ES2541535T3 - Ensayo de liberación de neuropéptido para canales de sodio - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un antagonista de Nav1.7, que comprende: (a) proporcionar ex vivo una célula que expresa una proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa, o una proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico que comprende un bucle extracelular de los dominios I o III de la subunidad-a de Nav1.7 de ratón que se ha remplazado por el correspondiente bucle de una subunidad-a de Nav1.7 humano; (b) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo que se une a, o bloquea una función de, la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano o de la proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico de (a) y esperar un primer periodo de tiempo; (c) poner en contacto la célula de (b) con uno o más mediadores inflamatorios y esperar un segundo periodo de tiempo; (d) determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de la célula después de la etapa (c); y (e) comparar la cantidad de CGRP liberado en la etapa (d) con la cantidad de CGRP liberado en presencia de un inhibidor conocido de canales de sodio, en donde un aumento en CGRP liberado en presencia de un compuesto de ensayo indica inhibición de Nav1.7.
Description
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dominio (por ejemplo, dAb). En una realización específica, el agente terapéutico comprende una inmunoglobulina humana o región variable de receptor de células T. En una realización específica, el agente terapéutico es un anticuerpo humano.
En un aspecto, se proporciona un sistema in vitro para identificar un antagonista de una proteína Nav1.7 humana, que comprende aislar un componente que contiene Nav1.7 de un ratón como se describe en este documento, exponer el componente a un antagonista sospechoso de Nav1.7 humano, y determinar un efecto del antagonista sobre la función de Nav1.7. En una realización, el componente que contiene Nav1.7 es una fracción de membrana. En una realización, el componente que contiene Nav1.7 es una célula. En una realización, el componente que contiene Nav1.7 es un tejido del ratón.
En una realización, la determinación del efecto comprende medir la presencia o ausencia de una respuesta dependiente de Nav1.7 en una célula derivada de un ratón como se describe en esta descripción. En una realización, la respuesta es un potencial de acción.
En un aspecto, se proporciona un método para la identificación de un modulador de un canal Nav1.7 humano, quimérico o variante, que comprende exponer un ratón como se describe en este documento a un compuesto de ensayo y detectar la actividad o inactividad del canal Nav1.7. En una realización, el método comprende ensayar compuestos de ensayo que modulan el flujo de iones sodio del canal Nav1.7. En otra realización, el método comprende emplear la tecnología de pinzamiento zonal. En una realización específica, el método se usa para identificar compuestos fisiológicamente activos útiles para el tratamiento una patología del cerebro. En una realización, la patología del cerebro se selecciona entre convulsiones, ataques epilépticos, trastornos de pánico, trastornos de hiperactividad, depresión, trastornos obsesivo-compulsivos, demencia, déficit de memoria, déficit de atención, obesidad, ansiedad, trastornos alimenticios, adicción y abuso de la droga, deseo sexual alterado, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. En otra realización, la patología está relacionada con una respuesta visceral originada en el sistema límbico. En una realización, la respuesta visceral se selecciona entre respiración y función gastrointestinal.
En una realización, el modulador aumenta la actividad del canal Nav1.7. En otra realización, el modulador disminuye la actividad del canal Nav1.7.
En una realización, el canal Nav1.7 humano, quimérico o humano variante está asociado con un trastorno del dolor. En una realización específica, el trastorno del dolor se selecciona entre insensibilidad congénita al dolor (CIP), eritromelalgia (IEM), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).
En un aspecto, se proporciona un método para determinar la probabilidad de enfermedad resultante de un canal Nav1.7 variante, que comprende identificar mutaciones en uno o más sitios dentro una secuencia de ácido nucleico de un gen de Nav1.7 aislado de una célula de un ratón como se describe en este documento que codifica una región N-terminal intracelular, un bucle extracelular en el dominio I, un bucle intracelular entre los dominios I y II, un bucle intracelular entre los dominios I y III, una región intramembrana del dominio II, o cualquier combinación de los mismos, donde las mutaciones identificadas codifican una proteína de canal Nav1.7 que presenta un cambio en la función no observado en un canal Nav1.7 no variante.
En una realización, el canal Nav1.7 humano, quimérico o humano variante está asociado con un trastorno del dolor. En una realización específica, el trastorno del dolor se selecciona entre insensibilidad congénita al dolor (CIP), eritromelalgia (IEM), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).
En un aspecto, se proporciona un método para seleccionar una serie o lote de una preparación farmacéutica que contiene un agente terapéutico que se une a una secuencia de Nav1.7 humano, que comprende exponer una célula que alberga una proteína Nav1.7 que comprende al menos una secuencia humana contigua a una muestra de la serie o lote de la preparación farmacéutica, determinar si la muestra se une a la célula, y seleccionar una serie o lote que corresponda a la muestra que se unió a al menos una secuencia humana contigua. En una realización, la al menos una secuencia humana contigua codifica un bucle de poro extracelular de la proteína Nav1.7. En una realización específica, el bucle de poro extracelular de la proteína Nav1.7 se selecciona entre el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I, el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio II, el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio III, el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio IV, y una combinación de los mismos. En una realización, el bucle de poro extracelular es el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del domino I. En una realización, el bucle de poro extracelular es el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del domino III.
En una realización, la serie o lote de preparación farmacéutica comprende un compuesto no proteico de unión a Nav1.7 humano. En una realización, la serie o lote de preparación farmacéutica comprende una proteína que se une a un Nav1.7 humano. En una realización específica, la preparación farmacéutica que comprende una proteína incluye un anticuerpo.
En una realización, la célula que alberga una proteína Nav1.7 que comprende al menos una secuencia humana
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inicial) y después (Post-CFA) de la administración de adyuvante completo de Freund en cohortes hembra de tipo silvestre (Scn9A+/+) y ratones homocigóticos para el gen de Nav1.7 quimérico que contiene un bucle de poro
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extracelular humano que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I (Scn9A). La FIG. 7F muestra el porcentaje de cambio desde la medida inicial en respuesta a estímulos nociceptivos en cohortes hembra de tipo silvestre (Scn9A+/+) y ratones homocigóticos para el gen de Nav1.7 quimérico que contiene un bucle de poro extracelular humano que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I
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(Scn9A). La FIG. 8 muestra la concentración (pg/ml) de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de tres poblaciones de ganglios de raíz dorsal (DRG) asiladas de ratones de tipo silvestre en respuesta a exposición a una mezcla inflamatoria (IM), 20 minutos pre-incubación con TTX 1 µM seguido por adición de una mezcla inflamatoria (TTX 1 µM e IM) o incubación con TTX 1 µM más una mezcla inflamatoria durante 20 minutos (TTX 1 µM + IM).
Descripción detallada
Esta invención no está limitada a métodos particulares, y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También se entiende que la terminología usada en este documento es con el fin de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones usadas en este documento incluyen los significados que los términos y expresiones han obtenido en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario
o sea evidente claramente del contexto en que se usa el término o expresión. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales particulares. Todas las publicaciones mencionadas por la presente se incorporan por referencia.
La expresión "vector de direccionamiento" o "construcción de direccionamiento" incluye una molécula polinucleotídica que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración de la construcción de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal mediante recombinación homóloga.
También se incluyen las regiones de direccionamiento que dirigen usando sitios de reconocimiento de recombinasa específica de sitio (por ejemplo, sitios lox o FRT).
En una realización específica, la construcción de direccionamiento comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácido nucleico que permiten recombinación mediada a través de la adición exógena de proteínas que ayudan a o facilitan la recombinación que implica dichas secuencias. En otra realización específica, la construcción de direccionamiento comprende adicionalmente un gen de interés, donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína que tiene una función similar a la proteína codificada por la secuencia endógena.
El término "remplazo" incluye cuando una secuencia de ADN se coloca en un coloca en un genoma de una célula de tal modo que remplace una secuencia dentro del genoma, en el locus de la secuencia genómica, con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón). La secuencia de ADN así colocada puede incluir una
- o más secuencias reguladoras que son parte del ADN fuente usado para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones no traducidas 5' ó 3', etc.). Por ejemplo, en diversas realizaciones, el remplazo es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que provoca la producción de un producto génico de la secuencia de ADN así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero sin expresión de la secuencia endógena; el remplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar a la proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un canal Nav, y el fragmento de ADN codifica uno
- o más canales Nav humanos). En diversas realizaciones, se remplaza un gen endógeno o fragmento del mismo con un gen humano correspondiente o fragmento del mismo. Un gen humano correspondiente o fragmento del mismo es un gen humano o fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar a o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento del mismo que se remplaza.
La expresión "canal Nav" incluye un canal de sodio abierto por voltaje, por ejemplo, un canal Nav1.7. Los genes de canal Nav incluyen una subunidad-α que se expresa sobre la superficie de la célula y sirve como puerta que permite el flujo de entrada de Na+ en la célula a través de un poro formado por segmentos transmembrana que son parte de la subunidad-α. La subunidad-α se asocia con otras subunidades, por ejemplo, β1, β2, β3y β4, para realizar potenciales de acción. Existen varios genes diferentes de canal Nav y pueden clasificarse por sensibilidad a toxinas de pez globo (tetrodotxina, o TTX). Los canales sensibles a TTX, es decir, aquellos bloqueados por bajas concentraciones nanomolares de TTX, incluyen Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.6 y Nav1.7. Los canales resistentes a TTX, es decir, aquellos bloqueados por concentraciones µM de TTX, incluyen Nav1.5, Nav1.8 y Nav1.9.
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no las subunidades-β, evita la reducción potencial de otros genes de Nav (por ejemplo, Nav1.6, Nav1.8, Nav1.9, etc.) que requieren las subunidades-β para regular la abertura por voltaje del canal, manteniendo de ese modo otras diversas funciones y procesos mediados a través de procesos dependientes de subunidad-β.
De acuerdo con informes, deleciones completas del gen de Nav1.7 endógeno en ratones son letales. Sin embargo, se han conseguido deleciones en subconjuntos específicos de células y parecen por lo demás normales. Los ratones de acuerdo con la presente invención tienen un locus de Nav1.7 endógeno funcionalmente silenciado porque la carecen de la capacidad de producir una subunidad-α de Nav1.7 funcional sobre la superficie celular.
Se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de un gen de Nav1.7 de ratón endógeno remplazado con un gen de Nav1.7 humano en la FIG. 3. Como se ilustra, un locus de Nav1.7 de ratón endógeno que se había delecionado se remplaza por una construcción de direccionamiento (vector de direccionamiento de Nav1.7 humano) con un casete de higromicina flanqueado por sitios recombinantes. El locus remplazado resultante codifica una proteína de subunidad-α de Nav1.7 humano expresada sobre la superficie de neuronas en el animal hospedador capaz de mediar potenciales de acción desencadenados por la despolarización de la célula en respuesta al flujo de iones Na+ al interior de la célula dentro del animal hospedador.
Un ratón modificado genéticamente que expresa una subunidad-α de Nav1.7 humano en el locus de Nav1.7 de ratón endógeno puede crearse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse un vector de direccionamiento que introduce el gen de Nav1.7 humano con un gen marcador de selección. La FIG. 3 ilustra un genoma de ratón que comprende un remplazo del locus de Nav1.7 endógeno (parte inferior). La construcción de direccionamiento contiene un brazo de homología 5' que contiene la secuencia cadena arriba del locus de Nav1.7 de ratón endógeno, seguido de un fragmento genómico que contiene un gen de Nav1.7 humano, un casete de selección con fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP), y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia cadena abajo del locus de Nav1.7 de ratón endógeno. Tras la recombinación homóloga en el locus endógeno, se remplaza el casete de selección con fármaco por la secuencia contenida en el vector de direccionamiento (parte inferior de la FIG. 3). El locus de Nav1.7 endógeno delecionado se remplaza de ese modo con un gen de Nav1.7 humano produciendo una célula o animal que expresa un gen de Nav1.7 humano. El casete de selección con fármaco puede retirarse opcionalmente por la posterior adición de una recombinasa (por ejemplo, por tratamiento con Cre).
Pueden conseguirse otras modificaciones del locus endógeno con esfuerzo mínimo usando técnicas similares para crear un locus que comprende un gen quimérico. Por ejemplo, se proporcionan ilustraciones esquemáticas del remplazo de dos bucles de poro extracelular entre los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I y III del gen de Nav1.7 de ratón endógeno en la FIG. 4 y FIG. 5, respectivamente. Como se ilustra, se insertan partes concretas de un gen de Nav1.7 humano en el locus de Nav1.7 de ratón endógeno mediante otras construcciones de direccionamiento (vector de direccionamiento de Nav1.7 DI/S5-S6 humano y vector de direccionamiento de Nav1.7 DIII/S5-S6 humano) con fragmentos genómicos que codifican cada uno un bucle extracelular de un gen de Nav1.7 humano localizado en el poro del canal y responsable de permitir el pase de iones Na+ al espacio intracelular. Tras la recombinación con uno cualquiera de los vectores de direccionamiento ilustrados, se remplaza un fragmento genómico del locus de Nav1.7 endógeno, que codifica un bucle de poro extracelular de la proteína Nav1.7 endógena, con un fragmento genómico humano que codifica el correspondiente bucle de poro en una proteína Nav1.7 humana. Esto crea un locus quimérico que produce una proteína Nav1.7 quimérica que comprende bucles extracelulares humanos en el poro de una proteína de canal Nav1.7.
Un ratón modificado genéticamente que exprese un bucle de poro extracelular de un canal Nav1.7 humano en el locus de Nav1.7 de ratón endógeno puede crearse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse un vector de direccionamiento que introduzca un fragmento genómico que codifica un bucle de poro extracelular de un canal Nav1.7 humano con un gen marcador de selección. Las FIG. 4 y 5 ilustran cada una un genoma de ratón que comprende remplazos diferentes de bucles extracelulares localizados en el poro de una proteína de canal Nav1.7. Cada construcción de direccionamiento contiene un brazo de homología 5' que contiene la secuencia cadena arriba de la secuencia de Nav1.7 de ratón endógena a remplazar, seguido de un fragmento genómico que contiene una secuencia humana correspondiente a la secuencia génica de Nav1.7 de ratón endógena que codifica un bucle de poro extracelular específico, un casete de selección con fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP), seguido de un brazo de homología 3' que contiene la secuencia cadena abajo de la secuencia de Nav1.7 de ratón endógena a remplazar. Tras la recombinación homóloga en el locus endógeno con cualquiera de los vectores de direccionamiento, se inserta un fragmento genómico en el locus de Nav1.7 de ratón endógeno que produce un locus quimérico capaz de expresar una proteína de canal Nav1.7 que comprende una secuencia humana correspondiente a un bucle de poro extracelular (FIG. 4 y 5, parte inferior). El casete de selección con fármaco puede retirarse opcionalmente por la posterior adición de una recombinasa (por ejemplo, por tratamiento con Cre).
Modelos experimentales de ratones humanizados para Nav1.7
Los animales no humanos modificados genéticamente que expresan genes de Nav1.7 humanos son útiles, por
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presencia del casete de neomicina del vector de direccionamiento se confirmó usando los cebadores NEOF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEC ID Nº7) y NEOR (GAACACGGCG GCATCAG; SEC ID Nº 8) y la sonda NEOP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEC ID Nº 9). La secuencia de nucleótidos a través del punto de deleción cadena arriba incluía lo siguiente, que indica secuencia de ratón endógena cadena arriba del punto de deleción (contenido dentro del paréntesis a continuación) ligada de forma contigua a la secuencia de casete presente en el punto de deleción: (CTAGCTGAGC TGTCACCACA CATTGCTCCT ACCACGTATT GTACAGCTAC TGCAAGAGCA CCACAGTTGG CTTTCTGTAT C) ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT (SEC ID Nº 10). La secuencia de nucleótidos a través del punto de deleción cadena abajo incluía lo siguiente, que indica la secuencia de casete contigua con secuencia de ratón endógena cadena abajo del punto de deleción (contenido dentro del paréntesis a continuación): ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT (AGCTTCGGTT TTGATACACT GTTTACAGCC TGCGAAGGTG ACTCACTCGT GTTAATAAGA CTCTTTTACG GAGGTCTATG CCAAACTCTT TTTATCAAAT ATTCTCAAAG GCAG) (SEC ID Nº 11). Después se usaron los clones de células ES positivos para implantar ratones hembra usando el método VELOCIMOUSE® (descrito a continuación) para generar una cama de crías que contenían una deleción del locus de Nav1.7 endógeno.
Las células ES dirigidas descritas anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en fase de 8 células por el método de VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 7.294.754 y Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. 2007. F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotech. 25(1): 91-99). Se identificaron ratones que albergaban una deleción de los exones 6 a 28 en el locus de Nav1.7 endógeno por genotipado usando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia del casete de neomicina y confirmó la ausencia de secuencias de Nav1.7 endógenas.
Los ratones que albergan una deleción de los exones 6 a 28 en el locus de Nav1.7 endógeno pueden cruzarse con una cepa de ratón Cre deletor (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional Nº WO 2009/114400) para retirar cualquier casete de neomicina entre lox introducido por el vector de direccionamiento que no está retirado, por ejemplo, en la fase de célula ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de higromicina se retiene en los ratones.
Las crías se genotipan y se selecciona una cría heterocigótica para las secuencias de Nav1.7 endógenas delecionadas para caracterizar la deleción de Nav1.7 endógeno.
Ejemplo II
Humanización de un locus de Nav1.7 endógeno
Se construyó un vector de direccionamiento para el remplazo del locus de Nav1.7 endógeno con el locus de Nav1.7 humano (FIG. 3) usando un proceso de dos etapas que implica el ligamiento de ADN de BAC y la reparación de los huecos (Zhang, Y., J. P. P. Muyrers, G. Testa, y F. A. Stewart. 2000. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nature Biotechnology 18:1314-1317; Zhang, Y., F. Buchholz, J. P. P. Muyrers, y F. A. Stewart. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics 20:123-128).
La primera etapa en la construcción del vector de direccionamiento de remplazo se realizó por ligamiento de un fragmento de ADN del clon de ADN de BAC de ratón RP23-454H3 con un fragmento de ADN humano del clon de BAC humano RP11-1002M1 (Invitrogen). Este ligamiento de fragmentos de ADN de BAC de ratón y humano creó un clon BAC modificado que contenía un remplazo de los exones 5 a 28 del locus de Nav1.7 de ratón (aproximadamente 81 kb) con los exones 5 a 28 del locus de Nav1.7 humano (aproximadamente 100 kb).
La segunda etapa en la construcción del vector de direccionamiento de remplazo se realizó por reparación de huecos (mencionado anteriormente) usando el clon de BAC de ratón RP23-454H3 y el clon de BAC humano RP1145AJ20 para añadir exones adicionales del locus de Nav1.7 humano al clon BAC modificado preparado en la primera etapa. La reparación de huecos se realizó usando estos clones de BAC de ratón y humano para remplazar los exones 2 a 7 del locus de Nav1.7 endógeno con los exones 2 a 7 del locus de Nav1.7 humano (~13 kb). Esta segunda etapa añadió las ~13 kb de la secuencia de Nav1.7 humano a las ~100 kb de la secuencia de Nav1.7 humana para hacer el remplazo del locus de Nav1.7 endógeno. Se añadió un casete de higromicina flanqueado por sitios loxP al extremo 3' del fragmento de BAC de ~113 kb que contenía el locus de Nav1.7 humano (FIG. 3, centro)
Se obtuvieron los brazos de homología cadena arriba y cadena debajo de ADN de BAC de ratón en las posiciones 5' y 3' del locus de Nav1.7 endógeno para su adición al fragmento de ADN humano-casete de higromicina para crear el vector de direccionamiento final para el remplazo del locus de Nav1.7 endógeno que contenían de 5' a 3' un brazo de homología 5' que contenía 70 kb del ADN de ratón 5' del locus de Nav1.7 endógeno, un fragmento de ADN de ~113 kb que contenía los exones 2 a 28 del locus de Nav1.7 humano, un casete de higromicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homología 3' que contenía 147 kb del ADN de ratón 3' del locus de Nav1.7 endógeno. El vector de direccionamiento se linealizó por digestión con Notl y después se usó en recombinación homóloga en células
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Inmunohistoquímica. El procesamiento del dolor es el resultado de complejas interacciones entre varias proteínas, receptores y canales que se expresan en neuronas nociceptivas del ganglio de la raíz dorsal (DRG). Se evaluaron anticuerpos anti-hNav1.7 seleccionados para la unión a neuronas DRG recogidas de ratones modificados por
hum/+
ingeniería para expresar Nav1.7 humano (Scn9a, Ejemplo 2), ratones modificados por ingeniería para expresar
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un Nav1.7 quimérico que contenía un bucle de poro extracelular humano (Scn9a, Ejemplo 3) y ratones de tipo silvestre (Scn9a+/+).
hum/+3.1/3.1 +/+ +/+
En resumen, se disociaron DRG lumbares recogidos de ratones Scn9a, Scn9ay Scn9ay ratas Scn9a(rScn9a+/+) y se sembraron en placa a una densidad de 5,5x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos tratadas con poli-DL-ornitina (0,1 mg/ml) y laminina (5 µg/ml) seguido de incubación a 37 ºC en 96,5 % de aire y 3,5 % de CO2. Las neuronas se mantuvieron en cultivo durante de 3 a 8 días en DMEM suplementado con 50 ng/ml de factor de crecimiento de nervios, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, vitaminas MEM, y suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 %. Las células sembradas después se fijaron en PFA al 4 % y sacarosa al 4 % en PBS pH 7,2 durante 30 minutos. Las células después se lavaron en PBS seguido de bloqueo en suero de cabra normal al 20 % durante una hora a temperatura ambiente. Después las neuronas se permeabilizaron en suero de cabra normal al 10 % con Triton X-100 al 0,1 % antes de inmunotinción para confirmar la actividad de unión a un Nav1.7 humano o quimérico (o de ratón y/o rata) sobre la superficie celular de las neuronas DRG. La Tabla 2 expone la unión específica de especie (+) o ausencia de unión (-) a neuronas DRG para anticuerpos anti-Nav1.7 seleccionados.
Tabla 2
Anticuerpo Genotipo DRG
hum/+ 3.1/3.1 +l+ +l+
Scn9aScn9aScn9arScn9a
Ab1 ---Ab2 +-Ab3 + -+/-Ab4 ++ + Ab5 +/---
Los anticuerpos anti-hNav1.7 seleccionados demostraron unión a neuronas DRG que expresaban una proteína Nav1.7 humana (por ejemplo, Ab3, Ab4, y Ab5), una proteína Nav1.7 quimérica (por ejemplo, Ab4) o una proteína Nav1.7 de ratón (por ejemplo, Ab2) sobre la superficie celular, mientras que no se observó unión a neuronas DRG que expresaban una proteína Nav1.7 de ratón o rata para otros anticuerpos (por ejemplo, Ab1 y Ab5). Otros anticuerpos anti-hNav1.7 demostraron reactividad cruzada de especie porque los anticuerpos mostraron unión a neuronas DRG de ratones con Nav1.7 humanizado, ratones de tipo silvestre y ratas (por ejemplo, Ab3 y Ab4).
Ensayo de liberación de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP). El neuropéptido péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) se libera de terminales periféricos y espinales de neuronas nociceptivas peptidérgicas de fibras A y C en respuesta a estímulos. La liberación de neuropéptido inicia la inflamación neurogénica, la desgranulación de mastocitos, y otras reacciones inflamatorias, que provocan hiperalgesia/sensación de dolor. Mediadores inflamatorios tales como prostaglandina E2, bradicinina, serotonina, histamina y capsaicina sensibilizan directamente y excitan DRG nociceptivo in vitro e in vivo conduciendo de ese modo a liberación de CGRP. Los nociceptores sensibilizados presentan un umbral más bajo de activación, actividad espontánea aumentada y una respuesta aumentada a estímulos supraumbral. Por tanto, la sensibilización de DRG y el disparo de potenciales de acción pueden conseguirse in vitro con diferentes mediadores inflamatorios provocando la liberación de CGRP y sirviendo de ese modo como un medio para medir la función nociceptiva de DRG. La activación nociceptores primarios se determinó en cultivos de DRG in vitro primarios aislados de ratones con Nav1.7 humanizado y de tipo silvestre por medición de la liberación de CGRP usando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) (Cayman, distribuido por SPlbio, Francia).
En resumen, se lavaron DRG entre 3 a 8 días de edad una vez en tampón de ensayo y se mantuvieron a 37 ºC hasta la adición de una mezcla inflamatoria (por ejemplo, prostaglandina E2 10 µM, bradicinina 10 µM, y capsaicina 1 µM). Se usaron dos inhibidores conocidos de canales Nav, tetrodotoxina (TTX) y ProTx-II, para determinar si Nav1.7 desempeña un papel en una liberación inducida por mezcla inflamatoria de CGRP in vitro. TTX se ensayó a concentraciones de 1 µM, una concentración inhibidora eficaz para canales sensibles a TTX, y 10 µM. ProTx-II inhibe en gran medida Nav1.7 a 10 nM (Schmalhofer, W.A, Calhoun, J., Burrows, R., Bailey, T., Kohler, M.G., Weinglass, A.B., Kaczorowski, G.J., Garcia, M.L., Koltzenburg, M., Priest, B.T. (2008) ProTx-II, a Selective Inhibitor of Nav1,7 Sodium Channels, Blocks Action Potential Propagation in Nociceptors. Molecular Pharmacology 74(5):1476-1484). Las neuronas se incubaron durante 20 minutos con el inhibidor (TTX o ProTx-II), seguido de estimulación con la mezcla inflamatoria durante 20 minutos o con el inhibidor combinado con la mezcla inflamatoria durante 20 minutos. Se prepararon diluciones del compuesto en tampón de ensayo y se añadieron las muestras por duplicado en una placa EIA de CGRP humano y se incubaron durante una noche. La concentración de CGRP liberado por DRG se midió el siguiente día usando un ensayo ELISA. Se calcularon promedios (media +/-desviación típica) para cada grupo de condiciones. La FIG. 8 muestra la respuesta a dosis para diferentes concentraciones de DRG en los ensayos de CGRP usando TTX en las condiciones mencionadas anteriormente. Los resultados para TTX se muestran en la Tabla 3. Los resultados para ProTx-II se muestran en la Tabla 4. IM: mezcla inflamatoria.
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