꼴로 나타나며, 이로 인해 유전적 다양성이 나타난다. SNP에 의한 동의 돌연변이는 게놈 내에 SNP가 존재하나 이에 의해 발현되는 아미노산에는 변화가 없는 돌연변이를 말한다. 동의 돌연변이의 경우, 게놈 내, 즉, DNA에 점 돌연변이(point mutation)이 발생하면, 이에 따라 전사된 RNA 서열에서도 변이가 존재하지만, 번역된 아미노산은 변이가 없다. 이에 반해, SNP에 의한 비동의 돌연변이는 게놈 내에 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 또는 삭제에 의한 SNP가 존재하며, 이러한 SNP에 의해 코돈 서열이 변경 되거나 프레임-쉬프트 돌연변이가 발생하여 발현되는 아미노산에 변형되는 돌연변이를 말한다. 비동의 돌연변이의 경우, 게놈 내, 즉, DNA 서열 내에 하나의 뉴클레오타이드가 치환, 삽입 또는 삭제되어 발생하면, 이에 따라 코돈 서열의 리딩 프레임(reading frame)이 변경되어 발현되는 단백질 또는 아미노산이 변형된다.
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation)
V 세그먼트의 대립 유전자 변이는 면역글로불린의 가변 영역에 존재하는 V 세그먼트들 중 일부 세그먼트에 하나 이상의 다형성(polymorphism) 변이를 포함하는 것을 말한다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 내에 V 세그먼트들 중 V1-69 세그먼트는 IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-69*03, IGHV1-69*04, IGHV1-69*05, IGHV1-69*06, IGHV1-69*07, IGHV1-69*08, IGHV1-69*09, IGHV1-69*10, IGHV1-69*11, IGHV1-69*12 및 IGHV1-69*13 등의 대립 유전자가 존재한다.
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV)
세그먼트의 복제수 변이는 면역글로불린의 가변 영역을 구성하는 V, J 및/또는 D 세그먼트들 중 일부 세그먼트가 삭제되거나 반복(중복)되는 것을 말한다. 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 내에 D 세그먼트 중 D1-14 세그먼트가 중복되어 존재할 수 있으며, 이 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자는 세그먼트의 복제수 변이를 가진다고 할 수 있다. 다른 예를 들면, 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 내에 V 세그먼트 중 V2-28 세그먼트가 삭제된 상태일 수 있으며, 이 경우, 면역글로불린 카파 유전자는 세그먼트의 복제수 변이를 가진다고 할 수 있다.
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV)
오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)은 mRNA로 전사되어 단백질로 번역될 가능성이 있는 염기서열을 의미한다. ORF의 복제수 변이는 면역글로불린 유전자 내에 일부 ORF가 삭제되거나 반복(중복)되는 것을 말한다.
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication)
면역글로불린 유전자는 큰 핵산 절편의 삭제, 삽입 또는 중복에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 유전자의 일 영역이 삭제 또는 중복될 수 있다. 또는, 면역글로불린 유전자에 일 영역이 삽입될 수 있다. 이때, 상기 일 영역은 적어도 8 내지 75 kb 길이의 큰 핵산 서열일 수 있다. 이러한 큰 핵산 절편의 삭제, 삽입 또는 중복에 의해 생성된 변이는 특정 세그먼트의 복제수 변이를 야기할 수 있다.
Hetero-allelic immunoglobulin heavy (IGH)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGHV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin Kappa (IGK)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGKV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin Lambda (IGL)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGLV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin heavy (IGH), Hetero-allelic immunoglobulin Kappa (IGK) and/or Hetero-allelic immunoglobulin Lambda (IGL)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 및 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또 다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또 다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제5 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제6 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제5 인종과 제6 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종 중 선택된 둘 이상의 인종은 동일한 인종일 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
이때, 상기 형질전환 동물은 비인간-동물로, 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
- 서로 다른 개체(또는 인종) 유래 이형 대립 유전자에 의한 항체 레퍼토리 다양성 증가
이형 대립 유전자에 따른 생식계 유전자 다양성은 B세포 레퍼토리의 다양성을 증가시킨다. 면역글로불린 유전자는 일반적으로 두 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 발현된다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, W. H. Freeman & Company). 즉, 면역글로불린 유전자의 두 대립 유전자(제1 대립 유전자 및 제2 대립 유전자) 중 임의로 선택된 하나의 대립 유전자(예를 들어, 제1 대립 유전자)에서 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)이 발생하여 정상적으로 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되면, 제2 대립 유전자는 발현되지 않고 재조합된 제1 대립 유전자만 발현한다. 그러나 제1 대립 유전자에서 정상적인 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되지 않으면, 제2 대립 유전자에서 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)이 발생한다. 제2 대립 유전자에 정상적인 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되면, 제1 대립 유전자는 발현되지 않고 정상적으로 재조합된 제2 대립 유전자만 발현한다. 이러한 특성을 면역글로불린 중쇄, 카파 및 람다 유전자에서 공통되게 나타난다. 일반적으로 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)은 면역글로불린 중쇄 유전자, 카파 유전자, 람다 유전자 순으로 발생하는 것으로 알려져 있다.
이러한 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)에 따른 단일 대립 유전자 발현 특징은 이형 대립 유전자를 이용하는 경우, 동형 대립 유전자를 이용하는 경우와 비교하여 재조합의 다양성을 증가시킬 수 있다. 다시 말해, 동일한 두 개의 대립 유전자에 의해 발생할 수 있는 재조합의 수에 비해 서로 다른 두 개의 대립 유전자에 의해 발생하는 재조합의 수가 훨씬 많으므로, 이형 대립 유전자에 의해 항체 레퍼토리의 다양성이 증가할 수 있다.
또한, V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)시 발생하는 세그먼트 접합부(junction)에서의 일부 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입 등이 생성된다. 이러한 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입은 접합부 다양성(Junctional diversity)을 발생시킨다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, W. H. Freeman & Company). 이러한 접합부 다양성(Junctional diversity)은 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)과 더불어 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다.
이 밖에도 Somatic hypermutation 및 class switching에 의해 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter12, W. H. Freeman & Company).
따라서, 항체 레퍼토리의 다양성은 이형 대립 유전자를 이용하는 경우 동형 대립 유전자에 비해 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자에 의한 V, D 또는 J 세그먼트의 다양성 증가; V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)의 수 증가; 세그먼트 다양성 및 재조합 증가에 따른 접합부 다양성 증가; 및 증가된 VDJ 조합 또는 VJ 조합에서 Somatic hypermutation 및/또는 class switching에 의한 다양성 증가에 의한 것이다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 제조될 수 있다.
이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법 및 염색체 교환(chromosome exchange)을 이용한 방법 등의 공지의 방법을 이용해 제작될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법은 미국등록특허 US 6,586,251, US 6,596,541, US 7,105,348, 및 미국공개특허 US 2004-0018626 A1 등을 참고할 수 있으며, 다만 이에 제한된 것은 아니다. 예를 들어, 상기 염색체 교환을 이용한 방법은 PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 및 한국 출원특허 KR 10-2019-0042840 등을 참고할 수 있으며, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간을 제외한 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구체예로서, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 염색체 교환(또는 교체, 치환) 기술을 이용해 제조될 수 있다. 이때, 상기 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 제1 형질전환 동물 세포 및 제2 형질전환 동물세포 일 수 있다.
상기 제1 형질전환 동물 세포는 다음의 방법으로 제조될 수 있다:
a) 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포 및 비인간-동물 세포 준비;
b) 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용한 마이크로세포 제조;
c) 상기 마이크로세포와 상기 비인간-동물 세포를 이용한 융합 비인간-동물 세포 제조; 및
d) 재조합효소 처리를 통해 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 동물 세포 제조.
a) 단계에서,
상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, loxp, FRT, attP, attB, ITR 등)가 포함되도록 조작된 세포이며, 상기 비인간-동물 세포는 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, loxp, FRT, attP, attB, ITR 등)가 포함되도록 조작된 세포일 수 있다.
이때, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소와 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소는 서로 페어링할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단은 재조합 요소로 각각 Lox66과 Loxm2/71을 포함할 수 있고, 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단은 재조합 요소로 각각 Loxm2/66과 Lox71을 포함할 수 있다. 이때, 상기 Lox66은 Lox71과 페어링할 수 있고, 상기 Loxm2/71은 Loxm2/66과 페어링할 수 있다.
b) 단계에서,
상기 마이크로세포는 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용해 공지의 방법을 통해 제조될 수 있다. 이는 문헌 “Thorfinn Ege et al 1974” 및 “Thorfinn Ege et al 1977”에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
c) 단계에서,
상기 융합 비인간-동물 세포는 b) 단계에서 제조된 마이크로세포와 상기 비인간-동물 세포를 접촉하여 융합시킴으로 제조될 수 있다. 이는 문헌 “Fournier RE et al 1977”; McNeill CA et al 1980”; 및 “Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)”에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
상기 융합 비인간-동물 세포는 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포의 인간 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체를 포함할 수 있다.
d) 단계에서,
c) 단계에서 제조된 상기 융합 비인간-동물 세포에 재조합 효소를 처리하여 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 제1 형질전환 동물 세포를 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 효소는 Cre recombinase일 수 있다. 이때, 상기 Cre recombinase는 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, Lox66과 Loxm2/71)와 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, Loxm2/66과 Lox71)를 인지할 수 있다. 특히, Cre recombinase는 재조합 요소의 페어링(예를 들어, Lox66와 Lox71의 페어링, Loxm2/71과 Loxm2/66의 페어링)을 인지하여 재조합을 유도할 수 있다. 이러한 재조합을 통해 인간화 면역글로불린 유전자좌가 생성될 수 있으며, 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 형질전환 동물 세포는 상기에 기술한 제1 형질전환 동물 세포의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조될 수 있다. 다만, 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포 대신에 제2 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용하여 제조될 수 있다. 이때, 제1 인종과 제2 인종은 서로 다른 인종일 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 인종이 코카시아 인종일 수 있고, 상기 제2 인종은 흑인 인종일 수 있다. 이때 a 단계에서, 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 코카시아 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 BJ cell (ATCC® CRL-2522™, ethnicity는 white임)일 수 있고, 상기 제2 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 흑인 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 WS1 cell (ATCC® CRL-1502™, ethnicity는 black임)일 수 있다.
체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer; SCNT)
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용한 체세포 핵 이식(SCNT)를 통해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 동물 세포 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 동물 세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 동물 세포의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 동물 세포의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 체세포 핵 이식은 상기 제1 형질전환 동물 세포 및 상기 제2 형질전환 동물 세포로부터 각각 공여 핵을 수득하고, 탈핵 난자에 상기 공여 핵을 각각 이식하여 각각의 복제란을 제작하고, 상기 복제란을 대리모의 자궁에 이식하여 각각의 산자를 발생시키는 것으로, 상기 SCNT는 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다. 상기 생산된 산자들은 서로 교배하여 이형접합성 형질전환 동물을 수득할 수 있다.
배아(embryo)로부터 발생
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 형질전환 배아(embryo)일 수 있다. 이때, 상기 형질전환 배아(embryo)는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 배아로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 배아 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 배아를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 배아의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 배아의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 제1 형질전환 배아 및 제2 형질전환 배아를 각각 대리모의 자궁에 착상시켜 각각의 배아로부터 산자를 발생시키고, 생산된 산자들을 서로 교배하여 수득된 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
배반포 주입 (Blastocyst Injection)
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용한 배반포 주입 (Blastocyst Injection)을 통해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 형질전환 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)일 수 있다. 이때, 상기 형질전환 배아 줄기세포는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 배아 줄기세포로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 배아 줄기세포 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 배아 줄기세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 배아 줄기세포의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 배아 줄기세포의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 제1 형질전환 배아 줄기세포 및 제2 형질전환 배아 줄기세포를 각각 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 각각의 산자를 발생시키고, 생산된 산자들을 서로 교배하여 수득된 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물을 이용한 항체 생산 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 방법은 이형접합성 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다.
상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다.
상기 대립 이형 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물을 이용한 항체 다양성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 방법은 이형접합성 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다.
상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다.
상기 대립 이형 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 방법은 상기 항원 주입을 통해 상기 이형접합성 형질전환 동물로부터 상기 항원에 특이적인 항체 집단 또는 B세포 집단을 수득할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체 집단 또는 B세포 집단은 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산된 항체 집단 또는 B세포 집단일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. 염색체 교환을 이용한 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 마우스의 제조 방법에 관한 것으로, 마우스의 면역글로불린 유전자가 인간화되고, 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 이형 대립 유전자를 가지는 형질전환 마우스에 관한 것이다. 하기의 설명은 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 서로 다른 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 대한 전반적인 실시예로, 이형접합성 형질전환 마우스 제조의 일 예일뿐, 이에 제한되지 않는다. 목적하는 이형접합성 형질전환 마우스의 제조는 하기에 기재된 실시예를 기초로 하여 다양하게 변경하여 실시함으로 생산할 수 있으며, 또한, 하기에 기재된 실시예 외에도 다양한 방법을 통하여 실시함으로써 생산할 수 있다.
실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 흑인(니그로, negro) 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
1. 벡터 설계
마우스 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체) 하기 위해, 각각의 가변 영역 양 말단에 loxp 삽입을 위해 벡터를 설계한다. 이때, 삽입된 loxp는 두 염색체(마우스 면역글로불린 유전자가 위치한 마우스 염색체 및 인간 면역글로불린 유전자가 위치한 인간 염색체) 사이의 재조합에 이용된다.
마우스 면역글로불린 유전자의 가변 영역 양 말단에 loxp를 삽입하기 위해 두 개의 벡터(제1 벡터 및 제2 벡터)를 설계한다.
상기 제1 벡터는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제1 상동성 암, piggyBac terminal repeat(PB-TR), 프로모터, loxm2/66(제1 RRS), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 프로모터, FRT 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제2 상동성 암을 포함한다.
상기 제2 벡터는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제3 상동성 암, 역위된(inverted) 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene), FRT, lox71(제2 RRS), 프로모터, neomycin 저항성 유전자(NeoR), piggyBac terminal repeat(PB-TR) 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제4 상동성 암을 포함한다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 양 말단에 loxp를 삽입하기 위한 두 개의 벡터(제3 벡터 및 제4 벡터)를 설계한다.
상기 제3 벡터는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제5 상동성 암, 프로모터, 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), lox66(제3 RRS), 프로모터, FRT, piggyBac terminal repeat(PB-TR) 및 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제6 상동성 암을 포함한다.
상기 제4 벡터는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제 7 상동성 암, piggyBac terminal repeat(PB-TR), 역위된(inverted) 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene), FRT, 역위된(inverted) 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), loxm2/71(제4 RRS), 프로모터, neomycin 저항성 유전자(NeoR) 및 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제 8 상동성 암을 포함한다.
이때, 상기 벡터 설계는 삽입 위치 및 loxp 종류에 따라 다양하게 설계될 수 있으며, 선별 과정을 위해서 다양한 요소를 추가 포함하도록 설계 변경이 가능하다.
2. Loxp가 삽입된 세포 제조
상기 벡터를 이용해 loxp가 삽입된 마우스 세포 및 흑인 인종에 속한 개체 유래의 인간 세포를 제조한다. 이때, 상기 벡터의 도입은 벡터가 여러 개일 경우, 순차적으로 또는 무작위적으로 수행 가능하며, 또한 동시에 도입 가능하다. 상기 벡터가 도입된 세포의 선별 과정은 벡터에 삽입된 요소에 따라 다양하게 변형 가능하다.
2-1. Loxp가 삽입된 마우스 세포 제조
사용되는 mouse embryonic stem cell(mESC)은 기본 배양액 2i 배지를 사용하였는데, 이 배양액은 FBS가 없는 N2B27배지에 MEK inhibitor PD0325901 (1 μM) and GSK3 inhibitor CHIR99021 (3 μM) (both from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1,000 U/ml LIF (Milliphore, Billerica, MA, USA)을 첨가한 기본 배양액(2i 배지)이며, 상기 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다. Transient transfection은 lipofectamine 3000 또는 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행한다. Transient transfection을 위해 1×106 cells을 FBS와 항생제가 들어가지 않은 배지에 준비한다. 여기에 제1 벡터 10μg을 첨가한 후 lipofectamin 3000 reagent를 섞고 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 한다. 또는 제1 벡터 10μg을 첨가하고 125V, 5ms, 2 pulse 로 transfection 한다. Transfection된 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다.
제1 벡터의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 mESC에 블라스티사이딘을 처리하여 세포의 생존 여부로 제1 벡터의 삽입을 확인한다. 블라스티사이딘 처리 후 생존 mESC를 수득하고, 수득한 mESC에 제2 벡터를 제1 벡터와 동일한 방법으로 transfection 한다. transfection된 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다. 제2 벡터의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 mESC에 G418(Life technologies, NY, USA)을 처리하여 mESC의 생존 여부로 제2 vector의 삽입을 확인한다. G418 처리 후 생존 mESC를 수득한다.
제1 벡터와 제2 벡터가 같은 염색체(마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 염색체)에 삽입되었는지를 확인하기 위해, G418 처리 후 수득한 mESC에 재조합효소인 flippase(FLP)를 처리한다. 제1 벡터 및 제2 벡터가 같은 염색체에 삽입된 경우, 두 벡터 내에 존재하는 FRT와 처리한 FLP에 의해 재조합이 유도되어 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 역위된다. 이를 확인하기 위해, FRT-FLP 재조합이 유도된 세포에 제오신을 처리하여 mESC의 생존 여부로 같은 염색체 내 제1 벡터 및 제2 벡터의 삽입을 확인한다. 제오신 처리 후 생존한 mESC를 수득한다. 수득한 mESC는 loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 mESC이다. 이러한 선별 과정은 일반적으로 체세포는 두 개의 대립 유전자를 가지므로, 두 개의 대립 유전자에 상기 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나만 삽입되는 경우를 제외하기 위한 것이다.
2-2. Loxp가 삽입된 인간 세포 제조
사용되는 인간 fibrobast인 WS1 cell (ATCC® CRL-1502™, ethnicity는 black임)은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM; ATCC® 30-2003™)배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다. Transient transfection은 lipofectamine 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행한다. Transient transfection을 위해 1×106 cells을 FBS와 항생제가 들어가지 않은 배지에 준비한다. 여기에 제3 벡터 10μg을 첨가한 후 lipofectamin 3000 reagent를 섞고 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 한다. 또는 제3 벡터 10μg을 첨가하고 150V, 7.5ms, 2 pulse로 transfection 한다. Transfection된 WS1 cell은 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다.
제3 벡터의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 WS1 cell에 블라스티사이딘을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 제3 벡터의 삽입을 확인한다. 블라스티사이딘 처리 후 생존 WS1 cell를 수득하고, 수득한 WS1 cell에 제4 벡터를 제3 벡터와 동일한 방법으로 transfection 한다. transfection된 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다. 제4 벡터의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 WS1 cell에 G418(Life technologies, NY, USA)을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 제4 벡터의 삽입을 확인한다. G418 처리 후 생존 WS1 cell를 수득한다.
제3 벡터 및 제4 벡터가 같은 염색체(인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 염색체)에 삽입되었는지를 확인하기 위해, G418 처리 후 수득한 WS1 cell에 재조합효소인 flippase(FLP)를 처리한다. 제3 벡터 및 제4 벡터가 같은 염색체에 삽입된 경우, 두 벡터 내에 존재하는 FRT와 처리한 FLP에 의해 재조합이 유도되어 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 역위된다. 이를 확인하기 위해, FRT-FLP 재조합이 유도된 WS1 cell에 제오신을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 같은 염색체 내 제3 벡터 및 제4 벡터의 삽입을 확인한다. 제오신 처리 후 생존한 WS1 cell를 수득한다. 수득한 WS1 cell은 lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 WS1 cell이다. 이러한 선별 과정은 일반적으로 체세포는 두 개의 대립 유전자를 가지므로, 두 개의 대립 유전자에 상기 제3 벡터 및 제4 벡터 중 하나만 삽입되는 경우를 제외하기 위한 것이다.
3. Loxp가 삽입된 WS1 cell를 이용한 마이크로세포(microcell) 제조
Micronuclei의 형성은 colcemid(Life technologies, Grand island, NY, USA)를 사용하여 진행한다. 상기 선별된 WS1 cell (lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 세포)를 1×106 cells가 되도록 배양하여 준비한 후, 다음날 20% FBS가 담긴 EMEM으로 배지를 교환한 후 colcemid 0.1μg/ml로 처리하고, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양한다. Micronucleation이 유도된 WS1 cell를 tryLE(Life technologies, Grand island, NY, USA)을 사용하여 떼어준 후, Serum-free EMEM로 씻어준 후 1000rpm, 5분간 원심분리(LABOGENE CO., Ltd, KOREA) 한다. 원심분리가 끝난 세포는 미리 데워 둔 serum-free EMEM : percoll ((Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1:1 (v:v))에 부유하고, cytochalsin B(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 10μg/ml이 되도록 처리한다. 16000g, 34℃ 내지 37℃에서 1시간 내지 1시간 30분 동안 원심분리(LABOGENE) 하여 whole cell과 microcell을 분리한다. 분리된 whole cell과 microcell을 50ml tube로 옮기고 serum-free EMEM을 넣어 준 후, 500g에서 10분간 원심분리 한다. 상등액은 조심스레 제거하고 tube표면에 붙은 pellet을 serum-free EMEM 10ml을 넣어주고 8μm filter(GE healthcare, CHICAGO, IL, USA)를 이용하여 8μm 이하 크기의 microcell을 분리한다. 분리한 microcell이 포함된 상등액은 다시 400g에서 10분간 원심분리 한다. 원심분리 된 microcell은 8μm filter 사용 방법과 동일한 방법으로 5μm filter를 사용한다. 최종 분리된 microcell은 Nicon eclipse TS100 광학 현미경(Nicon Instruments, Melville, NY, USA)을 통해 counting 한다. 이를 통해 WS1 cell로부터 마이크로세포를 수득한다.
4. 마이크로세포와 loxp가 삽입된 마우스 세포를 이용한 융합세포 제조
분리한 인간 마이크로세포와 recipient cell로 사용할 loxp가 삽입된 mESC(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 세포)를 준비한다. 상기 mESC에 TryLE를 처리하고 원심분리 한다. 원심분리 된 mESC를 1XDPBS로 Washing하여 주고 Hemacytometer를 사용하여 세포 수를 계산한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 융합은 HVJ-E protein(Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하며, suspension method 방법으로 진행한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 비율은 1:4가 되도록 사용한다. 각각 준비된 인간 마이크로세포와 mESC는 차가운 1X cell fusion buffer 500μl을 이용하여 washing 한다. Buffer에 담긴 인간 마이크로세포와 mESC를 300g로 5분간 4℃에서 원심분리 한다. mESC 2×105 cells 당 1X cell fusion buffer를 25μl씩 넣어주고, 인간 마이크로세포에도 동일한 volume의 1X cell fusion buffer를 넣어준다. mESC와 인간 마이크로세포를 섞어주고 HVJ-E protein을 5 내지 10μl을 넣어준 후 얼음에서 5분간 방치한다. Mixture를 37℃ water bath에서 15분간 방치한다. 이때 5분 간격으로 tapping 한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 세포 융합이 끝난 후 300g에서 5분간 원심분리 하여 남아있는 HVJ-E protein을 제거한다. 융합세포는 mESC의 배양 배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 제조된 융합세포는 인간 염색체(lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 삽입된 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 및 마우스 염색체(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 삽입된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체)를 포함하는 mESC이다.
5. 염색체 교환에 의한 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 세포 제조
상기 제조된 융합세포에 재조합 효소를 처리하여 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역과 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 교환(또는 교체)을 유도하여 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 융합세포, 즉, mESC를 제조한다. 이때, 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 유래 가변 영역 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포한하는 유전자좌이다.
1×106 cells의 융합세포(mESC)에 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100μl를 첨가한다. 여기에 pCMV-Cre(System Biosciences, LLC, Palo Alto, CA, USA) 벡터 10μg을 첨가하여 125V, 5ms, 2 pulse로 transfection 한다. 2i배지 300μl 첨가하여 융합세포와 잘 섞고, 100mm dish로 이동시키고 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간동안 배양한다.
Cre 재조합효소가 처리된 융합세포에 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체가 생성되었는지 확인하기 위해, Cre 재조합효소가 처리된 융합세포에 항생제(Puromycin, G418 및 네오마이신)를 처리한다. Cre 재조합효소가 처리된 융합세포는 Cre 재조합효소에 의해 인간 염색체(lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 삽입된 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 및 마우스 염색체(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 삽입된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 간의 재조합이 유도된다. 마우스 염색체 내에 제1 RRS와 인간 염색체 내에 제4 RRS가 서로 페어링하고, 마우스 염색체 내에 제2 RRS와 인간 염색체 내에 제3 RRS가 서로 페어링한다. 상기 RRS의 페어링을 Cre 재조합효소가 인지하여 재조합이 유도된다.
그 결과, 마우스 염색체의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역으로 교체된 제1 재조합 염색체(인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 마우스 염색체) 및 인간 염색체의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역으로 교체된 제2 재조합 염색체가 생성된다. 상기 제1 재조합 염색체는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역을 제외한 나머지 부분은 마우스 유전자(예를 들어, 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역은 마우스 유전자이다.)를 가진다. 상기 제2 재조합 염색체는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역을 제외한 나머지 부분은 인간 유전자(예를 들어, 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역은 인간 유전자이다.)를 가진다.
항생제(Puromycin, G418 및 네오마이신) 처리 후 생존한 세포(mESC)를 수득하였다. 수득한 세포는 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체를 포함하는 mESC이다.
수득한 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체를 포함하는 mESC에 piggyBac 트랜스포세이즈를 처리하여 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체에 포함된 RRS, 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), neomycin 저항성 유전자(NeoR), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 및 FRT를 제거한다. 이때, RRS, 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), neomycin 저항성 유전자(NeoR), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 및 FRT가 제거된 재조합 염색체를 포함하는 세포는 Fialuridine (FIAU)를 처리하여 선별한다.
상기 재조합 염색체는 RRS의 위치, 방향, 페어링(pairing)에 따라 다양하게 재조합 될 수 있다. 목적하는 재조합 염색체의 생산을 위해서, 앞서 설명은 벡터의 설계를 변경함으로써 생산 가능하다.
6. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC를 이용한 동형접합성 형질전환 마우스 제조
흑인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC를 이용해 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
상기에서 수득한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC는 배반포 주입(Blastocyst Injection)을 통해 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작한다. 제작된 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)는 대리모의 자궁에 착상시켜 마우스 산자를 발생시킨다. 생산된 마우스 산자는 키메릭 형질전환 마우스이고, 키메릭 형질전환 마우스의 교배를 이용해 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 동형접합성 형질전환 마우스는 게놈 상에 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 인간화(흑인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자의 가변 영역 치환(또는 교체))되어 있다. 이때, 상기 동형접합성 형질전환 마우스는 배반포 주입 외에도 다양한 방법으로 생산 가능하다.
실시예 1-2. 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 몽골인 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 몽골인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
해당 방법은 앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’과 동일하며, 다만, 실험에 사용된 인간세포는 몽골인 인종에 속하는 개체 유래의 인간 fibroblast인 OUMS-36 cell (JCRB1006.0, race는 Japanese임)이다. OUMS-36 cell은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA)배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다.
실시예 1-3. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
실시예 1-4. 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 코카시아 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 코카시아 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
해당 방법은 앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’과 동일하며, 다만, 실험에 사용된 인간세포는 코카시아 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 BJ cell (ATCC® CRL-2522™, ethnicity는 white임)이다. BJ cell은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC® 30-2003™) 배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다.
실시예 1-5. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
실시예 1-6. 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
상기 실시예에 기술한 이형접합성 형질전환 동물 외에, 상기 실시예를 기초로 서로 다른 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스를 생산할 수 있다.
앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’을 이용하여 다양한 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다. 이는 실험에 사용된 인간세포에 따라 다양화할 수 있다. 실험에 사용된 인간세포는 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian) 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race) 유래의 인간세포일 수 있으며, 이를 사용하여 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian) 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race) 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다.
상기에서 제조된 서로 다른 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 교배하여 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 이렇게 제조된 마우스는 코카시아 인종×몽골인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스 (코카시아 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스), 코카시아 인종×니그로 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 코카시아 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 코카시아 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×니그로 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 니그로 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 니그로 인종×리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스 또는 말레이 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스일 수 있다. 또한, 기술한 인종 외에 다른 인종 유래 인간세포를 이용하는 경우에도 동일한 방법으로 이형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다.

Claims (18)

  1. 인간화 면역글로불린 유전자좌(humanized immunoglobulin loci)를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물로,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region) 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역(constant region)을 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다른 이형 대립 유전자(hetero-alleles)로, 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하고,
    상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하며, 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable regions)이며,
    상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래이고,
    이때, 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종인,
    이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트, 하나 이상의 D 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 카파 유전자 또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 이형 가변영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가지는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물:
    i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
    ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
    iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
    iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
    v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타, 침팬지, 원숭이, 닭 또는 메추리인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  10. 인간화 면역글로불린 유전자좌(humanized immunoglobulin loci)를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물로,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region) 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역(constant region)을 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다른 이형 대립 유전자(hetero-alleles)로, 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하고,
    상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하며, 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable regions)이며,
    상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인간 개체 유래이고,
    이때, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체인,
    이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트, 하나 이상의 D 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 카파 유전자 또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 이형 가변영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가지는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물:
    i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
    ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
    iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
    iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
    v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
  16. 제10항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타, 침팬지, 원숭이, 닭 또는 메추리인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
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