PT2631654E - Ensaio de libertação de neuropéptidos para canais de sódio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ENSAIO DE LIBERTAÇÃO DE NEUROPEPTIDOS PARA CANAIS DE SÓDIO

Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido de Patente Provisional N.° 61/485.488, depositado a 12 de maio de 2011, Pedido U.S. com N.° de Série 13/155.491, depositado a 8 de junho de 2011 e Pedido U.S. com N.° de Série 13/236.117 depositado a 19 de setembro de 2011; cada um dos quais é incorporado no presente documento para referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se animais não humanos modificados geneticamente que expressam canais de sódio dependentes de voltagem humanos (Nav) ou fragmentos dos mesmos, em particular Navl.7 (Scn9A). Proporcionam-se ratinhos modificados geneticamente úteis para identificar e testar antagonistas para o tratamento de estados ou distúrbios de dor crónica associados com atividade e/ou função de Navl.7 aberrante. Proporcionam-se métodos para fabricar animais não humanos modificados geneticamente que expressam a proteína Nav1.7, e, alternativamente, que expressam uma proteína Navl.7 parcialmente humana. Proporcionam-se animais não humanos que não expressam uma proteína Navl. 7 endógena.

ANTECEDENTES

Os canais de sódio são proteínas de membrana integrais que formam canais iónicos na membrana plasmática de células excitáveis. Classificam-se como canais de sódio dependentes de voltagem (Nav) , que permitem o influxo de iões de Na+ que medeiam potenciais de ação em células excitáveis; e canais de sódio dependentes de ligando, que se unem a um ligando que desencadeia o influxo de iões levando a potenciais de ação semelhantes.

Os canais Nav, à semelhança dos canais de cálcio e potássio, estão compostos por uma subunidade α muito grande e complexa na superfície da célula que inclui quatro domínios (DI-DIV), cada um com seis segmentos de hélice α (S1-S6) e incluindo um poro que permite o influxo de iões Na+ para a célula (FIG. 1; veja-se também Clare 2010 Expert Opin. Investig. Drugs 19(1) :45-62) . Para os canais Nav, um único gene codifica todos estes domínios. O segmento transmembranar 4 (S4) em cada domínio dos canais Nav contém aminoácidos com carga positiva (FIG. 1) que atuam como um sensor de voltagem. A ansa intracelular que comunica os Domínios III e IV contém sequências que estão supostamente envolvidas na inativação. Os canais Nav interatuam com outras proteínas na superfície celular chamadas subunidades β, que estão envolvidas na cinética dos canais e com funções dependentes de voltagem. Os canais Nav exibem supostamente diversas propriedades funcionais e diferentes padrões de expressão, que implicam funções especializadas entre os canais e predispõe alguns a papéis na transmissão de sinais específicos, por exemplo, sinais de dor.

Apesar dos muitos esforços em elucidar as propriedades e funções dos canais Nav humanos, o grande tamanho e a natureza complexa da sua estrutura dificulta o estudo dos aspetos globais da sua atividade biológica e do seu envolvimento na resposta à dor. Esta dificuldade vê-se aumentada pelo fato de que a deleção global é letal; os cachorros Scn9A~/~ morrem pouco depois do nascimento, aparentemente devido a uma falha em alimentarem-se. Portanto, existe uma necessidade na técnica para composições e métodos que suplementem e potenciem os atuais sistemas in vitro (por exemplo, células transfectadas in vitro contendo construções que expressam canais Nav humanos em cultura) ao empregar abordagens mais biologicamente sensíveis para fabricar animais e células não humanos que incluem canais Nav totalmente humanos ou canais Nav quiméricos contendo fragmentos humanos específicos associados com a ativação de canais Nav e que podem funcionar na facilitação da resposta à dor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se animais, tecidos, e células não humanos geneticamente modificados que expressam uma subunidade a. da Nav humana, ou um fragmento funcional da mesma, na superfície de uma célula. Em várias formas de realização, a subunidade α da Nav é uma subunidade α de Navl. 7 .

Num aspeto, proporcionam-se animais não humanos geneticamente manipulados que expressam uma subunidade α da Navl. 7 na superfície de uma célula e proporcionam um sistema in vivo para identificar antagonistas do canal, e para identificar agentes terapêuticos para o tratamento de distúrbios ou síndromes da dor, tais como, por exemplo, dor crónica, eritromelalgia (IEM) e distúrbio de dor extrema paroxistica (PEPD).

Num aspeto, proporcionam-se animais não humanos geneticamente manipulados que expressam uma subunidade α da Navl. 7 na superfície de uma célula e proporcionam um sistema para testar seletivamente a eficácia e a toxicidade de uma terapêutica em formas mutantes ou variantes da Navl.7 humana. Numa forma de realização, o agente terapêutico é um composto que funciona como um bloqueador dos canais de sódio. Numa forma de realização específica, o composto é um composto sintético. Numa forma de realização, o composto sintético é selecionado a partir de lidocaína, mexiletina, carbamazepina, amitriptilina e bifenil pirazóis, ou uma combinação dos mesmos. Noutra forma de realização, o composto é uma toxina. Numa forma de realização especifica, a toxina é selecionada a partir da tetrodotoxina e da neosaxitosina ou uma combinação das mesmas.

Numa forma de realização, proporcionam-se animais não humanos geneticamente manipulados que expressam uma subunidade a da Nav1.7 na superfície de uma célula e proporcionam um sistema para testar seletivamente a funcionalidade (por exemplo, eficácia) e/ou toxicidade de combinações de agentes terapêuticos em formas mutantes ou variantes de uma Navl. 7 humana. Numa forma de realização, a combinação de agentes terapêuticos proporciona um efeito sinérgico após administração ao animal não humano geneticamente manipulado. Numa forma de realização especifica, a combinação de agentes terapêuticos compreende pelo menos dois de um composto sintético, uma toxina que ocorre naturalmente, ou uma proteína (por exemplo, um anticorpo anti-Nav) .

Num aspeto, proporcionam-se ratinhos geneticamente manipulados que expressam uma proteína de canal Nav, especificamente uma subunidade α da Navl. 7 humana. Os ratinhos estão geneticamente manipulados para incluir todo, ou substancialmente todo, um gene Nav1.7 humano.

Numa forma de realização, o gene Navl. 7 humano substitui um gene Navl.7 de ratinho endógeno no locus de Navl.7 de ratinho endógeno.

Num aspeto, proporcionam-se ratinhos geneticamente manipulados que expressam uma subunidade α de Navl. 7 quimérica, em que os ratinhos incluem uma subunidade α de Navl. 7 de ratinho com uma ou mais ansas de poro extracelulares contendo uma sequência correspondente a partir de um gene Navl.7 humano.

Numa forma de realização, a subunidade α da Navl. 7 quimérica compreende uma ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I que compreende a sequência correspondente do gene Navl. 7 humano. Noutra forma de realização, a subunidade α da Navl.7 quimérica compreende uma ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III que compreende a sequência correspondente do gene Navl.7 humano.

Num aspeto, proporciona-se um ratinho geneticamente manipulado que compreende substancialmente todo o ADN genómico humano que codifica uma proteína Navl. 7. Noutro aspeto, o ratinho geneticamente modificado compreende uma porção de ADN genómico humano, e o ratinho expressa uma proteína Navl. 7 quimérica.

Numa forma de realização, a porção de ADN genómico humano compreende a sequência humana que codifica a ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I do gene Navl . 7 humano. Noutra forma de realização, a porção de ADN genómico humano compreende a sequência humana que codifica a ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III do gene Navl. 7 humano.

Num aspeto, proporciona-se um ratinho geneticamente manipulado que é capaz de expressar uma proteína Navl. 7 humana ou quimérica na superfície de uma célula do ratinho.

Numa forma de realização, a Nav1.7 é quimérica e compreende uma ansa de poro extracelular humana. Numa forma de realização especifica, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos 5 e 6 do Domínio I. Noutra forma de realização específica, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Numa forma de realização, a célula é uma célula excitável. Noutra forma de realização a célula é uma célula não excitável. Numa forma de realização específica, a célula é um neurónio. Numa forma de realização específica, a célula é um neurónio de um gânglio espinal dorsal (DRG). Numa outra forma de realização específica, a célula é um neurónio de um gânglio simpático.

Numa forma de realização, o gene Nav1.7 humano ou quimérico está operativamente ligado a uma sequência líder humana ou de ratinho. Numa forma de realização, a sequência líder é uma sequência líder de ratinho.

Numa forma de realização, o gene Nav1.7 humano ou quimérico está operativamente ligado a um promotor humano ou de ratinho. Numa forma de realização específica, o promotor é um promotor do gene Navl. 7 de ratinho endógeno.

Numa forma de realização, o ratinho geneticamente modificado compreende um locus do gene Nav1.7 que codifica uma proteína Navl. 7 humana. Noutra forma de realização, o ratinho geneticamente modificado compreende um locus do gene Nav1.7 quimérico que compreende uma sequência humana que codifica uma ansa de poro extracelular que é substancialmente humana. Numa forma de realização específica, a sequência humana codifica uma ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I da proteína Navl. 7 quimérica. Numa outra forma de realização específica, a sequência humana codifica uma ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III da proteína Navl. 7 quimérica.

Numa forma de realização, o locus do gene Navl. 7 compreende um fragmento genómico humano que compreende cerca de 113 kb de ADN que codifica uma proteína Navl. 7 humana. Numa forma de realização específica, o locus do gene Navl. 7 compreende os exões 2 a 28 de um gene Navl. 7 humano.

Noutra forma de realização, o locus do gene Navl. 7 compreende uma sequência de ácidos nucleicos de um locus do gene Navl. 7 humano que compreende cerca de 10 kb de ADN que codifica uma ansa de poro extracelular de uma proteína Navl.7 humana. Numa forma de realização específica, a sequência de ácidos nucleicos compreende os exões 7 a 9 de um gene Navl.7 humano. Numa forma de realização especifica, a ansa de poro extracelular é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I de uma proteína Navl.7 humana.

Noutra forma de realização, o locus do gene Navl. 7 compreende uma sequência de ácidos nucleicos genómica humana que compreende cerca de 2,8 kb de ADN que codifica uma ansa de poro extracelular de uma proteína Navl.7 humana. Numa forma de realização específica, a sequência de ácidos nucleicos genómica humana compreende os exões 23 a 25 de um gene Navl. 7 humano. Numa forma de realização específica, a ansa de poro extracelular é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III de uma proteína Navl. 7 humana.

Numa forma de realização, o ratinho geneticamente modificado é capaz de expressar uma proteína Navl. 7 totalmente humana. Noutra forma de realização, o ratinho geneticamente modificado é capaz de expressar uma proteína Navl. 7 parcialmente humana. Numa forma de realização específica, o ratinho geneticamente modificado é capaz de expressar uma proteína Navl.7 quimérica que compreende uma sequência extracelular de uma proteína Navl. 7 humana.

Numa forma de realização, a proteína Navl. 7 parcialmente humana compreende uma ansa de poro extracelular que contém uma sequência humana. Numa forma de realização específica, a ansa de poro extracelular é selecionada a partir do grupo que consiste na ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I, e da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III. Numa forma de realização específica, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Noutra forma de realização, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Numa forma de realização, o ratinho compreende uma célula que expressa uma proteína Navl. 7 humana. Noutra forma de realização, o ratinho compreende uma célula que expressa uma proteína Navl. 7 quimérica que compreende uma ou mais ansas de poro extracelulares humanas. Numa forma de realização específica, as ansas de poro extracelulares humanas selecionam-se a partir do grupo que consiste na ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I, na ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III, e uma combinação das mesmas. Numa forma de realização específica, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Noutra forma de realização específica, a ansa de poro extracelular humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III. Numa forma de realização, a célula é uma célula excitável. Noutra forma de realização a célula é uma célula não excitável. Numa forma de realização específica, a célula é um neurónio. Numa forma de realização específica, o neurónio é um neurónio de DRG. Numa outra forma de realização especifica, o neurónio é um neurónio de um gânglio simpático.

Numa forma de realização, o ratinho compreende uma combinação de uma ou mais formas de realização e/ou aspetos descritos na presente divulgação.

Numa forma de realização, o ratinho geneticamente modificado é uma estirpe C57BL, numa forma de realização específica selecionada a partir de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/01a. Numa forma de realização específica, o ratinho geneticamente modificado é uma mistura de uma estirpe 129 supracitada e uma estirpe C57BL/6 supracitada. Numa outra forma de realização específica, o ratinho é uma mistura de estirpes 129 supracitadas, ou uma mistura de estirpes BL/6 supracitadas. Numa forma de realização específica, a estirpe 129 da mistura é uma estirpe 129S6 (129/SvEvTac).

Num aspeto, proporciona-se uma célula de ratinho que se isola a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento. Numa forma de realização, a célula é uma célula ES. Numa forma de realização, a célula é uma célula excitável. Noutra forma de realização, a célula é uma célula não excitável. Numa forma de realização, a célula é um neurónio. Numa forma de realização específica, o neurónio é um neurónio de DRG. Numa outra forma de realização específica, o neurónio é um neurónio de um gânglio simpático.

Num aspeto, proporciona-se uma célula; em que a célula carrega uma proteína Navl.7 que compreende uma sequência humana que corresponde a uma ansa de poro extracelular da proteína de canal Navl. 7 .

Numa forma de realização, a célula é uma célula neuronal. Numa forma de realização específica, a célula é selecionada a partir de uma célula de gânglio espinal dorsal (DRG), uma célula ganglionar trigeminal e um neurónio ganglionar simpático. Numa forma de realização específica, a célula é uma célula de DRG que expressa uma proteína Navl. 7 que compreende uma ansa humana selecionada a partir da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio II, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio IV, e uma combinação das mesmas. Numa forma de realização, a ansa humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Numa forma de realização especifica, a ansa humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Numa forma de realização, a célula é imortalizada.

Num aspeto, proporciona-se um embrião de ratinho, em que o embrião compreende uma célula ES dadora que é derivada a partir de um ratinho conforme escrito no presente documento.

Num aspeto, proporciona-se um vetor de direcionamento, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos genómica humana que contém um gene Navl.7 humano ou um fragmento do mesmo e uma cassete de seleção. Num aspeto, proporciona-se um vetor de direcionamento, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos genómica humana de -113 kb compreendendo os exões 2 a 28 de um gene Nav1.7 humano e uma cassete de higromicina. Noutro aspeto, proporciona-se um vetor de direcionamento, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos genómica humana de -10 kb compreendendo os exões 7 a 9 de um gene Navl. 7 humano e uma cassete de neomicina. Noutro aspeto, proporciona-se um vetor de direcionamento, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos genómica humana de -2,8 kb compreendendo os exões 23 a 25 de um gene Navl. 7 humano e uma cassete de neomicina.

Num aspeto, proporciona-se uma proteína Navl. 7 fabricada através de um ratinho conforme descrito no presente documento, em que a proteína Navl. 7 compreende uma sequência humana codificada por um fragmento de um gene Navl. 7 humano selecionado a partir do grupo que consiste nos exões 2 a 28, exões 7 a 9, e exões 23 a 25 de um gene Navl.7 humano. Num aspeto, o fragmento do gene Navl. 7 humano são os exões 2 a 28. Noutro aspeto, o fragmento do gene Navl.7 humano são os exões 7 a 9. Noutro aspeto, o fragmento humano do gene Navl. 7 humano são os exões 23 a 25.

Numa forma de realização, a proteína Navl.7 é reconstituída numa vesícula. Numa forma de realização, a

Navl. 7 está presente numa preparação de uma vesícula a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento.

Num aspeto, um método para fabricar um ratinho que expressa uma proteína Navl. 7 total ou parcialmente humanizada numa superfície de uma célula excitável, é proporcionado, compreendendo (a) modificar geneticamente uma célula ES de ratinho substituindo uma ou mais sequências de ADN de ratinho de Nav1.7 com uma ou mais sequências de ADN de Navl,7 humana para formar uma célula ES dadora de ratinho; (b) introduzir a célula ES dadora de ratinho num embrião de ratinho hospedeiro para formar um embrião modificado; (c) fazer a gestação do embrião modificado num ratinho adequado; e, (d) obter uma cria de ratinho que expressa a proteína Navl.7 total ou parcialmente humanizada na superfície de uma célula excitável da cria de ratinho.

Numa forma de realização, as uma ou mais sequências de ADN de Navl. 7 humano selecionam-se a partir dos exões 2 a 28 de um gene Nav1.7 humano, dos exões 7 a 9 de um gene Navl. 7 humano e dos exões 23 a 25 de um gene Navl. 7 humano.

Numa forma de realização, as uma ou mais sequências de ADN de Navl. 7 humano são na totalidade, ou substancialmente na totalidade, de uma sequência de ADN da Navl. 7 humana. Numa forma de realização especifica, a sequência são os exões 2 a 28 de um gene Navl. 7 humano. Numa outra forma de realização específica, a sequência são os exões 7 a 9 de um gene Nav1.7 humano. Numa outra forma de realização específica, a sequência são os exões 23 a 25 de um gene Navl.7 humano.

Num aspeto, proporciona-se um ratinho que expressa uma subunidade α da Navl. 7 humana a partir de um locus de Navl.7 de ratinho endógeno, em que o ratinho expressa uma subunidade β de Nav de ratinho endógena, e em que o ratinho expressa uma proteína Nav endógena selecionada a partir do grupo que consiste em Nav1.6, Navl.8 e Navl. 9.

Numa forma de realização, a subunidade α de Nav é uma subunidade α de Navl.7 variante, em que a variante compreende uma substituição de um aminoácido que compreende uma Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G, F1449V, ou uma combinação das mesmas.

Numa forma de realização, a subunidade α de Navl. 7 humana é uma subunidade α de Nav1.7 variante, em que a variante compreende uma substituição de um aminoácido que compreende uma R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K, A1632E, ou uma combinação das mesmas.

Numa forma de realização, a subunidade a. de Nav1.7 humana é uma subunidade α de Navl. 7 variante, em que a variante compreende uma substituição de um aminoácido que compreende uma F1200L, I1235L, ou uma combinação das mesmas.

Numa forma de realização, a subunidade α de Navl. 7 humana é uma subunidade α de Navl. 7 truncada, em que a proteína de subunidade α da Navl. 7 truncada termina num resíduo de aminoácido selecionado a partir de 259, 277, 328, 459, 693, 767, 830, 897, 1488, 1659 e 1689. Numa forma de realização específica, a proteína de subunidade α da Navl. 7 truncada termina no resíduo de aminoácido 693. Numa outra forma de realização específica, a proteína de subunidade α da Navl. 7 truncada termina no resíduo de aminoácido 1488.

Num aspeto, proporciona-se um método para fabricar uma linha celular que expressa uma sequência de Navl. 7 humana, compreendendo obter uma célula que expressa uma sequência de Navl. 7 humana a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento, isolar e clonar a célula, e manter a célula isolada e clonada em cultura. Numa forma de realização, o método compreende adicionalmente imortalizar a célula. Numa forma de realização, a célula é uma célula neuronal, por exemplo, um neurónio de um gânglio espinal dorsal (DRG).

Num aspeto, proporciona-se um método para fabricar uma linha celular imortalizada a partir de uma célula isolada de um ratinho conforme descrito no presente documento, compreendendo proporcionar uma célula isolada que expressa um canal Navl. 7 humano, quimérico ou variante humano, transfetar a célula isolada com um vetor que codifica um oncogene e um marcador selecionável (por exemplo, a neomicina), fazer crescer de células em cultura sob seleção para permitir a expansão de células que tenham sido transfetadas com o vetor retroviral, selecionando uma célula transfetada a partir da cultura que contém o vetor, isolar as células que contêm o vetor por tripsinização e limitando a diluição da célula transfetada em cultura, e criar uma linha celular clonal a partir do clone isolado que sobreviveu à seleção passando-o para uma nova cultura.

Numa forma de realização, a célula isolada é um neurónio. Numa forma de realização, a célula isolada é um neurónio de um DRG.

Numa forma de realização, o canal da Navl.7 humana é codificado pelos exões 2 a 28 de um gene Navl. 7 humano. Noutra forma de realização, o canal da Navl.7 quimérica é codificado por uma sequência genómica que compreende uma sequência a partir de um gene Navl. 7 humano que codifica uma sequência extracelular a partir de um gene Navl.7 humano.

Numa forma de realização, a sequência extracelular codifica uma sequência de ansa de poro. Numa forma de realização específica, a sequência de ansa de poro é selecionada a partir de uma ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I e uma ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III. Numa forma de realização específica, a ansa de poro é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Noutra forma de realização específica, a ansa de poro é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Num aspeto, proporciona-se um método de identificação de um antagonista de uma proteína Navl.7 humana, compreendendo a exposição de um ratinho conforme descrito no presente documento a um antagonista suspeito da Navl. 7 humana e a determinação do efeito do antagonista na função da Navl. 7 no ratinho.

Numa forma de realização, determinar o efeito do antagonista compreende medir a presença ou ausência de um potencial de ação após estimulação de uma célula compreendendo a Navl.7 humana.

Numa forma de realização, o antagonista é especifico para a Navl.7 e não exibe atividade antagonista com respeito à Nav1.6, Navl. 8 e Nav1.9.

Num aspeto, proporciona-se um método para determinar a atividade de ligação de um agente terapêutico que se liga a uma sequência de Navl.7 humana, compreendendo contactar o agente terapêutico com uma célula que expressa uma sequência de Navl. 7 humana, e determinar se o agente se liga à sequência de Navl. 7 humana. Numa forma de realização, a célula é derivada a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento.

Numa forma de realização, a célula é uma célula neuronal. Numa forma de realização especifica, a célula é selecionada a partir de uma célula de gânglio espinal dorsal (DRG), uma célula ganglionar trigeminal e um neurónio ganglionar simpático. Numa forma de realização especifica, a célula é uma célula de DRG que expressa uma proteína Navl.7 que compreende uma ansa humano selecionada a partir da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio II, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III, da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio IV e uma combinação das mesmas. Numa forma de realização, a ansa humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Numa forma de realização específica, a ansa humana é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Numa forma de realização, a célula é imortalizada.

Numa forma de realização, o agente terapêutico liga-se a uma Navl. 7 humana mas não se liga a uma sequência de Navl.7 selecionada a partir de um ratinho, rato, macaco e uma combinação dos mesmos.

Numa forma de realização, o agente terapêutico que se liga à sequência de Navl. 7 humana é selecionado a partir de uma benzodiazepina, uma benzazepinona, uma tetrodotoxina, uma bifenil pirazol dicarboxamida, um bloqueador de canais de sódio (por exemplo, amitriptilina, mexiletina, lidocaína, carbamazepina, bifenil pirazóis), um antagonista de piperidina de tipo T (por exemplo, Z123212), e análogos dos mesmos.

Numa forma de realização, o agente terapêutico que se liga à sequência de Navl. 7 humana é selecionado a partir de uma proteína de ligação que compreende um VH e/ou VL de uma imunoglobulina ou um fragmento de ligação a Navl. 7 da mesma, um anticorpo, um anticorpo biespecifico), uma imunoadesina, um ligandbody, um peptibody e um anticorpo de domínio (por exemplo, dAb). Numa forma de realização especifica, o agente terapêutico compreende uma imunoglobulina ou região variável de recetores de células T humanas. Numa forma de realização específica, o agente terapêutico é um anticorpo humano.

Num aspeto, proporciona-se um sistema in vitro para identificar um antagonista de uma proteína Navl. 7 humana, compreendendo isolar um componente que contém a Navl. 7 a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento, expor o componente a um antagonista suspeito da Navl.7 humana e determinar um efeito do antagonista na função da Navl.7. Numa forma de realização, o componente que contém a Navl. 7 é uma fração de membrana. Numa forma de realização, o componente que contém a Navl·7 é uma célula. Numa forma de realização, o componente que contém a Navl. 7 é um tecido do ratinho.

Numa forma de realização, determinar o efeito compreende medir a presença ou ausência de uma resposta dependente de Navl. 7 numa célula derivada a partir de um ratinho conforme descrito na presente divulgação. Numa forma de realização, a resposta é um potencial de ação.

Num aspeto, proporciona-se um método para a identificação de um modulador de canal de Navl. 7 humano, quimérico ou variante, compreendendo expôr um ratinho conforme descrito no presente documento a um composto de teste e detetar a atividade ou inatividade do canal de Navl.7. Numa forma de realização, o método compreende testar compostos de teste que modulam o fluxo de iões de sódio do canal de Navl. 7. Noutra forma de realização, o método compreende empregar tecnologia de fixação de membranas (patch clamp). Numa forma de realização especifica, o método é utilizado para identificar compostos fisiologicamente ativos úteis para o tratamento de uma condição de doença do cérebro. Numa forma de realização, a condição de doença do cérebro é selecionada a partir de convulsões, crises epiléticas, transtornos de pânico, transtornos de hiperatividade, depressão, transtornos obsessivo-compulsivos, demência, défices de memória, défice de atenção, obesidade, ansiedade, transtornos alimentares, dependência e utilização indevida de drogas, comportamento sexual alterado, doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Noutra forma de realização, a condição de doença relaciona-se com uma resposta visceral com origem no sistema limbico. Numa forma de realização, a resposta visceral é selecionada a partir de função respiratória e gastrointestinal.

Numa forma de realização, o modulador aumenta a atividade do canal da Navl. 7. Noutra forma de realização, o modulador diminui a atividade do canal da Nav1.7.

Numa forma de realização, o canal Navl · 7 humano, quimérico ou variante humano está associado com um distúrbio de dor. Numa forma de realização especifica, o distúrbio da dor seleciona-se a partir de insensibilidade congénita à dor (CIP), de eritromelalgia (IEM) e de distúrbio da dor extrema paroxistica (PEPD).

Num aspeto, proporciona-se um método para determinar a probabilidade de doença resultante de um canal Navl. 7 variante, compreendendo a identificação de mutações num ou mais sítios dentro de uma sequência de ácidos nucleicos de um gene Navl. 7 isolado a partir de uma célula de um ratinho conforme descrito no presente documento que codifica uma região N-terminal intracelular, uma ansa extracelular no domínio I, uma ansa de poro extracelular entre os domínios I e II, uma ansa intracelular entre os domínios II e III, uma região intermembranar do domínio II, ou qualquer combinação das mesmas, em que as mutações identificadas codificam uma proteína de canal Navl.7 que exibe uma alteração da função não observada num canal de Navl.7 não variante.

Numa forma de realização, o canal Navl. 7 humano, quimérico ou variante humano está associado com um distúrbio da dor. Numa forma de realização específica, o distúrbio da dor é selecionado a partir da insensibilidade congénita à dor (CIP), da eritromelalgia (IEM), e do distúrbio da dor extrema paroxistica (PEPD).

Num aspeto, proporciona-se um método para selecionar um grupo ou lote de uma preparação farmacêutica que contém um agente terapêutico que se liga a uma sequência da Navl. 7 humana, compreendendo expôr a célula que carrega uma proteína Navl. 7 que compreende pelo menos uma sequência humana contígua a uma amostra do grupo ou lote da preparação farmacêutica, determinar se a amostra se liga à célula, e selecionar um grupo ou lote que corresponde à amostra que se ligou a pelo menos uma sequência humana contígua. Numa forma de realização, a pelo menos uma sequência humana contígua codifica uma ansa de poro extracelular da proteína Navl.7. Numa forma de realização específica, a ansa de poro extracelular é selecionada a partir da ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I, da ansa que comunica os segmentos 5 e 6 do Domínio II, da ansa que comunica os segmentos 5 e 6 do Domínio III, da ansa que comunica os segmentos 5 e 6 do Domínio IV, e uma combinação das mesmas. Numa forma de realização, a ansa de poro extracelular é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I. Numa forma de realização, a ansa de poro extracelular é a ansa que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio III.

Numa forma de realização, o grupo ou lote de preparação farmacêutica compreende um composto de ligação a Navl.7 humana não proteico. Numa forma de realização, o grupo ou lote de preparação farmacêutica compreende uma proteína que se liga a uma Navl. 7 humana. Numa forma de realização específica, a preparação farmacêutica que compreende uma proteína inclui um anticorpo.

Numa forma de realização, a célula que carrega uma proteína Navl. 7 que compreende pelo menos uma sequência humana contígua está num ratinho no momento em que a amostra do grupo ou lote da preparação farmacêutica se expõe à célula.

Num aspeto, proporciona-se um método para determinar a eficácia de uma proteína de ligação a Navl. 7 para mediar uma resposta resultante de um estímulo nocicetivo, compreendendo expôr um ratinho conforme descrito no presente documento à proteína de ligação a Navl. 7 e medindo uma resposta nocicetiva do ratinho ao estimulo, em que uma resposta nocicetiva atenuada por parte do ratinho é um indicador da eficácia da proteína de ligação a Navl. 7.

Numa forma de realização, determina-se a eficácia para um grupo ou lote de preparação farmacêutica. Numa forma de realização específica, a eficácia determina-se como uma etapa de garantia de qualidade ou controlo de qualidade no fabrico da preparação farmacêutica para utilização em humanos .

Num aspeto, proporciona-se um método para acoplar seletivamente um recetor alvo na superfície de uma célula neuronal, compreendendo: contactar uma célula isolada a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento com um ou mais mediadores inflamatórios, desse modo acoplando seletivamente o recetor alvo; e, medir a libertação de um neuropéptido.

Numa forma de realização, o método emprega-se como um ensaio funcional para selecionar um antagonista para o recetor alvo.

Numa forma de realização, o recetor alvo é um canal de sódio. Numa forma de realização específica, o recetor alvo é a Navl. 7 .

Numa forma de realização, a célula neuronal é uma célula de um gânglio espinal dorsal (DRG).

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios são selecionados a partir da prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protões, pH baixo e um fator neurotrófico.

Numa forma de realização, o neuropéptido é um péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP).

Numa forma de realização, proporciona-se um método para acoplar seletivamente uma proteína Nav1.7 na superfície de um DRG, compreendendo expôr um DRG isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento, a um o mais mediadores inflamatórios acoplando seletivamente desta forma a Nav1.7 e medindo a libertação de CGRP.

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios compreendem a prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina.

Numa forma de realização, o método emprega-se como um ensaio funcional para selecionar um antagonista para a Navl.7. Numa forma de realização específica, o antagonista é um anticorpo.

Num aspeto, proporciona-se um método para identificar um antagonista da Navl. 7. compreendendo: proporcionar ex vivo uma célula que expressa uma proteína Navl. 7 humana ou quimérica; contactar a célula com um agente que se ligue à proteína Navl. 7 humana ou quimérica; após um posterior período de tempo, contactar a célula com um ou mais mediadores inflamatórios; após outro posterior período de tempo, determinar a quantidade de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) libertado pela célula; e, comparar a quantidade de CGRP libertado pela célula na presença do aqente que se liga à proteína Navl. 7 humana ou quimérica a uma amostra de referência, em que um aumento da libertação de CGRP sobre a amostra de referência indica inibição da Nav1.7; e, determinar se o agente inibe a função da Navl. 7 .

Numa forma de realização, a célula pode ser uma célula não humana, preferivelmente uma célula animal não humana. Numa forma de realização adicional, a célula pode ser uma célula humana ou não humana expressando exogenamente a proteína Nav1.7 humana ou quimérica. "Expressão exógena" significa desde modo que a célula se modifica geneticamente para expressar a proteína Navl. 7 humana ou quimérica e não expressaria esta proteína sem modificação genética. A modificação genética pode incluir a introdução de um gene codificando a proteína Navl.7 humana ou quimérica numa célula que não contenha tal gene no seu genoma (tal como uma célula não humana), ou qualquer dos seus precursores. A modificação genética pode também incluir a introdução de um gene codificando a proteína Navl. 7 humana ou quimérica numa célula que já contenha tal gene no seu genoma (tal como uma célula humana), ou qualquer dos seus precursores, onde o gene introduzido está sob o controlo de um promotor ou promotores diferentes dos que controlam dito gene já presente no genoma. Como um exemplo, as células humanas expressando exogenamente uma proteína Nav1.7 humana ou quimérica podem ser células HEK293 manipuladas para expressar de forma estável a proteína Navl. 7.

Numa forma de realização, o agente é um anticorpo. Numa forma de realização específica, o anticorpo é humano. Numa forma de realização, o agente é um péptido. Numa forma de realização, o agente é um composto orgânico não proteico. Numa forma de realização, o composto orgânico não proteico é selecionado a partir do grupo que consiste nos ácidos 2-alquilo alcanóicos (por exemplo, ácido valproico e análogos do mesmo), ácidos 3-alquilamino alcanóicos (por exemplo, gabapentina e análogos da mesma), l-benzazapin-2-onas, bupivicaína, capsaicinas, flecainida, flunarizina, lidocaína, mexiletina, fenitoína, propafefenona, prostaglandinas, quinidina, saxitoxina, tetracaína, tetrodotoxina e análogos das mesmas.

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios são selecionados a partir de prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protões, pH baixo e um fator neurotrófico. Numa forma de realização especifica, o um ou mais mediadores inflamatórios são a prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina.

Numa forma de realização, a célula é uma célula neuronal. Numa forma de realização específica, a célula neuronal é uma célula de um gânglio espinal dorsal (DRG). Numa forma de realização específica, a célula é uma célula de DRG de ratinho. Numa forma de realização, a célula isola-se a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento. Numa forma de realização específica, a célula é uma célula de DRG isolada a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento.

Numa forma de realização, a quantidade de CGRP libertada na presença do agente que se liga à proteína Navl.7 humana ou quimérica é cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de, 6 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 9 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 15 vezes, ou cerca de 15 vezes até cerca de 30 vezes mais elevada que a amostra de referência. Numa forma de realização específica, o agente é uma molécula orgânica não proteica. Numa forma de realização, a molécula não proteica é uma toxina selecionada a partir da tetrodotoxina e ProTX-II. Numa forma de realização específica, o agente é um anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo anti- Navl.7.

Numa forma de realização, a amostra de referência contém um bloqueador de canais de sódio. Numa forma de realização específica, o bloqueador de canais de sódio inibe uma ou mais funções de uma proteína de canal de sódio ligando-se e inibindo uma abertura de poro extracelular da proteína de canal. Numa forma de realização, o bloqueador de canais de sódio que inibe uma ou mais funções de uma proteína de canal de sódio ligando-se e inibindo uma abertura de poro extracelular da proteína de canal é uma toxina baseada em alcaloide (por exemplo, a tetrodotoxina ou a saxitoxina). Numa forma de realização específica, o bloqueador de canais de sódio inibe uma ou mais funções de um canal de sódio ligando-se e inibindo uma porção intracelular do canal. Numa forma de realização, o bloqueador de canais de sódio que inibe uma ou mais funções de um canal de sódio ligando-se e inibindo uma porção intracelular do canal é um anestésico local (por exemplo, lidocaina). Numa forma de realização, o bloqueador de canais de sódio que inibe uma ou mais funções de um canal de sódio ligando-se e inibindo uma porção intracelular do canal é um anticonvulsivo (por exemplo, gabapentina, carbamazepina, clonazepam, divalproex, lamotrigina, fenitoína, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato e ácido valproico).

Numa forma de realização, a amostra de referência contém uma toxina isolada a partir do veneno de um artrópode, um invertebrado, um peixe, ou um réptil. Numa forma de realização especifica, o veneno tóxico é derivado a partir de uma tarântula (por exemplo, ProTX-II).

Num aspeto, proporciona-se um método para identificar um antagonista da Nav1.7, compreendendo proporcionar ex vivo uma célula de gânglio espinal dorsal (DRG) que expressa uma proteína Nav1.7 humana ou quimérica; contactar o DRG com um agente que se liga à proteína Navl. 7 humana ou quimérica e esperar um período de tempo, e, após o primeiro período de tempo, contactar o DRG com um ou mais mediadores inflamatórios e esperar um segundo período de tempo, determinar a quantidade de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) libertado a partir do DRG, comparar a quantidade de CGRP libertado pelo DRG na presença do agente que se liga à proteína Navl. 7 humana ou quimérica a uma amostra de referência, em que um aumento da libertação de CGRP sobre a amostra de referência indica inibição da Nav1.7, e determinar se o agente inibe a função da Navl. 7 no DRG.

Numa forma de realização, a célula de DRG pode ser uma célula de DRG não humana. Numa forma de realização adicional, a célula de DRG pode ser uma célula de DRG humana ou não humana expressando exogenamente a proteína Navl. 7 humana ou quimérica. "Expressão exógena" significa desde modo que a célula é modificada geneticamente para expressar a proteína Navl. 7 humana ou quimérica e não expressaria esta proteína sem modificação genética. A modificação genética pode incluir a introdução de um gene codificando a proteína Navl. 7 humana ou quimérica numa célula de DRG que não contenha tal gene no seu genoma (tal como uma célula de DRG não humana) , ou qualquer dos seus precursores. A modificação genética pode também incluir a introdução de um gene codificando a proteína Navl. 7 humana ou quimérica numa célula de DRG que já contenha tal gene no seu genoma (tal como uma célula de DRG humana), ou qualquer dos seus precursores, em que o gene introduzido está sob o controlo de um promotor ou promotores diferentes dos que controlam dito gene já presente no genoma.

Numa forma de realização, o agente é um anticorpo. Numa forma de realização específica, o anticorpo é humano. Numa forma de realização, o agente é um péptido. Numa forma de realização, o agente é um composto orgânico.

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios são a prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina.

Numa forma de realização, o DRG isola-se a partir de um membro do grupo que consiste em humanos, ratinhos, ratos ou macacos. Numa forma de realização específica, o DRG é isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento. Numa forma de realização, o ratinho compreende uma sequência nucleotidica codificando uma subunidade α de Navl. 7 humana ou fragmento da mesma ligado operativamente a um promotor da Nav.

Num aspeto, proporciona-se um complexo ex vivo·, em que o complexo ex vivo compreende uma célula de ratinho que expressa uma proteína Navl. 7 compreendendo um domínio transmembranar de ratinho e um domínio de ansa humano; e, um antagonista de Navl. 7 ligado à ansa humana. Numa forma de realização, a célula de ratinho é uma célula imortalizada. Numa forma de realização, o antagonista de Navl. 7 compreende um domínio variável de imunoglobulina que se liga especificamente a uma ansa de Nav1.7 humana mas não a uma ansa de Navl. 7 de ratinho.

Num aspeto, proporciona-se um complexo ex vivo; em que o complexo ex vivo compreende uma membrana ou fragmento do mesmo que compreende uma proteína Navl. 7 que compreende um domínio transmembranar de ratinho e um domínio de ansa humano; e, um antagonista de Navl. 7 ligado à ansa humana. Numa forma de realização, o antagonista de Navl. 7 compreende um domínio variável de imunoglobulina que se liga especificamente a uma ansa de Navl.7 humana mas não a uma ansa de Navl. 7 de ratinho.

Qualquer das formas de realização e aspetos descritos no presente documento podem ser utilizados conjuntamente uns com os outros, a menos que de outro modo especificado ou aparente a partir do contexto. Outras formas de realização tornar-se-ão aparentes para os peritos na especialidade a partir de uma revisão da descrição que segue. Deve entender-se que tanto a precedente descrição geral e a seguinte descrição detalhada são simplesmente exemplares e explanatórias e não são restritivas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 mostra um diagrama de um canal Nav. A FIG. 2 mostra o locus do gene Navl. 7 (topo) com os exões numerados por cima e por debaixo do locus. Utilizou-se o vetor de direcionamento de Navl. 7 de ratinho (meio) para substituir uma região de 81 kb do locus endógeno abrangendo os exões 6-28 com uma cassete de neomicina flanqueada por sítios loxP. 0 alelo direcionado resulta num locus de Navl. 7 endógeno eliminado (fundo) A FIG. 3 mostra o locus de Navl. 7 endógeno eliminado (topo) direcionado com um vetor de direcionamento de Navl. 7 humano (meio) . 0 locus endógeno eliminado previamemente direcionado com uma cassete de neomicina substituiu-se com um vetor de direcionamento compreendendo os exões 2-28 de um locus de Nav1.7 humano. 0 alelo direcionado resulta num locus endógeno que expressa a proteína Navl. 7 humana. A FIG. 4 mostra o locus de Navl. 7 de ratinho (topo) direcionado com um vetor de direcionamento DI/S5-S6 de Navl.7 humana (meio). 0 alelo direcionado resulta num locus de Navl.7 endógeno parcialmente humanizado que expressa uma proteína Nawl. 7 quimérica que inclui uma ansa de poro S5-S6 extracelular humana no Domínio I. A FIG. 5 mostra o locus de Navl. 7 de ratinho (topo) direcionado com um vetor de direcionamento DIII/S5-S6 de Navl. 7 humana (meio) . 0 alelo direcionado resulta num locus de Navl. 7 endógeno parcialmente humanizado que expressa uma proteína Navl. 7 quimérica que inclui uma ansa de poro S5-S6 extracelular humana no Domínio III . A FIG. 6A mostra a latência da retirada da cauda (em segundos) como resposta a um estímulo nocicetivo (sacudidela da cauda) em coortes de machos e fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos heterozigóticos para um gene Navl.7 humano de comprimento completo (Scn9Ahum/+) . A FIG. 6B mostra o limiar de retirada da cauda (em gramas) como resposta a um estímulo nocicetivo (aperto da cauda) em coortes de machos e fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos heterozigóticos para um gene Navl.7 humano de comprimento completo (Scn9Ahum/+) . A FIG. 6C mostra a latência da retirada da pata (em segundos) como resposta a um estímulo nocicetivo (placa quente a 52 °C e 55 °C) em coortes de machos e fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos heterozigóticos para um gene Navl. 7 humano de comprimento completo (Scn9Ahum/+) . A FIG. 7A mostra a latência da retirada da cauda (em segundos) como resposta a um estímulo nocicetivo (sacudidela da cauda) em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Navl. 7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humana comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) . A FIG. 7B mostra o limiar da retirada da cauda (em gramas) como resposta a um estímulo nocicetivo (aperto da cauda) em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Navl. 7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humano comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) . A FIG. 7C mostra a latência da retirada da pata (em segundos) como resposta a um estimulo nocicetivo (placa quente a 52 °C e 55 °C) em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Navl. 7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humana comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) . A FIG. 7D mostra a alodinia mecânica medida como limiar da retirada da pata (em gramas) antes (linha de referência) e depois (pós-CFA) da administração de adjuvante de Freund completo em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Nav1.7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humana comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) . A FIG. 7E mostra a hiperalgesia térmica medida como limiar da retirada da pata (em gramas) antes (linha de referência) e depois (pós-CFA) da administração de adjuvante de Freund completo em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Nav1.7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humana comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) . A FIG. 7F mostra a percentagem de alteração desde a linha de referência como resposta a estímulos nocicetivos em coortes de fêmeas de tipo selvagem (Scn9A+/+) e ratinhos homozigóticos para o gene Navl. 7 quimérico contendo uma ansa de poro extracelular humana comunicando os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (Scn9A3'1/3'1) A FIG. 8 mostra a concentração (pg/ml) de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) libertado a partir de três populações de gânglios espinais dorsais (DRG) isolados a partir de ratinhos de tipo selvagem como resposta à exposição a uma mistura inflamatória (IM), 20 minutos de pré- incubação com TTX a 1 μΜ seguido de adição de uma mistura inflamatória (TTX a 1 μΜ e IM) ou incubação com TTX a 1 μΜ e uma mistura inflamatória durante 20 minutos (TTX a 1 μΜ + IM).

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção não está limitada a métodos particulares, e as condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada no presente documento é para o propósito de descrição de formas de realização particulares apenas, e não se destina a ser limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações. A menos que definido de outra forma, todos os termos e frases utilizados no presente documento incluem os significados que os termos e frases obtiveram na técnica, a não ser que o contrário seja claramente indicado ou claramente aparente a partir do contexto no qual o termo ou frase é utilizada. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todas as publicações mencionadas estão incorporadas no presente documento para referência. A frase "vetor de direcionamento" ou "construção de direcionamento" inclui uma molécula de polinucleótido que compreende uma região de direcionamento. Uma região de direcionamento compreende uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência numa célula, tecido ou animal alvo e permite a integração da construção de direcionamento numa posição dentro do genoma da célula, tecido ou animal através de recombinação homóloga.

Também se incluem regiões de direcionamento que direcionam utilizando sítios de reconhecimento de recombinases específicas de sítio (por exemplo, sítios lox ou FRT).

Numa forma de realização específica, a construção de direcionamento compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos ou gene de particular interesse, um marcador selecionável, sequências de controlo ou reguladoras, e outras sequências de ácidos nucleicos que permitem a recombinação mediada através da adição exógena de proteínas que ajudam ou facilitam a recombinação envolvendo tais sequências. Numa outra forma de realização específica, a construção de direcionamento compreende adicionalmente um gene de interesse, em que o gene de interesse é um gene heterólogo que codifica uma proteína que tem uma função semelhante a uma proteína codificada pela sequência endógena. 0 termo "substituição" inclui em que uma sequência de ADN é colocada num genoma de uma célula de tal forma a substituir uma sequência dentro de um genoma, no locus da sequência genómica, com uma sequência heteróloga (por exemplo, uma sequência humana num ratinho). A sequência de ADN colocada desta forma pode incluir uma ou mais sequências reguladoras que são parte do ADN de origem utilizado para obter a sequência assim colocada (por exemplo, promotores, potenciadores, regiões 5'- ou 3'- não traduzidas, etc.) . Por exemplo, em várias formas de realização, a substituição é uma substituição de uma sequência endógena para uma sequência heteróloga que resulta na produção de um produto de gene a partir da sequência de ADN assim colocada (compreendendo a sequência heteróloga), mas não expressão da sequência endógena; a substituição é de uma sequência genómica endógena com uma sequência de ADN que codifica uma proteína que tem uma função semelhante à da proteína codificada pela sequência genómica endógena (por exemplo, a sequência genómica endógena codifica um canal de Nav, e o fragmento de ADN codifica um ou mais canais de Nav humanos) . Em várias formas de realização, um gene endógeno ou fragmento do mesmo é substituído com um gene humano correspondente ou fragmento do mesmo. Um gene humano correspondente ou fragmento do mesmo é um gene ou fragmento humano que é um ortólogo de, ou é substancialmente idêntico ou o mesmo em estrutura e/ou função, que o gene endógeno ou fragmento do mesmo que é substituído. A frase "canal de Nav" inclui um canal de sódio dependente de voltagem, por exemplo, um canal Nav1.7. Os genes de canais Nav incluem uma subunidade α que se expressa na superfície da célula e serve como um acesso que permite o afluxo de Na+ para dentro da célula através de um poro formado por segmentos transmembranares que são parte da subunidade α. A subunidade α associa-se com outras subunidades, por exemplo, βΐ, β2, β3 e β 4 para levar a cabo potenciais de ação. Existem vários genes de canais de Nav diferentes e estes podem categorizar-se pela sensibilidade à toxina do peixe-balão (tetrodotoxina, ou TTX). Os canais sensíveis a TTX, isto é aqueles bloqueados por baixas concentrações nanomolares de TTX incluem Navl.l, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Navl. 6 e Navl. 7. Os canais resistentes a TTX, isto é, aqueles bloqueados por concentrações μΜ de TTX, incluem Nav1.5, Navl.8 e Navl. 9. Dentro dos genes de canais de Nav, descreveram-se subtipos ou mutantes em sujeitos humanos. A modo de ilustração, proporcionam-se sequências nucleotídicas e de aminoácidos de um gene Navl. 7 humano nas SEQ ID NOs: 42 e 43, respetivamente. Os peritos na especialidade após ler a presente divulgação reconhecerão que um ou mais genes de canais de Nav endógenos num genoma (ou todos) podem ser substituídos por um ou mais genes de canais de Nav heterólogos (por exemplo, subtipos ou mutantes, genes de outra espécie, formas quiméricas, etc.). 0 termo "variantes" inclui variações de uma sequência normal de um gene resultando numa série de formas diferentes do mesmo gene. As diferentes formas podem compreender diferenças de até, por exemplo, 20 aminoácidos na sequência de uma proteína de um gene. Por exemplo, podem-se considerar os alelos como sequências de ADN alternativas no mesmo locus génico físico, que podem ou não resultar em características diferentes (por exemplo, características fenotipicamente hereditárias) tais como a suscetibilidade a determinadas doenças ou condições que não resultam em outros alelos para o mesmo gene ou resultam em diversos graus nos outros alelos.

Uma "célula excitável" inclui uma célula que está envolvida em gerar potenciais de ação aquando da estimulação. Células excitáveis exemplares incluem neurónios, miocitos e eletrocitos. As células excitáveis alteram o potencial elétrico das suas membranas aquando da estimulação de maneira súbita e reversível para transmitir sinais elétricos a outras células excitáveis proporcionando assim comunicação célula-a-célula. Por exemplo, a contração muscular voluntária é controlada por potenciais de ação através de neurónios que enervam as fibras musculares. Em várias formas de realização, os animais não humanos geneticamente modificados da presente invenção exibem potenciais de ação controlados pela expressão das proteínas Navl.7 humanas e/ou quiméricas na superfície de neurónios, em vários tipos de tecidos, por exemplo músculo, dentro do animal não humano.

Um "neurónio" inclui uma célula nervosa e é uma célula especializada que exibe, por exemplo, excitabilidade elétrica. Os neurónios, conforme descrito no presente documento, formam junções de membrana complexas com outros neurónios para formar um contato permitindo assim que um neurónio transmita sinais a outro. Tais contactos entre neurónios referem-se na técnica como sinapses, que podem ser excitatórias ou inibitórias. Os neurónios podem ser uma parte do sistema nervoso central de um animal ou encontrar-se na periferia do animal noutros tecidos nervosos especializados, por exemplo, gânglios. Por exemplo, alguns neurónios situam-se em órgãos sensoriais tais como a retina e a cóclea. 0 termo "disrupção" é utilizado para referir-se a quando um fragmento de ADN se recombina com uma sequência homóloga endógena, por exemplo um gene ou locus génico. Estas disrupções de sequência podem incluir inserções, deleções, substituições, recolocações, sentido errado, ou uma deslocação de quadro de leitura de uma sequência de ADN, ou qualquer combinação das mesmas. As inserções podem incluir a inserção de genes inteiros ou fragmentos de genes, por exemplo, exões que podem ter uma origem diferente à da sequência endógena. A disrupção de uma sequência homóloga endógena pode alterar a proteína produzida a partir de um gene normal de tal forma que é inibida por inteiro ou em parte, ou pela produção de proteína a partir de um gene interrompido pode ser potenciada por cima do nível normal de produção a partir da sequência homóloga endógena não interrompida. Numa forma de realização, a disrupção resulta numa falta de proteína funcional produzida a partir da sequência homóloga endógena. Noutra forma de realização, a disrupção não tem efeito significativo na expressão do gene. A frase "locus endógeno" refere-se aos locus genéticos de ocorrência natural encontrados num animal hospedeiro de tipo selvagem que é interrompido, eliminado, substituído ou alterado. Numa forma de realização, o locus endógeno é eliminado. Noutra forma de realização, o locus endógeno é alterado, em que uma porção do locus endógeno é substituída por uma seguência heteróloga. Noutra forma de realização, todo ou substancialmente todo o locus endógeno é substituído por um locus heterólogo. Numa forma de realização, o locus heterólogo é um locus humano. 0 termo "heterólogo" guando utilizado em conjunto com um polipéptido ou gene refere-se a um polipéptido tendo uma seguência de aminoácidos ou um ADN codificando o polipéptido gue não se encontra no animal hospedeiro não humano. Assim, um ratinho geneticamente modificado tendo um gene de canal de Nav pode descrever-se como tendo um gene de canais de Nav heterólogo. 0 canal de Nav substituído pode ser detetado utilizando uma variedade de métodos incluindo, por exemplo, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RPLF) ou um ensaio de perda ou ganho de alelos. A frase "promotor endógeno" refere-se ao promotor gue está naturalmente associado, por exemplo, num organismo de tipo selvagem, com a seguência polinucleotídica gue codifica a proteína endógena. 0 termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinante. As células incluem aquelas de procariotas e eucariotas (unicelulares ou multicelulares) , células bacterianas (por exemplo, estirpes de E. coli, Bacillus spp.f Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células fúngicas, células de leveduras (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de insetos (por exemplo, SF-9, SF-21, células de insetos infetadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células animais não humanas, células humanas, ou fusões celulares tais como, por exemplo, hibridomas ou guadromas. Em algumas formas de realização, a célula é uma célula humana, de macaco, de símio, de hamster, de rato ou de ratinho. Em algumas formas de realização, a célula é eucariótica e seleciona-se a partir das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO Kl, DXB-11 CHO, Veggie-CHO) , COS (por exemplo, COS-7), células retinianas, Vero, CV1, renais (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmicas), CV-1, U937, 3T3, células L, células C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, células de Sertoli, células BRL 3A, células HT1080, células de mieloma, células tumorais e uma linha celular derivada de uma célula acima mencionada. Em algumas formas de realização, a célula compreende um ou mais gene virais, por exemplo, uma célula retiniana que expressa um gene virai (por exemplo, uma célula PER.C6™). A frase "animais não humanos" pretende incluir qualquer vertebrado tal como ciclóstomos, peixes ósseos, peixes cartilaginosos tais como tubarões e raias, anfíbios, répteis, mamíferos e aves. Mamíferos adequados incluem primatas não humanos, cabras, ovelhas, porcos, cães, vacas, e roedores. Animais não humanos adequados são selecionados a partir da família de roedores incluindo ratos e ratinhos. Numa forma de realização, os animais não humanos são ratinhos . O termo "conservative", quando usado para descrever uma substituição de aminoácidos conservativa, inclui a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácidos conservativa não alterará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de uma região variável para se ligar especificamente a um epítopo alvo com uma afinidade desejada. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem as cadeias laterais alifáticas tais como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadeias laterais alifáticas com hidroxilo, tais como serina e treonina; cadeias laterais que contêm amidas, tais como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas tais como fenilalanina, tirosina e triptofano; cadeias laterais básicas tais como lisina, arginina e histidina; cadeias laterais ácidas tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; e cadeias laterais que contêm enxofre tais como cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservatives incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, e asparagina/glutamina. Em algumas formas de realização, uma substituição de aminoácidos conservativa pode ser substituição de qualquer resíduo nativo numa proteína, com alanina, conforme utilizado, por exemplo, na mutagénese de rastreio de alanina. Em algumas formas de realização, efetua-se uma substituição conservativa que tem um valor positivo na matriz de log-verosimilhança PAM250 divulgada em Gonnet, G.H., Cohen, M.A., e Benner, S.A. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, incorporado no presente documento para referência. Em algumas formas de realização, a substituição é uma substituição moderadamente conservativa em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de log-verosimilhança PAM250. 0 termo "identidade" quando utilizado em conexão com uma comparação de sequências, inclui a identidade conforme determinada por uma série de diferentes algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequências de nucleótidos e/ou aminoácidos. Nalgumas formas de realização descritas no presente documento, determinam-se identidades utilizando um alinhamento (lento) ClustalW v. 1.83 empregando uma penalidade de lacuna aberta de 10,0, uma penalidade de lacuna de extensão de 0,1, e utilizando uma matriz de semelhança de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc. , 2008) . O termo "anticorpo", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se às moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptidicas, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves interconectadas por pontes dissulfureto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH) · A região constante de cadeia pesada compreende três domínios para a IgG, CH1, CH2 e Ch3 e um quarto domínio, CH4, no caso das regiões constantes de IgM e IgE. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio de um tipo □ ou λ (CD ou CÀ) . As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FRs). Cada VH e VL está composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas desde o término amino até ao término carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo humano", conforme utilizado no presente documento, destina-se a incluir anticorpos tendo regiões constantes e variáveis derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana, e pode incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme utilizado no presente documento, não se destina a incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas a partir da linha germinal de qualquer outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, tenham sido enxertadas em sequências estruturais humanas.

Um anticorpo "neutralizador" ou "bloqueador", conforme utilizado no presente documento, pretende referir-se a um anticorpo cuja ligação a uma molécula alvo (por exemplo, Nav1.7) resulta em inibição de pelo menos uma função da molécula alvo. Por exemplo, a inibição causada por um anticorpo neutralizador ou bloqueador de Navl.7 não necessita ser completa desde que seja detetável utilizando um ensaio adequado. Descrevem-se ensaios exemplares para detetar a inibição de Navl. 7 noutra parte do presente documento. A frase "intervalo micromolar" destina-se a significar 1-999 micromolar; a frase "intervalo nanomolar" destina-se a significar 1-999 nanomolar; a frase "intervalo picomolar" destina-se a significar 1-999 picomolar;

Expressão e Função dos Canais Nav

Existem nove membros conhecidos na família dos canais Nav. Os nomes dos genes vão desde SCN1A até SCN11A, e as respetivas proteínas designam-se Navl.1-Navl·9. Cada uma foi adicionalmente classificada com base na sua sensibilidade à toxina do peixe balão (tetrodotoxina, ou TTX) . Sabe-se que os nove canais de Nav exibem diversas propriedades funcionais e distintos padrões de expressão, que implicam funções especializadas entre os canais. A expressão dos canais Nav pode ser detetada, por exemplo, em neurónios dos sistemas nervosos central e periférico, miócitos cardíacos, músculo-esquelético, células da glia, e células de Schwann. Nav1.7, um canal Nav sensível a TTX também conhecido como PN1 e SCN9A, foi detetado em neurónios simpáticos, células de Schwann, células neuroendócrinas e gânglios espinais dorsais (DRG) . Navl. 7 expressa-se, quase exclusivamente, nos DRG e concentra-se nas extremidades destes neurónios especializados. Tal distribuição predispõe este canal a um papel na transmissão de sinais de dor.

Os canais Nav contêm uma subunidade a (FIG.l) que forma um poro na membrana de células que permite o fluxo de iões Na+ mediando assim os potenciais de ação. Esta subunidade α também se associa com uma a duas subunidades β, que funcionam na regulação do acionamento ou encerramento de canais. A expressão da subunidade α na superfície da célula parece ser necessária para a função dos canais. Os canais Nav abrem-se e fecham-se através de um poro, que está constituído pelos segmentos transmembranares 5 (S5) e 6 (S6) de cada um dos Domínios (FIG.l) . É através deste poro, formado pela disposição cíclica dos quatro domínios na superfície celular, que os iões de Na+ se deslocam para dentro da célula e provocam a despolarização da membrana celular. Esta ação altera o gradiente eletroquímico da célula e gera um potencial de ação, que leva à transmissão de sinais elétricos entre células. Os estudos de mutações demonstraram que os aminoácidos que constituem as ansas comunicando os segmentos transmembranares tanto no lado extracelular como no lado intracelular da célula regulam a abertura e o encerramento do canal de uma forma do tipo porta-recetor. Tais mutações alteram e/ou desestabilizam o estado do canal deixando o canal num estado perpétuo de ativação ou desativação, como tal, provocando o que se denominou como canalopatias, por exemplo, hiperexcitabilidade, que conduz a estados de dor grave e persistente.

Navl.7 e Vias da Dor

Entre os canais de Nav, Navl. 7 está associado com ativação e desativação rápidas, e postulou-se que atua como um canal de limiar. Estudos genéticos ligaram Navl. 7 tanto a dor grave como à indiferença à dor. Por exemplo, a eritromelalgia (IEM) e o distúrbio de dor extrema paroxística (PEPD) resultam de mutações de Navl. 7 que aumentam a atividade de canal tanto por alterar a ativação do canal para um potencial mais negativo como por comprometer a inativação. Descreveram-se outras mutações que levam a uma proteína Navl.7 não funcional e portanto uma ausência completa de dor, chamada indiferença congénita à dor (CIP) . As mutações de CIP, embora prejudiquem a capacidade olfativa, parecem não ter efeito nas funções motoras, cognitivas e cardíacas. Relataram-se várias mutações de Navl. 7 relacionadas com a IEM, PEPD e CIP e o efeito aberrante resultante na função de Navl.7. Também se sugeriu que Navl . 7 tem um papel nas metástases devido à constatação que Navl.7 é regulada positivamente em algumas linhas celulares de cancro. Além disso, demonstrou-se que o fator de crescimento nervoso (NGF) aumenta os níveis de Nav1.7, o que sugeriu uma relação com a dor inflamatória. Consequentemente, estas constatações indicam que Navl. 7 está envolvida em vários pontos de controlo fundamentais para a perceção da dor, inflamação e, talvez, a persistência de cancro.

As terapêuticas convencionais que empregam inibidores de canais de sódio não seletivos tais como, por exemplo, lidocaína, mexiletina e carbamazepina mostram algum valor no tratamento da dor, no entanto estão limitadas devido a efeitos secundários motores, cognitivos e cardíacos significativos derivados da sua inibição de canais Nav não implicados na resposta à dor. A utilização de analgésicos, anticonvulsivos e antiarritmicos para tratar a atividade anormal de Nav tem encontrado bons resultados. Isto revela a importância e necessidade imediata de inibidores de Nav específicos. A identificação de terapêuticas que inibam seletivamente Nav1.7 poderia revelar-se eficaz no tratamento da dor e da inflamação em seres humanos e a avaliação de tais terapêuticas requer um modelo animal adequado que expresse a Navl.7 humana. A presente invenção cumpre esta e outras necessidades.

As linhas celulares que expressam estavelmente proteínas de canal Nav revelaram-se difíceis de construir e como tal o desenvolvimento de modelos animais adequados para elucidar a função dos canais Nav e identificar inibidores específicos dos canais Nav tem sido afetada adversamente. Também, a deleção da Navl.7 de ratinho é letal, provocada por uma alegada diminuição no olfato, que se postula resultar na falha em alimentar-se. Alcançaram-se deleções de Navl.7 em subconjuntos de células e confirmaram um papel nos mecanismos da dor, mas a aplicabilidade desta abordagem não é sem limitação. Um ratinho em que as porções totais e/ou específicas da proteína Navl.7 humana se expressa, poderia em várias formas de realização ser utilizada para refletir com precisão os mecanismos da dor humanos e as patologias associadas com distúrbios resultantes de mutações da Nav1.7. Tal ratinho serviria como uma ferramenta vital na engenharia, análise e avaliação de terapêuticas para o tratamento de distúrbios da dor humanos, tais como, por exemplo, IEM, PEPD, dor crónica e aguda, e dor inflamatória, proporcionando um modelo animal capaz de alcançar um perfil de expressão e função mais preciso dos processos dos canais de Nav em seres humanos. Além disso, as linhas celulares derivadas a partir de tais ratinhos seriam ferramentas excecionalmente úteis para avaliar terapêuticas humanas.

Ratinhos Expressando Canais Navl.7 Heterólogos

Proporcionam-se animais não humanos geneticamente modificados que expressam proteína Navl.7 totalmente ou parcialmente humana. A proteína Navl. 7 pode ser expressa na superfície de células excitáveis, por exemplo neurónios, do sistema nervoso do animal. A modificação genética, em várias formas de realização, compreende uma deleção de um gene Navl. 7 de ratinho funcional por inteiro ou em parte, e nalgumas formas de realização uma modificação adicional compreendendo uma substituição com um gene Navl. 7 humano por inteiro ou em parte, em que o animal não humano expressa subunidades β de ratinho funcionais. Proporcionam-se também embriões não humanos geneticamente modificados, células, e construções de direcionamento para o fabrico dos animais não humanos, embriões não humanos, e células.

Proporcionam-se composições e métodos para o fabrico de um ratinho que expressa uma proteína Navl. 7 humana, incluindo variantes específicas (por exemplo, diferenças num único aminoácido), incluindo composições e métodos para o fabrico de um ratinho que expressa tais genes a partir de um promotor de ratinho e de uma sequência reguladora de ratinho. Os métodos incluem tornar seletivamente um gene Navl. 7 de ratinho não funcional (por exemplo, através de uma deleção da sua subunidade a), e empregar uma subunidade α de um gene Nav1.7 humano no locus do gene Navl. 7 de ratinho endógeno para expressar um gene de subunidade α de Navl.7 humano num ratinho. A deleção do gene Navl.7 de ratinho efetua-se através da deleção do gene da subunidade a, mas não de um gene de subunidade β. A abordagem torna seletivamente o gene da subunidade α de Navl. 7 não funcional enquanto retém uma subunidade β endógena funcional. A abordagem da substituição da subunidade α de Nav1.7 endógena emprega uma perturbação relativamente mínima na transdução de sinais mediada por Navl.7 natural no animal, em várias formas de realização, devido a que as sequências genómicas das subunidades α de Navl. 7 são substituídas num único fragmento e portanto retêm funcionalidade normal ao incluir sequências reguladoras necessárias. Assim, em tais formas de realização a modificação da subunidade α de

Navl.7 não afeta outros genes de canais de Nav endógenos dependentes de subunidades β funcionais. Adicionalmente, em várias formas de realização a modificação não afeta a montagem de um complexo de recetores funcional envolvendo uma subunidade α de Navl. 7 e uma subunidade β endógena, que se pensa serem necessários para abertura e encerramento adequado dos canais e a modulação da expressão dos canais das subunidades α de Navl. 7 na superfície celular e para a sinalização a jusante resultante de um canal ativado. Devido a que as subunidades β não são eliminadas, os animais que contém uma substituição de um gene de subunidade α de Navl.7 endógeno com um gene de subunidade α de Navl. 7 humano deveriam ser capazes de processar funções de canais de Nav dependentes de voltagem normais de passagem de Na+ para a célula através do poro da subunidade α de Navl. 7 humana presente na superfície dos neurónios.

Proporciona-se uma ilustração esquemática (não à escala) de um gene da Nav1.7 de ratinho endógeno eliminado na FIG. 2. Conforme ilustrado, a subunidade α de Navl. 7 de ratinho é codificada por 28 exões abrangendo mais de 80 kb de sequência. O gene da Navl.7 de ratinho endógeno é eliminado através de uma construção de direcionamento (vetor de direcionamento de Navl. 7 de ratinho) com uma cassete de neomicina flanqueada por sítios de recombinação. Este locus endógeno codifica a subunidade α do gene da Navl.7 de ratinho responsável pela geração de potenciais de ação desencadeados pela despolarização da membrana celular como resposta ao fluxo de iões de Na+ para o interior da célula.

Um ratinho geneticamente modificado carecendo de uma sequência de nucleótidos codificando uma subunidade α do gene Navl.7 endógeno pode ser fabricado através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, pode fabricar-se um vetor de direcionamento que elimina o gene da Navl. 7 de ratinho com marcador génico selecionável. A FIG. 2 ilustra um genoma de ratinho (fundo) marcado por uma construção de direcionamento tendo um braço de homologia 5' que contém a sequência a montante do exão 6 do locus de Navl. 7 endógeno, seguido de uma cassete de seleção de fármacos (por exemplo um gene de resistência à neomicina flanqueado por sequências LoxP), e um braço de homologia 3' que contém a sequência a jusante do exão 27 do locus endógeno de Navl. 7. Após recombinação homóloga no locus, o locus de Navl. 7 endógeno é substituído por uma cassete de seleção de fármacos (FIG. 2, fundo) . 0 locus de Navl. 7 endógeno é como tal eliminado resultando numa célula ou animal não humano que não expressa a subunidade α de Navl. 7 endógena. A cassete de seleção de fármacos pode ser opcionalmente removida através da subsequente adição de uma recombinase (por exemplo, por tratamento com Cre).

Modificar geneticamente um ratinho para tornar o gene da Navl. 7 endógeno não funcional, em várias formas de realização, resulta num ratinho que exibe defeitos nos processos do sistema nervoso, por exemplo na transmissão de informação nocicetiva, tornando o ratinho útil para avaliar o papel do gene da Nav1.7 endógeno na função neuronal normal e na com distúrbios. Em várias formas de realização, modificar a subunidade α do gene da Navl. 7 endógeno, mas não as subunidades β, evita a redução potencial de outros genes de Nav (por exemplo, Nav1.6, Nav1.8, Nav1.9, etc.) que requerem as subunidades β para regular a abertura e encerramento dependente de voltagem do canal, como tal mantendo várias outras funções e processos mediados através de processos dependentes da subunidade β.

De acordo com relatos, as deleções completas do gene da Navl. 7 endógeno em ratinhos são letais. No entanto, alcançaram-se deleções em subconjuntos específicos de células que parecem de outra forma, normais. Os ratinhos de acordo com a presente invenção têm um locus de Navl.7 endógeno funcionalmente silenciado no qual carecem da capacidade de produzir uma subunidade α de Nav1.7 funcional na superfície celular.

Proporciona-se uma ilustração esquemática (não à escala) de um gene da Nav1.7 de ratinho endógeno substituído com um gene da Navl. 7 humano na FIG. 3. Conforme ilustrado, um locus de Navl.7 de ratinho endógeno que fora eliminado é substituído por uma construção de direcionamento (vetor de direcionamento de Navl.7 de ratinho) com uma cassete de higromicina flanqueada por sítios de recombinação. 0 locus substituído resultante codifica uma proteína de subunidade α de Navl.7 humana expressa na superfície de neurónios no animal hospedeiro capazes de mediar potenciais de ação desencadeados pela despolarização da célula como resposta ao fluxo de iões Na+ para a célula dentro do animal hospedeiro.

Um ratinho geneticamente modificado que expressa uma subunidade α de Nav1.7 humana no locus de Nav1.7 de ratinho endógeno pode ser fabricado através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, pode fabricar-se um vetor de direcionamento que introduz o gene da Navl. 7 humano com um gene de marcador selecionável. A FIG. 3 ilustra um genoma de ratinho compreendendo uma substituição do locus de Navl.7 endógeno (fundo). A construção de direcionamento contém um braço de homologia 5' que contém a sequência a montante do locus da Navl. 7 de ratinho endógeno, seguido de um fragmento genómico que contém um gene da Navl.7 humano, uma cassete de seleção de fármacos (por exemplo um gene de resistência à higromicina flanqueado em ambos lados por sequências LoxP), e um braço de homologia 3' que contém a sequência a jusante do exão 27 do locus da Navl. 7 de ratinho endógeno. Após recombinação homóloga no locus endógeno, a cassete de seleção de fármacos é substituída pela sequência contida no vetor de direcionamento (fundo da FIG. 3) . 0 locus de Navl. 7 endógeno eliminado é como tal substituído por um gene da

Navl.7 humano resultando numa célula ou animal que expressa um gene da Navl. 7 humano. A cassete de seleção de fármacos pode ser opcionalmente removida através da subsequente adição de uma recombinase (por exemplo, por tratamento com Cre) .

Outras modificações ao locus endógeno podem ser alcançadas com mínimo esforço utilizando técnicas semelhantes para criar um locus compreendendo um gene quimérico. Por exemplo, proporcionam-se ilustrações esquemáticas da substituição de duas ansas de poro extracelulares entre os segmentos transmembranares 5 e 6 dos Domínios I e III do gene da Navl. 7 de ratinho endógeno na FIG. 4 e FIG. 5, respetivamente. Conforme ilustrado, inserem-se porções discretas de um gene da Navl. 7 humano no locus de Navl. 7 de ratinho endógeno através de outras construções de direcionamento (vetor de direcionamento Navl.7 DI/S5-S6 humano e vetor de direcionamento Navl. 7 DIII/S5-S6 humano) com fragmentos genómicos que codificam cada um uma ansa extracelular de um gene da Navl. 7 humano situada no poro de canal e responsável por permitir a passagem de iões Na+ para o espaço intracelular. Após recombinação com qualquer um dos vetores de direcionamento ilustrados, substitui-se um fragmento genómico do locus da Navl. 7 endógeno, que codifica uma ansa de poro extracelular da proteína Navl.7 endógena, com um fragmento genómico humano codificando a correspondente ansa de poro numa proteína Navl. 7 humana. Isto cria um locus quimérico que produz uma proteína Navl. 7 quimérica que compreende ansas extracelulares humanas no poro de uma proteína de canal Navl. 7 .

Pode fabricar-se um ratinho geneticamente modificado que expressa uma ansa de poro extracelular de um canal de Navl. 7 humano no locus da Navl. 7 de ratinho endógeno através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, pode fabricar-se um vetor de direcionamento que introduz um fragmento genómico que codifica uma ansa de poro extracelular de um canal de Navl.7 humano com um gene de marcador selecionável. As Figs. 4 e 5 ilustram cada uma um genoma de ratinho compreendendo substituições separadas de ansas extracelulares situadas no poro de uma proteína de canal Nav1.7. Cada construção de direcionamento contém um braço de homologia 5' que contém a sequência a montante da sequência da Navl.7 de ratinho endógena a ser substituída, seguida de um fragmento genómico que contém uma sequência humana correspondendo à sequência do gene da Navl. 7 de ratinho endógena que codifica uma ansa de poro extracelular específica, uma cassete de seleção de fármacos (por exemplo um gene de resistência à neomicina flanqueado em ambos lados por sequências LoxP), seguida de um braço de homologia 3' que contém a sequência a montante do locus de Navl. 7 de ratinho endógeno a ser substituída. Após recombinação homóloga no locus endógeno com qualquer dos vetores de direcionamento, insere-se um fragmento genómico no locus de Navl. 7 de ratinho endógeno resultando num locus quimérico capaz de expressar uma proteína de canal Navl. 7 compreendendo uma sequência humana correspondendo a uma ansa de poro extracelular (FIG. 4 e 5, fundo). A cassete de seleção de fármacos pode ser opcionalmente removida através da subsequente adição de uma recombinase (por exemplo, por tratamento com Cre).

Modelos Experimentais de Ratinhos Humanizados Navl. 7

Os animais não humanos geneticamente modificados que expressam genes de Nav1.7 humanos são úteis, por exemplo, para elucidar as várias funções da Navl.7 nas células do sistema nervoso, para medir a eficácia de um agente terapêutico que se une à proteína Nawl. 7 expressa na superfície celular, para determinar o papel de um canal de Navl. 7 nos mecanismos da dor e nos distúrbios da dor, para servir como modelos de dor aguda e/ou crónica, e para servir como parceiros de acasalamento para gerar outros ratinhos geneticamente modificados de interesse. São também úteis para preparar frações ou vesículas de membrana que compreendem proteínas Navl. 7 totalmente humanas ou quiméricas humano-ratinho, para identificar antagonistas da Navl.7 humana.

Numa forma de realização, utiliza-se um ratinho de acordo com a presente invenção para determinar o mecanismo de abertura e encerramento de canais que é regulado pelas ansas extracelulares situadas no poro de canais Nav humanos. Numa forma de realização, injeta-se um ratinho da presente invenção com toxinas que se unem às ansas de poro extracelulares de um canal Nav humano na superfície celular e, após um período de tempo subsequente, é sujeito a uma gama de estímulos para desencadear o disparo de potenciais de ação. A identidade da toxina conhece-se anteriormente à injeção e analisam-se os animais para a deficiência das respostas elétricas dependentes de Nav1.7 através de comparação com respostas elétricas observadas em animais de tipo selvagem.

Noutro aspeto, proporcionam-se animais não humanos geneticamente modificados compreendendo uma substituição do gene Navl.7 endógeno com um gene Navl. 7 humano. Tais animais são úteis para estudar a eficácia de agentes terapêuticos para bloquear a função da Navl.7. Adicionalmente, a Navl. 7 humana tem mostrado exibir formas mutantes associadas com doença (por exemplo, IEM, PEPD e CIP) . Assim, os animais não humanos geneticamente modificados que compreendem uma substituição do gene da Navl.7 endógeno com formas mutantes específicas de genes da Navl.7 podem ser utilizados para estudar os distúrbios humanos associados com mutações de Nav1.7 no animal. Numa forma de realização específica, as formas mutantes da Navl.7 humana estão associadas com a resposta à dor.

Variantes adequadas incluem formas mutantes da Navl.7 que são conhecidas na técnica. Variantes associadas com o distúrbio IEM incluem, por exemplo, mutações que mudam a ativação da Navl. 7 a um potencial mais negativo. Mutações exemplares da Navl. 7 que conduzem a IEM incluem Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G e F1449V. Numa forma de realização, a sequência da Navl. 7 humana compreende uma mutação sem sentido que provoca o distúrbio IEM. Numa forma de realização especifica, a mutação sem sentido que provoca o distúrbio IEM seleciona-se a partir de I848T e L858H.

Variantes associadas com o distúrbio PEPD incluem, por exemplo, mutações que comprometem a inativação de uma subunidade α da Navl. 7. As mutações que provocam PEPD mostraram mudar a inativação rápida de estado estacionário de uma subunidade α de Navl. 7 em direção a um estado caracterizado por potenciais de ação mais despolarizados provocando um aumento notável na corrente continua. Relata-se a ocorrência de tais mutações, por exemplo, nos aminoácidos que unem Dill e DIV, que contém um motivo de inativação associado com a inativação da subunidade α de Navl. 7. Mutações exemplares da Nav1.7 que conduzem a PEPD incluem R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K e A1632E. Numa forma de realização, a sequência da Navl. 7 humana compreende uma mutação selecionada a partir de I1461T, M1627K e A1632E.

Variantes associadas com o distúrbio CIP incluem, por exemplo, mutações sem sentido uninucleotidicas homozigóticas e mutações heterozigóticas compostas, que incluem mutações sem sentido num alelo e uma mutação por deleção noutro alelo. A mutação por deleção pode ser de sequências codificantes ou não codificantes, as últimas das quais podem levar à excisão-união deficiente que silencia funcionalmente a subunidade α da Navl.7. As mutações sem sentido são alterações na sequência do ADN, que introduzem codões de terminação prematuros, provocando que qualquer proteína resultante seja reduzida. Isto pode provocar uma perda de função na proteína, já que partes fundamentais da cadeia de aminoácidos já não são traduzidas. Consequentemente, os animais não humanos da presente invenção compreendendo uma subunidade a da Navl.7 com uma mutação que silencia funcionalmente a subunidade α da Navl. 7 humana demonstram uma ausência de dor como resposta aos estímulos nocicetivos.

Mutações silenciadoras exemplares num gene da Navl. 7 incluem mutações sem sentido, deleções de um ou mais nucleótidos numa sequência de ADN de Nav1.7, mutações da junção de excisão-união de exões, e mutações por deslocação do quadro de leitura. Numa forma de realização, o animal não humano geneticamente modificado é heterozigótico para uma mutação silenciadora que leva a CIP, em que um alelo de um gene da Navl. 7 compreende uma mutação sem sentido e o outro alelo de Navl. 7 compreende uma mutação por deslocação do quadro de leitura selecionada a partir de F1200L e I1235L. Noutra forma de realização, o animal não humano geneticamente modificado é homozigótico para uma mutação sem sentido que leva a CIP. Numa forma de realização, a mutação sem sentido compreende uma proteína de subunidade α de Navl. 7 truncada que termina num resíduo de aminoácido selecionado a partir de 259, 277, 328, 459, 693, 767, 830, 897, 1488, 1659 e 1689. Numa forma de realização específica, a proteína de subunidade α da Navl. 7 termina num resíduo de aminoácido selecionado a partir de 693 e 1488 .

Analisou-se a expressão de Nav1.7 de ratinho em ratinhos inteiros utilizando um sistema repórter compreendendo uma fusão de um gene repórter LacZ com a Navl. 7 de ratinho. A análise do sinal de LacZ em ratinhos inteiros revelou que a Navl·7 é expressa em todo o sistema nervoso de ratinho, incluindo no cérebro (incluindo gânglios do bolbo olfatório), tálamo, hipotálamo, mesencéfalo, protuberância, medula, colículo, núcleo ótico, córtex cerebral, matéria cinzenta da medula espinal (por exemplo, dorsal/sensorial), gânglios espinais dorsais, cadeia de gânglios simpáticos, gânglios do trigémeo, gânglio celíaco, plexo nervoso intestinal e em gânglios de menor tamanho em todo o corpo (por exemplo, língua, esófago, traqueia, brônquios, coração).

Assim, podem-se fabricar células, linhas celulares, e culturas celulares a partir dos tecidos mencionados acima como uma fonte de proteína Navl. 7 de ratinho. Além disso, os ratinhos geneticamente modificados de acordo com a presente invenção expressam Navl.7 parcialmente ou totalmente humanizada nos tecidos acima mencionados. Assim os tecidos e células dos ratinhos geneticamente modificados, incluindo linhas celulares e culturas celulares, podem ser gerados para servir como fonte de Navl. 7 humanizada para utilização em ensaios de ligação e funcionais, por exemplo, para analisar a ligação ou função de um agonista ou antagonista de Nav1.7, particularmente onde o agonista ou antagonista é específico para uma sequência de Navl. 7 humana.

Podem isolar-se células a partir de ratinhos geneticamente modificados e utilizar-se numa base ad hoc, ou podem manter-se em cultura durante muitas gerações. Numa forma de realização, imortalizam-se células dos ratinhos geneticamente modificados e mantêm-se em cultura indefinidamente (por exemplo, em culturas seriados).

Num aspeto, os ratinhos geneticamente modificados utilizam-se para fabricar gânglios espinais dorsais (DRG) modificados que compreendem uma ou mais das proteínas Navl.7 modificadas. 0(s) DRG(s) modificado(s) emprega(m)-se em ensaios ex vivo para determinar o efeito de um agente de ligação a Navl. 7 na função da proteína Navl. 7 e na função de outras proteínas, por exemplo, outros membros da família das Navs. Numa forma de realização, isola(m)-se DRG(s) modificado(s) de um ratinho e analisa(m)-se para uma ou mais funções de Nav1.7 em presença ou ausência de um agente de ligação a Navl. 7 (por exemplo, um agonista ou antagonista de Nav1.7) . Numa forma de realização, o(s) DRG(s) modificado(s) isola(m)-se e analisa(m)-se para a função de um ou mais membros da família das Navs em presença e ausência de um agente de ligação a Nav1.7. Numa forma de realização, o(s) DRG(s) modificado(s) analisa(m)-se em presença do agente de ligação para função de uma proteína ou canal não da família das Navs.

Numa forma de realização, proporciona-se um método para determinar o efeito de um agente de ligação a Navl. 7 num canal de DRG que não é um membro da família das Navs, compreendendo expor DRG(s) modificado(s) compreendendo para um agente de ligação a Nav1.7, e medir uma função de um canal de DRG não da família das Navs.

Noutro aspeto, proporciona-se um método para determinar um efeito de um agente terapêutico humano numa Navl. 7 humana, em que o agente terapêutico humano não se liga a uma proteína Navl. 7 humana, compreendendo expor um DRG modificado ao agente terapêutico humano num ensaio ex vivo, e medindo um efeito do agente terapêutico humano numa função de uma proteína Navl. 7 humana.

Em várias formas de realização e aspetos, analisa-se um DRG ou DRG modificado ou constata-se uma função de uma proteína de DRG ou proteína de DRG modificado num protocolo de patch clamp, um protocolo de produção de imagem por cálcio, um protocolo de coloração sensível à membrana, num ensaio ex vivo.

Num aspeto, proporciona-se uma cultura celular, em que a cultura celular compreende uma célula de um ratinho geneticamente modificado conforme descrito no presente documento, em que um número substancial das células em cultura expressa uma sequência da Navl.7 humana. Numa forma de realização, imortalizam-se as células que expressam a sequência da Navl.7 humana. Numa forma de realização, as células derivam a partir de um tecido selecionado a partir do cérebro (incluindo gânglios do bolbo olfatório), tálamo, hipotálamo, mesencéfalo, protuberância, medula, colículo, núcleo ótico, córtex cerebral, matéria cinzenta da medula espinal (por exemplo, dorsal/sensorial), gânglios espinais dorsais, cadeia de gânglios simpáticos, gânglios do trigémeo, gânglio celíaco, plexo nervoso intestinal e em gânglios de menor tamanho por todo o corpo (por exemplo, língua, esófago, traqueia, brônquios, coração).

Num aspeto, proporciona-se um método para determinar se um agonista ou antagonista de Navl. 7 potencial se liga a uma proteína Nav1.7, compreendendo expor o agonista ou antagonista de Navl. 7 potencial a uma célula conforme descrito no presente documento, e determinar se o agonista ou antagonista de Navl. 7 potencial se liga à célula.

Numa forma de realização, seleciona-se o agonista ou antagonista de Nav1.7 a partir de uma proteína, um péptido, e uma molécula pequena (por exemplo, composto orgânico não proteico). Numa forma de realização específica, a proteína compreende um domínio variável de imunoglobulina ou fragmento de ligação a Navl. 7 do mesmo. Numa forma de realização específica, a proteína é um anticorpo anti-Navl.7 humano.

Num aspeto, proporciona-se um método para determinar se uma preparação farmacêutica afeta a função de uma proteína Nav1.7 humana, compreendendo expor a preparação farmacêutica a uma célula conforme proporcionada no presente documento que expressa uma proteína Navl. 7 humana, e medir uma função de Nav1.7 da célula.

Numa forma de realização, a função de Navl. 7 medida é a ativação de nocicetores primários. Numa forma de realização específica, a função medida é a libertação de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) por parte da célula.

Numa forma de realização, a preparação farmacêutica compreende uma proteína, um péptido ou um análogo de um péptido. Numa forma de realização específica, a proteína compreende um domínio variável de imunoglobulina ou fragmento de ligação a Navl. 7 do mesmo. Numa forma de realização específica, a proteína é um anticorpo anti-Navl.7 humano.

Num aspeto, proporciona-se um ensaio de garantia de qualidade para uma preparação farmacêutica compreendendo um agente que se liga a uma sequência da Navl. 7 humana, compreendendo obter uma amostra de uma preparação farmacêutica e expor a preparação a um ratinho ou célula conforme descrito no presente documento, em que o ratinho ou célula expressa uma sequência da Navl.7 humana, e determinar (a) se a preparação farmacêutica se liga à célula, e/ou (b) determinar se a preparação farmacêutica afeta uma função de Navl. 7 da célula.

Numa forma de realização, a preparação farmacêutica é um anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo. Numa forma de realização, a preparação farmacêutica é um bloqueador de canais iónicos não anticorpo ou análogo do mesmo.

Libertação de Neuropéptidos a partir de Neurónios de Ratinhos Humanizados Navl. 7

Os neurónios nocicetivos primários são favoráveis a um número de técnicas de investigação estabelecidas, tais como gravações de eletrofisiologia, produção de imagem com cálcio e medição da libertação de neuropéptidos espontânea e estimulada, que proporcionam visões nas funções celulares e moleculares de neurónios individuais ou subpopulações neuronais. 0 péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), um péptido de 37 aminoácidos, sintetiza-se predominantemente e armazena-se nos neurónios sensoriais e pode ser libertado tanto a partir de axónios centrais como periféricos (Poyner, D.R. 1992. Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors. Pharmacol. Ther. 56 (1) : 23-51) . A libertação de CGRP a partir de terminais nervosos sensoriais nos tecidos periféricos tem um papel fundamental na inflamação neurogénica ao passo que a libertação a partir de terminais no corno dorsal da medula espinal modula a transmissão da dor (Oku, R., M. Satoh, N, Fujii, A. Otaka, H. Yajima, e H. Takagi. 1987. 0 péptido relacionado com o gene da calcitonina promove a nociceção mecânica potenciando a libertação de substância P a partir do corno dorsal espinal dorsal em ratos. Brain Res. 403 (2) : 350-354) . Os ratos com desativação de CGRP mostram uma resposta atenuada à dor química e à inflamação (Salmon, A., M.I. Damaj, L.M. Marubio, M.P. Epping-Jordan, E. Merlo-Pich, e J.P. Changeux. 2001. Altered neuroadaptation in opiate dependence and neurogenic inflammatory nociception in aCGRP-deficient mice. Nature Neuroscience 4 (4): 357-358), que implica o CGRP na regulação da resposta à dor.

Uma variedade de mediadores inflamatórios, tais como a prostaglandins E2, bradiquinina, e protões, ou outros estimulantes tais como o pH baixo, fatores neurotróficos e capsaicina têm um papel essencial na indução da dor. Além disso, sabe-se que os mediadores inflamatórios induzem a libertação de neuropéptidos ativando recetores específicos de membrana. Por exemplo, mediadores inflamatórios tais com a prostaglandina E2 e a bradiquinina excitam e sensibilizam os neurónios de DRG conduzindo a potenciais de ação que são bloqueados pela tetrodotoxina (Noda, K., Y. Ueda, K. Suzuki, e K. Yoda. 1997. Excitatory effects of algesic compounds on neuronal processes in murine dorsal root ganglion cell culture. Brain Res. 751 (2) : 348-351; Nicol G.D. and M. Cui. 1994. Enhancement by prostaglandin E2 of bradykinin activation of embryonic rat sensory neurones. Journal Physiol. 480 (Pt 3) : 485-492; Momin A. and P.A. McNaughton. 2009. Regulation of firing frequency in nociceptive neurons by pro-inflammatory mediators. Exp Brain Res. 196 (1): 45-52). Estes mediadores também mostraram regular a expressão de CGRP em neurónios de gânglios espinais dorsais (DRG) em cultura (Supowit, S.C., H. Zhao, K.A. Katki, P. Gupta, e D. J. Dipette 2011. Bradykinin and prostaglandin Ei regulate calcitonin gene-related peptide expression in cultured rat sensory neurons. Regul Pept. 167 (1) : 105-111; Averbeck, B., I. Izydorczyk, e M. Kress. 2000. Inflammatory mediators release calcitonin gene-related peptide from dorsal root ganglion neurons of the rat. Neuroscience 98 (1) : 135-140) . Além disso, a prostaglandins E2 potência a libertação de CGRP estimulada por bradiquinina e capsaicina (Vasko M.R., W. B. Campbell, e K. J. Waite. 1994. Prostaglandin E2 enhances bradykinin-stimulated release of neuropeptides from rat sensory neurons in culture. J. Neurosci. 14 (8) : 4987-4997;

Southhall, M.D. e M. R. Vasko. 2001. Prostaglandin receptor subtypes EP3C and EP4 mediate the prostaglandin E2-induced cAMP production and sensitization of sensory neurons. J. Biol. Chem. 276: 16083-16091) . A libertação de CGRP a partir de nervos estimulados é bloqueada pela antagonista de canais de sódio tetrodotoxina (TTX) e pela ómega conotoxina (CTX) mas não pela nifedipina, um conhecido bloqueador de canais de cálcio (Lundberg, J. Μ., A. Franco-Cereceda, K. Alving, P. Delay-Goyet, e Y. Lou. 1992.

Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from Sensory Neurons. Ann NY Acad. Sci. 657, 187-93) . Estas últimas verificações sugerem que ao passo que os canais de cálcio de tipo N são importantes para a exocitose de péptidos a partir de depósitos situados em grandes vesículas de núcleo denso de aferentes primários, os canais de sódio também desempenham um papel na libertação de CGRP. Demonstraram-se características semelhantes para a libertação de péptidos evocada por baixas concentrações de capsaicina, que também é sensível tanto a TTX como a CTX. No entanto, a elevada concentração de capsaicina provoca uma libertação massiva de CGRP, que só é marginalmente inibida, se possível, por TTX ou CTX (Lou Y.P., A. Franco-Cereceda, e J. M. Lundberg. 1992. Different ion channel mechanisms between low concentrations of capsaicin and high concentrations of capsaicin and nicotine regarding peptide release from pulmonary afferents. Acta Physiol. Scand. 146 (1) : 119- 127). Estes relatos sugerem que a libertação de CGRP induzida por diferentes agentes inflamatórios depende de canais/recetores e/ou vias diferentes. Assim, a estimulação correta para o acoplamento de recetores alvo específicos conhecidos como estando associados a respostas à dor pode identificar-se através da medição da libertação de CGRP por parte dos neurónios. Isto permite a análise funcional específica de um recetor alvo e a descoberta de como o recetor alvo funciona nas respostas à dor.

A despolarização de neurónios leva a um aumento da expressão e libertação de neuropéptidos, em particular um aumento na expressão de CGRP. A libertação de CGRP foi utilizada em vários estudos para avaliar a mediação da resposta à dor e a caracterização da função neuronal incluindo a geração de potenciais de ação com respeito a outros canais (embora não canais de sódio). Conforme descrito anteriormente, os mediadores inflamatórios, por exemplo, bradiquinina e prostaglandina E2, mostraram induzir a libertação de CGRP a partir de gânglios espinais dorsais (DRG) em cultura (Averbeck, B. et al. supra; Tumati, S., W. R. Roeske, T. W. Vanderah, e. V. Varga. 2010. Sustained morphine treatment augments prostaglandin E2-evoked calcitonin gene-related peptide release from primary sensory neurons in a PKA-dependent manner. Eur. J. Pharmacol. 648 (1-3):95-101). Embora a libertação de CGRP in vitro tenha demonstrado um papel essencial para os canais de cálcio, o envolvimento nos canais de sódio permaneceu menos claro (Ai, X., S. E. MacPhedran, e A. K.

Hall. 1998. Depolarization stimulates initial CGRP expression by embryonic sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 18 (22) : 9294-9302; Strecker, T., K. Messlinger, M. Weyand, e P. W. Reeh. 2005. Role of different proton-sensitive channels in releasing calcitonin gene-related peptide from isolated hearts of mutant mice. Cardiovasc. Res. 65 (2) :405-410; Spitzer, M. J., P. W. Reeh, e S. K. Sauer. 2008. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neurosci. 151 (3) :836-842) . Assim, permanece uma necessidade de desenvolver ensaios que avaliem a função neuronal mediada por canais de sódio, em particular através da aplicação de DRGs que expressam uma proteína Navl. 7 humana. Métodos para a medição da libertação de neuropéptidos a partir de neurónios isolados a partir de ratinhos que expressam a Navl.7 humana são úteis, por exemplo, para elucidar a função de neurónios nocicetivos expressando uma proteína Navl. 7 humana como resposta aos mediadores inflamatórios através da medição da libertação de CGRP. Também são úteis para a identificação de antagonistas específicos da Navl.7 através da avaliação da sua capacidade de alterar ou modificar a libertação de CGRP induzida por mediadores inflamatórios em DRG isolados a partir de ratinhos expressando uma proteína Navl. 7 humana.

Os neurónios de DRG, que se sabe que expressam Nav1.7, libertam CGRP após a despolarização. Esta propriedade dos neurónios de DRG sugere que DRGs que expressam a Navl. 7 humana podem ser utilizados num ensaio como um meio de identificar antagonistas da Nav1.7 utilizando medições do CGRP libertado a partir de DRG isolados em cultura. Assim, os neurónios (por exemplo, neurónios de DRG) que expressam uma Navl. 7 humana ou uma Navl. 7 quimérica podem ser empregues num ensaio para identificar antagonistas de

Navl.7 que acoplam canais de Navl.7 humana ou quimérica em neurónios de DRG e avaliar a atividade funcional do canal através de medições da libertação de CGRP. Em tal ensaio, por exemplo, a Nav1.7 humana ou quimérica é incubada com um inibidor de Navl. 7 (por exemplo, tetrodotoxina) durante cerca de vinte minutos, seguido de estimulação com um ou mais mediadores inflamatórios (por exemplo, prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina) durante vinte minutos adicionais. Podem empregar-se candidatos a antagonistas adicionais neste ensaio para avaliar o seu potencial terapêutico e a sua capacidade de bloquear a função dos canais da Navl. 7 . Após determinar as medições de referência de libertação de CGRP a partir dos neurónios que expressam uma Navl. 7 humana ou quimérica tanto em presença de um inibidor conhecido da Navl. 7 (por exemplo, TTX) como em ausência de um inibidor conhecido (isto é, unicamente mediadores inflamatórios), pode-se facilmente determinar o aumento de libertação de CGRP ao empregar candidatos a antagonistas neste ensaio. Assim, um ensaio adaptado a acoplar uma proteína de canal Nav tal como Navl. 7 é útil, por exemplo, para a identificação de antagonistas específicos da Navl. 7 através da avaliação da sua capacidade de alterar ou modificar o nível de libertação de CGRP em DRG isolados a partir de ratinhos expressando uma proteína Navl. 7 humana que estão expostos a mediadores inflamatórios.

Descrevem-se no presente documento ensaios que medem a libertação de neuropéptidos em células neuronais como resposta a um ou mais mediadores inflamatórios, que podem ser utilizados como testes funcionais para selecionar antagonistas para um recetor alvo. Especificamente, descrevem-se no presente documento ensaios que medem a libertação de CGRP a partir de DRGs em cultura para avaliação da função de canais de sódio em presença e ausência de antagonistas específicos, em particular os DRGs expressam uma proteína Navl. 7 humana, e que proporcionam métodos in vitro inovadores para a avaliação da ativação de nocicetores primários. Numa forma de realização, contactam-se neurónios de DRG com um ou mais mediadores inflamatórios (por exemplo, prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina, para acoplar especificamente canais de Nav sensíveis a TTX, especificamente Nav1.7) e determina-se a libertação de CGRP induzida pelos mediadores inflamatórios.

Neurotrofinas tais como GDNF, neurturina e artemina mostraram potenciar a libertação de CGRP induzida por capsaicina (Schmutzler, B. S., S. Roy, e C. M. Hingtgen. 2009. Glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands enhance capsaicin-stimulated release of calcitonin gene-related peptide from sensory neurons. Neurosci. 161:148-156; Schmutzler, B. S., S. Roy, S. K. Pittman, R. M. Meadows, e C. M. Hingtgen. 2011. Ret-dependent and Ret-independent mechanisms of Gfl-induced sensitization. Molecular Pain 7:1-22). As neurotrofinas unem-se preferencialmente aos seus próprios recetores da família das GDNF (GFRal, GFRa2 e GFRa3), e existe uma coexpresão de 90% de GFRa3 com TRPV1, também conhecido como o recetor da capsaicina. A capsaicina é um antagonista de TRPV1 e quase todos os neurónios que expressam TRPV1 também expressam CGRP. A artemina individualmente não altera o nível basal da libertação de CGRP. No entanto, a pré-incubação com artemina durante dez minutos antes da estimulação com 1 μΜ de capsaicina potência significativamente a libertação de CGRP. Assim, um ensaio em que se incubam neurónios com artemina (por exemplo, a 10 ng/ml) ou GDNF (por exemplo, a 10 ng/ml) durante dez minutos, seguido de estimulação com capsaicina durante dez minutos adicionais, pode ser empregue para acoplar especificamente GFRa3 e avaliar a atividade funcional do recetor através da medição da libertação de CGRP a partir de neurónios de DRG in vitro. Adicionalmente, o ensaio pode empregar antagonistas específicos de, por exemplo, GFRa3 para determinar a sua capacidade para bloquear a atividade e/ou função dos recetores. 0 princípio do ensaio pode ser adaptado para outro recetor alvo, por exemplo, TRPA1. 0 óleo de mostarda, um agonista específico de TRPA1 mostrou induzir a libertação de CGRP a partir de pele de pata posterior de rato isolada (Ruparel, N. B., A. M. Patwardhan, A. N. Akopian, e K. M. Hargreaves. 2008. Homologous and heterologous desensitization of capsaicin and mustard oil responses utilize different cellular pathways in nociceptors. Pain 135:271-279) . Assim, um ensaio onde os neurónios de DRG isolados a partir de um ratinho conforme descritos no presente documento, são expostos a óleo de mostarda poderia ser utilizado para acoplar especificamente TRPA1 para servir como um meio de avaliar funcionalmente a atividade de TRPA1 através da medição da libertação de CGRP a partir de neurónios de DRG in vitro. Adicionalmente, poderiam empregar-se antagonistas específicos no ensaio para determinar a sua capacidade para bloquear a atividade e/ou função de TRPA1. O princípio do ensaio pode ser adaptado para um outro recetor alvo, por exemplo, ASIC1 e/ou ASIC3. ASIC1 e ASIC3 são canais catiónicos abertos ou encerrados por protões que são ativados por variações do pH externo variando desde pH 6,8 até 4,0. O pH baixo mostrou desencadear a libertação de CGRP. Assim, um ensaio onde os neurónios de DRG isolados a partir de um ratinho conforme descritos no presente documento, são expostos a condições de baixo pH em cultura poderia ser utilizado para acoplar especificamente ASIC1 (ou ASIC3) como um meio de avaliar funcionalmente a atividade de ASIC1 (ou ASIC3) através da medição da libertação de CGRP a partir de neurónios de DRG in vitro. Adicionalmente, poderiam empregar-se antagonistas específicos no ensaio para determinar a sua capacidade para bloquear a atividade e/ou função de ASIC1 (ou ASIC3).

Num aspeto, proporciona-se um método de medir a atividade de um recetor alvo, compreendendo contactar um mediador inflamatório com uma célula tendo um recetor alvo codificado por um gene de ratinho humanizado, em que o mediador inflamatório se liga ao recetor alvo, e determinar a libertação de neuropéptido mediada por recetor alvo a partir da célula. Numa forma de realização, o mediador inflamatório é um ligando da Nav1.7, e o recetor alvo é uma Navl. 7 de ratinho humanizada.

Num aspeto, proporciona-se um método de acoplar seletivamente um recetor alvo, compreendendo contactar uma célula isolada a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento com um ou mais mediadores inflamatórios, como tal acoplando seletivamente o recetor alvo e determinando a libertação de um neuropéptido a partir da célula isolada.

Numa forma de realização, o recetor alvo é um canal de sódio. Numa forma de realização específica, o canal de sódio é Nav1.7.

Numa forma de realização, a célula é uma célula neuronal. Numa forma de realização específica, a célula neuronal é uma célula de um gânglio espinal dorsal (DRG). Numa forma de realização, a célula é uma célula imortalizada.

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios são selecionados a partir da prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protões, pH baixo, um fator neurotrófico e uma combinação dos mesmos.

Numa forma de realização, o neuropéptido é um péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP).

Numa forma de realização, o método emprega-se como um ensaio funcional para selecionar um antagonista para o recetor alvo.

Numa forma de realização, proporciona-se um método para acoplar seletivamente uma proteína Nav1.7 na superfície de um DRG isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento, compreendendo contactar o DRG com um ou mais mediadores inflamatórios como tal estimulando seletivamente a Navl.7 e determinar a libertação de CGRP.

Numa forma de realização, o um ou mais mediadores inflamatórios compreendem a prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina.

Numa forma de realização, o método emprega-se como um ensaio funcional para selecionar um antagonista para a Navl·7. Numa forma de realização específica, o antagonista é um anticorpo.

Num aspeto, proporciona-se um método para medir a libertação de CGRP a partir de um DRG isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento, em particular para determinar o efeito de um antagonista específico de Nav na libertação de CGRP associada com a despolarização de uma proteína de canal Navl.7 humana, em particular através da estimulação com um ou mais mediadores inflamatórios (por exemplo, prostaglandina E2, bradiquinina, serotonina, histamina e capsaicina).

Numa forma de realização, o DRG é imortalizado.

Numa forma de realização, o antagonista específico de Nav seleciona-se a partir de uma proteína, uma molécula pequena, e um pequeno ARN de interferência (siARN) . Numa forma de realização específica, o antagonista específico de Nav é uma proteína.

Numa forma de realização, cultiva-se um DRG isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento em presença de uma toxina especifica de Nav e, após um posterior período de tempo, determina-se a libertação de CGRP, em que um nível elevado de expressão de CGRP indica inibição da função específica de Nav na célula de DRG. A identidade do antagonista específico de Nav é conhecida anteriormente à cultura com o DRG e analisa-se o DRG para nível base da expressão de CGRP na presença e ausência do um ou mais mediadores inflamatórios.

Numa forma de realização, a toxina específica de Nav seleciona-se a partir da tetrodotoxina (TTX), ProTX-II e lidocaína. Numa forma de realização específica, a toxina específica de Nav é a TTX.

Numa forma de realização, cultiva-se um DRG isolado a partir de um ratinho conforme descrito no presente documento em presença de um anticorpo específico de Nav, e determina-se a libertação de CGRP, em que um nível elevado de expressão de CGRP indica inibição da função de Navl. 7 na célula de DRG. A identidade e perfil bioquímico (por exemplo, afinidade, especificidade, etc.) do anticorpo específico de Navl. 7 é conhecida anteriormente à cultura com o DRG e analisa-se o DRG para o nível base da expressão de CGRP na presença e ausência do um ou mais mediadores inflamatórios.

Numa forma de realização, o anticorpo específico de Navl.7 é um anticorpo humano. Numa forma de realização, o anticorpo específico de Navl. 7 é um anticorpo de ratinho. Numa forma de realização, o anticorpo específico de Navl. 7 é um anticorpo biespecífico.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados de modo a descrever aos peritos na especialidade como fabricar e utilizar os métodos e composições da presente invenção, e não se destinam a limitar o âmbito do que os inventores consideram como a sua invenção. A menos que seja indicado de outro modo, a temperatura é indicada em Celsius e a pressão é a atmosférica ou próxima.

Exemplo I

Deleção de um Locus da Navl. 7 Endógeno

Fabricou-se o vetor de direcionamento para introduzir uma deleção do gene da Navl. 7 endógeno utilizando a tecnologia VELOCIGENE® (veja-se, por exemplo, o documento de patente US N° 6.586.251 e Valenzuela et al. , D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M.,

Yancopoulos, G.D. 2003. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotech. 21 (6): 652-659) para modificar o cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-454H3 (Invitrogen). Modificou-se ADN de BAC RP23-454H3 para eliminar o gene da Navl. 7 endógeno compreendendo a subunidade a deste gene de canal de Nav que se expressa na superfície celular (FIG. 2).

Brevemente, derivaram-se braços de homologia a montante e a jusante de ADN de BAC de ratinho das localizações 5' do exão 6 e 3' do exão 28 do locus da Navl.7 endógeno, respetivamente. Estes braços de homologia utilizaram-se para fabricar uma cassete que eliminou ~81 kb do locus da Navl. 7 endógeno compreendendo os exões 6 a 28. Esta região foi substituída com uma cassete de neomicina flanqueada por sítios LoxP (FIG. 2, centro) . O vetor de direcionamento final de 5' a 3' incluiu um braço de homologia de 17 kb compreendendo a sequência genómica de ratinho 5' até ao exão 6 do locus da Navl. 7 endógeno, um sitio LoxP 5', uma cassete de neomicina, um sitio LoxP 3' e um braço de homologia de 29 kb compreendendo a sequência genómica de ratinho 3' até ao exão 28 do locus da Navl. 7 endógeno. O vetor de direcionamento foi linearizado através de digestão com Agel e posteriormente utilizado na recombinação homóloga em células bacterianas que contém o clone BAC de ratinho RP23-454h3 para alcançar uma deleção direcionada do locus da Navl. 7 endógeno (FIG. 2, fundo) .

0 ADN de BAC alvo (acima descrito) foi utilizado para eletroporar células ES de ratinho para criar células ES modificadas compreendendo uma deleção do locus da Navl. 7 endógeno. Identificaram-se células ES positivas compreendendo um locus da Navl. 7 endógeno eliminado através do ensaio quantitativo da PCR utilizando sondas TAQMAN® (Lie, Y. S. e C. J. Petropoulos. 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9: 43-48) . A região a montante do locus eliminado foi confirmada através de PCR utilizando os iniciadores 867TUP2F (GGGACTTCTC TGGGTTCAGT TA; SEQ ID NO: 1) e 867TUP2R (AAAGGCTCTC AATGGGAAAC AAG; SEQ ID NO: 2) e a sonda 867TUP2P (TCAATGACTT GACATAATGC ATGCACTCC; SEQ ID NO: 3), ao passo que a região a jusante do locus eliminado foi confirmada através de PCR utilizando os iniciadores 867TDPF (ATGTCAGCCA ATCCTTCTAA AGTG; SEQ ID NO:4) e 867TDPR (CGTTTTGCCT AAGGCGGTAC; SEQ ID NO:5) e a sonda 867TDPP (TCCTATGAGC CCATCACAAC CACAC; SEQ ID NO: 6) . A presença da cassete de neomicina a partir do vetor de direcionamento confirmou-se utilizando os iniciadores NEOF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO:7) e NEOR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO: 8) e a sonda NEOP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO: 9). A sequência nucleotídica ao outro lado do ponto de deleção a montante incluiu o seguinte, que indica sequência de ratinho endógena a montante do ponto de deleção (contida dentro dos parênteses abaixo) ligada contiguamente à sequência de cassete presente no ponto de deleção: (CTAGCTGAGC TGTCACCACA CATTGCTCCT ACCACGTATT GTACAGCTAC TGCAAGAGCA CCACAGTTGG CTTTCTGTAT C) ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT (SEQ ID NO: 10) . A sequência nucleotídica ao outro lado do ponto de deleção a jusante incluiu o seguinte, que indica sequência de cassete contígua com a sequência de ratinho endógena a jusante do ponto de deleção (contida dentro dos parênteses abaixo): ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT (AGCTTCGGTT TTGATACACT GTTTACAGCC TGCGAAGGTG ACTCACTCGT GTTAATAAGA CTCTTTTACG GAGGTCTATG CCAAACTCTT TTTATCAAAT ATTCTCAAAG GCAG) (SEQ ID NO: 11) . Os clones de células ES positivas foram posteriormente utilizados para implantar ratinhos fêmeas utilizando o método VELOCIMOUSE® (descrito abaixo) para gerar uma ninhada de crias que contém uma deleção do locus da Navl.7 endógeno.

As células ES alvo descritas acima foram utilizadas como células ES dadoras e introduzidas num embrião de ratinho em etapa de 8 células através do método VELOCIMOUSE® (veja-se, por exemplo, o documento de patente US N.° 7.294.754 e Poueymirou, W.T., Auerbach, W.,

Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.Μ. 2007. F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotech. 25 (1): 91- 99) . Identificaram-se ratinhos portando uma deleção dos exões 6 a 28 no locus da Navl. 7 endógeno através de genotipagem utilizando um ensaio de modificação de alelos (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença da cassete de neomicina e confirmou a ausência de sequências de Navl. 7 endógenas.

Os ratinhos portando uma deleção dos exões 6 a 28 no locus da Navl. 7 endógeno podem ser reproduzidos para uma estirpe de ratinhos de eliminador Cre (veja-se, por exemplo, a publicação de pedido de patente internacional N.° WO 2009/114400) de forma a remover qualquer cassete de neomicina com lox introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removida, por exemplo, na etapa de células ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de higromicina é retida no ratinho.

As crias são genotipadas e seleciona-se uma cria heterozigótica para as sequências de Navl. 7 endógenas eliminadas para caracterizar a deleção de Navl. 7 endógena.

Exemplo II

Humanização de um Locus da Navl.7 Endógeno

Construiu-se um vetor de direcionamento para a substituição do locus da Navl.7 endógeno com o locus da Navl. 7 humano (FIG. 3) utilizando um processo de duas etapas envolvendo a ligação de ADN de BAC e reparação GAP (Zhang, Y., J. P. P. Muyrers, G. Testa, e F. A. Stewart. 2000. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nature Biotechnology 18:1314-1317; Zhang, Y., F. Buchholz, J. P. P. Muyrers, e F. A. Stewart. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in

Escherichia coli. Nature Genetics 20:123-128). A primeira etapa na construção do vetor de direcionamento de substituição efetuou-se através de ligação de um fragmento de ADN de clone RP23-454H3 de ADN BAC de ratinho com um fragmento de ADN humano a partir do clone BAC humano RP11-1002M1 (Invitrogen). Esta ligação de fragmentos de ADN de BAC de ratinho e ser humano criou um clone BAC modificado que contém uma substituição dos exões 5 a 28 do locus da Navl. 7 de ratinho (cerca de 81 kb) com os exões 5 a 28 do locus da Navl. 7 humana (cerca de 100 kb) . A segunda etapa na construção do vetor de direcionamento de substituição foi efetuada através de reparação GAP (referida acima) utilizando o clone BAC de ratinho RP23-454H3 e o clone BAC humano RP11-45AJ20 para adicionar exões adicionais do locus da Navl.7 humano ao clone BAC modificado fabricado na primeira etapa. Efetuou-se a reparação GAP na utilização destes clones BAC de ratinho e ser humano para substituir os exões 2 a 7 do locus da Navl. 7 endógeno com os exões 2 a 7 do locus da Navl·7 humano (—13 kb). Esta segunda etapa adicionou as ~13 kb da sequência da Navl. 7 humana às -100 kb da sequência da Navl. 7 humana para efetuar a substituição do locus da Navl. 7 endógeno. Adicionou-se uma cassete de higromicina flanqueada por sítios loxP ao extremo 3' do fragmento BAC de -113 kb que contém o locus da Navl. 7 humano (FIG. 3, centro).

Os braços de homologia a montante e a jusante foram derivados a partir de ADN de BAC de ratinho nas posições 5' e 3' do locus da Nav1.7 endógeno para adição ao fragmento de ADN humano-cassete de higromicina para criar o vetor de direcionamento final para a substituição do locus da Navl. 7 endógeno que continha de 5' a 3' um braço de homologia 5' que contém 7 0 kb de ADN 5' d ratinho do locus da Navl. 7 endógeno, um fragmento de ADN de -113 kb que contém os exões 2 a 28 do locus da Navl. 7 humano, uma cassete de higromicina flanqueada por sítios loxP, e um braço de homologia 3' que contém 147 kb de ADN 3' de ratinho do locus endógeno de Navl.7. O vetor de direcionamento foi linearizado através de digestão com Notl e posteriormente utilizado na recombinação homóloga em células bacterianas para alcançar uma substituição direcionada do locus da Navl. 7 endógeno com os exões 2 a 28 do locus da Navl. 7 humano (FIG. 3, fundo).

O ADN BAC alvo (acima descrito) foi utilizado para eletroporar células ES de ratinho para criar células ES modificadas compreendendo uma substituição do locus da Navl. 7 endógeno com um fragmento genómico compreendendo um locus da Navl.7 humano. As células ES positivas que contém um locus da Navl.7 endógeno eliminado substituído por um fragmento genómico compreendendo um locus da Navl. 7 humano foram identificadas através de um ensaio quantitativo utilizando sondas Taqman® (Lie e Petropoulos, supra). As regiões a montante e a jusante fora do locus modificado foram confirmadas por PCR utilizando os mesmos iniciadores e sondas conforme descrito no Exemplo 1 (8 67TUP2F/8 67TUP2R/8 67TUP2P e 8 67TDPF/8 67TDPR/8 67TDPP) . A inserção da sequência da Nav1.7 humana foi confirmada através de PCR utilizando os iniciadores 935HF (ATCAAAGGAA CCCAAAGAAG; SEQ ID NO: 12) e 935HR (GAAGGGCAGC TGTTTGCCAG; SEQ ID NO: 13) e a sonda 935HP (ATGAAGAAGC CCCAAAGCCA AGCA; SEQ ID NO: 14) . A presença da cassete de higromicina a partir do vetor de direcionamento confirmou-se com os iniciadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO: 15) e HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO: 16) e a sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO: 17) . A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de deleção a montante incluiu o seguinte, que indica sequência de ratinho endógena a montante do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo) ligada contiguamente à sequência genómica da Navl.7 humana presente no ponto de inserção: (TTAGGTAAGG ATCCGAAGGG GAAATAAAAC CTACAGGATG AGAAG) ATGGCAATGT TGCCTCCCCC AGGACCTCAG AGCTTTGTCC ATTTCACAAA ACAG (SEQ ID NO: 18). A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante na extremidade 5' da cassete de higromicina incluiu o seguinte, que indica sequência genómica da Navl. 7 humana contígua com a sequência de cassete a jusante do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo): GTATGAATAA AAAAGCATTG AAATAGGGAT TCTTGCCAAC TTGCTC (TCTCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTA TACGAAGTTA T) (SEQ ID NO: 19) . A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante no extremo 3' da cassete de higromicina incluiu o seguinte, que indica sequência de cassete contígua a sequência genómica de ratinho no extremo 3' do locus da Navl. 7 endógeno (contido dentro dos parênteses abaixo): TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGAGCTAG (CAGCTTCGGT TTTGATACAC TGTTTACAGC CTGCGAAGGT G) (SEQ ID NO: 20) . Os clones de células ES positivas foram posteriormente utilizados para implantar ratinhos fêmeas utilizando o método VELOCIMOUSE® (supracitado) para gerar uma camada de crias que contém uma substituição do locus da Navl. 7 endógeno com um locus da Navl. 7 humano. A célula ES alvo descritas acima foram utilizadas como células ES dadoras e introduzidas num embrião de ratinho em etapa de 8 células através do método VELOCIMOUSE® (supra). Identificaram-se ratinhos portando um locus da Navl. 7 humano através de genotipação utilizando um ensaio de modificação de alelos (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença de um locus da Nav1.7 humano.

Os ratinhos portando um locus da Navl. 7 humano podem ser reproduzidos para uma estirpe de ratinhos de eliminador Cre (veja-se, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional N.° WO 2009/114400) de forma a remover qualquer cassete de higromicina com lox introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removida, por exemplo, na etapa de células ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de higromicina é retida no ratinho.

As crias são genotipadas e seleciona-se uma cria heterozigótica para um locus da Navl. 7 humano para caracterizar a humanização de Navl. 7 .

Exemplo III

Humanização da Ansa Extracelular dos Segmentos

Transmembranares 5 a 6 no Dominio I de um locus da Navl. 7 Endógeno

Construiu-se um vetor de direcionamento para a humanização da ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I (DI/S5-S6) através de método de reparação GAP (descrito acima)

utilizando o clone BAC de ratinho RP23-20C24 e o clone BAC humano RP11-45AJ20 (FIG. 4) . O método de reparação GAP utilizou-se para substituir um fragmento de ADN de 13,8 kb que contém os exões 7 a 9 do locus da Navl. 7 endógeno com um fragmento de ADN de 10 kb que contém os exões 7 a 9 do locus da Navl.7 humano. Adicionou-se uma cassete de neomicina flanqueada por sítios loxP à extremidade do fragmento humano de 10 kb que contém os exões 7 a 9 do locus da Navl. 7 humano (FIG. 4, centro) .

Os braços de homologia a montante e a jusante foram derivados a partir de ADN de BAC de ratinho nas posições 5' e 3' dos exões 7 e 9, respetivamente, e adicionados ao fragmento humano de 10 kb-cassete de neomicina para criar o vetor de direcionamento final para a humanização da ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Domínio I do locus da Navl. 7 endógeno que continha de 5' a 3' um braço de homologia 5' que contém 35 kb de ADN de ratinho a 5' do exão 7 do locus da Navl. 7 endógeno, um fragmento de ADN de 10 kb que contém os exões 7 a 9 do locus da Navl.7 humano, uma cassete de neomicina flanqueada por sítios loxP, e um braço de homologia 3' que contém 27 kb de ADN de ratinho a 3' do locus endógeno de Navl.7. O vetor de direcionamento foi linearizado através de digestão com PspX e Sail e posteriormente utilizado na recombinação homóloga em células bacterianas para alcançar uma substituição orientada dos exões 7 a 9 do locus da Navl.7 endógeno com os exões 7 a 9 do locus da Navl. 7 humano (FIG. 4, fundo) .

O ADN de BAC alvo (acima descrito) foi utilizado para eletroporar células ES de ratinho para criar células ES modificadas compreendendo uma substituição dos exões 7 a 9 do locus da Navl.7 endógeno com um fragmento genómico compreendendo os exões 7 a 9 de um locus da Navl. 7 humano. As células ES positivas que contém um fragmento genómico compreendendo os exões 7 a 9 de um gene da Navl. 7 humano foram identificadas através de um ensaio quantitativo utilizando sondas Taqman® (Lie e Petropoulos, supra) . A região a montante fora da região modificada do locus endógeno confirmou-se através de PCR utilizando os iniciadores 869TUPF (GGACTACAAC TGTTTATGGG CAAC; SEQ ID NO: 21) e 869TUPR (TCAATTCTTC TTCACTCTCA GCAG; SEQ ID NO: 22) e a sonda 869TUPP (TCCGGAAGGA CCTTGAGCAG AATGA; SEQ ID NO: 23), ao passo que a região a jusante fora da região modificada do locus endógeno foram confirmadas com os iniciadores 869TDPF (CAACAGGTGA GCAGCAACAG; SEQ ID NO: 24) e 869TDPR (GCAGGAGACA CATACACCAG AC; SEQ ID NO: 25) e a sonda 869TDPP (AAACACGCAT GTCTGAAGGC AGTCGG; SEQ ID NO: 26) . A presença da cassete de neomicina a partir do vetor de direcionamento confirmou-se utilizando os mesmos iniciadores e sonda conforme descritos no Exemplo I. A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de deleção a montante incluiu o seguinte, que indica sequência de ratinho endógena a montante do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo) ligada contiguamente à sequência genómica da Navl. 7 humana presente no ponto de inserção: (TACATTTTAA GGACTAAAAA CCATCGTGGG GGCCCTGATC CAATCAGTGA AGAAGCTCTC TGACGTCATG ATCCTCACTG TGTTCTGTCT CAGTGTGTTC) GCACTAATTG GACTACAGCT GTTCATGGGA AACCTGAAGC ATAAATGTTT TCGAAATTCA CTTGAAAATA ATGAAACATT AGAAAGCATA AT-GAATACCC T (SEQ ID NO: 27) . A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante no extremo 5' da cassete de neomicina incluiu o seguinte, que indica sequência genómica da Navl. 7 humana contígua a sequência de cassete a jusante do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo): AGGTGAGTAC CAAGAGAAAC ATGCATTGTA TTTTTGAATG GCATATGTAC CTGGTGTATG TTAAGAGCCT GTATTAGGAG GTTTTTTATT TATTTGAGAA TGGAGGAAAC TCTATTA (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT) (SEQ ID NO: 28). A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante na extremidade 3' da cassete de neomicina incluiu o seguinte, que indica sequência de cassete contígua com a sequência genómica de ratinho na extremidade 3' do exão 9 do locus da Navl.7 endógeno (contido dentro dos parênteses abaixo) : TATACGAAGT TATGCTAGC (TCTGCAGACA GTCTGGGACT CCCTAATGTG CATTATTAAA ATTACAGGCA ATTTACTTGG CTGATATGAG AACAGATAGT TCTGAAGTCA TCAATAATTT TCTGCTGTGT CTGACCAGCG TT) (SEQ ID NO: 29) . Os clones de células ES positivas foram posteriormente utilizados para implantar ratinhos fêmeas utilizando o método VELOCIMOUSE® (descrito abaixo) para gerar uma ninhada de crias que contém uma substituição dos exões 7 a 9 do locus da Navl. 7 endógeno com os exões correspondentes do locus da Navl. 7 humano.

As células alvo descritas acima foram utilizadas como células ES dadoras e introduzidas num embrião de ratinho em etapa de 8 células através do método VELOCIMOUSE® (supracitado). Identificaram-se ratinhos portando a humanização dos exões 7 a 9 no locus da Navl.7 endógeno através de genotipagem utilizando um ensaio de modificação de alelos (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença das sequências da Navl. 7 humanas.

Os ratinhos portando os DI/S5-S6 no locus da Navl.7 endógeno podem ser reproduzidos para uma estirpe de ratinhos de eliminador Cre (veja-se, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional N.° WO 2009/114400) de forma a remover qualquer cassete de neomicina com lox introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removida, por exemplo, na etapa de células ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de neomicina é retida no ratinho.

As crias são genotipadas e seleciona-se uma cria heterozigótica para os DI-S5-S6 humanizados no locus da Navl. 7 endógeno para caracterizar a humanização de DI/S5-S6 da Navl. 7 .

Exemplo IV

Humanização da Ansa Extracelular dos Segmentos Transmembranares 5 a 6 no Dominio III de um locus da Navl. 7 Endógeno

Construiu-se um vetor de direcionamento para a humanização da ansa de poro extracelular que comunica os segmentos transmembranares 5 e 6 do Dominio III (DIII/S5-S6) através da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o clone BAC de ratinho BMQ-311E20 e o clone BAC humano RP11-746P5 (FIG. 5) . Amplificaram-se os exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 humano a partir do clone BAC humano RP11-746P5. Adicionou-se uma cassete de neomicina flanqueada por sítios loxP à extremidade 3' do fragmento de PCR de 2,8 kb (FIG. 5, centro) . Este fragmento de ADN ligado que contém os exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 humano e a cassete de neomicina foi utilizado para substituir uma secção de 2,4 kb do locus da Nav1.7 de ratinho endógeno que contém os exões 23 a 25 no clone BAC de ratinho BMQ-311E20 (FIG. 5).

Os braços de homologia a montante e a jusante foram derivados de ADN de BAC de ratinho nas posições 5' e 3' dos exões 23 e 25, respetivamente, e foram adicionados ao fragmento de ADN humano-cassete de neomicina para criar o vetor de direcionamento final para a humanização do DIII/S5-S6 do locus da Navl. 7 endógeno que continha de 5' a 3' um braço de homologia 5' que contém 21 kb de ADN de ratinho a 5' do exão 23 do locus da Navl. 7 endógeno, um fragmento de ADN de 2,8 kb que contém os exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 humano, uma cassete de neomicina flanqueada por sítios loxP, e um braço de homologia 3' que contém 108 kb de ADN de ratinho a 3' do exão 25 do locus endógeno de Navl. 7. O vetor de direcionamento foi linearizado através de digestão com Notl e posteriormente utilizado na recombinação homóloga em células bacterianas para alcançar uma substituição direcionada dos exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 endógeno com os exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 humano (FIG. 5, fundo). O ADN de BAC alvo (acima descrito) foi utilizado para eletroporar células ES de ratinho para criar células ES modificadas compreendendo uma substituição dos exões 23 a 25 do locus da Navl.7 endógeno com um fragmento genómico compreendendo os exões 23 a 9 de um locus da Nav1.7 humano. As células ES positivas que contém um fragmento genómico compreendendo os exões 23 a 25 de um gene da Navl. 7 humano foram identificadas através de um ensaio quantitativo utilizando sondas TAQMAN® (Lie e Petropoulos, supracitado). A região a montante fora da região modificada do locus endógeno confirmou-se através de PCR utilizando os iniciadores 869TUPF (GCTTGGGCTT GCACCTTTA; SEQ ID NO: 30) e 892TUPR (TGCGTTGACC ACTACCTGAT AC; SEQ ID NO: 31) e a sonda 892TUPP (TCTGCATTGG CGTCTGTTTG TCA; SEQ ID NO: 32), ao passo que a região a jusante fora da região modificada do locus endógeno foi confirmada com os iniciadores 869TDP3F (TGACTTGCCC TATCAATCTG AGATC; SEQ ID NO: 33) e 892TDP3R (GCTCACACTG TATACACACA AAATCTTC; SEQ ID NO: 34) e a sonda 892TDP3P (TCACTGCCTA TGATAAAGT; SEQ ID NO: 35) . A presença da cassete de neomicina a partir do vetor de direcionamento confirmou-se utilizando os mesmos iniciadores e sonda conforme descritos no Exemplo I. A inserção da sequência da Navl. 7 humana foi confirmada através de PCR utilizando os iniciadores 892HF (CACGGTTTCC TGCAAGTCAA; SEQ ID NO: 36) e 892HR (GGGACACTTA CAACTTGAAG CA; SEQ ID NO: 37) e a sonda 892HP (TCGTTCCGAA TGTTTTGCCC TTATGA; SEQ ID NO: 38) . A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de deleção a montante incluiu o seguinte, que indica sequência de ratinho endógena a montante de exão 23 do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo) ligada contiguamente à sequência genómica da Navl. 7 humana presente no ponto de inserção: (TTTCATTTAT TTGAAGTGCA ATATCATCTT GGCCATCTAC TCCTCTGTAT GCTAGTAG) GTAAGCCTGG TGATCACAGA (SEQ ID NO: 39). A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante na extremidade 5' da cassete de neomicina incluiu o seguinte, que indica sequência genómica da Navl. 7 humana contígua com a sequência de cassete a jusante do ponto de inserção (contida dentro dos parênteses abaixo) : GACTAGTATA CAATTACAAA TATGC (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT) (SEQ ID NO: 40) . A sequência nucleotidica ao outro lado do ponto de inserção a jusante na extremidade 3' da cassete de neomicina incluiu o seguinte, que indica sequência de cassete contígua com a sequência genómica de ratinho na extremidade 3' do exão 25 do locus da Navl. 7 endógeno (contida dentro dos parênteses abaixo): TATACGAAGT TATGCTAGC (TTTCCTGCTA ACCATCATTC TGGGG-TATGT GTTATGATGG AAGTTAAGTG ACAGTTACTT ATAATATGGC TGCT) (SEQ ID NO: 41) . Os clones de células ES positivas foram posteriormente utilizados para implantar ratinhos fêmeas utilizando o método VELOCIMOUSE® (descrito abaixo) para gerar uma ninhada de crias que contém uma substituição dos exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 endógeno com os exões correspondentes do locus da Nav1.7 humano.

Os ratinhos que contém uma humanização dos exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 endógeno com um vetor de direcionamento do DIII/S5-S6 foram gerados através de eletroporação de um ADN de BAC alvo (descrito acima) em células ES de ratinho. Os clones de células Es positivos foram confirmados por rastreio e cariotipagem de Taqman™ Os clones de células ES positivas foram posteriormente utilizados para implantar ratinhos fêmeas utilizando o método VELOCIMOUSE® (descrito abaixo) para gerar uma ninhada de crias que contém uma humanização dos exões 23 a 25 do locus da Navl. 7 endógeno.

As células ES alvo descritas acima foram utilizadas como células ES dadoras e introduzidas num embrião de ratinho em etapa de 8 células através do método VELOCIMOUSE® (veja-se, por exemplo, o documento de patente US N.° 7.294.754 e Poueymirou et al., supra). Identificaram-se ratinhos portando a humanização dos exões 23 a 25 no locus da Navl. 7 endógeno através de genotipagem utilizando um ensaio de modificação de alelos (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença das sequências da Navl.7 humanas.

Os ratinhos portando os DIII/S5-S6 no locus da Navl. 7 endógeno podem ser reproduzidos para uma estirpe de ratinhos de eliminador Cre (veja-se, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional N.° WO 2009/114400) de forma a remover qualquer cassete de neomicina com lox introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removida, por exemplo, na etapa de células ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de neomicina é retida no ratinho.

As crias são genotipadas e seleciona-se uma cria heterozigótica para os DIII-S5-S6 humanizados no locus da Navl.7 endógeno para caracterizar a humanização de DIII/S5-S6 da Navl. 7 .

Exemplo V

Fenotipagem Comportamental de Ratinhos com Navl. 7 Humanizada

Os métodos atuais de estudo dos efeitos da manipulação farmacológica da Navl. 7 humana apoiam-se em células transfetadas que são cultivadas in vitro. Estas células que estão manipuladas para expressar a proteína Navl. 7 humana carecem de proteínas auxiliares e podem não ser totalmente representativas dos mecanismos pelos quais a Navl. 7 humana funciona in vivo. Assim, geraram-se ratinhos manipulados para expressar a Navl. 7 humana ou uma Navl. 7 quimérica tendo uma ansa de poro extracelular humanizada conforme descrito nos Exemplos 2-4 e analisaram-se para entender a função da Navl. 7 in vivo.

Brevemente, dois grupos (n=6/6 cada; macho/fêmea com 10-20 semanas) de ratinhos, de tipo selvagem (Scn9a+/+) e ratinhos heterozigóticos para uma substituição de um gene da Navl. 7 de ratinho com um gene da Navl. 7 humana (Scn9ahum/+) , foram sujeitos cada um a uma variedade de estímulos nocifensivos (térmico por placa quente, térmico por sacudidela da cauda e pressão mecânica nociva). Os resultados mostram-se nas FIGs. 6A - 6C.

Numa experiência semelhante, dois grupos (n=10 cada; fêmeas com 10-20 semanas) de ratinhos, de tipo selvagem (Scn9a+/+) e ratinhos homozigóticos para um gene da Navl. 7 quimérico que contém uma sequência humana que codifica uma ansa de poro extracelular (DI/S5-S6; Scn9a3'1/3'3) , foram sujeitos cada um a uma variedade de estímulos nocifensivos (térmico por placa quente, térmico por sacudidela da cauda, mecânico nociva e hipernociceção utilizando Adjuvante Completo de Freund). Os resultados mostram-se nas FIGs. 7A - 7D. Não se observaram diferenças significativas em qualquer dos desfechos agudos entre ratinhos Scn9a+/+ e Scn9ahum/+ ou Scn9a+/+ e Scn9a3'1/3'1. Estes resultados demonstram que ratinhos humanizados que contém ou um gene da Navl.7 humana de comprimento completo em lugar do gene endógeno (conforme descrito no Exemplo 2) ou uma sequência humana que codifica uma ansa de poro extracelular (conforme descrito no Exemplo 3) exibem comportamentos nocicetivos normais como resposta a estímulos nocifensivos comparados com ratinhos controlo de tipo selvagem.

Conforme mostrado no presente Exemplo, ratinhos manipulados para expressar proteína Navl. 7 totalmente ou parcialmente humana na superfície de neurónios respondem a estímulos nocicetivos de forma semelhante conforme comparados com os de tipo selvagem e como tal proporcionam uma plataforma para identificar antagonistas da subunidade α da Navl.7 e/ou uma ansa de poro extracelular particular. Tais antagonistas podem ser úteis no bloqueio de funções específicas e atividades neuronais associadas no tratamento de várias síndromes de dor clínica.

Exemplo VI

Identificação e Função de DRG em Ratinhos com Navl. 7 Humanizada

Geraram-se anticorpos humanos específicos para a Navl. 7 humana e analisaram-se para a ligação a células neuronais isoladas a partir de ratinhos com Navl. 7 humanizada descritos nos Exemplos 2-4.

Brevemente, administrou-se a ratinhos VELOCIMMUNE® (documento de patente US 6.956.541) antigénio da Navl. 7 humana (hNav1.7) com adjuvante (por exemplo adjuvante de

Freund completo ou incompleto, sistema de adjuvantes MPL+TDM (Sigma), ou RIBI (muramil dipéptidos (veja-se 0'Hagan 2000 Vaccine Adjuvant, por Human Press, Totowa, NJ) . Monitorizou-se a resposta imune e isolaram-se anticorpos que contém regiões variáveis humanas e regiões constantes de ratinho a partir de linhas celulares de hibridoma fabricadas a partir de células B de expressão de anticorpos colhidas a partir de ratinhos imunizados. Alternativamente, podem isolar-se células de hibridoma específicas de antigénio através de citometría de fluxo. Podem identificar-se também anticorpos específicos para hNavl. 7 através de isolamento direto de esplenocitos (por exemplo, veja-se o documento de patente U.S. 7.852.298). Obtiveram-se vários anticorpos de hNavl. 7 a partir dos métodos acima expostos e utilizaram-se células HEK293 modificadas para expressar de forma estável a Navl. 7 humana ou a Navl.5 humana para identificar anticorpos que se unem especificamente a Navl. 7 mas não a Navl. 5 conforme determinado por citometría de fluxo.

Testaram-se anticorpos anti-hNav1.7 selecionados para determinar a sua capacidade de bloquear a função eletrofisiológica (por exemplo, corrente, fluxo iónico, etc.) do canal da Navl. 7 utilizando o sistema IONWORKS QUATTRO™ (IWQ, Molecular Devices), o sistema Port-a-Patch® (Nanion Techonologies) e o sistema QPatch (Sophion

Bioscience). O Quadro 1 estabelece a percentagem de inibição média para cinco anticorpos anti-hNav1.7 selecionados: menos de 15% (-), 15-30% (+), superior a 30% (++). nd: não determinado.

Imunohistoquímica. 0 processamento da dor é ο resultado de interações complexas entre várias proteínas, recetores e canais que se expressam nos neurónios nocicetivos dos gânglios espinais dorsais (DRG). Avaliaram-se anticorpos anti-hNav1.7 selecionados para a ligação aos neurónios de DRG colhidos a partir de ratinhos modificados para expressar a Navl. 7 humana (Scn9ahum/+, Exemplo 2), ratinhos modificados para expressar uma Navl. 7 quimérica que contém uma ansa de poro extracelular humana (Scn9a3'1/3'1, Exemplo 3) e ratinhos de tipo selvagem (Scn9a+/+) .

Brevemente, dissociaram-se DRGs lombares colhidos a partir de ratinhos Scn9ahum/+, Sen 9a3'1/3'3 e Scn9a+/+ e de ratos Scn9a+/+ {rScn9a+/+) e colocados em placas numa densidade de 5,5xl04 células/poço em placas de 96 poços tratadas com poli-DL-ornitina (0,1 mg/1) e laminina (5 pg/ml) seguido de incubação a 37 °C em 96.5% de ar e 3.5% de CO2. Mantiveram-se os neurónios em cultura durante 3 a 8 dias em DMEM suplementado com fator de crescimento de nervos a 50 ng/ml, penicilina/estreptomicina a 100 U/ml, vitaminas MEM, e soro bovino fetal inativado por calor a 10%. As células colocadas em placas foram então fixadas em PFA a 4% e sacarose a 4% em PBS, pH 7,2 durante 30 minutos. As células foram então lavadas com PBS seguido de bloqueio em soro de cabra normal a 20% durante uma hora à temperatura ambiente. Permeabilizaram-se então os neurónios em soro de cabra normal a 10% com Triton X-100 a 0,1% antes da imunocoloração para confirmar a atividade de ligação a uma Navl. 7 humana ou quimérica (ou de ratinho e/ou rato) na superfície celular dos neurónios de DRG. O Quadro 2 estabelece a ligação ( + ) ou não ligação (-) específica de espécie a neurónios de DRG para anticorpos anti-Nav1.7 selecionados.

Quadro 2

Anticorpos anti-hNav1.7 selecionados demonstraram ligar-se a neurónios de DRG expressando uma proteína Navl. 7 humana (por exemplo, Ab3, Ab4 e Ab5), uma proteína Navl.7 quimérica (por exemplo, Ab4) ou uma proteína Navl. 7 de ratinho (por exemplo, Ab2) na superfície celular, ao passo que não se observou ligação a neurónios de DRG expressando uma proteína Navl. 7 de ratinho ou de rato para outros anticorpos (por exemplo, Abl e Ab5) . Outros anticorpos anti-hNav1.7 demonstraram reatividade cruzada entre espécies mostrando ligação a neurónios de DRG de ratinhos com Navl. 7 humanizada, ratinhos de tipo selvagem e ratos (por exemplo, Ab3 e Ab4).

Ensaio sobre a Libertação de Neuropéptido Relacionado com o Gene da Calcitonina (CGRP) . 0 neuropéptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) liberta-se a partir dos terminais periféricos e espinais dorsais dos neurónios nocicetivos de fibras A e C peptidérgicas como resposta a estímulos. A libertação de neuropéptido inicia a inflamação neurogénica, desgranulação de mastócitos, e outras reações inflamatórias, que resultam na hiperalgesia/sensação à dor. Mediadores inflamatórios tais como prostaglandina E2, bradiquinina, serotonina, histamina e capsaicina sensibilizam e excitam diretamente os DRG nocicetivos in vitro e in vivo conduzindo como tal à libertação de CGRP. Os nocicetores sensibilizados exibem um limiar de ativação reduzido, atividade espontânea aumentada e uma resposta aumentada a estímulos supralimiares. Assim, a sensibilização de DRGs e o disparo de potenciais de ação pode alcançar-se in vitro com diferentes mediadores inflamatórios resultando na libertação de cGRP e como tal servem como um meio de medir a função nocicetiva de DRG. A ativação dos nocicetores primários determinou-se em culturas de DRG in vitro primários isolados a partir de Navl.7 humanizada e ratinhos de tipo selvagem através da medição da libertação de CGRP utilizando um kit de imunoensaio de enzimas (EIA) (Cayman, distribuído por SPlbio, França).

Brevemente, lavaram-se uma vez DRGs de 3 a 8 dias de vida num tampão de ensaio e mantiveram-se a 37 °C até à adição de uma mistura inflamatória (por exemplo prostaglandina E2 a 10 μΜ, bradiquinina a 10 μΜ e capsaicina a 1 μΜ) . Dois inibidores conhecidos de canais de Nav, a tetrodotoxina (TTX) e a ProTX-II, foram utilizadas para determinar se a Navl. 7 tem um papel na libertação de CGRP induzida por uma mistura inflamatória in vitro. Testou-se a TTX em concentrações de 1 μΜ, uma concentração inibitória eficaz para os canais sensíveis a TTX, e 10 μΜ. A ProTX-II inibe em grande parte a Navl.7 a 10 μΜ (Schmalhofer, W.A, Calhoun, J., Burrows, R., Bailey, T., Kohler, M.G., Weinglass, A.B., Kaczorowski, G.J., Garcia, M.L., Koltzenburg, M., Priest, B.T. (2008) ProTx-II, a Selective Inhibitor of Navl.7 Sodium Channels, Blocks Action Potential Propagation in Nociceptors. Molecular Pharmacology 74 (5) :1476-1484) . Incubaram-se os neurónios durante 20 minutos com o inibidor (TTX ou ProTX-II), seguido de estimulação com a mistura inflamatória durante 20 minutos ou com o inibidor combinado com a mistura inflamatória durante 20 minutos. Prepararam-se diluições compostas em tampão de ensaio e adicionaram-se amostras por duplicado numa placa EIA de CGRP humano e incubadas durante a noite. Mediu-se a concentração de CGRP libertado pelos DRGs no dia seguinte utilizando um ensaio ELISA. Calcularam-se médias (média +/- desvio-padrão) para cada grupo de condições. A FIG. 8 mostra a resposta à dose para diferentes concentrações de DRGs nos ensaios de CGRP utilizando TTX sob as condições mencionadas abaixo. Os resultados para a TTX mostram-se no Quadro 3. Os resultados para a ProTX-II mostram-se no Quadro 4. IM: mistura inflamatória.

Numa experiência semelhante, testou-se também o papel da Navl.7 na libertação de CGRP potenciada por TTX em DRGs colhidos a partir de ratinhos Scn9a3'1/3'1 utilizando um anestésico local de tipo amida aminada (lidocaina) . Este ensaio realizou-se para confirmar que a potenciação da libertação de CGRP não se deveu a um efeito não especifico das toxinas nos neurónios de DRG. Os resultados mostram-se no Quadro 5. IM: mistura inflamatória.

Noutro ensaio semelhante, anticorpos anti-hNavl.7 selecionados foram analisados quanto ao seu efeito na libertação de CGRP in vitro em DRG isolados a partir de ratinhos Scn9a+/+r Scn9ahum/+ e Scn9a3'1/3'1. Os resultados mostram-se nos Quadros 6-9. IM: mistura inflamatória.

Conforme mostrado no presente Exemplo, quando os neurónios (DRGs) expressando uma proteína Navl.7 de tipo selvagem ou quimérica na superfície celular são pré-incubados com inibidores conhecidos da Navl. 7 (TTX ou ProTX-II, Quadro 3 ou 4, respetivamente) ou um anestésico local não específico de Navl.7 (lidocaina, Quadro 5), potencia-se notavelmente a libertação de CGRP induzida pela mistura inflamatória. No entanto, quando se adicionou tanto um inibidor da Navl. 7 como um anestésico local à mistura inflamatória previamente à exposição aos neurónios, não se observou potenciação da libertação de CGRP induzida pelo inflamatório. Assim, estes ensaios mostram que a inibição da Navl.7 antes da estimulação com mediadores inflamatórios (prostaglandina E2, bradiquinina, e capsaicina) potência a libertação de CGRP em neurónios de DRG a partir de ratinhos de tipo selvagem e humanizados.

Adicionalmente, quando se incubam os neurónios (DRGs) com um anticorpo anti-hNavl. 7, potencia-se notavelmente a libertação de CGRP induzida pela mistura inflamatória (Quadros 6-9) . Estes ensaios demonstram que as proteínas Navl.7 humanas e quiméricas expressas na superfície celular de DRGs em ratinhos humanizados são funcionais. Este Exemplo demonstra que os anticorpos anti-hNav1.7 foram capazes de imitar a potenciação mediada por TTX da libertação de CGRP induzida por mediadores inflamatórios em neurónios de DRG a partir de ratinhos Sch9ahum/+ e Scn9a3'1/3'1. Assim, os ratinhos com Navl. 7 humanizada {Scn9ahum/+, Scn9a3'1/3'1 e Scn9a3'3/3'3) descritos no presente documento proporcionam um sistema para a caracterização in vitro da ligação de anticorpos anti-hNav1.7 e da inibição da função de canais in vivo. Além disso, estes ratinhos representam um sistema modelo in vivo para a examinação de novos antagonistas específicos de Nav1.7 e avaliação do seu potencial terapêutico para tratar respostas mediadas pela Navl. 7 .

Exemplo VII

Geração de Linhas Celulares de DRG Imortalizadas a partir de Ratinhos Humanizados

Podem isolar-se neurónios a partir de ratinhos humanizados e ser imortalizados para estudo continuo a longo prazo da função da Nav humana in vitro.

Podem imortalizar-se neurónios de DRG através de qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, ver o documento de patente US 2009/0298095A1). A imortalização típica de DRGs isolados alcança-se empregando um vetor de origem retroviral que foi modificado com sequências de ADN codificando um oncogene (por exemplo myc) e um marcador selecionável (por exemplo, a neomicina). Oncogenes adequados que podem ser clonados num vetor para imortalizar uma célula de DRG isolada incluem fatores de crescimento de mitógenos (por exemplo, c-Sis), tirosina quinases de recetores (por exemplo, recetor de fatores de crescimento epidérmicos, recetor de fatores de crescimento derivados de plaquetas, e recetor de fatores de crescimento endoteliais vasculares), tirosina quinases citoplásmicas (por exemplo, família Src, família Syk-ZAP-70, e família BTK de tirosina quinases), serina/treonina quinases citoplásmicas e as suas subunidades reguladoras (por exemplo, sobre expressão da Raf quinase e de quinases dependentes de ciclinas), GTPases reguladoras (por exemplo, Ras), e fatores de transcrição (por exemplo, myc). Uma vez construído o vetor para albergar ambas sequências de ADN de tal forma que sejam capazes de transcrição dentro da célula, pode ser utilizado para criar uma linha celular de DRG imortalizadas através de transfeção em DRGs isolados a partir de um ratinho humanizado conforme descrito nos Exemplos 2-4.

Brevemente, podem preparar-se neurónios de DRG primários dissociados através de métodos conhecidos na técnica (ver Wood, J.N., Bevan, S.J., Coote, P.R., Dunn, P.M., Harmar, A. Hogan, P., Latchman, D.S., Morrison, C., Rougon, G., Theveniau, M., Wheatley, S. 1990. Novel Cell lines display properties of nociceptive sensory neurons. Proceedings of Biological Sciences, The Royal Society 241 (1302):187-94; Raymond, H.K., Thode, S., Zhou, J., Friedman, G.C., Pardinas, J.R., Barrere, C., Johnson, R.M., Sah, D.W.Y. 1999. Immortilized human dorsal root ganglion cells differentiate into neurons with nociceptive properties. Journal of Neuroscience 19 (13) :5420-5428; Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. 2007. Immortialization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J of the Perhipheral Nervous System 12:121-130) . Transfetam-se então culturas de DRGs isolados que expressam uma Navl. 7 humana conforme descrito nos Exemplos 2-4, por exemplo por eletroporação, com um vetor candidato fabricado conforme descrito acima.

Após a transfeção, deixam-se crescer as culturas celulares em meio de seleção e mantêm-se no meio de seleção durante até 1-2 semanas até se terem formado colónias isoladas com 200-300 células. Escolhem-se e ampliam-se as colónias utilizando métodos de cultura padrão quando alcançada uma confluência de cerca de 80-90%. Podem rastrear-se células a partir de culturas para a expressão da proteína Navl. 7 humana através de Southern ou Western blot utilizando sondas desenhadas para a sequência da Navl. 7 humana. Alternativamente, pode alcançar-se a confirmação da proteína de canal Navl. 7 humana nas células transfetadas através a reação em cadeia da polimerase em ADN ou ARN isolados a partir das células transfetadas.

Uma vez demonstrada a capacidade de autorreplicação por parte da linha celular de DRG imortalizada durante múltiplas gerações, será útil para vários ensaios diferentes, incluindo, por exemplo, análise das propriedades neuronais do canal Navl.7 humano, ensaios de toxicidade neuronal, medição da resposta de DRG a estímulos nocicetivos, ensaios de patch-clamp, rastreio de fármacos de alto rendimento, e teste de bloqueadores específicos da Navl. 7 (por exemplo, um anticorpo anti-Nav1.7) .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> ENSAIO DE LIBERTAÇÃO DE NEUROPÉPTIDOS PARA CANAIS DE SÓDIO <130> 210-002EPT2 <150> EP 12167014.5 <151> 07-05-2012 <15Ο> US 13/236.117 <151> 19-09-2011 <150> US 13/155.491 <151> 08-06-2011 <150> US 61/485.488 <151> 12-05-2011 <160> 43 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 1 gggacttctc tgggttcagt ta 22

<210> 2 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 2 aaaggctctc aatgggaaac aag 23

<210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 3 tcaatgactt gacataatgc atgcactcc 29

<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 4 atgtcagcca atccttctaa agtg 24

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 5 cgttttgcct aaggcggtac 20 <210> 6 <211> 25

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 6 tcctatgagc ccatcacaac cacac 25

<210> 7 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 7 ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 8 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 8 gaacacggcg gcatcag 17

<210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 9 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 10 <211> 115 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 10 ctagctgagc tgtcaecaca cattgctcet aceacgtatt gtacagctac tgcaagagca 60 ccacagttgg ctttctgtat eataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttat 115

<210> 11 <211> 148 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 11 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatagcttc ggttttgata cactgtttac 60 agcctgcgaa ggtgactcac tcgtgttaat aagaotcttt tacggaggtc tatgccaaac 120 tctttttatc aaatattctc aaaggcag 148

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 12 atcaaaggaa cccaaagaag 20

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 13 gaagggcagc tgtttgccag 20

<210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 14 atgaagaagc cccaaagcca agca 24

<210> 15 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 15 tgcggccgat cttagcc 17

<210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 16 ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 17 acgagcgggt tcggcccatt c 21

<210> 18 <211> 99 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 18 ttaggtaagg atccgaaggg gaaataaaac ctacaggatg agaagatggc aatgttgcct 60 cccccaggac ctcagagctt tgtccatttc acaaaacag 99

<210> 19 <211> 87 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 19 gtatgaataa aaaagcattg aaatagggat tcttgccaac ttgctctctc gagataactt 60 cgtataatgt atgctatacg aagttat 87

<210> 20 <211> 90 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 20 tatacgaagt tatgctagta actataacgg tcctaaggta gcgagctagc agcttcggtt 60 ttgatacact gtttacagcc tgcgaaggtg 90

<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 21 ggactacaac tgtttatggg caac 24

<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 22 tcaattcttc ttcactctca gcag 24

<210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 23 tccggaagga ccttgagcag aatga 25

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 24 caacaggtga gcagcaacag 20

<210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 25 gcaggagaca catacaccag ac 22

<210> 26 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 26 aaacacgcat gtctgaaggc agtcgg 26

<210> 27 <211> 201 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 27 tacattttaa ggactaaaaa ccatcgtggg ggccctgatc caatcagtga agaagctctc 60 tgacgtcatg atcctcactg tgttctgtct cagtgtgttc gcactaattg gactacagct 120 gttcatggga aacctgaagc ataaatgttt tcgaaattca cttgaaaata atgaaacatt 180 agaaagcata atgaataccc t 201

<210> 28 <211> 157 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 28 aggtgagtac caagagaaac atgeattgta tttttgaatg gcatatgtac ctggtgfcatg 60 ttaagagcct gtattaggag gttttttatt tatttgagaa tggaggaaac tctattactc 120 gagataactt cgtataatgt atgetatacg aagttat 157

<210> 29 <211> 141 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 29 tatacgaagt tatgctagct ctgcagacag tctgggactc cctaatgtgc attattaaaa 60 ttacaggcaa tttacttggc tgatatgaga acagatagtt ctgaagtcat caataatttt 120 ctgctgtgtc tgaccagcgt t 141

<210> 30 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 30 gcttgggctt gcaccttta 19

<210> 31 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 31 tgcgttgacc actacctgat ac 22

<210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 32 tctgcattgg cgtctgtttg tea 23

<210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 33 tgacttgccc tatcaatctg agate 25

<210> 34 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 34 gctcacactg tatacacaca aaatette 28

<210> 35 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 35 tcactgccta tgataaagt 19

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 36 cacggtttcc tgcaagtcaa 20

<210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 37 gggacactta caacttgaag ca 22

<210> 38 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 38 tcgttccgaa tgttttgccc ttatga 26

<210> 39 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 39 tttcatttat ttgaagtgca atatcafcctt ggccafcctac tcctctgtat gctagtaggt 60 aagcctggtg atcacaga 78

<210> 40 <211> 65 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 40 gactagtata caattacaaa tatgcctcga gataacttcg tataatgtat gctatacgaa 60 gttat 65

<210> 41 <211> 93 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 41 tatacgaagt tatgctagct ttcctgctaa ccatcattct ggggtatgtg ttatgatgga 60 agttaagtga cagttactta taatatggct get 93

<210> 42 <211> 9771 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 42 cggggctgct acctccacgg gcgcgccctg gcaggagggg cgcagtctgc ttgcaggcgg 60 tcgccagcgc tccagcggcg gctgtcggct ttccaattee gccagetcgg etgaggctgg 120 gctagcctgg gtgccagtgg ctgctagcgg caggcgtccc ctgagcaaca ggagcccaga 180 gaaaaagaag cagccctgag agagcgccgg ggaaggagag gcccgcgccc tctcctggag 240 ccagattctg caggtgcact gggtggggat gatcggcggg ctaggttgca agcctcttat 300 gtgaggagct gaagaggaat taaaatatac aggatgaaaa gatggcaatg ttgcctcccc 360 caggacctca gagctttgtc catttcacaa aacagtcfcct tgccctcatt gaacaaegea 42Q ttgctgaaag aaaatcaaag gaacccaaag aagaaaagaa agatgatgat gaagaagccc 480 caaagccaag cagtgacttg gaagctggca aacagctgcc cttcatctat ggggacattc 540 ctcccggcat ggtgtcagag cccotggagg acttggaccc ctactatgca gacaaaaaga 600 ctttcatagt attgaacaaa gggaaaacaa tcttccgttt caatgccaca cctgctttat 660 atatgctttc tcctttcagt cctctaagaa gaatatctat taagatttta gtacactcct 720 tattcagcat gctcatcatg tgcactattc tgacaaactg catatttatg accatgaata 780 acccaccgga ctggaccaaa aatgtcgagt acacttttac tggaatatat acttttgaat 840 cacttgfcaaa aatccttgca agaggcttct gtgtaggaga attcactttt cttcgtgacc 900 cgtggaactg gctggatttt gtcgtcattg tttttgcgta tttaacagaa tttgtaaacc 960 taggcaatgt ttcagcfcctt cgaactttca gagtattgag agctttgaaa actatttctg 1020 taatcccagg cctgaagaca attgtagggg ctttgatcca gtcagtgaag aagctttctg 1080 atgtcatgat cctgactgtg ttctgtctga gtgtgtttgc actaattgga ctacagctgt 1140 tcatgggaaa ootgaagcat aaatgttttc gaaattcact tgaaaataat gaaaeattag 1200 aaagcataat gaatacccta gagagtgaag aagactttag aaaatatttt tattacttgg 1260 aaggatccaa agatgctctc ctttgtggtt toagcacaga ttoaggtcag tgfcccagagg 1320 ggtacacctg tgtgaaaatt ggcagaaacc ctgattatgg cfcacacgagc tttgacactt 1380 tcagctgggc cttcttagcc ttgtttaggc taatgaccca agattactgg gaaaaccttt 1440 accaacagac gctgcgtgct gctggoaaaa cctacatgat cttctttgte gtagtgattt 1500 tcctgggctc ettttatcta ataaacttga tcctggetgt ggttgccatg gcatatgaag 1560 aacagaacca ggcaaacatt gaagaagcta aacagaaaga attagaattt caacagatgt 1620 tagaccgtct taaaaaagag caagaagaag ctgaggcaat tgcagcggca gcggctgaat 1680 atacaagbat taggagaagc agaattatgg gcctctcaga gagttcttct gaaacatcca 1740 aactgagctc taaaagtgct aaagaaagaa gaaacagaag aaagaaaaag aatcaaaaga 1800 agctctccag tggagaggaa aagggagatg etgagaaatt gtcgaaatca gaatcagagg 1860 acagcatcag aagaaaaagt ttccaccttg gtgtcgaagg gcataggcga gcacatgaaa 1920 agaggttgtc tacccccaat cagtcaccac tcagcattcg tggotcattg ttttctgcaa 1980 ggcgaagcag cagaacaagt ctttttagtt teaaaggcag aggaagagat ataggatctg 2040 agactgaatt tgccgatgat gagcacagca tttttggaga caatgagagc agaaggggct 2100 cactgtttgt gccccacaga ccccaggagc gacgcagcag taacatcagc caagccagta 2160 ggtecccaec aatgctgccg gtgaaeggga aaatgcacag tgctgtggae tgcaaoggtg 2220 tggtctccct ggttgatgga cgctcagccc tcatgctccc caatggacag cttctgccag 2280 agggcacgac caatcaaata cacaagaaaa ggcgttgtag ttcctatctc ctttcagagg 2340 atatgctgaa tgatcccaac ctcagacaga gagcaatgag tagagcaagc atattaacaa 2400 acactgtgga agaacttgaa gagtccagac aaaaatgtcc accttggtgg tacagatttg 2460 cacacaaatt cttgatctgg aattgctctc catattggat aaaattcaaa aagtgtatct 2520 attttattgt aatggatcct tttgtagate ttgcaattae catttgcata gttttaaaca 2580 cattatttat ggctatggaa caccaoccaa tgactgagga attcaaaaat gtaettgeta 2640 taggaaattt ggtctttact ggaatctttg cagctgaaat ggtattaaaa ctgattgcca 2700 tggatccata tgagtatttc caagtaggct ggaatatttt tgacagcctt attgtgactt 2760 taagtttagt ggagctcttt etageagatg tggaaggatt gtcagttctg cgatcattca 2820 gaetgctccg agtettcaag ttggoaaaat ectggccaac attgaacatg ctgattaaga 2880 tcattggtaa ctcagtaggg gctctaggta aoctaaeotfc agtgttggco atcatcgtct 2940 tcatttttgc tgtggtcggc atgeagetet ttggtaagag ctacaaagaa tgtgtetgca 3000 agatcaatga tgactgtacg ctcccacggt ggcacatgaa cgacttcttc cactccttcc 3060 tgattgtgtt ccgcgtgctg tgtggagagt ggatagagac catgtgggac tgtatggagg 3120 tcgctggtca agctatgtgc cttattgttt acatgatggt catggtcatt ggaaacctgg 3180 tggtcetaaa cctatttctg geettattat tgagctcatt tagttcagac aatcttacag 3240 caattgaaga agaecctgat gcaaacaacc tccagattgc agtgactaga attaaaaagg 3300 gaataaatta tgtgaaacaa accttacgtg aatttattct aaaagcattt tccaaaaagc 3360 eaaagatttc cagggagata agac&agcag aagatctgaa taetaagaag gaaaactata 3420 tttctaacca tacacttgct gaaatgagca aaggtcacaa tttcctcaag gaaaaagata 3480 aaatcagtgg ttttggaagc agcgtggaca aacacttgat ggaagacagt gatggtcaat 3540 catttattca caatcccagc ctcacagtga cagtgccaat tgcacctggg gaateegatt 3600 tggaaaatat gaatgctgag gaaettagea gtgattcgga tagtgaatac agcaaagtga 3660 gattaaaccg gtcaagctcc teagagtgea gcacagttga taaccctttg cctggagaag 3720 gagaagaage agaggctgaa cctatgaatt ccgatgagcc agaggcctgt ttcacagatg 3780 gttgtgtacg gaggttctca tgctgccaag ttaacataga gtcagggaaa ggaaaaatct 3840 ggtggaacat caggaaaacc tgctaeaaga ttgttgaaca cagttggttt gaaagcttca 3900 ttgtcctcat gatcctgctc agoagtggtg cectggcttt tgaagatatt tatattgaaa 3960 ggaaaaagac cattaagatt abcctggagt atgcagacaa gatcttcact tacatcttca 4020 ttctggaaat gcttctaaaa tggatagcat atggttataa aacatatttc accaatgcct 4080 ggtgttggct ggatttccta abbgbtgatg bbbctbbggt tactttagtg gcaaacactc 4140 bbggabacbc agatcttggc cccattaaat cccttcggac acbgagagcb btaagacctc 4200 baagagccbfc atctagattt gaaggaabga gggtcgttgt gaabgcacbc abaggagcaa 4260 ttccttccat catgaatgtg cbacbbgbgb gtcttatatt ctggctgata ttcagcatca 4320 bgggagtaaa tttgtttgct ggcaagttcb atgagtgtat baacaccaca gatgggtcac 4380 ggbbtccbgc aagbcaagbb ccaaabcgbb ccgaabgbbb tgcccttatg aatgttagtc 4440 aaaatgtgcg atggaaaaac otgaaagtga actttgataa tgtcggactt ggbbacctab 4500 ctctgcttca agttgcaact tttaaggget ggacgattat tatgtatgca gcagtggatt 4560 ctgttaatgt agacaagcag cccaaatatg aatatagcct ctacatgtat atttattttg 4620 tcgtctttat catctttggg tcattcttca cbbbgaactt gttcattggt gtcatcatag 4680 ataatttcaa ccaacagaaa aagaagcttg gaggtcaaga cabctbbabg acagaagaac 4740 agaagaaata cbataabgca atgaaaaagc tggggtccaa gaagccacaa aagcoaattc 4800 ctegaocagg gaacaaaatc eaaggatgta tatttgacot agbgacaaab caagcctttg 4860 atattagtat catggttctt atctgtctca acatggtaac catgatggta gaaaaggagg 4320 gtcaaagtca acatatgact gaagttttat attggataaa tgtggttttt ataatccttt 4980 bcacbggaga atgtgtgcta aaactgatct ccctcagaca ctactacttc acbgtaggab 5040 ggaatatttt tgattttgtg gttgtgatta tctccattgt aggtatgttt ctagctgatt 5100 tgattgaaac gtattttgtg tccoctaccc tgttcogagt gatoegtctt gccaggabbg 5160 gccgaatcct acgbcbagbc aaaggagcaa aggggatcog cacgcbgctc bbtgcbttga 5220 tgatgtccct tcctgcgttg tttaacatcg gcctcctgct cttcctggtc atgttcatct 5280 acgccatctt bggaabgbcc aactttgcct atgttaaaaa ggaagatgga attaatgaca 5340 tgttcaattt bgagacctbb ggcaacagta tgabttgccb gttccaaatt acaaeetetg 5400 otggctggga tggattgcta geacctattc ttaacagtaa gccacccgac tgtgacccaa 5460 aaaaagttca bcctggaagt tcagttgaag gagactgtgg taacccatct gttggaatat 5520 tctacbtbgt bagtbabatc atcatatcct tcctggttgt ggtgaacatg tacattgcag 5580 tcatactgga gaattttagt gttgccactg aagaaagtac tgaacctctg agtgaggatg 5640 actttgagat gttctatgag gtttgggaga agtttgatcc cgabgcgacc cagtttatag 5700 agttctctaa actctctgat bbbgcagctg cccbggabcc tcctcttctc atagcaaaac 5760 ccaacaaagt ccagctcatt gccatggatc bgcccabggb tagtggtgac cggatcoatt 5820 gtcttgacat cbtabttgct tttacaaagc gtgttttggg tgagagtggg gagatggatt 5880 ctcttcgttc acagabggaa gaaaggttca tgtctgcaaa tccttccaaa gtgtcctatg 5940 aacccatcac aaccacacta aaacggaaac aagaggatgt gtctgctact gtcattcagc 6000 gbgcbtatag acgbtaccgc ttaaggcaaa afcgbcaaaaa tatatcaagt atatacataa 6060 aagatggaga cagagabgat gatttactca ataaaaaaga tatggctttt gataatgtta 6120 atgagaacbc aagtccagaa aaaacagafcg ccacbtcabc caccacctct ccaccttcat 6180 atgatagtgt aacaaagcca gacaaagaga aatabgaaca agacagaaca gaaaaggaag 6240 acaaagggaa agacagcaag gaaagcaaaa aabagagctt catbbbbgat atattgttta 6300 cagcctgtga aagtgattta tttgtgbtaa taaaactctt ttgaggaagt ctatgccaaa 6360 atccttbtta tcaaaabatt ctcgaaggca gtgcagtcac baactcbgat ttcctaagaa 6420 aggtgggcag cattagcaga bggbtabtbb tgcactgabg attctttaag aatcgtaaga 6480 gaactctgta ggaattattg attatagcat acaaaagtga ttoagttttt tggbttttaa 6540 taaatcagaa gaccabgtag aaaaotttta catctgcctt gtcatctttt cacaggattg 6600 taattagtct tgtttcccat gtaaataaac aacacacgca tacagaaaaa tctattattt 6660 atctattabb tggaaabcaa caaaagtatt tgcctbggct ttgcaatgaa atgcbtgata 6720 gaagtaatgg acattagtta bgaatgttta gtbaaaabgc attattaggg agcttgactt 6780 tttateaatg tacagaggtb attotatatt ttgaggtgct taaatttatt ctacattgca 6840 tcagaaocaa tttatatgtg cctataaaab gccabgggat taaaaatata tgtaggctat 6900 tcatttctac aaatgfcbttt cattcatctt gaetcacatg ccaacaagga taagacttac 6960 ctttagagta ttgtgtttca tagcctttct tctttcatat cccbttbbgt tcatagaata 7020 accacagaac fcbgaaaaatt attctaagta cababbacac tcctcaaaaa aaacaaagat 7080 aactgagaaa aaagttattg acagaagbbc babbbgcbab babbtacaba gcctaacatt 7140 tgactgbgcb gcccaaaaba cbgataabag totcbbaaac bebbtbgbca aattbbccbg 7200 cbbbcbtatg cagtatbgtt bagtcabccb ttcgctgtaa gcaaagttga bgaaatccbb 7260 ccbgabatgc agttagttgt btgaccacgg tacatacttg agcagabaat aacttgggca 7320 cagbatbtab bgcatcacbb gtatacaabc ccgtgtttgg caagcbbbca aatcatgtaa 7380 batgacagac tbbacacaga tabgtgbtta gtatgaataa aaaagcabbg aaabagggab 7440 bcbbgccaac tbgctcbctt gccaccaacb bacttbceba aabbabggaa gtaatctttt 7500 btggababac ttcaatgtat acaatgagga agabgbcacc ttctccttaa aabtcbatga 7560 bgbgaaabab abbbbgcctc aabcaacaca gbaccatggg cbbctaabbb abeaagcaca 7620 babbcatbbt gcattagctg tagacabcta gbbbtbtgaa aacacctabb aabagbaabb 7680 bgaaaagaaa taaecabaat gcbbbbbbtc gbgagbttab bbcaggaaba tgagabctbb 7740 cttctataaa gttattcatg cacaggcaaa aattgagcta cacaggtaga atgtagtttt 7800 acttagaaga tttttgtggg aggttttgaa gcaaatatat aaaacaactt tcactaattt 7860 gctttccata tttaaaaaat aataaattac atttatataa taaatgttta aagcacatat 7920 tttttgttgt tctggcaatt taaaaagaaa gaggatttaa acgtacctat agaaacaaag 7980 atttatggtt aaagaatgag atcagaagtc tagaatgttt ttaaattgtg atatatttta 8040 caacatccgt tattactttg agacatttgt cctaatctac gtataaaact caatctaggg 8100 ctaaagattc tttataccat cttaggttea ttcatottag gctatttgaa ccacttttta 8160 atttaatatg aaagacacca tgcagtgttt tccgagacta catagatcat tttatcacat 8220 acctaccaag cctgttggaa ataggttttg ataatttaag tagggaccta tacaaaatat 8280 attacattta tcagatfcttt aaatacattc aattaagaat ttaacatcac cttaaatttg 8340 aattcaatct accgttattt caaactcaca aatataactg cattatgaat acttacataa 8400 tgtagtaaga caagatgttt gacaggttcg tgtgtaattt tctattaatg tttttacatt 8460 gccttgtttt tatgtaaaat aaaaaatatg ggcaactggt ttgttaacaa cacaatttct 8520 tcttagcatt tcaaaaatat atataaagtt gttctttttc ctatttcatg aactatgttt 8530 ttttttaaaa taacatggtt aagttttata tatatttacg tttgtttcag gaatgtctac 8640 ttgtgacttt ttatcaatta aaaataatat ttggaagaaa gagcttatta agtataagct 8700 tgaagtaaaa ttagacctet etttccatgt agattactgt ttgtactgat ggtttcaccc 8760 ttcagaaggc actgtcatat taatatttaa attttataat cgctgaactt attacaccca 8820 acaatacaga aaggcagtta cactgaagaa cttaacttag aataaaatgg aagcaaacag 8880 gttttctaaa aacttttfcta agtgaccagg tetcgctctg tcacceaggc tagagtgcaa 8940 tggcatgatc atagctctct gcagcctcaa ctctgggctc aagcaaccct cctgcctcag 9000 cctcccaagt agctaagact acaggtacat gccaccatgc ctggctaata tttaaatttt 9060 tgtagataag gggtcttgct atgttgccca ggctagtctc aaactcctgg cttcaagtgt 9120 tcctactgtc atgacctgcc aacatgetgg ggttacaggc atgagccacc atgccccaaa 9180 caggtttgaa cacaaatctt tcggatgaaa attagagaac ctaattttag ctttttgata 9240 gttacctagt ttgcaaaaga tttgggtgac ttgtgagctg tttttaaatg ctgattgttg 9300 aacatcacaa cccaaaatac ttagcatgat tttatagagt tttgatagct ttattaaaaa 9360 gagtgaaaat aaaatgcata tgtaaataaa gcagttctaa atagctattt cagagaaatg 9420 ttaatagaag tgctgaaaga agggccaact aaattaggat ggccagggaa ttggcctggg 9480 tttaggacct atgtatgaag gccaccaatt ttttaaaaat atctgtggtt tattatgtta 9540 ttatcttctt gaggaaaaca atcaagaatt gcttcatgaa aataaataaa tagccatgaa 9600 tatcataaag ctgtttacat aggattcttt aeaaatttca tagatctatg aatgctcaaa 9660 atgtttgagt ttgccataaa ttatattgta gttatattgt agttatactt gagactgaca 9720 cattgtaata taatctaaga ataaaagtta tacaaaataa aaaaaaaaaa a 9771

<210> 43 <211> 1977 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintética <400> 43

Met Ala Met Leu Pro Pro Pro Gly Pro Gin Ser Phe Val His Phe Thr 15 10 15

Lys Gin Ser Leu Ala Leu lie Glu Gin Arg lie Ala Glu Arg Lys Ser 20 25 30

Lys Glu Pro Lys Glu Glu Lys Lys Asp Asp Asp Glu Glu Ala Pro Lys 35 40 45

Pro Ser Ser Asp Leu Glu Ala Gly Lys Gin Leu Pro Phe lie Tyr Gly 50 55 60

Asp lie Pro Pro Gly Met Val Ser Glu Pro Leu Glu Asp Leu Asp Pro 65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Lys Lys Thr Phe lie Val Leu Asn Lys Gly Lys Thr 85 90 95 lie Phe Arg Phe Asn Ala Thr Pro Ala Leu Tyr Met Leu Ser Pro Phe 100 105 110

Ser Pro Leu Arg Arg lie Ser lie Lys lie Leu Val His Ser Leu Phe 115 120 125

Ser Met Leu lie Met Cys Thr lie Leu Thr Asn Cys lie Phe Met Thr 130 135 140

Met Asn Asn Pro Pro Asp Trp Thr Lys Asn Val Glu Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160

Gly lie Tyr Thr Phe Glu Ser Leu Val Lys lie Leu Ala Arg Gly Phe 165 170 175

Cys Val Gly Glu Phe Thr Phe Leu Arg Asp Pro Trp Asn Trp Leu Asp 180 185 190

Phe Val Val lie val Phe Ala Tyr Leu Thr Glu Phe val Asn Leu Gly 195 200 205

Asn Val Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Leu Arg Ala Leu Lys Thr 210 215 220 lie Ser Val lie Pro Gly Leu Lys Thr lie Val Gly Ala Leu lie Gin 225 230 235 240

Ser Val Lys Lys Leu Ser Asp Val Met lie Leu Thr Val Phe Cys Leu 245 250 255

Ser Val Phe Ala Leu lie Gly Leu Gin Leu Phe Met Gly Asn Leu Lys 260 265 270

His Lys Cys Phe Arg Asn Ser Leu Glu Asn Asn Glu Thr Leu Glu Ser 275 280 285 lie Met Asn Thr Leu Glu Ser Glu Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Phe Tyr 290 295 300

Tyr Leu Glu Gly Ser Lys Asp Ala Leu Leu Cys Gly Phe Ser Thr Asp 305 310 315 320

Ser Gly Gin Cys Pro Glu Gly Tyr Thr Cys Val Lys lie Gly Arg Asn 325 330 335

Pro Asp Tyr Gly Tyr Thr Ser Phe Asp Thr Phe Ser Trp Ala Phe Leu 340 345 350

Ala Leu Phe Arg Leu Met Thr Gin Asp Tyr Trp Glu Asn Leu Tyr Gin 355 360 365

Gin Thr Leu Arg Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Met lie Phe Phe Val Val 370 375 380

Val lie Phe Leu Gly Ser Phe Tyr Leu lie Asn Leu lie Leu Ala Val 385 390 395 400

Val Ala Met Ala Tyr Glu Glu Gin Asn Gin Ala Asn lie Glu Glu Ala 405 410 415

Lys Gin Lys Glu Leu Glu Phe Gin Gin Met Leu Asp Arg Leu Lys Lys 420 425 430

Glu Gin Glu Glu Ala Glu Ala lie Ala Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Thr 435 440 445

Ser lie Arg Arg Ser Arg lie Met Gly Leu Ser Glu Ser Ser Ser Glu 450 455 460

Thr Ser Lys Leu Ser Ser Lys Ser Ala Lys Glu Arg Arg Asn Arg Arg 465 470 475 480

Lys Lys Lys Asn Gin Lys Lys Leu Ser Ser Gly Glu Glu Lys Gly Asp 485 490 495

Ala Glu Lys Leu Ser Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ser lie Arg Arg Lys 500 505 510

Ser Phe His Leu Gly Val Glu Gly His Arg Arg Ala His Glu Lys Arg 515 520 525

Leu Ser Thr Pro Asn Gin Ser Pro Leu Ser lie Arg Gly Ser Leu Phe 530 535 540

Ser Ala Arg Arg Ser Ser Arg Thr Ser Leu Phe Ser Phe Lys Gly Arg 545 550 555 560

Gly Arg Asp lie Gly Ser Glu Thr Glu Phe Ala Asp Asp Glu His Ser 565 570 575

He Phe Gly Asp Asn Glu Ser Arg Arg Gly Ser Leu Phe Val Pro His 580 585 590

Arg Pro Gin Glu Arg Arg Ser Ser Asn lie Ser Gin Ala Ser Arg Ser 595 600 605

Pro Pro Met Leu Pro val Asn Gly Lys Met His Ser Ala val Asp Cys 610 615 620

Asn Gly Val Val Ser Leu Val Asp Gly Arg Ser Ala Leu Met Leu Pro 625 630 635 640

Asn Gly Gin Leu Leu Pro Glu Gly Thr Thr Asn Gin lie His Lys Lys 645 650 655

Arg Arg Cys Ser Ser Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Met Leu Asn Asp Pro 660 665 670

Asn Leu Arg Gin Arg Ala Met Ser Arg Ala Ser lie Leu Thr Asn Thr 675 680 685

Val Glu Glu Leu Glu Glu Ser Arg Gin Lys Cys Pro Pro Trp Trp Tyr 690 695 700

Arg Phe Ala His Lys Phe Leu lie Trp Asn Cys Ser Pro Tyr Trp lie 705 710 715 720

Lye Phe Lys Lys Cys lie Tyr Phe He Val Met Asp Pro Phe Val Asp 725 730 735

Leu Ala lie Thr He Cys lie Val Leu Asn Thr Leu Phe Met Ala Met 740 745 750

Glu His His Pro Met Thr Glu Glu Phe Lys Asn Val Leu Ala lie Gly 755 760 765

Asn Leu Val Phe Thr Gly lie Phe Ala Ala Glu Met Val Leu Lys Leu 770 775 780 lie Ala Met Asp Pro Tyr Glu Tyr Phe Gin Val Gly Trp Asn lie Phe 785 790 795 800

Asp Ser Leu lie Val Thr Leu Ser Leu Val Glu Leu Phe Leu Ala Asp 805 810 815

Val Glu Gly Leu Ser Val Leu Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe 820 825 830

Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Met Leu He Lys lie He 835 840 845

Gly Asn Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Ala lie 850 855 860 lie Val Phe He Phe Ala Val Val Gly Met Gin Leu Phe Gly Lys Ser 865 870 875 880

Tyr Lys Glu Cys Val Cys Lys lie Asn Asp Asp Cys Thr Leu Pro Arg 885 890 895

Trp His Met Asn Asp Phe Phe His Ser Phe Leu He Val Phe Arg Val 900 905 910

Leu Cys Gly Glu Trp lie Glu Thr Met Trp Asp Cys Met Glu Val Ala 915 920 925

Gly Gin Ala Met Cys Leu lie Val Tyr Met Met Val Met Val He Gly 930 935 940

Asn Leu Val Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ser Phe 945 950 955 960

Ser Ser Asp Asn Leu Thr Ala lie Glu Glu Asp Pro Asp Ala Asn Asn 965 970 975

Leu Gin lie Ala Val Thr Arg lie Lys Lys Gly He Asn Tyr Val Lys 980 985 990

Gin Thr Leu Arg Glu Phe lie Leu Lys Ala Phe Ser Lys Lys Pro Lys 995 1000 1005 lie Ser Arg Glu He Arg Gin Ala Glu Asp Leu Asn Thr Lys Lys Glu 1010 1015 1020

Asn Tyr lie Ser Asn His Thr Leu Ala Glu Met Ser Lys Gly His Asn 1025 1030 1035 1040

Phe Leu Lys Glu Lys Asp Lys lie Ser Gly Phe Gly Ser Ser Val Asp 1045 1050 1055

Lys His Leu Met Glu Asp Ser Asp Gly Gin Ser Phe lie His Asn Pro 1060 1065 1070

Ser Leu Thr Val Thr Val Pro lie Ala Pro Gly Glu Ser Asp Leu Glu 1075 1080 1085

Asn Met Asn Ala Glu Glu Leu Ser Ser Asp Ser Asp Ser Glu Tyr Ser 1090 1095 1100

Lys Val Arg Leu Asn Arg Ser ser Ser Ser Glu Cys Ser Thr Val Asp 1105 1110 1115 1120

Asn Pro Leu Pro Gly Glu Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Pro Met Asn 1125 1130 1135

Ser Asp Glu Pro Glu Ala Cys Phe Thr Asp Gly Cys Val Arg Arg Phe 1140 1145 1150

Ser Cys Cys Gin Val Asn He Glu Ser Gly Lys Gly Lys lie Trp Trp 1155 1160 1165

Agn 11« Arg Lys Thr Cye Tyr Lys lie Val Glu His Set Trp Phe Glu 1170 1175 1180

Ser Phe lie Val Leu Met lie Leu Leu Ser Ser Gly Ala Leu Ala Phe 1185 1190 1195 1200

Glu Asp He Tyr lie Glu Arg Lys Lys Thr He Lys He lie Leu Glu 1205 1210 1215

Tyr Ala Asp Lys lie Phe Thr Tyr lie Phe He Leu Glu Met Leu Leu 1220 1225 1230

Lys Trp He Ala Tyr Gly Tyr Lys Thr Tyr Phe Thr Asn Ala Trp Cys 1235 1240 1245

Trp Leu Asp Phe Leu He Val Asp Val Ser Leu Val Thr Leu Val Ala 1250 1255 1260

Asn Thr Leu Gly Tyr Ser Asp Leu Gly Pro lie Lys Ser Leu Arg Thr 1265 1270 1275 1280

Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu Ser Arg Phe Glu Gly Met 1285 1290 1295

Arg Val Val Val Asn Ala Leu lie Gly Ala lie Pro Ser lie Met Asn 1300 1305 1310

Val Leu Leu Val Cys Leu lie Phe Trp Leu lie Phe Ser He Met Gly 1315 1320 1325

Val Asn Leu Phe Ala Gly Lys Phe Tyr Glu Cys lie Asn Thr Thr Asp 1330 1335 1340

Gly Ser Arg Phe Pro Ala Ser Gin Val Pro Asn Arg Ser Glu Cys Phe 1345 1350 1355 1360

Ala Leu Met Asn Val Ser Gin Asn Val Arg Trp Lys Asn Leu Lys Val 1365 1370 1375

Asn Phe Asp Asn Val Gly Leu Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Val Ala 1380 1385 1390

Thr Phe Lys Gly Trp Thr He lie Met Tyr Ala Ala Val Asp Ser Val 1395 1400 1405

Bsn Ual Ben T.»o (ϊΐτι Βτλ Τ.νβ Tut* ft! 11 ΤΗ#** <íar t.oi> Tvr Met. Tur Tie τν·* *“r “J“ «*** ------ -j — — —- -j — ----- -j — — — 1410 1415 1420

Tyr Phe Val Val Phe He lie Phe Gly Ser Phe Phe Thr Leu Asn Leu 1425 1430 1435 1440

Phe He Gly Val lie He Asp Asn Phe Asn Gin Gin Lys Lys Lys Leu 1445 1450 1455

Gly Gly Gin Asp He Phe Met Thr Glu Glu Gin Lys Lys Tyr Tyr Asn 1460 1465 1470

Ala Met Lys Lys Leu Gly Ser Lys Lys Pro Gin Lys Pro He Pro Arg 1475 1480 1485

Pro Gly Asn Lys He Gin Gly Cys He Phe Asp Leu Val Thr Asn Gin 1490 1495 1500

Ala Phe Asp He Ser He Met Val Leu He Cys Leu Asn Met Val Thr 1505 1510 1515 1520

Met Met Val Glu Lys Glu Gly Gin Ser Gin His Met Thr Glu Val Leu 1525 1530 1535

Tyr Trp He Asn Val Val Phe Ile Ile Leu Phe Thr Gly Glu Cys Val 1540 1545 1550

Leu Lys Leu He Ser Leu Arg Hig Tyr Tyr Phe Thr Val Gly Trp Asn 1555 1560 1565

He Phe Asp Phe Val Val Val lie lie Ser He Val Gly Met Phe Leu 1570 1575 1580

Ala Asp Leu lie Glu Thr Tyr Phe Val Ser Pro Thr Leu Phe Arg Val 1585 1590 1595 1600 lie Arg Leu Ala Arg He Gly Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys Gly Ala 1605 1610 1615

Lys Gly He Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser Leu Pro Ala 1620 1625 1630

Leu Phe Asn lie Gly Leu Leu Leu Phe Leu Val Met Phe Ile Tyr Ala 1635 1640 1645 lie Phe Gly Met Ser Asn Phe Ala Tyr Val Lys Lys Glu Asp Gly Ile 1650 1655 1660

Asn Asp Met Phe Asn Phe Glu Thr phe Gly Asn Ser Met lie Cys Leu 1665 1670 1675 1680

Phe Gin He Thr Thr Ser Ala Gly Trp Asp Gly Leu Leu Ala Pro lie 1685 1690 1695

Leu Asn Ser Lys Pro Pro Asp Cys Asp Pro Lys Lys Val His Pro Gly 1700 1705 1710

Ser Ser Val Glu Gly Asp Cys Gly Asn Pro Ser Val Gly lie Phe Tyr 1715 1720 1725

Phe Val Ser Tyr lie lie lie Ser Phe Leu Val Val Val Asn Met Tyr 1730 1735 1740 lie Ala Val lie Leu Glu Asn Phe Ser Val Ala Thr Glu Glu Ser Thr 1745 1750 1755 1760

Glu Pro Leu Ser Glu Asp Asp Phe Glu Met Phe Tyr Glu Val Trp Glu 1765 1770 1775

Lys Phe Asp Pro Asp Ala Thr Gin Phe lie Glu Phe Ser Lys Leu Ser 1780 1785 1790

Asp Phe Ala Ala Ala Leu Asp Pro Pro Leu Leu lie Ala Lys Pro Asn 1795 1800 1805

Lys Val Gin Leu He Ala Met Asp Leu Pro Met Val Ser Gly Asp Arg 1810 1815 1820 lie His Cys Leu Asp He Leu Phe Ala Phe Thr Lys Arg Val Leu Gly 1825 1830 1835 1840

Glu Ser Gly Glu Met Asp Ser Leu Arg Ser Gin Met Glu Glu Arg Phe 1845 1850 1855

Met Ser Ala Asn Pro Ser Lys Val Ser Tyr Glu Pro He Thr Thr Thr 1860 1865 1870

Leu Lys Arg Lys Gin Glu Asp Val Ser Ala Thr Val He Gin Arg Ala 1875 1880 1885

Tyr Arg Arg Tyr Arg Leu Arg Gin Asn Val Lys Asn lie Ser Ser He 1890 1895 1900

Tyr He Lys Asp Gly Asp Arg Asp Asp Asp Leu Leu Asn Lys Lys Asp 1905 1910 1915 1920

Met Ala Phe Asp Asn Val Asn Glu Asn Ser Ser Pro Glu Lys Thr Asp 1925 1930 1935

Ala Thr Ser Ser Thr Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Asp Ser Val Thr Lys 1940 1945 1950

Pro Asp Lys Glu Lys Tyr Glu Gin Asp Arg Thr Glu Lys Glu Asp Lys 1955 1960 1965

Gly Lys Asp Ser Lys Glu Ser Lys Lys 1970 1975

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 61485488 A [0001] • US 15549111 A [0001] • US 23611711 A [0001] • US 6586251 B [0187] • US 7294754 B [0190] [0211] • WO 2009114400 A [0191] [0199] [0205] [0212] • US 6596541 B [0220] • US 7582298 B [0220] • US 20090298095 AI [0232] • EP 12167014 A [0236] • US 13236117 B [0236] • US 13155491 B [0236] • US 61485488 B [0236]

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Lisboa, 2 de Julho de 2015

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para identificar um antagonista da Nav1.7, que compreende: (a) proporcionar ex vivo uma célula que expressa uma proteína de subunidade α da Nav1.7 humana de comprimento completo, ou uma proteína de subunidade α da Navl. 7 quimérica compreendendo uma ansa extracelular do domínio I ou III da subunidade α da Navl.7 de ratinho que foi substituída pela correspondente ansa a partir de uma subunidade α da Navl.7 humana; (b) contactar a célula com um composto de teste que se liga a, ou bloqueia uma função, da proteína de subunidade α da Navl. 7 humana ou da proteína de subunidade α da Navl. 7 quimérica de (a) e esperar durante um primeiro período de tempo; (c) contactar a célula de (b) com um ou mais mediadores inflamatórios e esperar durante um segundo período de tempo; (d) determinar a quantidade de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) libertado pela célula após a etapa (c); e (e) comparar a quantidade de CGRP libertada na etapa (d) com a quantidade de CGRP libertada na presença de um conhecido inibidor de canais de sódio, em que um aumento da libertação de CGRP em presença de um composto de teste indica a inibição da Nav1.7.
2. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a célula é uma célula neuronal, preferivelmente em que a célula neuronal é uma célula de um gânglio espinal dorsal (DRG).
3. 3. 0 método da reivindicação 2, em que a célula é uma célula de ratinho.
4. 4. 0 método da reivindicação 1, em que a quantidade de CGRP libertado em presença do composto de teste inibe uma ou mais funções da proteína Navl. 7 humana ou quimérica e é pelo menos 2 vezes superior ao inibidor de canais de sódio conhecido.
5. 5. Um método para identificar um antagonista da Nav1.7, que compreende: (a) contactar uma célula de DRG que expressa uma proteína de subunidade α da Navl. 7 humana de comprimento completo, ou uma proteína de subunidade α da Navl. 7 quimérica compreendendo uma ansa extracelular do domínio I ou III da subunidade α da Navl. 7 de ratinho que foi substituída pela correspondente ansa a partir de uma subunidade α da Navl. 7 humana com um composto de teste que se liga a, ou bloqueia uma função, da proteína de subunidade a. da Nav1.7 humana ou da proteína de subunidade α da Navl.7 quimérica e esperar durante um primeiro período de tempo; (b) contactar o DRG de (a) com um ou mais mediadores inflamatórios e esperar um segundo período de tempo; (c) determinar a quantidade de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) libertado pelo DRG após a etapa (b); e (d) comparar a quantidade de CGRP libertada na etapa (c) com a quantidade de CGRP libertada na presença de um conhecido inibidor de canais de sódio, em que um aumento da libertação de CGRP em presença de um composto de teste indica inibição da Navl. 7 .
6. 6. 0 método da reivindicação 1 ou 5, em que o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um péptido, um composto orgânico, e uma toxina, preferivelmente em que o anticorpo é humano.
7. 7. 0 método da reivindicação 1 ou 5, em que o um ou mais mediadores inflamatórios são selecionados a partir da prostaglandina E2, bradiquinina, capsaicina, protões, e um fator neurotróf ico, preferivelmente em que o um ou mais mediadores inflamatórios são a prostaglandina E2, bradiquinina e capsaicina.
8. 8. 0 método da reivindicação 5, em que o DRG é isolado a partir de um membro do grupo que consiste em ser humano, ratinho, rato, ou macaco, preferivelmente em que o DRG é isolado a partir de um ratinho.
9. 9. 0 método da reivindicação 1 ou 5, em que a célula se isola a partir de um ratinho geneticamente modificado que compreende, na sua linha germinativa, uma sequência nucleotidica que codifica uma subunidade α da Navl. 7 ou fragmento da mesma ligado operativamente a um promotor da Nav.
10. 10. O método da reivindicação 1 ou 5, em que o inibidor de canais de sódio conhecido é tetrodotoxina ou ProTX-II.
11. 11. O método da reivindicação 1 ou 5, em que proteína da subunidade α da Navl. 7 humana de comprimento completo é codificada pelos exões 2 a 28 de um gene da Navl. 7 humano.
12. 12. O método de acordo com a reivindicação 11, em que a proteína de subunidade α da Nav1.7 humana é uma variante da Navl. 7 humana.
13. 13. O método da reivindicação 12, em que a variante da Navl. 7 humana compreende uma substituição de um aminoácido selecionada a partir de uma Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P, V872G, F1449V, ou uma combinação das mesmas.
14. 14. 0 método da reivindicação 12, em que a variante da Navl. 7 humana compreende uma substituição de um aminoácido selecionada a partir de uma R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K, A1632E, ou uma combinação das mesmas.
15. 15. 0 método da reivindicação 12, em que a variante da Navl. 7 humana compreende uma substituição de um aminoácido selecionada a partir de uma F1200L, I1235L, ou uma combinação das mesmas. Lisboa, 2 de Julho de 2015