KR20050121270A - 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 조직 보호 화합물을동정하기 위한 분석 및 그의 용도 - Google Patents

조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 조직 보호 화합물을동정하기 위한 분석 및 그의 용도 Download PDF

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앤소니 세라미
피에트로 게찌
프비오 피오르달리소
마달레나 프라텔리
마르셀 레이스트
메테 니엘센
토마스 사게르
라르스 오스테르가르드 페데르센
젠스 게르위엔
토마스 콜만
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더 케네쓰 에스. 워렌 인스티튜트 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은, 조직 보호 활성을 매개하는 이종다량체(heteromultimer) 수용체 복합체를 사용하여, 조직 보호 활성을 갖는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 복합체는 복합체 내에 하나 이상의 βc 수용체와 함께 하나 이상의 EPO-R로 이루어진다. 조직 보호 화합물을 동정하는데 분석에서 사용되는 이들 화합물은 작은 분자 및 새체물질을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 이들 분석을 사용하여 동정되는 화합물은 기타 에리트로포이에틴-응답 또는 흥분성 세포, 조직 및 기관뿐만 아니라 중추신경계 및 말초신경계의 여러 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

Description

조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 조직 보호 화합물을 동정하기 위한 분석 및 그의 용도{TISSUE PROTECTIVE CYTOKINE RECEPTOR COMPLEX, ASSAYS FOR IDENTIFYING TISSUE PROTECTIVE COMPOUNDS AND USES THEREOF}
본 발명은, 약물 검색/발견을 위해 하나 이상의 베타 공통(βc) 수용체(CD131로도 알려져 있음) 및 하나 이상의 에리트로포이에틴(EPO) 수용체를 갖는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표적으로 하는 방법, 및 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 동정 및 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물과 같이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 이용하여 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물과 같이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 이용하여 흥분성 조직 기능을 향상시키는 방법을 포함한다.
여러 종류의 증거에서, 사이토카인 상과(superfamily)의 일종인 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 수용체(EPO-R)와의 상호작용을 통해 매개되는 중요한 생리 기능을 수행하는 것을 암시한다. 이러한 작용들은 적혈구의 생산, 세포 분열, 평활근 및 신경 세포로의 칼슘 유입의 조절, 및 중간대사에 대한 효과를 포함한다.
EPO-R은 68 kDa의 단백질로서 타입-1 사이토카인 수용체 패밀리의 일부이다. 상기 패밀리는 인터류킨(IL)-IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 백혈병 억제 인자(LIF), 섬모 호중구성 인자(CNTF), 트롬보포이에틴, 성장 호르몬 및 프로락틴에 대한 수용체들을 포함한다. 이들 수용체는 그들의 세포 외 도메인의 상동성으로 인해 함께 분류된다. 이들 수용체의 보존적인 세포 외 도메인은 아미노-말단 지역에 국소적으로 보존된 4개의 시스테인 잔기들(Cys 294, Cys 283, Cys 248, Cys 238)과 막관통 도메인에 인접하여 위치한 Trp-Ser-X-Trp-Ser 모티프(motif)를 포함하는, 약 200개 아미노산 길이를 갖는다. 상기 4개의 시스테인은 이들 수용체의 유지 및 구조적 보존에 결정적인 것으로 보인다(Murray, 1996, Harpers Biochemistry 24th ed. pp.524-526, Appilion & Lange, Ltd.; Caravella et al., 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401).
타입-1 사이토카인 수용체 패밀리 내 많은 수용체들과 같이, EPO-R은 그의 내생적 리간드 EPO와의 상호작용에 의해 활성화되는 것으로 보인다. 이량체 내 제 1 EPO-R이 높은 친화력으로 EPO에 결합하고, 그 후에 제 2 EPO-R이 낮은 친화력으로 상기 복합체에 결합한다. 이러한 EPO-R의 이량체화는 EPO-R과 관련된 Jak2 티로신 키나아제를 밀접한 제휴관계에 놓이게 하여 그들의 인산전이(transphosphorylation)를 유발한다. 이러한 활성화는 포스파티딜이노시틸(PI) 3-키나아제 경로, Ras/MAP 키나아제 경로, 및 STAT 경로와 같은 몇몇 다른 경로들을 이어서 활성화시키는 몇몇 단백질의 티로신 인산화를 야기한다. 이러한 경로들은 에리트로포이에틴에 의해 매개되는 생리 기능을 촉발한다(Kirito et al., 2002, Blood 99:102-110; Livnah et al., 1999, Science 283:987-990; Naranda et al., 2002, Endocrinology 143:2293-2302; Remy et al., 1999, Science 283:990-993; and Yoshimura et al., 1996, The Oncol. 1:337-339).
다중체 형성 이외에, 타입-1 패밀리의 대다수 구성원은 세 개의 서로 다른 신호전달 수용체 성분-gp130, 베타 공통(βc 수용체), 또는 IL2 수용체의 감마 하위 단위 수용체(γc 수용체)-중의 하나를 그의 수용체 복합체 내에 도입시킨다. 예를 들면, GM-CSF에 대한 수용체 복합체는 GM-CSF 수용체, 2개의 βc 수용체, 및 GM-CSF 리간드로 이루어져 있다. EPO-R은 βc 수용체와 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다(Yutaka et al., 1995, Bioch. Biophys. Res. Com. 208:1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood 90:1867-1873; DAndrea et al., 1998, J. Clin, Invest. 102:1951-1960 참조). 그러나, 이러한 복합체는 생리적으로 관련된 어떠한 효과도 나타내지 못하였다고 보고되었다(Scott et al., 2000, Blood, 96:1588-1590).
도 1은 카바밀화 EPO(carbamylated EPO)가 EPO-R에 결합하지 않는다는 것을 증명하는 EPO와 카바밀화 EPO 사이의 경쟁적 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 래트의 뇌 막 내에 βc 수용체의 존재를 나타낸 것이다.
도 3은 βc 수용체의 존재에 대해 염색된 래트의 척수 조직을 나타낸 것이다.
도 4는 βc 수용체의 존재에 대해 염색된 래트의 척수 조직의 확대도를 나타낸 것이다.
도 5은 EPO-R 및 βc 수용체의 동시침전(coprecipitation)을 나타낸 것이다.
도 6은 조직 보호 수용체 복합체의 가능한 형상을 나타낸 것이다.
도 7은 EPO의 존재 및 부재 하에서 정상 및 βc 수용체 넉-아웃(knockout) 마우스로부터 단리된 심근 세포에서의 세포자멸을 나타낸 것이다.
도 8은 포스포타이린(phosphotyrine, PY)-Jak2 항체를 이용한 폴리아크릴아마이드 겔에 의해 분리된 세포 단백질의 웨스턴 블럿팅의 사진들을 나타낸 것이다. 상부 겔은 인산화된 Jak2가 5 nM 및 50 nM 농도에서 EPO에 의해 자극된 세포 내에 존재하였음을 나타낸다. 하부 겔은 동일한 양의 부하를 확인하기 위해 막들을 떼어낸 후 Jak2에 대한 항체로 재탐색된 경우에 수행된 대조군을 나타낸다.
도 9는 EPO 수용체를 발현하는 BaF3 세포들에 대한 리간드 결합 친화력의 그래프를 나타낸 것이다. nM의 리간드 농도(x-축)가 EPO 수용체 리간드들 EPO 및 카바밀화 EPO에 접촉되는 BaF3 EPO 수용체 발현 세포들에 대한 결합(cpm)(y-축)에 대해 기입되었다.
도 10은 EPO 수용체를 갖는 UT-7 세포 막들에 대한 리간드 결합 친화력의 그래프를 나타낸 것이다. nM의 리간드 농도(x-축)가 EPO 수용체 리간드들 EPO 및 카바밀화 EPO에 접촉되는 UT-7 EPO 수용체 발현 세포 막들에 대한 결합(cpm)(y-축)에 대해 기입되었다.
도 11은 대조군(운반체), EPO, 카바밀화 EPO, 및 아시알로EPO(x-축)의 투여 후 마우스에서, 적혈구 용적률(hematocrit)의 백분율 부피(y-축)에 의해 측정되는 적혈구 용적률의 막대그래프(11A), 및 mM 농도로 측정된 헤모글로빈 농도(y-축)의 막대그래프(11B)를 나타낸 것이다.
도 12는 원형의 103KD 뉴클레올린(nucleolin) 단백질을 이용한 SDS-PAGE 겔의 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 2개의 야생형 및 3개의 βc 넉-아웃인 5개 군의 마우스에 각각 PBS, EPO 또는 카바밀화 EPO가 투여되고 그 직후에 척수 손상이 수반된 경우에 척수 손상이 수반되는 날짜들로 측정한 시간(x-축)에 대한 BBB 운동 점수(y-축)의 그래프를 나타낸 것이다. 카바밀화 EPO가 투여된 상기 야생형 마우스 군은 모든 다른 군들과 비교하여 42일간의 후-손상 기간동안 내내 증가된 운동 점수를 나타내었다.
도 14는 상기 도 13에서 기술된 5개 군들에 대하여 곡선 하 면적에서 측정된 임상적 위중도(AUC)(y-축) 및 군들(x-축)의 막대그래프를 나타낸 것이다. 카바밀화 EPO가 투여된 마우스의 야생형 군(칼럼 1)은 모든 다른 군들(칼럼 2-5)과 비교하여 임상적 위중도 평가에서 현저한 증가(즉, 덜 심각함)를 나타내었다.
본 출원은 각각의 전체 내용이 여기에 완전하게 참고문헌으로 도입된, 2003년 4월 25일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/465,891호에 대해 35 U.S.C. § 119(e)에 근거하여 우선권을 주장하는, 2003년 9월 30일자로 출원된 동시-계류중인 미국 특허출원 제10/676,694호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 약물 검색/발견을 위한 "조직 보호 사이토카인 수용체 복합체"(아래 정의됨)를 표적으로 하고, 생체 외 조직 보호 및 복구를 달성하기 위한, 예컨대 다양한 질환, 장애 및 상태의 예방 및 치료를 위한, 또는 인간 대상자들 또는 다른 포유동물들의 흥분성 조직의 기능을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로는, EPO 수용체/βc 수용체 복합체들이 흥분성 조직들의 보호에 중요한 역할을 담당한다는 출원인의 발견을 기초로 한다. 여기에 기술된 실험들은 EPO가 EPO 수용체 및 βc 수용체를 모두 발현하는 야생형 세포들에서 보호효과, 즉 완화된 세포자멸(mitigated apoptosis) 효과를 나타내고 있음을 증명한다; 그러나, EPO는 상기 βc 수용체들이 결여된 세포들에서는 보호효과를 갖지 않는다. 동물 연구들에서, 허혈성 척수 손상이 (양쪽 수용체들 모두를 발현하는) 야생형 마우스 및 (상기 βc 수용체를 발현하지 않는) βc 넉-아웃 마우스에 가해졌다. (비-적혈구조혈성이고, EPO 수용체 이량체에 결합하지 않는) 카바밀화 EPO의 투여는 야생형 마우스에서 향상된 회복의 결과를 나타낸다. 그러나, EPO 및 카바밀화 EPO 모두 상기 βc 수용체 넉-아웃 마우스에서는 회복 효과를 나타내지 못했다. 이러한 결과들은 βc 수용체의 발현이 조직 보호 효과를 달성하는데 필수적임을 증명하는 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들에 결합하는 화합물들을 동정하기 위한 무세포 검색 분석에서, EPO 수용체 및 βc를 포함하는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들의 활성을 조절, 즉 향상시키거나 억제하는 화합물들을 동정하고, 또는 조직 보호 활성을 나타내는 화합물들을 동정하기 위한 세포-기반 검색 분석에서, EPO 수용체 및 βc를 포함하는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들에 의존적으로 조직 보호 활성을 나타내는 화합물들을 동정하기 위한 동물-기반 검색 분석에서 EPO 수용체 및 βc를 포함하는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들의 용도에 관한 것이다. 또 다른 특별한 양태에서, 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물들은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 그의 리간드 사이의 상호작용을 조절하고 조직 보호 활성을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조절하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 투여함으로써 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 검색 방법의 특정 실시양태에서, 시험 화합물은 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, EPO와 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 리간드의 존재 및/또는 부재 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉된다. 이러한 분석법들은 리간드와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 상호작용을 조절하는 화합물들을 동정하는데 사용될 수 있다.
무세포 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 화합물들을 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들 또는 이러한 복합체들의 막 조직표본은 시험 화합물과 접촉되고 상기 결합의 징조가 측정된다. 상기 분석은 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉하는 경우에 직접적인 결합 분석일 것이다. 경쟁적 결합 분석에서, 2개의 화합물들(예컨대, 시험 화합물과 리간드, 또는 2개의 시험 화합물들) 중 어느 것이 더 큰 결합 친화력을 갖는지를 결정하기 위해 상기 2개의 화합물들은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 접촉된다. 제 1 화합물이 상기 복합체에 결합하는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 접촉하게 되고, 만약 제 2 화합물이 결합된 제 1 화합물을 대체할 능력을 가지고 있다면, 제 2 화합물이 상기 분석에 첨가되는 경우에 상기 분석은 치환(displacement) 결합 분석일 것이다. 결합 분석에서, 상기 결합은 분석에 첨가된 화합물들을 표지하고/하거나 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표지함으로써 측정될 수 있다.
세포-기반 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 리간드의 존재 및/또는 부재 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표적하는 화합물들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 세포는 시험 화합물과 접촉된다. 상기 시험 화합물이 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는지 여부를 결정하기 위해, 판독이 관찰되거나 측정된다. 상기 판독은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 시험 화합물의 결합의 단순한 측정일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 시험 화합물은 표지되며, 표지화된 시험 화합물의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 결합은 상기 시험 화합물에 부착된 표지를 검출함으로써 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 판독은 세포 크기, 모양, 또는 상기 세포의 세포자멸과 같은 표현형 변화이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 판독은 리포터(reporter) 유전자의 발현 또는 세포 내에 적재되거나 배양 배지 내에 포함된 지시염료에 있어서의 변화이다. 이러한 실시양태에서, 상기 분석에 사용된 세포들은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성시 리포터 유전자 산물을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 판독은 세포의 효소반응에 의해 결정된다. 이러한 실시양태에서, 시험 화합물에 접촉된 후에 상기 분석에 사용된 세포들은 용해된다. 상기 세포 용해물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성화의 표시들에 대해 조사된다. 예를 들면, 세포 용해물은 상기 복합체에 결합하는 항체에 노출될 수 있는데, 상기 항체는 또한 상기 복합체에 고정된 지지체에 부착할 수 있다. 그 후에 다른 항체들이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 활성화되었는지 여부를 검출하기 위해 상기 분석에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 항-포스포티로신(anti-phosphotyrisine) 항체들은 상기 복합체의 인산화 부분들 및/또는 EPO/β 공통 수용체 복합체의 하류 성분들에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 복합체의 β 공통 수용체 부분의 인산화 부분들에 결합할 수 있는 항체들 및/또는 EPO 수용체의 인산화 부분들에 결합할 수 있는 항체들이 사용된다. 특정 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들을 발현하는 세포들은 β 공통 수용체 및/또는 EPO 수용체의 인산화 부분들에 결합할 수 있는 항체들과 접촉된다. 특정 실시양태에서, 분리된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들은 β 공통 수용체 및/또는 EPO 수용체의 인산화 부분들에 결합할 수 있는 항체들과 접촉된다. 특정 실시양태에서, EPO 수용체의 인산화 부분들에 결합할 수 있는 항체들은 PY-JAK2 항체들이다. 하류 사이토카인 활성화 표적들이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들에 대해 동정되었기 때문에, 본 발명의 검색 방법의 판독은 하류 세포 성분들의 인산화의 검출일 수 있다.
하류 세포 산물들의 존재는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표적하는 화합물들을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 세포와 접촉시킨 후에, 상기 세포는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성화의 지표인 뉴클레올린 또는 뉴로글로빈과 같은 다른 세포 산물들의 존재 여부에 대해 조사될 수 있다.
본 발명의 검색 방법의 특정 실시양태에서, 상기 세포는 하나 이상의 EPO 수용체 또는 β 공통 수용체를 발현하도록 유전자 재조합에 의해 조작된다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 β 공통 수용체 폴리펩타이드 또는 EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 과발현하도록 유전적으로 조작된다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 β 공통 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 과발현하도록 유전적으로 조작된다. 상기 과발현은 상기 핵산들을 프로모터에 작동적으로 연결시킴으로써 달성될 수 있고, 유전공학은 내생적 유전자들의 유전자 활성화를 달성하기 위한 상동 재조합 또는 상기 활성화된 유전자들을 이용한 세포들의 무작위 통합 및 선별을 목적으로 하는 표준 형질전환 기법들에 의해 일어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 세포와 동일한 종들로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 β 공통 수용체 및/또는 EPO 수용체를 내생적으로 발현한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 내생적으로 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 제 1 세포에 화합물을 투여하고 이어서 바로 상기 세포를 유해제제에 노출시키고, 상기 화합물을 제 1 세포와 동일한 유형이지만 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 발현이 결손된(즉, β 공통 수용체의 발현이 결여된) 제 2 세포에 투여하고 이어서 바로 상기 세포를 제 1 세포와 동일한 유해 제제에 노출시키는 것을 포함하고, 그러한 경우에 만약 세포의 생존이 제 2 세포와 비교하여 제 1 세포에서 다르다면, 그렇다면 상기 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표적하는 화합물인, β 공통 수용체 넉-아웃 세포에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 세포들은 β 공통 수용체 넉-아웃 동물로부터 유래된다.
분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 표적으로 하는 화합물들을 동정하기 위해 동물 모델들에서 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은, 내생적으로 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 손상된 직후의 제 1 동물에게 상기 화합물을 투여하고, 상기 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 발현이 결손되고 동일한 종류의 손상이 가해진 직후의 제 2 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 이로 인해 손상으로부터의 회복이 제 2 동물에 비하여 제 1 동물에서 다르면, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물이 동정되는, 포유동물에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 검색 방법에서 사용될 수 있는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 세포들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포유동물, 곤충, 진핵, 원핵, 진균, 또는 세균 세포들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 세포들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 pre-B 세포들, 293 세포들, 293T 세포들, HeLa 세포들, HepG2 세포들, K562 세포들, 또는 3T3 세포들이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 마우스 세포들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 BaF3 세포들이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 진균 세포들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 피치아, 및 한세눌라 속으로부터 유래된 세포들이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 치료학적 유효량으로 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에게서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 흥분성 조직에 영향을 미치는 질환 또는 장애이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 치료학적 유효량으로 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에게서 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키는 방법을 제공하는데, 상기 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능 향상은 연상 학습 또는 기억이 향상되는 결과를 가져온다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 이러한 치료 또는 예방이 요구되는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에게서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간에게서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조절하는 것을 포함하는, 인간에게서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간에게서 조직 복합 사이토카인 수용체 복합체를 조절하는 것을 포함하는, 인간에게서 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다.
질환 또는 장애를 치료 또는 예방하고, 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키고, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하기 위한 본 발명의 실시양태에서, 투여되는 상기 화합물은 조직 보호 효과를 갖거나 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물들을 동정하기 위한 여기에 상기에서 기술된 검색 방법 중의 어느 하나의 방법에 의해 동정될 수 있다. 관련된 실시양태에서, 상기 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체이다. 관련된 실시양태에서, 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 특이적인 항체이다. 관련된 실시양태에서, 상기 화합물은 작은 분자, 펩타이드, 또는 라이브러리(library)의 구성원이다. 관련된 실시양태에서, 상기 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합한다. 관련된 실시양태에서, 상기 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 증강시킨다. 관련된 실시양태에서, 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 방해한다. 관련된 실시양태에서, 상기 화합물은 EPO와 함께 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 EPO이다. 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 EPO가 아니다. 관련된 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 변형된 EPO 또는 EPO 돌연변이가 아니다. 변형된 EPO 및 돌연변이 EPO 화합물들의 예시들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 항목 5.4.1.1.에 기술된 것들을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물이 EPO, 변형된 EPO, 또는 EPO 유도체인 경우에, 상기 투여된 화합물은 EPO 수용체에 결합하지 않는다. 본 발명의 관련된 실시양태에서, 상기 투여된 화합물이 EPO, 변형된 EPO, 또는 EPO 유도체인 경우에, 상기 투여된 화합물은 EPO 수용체 이량체에 결합하지 않는다. 치료, 예방, 흥분성 조직의 기능 향상, 및 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 EPO, 즉 모든 EPO, 변형된 EPO, 돌연변이 EPO 또는 그의 유도체가 아니다.
질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 조직의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 EPO 수용체에 결합하지 않는다. 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 조직의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 2개의 EPO 수용체들로 이루어진 이량체에 결합하지 않는다. 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 조직의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 투여된 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합한다.
질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 결핍 과다활동 장애, 알츠하이머병, 노화, 또는 인지 기능장애이다. 관련된 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 저산소증, 발작성 장애, 신경변성 질환, 신경독소 중독, 다발성 경화증, 저혈압, 심박 정지, 방사선, 또는 저혈당증에 의해 야기된다. 관련된 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 허혈 또는 뇌졸증이다. 관련된 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 신경변성 상태이다. 관련된 실시양태에서, 상기 신경변성 상태는 뇌졸증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 인지력의 연령-관련 손실, 기억 손실, 근위축성 측삭경화증, 발작성 장애, 알코올 중독, 망막 허혈, 노화, 녹내장 또는 신경 세포 손실이다. 다른 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 신경근육 또는 근육 상태이다. 특정 실시양태에서, 상기 신경근육 또는 근육 상태는 심장 조직의 것이다. 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 조직의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 질환, 장애, 또는 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들은 대뇌 유래가 아니다. 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 조직의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 질환, 장애, 상태, 또는 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 콩팥 조직, 심장 조직, 내피 조직, 망막 조직, 혈관 조직, 허파 조직, 췌장 조직, 골격 조직, 피부 조직, 배아 조직, 태아 조직, 간 조직을 포함하는 중추신경계의 것이 아니다.
흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키기 위한 본 발명의 실시양태에서, 상기 흥분성 조직은 중추신경계 조직 또는 말초신경계 조직이다. 특정 실시양태에서, 상기 말초신경계 조직은 태반조직, 망막조직, 또는 심장조직이다.
질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방, 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능의 향상, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조절을 위한 본 발명의 실시양태에서, 상기 투여는 경구, 국소, 두개 내, 관 내, 흡입, 코, 비경구, 정맥 내, 말초, 동맥 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 점막 하 또는 진피 내 투여이다. 관련된 실시양태에서, 상기 투여는 의학적 또는 외과적 과정 전이다. 특정 실시양태에서, 상기 외과적 과정은 종양 절제술, 동맥류 회복 또는 심장동맥 우회술이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 의학적 절차는 해산 또는 분만이다.
3.1 용어
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "조직 보호 활성"은 세포, 조직, 또는 기관의 손상 또는 사멸을 억제하거나 지연시키는 효과를 말한다. 상기 조직 보호 활성은 다양한 상태, 질환, 및 세포, 기관, 및/또는 조직 손상, 예컨대, 항목 5.5.에 기술된 것들에 대항할 수 있다. 조직 보호 활성은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 중주신경계의 조직과 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 갖는 흥분성 조직, 세포들, 및/또는 기관들에 특이적일 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "조직 보호 사이토카인 수용체 복합체"는 하나 이상의 에리트로포이에틴과 하나 이상의 베타 공통 수용체를 포함하는 복합체를 의미한다. 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 여기에서 항목 5.1.3.에 기술된 바와 같은 다른 유형의 수용체들뿐만 아니라, 다중 에리트로포이에틴 수용체들 및/또는 베타 공통 수용체들을 포함할 수 있다.
용어 "조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드"는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하여 상기 복합체를 활성화시키거나 공지된 활성화 리간드에 의한 활성화를 억제하는 임의의 화합물을 의미한다. "조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드"는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 단백질, 펩타이드들, 작은 분자들, 유기분자들, 또는 비-유기분자들과 같은 모든 종류의 화합물일 수 있다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드들의 비-제한적 예시들로는 돌연변이체, 화학적 변형, 또는 그의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-결합 절편들을 포함하는 EPO를 포함한다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 또 다른 예시로는 상기 복합체에 특이적인 항체이다.
용어 "질환, 장애 또는 상태를 예방하는"은 이러한 질환, 장애 또는 상태의 발병을 지연시키고, 진행을 방해하고, 출현을 저지하고, 이들로부터 보호하고, 출현을 억제하거나 제거하고, 또는 발생률을 감소시키는 것을 의미한다. 용어 "예방"의 사용은 예방 요법이 시행된 환자 집단 내 모든 환자들에게서 예방을 목적으로 하는 질환, 장애, 또는 상태가 전혀 발생하지 않는 것이 아니라, 상기 환자 집단이 상기 질환, 장애, 또는 상태의 발생률에 있어서의 감소를 나타낼 것임을 암시하는 것을 의미한다. 예를 들어, 많은 독감 백신들은 상기 백신이 투여된 사람들에게서 독감을 예방하는데 100% 효과적이지 않다. 예방은 또한 흥분성 조직들의 보호를 포함한다. 당업자는 예방 요법이 유익할 것인 환자들 및 상황들, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 수술이 계획된 환자들, 유전적 질환, 장애, 또는 상태에 대해 위험한 환자들, 환경적 요인들에 의해 야기된 질환, 장애, 또는 상태에 대해 위험한 환자들, 또는 노년층, 유아와 같은 특정 질환, 장애, 또는 상태에 대해 위험한 집단의 일부분, 또는 약화된 면역계를 갖는 환자들, 또는 질환, 장애, 또는 상태에 대한 유전적 또는 다른 위험 인자들을 갖는 환자들을 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 방법과 관련하여 용어 "동시에 투여된"은 질환, 장애, 또는 상태의 발병 전에, 그와 동시에, 및/또는 이어서 화합물을 투여하는 것을 의미한다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명은 조직 보호 화합물의 조직 보호 활성을 매개하는 이종다량체(heteromultimer) 수용체 복합체의 사용을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 조직 보호 화합물들을 동정하기 위한 검색 방법 및 질환, 장애, 또는 상태의 치료 또는 예방에 있어서 이러한 화합물들의 용도, 또는 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키기 위한 방법에 있어서 이러한 화합물들의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물들을 투여함으로써 질환, 장애, 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물들을 투여함으로써 흥분성 세포들, 조직들, 또는 기관들의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조절하거나 표적하는 화합물을 투여함으로써 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 뇌, 척수 및 심장과 같은 흥분성 세포들 및 조직들 내에서 EPO 수용체가 βc 수용체와 복합체를 형성한다는 본 발명자들에 의한 발견에 기초한다. 상기 복합체는 하나 이상의 βc 수용체와의 복합체로서 하나 이상의 EPO-R로 이루어진다. 상기 βc 수용체 이외에, 이에 한정되는 것은 아니지만, γc 수용체 및 GP130, 이에 한정되는 것은 아니지만, GM-CSF, IL-3, IL-5 등을 포함하는 다른 타입-1 사이토카인 수용체들의 분절들 및 부분들, 및 이에 한정되는 것은 아니지만, ROR1, NR6, HM74 등을 포함하는 희귀 수용체들을 포함하는 다른 신호전달 수용체들이 사용될 수 있다. 본 발명의 검색 방법은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물들을 동정하기 위한 분석에서 이러한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들을 사용할 수 있다. 이러한 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 리간드에 결합하는 화합물들을 동정하기 위한 결합 분석을 포함한다. 출원인의 상기 발견은 흥분성 세포들, 조직들, 및 기관들의 향상뿐만 아니라, 질환, 장애, 및 상태의 치료 및 예방에 있어서의 사용을 위해 특별히 효과적인 화합물들을 동정하기 위한 수단들을 제공한다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성화는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 뉴클레올린 및 뉴로글로빈 및 사이토글로빈(히스토글로빈)과 같은 글로빈들을 포함하는 보호 단백질의 생산의 상향조절을 초래할 수 있다. 조직 보호 활성을 분석하는 여기에 상기에서 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 조직 보호 활성에 대해 동정된 화합물을 분석하는 단계는 세포 내 뉴클레올린의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
조직 보호 활성을 분석하는 여기에 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 조직 보호 활성에 대해 동정된 화합물을 분석하는 단계는 세포 내 뉴로글로빈 또는 사이토글로빈의 증가된 수준을 검출 또는 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 조직 보호 활성을 갖는 화합물들을 동정하기 위한 검색 방법은 이러한 상향 조절된 단백질의 검출을 이용할 수 있다.
상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 하류 조절인자들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 작은 분자들 및 생물 제제를 포함하는 조직 보호 화합물들을 동정하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이러한 분석을 이용하여 동정된 상기 화합물들은 다른 흥분성 세포들, 조직들, 및 기관들뿐만 아니라 중추 및 말초신경계의 다양한 상태들을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
5.1 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체
본 발명의 방법에 사용하기 위한 수용체 복합체는 하나 이상의 EPO 수용체 및 하나 이상의 βc 수용체를 포함한다. 다양한 유형의 자연적으로 발생한, 변형된, 및/또는 돌연변이 EPO 수용체들 및 βc 수용체들은 다양한 수의 수용체들의 이러한 복합체들을 형성하기 위해 결합될 수 있다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들의 비-제한적인 예시들을 하기에 기술하였다.
5.1.1 EPO-R
포유동물 EPO-R이 본 발명에서 사용될 수 있다. EPO-R cDNA를 마우스 간(Tojo et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 148: 443-48) 및 인간 태아 간(Jones et al., 1990, Blood 76:31-35; Winkelmann et al., 1990, Blood 76:24-30)으로부터 분리하였다. 상기 인간 cDNA는 약 55 kDa 분자량의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하고, 약 508개 아미노산을 갖는다. 분리되고 서열이 분석된 인간 EPO-R의 다른 유전자 클론들 역시 본 발명에 의해 심사숙고되었다(Penny and Forget, 1991, Genomics 11:974-80; Noguchi et al., 1991, Blood 78:2548-2556). 이러한 EPO-R의 공통적인 구조는 신호 펩타이드 내 약 24개 아미노산 잔기들, 세포 외 도메인 내 약 226개 아미노산들, 막-전장(membrane-spanning) 도메인 내 약 23개 아미노산들, 및 세포질 도메인 내 약 235개 아미노산들로 이루어져 있다(D'Andrea and Zon, 1990, J. Clin. Invest., 86:681-687; Jones et al., 1990, Blood, 76:31-35; Penny and Forget, 1991, Genomics, 11:974-80). 성숙 인간 EPO-R 단백질은 약 484개 아미노산을 갖는다. EPO-R은 BD 바이오사이언스 클론테크(BD Biosciences Clonetech, Palo Alto, CA)로부터 상업적으로 이용 가능하고, 유전자은행(gene bank) 등재번호 제M60459호 및 SwissProt 등재번호 제P19235호를 갖는다.
본 발명의 실행에 유용한 EPO-R의 형태들은 인간 및 다른 포유동물 EPO-R 관련 분자들의 자연적으로 발생한, 합성된 및 재조합 형태들을 포함한다. 또한, 본 발명의 실행에 유용한 EPO-R 형태들은 기능적으로 동등한 유전자 산물들을 나타내는 단백질을 포함한다. 이러한 기능적으로 동등한 유전자 산물들은 돌연변이 EPO-R 및 화학적으로 변형된 EPO-R을 포함한다. 돌연변이 EPO-R은 내부 결실을 포함하는 결실들, 융합 단백질을 양산하는 부가를 포함하는 부가들, 또는 아미노산 서열 내 및/또는 이에 근접한 아미노산 잔기들의 보존적 치환들을 포함할 수 있지만, 상기 변화는 기능적으로 동등한 EPO-R을 생산하는 "침묵" 변화라는 결과를 나타낸다. 이러한 아미노산 치환들은 관여하는 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산들은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산들은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양 전하를 띤(염기성) 아미노산들은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음 전하를 띤(산성) 아미노산들은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 미국 특허 제5,292,654호에 기재된 바와 같은 다른 공지된 EPO-R 돌연변이들 역시 본 발명에 포함된다.
나아가, 오직 세포 외 도메인만을 포함하는 EPO 수용체의 수용성 (절단된) 형태들 역시 공지된 문헌들(Harris et al. 1992, J. Biol. Chem. 267:15205; Yang & Jones, 1993, Blood 82:1713; 및 미국 특허출원공개 제20020031806호)에 기술된 바와 같이 본 발명에 사용되기 위해 심사숙고된다.
5.1.2 β c 수용체
βc 수용체는 전형적으로 인간 GM-CSF, IL-3 및 IL-5와 관련된 신호 수용체 하위 단위로서 확인된다. 이러한 사이토카인들 이외에, βc 수용체(예컨대, 스위스 등재번호 제P32927호 또는 Genebank 등재번호 제M59941호)가 특정한 경우들에서 EPO-R에 결합하는 것으로 입증되었다. 상기 βc 수용체의 보존영역은 세포 외 리간드-결합 지역의 전부 또는 일부를 구성한다. 본 발명은, 부분적으로는, EPO-R 및 βc 수용체가 뇌(도 2 참조) 및 척수(도 3 및 4 참조)와 같은 몇몇 흥분성 세포들 내에 함께 존재한다는 출원인들에 의한 입증에 근거한다. 출원인들은 또한 EPO-R 및 βc 수용체의 복합체들이 이들 복합체들을 발현하는 조직의 보호 및 복구의 생리적 과정을 이끄는 기작에서 역할을 담당한다는 것을 발견하였다(도 13 및 14 참조).
본 발명의 실행에 유용한 βc 수용체의 형태들은 인간 및 다른 포유동물 βc 수용체 관련 분자들의 자연적으로 발생한, 합성된 및 재조합 형태들을 포함한다. 또한, 본 발명의 실행에 유용한 βc 수용체 형태들은 기능적으로 동등한 유전자 산물들을 나타내는 단백질을 포함한다. 이러한 기능적으로 동등한 유전자 산물들은 돌연변이 βc 수용체 및 화학적으로 변형된 βc 수용체를 포함한다. 상기 돌연변이 βc 수용체들은 내부 결실을 포함하는 결실들, 융합 단백질을 양산하는 부가를 포함하는 부가들, 또는 아미노산 서열 내 및/또는 이에 근접한 아미노산 잔기들의 보존적 치환들을 포함할 수 있지만, 상기 변화는 기능적으로 동등한 EPO-R을 생산하는 "침묵" 변화라는 결과를 나타낸다. 돌연변이된 βc 수용체들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 1374N, FIΔ, ΔGA, H544R, V449, A459D, L445Q, CRD4 점 돌연변이들(I374N, L356P, W358N, Q375P, Y376N, W383R, 및 L399P), 및 세포 외 절단들(1GH7)을 포함한다. (R.J. DAndrea and T.J. Gonda, 2000, Experimental Hematology 28:231-243; DAndrea et al., 1998, J. Clin. Invest. 102:1951-1960; Jenkins et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8669-8677 참고).
이에 한정되는 것은 아니지만, γc 수용체 및 GP-130, 및 희귀 수용체들을 포함하는 다른 공지된 신호 수용체 하위 단위들 역시 본 발명에 사용될 수 있는 것임이 심사숙고된다.
5.1.3 이종다량체 수용체 복합체의 구조
βc 수용체는 GM-CSF, IL-3, 및 IL-5에 결합하는 것으로 이미 알려진 많은 수용체들과 다량체를 형성한다. 예를 들면, GM-CSF에 대한 상기 수용체 복합체는 GM-CSF 수용체, 2개의 βc 수용체들, 및 GM-CSF 리간드로 이루어진다. EPO-R은 βc 수용체와 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. (Yutaka et al., 1995, Biochem. Biophy. Res. Com. 208:1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood, 90:1867-1873; DAndrea et al., 1998, J. Clin, Invest. 102:1951-1960 참조) 이와 유사하게, 본 발명에 따르면, 상기 βc 수용체는 조직 보호 수용체 복합체를 형성하기 위해 EPO-R과 함께 이종다량체를 형성한다. 이는 βc 수용체 및 EPO-R 수용체들이 동시-침전됨을 입증하는 면역침전 연구들을 근거로 한다(도 5 참조).
상기 조직 보호 수용체 복합체는 하나 이상의 EPO-R 및 하나 이상의 βc 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 조직 보호 수용체 복합체는 하나의 이상의 βc 수용체를 포함할 것이다. 하나의 이상의 EPO-R을 포함하는 조직 보호 수용체 복합체 형상들 또한 본 발명에 의해 예상된다. 본 발명에 의해 예상되는 조직 보호 수용체 복합체들의 예시들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, EPO-R2/βc 수용체 2, EPO-R/βc 수용체 2, 및 EPO-R/βc 수용체 3을 포함한다. 상기 조직 보호 수용체 복합체의 가장 많이 제안된 형상은 도 6에 나타낸 바와 같은 EPO-R/βc 수용체 2이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 임의의 특정한 이론에 의해 구속되지 않으면서, 상기 조직 보호 화합물이 조직 보호 수용체 복합체에 결합하는 가능한 기작은 상기 조직 보호 화합물이 먼저 EPO-R에 결합하고 그 후에 이어서 2개의 βc 수용체들이 상기 복합체에 결합하는 것을 포함한다. 이러한 기재는 단지 리간드가 상기 조직 보호 수용체 복합체에 결합하는 하나의 방법을 예시한 것으로, 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자는 상기 결합이 일어날 수 있는 다른 기작들-상기 수용체 복합체가 리간드에 결합하기 전에 수행될 수 있는 (EPO-R 및 2개의 βc 수용체) 등의 기작들을 합리적으로 상상할 수 있다.
전장의 수용체들, 수용체 단편들(예컨대, 리간드-결합 단편들), 및 융합 폴리펩타이드들을 포함하는 본 발명의 수용체 폴리펩타이드들은 통상적인 기법들에 따라서 유전적으로 조작된 숙제 세포들 내에서 생산될 수 있다. 예를 들면, 상기 EPO 수용체의 에리트로포이에틴 결합 단편들이 동정된 바 있다(Barone et al., J. Biol. Chem. 272:4985-4992). βc 수용체와 복합체를 이루는 이러한 단편들 역시 본 발명의 검색 방법에 사용될 수 있다.
5.2 검색 분석
이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 상기에 기술된 것들과 같은, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들은 조직 보호 활성을 갖는 화합물들을 동정하기 위한 검색 분석에 사용될 수 있다. 이러한 분석에서 동정된 화합물들은 복합체의 활성, 예컨대 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하거나, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 및 상기 복합체 사이의 상호작용 조절할 수 있다. 또한, 상기 동정된 화합물들은 그들 자체가 조직 보호 활성을 가질 수 있다.
본 발명은 다양한 약물 검색 기법들 중의 어느 하나에서 EPO 수용체-βc 수용체 복합체를 사용함으로써 화합물들을 검색하는데 특히 유용하다. 이러한 검사에 사용된 상기 수용체 복합체는 용액 내에 유리된 상태이거나, 고체 지지체에 고정되거나, 세포 표면에 운반되거나, 또는 세포 내에 위치한다. 약물 검색의 한 방법은 폴리펩타이드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산으로 안정적으로 형질전환된 진핵 세포들을 이용한다. 약물들은 경쟁적 결합 분석에서 이러한 형질전환 세포들에 대해 검색된다. 생존한 또는 고정된 형태의, 이러한 세포들은 표준 결합 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 수용체 및 검사되는 제제 사이의 복합체들의 형성을 측정하거나 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및, 당해 분야에 공지된, 적당한 세포주 사이의 복합체 형성에 있어서의 감소를 조사할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 항목 6 및 7을 참고하라.
상기 항목 5.1에 기술된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들은 고-처리 검색을 위한 다중 수용체들의 패널을 포함하는, 생물학적 활성을 결정하기 위한 분석에서 (표지화된 시약을 포함하는) 시약으로서, 또는 생물학적 유액 내 조직 보호 화합물의 농도를 정량적으로 결정하고, 당연히, 관련된 리간드들을 분리하기 위기 위해 고안된 분석에서, 그에 상응하는 조직 보호 화합물이 (지속적으로 또는 조직 분화 또는 발달의 특정 단계에서 또는 질환 상태에서) 우선적으로 발현되는 조직들에 대한 마커로서 유사하게 사용될 수 있다.
상기에 열거된 분석을 수행하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법을 개시하고 있는 참고문헌들로 제한 없이 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, 및 "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987을 포함한다.
특정 실시양태에서, 여기에 기술된 본 발명의 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용하는 화합물을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 부재 하에서 수행될 수 있다. 상기 상호작용은, 예를 들면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 시험 화합물의 결합 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성일 것이다. 이러한 실시양태에서, 상기 시험 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉된다. 상기 동정된 화합물은 판독, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성화, 리포터 유전자의 전사, 세포 증식, 또는 조직 보호 활성을 만들어내는 화합물이다. 이러한 분석은 전형적으로 상기 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉하지 않는 대조군과 함께 수행된다. 상기 화합물의 유무에 따라 판독에 차이가 있는 경우에, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용하는 화합물이 동정된다. 다르게는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성과 같은 판독의 표준 수준들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 시험 화합물과 접촉하기 전에 측정될 수 있고, 상기 화합물의 첨가 전후에 판독에 있어서의 차이가 화합물들을 동정하는데 사용될 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 사이의 상호작용을 조절, 즉 향상시키거나 방해하는 화합물들을 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석은 EPO와 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 또는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체의 존재 하에 수행될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 시험 화합물의 존재 유무에 따른 판독 수준에 있어서의 차이가 검출될 수 있다. 그 다음, 판독의 수준이 EPO 부재 하에서의 수준과 비교될 수 있다. 만약 상기 화합물의 존재 유무에 따라 검출된 판독의 수준에 있어서의 차이가 EPO의 존재에 의존적이라면, 그렇다면 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 그의 리간드의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정된다. 예를 들면, 만약 검출된 판독 수준에 있어서의 차이가 화합물의 존재 하에 판독에 있어서의 증가에 의한 것이고, 상기 증가가 EPO의 존재에 의존적이라면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 그의 리간드 사이의 상호작용의 작용제가 동정된다. 다르게는, 만약 검출된 판독 수준에 있어서의 차이가 화합물의 존재 하에 판독에 있어서의 감소에 의한 것이고, 상기 감소가 EPO의 존재에 의존적이라면, 그렇다면 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 그의 리간드 사이의 상호작용의 길항제가 동정된다. 이 상황은 상기 판독이 부정적 판독인 실시양태에서는 반대가 된다. 예를 들면, 판독은 화합물이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 아무런 효과를 보이지 않을 때 나타날 수 있고, 이러한 효과를 갖는 화합물이 상기 분석에 도입되었을 때 사라질 수 있는데, 그렇다면 부정적 판독은 목적하는 효과를 갖는 화합물이 동정되었음을 나타낼 것이다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 사용하는 이러한 분석의 어느 하나 또는 전부는 연구 및/또는 임상 제품들로서 상업화를 위해 시약 등급 또는 키트 형식으로 개발되어질 수 있다.
5.2.1 무세포 분석
여기에 기술된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들은 조직 보호 활성을 갖는 화합물들을 동정하기 위해 무세포 분석에 사용될 수 있다. 무세포 분석의 특정 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체들은 용액 내 유리 상태이거나 고체 지지체에 부착된 상태일 수 있다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 활성은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 상기 화합물의 활성, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 화합물의 결합 친화력일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 포함하는 분리된 막들의 형태로 결합 분석에 첨가된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은, 시험 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉시키고, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 측정하고, 상기 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준과 비교하여, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하고, 조직 보호 활성에 대해 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함하는, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
직접 결합 분석에서, 상기 리간드 및/또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 상기 리간드 또는 수용체에 대한 상기 시험 화합물의 결합을 허용하는 조건들 하에서 시험 화합물과 접촉된다. 상기 결합은 액체 내에서 또는 고체 표면에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험 화합물은 검출을 위해 미리 표지화된다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 발광물질, 형광물질, 또는 방사성 동위원소 또는 이를 포함하는 군, 또는 효소 또는 염료와 같은 비방사성 표지와 같은 모든 검출 가능한 화합물이 표지를 위해 사용될 수 있다. 결합이 일어나기에 충분한 배양 기간 후에, 상기 반응은 과량의 또는 비-특이적으로 결합된 시험 화합물을 제거하는 조건들 및 조작들에 노출된다. 전형적으로, 이는 적당한 완충용액을 이용한 세척을 포함한다. 마지막으로, 상기 시험 화합물에 결합된 리간드(예컨대, EPO-시험 화합물) 또는 시험 화합물에 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 존재가 검출된다.
경쟁 결합 분석에서, 시험 화합물들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 상기 리간드(예컨대, EPO)의 결합을 파괴하거나 증강시키는 그들의 능력에 대해 분석된다. 표지화된 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 단편과 혼합되어 시험 화합물이 첨가되거나 첨가되지 않은 상태에서, 이들 사이의 상호작용이 정상적으로 야기되는 조건들 하에 놓여질 것이다. 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 표지화된 리간드(예컨대, EPO)의 양은 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 결합된 양과 비교될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 복합체 형성 및 검출을 용이하게 하기 위해, 상기 결합 분석은 고체 표면에 부동화된 하나 이상의 성분들과 함께 수행된다. 다양한 실시양태에서, 상기 고체 지지체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리카보네이드, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 유리, 나이트로셀룰로오스, 덱스트란, 나일론, 폴리아크릴아마이드 및 아가로스일 수 있다. 상기 지지체 형상은 비이드, 막, 미세입자, 미세역가 플레이트와 같은 반응관의 내부 표면, 시험관 또는 다른 반응관을 포함할 수 있다. 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 또는 다른 성분의 부동화는 공유 또는 비공유 부착들을 통해 달성될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 부착은 간접적, 즉 부착된 항체를 통한 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 음성 대조군들은 상기 고체 지지체에 대한 부착이 항-GST(Santa Cruz Biotechnology)와 같은 상업적으로 이용 가능한 항체에 의해 매개될 수 있도록 글루타치온 S-전이효소(GST)와 같은 에피토프로 표지화된다.
예를 들면, 이러한 친화력 결합 분석은 고체 지지체에 부동화된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 사용하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 상기 결합 반응의 부동화된 성분, 이러한 경우에는 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO) 또는 시험 화합물은 검출이 가능하도록 표지화된다. 다양한 표지 방법이 이용 가능하고 발광물질, 발색단, 형광물질, 또는 방사성 동위원소 또는 이를 포함하는 군, 및 효소 또는 염료와 같은 비방사성 표지들이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 시험 화합물은 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC, Sigma Chemicals로부터 입수가능, St. Louis)와 같은 형광단으로 표지화된다.
그 후에, 상기 표지화된 시험 화합물들, 또는 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)와 시험 화합물들은 특이적 결합이 야기되는 것을 허용하는 조건들 하에서 고체 지지체와 접촉하는 것이 허용된다. 상기 결합 반응이 일어난 후에, 비결합 및 비-특이적으로 결합된 시험 화합물들은 상기 표면을 세척함으로써 제거된다. 상기 고체상에 대한 결합 파트너의 부착은 이에 한정되는 것은 아니지만, 화학적 교차-결합, 플라스틱 표면에 대한 비-특이적 부착, 상기 고체상에 부착된 항체와의 상호작용, (바이오틴과 같은) 결합 파트너에 부착된 리간드와 상기 고체상에 부착된 (애비딘 또는 스트렙타비딘과 같은) 리간드-결합 단백질 사이의 상호작용 및 기타 등등을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 완전한 세포들 (항목 5.2.2에 기술된 분석 참조) 또는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 포함하는 분리된 막들의 형태로 결합 분석에 첨가된다. 따라서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 직접 결합 또는 리간드-조직 보호 사이토카인 수용체 복합체(예컨대, EPO-조직 보호 사이토카인 수용체 복합체)를 조절하기 위한 시험 화합물의 활성은 상기 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 배양 중인 완전한 세포들 또는 동물 모델들에서 분석될 수 있다. 표지화된 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)는 이러한 세포들로부터 얻어진 조 추출물들과 혼합되고, 상기 시험 화합물이 첨가될 수 있다. 분리된 막들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용을 하는 화합물들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 분리된 막들을 이용한 전형적인 실험에서, 세포들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 막들은 표준 기법들에 의해 수확되어 생체 외 결합 분석에 사용될 수 있다. 표지화된 리간드(예컨대, 125I-표지 EPO)는 상기 막들에 결합되어 특이적 활성에 대해 분석된다; 특이적 결합은 과량의 비표지화된 (냉각) 리간드의 존재 하에 수행된 결합 분석과의 비교에 의해 결정된다.
상기 수용성 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 또한 재조합에 의해 발현되고 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 결합하는 화합물들을 동정하기 위한 비-세포 기반 분석에 사용될 수 있다. 다르게는, 재조합에 의해 발현된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 리간드 결합 도메인, 또는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 단편은 비-세포 기반 검색 분석에 사용될 수 있다. 또 다른 교대의 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 하나의 이상의 결합 도메인들에 상응하는 펩타이드들, 또는 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 하나의 이상의 결합 도메인들을 포함하는 융합 단백질은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 세포질 부분에 결합하는 화합물들을 동정하기 위한 비-세포 기반 분석 시스템들에 사용될 수 있다; 이러한 화합물들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 신호 전달 경로를 조절하는데 유용할 수 있다. 비-세포 기반 분석에서, 재조합에 의해 발현된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 당해 분야에 잘 알려진 수단들에 의해 시험관, 미세역가 웰 또는 칼럼과 같은 고체 기질에 부착된다(Ausubel et al., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 참조). 그 후에, 상기 시험 화합물들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 그들의 능력에 대해 분석된다.
양재택일로, 상기 결합 반응은 용액 내에서 수행될 수 있다. 이 분석에서, 상기 표지화된 화합물은 용액 내에서 그의 결합 파트너(들)와 상호작용하는 것이 허용된다. 만약 상기 표지화된 화합물과 그의 결합 파트너(들) 사이의 크기 차이가 이러한 분리를 허용한다면, 상기 분리는 그의 결합 파트너(들) 또는 그의 결합 파트너(들)에 결합된 표지화된 화합물이 아닌 비결합 표지 화합물의 통과를 허용하는 크기의 기공을 갖는 초미세여과기를 통해 결합 반응의 산물들을 통과시킴으로써 달성될 수 있다. 분리는 또한 상기 결합 파트너에 대한 항체, 상기 결합 파트너에 미리 부착된 리간드와 상호작용을 할 수 있는 리간드-결합 단백질, 및 기타 등등과 같은, 용액으로부터 상기 표지화된 화합물의 결합 파트너를 포획할 수 있는 임의의 시약을 사용하여 달성될 수도 있다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면, 파아지 라이브러리는 플라스틱 비이드와 같은 고체상에 연결된, 정제된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 또는 그의 단편, 또는 도메인을 포함하는 칼럼을 통해 연속 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 파아지를 통과시킴으로써 검색될 수 있다. 상기 세척 완충용액의 강도(stringency)를 변화시킴으로써, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대해 높은 친화력을 갖는 펩타이드들을 발현하는 파아지에 대해 풍부하게 할 수 있다. 상기 칼럼으로부터 분리된 파아지는 클로닝되고, 짧은 펩타이드들의 친화력은 직접적으로 측정될 수 있다. 하나의 올리고뉴클레오타이드 이상에 대한 서열들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 리간드와의 복합체에 결합하는 훨씬 더 높은 친화력에 대해 조사하기 위해 결합될 수 있다. 어떠한 아미노산 서열들이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 가장 강력한 결합력을 부여하는지를 안다면, 컴퓨터 모델들이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 시험 화합물 사이의 분자적 접촉들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이는 이러한 접촉들을 모방하는 비-단백질성 화합물들의 고안을 허용할 것이다. 이러한 화합물은 상기 펩타이드의 동일한 활성을 가질 수 있고, 생산하는데 효율적이고 덜 비용이 드는 장점을 가지고, 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 또 다른 특이적 실시양태에서, 상기 고체 지지체는 미세역가 접시에 부착된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 포함하는 막들이다. 시험 화합물들, 예를 들어, 라이브러리 구성원들을 발현하는 세포들은 상기 미세역가 접시 내에서 라이브러리 구성원들의 발현을 허용하는 조건들 하에서 배양된다. 상기 단백질(또는 핵산 또는 유도체)에 결합하는 라이브러리 구성원들이 수확된다. 이러한 방법은 팜레이 및 스미스(Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305 318); 포울크스 등(Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13:422-427); PCT 공개 WO94/18318; 및 상기에서 언급된 참고문헌들에 실시예로서 기술된다.
마지막으로, 상기 고체 표면에 잔존하는 표지는 당해 분야에 공지된 임의의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 만약 상기 시험 화합물이 형광단으로 표지되다면, 형광측정기가 복합체들을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 생체 외 분석이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하고, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 상호작용을 조절하고, 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물의 능력을 동정하고 증명하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)와 시험 화합물 사이의 상호작용들은 생체 외에서 분석될 수 있다. 공지된 또는 비공지된 분자들이 결합에 도움이 되는 조건들 하에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체, 또는 그의 단편들에 대한 특이적 결합에 대해 분석되고, 그 다음에 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적으로 결합하는 분자들이 동정된다. 2개의 성분들이 다양한 방법로 측정될 수 있다. 하나의 한가지 접근은 상기 성분들 중의 하나를 용이하게 검출 가능한 표지로 표지하고, 이를 결합이 발생하는 것을 허용하는 조건들 하에서 시험 화합물(들)과 함께 놓아두고, 비결합된 표지 성분으로부터 결합된 표지 성분을 분리하는 분리 단계를 수행하고, 그 다음에 결합된 성분의 양을 측정하는 것이다. 하나의 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 표지되고 결합이 발행하는 것을 허용하는 조건들을 이용하여, 시험 제제에 첨가될 수 있다. 상기 시험 제제의 결합은 시험 제제의 존재 및 부재 하에서 형성된 복합체들을 비교하기 위해 폴리아크릴아마이드 겔 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
다중 생체 외 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-매개 과정에 대한 화합물의 효과를 평가하기 위해 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 상기 평가는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성, 예컨대, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 시험 화합물의 결합, 세포 증식, 세포 분화, 및 보호 단백질, 예컨대 글로빈의 상향조절을 측정하거나 검출함으로써 이루어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 여기에 기술된 상기 생체 외 분석은 (예컨대, 미세역가 플레이트 내에서) 고처리 형식으로 수행된다.
5.2.2 세포-기반 분석
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 배양된 세포 내에서 발현될 수 있고, 상기 세포는 그 다음에 천연 리간드 뿐만 아니라 상기 천연 리간드의 작용제들 및 길항제들을 포함하는, 상기 수용체 복합체에 대한 리간드들을 검색하기 위해 사용될 수 있다.
상기 세포-기반 분석에 대한 접근을 요약하면, cDNA 또는 상기 수용체를 암호화하는 유전자는 그의 발현에 필요한 다른 유전적 요소들(예컨대, 전사 프로모터)과 결합되고, 그 결과로 얻어진 발현 벡터는 숙제 세포 내에 삽입된다. EPO 수용체 또는 β 공통 수용체를 암호화하는 벡터가 합성될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 숙주 세포를 목적하는 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염시키 위해 사용될 수 있다. 안정적 형질전환체들의 사용이 바람직하다.
상기 DNA를 발현하고 기능적 수용체를 생산하는 세포들이 선발되고, 하기에서 자세히 기술된 바와 같은, 다양한 가능한 검색 시스템들 중의 하나와 함께 사용된다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 그의 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 세포-기반 방법의 예시는, (a) 시험 화합물을 상기 리간드 및 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-발현 세포와 접촉시키고; (b) 상기 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 측정하며, 이로 인해 (b)에서 측정된 활성의 수준이 상기 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준과 다르면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 그의 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정된다.
조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법의 또 다른 예시는 시험 화합물을 EPO 수용체 또는 β 공통 수용체를 발현하도록 재조합에 의해 조작된 세포와 접촉시키되, 상기 세포는 (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) β 공통 수용체 또는 EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되고, 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 수준을 측정하고, 대조군 세포에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성에 비하여 상기 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하되, 상기 대조군 세포는 상기 시험 화합물과 접촉하는 세포와 동일한 세포 유형이고, (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) β 공통 수용체 또는 EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되지 않으며, 조직 보호 활성에 대해 상기 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함한다.
다르게는, 세포-기반 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용을 하는 화합물들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-발현 세포와 접촉될 수 있고, 결합 친화력, 세포 증식, 또는 리포터 유전자 전사물의 존재에 의해 측정되는 바와 같이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성이 결정될 수 있다. 만약 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성이 다르다면, 예컨대 상기 시험 화합물의 부재 하에서의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성과 비교하여 증가하거나 감소한다면, 그렇다면 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용을 하는 화합물이 동정된다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성이 측정되는, 여기에 상기에서 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 이러한 활성은 세포 증식 또는 세포 분화에 의해 측정된다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성이 측정되는, 여기에 상기에서 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 이렇게 측정된 활성은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 상호작용하기 위한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성이다.
세포-기반 검색 분석은 작용제 및 길항제 리간드들 모두를 검출하는데 유용하다. (천연 리간드를 포함하는) 작용제들 및 길항제들은 생체 외 및 생체 내 적용에 엄청난 가능성을 가지고 있다. 수용체 작용제로 동정된 화합물들은 생체 외 및 생체 내에서 표적 세포들의 증식 및 발달을 촉진하는데 유용하다. 예를 들면, 작용제 화합물들은 정의된 세포 배양 배지의 성분들로서 유용하고, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 대체하기 위해 단독으로 또는 다른 사이토카인들 및 호르몬들과 함께 사용될 수 있다. 작용제들은 배양 시에 (이에 한정되는 것은 아니지만, 신경, 심장, 및 망막 유래 세포들을 포함하는) EPO-반응세포들의 성장 및/또는 발달을 특이적으로 촉진하는데 유용할 수 있다. 길항제들은 리간드-수용체 상호작용의 부위들을 동정하기 위한 연구 시약들로서 유용하다. 생체 내에서, 수용체 작용제들 또는 길항제들은 신경, 심장 및/또는 망막 질환들의 치료에 있어서의 적용을 발견할 수 있다. 다양한 적절한 분석이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 분석은 표적 세포 내에서 생물학적 반응의 검출을 근거로 할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)의 결합은 동물 모델들에서 완전한 세포들 내에서 분석될 수 있다. 표지화된 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)는 시험 화합물을 첨가하거나 첨가하지 않고, 동물에게 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 상기 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)의 하류 효과, 예컨대 조직 보호 또는 세포 증식은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 이들 분석을 위해, 상기 시험 화합물이 첨가되는 숙주 세포들은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및/또는 리간드(예컨대, EPO 또는 카바밀화 EPO)를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있는데, 이는 일시적, 유도적 또는 구성적, 또는 안정적일 수 있다. 본 발명의 검색 방법의 목적들을 위해, 이에 한정되는 것은 아니지만, 조직 배양 세포들, 포유동물 세포들, 및 효모 세포들을 포함하는, 매우 다양한 숙주 세포들이 사용될 수 있다. 뇌 세포들과 같은 포유동물 세포들 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 다른 세포들이 본 발명의 분석을 수행하는데 바람직한 세포 유형일 수 있다.
5.2.2.1 세포
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 상기 세포는 포유동물 세포이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 숙주 세포들은 조직 또는 목적하는 다른 생물학적 시료로부터 분리된 일차 세포들이다. 당업자는 서로 다른 세포 유형들이 화합물들을 검색하거나 동정하기 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 사용된 세포 유형들은 내생적으로 EPO 수용체, β 공통 수용체, EPO 수용체 및 β 공통 수용체 모두를 내생적으로 발현하거나 EPO 수용체 또는 β 공통 수용체를 발현하지 않을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 흥분성 조직으로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 흥분 신경조직으로부터 유래된다.
비-제한적 예시들로서, 응답 또는 흥분성 세포들은 신경, 망막, 근육, 심장, 허파, 간, 콩팥, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부, 또는 자궁내막 세포들 또는 조직일 수 있다. 나아가, 응답성 또는 흥분성 세포들의 비-제한적 예시들은 광수용체 세포들(막대 및 원뿔), 신경절 세포들, 양극성 세포들, 수평적 세포들, 무축삭 세포들, 뮐러 세포들, 심장전도근육 세포들, 심근 세포들, 심박조율기 세포들, 굴심방결절 세포들(sinoatrial node), 굴심방결절 세포들(sinus node), 연접조직 세포들, 방실결절 세포들, 히스속 세포들, 간 세포들, 별 세포들, 쿠퍼 세포들, 혈관간 세포들, 망막상피 세포들, 세뇨관 사이질 세포들, 술잔 세포들, 창자샘 세포들(와, crypts), 창자 내분비 세포들, 사구체 세포들, 군생 세포들, 망상 세포들, 크롬친화 세포들, 혈관주위 세포들, 레이디히 세포들, 버팀 세포들, 정자 세포들, 성숙난포 세포들, 원시난포 세포들, 랑게르한스섬 세포들, α-세포들, β-세포들, γ-세포들, F-세포들, 골조상 세포들, 파골 세포들, 골모 세포들, 자궁내막버팀질 세포들, 자궁내막 세포들, 줄기 세포들 및 내피 세포들을 포함한다.
상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하고 수용체-매개 신호를 전달하는데 사용을 위해 적절한 포유동물 세포들은 기능성 조직 보호 수용체 복합체를 형성하기 위해 사용되는 하나 이상의 수용체 하위 단위들을 발현하는 세포들을 포함한다. 이러한 하위 단위들은 클래스 Ⅰ 사이토카인 수용체들의 하위 단위들을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 발현되는 수용체와 동일한 종으로부터 유래된 세포를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 바람직한 실시양태 내에서, 상기 세포는 그의 증식을 위해 외인성으로 공급된 조혈성장인자에 의존적이다. 특정 실시양태에서, 이러한 유형의 세포주들은 인간 TF-1 세포주(ATCC 번호 CRL-2003) 및 AML-193 세포주(ATCC 번호 CRL-9589)로, 이들은 GM-CSF-의존성 인간 백혈병 세포주들이다. 또 다른 실시양태에서, 적절한 숙주 세포들은 필요한 수용체 하위 단위 또는 목적하는 세포반응을 위해 요구되는 다른 세포 성분을 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 상기 생쥐 세포주 BaF3(Palacios 및 Steinmetz, 1985, Cell 41:727-734; Mathey-Prevot et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135) 또는 새끼 햄스터 콩팥(BHK) 세포주는 필요한 EPO-R 및 βc 수용체를 발현하도록 형질감염될 수 있다. 세포주들이 임의의 종으로부터 수용체 하위 단위들을 발현하도록 조작될 수 있고, 그로 인해 종 특이성으로부터 야기되는 가능한 제한점들을 극복할 수 있기 때문에, 상기 후자의 접근법이 유리하다. 다르게는, 인간 수용체 cDNA의 종 상동단백질(orthologs)은 클로닝되어, BaF3 세포주 내에서 마우스 cDNA와 같이 동일한 종으로부터 유래된 세포주 내에서 사용될 수 있다. GM-CSF와 같은 하나의 조혈성장인자에 의존하는 세포주들은 조직 보호 수용체 복합체 리간드에 의존적이 되도록 그렇게 조작될 수 있다.
유사하게, 상기 분석이 유사한 방식으로 형질전환될 수 있는 다른 세포주들에서 수행될 수 있음은 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 인식될 수 있다. 더욱이, 세포 증식 분석은 EPO 및 βc 수용체 모두를 갖는 것으로 알려진 세포들 내에서 수행될 수 있다. 이러한 세포들은 바람직하게는, 이에 한정되는 것은 아니지만, P-19, PC-12, 및 별아교세포를 포함하는 신경 세포주 또는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 망막 및 심장세포들을 포함하는 EPO-반응성인 것으로 알려진 다른 세포주들을 포함할 것이다. 이러한 세포주들에서 EPO 및 βc 수용체들 모두의 존재는 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자에게 잘 알려진 면역침강 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 재조합에 의해 생산하기 위해 사용될 수 있거나 본 발명의 검색 방법에 사용될 수 있는 다른 숙주 세포들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마, pre-B 세포들, 293 세포들, 293T 세포들, HeLa 세포들, HepG2 세포들, K562 세포들, 3T3 세포들을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주 세포들은 공급원, 예컨대 조직으로부터 유래된 무한증식 세포주들이다. 본 발명에 사용될 수 있는 여전히 다른 숙주 세포들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 효모 세포들, 바이러스-감염 세포들, 세균 세포들, 곤충 세포들, 또는 식물 세포들을 포함한다.
바람직한 포유동물 숙주 세포들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 인간, 원숭이 및 설치류로부터 유래된 것들(예를 들면, Kriegler M. in "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", New York, Freeman & Co. 1990 참조), 예컨대 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 콩팥 세포주(COS-7, ATCC Accession No. CRL 1651); 인간 배아 콩팥 세포주들(현탁배양에서 성장하는 동안 서브클로닝된 293, 293-EBNA, 또는 293 세포들, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); 새끼 햄스터 콩팥 세포들(BHK, ATCC 등재번호 CCL 10); 중국 햄스터 난소-세포들-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77; 4216); 마우스 버팀세포들(Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251); 마우스 섬유아세포들(NIH-3T3), 원숭이 콩팥 세포들(CVI ATCC 등재번호 CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 콩팥 세포들(VERO-76, ATCC 등재번호 CRL-1587); 인간 자궁암 세포들(HELA, ATCC 등재번호 CCL 2); 개 콩팥 세포들(MDCK, ATCC 등재번호 CCL 34); 물소 래트 간 세포들(BRL 3A, ATCC 등재번호 CRL 1442); 인간 허파 세포들(W138, ATCC 등재번호 CCL 75); 인간 간 세포들(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 종양 세포들(MMT 060562, ATCC 등재번호 CCL51)을 포함한다. 적당히 배양된 포유동물 세포들은 COS-1(ATCC No. CRL 1650), BHK(ATCC No. CRL 1632), 및 BHK 570(ATCC No. CRL 10314), 293(ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 세포주들을 포함한다. 추가로 적당한 세포주들은 당해 분야에 알려져 있고 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, Va)과 같은 공공 기탁기관들로부터 이용 가능하다.
다른 유용한 진핵 숙주-벡터 시스템은 효모 및 곤충 시스템들을 포함할 수 있다. 효모에서, 구성적 또는 유도성 프로모터들을 포함하는 수많은 벡터들이 사카로마이세스 세레비지에(베이커 효모), 쉬조사카로마이세스 팜비(분열 효모), 피치아 파스토리스, 및 한세눌라 폴리모르파(조건적 메틸 영양체 효모)와 함께 사용될 수 있다. 검토를 위해, 분자생물학에 있어서의 최신 프로토콜들, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, 효모를 위한 발현 및 분비 벡터들, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. Ⅱ, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter, 1987, 효모에서의 이종 유전자 발현, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; 및 효모 사카로마이세스의 분자생물학, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. Ⅰ 및 Ⅱ를 참조하라.
효모 세포들, 및 특히 사카로마이세스 종의 세포들을 포함하는 진균 세포들은 또한 예컨대 수용체 폴리펩타이드들, 수용체 단편들, 폴리펩타이드 융합체들, 또는 복합체들을 생산하기 위해, 및 조직 보호 사이토카인 활성을 조절하는 화합물들을 동정하기 위한 세포-기반 분석을 위해, 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 외인성 DNA를 이용하여 효모 세포들을 형질전환시키고 그로부터 재조합 폴리펩타이드들을 생산하기 위한 방법은 예를 들면, 가와사키, 미국 특허 제4,599,311호; 가와사키 등, 미국 특허 제4,931,373호; 브레이크, 미국 특허 제4,870,008호; 웰치 등, 미국 특허 제5,037,743호; 및 머레이 등, 미국 특허 제4,845,075호에 기재되어 있다. 형질전환된 세포들은 선택 마커, 통상적으로 약물 저항성 또는 특정 영양소(예컨대, 류신)의 부재 하에서 성장할 수 있는 능력에 의해 결정되는 표현형질에 의해 선발된다. 효모에서의 사용을 위해 바람직한 벡터 시스템은 가와사키 등에 의해 기술된 POT1 벡터 시스템(가와사키 등, 미국 특허 제4,931,373호)으로, 이는 형질전환 세포들이 글루코스-함유 배지에서의 성장에 의해 선발되는 것을 허용한다. 효모에서의 사용을 위해 적당한 프로모터들 및 종결자들은 해당효소 유전자들(예컨대, 가와사키, 미국 특허 제4,599,311호; 킹스만 등, 미국 특허 제4,615,974호; 및 비터, 미국 특허 제4,977,092호 참조) 및 알코올 탈수소효소 유전자들로부터 유래된 것들을 포함한다. 또한, 미국 특허 제4,990,446호; 제5,063,154호; 제5,139,936호 및 제4,661,454호를 참조하라. 한세눌라 폴리모르파, 쉬조사카로마이세스 팜비, 글루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스, 우스틸라고 마이디스, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 피치아 길레르몬디 및 칸디다 말토사를 포함하는 다른 효모들을 위한 형질전환 시스템들 역시 본 발명에서의 사용을 위해 이용 가능하다(예를 들면, Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 및 Cregg, 미국 특허 제4,882,279호를 참조하라). 아스페르질러스 세포들은 멕나이트 등의 방법(미국 특허 제4,935,349호)에 따라 사용될 수 있다. 아크레모니움 크리소제눔을 형질전환하기 위한 방법은 수미노 등에 의해 기술되었다(미국 특허 제5,162,228호). 뉴로스포라를 형질전환하기 위한 방법은 람보위츠에 의해 기술되었다(미국 특허 제4,486,533호).
목적하는 핵산 서열을 숙주 세포들 내로 도입하는 표준 방법이 사용될 수 있다. 형질전환은 숙제 세포 내로 폴리뉴클레오타이드들을 도입하기 위한, 예를 들면 바이러스 내에 상기 폴리뉴클레오타이드를 패키징하고 숙주 세포에 상기 바이러스를 형질도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 직접 섭취에 의해 이루어질 수 있다. 사용된 상기 형질전환 과정은 형질전환되는 숙주에 의존한다. 직접 섭취에 의한 포유동물 세포 형질전환들(즉, 형질감염들)은 인산칼슘 침전 방법(Graham & Van der Eb, 1978, Virol. 52:546) 또는 그의 다양한 공지된 변형들을 이용하여 수행될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드들을 세포들, 특히 포유동물 세포들 내로 도입하기 위한 다른 방법로는 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 상기 폴리뉴클레오타이드(들)의 리포솜들 내로의 피막화, 및 상기 폴리뉴클레오타이드들의 핵 내로의 직접 주입을 포함한다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
적당한 숙주 세포들은 배양시 외인성 DNA로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 그러한 세포 유형들로서, 진균 세포들, 및 배양된 고등 진핵 세포들을 포함한다. 진핵 세포들, 특히 다세포 생물들의 배양된 세포들이 바람직하다. 클로닝된 DNA 분자들을 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포들 내로 도입시키기 위한 기법들은 샘브룩 등 및 아우슈벨 등에 의해 기술되어 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).
형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포들은 영양소들 및 상기 선발된 숙주 세포들의 성장에 요구되는 다른 성분들을 포함하는 배양 배지에서 통상적인 과정들에 따라 배양된다. 한정 배지 및 복합 배지를 포함하는, 다양한 적당한 배지들이 당해 분야에 알려져 있으며, 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산들, 비타민류 및 무기염류를 포함한다. 배지는 또한 성장인자들 또는 혈청과 같은 성분들을 필요에 따라서 포함할 수 있다.
배양된 포유동물 세포들은 본 발명 내에서 바람직한 숙주들이다. 외인성 DNA를 포유동물 숙주 세포들에 도입하는 방법은 인산칼슘-매개 형질감염(Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603: Graham and Van der Eb, 1973, Virology 52:456), 전기천공(Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845,), DEAE-텍스트란 매개 형질감염(Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), 및 리포솜-매개 형질감염(Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73; Ciccarone et al., 1993, Focus 15:80)을 포함한다. 본 발명의 수용체 복합체의 성분들인 폴리펩타이드들을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드들의 배양된 포유동물 세포들에서의 생산은, 예를 들면 레벤손 등, 미국 특허 제4,713,339호; 하겐 등, 미국 특허 제4,784,950호; 팔미터 등, 미국 특허 제4,579,821호; 및 링골드, 미국 특허 제4,656,134호에 의해 기술되었다. 일반적으로, SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 프로모터들과 같은 강한 전사 프로모터들이 바람직하다(예컨대, 미국 특허 제4,956,288호 참조). 다른 적당한 프로모터들로는 금속티오네인 유전자들(미국 특허 제4,579,821호 및 제4,601,978호)로부터 유래된 프로모터들 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터를 포함한다. 성장 배지는 일반적으로 외인성으로 첨가된 DNA를 포함하는 세포들을 예를 들면, 상기 발현 벡터 상에서 수행된 선택 마커에 의해 보충되거나 상기 숙주 세포 내로 동시-형질감염된 약물 선택 또는 필수 영양소에 있어서의 결핍에 의해 선발될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 목적하는 컨스트럭트들을 포함하는 안정적 세포주들이 고처리 검색을 위해 제조된다. 이러한 안정적 세포주들은 선택 마커를 포함하는 컨스트럭트를 도입하고, 상기 세포들을 영양강화 배지에서 1-2일간 성장하는 것을 허용한 후, 상기 세포들을 선택 배지 상에서 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 플라스미드 내에서 상기 선택 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포들이 상기 플라스미드를 자신의 염색체 내로 안정적으로 통합시키고 차례로 클로닝되고 세포주 내로 확장될 수 있는 병소들을 형성하도록 성장하는 것을 허용한다.
약물 선택은 외래 DNA가 삽입되어진 배양된 포유동물 세포들을 선택하기 위해 일반적으로 사용된다. 이러한 세포들은 보통 "형질감염체들"로서 언급된다. 선택 제제의 존재 하에 배양되고 목적하는 유전자를 그들의 자손에게 전달할 수 있는 세포들은 "안정적 형질감염체들"이라고 언급된다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전이효소(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실전이효소(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자들을 포함하는 수많은 선택 시스템들이 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포들에서 사용될 수 있다. 또한, 항-대사산물 저항성이 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147) 유전자들에 대한 선택의 근거으로서 사용될 수 있다. 바람직한 선택 마커는 항생제 네오마이신에 대한 저항성을 암호화하는 유전자이다. 선택은 G-418 따위와 같은 네오마이신-유형 약물의 존재 하에 수행될 수 있다. 선택 시스템들은 또한 "증폭"으로서 언급되는 과정인, 목적하는 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 증폭은 저농도의 선택 제제의 존재 하에 형질감염체들을 배양한 후에 상기 도입된 유전자들의 산물들을 고농도로 생산하는 세포들을 선발하기 위해 선택 제제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 바람직한 증폭 가능한 선택 마커는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 다이하이드로폴레이트 리덕타제이다. 다른 약물 저항성 유전자들(예컨대, 다약제 내성, 퓨로마이신 아세틸전이효소) 또한 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, βc 수용체를 가지고 있는 BaF3, 인터류킨-3 의존성 pre-B 세포주는 재조합 EPO-R로 형질감염될 수 있다. 상기 EPO-R의 존재는 그 다음에 (2 ㎎/㎖의) 제오신 및 (2 ㎍/㎖의) 퓨로마이신과 같은 화합물들에 대한 저항성에 의해 선별될 수 있다.
5.2.2.2 BaF3 세포 분석
BaF3 세포 분석은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물들을 동정하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 상기 수용체 복합체를 통한 신호전달에 의한 BaF3 세포들의 증식을 검사하기 위한 분석은 하기와 같이 수행될 수 있다. 96-웰 플레이트에서, 성장 배지 단독의 8회에 걸친 1:2 연속 희석액들(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 1 mM 소듐 파이루베이트, 2 mM L-글루타민), 및 목적하는 작은 분자, 생물학적 또는 화학적 화합물들. 각 희석액의 최종 부피는 약 100 ㎕로 하였다.
EPO-R로 형질감염된 BaF3 부모 세포주 및 BaF3 세포들은 그 후에 성장 배지로 3회 세척하고(상기 참조), 침전물들을 성장 배지에 재현탁하고, 세포들의 수를 세고 성장 배지로 5,000 세포/100 ㎕로 희석하였다. 그 다음, 100 ㎕의 희석된 세포들은 시료들의 각 희석액에 첨가될 수 있다. 상기 분석 플레이트는 그 후에 37℃ 배양기에서 3 내지 4일간 배양될 수 있다. 알로마 블루(Alomar blue)의 20 ㎕ 분액이 각 웰에 첨가될 수 있고, 상기 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 플레이트들은 형광 플레이트 판독기 상에서 544의 여기파장 및 590의 방출파장에서 판독된다.
만약 상기 화합물이 조직 보호 활성을 나타낸다면, 상기 BaF3 세포들은 목적하는 작은 분자, 생물학적 또는 화학적 화합물에 노출되었을 때 증식할 것이다.
상기 조직 보호 수용체 복합체에 대한 천연 리간드 역시 상기 수용체 복합체를 발현하는 세포주를 돌연변이시키고 이를 자가분비 성장을 위해 선택된 조건들 하에서 배양함으로써 동정될 수 있다. (WIPO 공개 WO 95/21930 참조). 전형적인 과정 내에서, 조직 보호 수용체 복합체 및 필요한 부가적인 하위 단위들을 발현하는 BaF3 세포들은 예컨대 2-에틸메탄설포네이트(EMS)의 처리에 의해 돌연변이화된다. 그 후에 상기 세포들은 IL-3의 존재하에 복구되도록 허용되고, 이어서 IL3- 및 IL-4가 결여된 배양 배지로 옮겨진다. 생존하는 세포들은 예컨대 상기 배양 배지에 수용성 수용체를 첨가하거나 야생형 BaF3 세포들 또는 상기 수용체를 발현하는 BaF3 세포들에 대한 적응용 배지를 분석함으로써 조직 보호 수용체 복합체 리간드의 생산에 대해 선발된다.
5.2.2.3 수용체 유전자 분석
본 발명의 특정 실시양태에서, 리포터 유전자를 발현하도록 추가로 조작되는 세포들이 조직 보호 활성을 갖는 화합물들을 동정하기 위한 분석에 사용된다. 상기 리포터 유전자는 수용체-연관 경로에 대해 반응적인 프로모터 요소들에 연결되고, 상기 분석은 상기 리포터 유전자의 전사 활성을 검출한다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 순응하는 리포터 유전자 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성 조절에 대해서 화합물을 검사하는 것을 포함하되, 상기 활성화된 복합체는 숙주 세포 내에서 전사인자의 생산 결과를 나타낸다. 상기 숙주 세포는 또한 그의 발현이 전사 활성인자에 의해 조절되고, 그로 인해 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 활성화시키는 화합물의 존재에 대한 반응으로 세포 내에서 루시퍼라제 유전자 산물이 작동되거나 작동되지 않는(즉, 존재 또는 부재, 또는 서로 다른 양으로 존재), 루시퍼라제 리포터 유전자에 작동적으로 연결된 SRE 프로모터 요소를 포함한다.
또한 본 발명은 시험 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-발현 세포와 접촉시키되, 상기 세포가 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성과 관련된 조절 요소에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 것이고, 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 리포터 유전자 발현 수준에 비하여 리포터 유전자 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하고, 동정된 시험 화합물의 조직 보호 활성을 분석하는 것을 포함하는, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 조절 요소는 혈청 응답 요소이다. 또한, 본 발명은, 시험 화합물을 (ⅰ) 전사 활성인자의 DNA 결합 도메인에 특이적인 결합 부위에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 포함하는 핵산 서열, (ⅱ) (A) 상기 전사 활성인자의 DNA 결합 도메인, 및 (B) 제 1 조직 보호 사이토카인 수용체 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 포함하는 제 1 융합 단백질, 및 (ⅲ) (A) 상기 전사 활성인자의 활성 도메인 및 (B) 제 2 조직 보호 사이토카인 수용체를 포함하는 제 2 융합 단백질을 포함하는 세포와 접촉시키고, 리포터 유전자 발현을 검출하는 것을 포함하며, 이로 인해 시험 화합물의 존재 하에 검출된 리포터 유전자의 발현이 시험 화합물의 부재 하에서 검출된 리포터 유전자의 발현과 비교하여 다르다면, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물이 동정되는, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 추가로 제공한다.
당업자에게 잘 알려진 모든 리포터 유전자가 조직 보호 사이토카인 매개 과정들 또는 보호 글로불린들의 상향조절에 대한 화합물의 효과를 확인하기 위해 리포터 유전자 컨스트럭트들에 사용될 수 있다. 이러한 양태에서 바람직한 프로모터 요소는 혈청 응답 요소 또는 SRE(예컨대, Shaw et al., 1989, Cell 56:563-572 참조)이다. 이러한 리포터 유전자의 바람직한 형태는 루시퍼라제 유전자(예컨대, 초파리 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 및 방아벌레무리 루시퍼라제)(de Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:725)이다. 상기 루시퍼라제 유전자의 발현은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 발광에 의해 검출된다(예컨대, Baumgartner et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:29094-29101; Schenborn 및 Goiffin, 1993, Promega Notes 41:11). 루시퍼라제 활성 분석 키트들은, 예를 들면 프로메가사(Promega Corp., Madison, Wis)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 유형의 표적 세포주들은 화학물질들의 라이브러리, 세포-적응용 배양 배지, 진균 액체배지, 토양 시료들, 물 시료들, 및 기타 같은 종류의 것들을 검색하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포-적응용 배지 시료들의 은행이 리간드를 생산하는 세포들을 동정하기 위해 표적 세포에 대해 분석될 수 있다. 그 다음, 양성 세포들은 포유동물 발현 벡터 내에서 cDNA 라이브러리를 생산하기 위해 사용되는데, 이 발현 벡터는 풀들(pools)로 세분화되고, 숙주 세포들 내로 형질감염되고, 발현된다. 그 후에, 형질감염된 세포들로부터 얻은 배지 시료들은 상기 리간드를 암호화하는 cDNA 클론을 분리하기 위해 풀들의 연속적인 분할, 재-형질감염, 계대배양, 및 양성 세포들의 재-분석을 이용하여 분석된다.
리포터 유전자들의 예시들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 형광 단백질(예컨대, 녹색 형광 단백질("GFP"), 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 및 파란색 형광 단백질), 베타-칼락토사이드("베타-갈"), 베타-글루큐로니다제, 베타-락타메이즈, 클로람페니콜 아세틸전이효소("CAT"), 분비된 알칼라인 포스파타제("SEAP"), 홍당무 과산화효소("HRP") 및 알칼라인 포스파타제("AP")를 포함한다. 다르게는, 리포터 유전자는 또한 넌센스 억압이 펩타이드를 생산하고 단백질 표지를 검출하기 위해 상기 단백질이 ELISA, 웨스턴 블럿팅, 또는 다른 임의의 면역분석에 의해 관찰될 수 있도록 단백질 표지, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만 myc, His, FLAG, 또는 GST일 수 있다.
본 발명의 검색 방법은 또한 다른 리포터 유전자들의 용도를 포함한다. 리포터 유전자들은 획득될 것이고, 상기 요소들의 뉴클레오타이드 서열은 당업자에게 잘 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 리포터 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 예컨대, 문헌 또는 GenBank와 같은 데이터베이스로부터 획득될 수 있다. 다르게는, 리포터 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 적당한 제공원으로부터 얻은 핵산으로부터 제조될 수 있다. 만약 특정 리포터 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 클론이 이용 가능하진 않지만, 상기 리포터 유전자의 서열이 공지되어 있다면, 상기 리포터 유전자를 암호화하는 핵산은 화학적으로 합성되거나 적당한 제공원(예컨대, a cDNA 라이브러리, 또는 상기 리포터 유전자를 발현하는 모든 조직 또는 세포들로부터 제조된 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA)으로부터 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있다. 일단 리포터 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 결정되면, 상기 리포터 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열들의 조작을 위해 당해 분야에 잘 알려진 방법, 예컨대 재조합 DNA 기법들, 부위 지적 돌연변이화, PCR 등등(예를 들어, 샘브룩 등(Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), 및 NY 및 아우슈벨 등(NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)에 기재된 기법들로, 이들 모두는 완전히 본 명세서에 참고문헌으로 도입된다)을 사용하여, 서로 다른 아미노산 서열을 갖는 리포터 유전자들을 제조하기 위해, 예를 들면 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는 삽입들을 만들어내기 위해 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기에서 기술된 리포터 유전자 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 부재 하에서 수행될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 동정된 시험 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용을 하는 화합물이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기에서 기술된 리포터 유전자 분석은 EPO와 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 존재 하에 수행될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 시상기 험 화합물의 존재 및 부재 하에서 리포터 유전자의 전사 수준에 있어서의 차이가 검출될 수 있다. 그 다음, 전사물의 수준은 EPO 부재 하에서의 전사물의 수준과 비교될 수 있다. 상기 화합물이 있고 없는 경우에 측정된 전사물의 수준에 있어서의 차이가 EPO의 존재에 의존적이라면, 그렇다면 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 EPO와의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정된다. 예를 들어, 만약 검출된 전사물 수준에 있어서의 차이가 화합물의 존재 하에 증가하고, 상기 증가가 EPO의 존재에 의존적이라면, 그렇다면 EPO 및 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 사이의 상호작용의 작용제가 동정된다.
5.2.2.4 효모-이중 잡종 분석
"이중-잡종" 시스템은 효모 사카로마이세스 세레비지에 내에서 단백질-단백질 상호작용들을 검출하는데 사용될 수 있다(Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; U.S. Patent No. 5,283,173 by Fields and Song). 상기 상호작용들은 효모 내에 대해서 검색되기 때문에, 이 시스템에서 검출된 분자간 단백질 상호작용들은 포유동물 세포들에서의 조건들을 모방하는 생리적 조건들 하에서 야기된다(Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578 9581). 분석은 전사 활성인자의 2개의 기능적 단위들, DMA-결합 도매인 및 활성 도메인에 융합되어진 2개의 단백질 도메인들의 상호작용을 통해 GAL4(Johnston, 1987, Microbiol. Rev. 51:458-476)와 같은 전사 활성인자의 재구성을 이용한다. 이는 GAL4와 같은 특정 전사 인자들의 이분(양분) 성질에 기인된 것일 수 있다. 이분으로 특정되는 것은 DNA-결합 및 활성화 기능들이 독립적인 도메인들에 존재하고 교차로 작용할 수 있다는 것을 의미한다(Keegan et al., 1986, Science 231:699-704). 상기 전사 활성인자의 재구성은 전사 활성인자의 DNA-결합 도메인에 대한 결합부위(상류 활성화 서열 또는 UAS)를 포함하는 프로모터의 조절 하에 있는 lacZ 유전자와 같은 리포터 유전자의 활성화에 의해 관찰된다. 이 방법은 2개의 공지된 단백질 사이의 상호작용을 검출하거나(Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246) 공지된 단백질에 결합하게 되는 집단으로부터 상호작용 단백질을 동정하기 위해(Durfee et al., 1993, Genes Dev. 7:555-569; Gyuris et al., 1993, Cell 75:791-803; Harper et al., 1993, Cell 75:805-816; Vojtek et al., 1993, Cell 74:205-214) 가장 일반적으로 사용되고 있다. 효모 이중-잡종 시스템들에 대해 여기에 기술된 방법 및 효모 이중-잡종 시스템들을 위한 다른 방법에 대한 변화들은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고 본 발명의 검색 방법에 사용될 수 있다.
향상된 효모 이중-잡종 시스템에 의한 상호작용 단백질의 동정은 리포터 유전자의 전사가 전사 조절인자의 반쪽에 각각 융합된, 2개의 단백질의 상호작용에 의한 전사 조절인자의 재구성에 의존적인, 리포터 유전자의 발현의 검출에 근거한다. "미끼"(즉, 본 발명의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 유도체들 또는 유사체들) 및 "먹이"(상기 미끼와 상호작용하는 능력에 대해 조사되는 단백질) 단백질은 각각 또는 그 반대로, DNA 결합 도메인, 및 전사 조절 도메인에 대한 융합 단백질로서 발현된다.
구체적 실시양태에서, 무작위 펩타이드들을 발현하는 재조합 생물학적 라이브러리들이 먹이 핵산들의 제공원으로 사용될 수 있다.
일반적으로, 상기 미끼 및 먹이 집단들의 단백질은 미리-선택된 서열에 인접한 각각의 단백질을 포함하는(바람직하게는 키메라 코딩 서열의 재조합 발현에 의한) 융합 (키메라) 단백질로서 제공된다. 하나의 집단을 위해, 상기 미리-선택된 서열은 DNA 결합 도메인이다. 상기 DNA 결합 도메인은 그것이 프로모터 내 DNA 서열을 특이적으로 인식하는 한 임의의 DNA 결합 도메인일 수 있다. 예를 들면, 상기 DNA 결합 도메인은 전사 활성인자 또는 억제인자이다. 다른 집단을 위해, 미리-선택된 서열은 각각 전사 활성인자 또는 억제인자의 활성인자 또는 억제인자 도메인이다. 상기 조절 도메인 단독(단백질 서열에 대한 융합 단백질로서가 아닌) 및 DNA 결합 도메인 단독(단백질 서열에 대한 융합 단백질로서가 아닌)은 바람직하게는 검출 가능하게 상호작용을 하지 않는다(상기 분석에서 위양성들을 피하기 위해). 상기 분석 시스템은 전사 활성인자(또는 억제인자)의 DNA 결합 도메인의 결합 부위를 포함하는 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 본 방법에서, 먹이 융합 단백질에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 융합 단백질의 결합은 상기 리포터 유전자의 발현을 활성화시키는(또는 억제하는) 전사 활성인자(또는 억제인자)의 재구성을 초래한다. 상기 리포터 유전자 전사의 활성(또는 억제)는 세포 내, 예컨대 원핵 또는 진핵 세포들 내에서, 바람직하게는 세포 배양액 내에서 야기한다.
상기 리포터 유전자 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 상기 뉴클레오타이드 서열의 천연형 또는 비-천연형 프로모터일 수 있고, 융합 단백질의 DNA 결합 도메인 부분에 의해 인식되는 상기 DNA 결합 부위(들)는 상기 프로모터에 대해 천연형(만약, 상기 프로모터가 보통 이러한 결합 부위(들)를 포함한다면) 또는 상기 프로모터에 대해 비-천연형일 수 있다. 다르게는, 목적하는 유전자(들)의 전사 활성 결합 부위는 결실되고 GAL4 결합 부위들로 대체될 수 있다(Bartel et al., 1993, BioTechniques 14:920 924, Chasman et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:4746 4749).
상기 분석에 사용되는 활성 도메인 및 DNA 결합 도메인은 이들 전사 활성인제들이 분리 가능한 결합 및 전사 활성 도메인들을 가지고 있는 한, 매우 다양한 전사 활성인자 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, S. 세레비지에의 GAL4 단백질(Ma et al., 1987, Cell 48:847 853), S. 세레비지에의 GCN4 단백질(Hope & Struhl, 1986, Cell 46:885 894), S. 세레비지에의 ARD1 단백질(Thukral et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2360 2369), 및 인간 에스트로겐 수용체(Kumar et al., 1987, Cell 51:941 951)가 분리 가능한 DNA 결합 및 활성 도메인들을 가지고 있다. 융합 단백질에 사용되는 DNA 결합 도메인 및 활성 도메인은 동일한 전사 활성인자로부터 유래될 필요는 없다. 구체적 실시양태에서, GAL4 또는 LEXA DNA 결합 도메인이 사용된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, GAL4 또는 허피스 심플렉스 바이러스 VP16(Triezenberg et al., 1988, Genes Dev. 2:730 742) 활성 도메인이 사용된다. 구체적 실시양태에서, GAL4의 1 내지 147 아미노산들(Ma et al., 1987, Cell 48:847 853; Ptashne et al., 1990, Nature 346:329 331)이 상기 DNA 결합 도메인이고, VP16의 411 내지 455 아미노산들(Triezenberg et al., 1988, Genes Dev. 2:730 742; Cress et al., 1991, Science 251:87 90)은 상기 활성 도메인을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 서로 다른 융합 단백질 집단들을 암호화하는 플라스미드들은 단백질-단백질 상호작용들에 대한 상기 분석을 수행하기 위해 동시-형질감염에 의해 하나 이상의 리포터 유전자들을 포함하는 단일 숙주 세포(예컨대, 반수체 효모 세포) 내로 동시에 도입될 수 있다. 또는, 바람직하게는, 2개의 융합 단백질 집단들이(예컨대, 효모 세포들을 위한) 교배 또는 (예컨대, 포유동물 세포들을 위한) 세포 융합들에 의해 단일 세포 내로 도입된다. 교배 유형 분석에서, 결합 도메인 융합 발현 컨스트럭트(바람직하게는 플라스미드) 및 활성(또는 억제) 도메인 융합 발현 컨스트럭트(바람직하게는 플라스미드) 각각으로 형질전환된 반대 교배 유형의 반수체 효모 세포들의 접합은 동일한 이배체 세포 내로 상기 두 컨스트럭트틀을 운반할 것이다. 효모 균주의 교배 유형은 HO 유전자를 이용한 형질전환에 의해 조작될 수 있다(Herskowitz and Jensen, 1991, Meth. Enzymol. 194:132 14).
바람직한 실시양태에서, 효모 상호작용 교배 분석은 2개의 서로 다른 유형의 숙주 세포들, 효모 사카로마이세스 세레비지에의 균주-유형 a 및 알파를 사용하여 이용된다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는, 각각이 (예컨대, 전사 활성인자의) DNA 결합 도메인에 대한 하나의 이상의 결합 부위들을 갖는, 적어도 2개의 리포터 유전자들을 포함한다. 상기 활성인자 도메인 및 DNA 결합 도메인은 단백질의 2개의 개별적 집단들로부터 형성된 키메라 단백질의 각 부분들이다. 숙주 세포들의 한 균주, 예를 들면 a 균주는 뉴클레오타이드 서열들의 라이브러리와 GAL4와 같은 전사 활성인자의 DNA 결합 도메인과의 융합들을 포함한다. 이러한 숙주 세포들의 셋트에서 발현된 상기 잡종 단백질은 상기 리포터 유전자 컨스트럭트 내 프로모터 또는 인핸서 지역 내 DNA-결합 부위를 인식할 수 있다. 효모 숙주 세포들의 두 번째 셋트, 예를 들면 알파 균주는 전사 활성인자의 활성 도메인에 융합된 DNA 서열들의 라이브러리의 융합체들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열들을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은, (a) 제 1 교배 유형인 효모 세포들의 제 1 집단 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 단편 및 DNA 결합 도메인을 포함하는 제 1 융합 단백질을 재조합적으로 발현하는 단계로, 이때 상기 효모 세포들의 제 1 집단이 상기 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 하나의 이상의 DNA 결합 부위들에 의해 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된 제 1 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이로 인해 전사 활성 도메인을 포함하는 제 2 융합 단백질과 상기 제 1 융합 단백질의 상호작용이 상기 제 1 뉴클레오타이드 서열의 증가된 전사 결과를 나타내고; (b) 상기 제 1 뉴클레오타이드 서열의 증가된 전사가 상기 제 2 융합 단백질의 부재 하에서 야기되는 상기 제 1 집단 내 그러한 효모 세포들을 제거하기 위해 음성적으로 선발하는 단계; (c) 각각의 제 2 융합 단백질이 단백질의 단편, 유도체 또는 유사체 및 전사 활성인자의 활성 도메인을 포함하며, 그의 활성 도메인이 상기 각각의 제 2 융합 단백질 내에서 동일한, 복수개의 상기 제 2 융합 단백질을 상기 제 1 교배 유형과는 다른 제 2 교배 유형의 효모 세포들의 제 2 집단 내에서 재조합적으로 발현시키는 단계; (d) 이배체 효모 세포들의 제 3 집단을 형성하기 위해 상기 효모 세포들의 제 1 집단을 상기 효모 세포들의 제 2 집단과 교배시키는 단계로, 상기 이배체 효모 세포들의 제 3 집단은 상기 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 DNA 결합 부위에 의해 유도된 프로모터에 작동적으로 연결된 제 2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 그렇게 해서 상기 제 1 융합 단백질과 제 2 융합 단백질의 상호작용이 상기 제 2 뉴클레오타이드 서열의 증가된 전사 결과를 나타내고; (e) 상기 제 1 및/또는 제 2 뉴클레오타이드 서열의 상기 증가된 전사를 검출하고 그로 인해 상기 제 1 융합 단백질과 제 2 융합 단백질 사이의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는, 하나의 이상의 단백질-단백질 상호작용들을 검출하는 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (ⅰ) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-응답 프로모터에 작동적으로 연결되고 (ⅱ) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 효모 균주의 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 리포터 유전자 발현 수준을 측정함으로써 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성 수준을 결정하는 것을 포함하며, 이로 인해 화합물의 존재 하에서의 리포터 유전자 활성의 수준이 상기 화합물의 부재 하에서의 리포터 유전자 활성의 수준에 비하여 증가하거나 감소하면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물이 동정된다.
상기 수용체 복합체들은 또한 결합 상호작용의 억제인자들을 동정하기 위해 공지된 단백질에 결합하는 단백질을 동정하기 위한 상호작용 트랩 분석(예를 들면, Gyuris et al., 1993, Cell 75:791-803에 기술된 바와 같은)에 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 제 1 뉴클레오타이드 서열로 LEU2 리포터 유전자를 사용하고 제 2 뉴클레오타이드 서열로 lacZ 리포터 유전자를 사용하여 전사 활성인자 시스템의 재구성 결과를 나타내는 단백질-단백질 상호작용들이 류우신 결핍 및 β-갈락토시다제의 발현에 대해 세포 내에서 선택될 수 있도록, 상기에서 기술된 바와 같은 변형된 이중-잡종 시스템이다. 상기 DNA-결합 도메인은 LexA DNA-결합 도메인인 반면, 상기 활성인자 서열은 B42 전사 활성인자 도메인(Ma and Ptashne, 1987, Cell 51:113-119)으로부터 얻어질 수 있다. 상기 리포터 유전자들의 프로모터들은 LexA 결합 서열들을 포함하고 기능적 전사 활성인자의 재구성에 의해 활성화된다. 이 시스템의 또 다른 특징은 DNA-결합 도메인 융합 단백질을 암호화하는 유전자가 GAL 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 영향 하에 있어서 확인 시험들이 유도성 및 비-유도성 조건들 하에서 수행될 수 있다는 것이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 EPO와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 상호작용을 조절하는 화합물을 검출하는 방법을 제공한다. 제 1 융합 단백질을 포함하는 효모 세포들의 제 1 집단은 EPO 수용체와 같은 제 1 조직 보호 사이토카인 수용체의 서열 및 LexA DNA-결합 도메인을 포함한다. 효모 세포들의 제 2 집단은 β 공통과 같은 제 1 조직 보호 사이토카인 수용체의 서열에 융합된 B42 전사 활성 도메인을 포함하는 제 2 융합 단백질을 포함한다. 상기 LEU2 리포터 유전자 및 lacZ 리포터 유전자는 LexA 결합 서열들을 포함하는 프로모터들에 작동적으로 연결되어 있으며, 이로 인해 상기 제 1 융합 단백질과 제 2 융합 단백질의 상호작용은 상기 리포터 유전자들의 증가된 전사 결과를 나타낸다. 상기 융합 단백질을 포함하는 세포들의 집단들은 선별하기 위해 류신이 결핍된 배지에서 생육된다. 상기 배지는 EPO를 포함하고, 상기 분석은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 수행된다. 전사 수준이 시험 화합물의 존재 하에 달라지면, 그렇다면 EPO와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 사이의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정된다.
이중-잡종 접근의 또 다른 방식들이 존재하는데, 예를 들면 "부수적 복제 분석"(Nallur et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:3867-3873; Vasavada et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10686-10690)이 보고되었다. 이 경우에, 2개의 융합 단백질 사이의 상호작용에 기인한 포유동물 세포들에서 전사인자의 재구성은 SV40 T 항원의 전사 활성을 초래한다. 이 항원은 활성 도메인 융합 플라스미드들의 복제를 허용한다. 포유동물 세포들을 이용하는 이중-잡종 접근의 또 다른 변형은 전사 활성인자의 재구성을 또한 사용하는 "핵질 상호작용 선택 전략"이다(Fearon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7958-7962). 이 경우에 사용되는 리포터 유전자들은 세균성 클로람페니콜 아세틸전이효소를 암호화하는 유전자, 세포-표면 항원 CD4에 대한 유전자, 및 하이그로마이신 B에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 포함하고 있다. 상기 포유동물 시스템들 모두에서, 재구성되는 전사인자는 그의 DNA-결합 도메인은 GAL4 유래이고 활성 도메인은 VP16 유래인 잡종 전사 활성인자이다. 전사 활성화 시스템이 집단 내에서 가능한 단백질-단백질 상호작용들을 분리하고 분류하기 위해 기술되어 왔으며, 두 집단들 사이의 이러한 상호작용들의 비교를 허용한다(1997년 12월 18일자로 공개된 PCT 공개 WO 97/47763 참조).
5.2.3 리간드/조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 분석
여기에 기술된 무세포 및 세포-기반 검색 방법에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 리간드들은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 그의 리간드들의 상호작용을 조절하는 화합물들을 동정하기 위한 분석에 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은, 결합을 유도하는 조건들 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 (ⅰ) 제 1 표지에 부착된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 및 (ⅱ) 제 2 표지에 부착된 동량의 시험 화합물과 접촉시키고, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체로부터 비결합 물질을 제거하고, 제 1 및 제 2 표지들의 수준을 검출하되, 여기서 제 2 표지가 나타나면 상기 화합물이 상기 복합체에 결합한 것이고, 상기 제 1 표지의 수준이 결합을 유도하는 조건들 하에서 비결합 물질의 제거 후에 표지화된 리간드가 시험 화합물의 부재 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉하게 되는 경우의 제 1 표지의 수준과 비교하여 감소하면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 화합물이 동정되는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대해 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 결합을 유도하는 조건들 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드를 하나 이상의 시험 화합물의 존재 하에 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉시키고, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양을 측정하는 것을 포함하며, 이로 인해 하나 이상의 시험 화합물들의 존재 하에 측정된 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양이 하나 이상의 시험 화합물들의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양과 다르면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합을 조절하는 화합물이 동정되는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 접촉된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합이 측정되는, 여기에 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 양은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드-특이적인 항체를 사용하여 측정된다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 접촉된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합이 측정되는, 여기에 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 표지되고 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 부착된 표지를 검출함으로써 측정된다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 접촉된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합이 측정되는, 여기에 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 표지되고 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 표지화된 리간드의 결합은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 부착된 표지를 검출함으로써 측정된다. 관련된 실시양태에서, 상기 표지는 형광물질이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은, 조직 보호 사이토카인 수용체를 하나 이상의 시험 화합물들과 접촉시키고, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 측정하는 것을 포함하며, 이로 인해 하나 이상의 시험 화합물들의 존재 하에서 측정된 상기 활성이 하나 이상의 시험 화합물들의 부재 하에서 측정된 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성과 다르면, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정되는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
여기에 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 화합물은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합한다. 여기에 상기에서 기술된 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 화합물은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 결합한다.
5.2.4 고처리 검색 분석
여기에 기술된 세포-기반 및 비-세포 기반 분석은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 조절하거나 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 그러한 화합물들을 동정하기 위해 화합물들의 라이브러리를 검색하기 위한 고처리 형식으로 이용될 수 있다. 고처리 검색 분석에 사용될 수 있는 화합물들의 라이브러리들의 예시들은 하기 항목 5.4에 기재되어 있다.
표지화된 탐침들을 이용한 고처리 검색은 특이적 기능성 부위들의 형성에 영향을 미치는 화합물들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 기능성 부위 개요들이 약물들 및 약물 후보물질들을 동정하기 위해 약물로 처리된 세포들과 비처리된 또는 대조군 세포들간에 비교될 수 있다. 더욱이, 특이적 기능성 부위가 조직 보호 활성과 관련되어 있는 경우에, 이러한 부위에 특이적인 탐침들은 기능성 부위의 상태를 변경시키는 약물을 동정하기 위해 약물 처리 전후에 상기 부위의 상태를 결정하기 위해 사용될 수 있고, 따라서, 세포, 조직, 또는 기간 보호 요법에 유용할 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 약물의 처리는 기능성 부위의 상태를 대조군 시료에서 관찰되는 상태로 회복시킨다.
본 발명의 검색 분석은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 조절자들을 동정하기 위한 고처리 검색들 및 분석을 포함한다. 이 실시태양에 따라, 하기에 기술된 시스템들은 키트들로 제조될 수 있다. 이를 위해, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 세포들, 또는 그의 용해물들은 다양한 용기들, 예컨대 바이알, 튜브, 미세역가 웰 플레이트, 병 및 기타 동등한 것 내로 포장될 수 있다. 다른 시약들이 독립된 용기들 내에 포함되어 상기 키트와 함께 제공될 수 있다; 예컨대, 양성 대조군 시료들, 음성 대조군 시료들, 완충용액들, 세포 배양 배지 등등. 본 발명의 상기 분석은 먼저 소규모(즉, 시험관 내에서)로 최적화된 후 고처리 분석을 위해 대용량화될 수 있다.
5.3 화합물을 동정하거나 검색 분석에서 동정된 화합물을 검사하기 위한 분석
5.3.1 생물학적 검색 또는 분석
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성에 대한 효과를 갖는 것으로 동정된 화합물들 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합 및 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 것으로 발견된 화합물들은 조직 보호 활성, 예컨대 세포들, 조직들 또는 기관들을 보호하는 활성에 대해 검사될 수 있다. 보호 활성은 생체 외 및 생체 내 분석을 이용하여 추가로 검사될 수 있다. 조직 보호 활성을 나타내는 생체 외 검사들은 예를 들면, 세포 증식 분석, 세포 분화 분석, 또는 뉴클레올린, 뉴로글로빈, 및 사이토글로빈과 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성에 의해 상향조절되는 단백질 또는 핵산들의 존재의 검출을 포함한다. 예를 들어, 뉴로글로빈은 산소의 운반 또는 단기간 저장을 촉진하는데 관여될 수 있다. 따라서, 산소 운반 또는 저장 분석은 조직 보호 사이토카인 활성을 조절하는 화합물들을 동정하거나 검색하기 위한 분석으로서 사용될 수 있다.
뉴로글로빈은 저산소증 또는 허혈에 대한 반응으로 중추신경계의 세포들 및 조직들 내에서 발현되고, 손상으로부터 보호를 제공할 수 있다(Sun et al. 2001, PNAS 98:15306-15311; Schmid et al., 2003, J. Biol. Chem. 276:1932-1935). 사이토글로빈은 보호에 있어서 유사한 작용을 하지만, 다양한 수준으로 다양한 조직들에서 발현된다(Pesce et al., 2002, EMBO 3:1146-1151). 본 발명의 하나의 실시양태에서, 세포 내 상향조절된 단백질의 수준들은 동정된 시험 화합물을 세포와 접촉시킨 전후에 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 내 조직 보호 활성과 관련하여 상향조절된 단백질의 존재는 화합물의 조직 보호 활성을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
뉴클레올린은 세포를 손상으로부터 보호할 것이다. 이는 전사 과정들의 조절, 서열 특이적인 RNA-결합 단백질, 세포질 분열, 핵질형성, 신호 전달, T-세포들에 의해 유도되는 세포자멸, 염색질 재형성, 또는 복제를 포함하는 세포 내 수많은 역할들을 담당한다. 또한, 뉴클레올린은 세포 표면 수용체 DNA/RNA 헬리케이즈, DNA-의존성 ATPase, 단백질 셔틀, 전사인자 요소, 또는 전사 억제인자로서 작용할 수 있다(Srivastava and Pollard, 1999, FASEB J., 13:1911-1922; and Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112:761-772).
상향조절된 단백질의 발현은 세포 내에서 상기 단백질에 상응하는 mRNA 수준들을 검출함으로서 검출될 수 있다. 상기 mRNA는 상기 상향조절된 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 탐침에 혼성화될 수 있다. 혼성화는, 예를 들면, 노던 블럿, 서던 블럿, 배열 혼성화, 친화 크로마토그래피, 또는 in situ 혼성화로 이루어질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 활성화시키는 그들의 능력에 대해서 시험 화합물들을 검색하기 위한 신속하고 정량적인 분석 시스템들이 사용될 수 있다. 미국 특허 제5,763,198호에 실시예로서 기술된 바와 같이, 이러한 분석은 항-포스포티로신 항체 및 상기 단백질 항체에 대해 특이적인 항체를 이용하여 단백질 기질의 티로신 인산화 상태를 결정함으로써 신호전달에 관여하는 티로신 키나아제 또는 포스파타제 활성들의 조절을 검출한다. 이러한 분석은 전세포 또는 무세포 시스템 내에서 실행될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 인산화되었는지 여부를 결정하기 위해 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 세포를 접촉시키거나 상기 세포를 용해시키는 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체는 항-EPO 수용체 항체와 함께 침전되고, 침전된 복합체는 βc 수용체에 대한 항-포스포티로신 항체로 표지화된다.
동물 모델 시스템들은 화합물의 조직 보호 활성을 증명하기 위해 또는 상기에서 기술된 본 발명의 검색 방법에 의해 동정된 화합물들의 안정성 및 효과를 증명하기 위해 사용될 수 있다. 그 후에, 상기 분석에서 동정된 화합물들은 목적하는 조직 손상, 질환, 상태, 또는 증후군의 특정 유형에 대한 동물 모델들을 이용하여 생물학적 활성에 대해 검사될 수 있다. 이들은 기능성 판독 시스템에 연결된 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 포함하도록 조작된, 형질전환 마우스와 같은 동물들을 포함한다.
동정된 화합물의 상기 세포 또는 조직 보호 활성의 효율을 검사하기 위해 사용될 수 있는 동물 모델들은, 예를 들면, 루이스 래트들에서 급성 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 발병에 대한 보호, 뇌 외상을 입은 후 마우스에서 감소된 인지 기능의 회복 또는 보호(Brines et al., 2000, PNAS, 97:10295-10672), 및 유도된 망막 허혈로부터의 보호(Rosenbaum et al.,1997, Vis. Res. 37:3443-51)를 포함한다. 이러한 분석은 완전하게 참고문헌으로 여기에 도입된, PCT 공개 WO 02/053580에서 더욱 자세하게 기술되어 있다. 거기에 기술된 생체 내 검사들은 EPO의 투여에 대해 지시하였지만, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성에 대해 효과를 갖는 것으로 동정된 시험 화합물은 조직 보호 활성에 대해 검사하기 위해 EPO 대신에 투여될 수 있다. 화합물의 조직 보호 활성을 결정하기 위한 다른 분석이 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
동정된 화합물의 조직 보호 활성을 결정하도록 고안된 상기 분석은 상기 동정된 화합물이 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 상호작용을 하는지 또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 조직 보호 수용체 복합체 사이의 상호작용을 조절하는지 여부에 의존하면서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 존재 또는 부재 하에서 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 부가적인 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드가 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 상호작용에 대한 화합물의 조절 활성을 추가로 확인하기 위해 첨가된다.
5.3.2 세포 결합 분석
다르게는, 항목 5.2.2.1에 기술된 세포들을 이용하는 세포 결합 분석이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, BaF3 세포들은 상기에 기술된 바와 같이 EPO 및 βc 수용체로 형질감염될 수 있다. 추가로, 목적하는 작은 분자, 생물학적 또는 화학적 화합물이 형광물질 또는 방사성표지 마커와 같은 생물학적 마커에 결합될 수 있다.
96-웰 플레이트에서, 성장 배지 단독(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 1 mM 소듐 파이루베이트, 2 mM L-글루타민), 및 목적하는 작은 분자, 생물학적 또는 화학적 화합물들의 8회의 1:2 연속 희석액들. 각 희석액의 최종 부피는 약 100 ㎕일 수 있다.
그 후에, EPO-R로 형질감염된 BaF3 부모 세포주 및 BaF3 세포들을 성장 배지로 3회 세척하였고(상기 참조), 침전물들을 성장 배지에 재현탁하였고, 세포들을 세고 성장배지로 5,000 세포/100 ㎕로 희석하였다. 그 후에, 100 ㎕의 희석된 세포들을 시료들의 각 희석액에 첨가하였다. 그 다음, 상기 분석 플레이트를 37℃ 배양기에서 3 내지 4일간 배양하였다. 그 다음, 상기 세포들을 세척하였고, 상기 플레이트를 형광 플레이트 판독기 또는 목적하는 상기 화합물에 부착된 바이오마커를 검출하기 위한 다른 적절한 방법에 의해 판독하였다.
유사하게, 화합물이 조직 보호성인지 여부를 결정하기 위해 경쟁적 분석이 사용될 수 있다. 경쟁적 분석에서, 이에 한정되는 것은 아니지만, U.S. 특허출원 제10/188,905호 및 제10/185,841호에 기술된 것들과 같은 조직 보호 사이토카인들을 포함하는, 조직 보호성인 것으로 알려진 화합물이 적절한 바이오마커에 부착될 수 있다.
96-웰 플레이트에서, 성장 배지 단독(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 1 mM 소듐 파이루베이트, 2 mM L-글루타민)의 8회의 1:2 연속 희석액들, 및 잔존하는 웰들은 상기 조직 보호 화합물/바이오마커, 상기 조직 보호 화합물/바이오마커 및 그들 내에 과량의 목적하는 작은 분자, 생물학적 또는 화학적 화합물을 갖는다. 상기 각 희석액의 최종 부피는 약 100 ㎕일 수 있다. 다시 한번, 상기 BaF3 세포들을 상기에 기술된 바와 같이 상기 플레이트들에 접종하고 배양시켰다. 적절한 시간이 경과한 후에, 상기 세포들은 세척된 후, 상기 플레이트는 형광 플레이트 판독기 또는 상기 바이오마커를 검출하기 위해 적절한 다른 방법에 의해 판독될 수 있다. 만약 조직 보호 화합물/바이어마커 및 목적하는 화합물을 포함하는 상기 플레이트들의 판독이 오직 조직 보호 화합물/바이오마커만을 포함하는 플레이트들의 판독에 비해 못하다면, 그렇다면 상기 목적하는 화합물은 조직 보호성이다.
5.3.3 사이토카인 및 세포 증식/분화 활성
본 발명의 수용체 복합체는 사이토카인, (유도하거나 억제하는) 세포 증식 또는 (유도하거나 억제하는) 세포 분화 분석에 있어서, 조직 보호 화합물들(작은 분자, 단백질, 화학적 제제들)을 동정하는데 유용할 수 있다. 모든 공지된 사이토카인들을 포함하여, 오늘날까지 발견된 많은 단백질 인자들은 하나 이상의 인자-의존성 세포 증식 분석에서 활성을 나타내었고, 따라서, 이들 분석은 사이토카인 활성의 편리한 확인으로서 제공된다. 화합물의 상기 활성은 제한없이, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e 및 CMK를 포함하는 세포주들에 대한 통상적인 인자 의존성 세포 증식 분석 중의 어느 하나에 의해 입증될 수 있다. 이러한 세포들은 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 배양되고, 세포 증식은, 예를 들면, 삼중수소 티미딘의 도입을 측정함으로써 또는 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)의 대사 분해에 기초한 비색 분석(Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65:55-63)에 의해 검출된다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 상기 활성은, 다른 수단들 중에서, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 화합물 또는 리간드의 결합, 세포 증식, 세포 분화, 조직 보호 효과를 갖는 단백질의 상향조절, 또는 조직 보호 활성에 의해 측정될 수 있다.
5.3.4 융합 단백질
수용체 세포 외 도메인은 2개의 불변영역 도메인들과 힌지 영역을 포함하지만 가변영역은 결실된 면역글로불린 중쇄 불변영역들, 전형적으로 Fc 단편과의 융합체로서 발현될 수 있다. 이러한 융합체들은 Fc 부분들이 서로에게 이황화 결합에 의해 연결되고 2개의 수용체 폴리펩타이드들이 서로에게 아주 근접하여 배열되는 중합체 분자들로서 전형적으로 분비된다. 본 발명에 따라, 상기 융합체 상에서 수용체 폴리펩타이드들은 하나 이상의 EPO-R 세포 외 도메인과 하나의 βc 수용체 세포 외 도메인을 포함할 것이다. 이러한 유형의 융합체들은 리간드를 특이적으로 적정함에 의해, 및 생체 외 신호들을 차단하고, 생체 내 길항제로서 순환하는 리간드에 결합하고 상기 순환으로부터 이를 소실시키기 위해 이들을 비경구로 투여함에 의해 생체 내 신호들을 차단하기 위해, 생체 외 분석 기구로서, 용액으로부터 동질의 리간드를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 리간드를 정제하기 위해, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 키메라가 수용체-리간드 결합을 용이하게 하는 조건들(전형적으로 근접-생리적 온도, pH, 및 이온강도) 하에서 상기 리간드를 포함하는 시료(예컨대, 세포-적응용 배양배지 또는 조직 추출물)에 첨가된다. 그 다음, 상기 키메라-리간드 복합체는 고체 지지체(예컨대, 불용성 수지 비이드들)에 부동화된 단백질 A를 이용한 혼합물에 의해 분리된다. 그 후에 상기 리간드는 염 또는 pH 구배와 같은 통상적인 화학적 기법들을 이용하여 용출된다. 다르게는, 상기에서와 같이 수행된 결합 및 용출을 이용하여, 상기 키메라는 그 자체로 고체 지지체에 결합될 수 있다. 높은 결합 친화력을 갖는 키메라들은 비경구로(예컨대, 근육 내, 피하 또는 정맥 내 주사) 투여된다. 순환하는 분자들이 리간드에 결합하고 정상적인 생리 과정들에 의해 순환으로부터 소실된다. 분석에서의 사용을 위해, 상기 키메라들은 상기 Fc 영역을 통해 지지체에 결합될 수 있고 ELISA 형식으로 사용될 수 있다.
리간드-결합 수용체 복합체 융합 단백질 또는 리간드-결합 수용체 복합체 단편을 이용하는 바람직한 분석 시스템은 상업적으로 이용 가능한 바이오센서 기구(BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.)를 사용하는데, 상기 융합 단백질은 수용체 칩의 표면에 부동화된다. 이러한 기구의 사용은 칼손(Karlsson, 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240), 및 쿠닝햄 및 웰스(Cunningham and Wells, 1993, J. Mol. Biol. 234:554-563)에 의해 개시되었다. 융합 단백질은 아민 또는 설프하이드릴 화학을 이용하여, 유동 세포 내 금 필름에 부착된 덱스트란 섬유들에 공유적으로 부착된다. 시험 시료는 상기 세포를 통과하게 된다. 만약 리간드가 상기 시료 내에 존재한다면, 이 리간드는 상기 부동화된 융합 단백질에 결합하여, 상기 금 필름의 표면 플라스몬 공명에 있어서의 변화로서 검출되는, 배지의 굴절 지수에 있어서의 변화를 야기할 것이다. 이 시스템은 그의 결합 친화력이 계산될 수 있는 작동- 및 비작동-비율의 결정 및 결합의 화학량론의 평가를 허용한다.
리간드-결합 융합 단백질은 또한 당해 분야에 알려진 다른 분석 시스템들 내에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템들은 결합 친화력의 결정을 위한 스캐챠드 분석(Scatchard, 1949, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672 참조) 및 열량측정 분석(Cunningham et al., 1991, Science 253:545-548; Cunningham et al., 1991, Science 254:821-825)을 포함한다.
수용체 리간드-결합 융합 단백질 역시 리간드의 정제를 위해 사용될 수 있다. 상기 융합 단백질은 아가로스, 교차-결합된 아가로스, 유리, 셀룰로스성 수지들, 실리카-기반 수지들, 폴리스타이렌, 교차-결합된 폴리아크릴아마이드, 또는 사용 조건들 하에서 안정한 유사 물질들과 같은 고체 지지체에 부동화된다. 고체 지지체들에 폴리펩타이드들을 결합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 아민 화학, 브롬화 시아노겐 활성화, N-하이드록시석시니미트 활성화, 에폭사이드 활성화, 설프하이드릴 활성화, 및 하이드라지드 활성화를 포함한다. 그 결과 배지는 일반적으로 칼럼의 형태로 형성될 것이며, 리간드를 포함하는 액체들은 리간드가 상기 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 것이 허용되도록 1회 이상 상기 칼럼을 통과하게 된다. 상기 리간드는 그 다음에 리간드-수용체 결합을 파괴하기 위해 염 농도 또는 pH에 있어서의 변화를 이용하여 용출된다.
5.3.5 다른 분석
당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자는 본 발명의 수용체 복합체가, 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역학에 있어서 최신 프로토콜들(Current Protocols in Immunology, vol. 4, Chapter 18, 2001, John E. Coligan Ed. John Wiley and Sons)에 기재된 리간드-수용체 분석을 포함하는 몇몇 잘 알려진 분석에서 유용성을 가짐을 인식할 것이다.
만약 화합물이 조직 보호 활성을 나타낸다면, 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자는 상기 화합물이 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, P-19, PC-12, TF-1, 및 UT-7 세포 분석과 같은 신경 보호 및 조직 보호 분석 중의 하나를 이용하여 얻은 결과를 입증하는데 유익할 것임을 인식할 것이다. 부가적으로, 척수 손상, 허혈 뇌졸증, 말초신경 손상, 및 심장 및 안구와 관련된 동물 모델들과 같은 다양한 생체 내 모델들이 분리된 상기 조직 보호 화합물을 더욱 특징짓는데 유용할 수 있다. 적절한 생체 외 및 생체 내 분석은 U.S. 특허출원 제10/188,905호 및 제10/185,841호에 기재되어 있다.
5.3.5.1 β c (-/-) 넉-아웃 동물을 이용한 분석
본 발명은 또한 상기 동물의 내생적 βc 수용체의 발현을 억제하거나 "넉-아웃"시키고 및/또는 인간 βc 수용체(또는 그의 돌연변이)를 발현하도록 유전적으로 조작된 숙주 세포들 및 동물들의 용도에 관한 것이다. 이러한 형질전환 동물들은 신경보호 경로들 및 신경보호 경로들을 활성화시키는 화합물들을 동정하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
내생적 표적 유전자 발현은 또한 표적 상동성 재조합(예컨대, Smithies et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson et al., 1989, Cell 5, 313-321 참조; 이들 각각은 완전하게 여기에 참고문헌으로 도입되었다)을 이용하여 상기 표적 유전자 또는 그의 프로모터를 비활성화 또는 "넉-아웃"시킴으로써 감소될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이, 상기 내생적 표적 유전자(상기 표적 유전자의 코딩 지역들 또는 조절 지역들)에 상동성을 갖는 DNA가 측면에 위치한 비-기능성 표적 유전자(또는 완전히 비연관된 DNA 서열)는, 선택 마커 및/또는 음성 선택 마커와 함께 또는 없이, 상기 표적 유전자를 생체 내에서 발현하는 세포들을 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 표적 상동성 재조합을 통한, 상기 DNA 컨스트럭트의 삽입은 상기 표적 유전자의 비활성화 결과를 나타낸다. 이러한 접근들은 비활성 표적 유전자를 갖는 동물 자손을 생산하기 위해 사용될 수 있는 ES(배아줄기) 세포들에 특히 알맞은 변형들이다(예컨대, Thomas & Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 상동, 참조). 그러나, 만약 상기 재조합 DNA 컨스트럭트들이 직접적으로 투여되거나 적절한 바이러스성 벡터들을 이용하여 생체 내로 필요한 부위에 표적된다면, 이러한 접근은 인간들에서의 사용을 위해 적응될 수 있다.
일단 βc 수용체 (-/-) 넉-아웃 동물들이 제조되면, 상기 재조합 βc 리포터 유전자의 발현은 표준 기법들을 이용하여 분석될 수 있다. 초기 검색은 내생적 유전자의 넉-아웃이 일어났는지 여부를 조사하기 위해 동물 조직들을 분석하기 위한 서던 블럿 분석 또는 PCR 기법들에 의해 수행될 수 있다. 상기 형질전환 동물들의 조직들에서 전이유전자의 mRNA 발현 수준은 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 동물로부터 얻은 조직 시료들의 노던 블럿 분석, in situ 혼성화 분석, 및 TR-PCR(역전사효소 PCR)을 포함하는 기법들을 이용하여 분석될 수 있다. βc 수용체 유전자-발현 조직 시료들은 또한 상기 βc 수용체 전이유전자 산물에 특이적인 항체들을 이용하여 면역조직학적으로 평가될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, βc 수용체 (-/-) 넉-아웃 동물들은 조직 보호 활성에 관여하는 경로들 및/또는 화합물들을 동정하기 위한 분석에 사용된다. 예를 들면, 정상 및 βc 수용체 (-/-) 넉-아웃 동물들은 모두 조직 손상, 예컨대 허혈을 야기하는 것으로 알려진 제제 또는 압력이 가해질 수 있다. 그 다음, 두 동물들 모두에게 화합물이 투여될 수 있고, 상기 화합물의 조직 보호 활성이 결정될 수 있다. 조직 보호 활성을 결정하기 위한 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고 이러한 방법의 예시들은 완전하게 여기에 참고문헌으로서 포함되어진 PCT 공개 WO02/053580에 개시되어 있다. 만약 조직 보호 활성이 동일한 화합물이 투여된 βc 수용체 (-/-) 넉-아웃 동물들에서가 아니라 정상 동물들에서 관찰된다면, 그렇다면 βc 수용체에 의존적인 조직 보호 활성을 갖는 화합물이 동정된다. 동정된 βc 수용체 의존적 조직 보호 경로에 대한 추가적인 조사는 상기 화합물이 상기 βc 수용체 또는 그의 복합체들에 결합하는지 여부를 결정하거나, 상기 조직 보호 활성을 나타내는 동물들에게서만 나타나는 단백질 또는 mRNA 전사물들을 동정하는 것으로 이루어질 것이다. 출원인들은 조직 보호를 위한 이차 또는 과잉 경로들이 존재할 것이고 βc 수용체 (-/-) 넉-아웃 동물들이 이러한 경로들을 조사하기 위해 사용될 수 있다고 가정한다.
5.4 화합물
화합물을 선별하고 확인하기 위한 본 발명의 방법은 작은 분자, 유기 분자, 비-유기 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 비-천연 아미노산, 예를 들면, D-아미노산, 아미노산의 인 유사체, 예를 들면, D-아미노 인산, 또는 비-펩타이드 결합을 갖는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 비롯한 펩타이드 유사체, 핵산 유사체, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 PNA를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 많은 유형의 화합물들을 이용할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 시험되고 확인될 수 있는 화합물은 앨드리치(Aldirich, 위스콘신주 53233 밀워키 소재), 시그마 케미칼(Sigma Chemical, 미주리주 세인트 루이스 소재), 플루카 케미 에이지(Fluka Chemie AG, 스위스 부시 소재), 플루카 케미칼 코포레이션(Fluka Chemical Corp., 뉴욕주 론콘코마 소재), 이스트만 케미칼 캄파니, 파인 케미칼스(Eastman Chemical Company, Fine Chemicals, 테네시주 킹스포트 소재), 베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH, 독일 만하임 소재), 타카사고(Takasago, 뉴저지주 로크레이 소재), 에스에스티 코포레이션(SST Corporation, 뉴저지주 클립톤 소재), 페로(Ferro, 로스앤젤레스 70791 자카리 소재), 리델-데하엔 아크티엔게젤샤프트(Riedel-deHaen Aktiengesellschaft, 독일 실즈 소재), 피피지 인더스트리즈 인코포레이티드, 파인 케미칼스(PPG Industries Inc., Fine Chemicals, 펜실바니아주 15272 피츠버그 소재)를 포함하여 임의의 상업적 공급처로부터 수득된 화합물을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 미생물, 진균류, 식물 또는 동물 추출물을 포함하여 또 다른 임의 종류의 천연 생성물을 본 발명의 방법을 이용하여 선별할 수 있다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 라이브러리도 또한 본 발명의 분석에 이용할 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물은 작은 분자, 유기 분자, 비-유기 분자 또는 펩타이드일 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 선별될 수 있는 상기 화합물의 라이브러리의 예로는 펩토이드; 불규칙 생체올리고머; 다중체(diversomer), 예를 들면, 하이단토인, 벤조다이아제핀 및 다이펩타이드; 비닐성 폴리펩타이드; 비펩타이드성 펩타이드 모방체(peptidomimetics); 올리고카바메이트; 펩타이딜 포스포네이트; 펩타이드 핵산 라이브러리; 항체 라이브러리; 탄수화물 라이브러리; 및 작은 분자 라이브러리(소 유기 또는 비-유기 분자 라이브러리)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 라이브러리의 예로는 불규칙 펩타이드 라이브러리(예를 들면, 문헌 [Lam et al., Nature 354:82-84, 1991; Houghten et al., Nature 354:84-86, 1991] 참조); 및 D- 및/또는 L-구조 아미노산으로 이루어진 조합 화학-유도된 분자 라이브러리, 포스포펩타이드(불규칙 또는 부분 변성, 방향성 포스포펩타이드 라이브러리의 구성원을 포함하나 이로 한정되지는 않음; 예를 들면, 문헌 [Songyang et al., Cell, 72:767-778, 1993] 참조), 항체(다클론성, 단클론성, 인간화, 항-유전자형, 키메라 또는 단일 쇄 항체, 및 FAb, F(ab')2 및 FAb 발현 라이브러리 단편, 및 그의 에피토프-결합 단편을 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 및 소 분자 또는 무기 분자가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, EPO-조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 상호작용의 조절제를 선별하기 위해 사용될 수 있는 시험 화합물의 공급원으로서 펩타이드 라이브러리를 사용할 수 있다. 다양성 라이브러리, 예를 들면, 불규칙 또는 조합 펩타이드 또는 비펩타이드 라이브러리를 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적으로 결합하는 분자에 대해 검색할 수 있다. 사용할 수 있는 많은 라이브러리, 예를 들면, 화학 합성된 라이브러리, 재조합체(예를 들면, 파지 표시 라이브러리) 및 시험관 내 번역-기준 라이브러리가 당해 분야에 공지되어 있다.
화학 합성된 라이브러리의 예는 문헌 [Fodor et al, Science 251:767-773, 1991; Houghten et al., Nature 354:84-86, 1991; Lam et al., Nature 354:82-84, 1991; Medynski, Bio/Technology 12:709-710, 1994; Gallop et al., J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251, 1994; Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426, 1994; Houghten et al., Biotechniques 13:412, 1992; Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618, 1994; Salmon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712, 1993]; PCT 공개공보 WO 93/20242 호; 및 [Brenner and Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383, 1992]에 기술되어 있다.
파지 표시 라이브러리의 예는 문헌 [Scott & Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin et al., Science, 249:404-406, 1990; Christian et al., J. Mol. Biol. 227:711-718, 1992; Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-157, 1992; Kay et al., Gene 128:59-65, 1993]; 및 1994년 8월 18일자 PCT 공개공보 WO 94/18318 호에 기술되어 있다.
비펩타이드 라이브러리의 예로서, 벤조다이아제핀 라이브러리(예를 들면, 문헌 [Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712, 1994] 참조)를 사용하기에 적합하게 할 수 있다. 펩토이드 라이브러리[Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371, 1992]도 또한 사용할 수 있다. 펩타이드 중의 아마이드 작용기가 퍼메틸화되어 화학적으로 변환된 조합 라이브러리를 제공하는, 사용될 수 있는 라이브러리의 또 다른 예가 문헌 [Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142, 1994]에 기술되어 있다.
라이브러리를 선별하는 것은 임의의 다양한 통상적으로 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 라이브러리의 선별을 개시하고 있는 하기의 참조문헌들을 참조하시오: [Parmley & Smith, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218, 1989; Scott & Smith, Science 249:386-390, 1990; Fowlkes et al., BioTechniques 13:422-427, 1992; Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397, 1992; Yu et al., Cell 76:933-945, 1994; Staudt et al., Science 241:577-580, 1988; Bock et al., Nature 355:564-566, 1992; Tuerk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992, 1992; Ellington et al., Nature 355:850-852, 1922]; 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 제 5,096,815 호, 제 5,223,409 호 및 제 5,198,346 호; 문헌 [Rebar & Pabo, Science 263:671-673, 1993]; 및 PCT 공개공보 WO 94/18318 호.
바람직한 실시양태에서, 조합 라이브러리는 소 유기 분자 라이브러리, 예를 들면, 벤조다이아제핀, 아이소프레노이드, 티아졸리디논, 메타티아자논, 피롤리딘, 모폴리노 화합물 및 벤조다이아제핀이지만, 이로 한정되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 조합 라이브러리는 펩타이드; 불규칙 생체올리고머; 벤조다이아제핀; 다중체, 예를 들면, 하이단토인, 벤조다이아제핀 및 다이펩타이드; 비닐성 폴리펩타이드; 비펩타이드성 펩타이드 모방체; 올리고카바메이트; 펩타이딜 포스포네이트; 펩타이드 핵산 라이브러리; 항체 라이브러리; 또는 탄수화물 라이브러리를 포함한다. 조합 라이브러리는 자체로 상업적으로 시판한다(예를 들면, 뉴저지주 프린스턴 소재의 콤제넥스(ComGenex); 러시아 모스코바 소재의 아시넥스(Asinex); 미주리주 세인트 루이스 소재의 트리포스, 인코포레이티드(Tripos, Inc.); 러시아 모스코바 소재이 켐스타, 리미티드(ChemStar, Ltd.); 펜실바니아주 엑스톤 소재의 3D 파마슈티칼스(3D Pharmaceuticals); 메릴랜드주 콜럼비아 소재의 마르텍 바이오사이언시즈(Martek Biosciences); 등).
바람직한 실시양태로, 라이브러리의 화합물들이 세포 흡수에 보다 용이하도록 라이브러리를 미리 선택한다. 예를 들면, 크기, 친유성, 친수성, 및 화합물이 세포에 들어갈 가능성을 증대시키는 수소결합과 같은(이로 한정되지는 않는다) 특정 파라미터를 기준으로 화합물을 선택한다. 또 다른 실시양태에서는, 화합물을 3차원 또는 4차원 컴퓨터 연산 프로그램에 의해 분석한다.
한 실시양태로, 본 발명의 방법을 위한 조합 화합물 라이브러리를 합성할 수 있다. 약리학적, 생물학적 또는 다른 활성에 대해 선별할 수 있는 소 유기 화합물의 거대 컬렉션 또는 라이브러리의 제작에 관한 합성 방법은 매우 흥미롭다. 거대 조합 라이브리러를 제작하기 위해 적용된 합성 방법은 액상 또는 고체상으로, 즉, 고체 지지체 상에서 수행된다. 고체상 합성은 다단계 반응을 수행하는 것 및 반응을 고수율하에 완료하는 것을 보다 용이하게 만드는데, 그 이유는 과량의 시약들이 용이하게 첨가되고 각 반응 단계 후에 세척될 수 있기 때문이다. 고체상 조합 합성은 또한 단리, 정제 및 선별을 개선시키는 경향이 있다. 그러나, 보다 전통적인 액상 화학은 고체상 화학보다 광범위하게 다양한 유기 반응을 지지한다.
본 발명의 조합 화합물 라이브러리는 본원에 전체로 참고로 인용된, 킬코인(Kilcoin) 등의 미국 특허 제 6,190,619 호에 기술된 장치를 사용하여 합성할 수 있다. 미국 특허 제 6,190,619 호는 여러 별개의 화합물들의 병렬 합성 또는 화합물들의 조합 라이브러리를 위해 다수의 반응 용기를 유지할 수 있는 합성 장치를 개시하고 있다.
한 실시양태에서, 조합 화합물 라이브러리는 용액으로 합성할 수 있다. 본원에 전체로 참고로 인용된, 보거(Boger) 등의 미국 특허 제 6,194,612 호에 개시된 방법은 조합 라이브러리의 액상 합성용 주형으로 유용한 화합물을 다루고 있다. 상기 주형은 액체/액체 또는 고체/액체 추출을 이용하여 미반응 반응물로부터 반응 생성물이 용이하게 정제되도록 고안된다. 주형을 이용한 조합 합성에 의해 생성된 화합물은 바람직하게는 소 유기 분자일 것이다. 라이브러리의 몇몇 화합물은 비-펩타이드 또는 펩타이드의 효과를 모방할 수 있다. 조합 화합물 라이브러리의 고체상 합성과 대조적으로, 액상 합성은 다단계 고체상 합성의 개개 단계를 모니터하기 위한 전문 프로토콜의 사용을 필요로 하지 않는다[Egner et al., J. Org. Chem. 60:2652, 1995; Anderson et al., J. Org. Chem. 60:2650, 1995; Fitch et al., J. Org. Chem. 59:7955, 1994; Look et al, J. Org. Chem. 49:7588, 1994; Metzger et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 32:894, 1993; Youngquist et al., Rapid Commun. Mass Spect. 8:77, 1994; Chu et al., J. Am. Chem. Soc. 117:5419, 1995; Brummel et al., Science 264:399, 1994; Stevanovic et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:431, 1993].
본 발명의 방법에 유용한 조합 화합물 라이브러리는 고체 지지체상에서 합성할 수 있다. 한 실시양태에서, 합성시 고체 지지체를 분리하고 혼합하는 프로토콜인 분할 합성 방법을 이용하여 고체 지지체 상에서 화합물 라이브러리를 합성한다(예를 들면, 문헌 [Lam et al., Chem. Rev. 97:441-448, 1997; Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926, 1993] 및 그 중에 인용된 참조문헌 참고). 최종 라이브러리에서의 각 고체 지지체는 그 표면에 부착된 실질적으로 한 유형의 화합물을 갖는다. 하나의 생성물을 각각의 지지체에 부착시키는, 고체 지지체 상에서 조합 라이브러리를 합성하기 위한 다른 방법이 당해 분야에 기술을 가진 자들에게 공지되어 있을 것이다(예를 들면, 문헌 [Nefzi et al., Chem. Rev. 97:449-472, 1997] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "고체 지지체"란 용어는 특정 유형의 고체 지지체로 한정되지 않는다. 오히려 많은 수의 지지체를 사용할 수 있으며 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 고체 지지체로는 실리카겔, 수지, 유도체화 플라스틱 필름, 유리 비이드, 면, 플라스틱 비이드, 폴리스타이렌 비이드, 알루미나겔 및 폴리사카라이드가 포함된다. 적합한 고체 지지체는 목적하는 최종 용도 및 다양한 합성 프로토콜에 대한 적합성을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 합성의 경우, 고체 지지체는 수지, 예를 들면, p-메틸벤질하이드릴아민(pMBHA) 수지(켄터키주 루이스빌 소재의 펩타이드 인터내셔날(Peptides International)), 클로로메틸폴리스타이렌, 하이드록시메틸폴리스타이렌 및 아미노메틸폴리스타이렌을 포함한 폴리스타이렌(예를 들면, 바켐 인코포레이티드(Bachem Inc.), 페닌슐라 래버러토리즈(Peninsula Laboratories) 등에서 입수한 PAM-수지), 폴리(다이메틸아크릴아마이드)-그래프트된 스타이렌 코-다이비닐-벤젠(예를 들면, 캐나다의 아미노테크(Aminotech)에서 입수한 폴리하이프(POLYHIPE) 수지), 폴리아마이드 수지(페닌슐라 래버러토리즈에서 입수), 폴리에틸렌 글라이콜과 그래프트된 폴리스타이렌 수지(예를 들면, 텐타겔(TENTAGEL) 또는 아르고겔(ARGOGEL), 독일 튜빙겐 소재의 베이어(Bayer)), 폴리다이메틸아크릴아마이드 수지(캘리포니아의 밀리겐/바이오서치(Milligen/Biosearch)에서 입수) 또는 세파로스(Sepharose)(스웨덴의 파마시아(Pharmacia))일 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서는, 화합물을 링커에 의해 고체 지지체에 부착할 수 있다. 링커는 고체 지지체의 일체 및 부분일 수 있거나, 또는 이들은 고체 지지체 상에서 합성되거나 합성후 고체 지지체에 부착되는 비일체형일 수 있다. 링커는 고체 지지체에 대한 화합물의 부착점을 제공하는데 뿐 아니라, 링커의 성질에 따라 상이한 조건 하에서 고체 지지체로부터 상이한 분자들의 군을 분리시키는데 유용하다. 예를 들면, 링커는 특히 친전자성으로 분리되거나, 친핵성으로 분리되거나, 광분리성이거나, 효소적으로 분리되거나, 금속에 의해 분리되거나, 환원 조건 하에 분리되거나 또는 산화 조건 하에 분리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물의 고 처리량 선별에 앞서 고체 지지체로부터 분리된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 사이토카인이다. 본 발명의 선별 방법 및 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있는 사이토카인의 예로는 다음이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다: IL-1 알파, IL-1 베타, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-13, IL-12, IL-15, IL-18, TNF-알파, 뇌-유래 향신경성 인자, 뼈 형태형성 단백질-2, 베타-신경 성장 인자, 섬모 향신경성 인자, 표피 성장 인자, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 과립구-콜로니 자극 인자, 인간 성장 호르몬, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자, 간세포 성장 인자, 인터페론-알파 2a, 인터페론-알파 2b, 인터페론-알파 1b, 인터페론-베타 1a, 인터페론-베타 1b, 인터페론-감마, 인슐린 유사 성장 인자-I, 인슐린 유사 성장 인자-II, 케라티노사이 성장 인자, 뉴로트로핀-3, 혈소판 유래 성장 인자-bb, 줄기 세포 인자, 괴사 인자-알파, 종양 괴사 인자-베타, 관 내피 성장 인자, 렙틴 또는 프로락틴. 화합물이 사이토카인인 특정 실시양태에서, 화합물은 재조합적으로 생성된다. 화합물이 사이토카인인 특정 실시양태에서, 화합물은 인간이다.
화합물이 소 분자인 본 발명 방법의 실시양태들에서, 작은 분자는 리셉트론(Receptron)(캘리포니아주 마운틴뷰 소재의 리셉트론, 인코포레이티드(Receptron, Inc.))에서 시판하는 것과 같이, EPO 수용체에 특이적일 수 있다. 작은 분자의 다른 예로는 문헌 [Goldberg et al., J. Amer. Chem. Soc. 124:544-555, 2002; and Boger and Goldberg, Bioorg. and Org. Chem. 9:557-562, 2001]에 개시된 것들이 포함된다.
5.4.1.1 변형된 EPO 및 EPO 돌연변이체
본 발명의 특정 실시양태에서, 분석에 사용된 시험 화합물 및/또는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 그의 리간드의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 분석에 사용된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 화학적으로 변형된 EPO, 돌연변이 EPO 또는 그의 조합이다. 예를 들면, 2003년 4월 17일 20030072737-A1으로 공개된 미국 특허출원 제 10/188,905 호, 및 미국 특허출원 제 10/612,665 호는 화학적으로 변형되고/되거나 돌연변이 EPO를 개시하고 있으며 본원에 전체로 참고로 인용된다. 상기 화학적으로 변형되고/되거나 돌연변이 분자를 본원에 기술된 본 발명의 선별 분석에 사용할 수 있다(또한 본원에 전체로 참고로 인용된, PCT 출원번호 PCT/US01/49479 호, 미국 특허출원 제 10/188,905 및 10/185,841 호를 참조하시오). 상기 조직 보호 사이토카인은, 신경, 망막, 근육, 심장, 콩팥 세포 또는 조직을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 에리트로포이에틴-반응성 포유동물 세포, 조직 및 기관의 기능 및/또는 생존력을 보호, 유지, 증대 및/또는 회복시킨다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 화학적으로 변형된 EPO 분자는, 예를 들면, 천연 에리트로포이에틴에 비해, 바람직하게는 천연 인간 에리트로포이에틴에 비해 하나 이상의 변형에 의해 변형된 에리트로포이에틴을 포함한다. 상기 하나 이상의 변형은 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 아미노산의 변형, 또는 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 탄수화물의 변형일 수 있다. 본 발명에 유용한 화학적으로 변형된 EPO는 천연 분자에 비해 다수의 변형, 예를 들면, 분자의 아미노산 부분의 다중 변형, 분자의 탄수화물 부분의 다중 변형 또는 분자의 아미노산 부분의 하나 이상의 변형 및 분자의 탄수화물 부분의 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 화학적으로 변형된 EPO 분자는 반응성 포유동물 세포의 기능 또는 생존력을 보호, 유지, 증대 또는 회복시키는 그 능력을 보유하지만, 천연 분자에 비해 전술한 바람직한 특징과 무관한 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 성질이 부재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 골수에 대한 에리트로포이에틴의 불리한 영향, 즉, 증가된 헤마토크릿(적혈구생성), 혈관수축(고혈압), 증가된 혈압, 혈소판의 과잉활동, 전-응고제 활성 및 증가된 혈소판 생성이 없다. 보다 바람직하게는, 화학적으로 변형된 EPO는 적혈구생성이 없으며, 가장 바람직하게는 화학적으로 변형된 EPO는 골수에 대한 모든 에리트로포이에틴의 영향이 배제된다.
예로서, 본 발명의 화학적으로 변형된 EPO는 아시알로에리트로포이에틴일 수 있다. 또 다른 예로, 본 발명의 화학적으로 변형된 EPO는 천연 에리트로포이에틴 또는 아시알로에리트로포이에틴의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노기를 변형시키는 하나 이상의 시약과 반응시킨 에리트로포이에틴 또는 아시알로에리트로포이에틴일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 비에리트로포이에틱 화합물이다.
한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 아시알로에리트로포이에틴이고, 가장 바람직하게는 인간 아시알로에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태로, 화학적으로 변형된 EPO는 1 내지 13개의 시알산 잔기를 갖는다. 상기 부분적으로 탈시알화된 에리트로포이에틴은 본원에서 하이포시알로에리트로포이에틴으로 칭한다. 이들은 천연 에리트로포이에틴의 화학적 또는 효소적 변형에 의해 제조할 수 있거나, 또는 분자를 전혀 시알화시키지 않거나 에리트로포이에틴을 단지 부분적으로만 시알화시키는 시스템에서 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 아시알로에리트로포이에틴 및 하이포시알로에리트로포이에틴은 분자가 제조되는 방법과 관계없이 포함된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 변형된 라이신 잔기, 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형, 예를 들면, 라이신 엡실론 아미노기 또는 N-말단 아미노기와 아미노-기-변형제 또는 변형제들과의 반응으로부터 야기되는 변형을 포함한다. 변형된 라이신 잔기 또는 변형된 N-말단 아미노기는 또한 화학적으로 환원될 수 있다. 바람직한 한 실시양태에서, 에리트로포이에틴은 하나 이상의 라이신기 또는 N-말단에서 바이오티닐화, 카바밀화, 석시닐화 또는 아세틸화된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서는, 라이신을 알데하이드 또는 환원당과 반응시켜 이민을 생성하고, 이어서, 상기 이민을 선택적으로 화학적 환원에 의해, 예를 들면, 나트륨 사이아노보로하이드라이드를 사용하여 안정화시켜 글루시톨릴 라이신과 같은 N-알킬화 라이신 잔기를 생성하거나, 또는 환원당의 경우 상기 이민은 아마도리(Amadori) 또는 헤인스(Heyns) 재배열에 의해 안정화시켜 알파-데옥시 알파-아미노 당, 예를 들면, 알파-데옥시-알파-프럭토실라이신을 생성할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태로, 라이신 또는 N-말단 아미노기는, 예를 들면, 사이아네이트 이온과의 반응에 의해 카바밀화(카바모일화)되거나, 각각 알킬-아이소사이아네이트, 아릴-아이소사이아네이트 또는 아릴-아이소티오사이아네이트로 알킬-카바밀화, 아릴-카바밀화 또는 아릴-티오카바밀화되거나, 또는 반응성 알킬카복실산 또는 아릴카복실산 유도체에 의해, 예를 들면, 아세트산 무수물, 석신산 무수물 또는 프탈산 무수물과의 반응에 의해 아실화될 수 있다. 하나 이상의 라이신기 또는 N-말단 아미노기는 또한 트라이나이트로벤젠설폰산, 또는 바람직하게는 그 염 중 하나와의 반응에 의해 변형된 트라이나이트로페닐일 수 있다. 또 다른 실시양태로, 라이신 잔기는 글라이옥살과의 반응, 예를 들면, 글라이옥살, 메틸글라이옥살 또는 3-데옥시글루코손과의 반응에 의해 변형되어 상응하는 알파-카복시알킬 유도체를 생성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 방향족 고리 위치를 변형시키기 위해, 친전자성 시약을 사용하여 에리트로포이에틴의 하나 이상의 티로신 잔기를 변형시킴으로써, 예를 들면, 질화 또는 요오드화에 의한 변형에 의해(이로 한정되지는 않는다) 생성될 수 있다.
상기에서 언급했듯이, 본 발명에 유용한 조직 보호제는 전술한 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 상기 변형들 중 하나보다 많은 변형을 가질 수 있다. 분자의 아미노산 부분에 하나의 변형 및 분자의 탄수화물 부분에 선택적 변형을 갖는 화학적으로 변형된 EPO의 예로서, 화학적으로 변형된 EPO는 카바밀에리트로포이에틴, 카바밀아시알로에리트로포이에틴, 카바밀하이포시알로에리트로포이에틴, 아세틸에리트로포이에틴, 아세틸아시알로에리트로포이에틴, 아세틸하이포시알로에리트로포이에틴, 석시닐에리트로포이에틴, 석시닐아시알로에리트로포이에틴, 석시닐하이포시알로에리트로포이에틴, 바이오티닐에리트로포이에틴, 바이오티닐아시알로에리트로포이에틴, 바이오티닐하이포시알로에리트로포이에틴, 요오도에리트로포이에틴, 요오도아시알로에리트로포이에틴, 요오도하이포시알로에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸아시알로에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸하이포시알로에리트로포이에틴, 및 글루시톨릴에리트로포이에틴, 글루시톨릴아시알로에리트로포이에틴, 글루시톨릴아시알로하이포에리트로포이에틴이다. 이들 화합물은 단지 본 발명의 변형된 에리트로포이에틴의 예일 뿐이다. 상기 통속명은 단지 천연 에리트로포이에틴 분자의 변형을 나타내는 것이며, 하기에서 기술하는 바와 같이, 아미노기의 변형은 라이신 잔기의 하나 이상의 엡실론 아미노기, 또는 나이트로- 또는 요오도-변형된 에리트로포이에틴의 경우에는 하나 이상의 티로신 잔기의 N-말단 아미노기 상에서 이루어질 수 있다. 상기 변형의 임의의 조합도 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 하나 이상의 상기 화학적 변형을 포함하는 화학적으로 변형된 EPO를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, 효과량의 임의의 하나 이상의 전술한 화학적으로 변형된 EPO 또는 본 발명의 선별 방법으로 확인된 화합물과 같이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 투여함으로써, 응답성 포유동물 세포 및 그의 관련된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존력을 보호, 유지, 증대 또는 회복시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 특정한 한 실시양태에서, 응답성 포유동물 세포 및 그의 관련 세포, 조직 또는 기관은 치밀한 내피 세포 장벽으로 인해 맥관 구조에서 멀리 위치한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 세포, 조직, 기관 또는 기타 몸체 부분은 포유동물 몸체, 예를 들면, 이식 또는 재흡착하고자 한 몸체로부터 단리된다. 비-제한 예로서, 반응성 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근육, 심장, 허파, 간, 콩팥, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세관 내피, 고환, 난소, 췌장, 피부, 뼈 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있다. 이러한 반응성 세포의 예는 단지 예시적인 것이다. 특정 실시양태에서, 반응성 세포 또는 그의 관련 세포, 조직, 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나, 또는 주로 흥분성 세포 또는 조직을 포함하지도 않는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 전술한 화학적으로 변형된 EPO 또는 본 발명의 선별 방법에 의해 확인된 화합물과 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물이 투여될 수 있는 포유동물 세포, 조직 또는 기관은 세포, 조직 또는 기관의 생존력에 불리한 하나 이상의 조건 하에서 시간 기간을 연장시키거나 연장시킬 것들이다. 상기 조건은 외상에 의한 동소발생부위 저산소증 또는 대사 기능장애, 수술에 의해 유도된 동소발생부위 저산소증 또는 대사 기능장애, 또는 동소발생부위 독소 노출을 포함할 수 있으며; 후자는 화학요법 또는 방사선 요법과 관련될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 심폐 우회로수술로부터 야기되는 불리한 조건에 대해 보호한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 화학적으로 변형된 EPO를 사용하는 선별 방법을 제공한다: (i) 시알산 잔기가 결여된 에리트로포이에틴; (ii) N-결합되거나 O-결합된 탄수화물이 결여된 에리트로포이에틴; (iii) 천연 에리트로포이에틴을 하나 이상의 글라코시다제로 처리하여 감소된 탄수화물 함량을 갖는 에리트로포이에틴; (iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; (v) 화학적으로 환원된, 하나 이상의 산화된 탄수화물을 포함하는 에리트로포이에틴; (vi) 하나 이상의 변형된 아르기는 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴; (vii) 하나 이상의 변형된 라이신 잔기, 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기의 변형을 포함하는 에리트로포이에틴; (viii) 하나 이상의 변형된 티로신 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴; (ix) 하나 이상의 변형된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴; (x) 하나 이상의 변형된 트립토판 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴; (xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; (xii) 에리트로포이에틴 분자 중의 하나 이상의 시스틴 결합의 하나 이상의 개시부를 포함하는 에리트로포이에틴; 또는 (xiii) 절단된 에리트로포이에틴.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 화학적으로 변형된 EPO는 아시알로에리트로포이에틴 또는 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 내피 세포 장벽을 횡단할 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈관-뇌 장벽, 혈관-안구 장벽, 혈관-고환 장벽, 혈관-난소 장벽 및 혈관-자궁 장벽으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 화학적으로 변형된 EPO, 또는 에리트로포이에틴인 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 선별 방법에 의해 확인된 화합물과 같은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 아시알로에리트로포이에틴이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 인간 아시알로에리트로포이에틴이다. 화학적으로 변형된 EPO는 바람직하게는 N-결합 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 화학적으로 변형된 EPO는 바람직하게는 O-결합 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 글라이코시다제로 처리된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 페리오데이트-산화된 에리트로포이에틴이다. 페리오데이트-산화된 에리트로포이에틴은 바람직하게는 나트륨 사이아노보로하이드라이드에 의해 화학적으로 환원된다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살 잔기(여기서, R은 아릴 또는 알킬 잔기이다)를 포함하는 에리트로포이에틴이다. 에리트로포이에틴은 바람직하게는 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 아르기닌 잔기가 2,3-뷰테인다이온 및 사이클로헥세인다이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 다이케톤과의 반응에 의해 변형된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 아르기닌 잔기가 3-데옥시글루코손과 반응한 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 바이오티닐화 라이신 또는 N-말단 아미노기를 포함하는 에리트로포이에틴 분자이다. 에리트로포이에틴 분자는 바이오티닐화 에리트로포이에틴일 수 있다.
본 발명은 또한 글루시톨릴 라이신 에리트로포이에틴 또는 프럭토실 라이신 에리트로포이에틴인 화학적으로 변형된 EPO를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명 방법의 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 카바밀화 라이신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 카바밀화 에리트로포이에틴은 알파-N-카바모일에리트로포이에틴; N-엡실론-카바모일에리트로포이에틴; 알파-N-카바모일,N-엡실론-카바모일에리트로포이에틴; 알파-N-카바모일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카바모일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카바모일,N-엡실론-카바모일아시알로에리트리포이에틴; 알파-N-카바모일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카바모일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-카바모일,N-엡실론-카바모일하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명 방법의 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 라이신 잔기가 아실화된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 에리트로포이에틴의 라이신 잔기는 아세틸화된다. 또 다른 실시양태에서, 아세틸화 에리트로포이에틴은 알파-N-아세틸에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸,N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸,N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-아세틸,N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화학적으로 변형된 EPO는 석시닐화 라이신 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴이다. 한 실시양태에서, 에리트로포이에틴은 알파-N-석시닐에리트로포이에틴; N-엡실론-석시닐에리트로포이에틴; 알파-N-석시닐,N-엡실론-석시닐에리트로포이에틴; 알파-N-석시닐아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석시닐아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석시닐,N-엡실론-석시닐아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석시닐하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석시닐하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-석시닐,N-엡실론-석시닐하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명 방법의 화학적으로 변형된 EPO는 2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰산 염으로 변형된 하나 이상의 라이신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 염은 2,4,6-트라이나이트로벤젠설포네이트 나트륨이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명 방법의 화학적으로 변형된 EPO는 하나 이상의 티로신 잔기가 질화되고/되거나 요오드화된 에리트로포이에틴이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명 방법의 화학적으로 변형된 EPO는 아스파트산 및/또는 글루탐산 잔기가 카보다이이미드에 이어 아민과 반응한 에리트로포이에틴이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아민은 글라이신아마이드이다.
돌연변이 EPO 분자도 또한 사용할 수 있다, 예를 들면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 서열번호 10의 11 내지 15번 위치[서열 번호: 1], 서열번호 10의 44 내지 51번 위치[서열 번호: 2], 서열번호 10의 100 내지 108번 위치[서열 번호: 3] 또는 서열번호 10의 146 내지 151번 위치[서열 번호: 4]에 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는, 재조합적으로 생성될 수 있는 돌연변이 EPO일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 서열번호 10의 다음 위치: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 또는 161 중 하나 이상에 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 EPO이다.
또 다른 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 하기 변화 중 하나 이상을 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열(각각의 변형된 서열은 별개의 서열 식별 번호를 지정하였다)을 포함하는 돌연변이 EPO이다: 서열번호 10의 잔기 6에 알라닌[서열 번호: 15]; 서열번호 10의 잔기 7에 알라닌[서열 번호: 16]; 서열번호 10의 잔기 7에 세린[서열 번호: 17]; 서열번호 10의 잔기 10에 아이소류신[서열 번호: 18]; 서열번호 10의 잔기 11에 세린[서열 번호: 19]; 서열번호 10의 잔기 12에 알라닌[서열 번호: 20]; 서열번호 10의 잔기 13에 알라닌[서열 번호: 21]; 서열번호 10의 잔기 14에 알라닌[서열 번호: 22]; 서열번호 10의 잔기 14에 글루탐산[서열 번호: 23]; 서열번호 10의 잔기 14에 글루타민[서열 번호: 24]; 서열번호 10의 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 25]; 서열번호 10의 잔기 15에 페닐알라닌[서열 번호: 26]; 서열번호 10의 잔기 15에 아이소류신[서열 번호: 27]; 서열번호 10의 잔기 20에 글루탐산[서열 번호: 28]; 서열번호 10의 잔기 20에 알라닌[서열 번호: 29]; 서열번호 10의 잔기 21에 알라닌[서열 번호: 30]; 서열번호 10의 잔기 24에 라이신[서열 번호: 31]; 서열번호 10의 잔기 29에 세린[서열 번호: 32]; 서열번호 10의 잔기 29에 티로신[서열 번호: 33]; 서열번호 10의 잔기 아스파라긴[서열 번호: 34]; 서열번호 10의 잔기 32에 트레오닌[서열 번호: 35]; 서열번호 10의 잔기 33에 세린[서열 번호: 36]; 서열번호 10의 잔기 33에 티로신[서열 번호: 37]; 서열번호 10의 잔기 38에 라이신[서열 번호: 38]; 서열번호 10의 잔기 83에 라이신[서열 번호: 39]; 서열번호 10의 잔기 42에 아스파라긴[서열 번호: 40]; 서열번호 10의 잔기 42에 알라닌[서열 번호: 41]; 서열번호 10의 잔기 43에 알라닌[서열 번호: 42]; 서열번호 10의 잔기 44에 아이소류신[서열 번호: 43]; 서열번호 10의 잔기 45에 아스파트산[서열 번호: 44]; 서열번호 10의 잔기 45에 알라닌[서열 번호: 45]; 서열번호 10의 잔기 46에 알라닌[서열 번호: 46]; 서열번호 10의 잔기 47에 알라닌[서열 번호: 47]; 서열번호 10의 잔기 48에 아이소류신[서열 번호: 48]; 서열번호 10의 잔기 48에 알라닌[서열 번호: 49]; 서열번호 10의 잔기 49에 알라닌[서열 번호: 50]; 서열번호 10의 잔기 49에 세린[서열 번호: 51]; 서열번호 10의 잔기 51에 페닐알라닌[서열 번호: 52]; 서열번호 10의 잔기 51에 아스파라긴[서열 번호: 53]; 서열번호 10의 잔기 52에 알라닌[서열 번호: 54]; 서열번호 10의 잔기 59에 아스파라긴[서열 번호: 55]; 서열번호 10의 잔기 62에 트레오닌[서열 번호: 56]; 서열번호 10의 잔기 67에 세린[서열 번호: 57]; 서열번호 10의 잔기 70에 알라닌[서열 번호: 58]; 서열번호 10의 잔기 96에 아르기닌[서열 번호: 59]; 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌[서열 번호: 60]; 서열번호 10의 잔기 100에 아르기닌[서열 번호: 61]; 서열번호 10의 잔기 100에 글루탐산[서열 번호: 62]; 서열번호 10의 잔기 100에 알라닌[서열 번호: 63]; 서열번호 10의 잔기 100에 트레오닌[서열 번호: 64]; 서열번호 10의 잔기 101에 알라닌[서열 번호: 65]; 서열번호 10의 잔기 101에 아이소류신[서열 번호: 66]; 서열번호 10의 잔기 102에 알라닌[서열 번호: 67]; 서열번호 10의 잔기 103에 알라닌[서열 번호: 68]; 서열번호 10의 잔기 103에 글루탐산[서열 번호: 69]; 서열번호 10의 잔기 104에 알라닌[서열 번호: 70]; 서열번호 10의 잔기 104에 아이소류신[서열 번호: 71]; 서열번호 10의 잔기 105에 알라닌[서열 번호: 72]; 서열번호 10의 잔기 106에 알라닌[서열 번호: 73]; 서열번호 10의 잔기 106에 아이소류신[서열 번호: 74]; 서열번호 10의 잔기 107에 알라닌[서열 번호: 75]; 서열번호 10의 잔기 107에 류신[서열 번호: 76]; 서열번호 10의 잔기 108에 라이신[서열 번호: 77]; 서열번호 10의 잔기 108에 알라닌[서열 번호: 78]; 서열번호 10의 잔기 108에 세린[서열 번호: 79]; 서열번호 10의 잔기 116에 알라닌[서열 번호: 80]; 서열번호 10의 잔기 126에 알라닌[서열 번호: 81]; 서열번호 10의 잔기 132에 알라닌[서열 번호: 82]; 서열번호 10의 잔기 133에 알라닌[서열 번호: 83]; 서열번호 10의 잔기 134에 알라닌[서열 번호: 84]; 서열번호 10의 잔기 140에 알라닌[서열 번호: 85]; 서열번호 10의 잔기 142에 아이소류신[서열 번호: 86]; 서열번호 10의 잔기 143에 알라닌[서열 번호: 87]; 서열번호 10의 잔기 146에 알라닌[서열 번호: 88]; 서열번호 10의 잔기 147에 라이신[서열 번호: 89]; 서열번호 10의 잔기 147에 알라닌[서열 번호: 90]; 서열번호 10의 잔기 148에 티로신[서열 번호: 91]; 서열번호 10의 잔기 148에 알라닌[서열 번호: 92]; 서열번호 10의 잔기 149에 알라닌[서열 번호: 93]; 서열번호 10의 잔기 150에 알라닌[서열 번호: 94]; 서열번호 10의 잔기 150에 글루탐산[서열 번호: 95]; 서열번호 10의 잔기 151에 알라닌[서열 번호: 96]; 서열번호 10의 잔기 152에 알라닌[서열 번호: 97]; 서열번호 10의 잔기 152에 트립토판[서열 번호: 98]; 서열번호 10의 잔기 153에 알라닌[서열 번호: 99]; 서열번호 10의 잔기 154에 알라닌[서열 번호: 100]; 서열번호 10의 잔기 155에 알라닌[서열 번호: 101]; 서열번호 10의 잔기 158에 알라닌[서열 번호: 102]; 서열번호 10의 잔기 160에 세린[서열 번호: 103]; 서열번호 10의 잔기 161에 알라닌[서열 번호: 104]; 또는 서열번호 10의 잔기 162에 알라닌[서열 번호: 105]. 한 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 서열 번호: 15 내지 105 및 119의 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 EPO이다.
또 다른 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 서열번호 10의 아미노산 잔기 44 내지 49가 결실된 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 EPO이다.
또 다른 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 하기 변화 중 하나 이상을 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열(각각의 변형된 서열은 별개의 서열 식별 번호를 지정하였다)을 포함하는 돌연변이 EPO이다: (i) 서열번호 10의 잔기 45에 아스파트산 및 잔기 100에 글루탐산[서열 번호: 106]; (ii) 서열번호 10의 잔기 30에 아스파라긴 및 잔기 32에 트레오닌[서열 번호: 107]; (iii) 서열번호 10의 잔기 45에 아스파트산 및 잔기 150에 글루탐산[서열 번호: 108]; (iv) 서열번호 10의 잔기 103에 글루탐산 및 잔기 108에 세린[서열 번호: 109]; (v) 서열번호 10의 잔기 140에 알라닌 및 잔기 52에 알라닌[서열 번호: 110]; (vi) 서열번호 10의 잔기 140에 알라닌, 잔기 52에 알라닌 및 잔기 45에 알라닌[서열 번호: 111]; (vii) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌 및 잔기 152에 알라닌[서열 번호: 112]; (viii) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌 및 잔기 45에 알라닌[서열 번호: 113]; (ix) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌 및 잔기 52에 알라닌[서열 번호: 114]; (x) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌, 잔기 52에 알라닌 및 잔기 140에 알라닌[서열 번호: 115]; (xi) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌, 잔기 52에 알라닌, 잔기 140에 알라닌, 잔기 154에 알라닌, 잔기 24에 라이신, 잔기 38에 라이신, 잔기 83에 라이신, 잔기 24에 라이신 및 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 116]; (xii) 서열번호 10의 잔기 24에 라이신, 잔기 38에 라이신 및 잔기 83에 라이신[서열 번호: 117]; 또는 (xiii) 서열번호 10의 잔기 24에 라이신 및 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 118]. 한 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 하기의 서열 번호: 106 내지 118의 아미노산 잔기 치환 중 하나 이상을 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 EPO이다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 돌연변이 EPO이며, 하기의 변화, 즉, 치환 중 하나 이상을 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열(각각의 변화 또는 열거된 변화들의 조합은 별개의 서열 식별 번호를 지정하였다)을 포함할 수 있다: (i) 서열번호 10의 잔기 45에 아스파트산 및 잔기 100에 글루탐산[서열 번호: 106]; (ii) 서열번호 10의 잔기 30에 아스파라긴 및 잔기 32에 트레오닌[서열 번호: 107]; (iii) 서열번호 10의 잔기 45에 아스파트산 및 잔기 150에 글루탐산[서열 번호: 108]; (iv) 서열번호 10의 잔기 103에 글루탐산 및 잔기 108에 세린[서열 번호: 109]; (v) 서열번호 10의 잔기 140에 알라닌 및 잔기 52에 알라닌[서열 번호: 110]; (vi) 서열번호 10의 잔기 140에 알라닌, 잔기 52에 알라닌 및 잔기 45에 알라닌[서열 번호: 111]; (vii) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌 및 잔기 152에 알라닌[서열 번호: 112]; (viii) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌 및 잔기 45에 알라닌[서열 번호: 113]; (ix) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌 및 잔기 52에 알라닌[서열 번호: 114]; (x) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌, 잔기 52에 알라닌 및 잔기 140에 알라닌[서열 번호: 115]; (xi) 서열번호 10의 잔기 97에 알라닌, 잔기 152에 알라닌, 잔기 45에 알라닌, 잔기 52에 알라닌, 잔기 140에 알라닌, 잔기 154에 알라닌, 잔기 24에 라이신, 잔기 38에 라이신, 잔기 83에 라이신, 잔기 24에 라이신 및 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 116]; (xii) 서열번호 10의 잔기 24에 라이신, 잔기 38에 라이신 및 잔기 83에 라이신[서열 번호: 117]; 또는 (xiii) 서열번호 10의 잔기 24에 라이신 및 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 118].
본 발명의 또 다른 실시양태에 따라서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드는 하기 아미노산 잔기 치환 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이 EPO이다(각 변화 또는 열거된 변화들의 조합은 별개의 서열 식별 번호를 지정하였다): 서열번호 10의 잔기 152에 트립토판[서열 번호: 98]; 서열번호 10의 잔기 14에 알라닌 및 잔기 15에 알라닌[서열 번호: 119]; 서열번호 10의 잔기 6에 알라닌[서열 번호: 15]; 서열번호 10의 잔기 7에 알라닌[서열 번호: 16]; 서열번호 10의 잔기 43에 알라닌[서열 번호: 42]; 서열번호 10의 잔기 42에 알라닌[서열 번호: 41]; 서열번호 10의 잔기 48에 알라닌[서열 번호: 49]; 서열번호 10의 잔기 49에 알라닌[서열 번호: 50]; 서열번호 10의 잔기 32에 트레오닌[서열 번호: 35]; 서열번호 10의 잔기 133에 알라닌[서열 번호: 83]; 서열번호 10의 잔기 134에 알라닌[서열 번호: 84]; 서열번호 10의 잔기 147에 알라닌[서열 번호: 90]; 서열번호 10의 잔기 148에 알라닌[서열 번호: 92]; 서열번호 10의 잔기 150에 알라닌[서열 번호: 94]; 서열번호 10의 잔기 151에 알라닌[서열 번호: 96]; 서열번호 10의 잔기 158에 알라닌[서열 번호: 102]; 서열번호 10의 잔기 161에 알라닌[서열 번호: 104]; 또는 서열번호 10의 잔기 162에 알라닌[서열 번호: 105].
5.4.1.2 항체
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 선별 분석법에서 시험된 화합물은 항체이다. 리간드도 또한 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체와 공지된 리간드와의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하기 위해 설계된 선별 분석법에서 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체일 수 있다. 상기 항체의 제조 방법을 본원에 기술한다. 확인된 항체는 또한 조직 보호에 유용할 수 있다. 확인된 항체는 또한 질환, 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 화합물로서 유용할 수 있다.
상기 항체로는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAb), 인간화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-유전자형(항-Id) 항체, 및 상기 항체들 중 임의의 에피토프-결합 단편이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 항체는, 예를 들면, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체의 활성 또는 조직 보호 활성에 대한 시험 화합물의 영향을 평가하기 위해, 전술한 바와 같은 화합물 선별 방법과 함께 이용될 수 있다.
조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체를 생성하기 위해, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 일부분을 주입하여 다양한 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체의 항원 부분은 당해 분야에 공지된 알고리듬에 의해 용이하게 예상할 수 있다.
숙주 동물로는 토끼, 마우스 및 래트 등이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위해, 프러인트용액(Freund's)(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 무기질 겔, 라이소레시틴, 플루론성 폴리올과 같은 표면활성 물질, 다중음이온, 펩타이드, 오일 유화액, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모사이아닌, 다이나이트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예를 들면, BCG(바실러스 칼메트-게랭(bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파븀(Corynebacterium parvum)을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 보조제를 사용할 수 있다.
다클론성 항체는 항원, 예를 들면, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 항원 작용성 유도체로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 개체군이다. 다클론성 항체를 생성하기 위해, 전술한 바와 같은 보조제로 보충된 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 일부를 주입하여 전술한 바와 같은 숙주 동물을 면역화할 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 동종 개체군인 단클론성 항체는 배양시 연속 세포계에 의해 항체 분자를 생성하는 임의의 기술에 의해 수득할 수 있다. 이러한 기술로는 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 하이브리도마 기술(문헌 [Nature 256, 495-497, 1975]; 및 미국 특허 제 4,376,110 호), 인간 B-세포 하이브리도마 기술[Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030, 1983], 및 EBV-하이브리도마 기술[Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985]이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 임의의 아강을 포함하여 임의의 면역글로뷸린 부류에 속하는 것이다. 본 발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양할 수 있다. 생체 내에서 높은 역가의 mAb의 생성으로 인해 이 방법이 현재 바람직한 생성 방법이 된다.
또한, 적절한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터의 유전자와 접합시킴으로써 "키메라 항체"[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1985]의 생성을 위해 개발된 기술을 이용할 수 있다. 키메라성 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유도된 분자, 예를 들면, 뮤린의 mAb로부터 유도된 가변 영역 및 인간 면역글로뷸린 불변 영역을 갖는 분자이다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제 4,816,567 호 및 보스(Boss) 등의 미국 특허 제 4,816,397 호를 참조하시오).
본 발명의 또 다른 실시양태로, 단클론성 항체는 무균 동물에서 생성될 수 있다(1989년 12월 12일자로 공개된 PCT 국제 공개공보 WO 89/12690 호 참조). 본 발명에 따르면, 인간 항체를 사용할 수 있으며 인간 하이브리도마를 사용하여[Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030, 1983] 또는 시험관 내에서 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 형질전환시킴으로써[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96, 1985] 수득할 수 있다. 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터의 유전자와 접합시킴으로써 "키메라 항체"[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1985]의 생성을 위해 개발된 기술도 또한 사용할 수 있으며; 상기 항체는 본 발명의 범위에 속한다.
인간화된 항체도 또한 제공된다(윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,225,539 호 참조). 면역글로뷸린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 고도가변 영역에 의해 중단되는 "골격" 영역으로 이루어진다. 골격 영역 및 CDR의 범위는 정확하게 정의되었다["Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., US Department of Health and Human Services, 1983]. 간략하게, 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로뷸린 분자로부터의 골격 영역을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 분자이다. 상기 CDRS-그래프트된 항체가, 예를 들면, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, 1989]에 기술된 바와 같은 IL-2 수용체에 대한 항체; 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323, 1988]에 기술된 바와 같은 세포 표면 수용체 CAMPATH에 대한 항체; 문헌 [Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991]에 기술된 B형 간염에 대한 항체; 및 문헌 [Tempest et al., Bio-Technology 9:267, 1991]에 기술된 호흡기 합포체 바이러스의 바이러스 항원에 대한 항체가, 다양한 항원에 대해 성공적으로 구축되었다. 인간화 항체가 인간의 치료 용도에 가장 바람직하다.
또는, 단일쇄 항체의 생성에 대해 기술된 기술(미국 특허 제 4,946,778 호; 문헌 [Bird, Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; and Ward et al., Nature 334:544-546, 1989])을 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 또는 그의 부분들에 특이적인 단일쇄 항체를 생성하도록 변형시킬 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합시켜 단일쇄 폴리펩타이드를 제공함으로써 생성된다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편을 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 단편에는 항체 분자의 펩신 절단에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 다이설파이드 가교를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 또는, 목적하는 특이성을 갖는 단클론성 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능케하도록 Fab 발현 라이브러리를 구축할 수 있다[Huse et al, Science 246:1275-1281, 1989].
조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 대한 항체는, 차례로 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 기술을 이용하여 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체를 "모방"하는 항-유전자형 항체를 생성하기 위해 이용할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Greenspan & Bona, FASEB J 7(5):437-444, 1993; and Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438, 1991] 참조). 예를 들면, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 결합하고 EPO 또는 다른 공지된 리간드가 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 항체를, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체의 결합 영역을 "모방"하고, 따라서 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 결합하고 중화시키는 항-유전자형을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 상기 항-유전자형 또는 상기 항-유전자형의 Fab 단편의 중화를 천연 리간드를 중화시키기 위한 치료 전략에 이용할 수 있으며, 이어서 조직 보호를 제공하는 본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물을 투여할 수 있는데, 이것은 천연 리간드에 의해 제공된 보호에 비해 월등할 수 있다. 또는, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 활성의 작용제로 작용할 수 있는 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 대한 항체를 생성할 수 있다. 상기 항체는 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체에 결합하고 수용체 복합체의 신호 전환 활성을 활성화시킬 것이다. 또한, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체 활성의 길항제로 작용하는, 즉, 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체의 활성화를 억제하는 항체는 조직 보호 수용체 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 분석에 음성 대조군으로 유용할 것이다. 상기 작용제 및 길항제를 분석하기 위한 방법은 상기 부분에서 상세히 기술하였다.
5.4.2 화합물 구조의 특성
당해 분야의 숙련자에게 잘 공지된 여러 방법에 의해, 본 발명의 선별 방법에 의해 규정된 시험 화합물의 구조를 결정할 수 있다. 예를 들면, 화합물의 구조를 밝히기 위해 X선 결정술(crystallography)이 사용될 수 있다. X선 결정술의 검토를 위해 예컨대 블런델(Blundell) 등의 문헌 [2002, Nat Rev Drug Discov 1(1):45-54]을 참고한다.
특정 실시양태에서, 화합물의 구조를 밝히기 위해 진동 분광(vibrational spectroscopy)(예컨대, 적외선 분광 또는 라만 분광)가 사용될 수 있다. 개선된 라만 분광기는, 본원에 참고로 인용하고 있는 핑크(Fink) 등의 미국 특허 제 5,786,893 호에 기술되어 있다. 가시 현미경과 분광계의 통합에 의한 단일 비이드에 관여하는 공간 분석 방식으로 진동(vibrational) 현미경 검사가 측정할 수 있다. 현미경 적외선 분광계는 본원에 전반적으로 참고로 인용하고 있는 레프너(Reffner) 등의 미국 특허 제 5,581,085 호에서 기술되어 있다. 하나의 샘플에 대해 현미경 적외성 및 현미경 라만 분석을 동시에 수행하는 장비가 본원에 전반적으로 참고로 인용하고 있는 소스테크(Sostek) 등의 미국 특허 제 5,841,139 호에 기술되어 있다. 방법에 대한 하나의 실시양태에서, 각각의 생성된 비이드가, 페니리(Fenniri) 등의 문헌 [2000, J. Am. Chem. Soc. 123:8151-8152]에 기술된 비제한적인 방법에 의하면 진동(IR 또는 라만) 스펙트럼에서 흡수 선의 특정 패턴이 갖도록, 화학적으로 개질된 스타이렌 단량체로 도핑된 폴리스타이렌 비이드 상에서 화합물이 합성된다. 당해 분야의 숙련자에게 익숙한 스플릿-푸울(split-pool) 합성 방법을 사용하여, 비이드의 분광학적 패턴이 비이드 상에서 화합물의 성분들 중 하나를 동정하도록 화합물의 라이브러리가 제조된다. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 결합시키려는 그들의 능력에 따라 구분된 비이드는 그들의 진동 스펙트럼에 의해 동정될 수 있다.
조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 결합시키는 화합물의 고출력 검색 및 화합물의 구조를 밝히는 모두를 위해, 질량 분광계(예컨대, 전기분무 이온화(electrospray ionization(ESI)) 및 매트릭스-조력 레이저 탈착-이온화(matrix-assisted laser desorption-ionization(MALDI)), 푸리에-변환 이온 사이클로트론 공명(Fourier-transform ion cyclotron resonance(FT-ICR))가 사용될 수 있다.
MALDI는 이온 탈착용 펄스화 레이저 및 비행시간 분석기(time-of-flight analyzer)를 사용하며, 비공유 tRNA:아미노-아실-tRNA 신테타제 복합체의 검출을 위해 사용되어 왔다[그루익-소불즈(Gruic-Sovulj) 등의 문헌 "1997, J. Biol. Chem. 272:32084-32091"]. 그러나, 표적 핵산과 화합물 사이의 공유 가교결합은 통상적으로 검출에 필요한데, 이는 비공유 결합 복합체는 MALDI 공정 동안 해리될 수 있다.
ESI 질량 분광학(ESI-MS)은 MALDI 공정과 달리 비공유 분자 상호작용에 크게 유용적이어 왔으며, ESI-MS는 분자 이온을 거의 발생하지 않아 분열시키지 못한다[자비어(Xavier) 등의 문헌 "2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356"]. ESI-MS는 HIV Tat 펩타이드에 의해 형성된 복합체, 및 TAR RNA를 갖는 단백질을 연구하는데 사용되어 왔다[사네스-로워리(Sannes-Lowery) 등의 문헌 "1997, Anal. Chem. 69:5130-5135"].
푸리에-변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR) 질량 분광계는 고해상도 스펙트럼, 동위원소-분해된 전국체 이온 선택 및 정교한 질량 할당을 제공한다[자비어 등의 문헌 "2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356"]. FT-ICR은 아미노글라이코사이드 항생제와 인지체(cognate) 및 비-인지체 RNA의 상호작용을 연구하는데 사용되어 왔다[호프스태들러(Hofstadler) 등의 문헌 "1999, Anal. Chem. 71:3436-3440"; 그리페이(Griffey) 등의 문헌 "1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10129-10133"]. 본원에서 논의되는 질량 분광 방법 모두에 대한 진실로서, FT-ICR은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 또는 화합물의 표지화를 필요로 하지 않는다.
질량 분광의 이점은 화합물의 구조에 대한 설명뿐만 아니라, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합된 화합물의 구조에 대한 측정이다. 이러한 정보는 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특별하게 결합된 화합물의 콘센서스(consensus) 구조를 밝힐 수 있게 된다.
NMR 분광 방법은 또한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 관련된 화합물을 특징화하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 착화된 분자는 화학적 이동(chemical shift)에서의 변화를 정성적으로 측정함으로써 특히 이완 효과를 사용하여 측정된 거리로부터 검사될 수 있으며, NMR-기초 접근 방법은 단백질 약물 표적의 작은 분자 결합제의 동정에서 사용되어 왔다[자비어 등의 문헌 "2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356"]. NMR에 의한 구조-활성 관계(SAR)의 측정은, 인접 하위 부위들을 결합시키는 작은 분자들이 표적 단백질의 2차원 H-N 스펙트럼에 의해 동정된 NMR에 관한 제 1 방법이다[슈커(Shuker) 등의 문헌 "1996, Science 274:1531-1534"]. 결합된 분자로부터의 신호는 라인 광역화(line broadening), 전이된 NOE 및 간헐영역 구배 확산 측정(pulsed field gradient diffusion measurement)를 사용함으로써 모니터링된다[무어(Moore)의 문헌 "1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10:54-58"]. 작은 분자들의 라이브러리를 사용하여 NMR에 의해 발생된 유도 전략이 최근 기술되어 있다[페즈조(Fejzo) 등의 문헌 "1999, Chem. Biol. 6:755-769"].
본 발명에 사용될 수 있는 NMR 방법의 다른 예로는 상관 분광(COSY) 및 핵 오버하우저 효과(nuclear Overhauser effect(NOE)) 분광뿐만 아니라 1차원, 2차원, 3차원, 4차원 NMR 방법이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 이러한 화합물의 구조 측정 방법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.
질량 분광과 유사하게, NMR의 이점은 화합물의 구조에 대한 설명뿐만 아니라, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합된 화합물의 구조에 대한 측정이다.
5.5 치료 용도
당해 분야의 숙련자는 본 발명의 분석에 의해 동정된 화합물을 인지하고 있으며, 여러 질환, 장애 및 상태의 치료 또는 예방을 위한 치료제로서 유용하다. 당해 분야의 숙련자는 또한 이러한 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 조정을 달성하는데 사용될 수 있음을 인지하고 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조정하는 것은 복합체와 상기 복합체의 리간드의 상호작용을 보강 또는 억제하는 화합물에 의해 달성될 수 있다. 예컨대 앞서 개시된 본 발명의 분석에 의해 동정된 화합물의 치료 징후를 평가하는데 사용될 수 있는 생체 외 및 생체 내 기법 모두는, 본원에 참고로 인용하고 있는 PCT 출원 PCT/US01/49479 호, 미국 특허출원 제 10/188,905 호 및 미국 특허출원 제 10/185,841 호에 개시되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 전술된 화합물은 일반적으로 신경 또는 정신 상태를 주로 갖는 인간의 중추신경계 또는 말초신경계의 질환, 안 질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 콩팥 질환, 비뇨생식기 질환, 뼈 질환, 피부 질환, 위장관 질환 및 내분비 및 대사 이상을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 용도의 예로는 외상 및 뇌에 대한 염증으로부터 초래되는 손상(허열 뇌졸증(ischemic stroke), 둔기 외상(blunt trauma), 거미막밑 출혈(subarrachnoid hemorrhage)), 척수(허혈, 둔력 외상(blunt force trauma)), 말초 신경(좌골 신경 손상, 당뇨병성 신경병증, 손목굴 증후군(carpal tunnel syndrome)), 망막(황반 부종), 및 심장(심근 경색, 만성 심장 부전)에 대한 보호 및 상기 손상의 복구가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 특히, 이러한 질환, 장애 및 상태는 흥분성 조직, 예컨대 뇌, 심장 또는 망막/눈과 같은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직, 또는 심장 조직 또는 망막 조직의 흥분성 조직에 불리한 영향을 미치는 저산소증을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물은 다양한 조건 및 환경 하에서의 저산소 조건으로부터 야기되는 흥분성 조직의 손상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 조건 및 환경의 비제한적인 예가 하기 표에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료 및 예방 가능한 신경조직 병증의 보호의 예에서, 이러한 병증은 신경 조직의 감소된 산소화로 인해 야기된 것을 포함한다. 신경 조직에 대한 산소 이용률을 감소시키는 임의의 상태(이로 인해 스트레스 및 손상이 생기고, 최종적으로는 신경 세포가 사멸하게 됨)는 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료될 수 있다. 일반적으로 저산소증 및/또는 허혈로 지칭되는 이들 상태는, 뇌졸증, 혈관 폐색, 출산 전 또는 출산 후 산소 부족, 질식, 기도폐색, 거의 익사 상태, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술 및 방사선치료를 비롯한 외상, 질식(suffocation), 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄성 허파 질환, 허파 기종, 성인 호흡곤란 증후군, 고혈압 쇼크, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크(anaphylactic shock), 인슐린 쇼크, 낫적혈구 뇌졸증, 심장정지, 율동장애(dysrhythmia), 질소 마취, 및 심폐 회로술에 의해 야기된 신경 결핍으로부터 발생되거나 이러한 질환을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
하나의 실시양태에서는, 본 발명의 분석을 사용하여 동정되어 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물은, 단독으로 또는 조성물의 일부로서 투여되어서 수술 절차 또는 의료 절차 전, 도중 또는 이후에 상해 또는 조직 손상의 위험으로부터 야기되는 상해 또는 조직 손상을 예방한다. 예를 들면, 수술 절차는 종양 절제 또는 동맥류 치유를 포함할 수 있으며, 의료 절차는 화학치료를 포함하고, 자연 과정으로는 노동 또는 이동이 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료 가능한 저혈당증에 의해 야기되거나 발생되는 다른 병증으로는, 원인불명 고인슐린혈증으로도 지칭되는 인슐린 과다투여, 인슐린종, 성장 호르몬 결핍, 저코티솔혈증, 약물 과다투여 및 특정 암이 포함된다.
흥분성 신경 세포 손상으로부터 발생되는 다른 병증은 간질, 경련 또는 만성 발작 장애와 같은 발작 장애를 포함한다. 다른 치료 가능한 상태 및 질환은 뇌졸증, 다발성 경화증, 고혈압, 심장정지, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 연령-관련 인지 기능 상실, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 발작 장애, 알코올 중독, 망막 허혈, 녹내장으로 인한 시신경 손상 및 신경 손상과 같은 질환을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 특정 화합물을 사용하여 질환 상태 또는 다양한 외상으로부터 야기된 염증, 예컨대 물리적 또는 화학적으로 유도된 염증을 치료할 수 있다. 이러한 외상은 관염(angitis), 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 관자동맥염, 뇌염, 수막염, 횡단 척수염, 피부근육염, 다발근육염, 괴사 근막염, 간염 및 괴사 콩팥결장염을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 망막 조직의 상태 및 그에 대한 손상을 치료 또는 예방할 수 있다. 이러한 장애는 망막 허혈, 황반 변성, 망막 박리, 망막 색소변성, 동맥경화성 망막병증, 고혈압 망막변증, 망막 동맥 폐색, 망막 정맥 폐색, 저혈압 및 당뇨성 망막병증을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
다른 실시양태에서는, 본 발명의 방법 및 본 발명의 원리에 의해 동정된 화합물을 사용하여 흥분성 조직의 방사선 손상으로부터 야기되는 손상을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물의 추가 용도는 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌(Guam)병과 같은 신경독 중독, 근위축성 측삭 경화증 및 파킨슨병을 치료하는 것이다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 전술된 조직 보호 사이토카인을 말초혈관에 투여함으로써 포유동물에서 흥분성 조직 기능을 향상시키는데 사용하기 위한 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물에 관한 것이다. 다양한 질환 및 상태는 이 방법을 이용하여 치료할 수 있고, 또한 이 방법은 다른 상태 또는 질환이 없는 경우 인지 기능을 향상시키는데 유용한다. 본 발명의 이들 용도는 아래 더욱 상세하게 기재되고 있으며, 인간 및 인간 이외의 포유동물 모두의 학습 및 훈련 향상을 포함한다.
중추신경계와 관련된 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료될 수 있는 상태 및 질환은, 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 결핍 과다운동 장애 및 인지 장애를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 신경 세포 기능을 향상시키면 이들 상태에 유리하다. 본 발명의 교시에 따라 치료 가능한 다른 장애는 수면 방해, 예컨대 수면 무호흡증 및 여행-관련 질환; 거미막밑 및 동맥류 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕 손상, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 다양한 뇌염 및 수막염의 후유증 속발증, 예컨대 루푸스(lupus)와 같은 결합조직-관련 수막뇌염을 포함한다. 다른 용도는 신경 독소에 의한 중독, 예컨대 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 수술후 색전 또는 허혈 손상 치료; 전뇌 조사; 낫적혈구 발작; 및 자간의 예방 또는 보호를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 다른 질환 군은 선천성 또는 후천성 미토콘드리아 기능장애를 포함하며, 이는 신경 세포 손상 및 사멸로 대표되는 다양한 신경 질환의 원인이다. 예를 들면, 라이(Leigh)병(아급성 괴사뇌병증(subacute necrotizing encephalopathy))은 신경 결실로 인한 점진적인 시력 상실 및 뇌병증, 및 근육병증을 그 특징으로 한다. 이들 경우, 불완전한 미토콘드리아 대사는 흥분성 세포의 대사에 연료를 공급하기에 충분히 높은 에너지 기질을 공급하지 못한다. 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절제는 다양한 미토콘드리아 질환의 기능 상실을 최적화시킨다. 앞서 언급한 바와 같이, 저산소증은 흥분성 조직에 불리한 영향을 미친다. 흥분성 조직은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직 및 심장 조직을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 앞서 기재된 상태와 더불어, 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 기도 폐색 및 거의 익사 상태를 치료하는데 유용하다. 저산소 상태를 발생시키거나 또는 흥분성 조직 손상을 유도하는 다른 수단에 의한 다른 질환은 인슐린을 적절하게 투여하지 못할 경우 또는 인슐린-생성 종양(인슐린종)과 함께 발생될 수 있는 저혈당증을 포함한다.
흥분성 조직 손상으로부터 유래되는 것으로 생각되는 다양한 신경정신 장애는 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 치료할 수 있다. 신경 세포 손상이 포함되고 본 발명에 의해 치료 또는 예방되는 만성 장애는, 연령-관련 인지 기능 상실 및 노인성 치매, 만성 발작 장애, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절 경화증, 윌슨(Wilson's)병, 뇌성마비, 진행성 핵상마비, 괌병, 루이 소체(Lewy body) 치매, 해면 뇌병증과 같은 프리온(prion) 질환, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅톤병, 근육긴장 퇴행위축, 프리드리히 조화운동불능(Freidrich's ataxia) 및 다른 조화운동불능, 및 길 드 라 토렛(Gilles de la Tourette's) 증후군, 간질 및 만성 발작 장애와 같은 발작 장애, 중풍, 뇌 및 척수 외상, AIDS 치매, 알코올 중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면 장애와 같은 자율 기능 장애; 및 정신분열증, 정신분열정동장애, 주의력 결핍 장애, 과다운동, 기분저하 장애, 주요 우울 장애, 조증, 강박 장애, 정신작용 물질 사용 장애, 불안증, 공황 장애, 및 단극성 및 양극성 정동장애를 포함하지만 이에 국한되지 않는 신경정신병을 비롯한 중추신경계 및/또는 말초신경계과 관련된 질환을 포함한다. 추가의 신경정신병 및 신경퇴행성 장애는 예를 들어 미국 정신과 협회의 정신 질환 진단 통계 매뉴얼(American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders, DSM)에 열거된 것을 포함하며, 이들 매뉴얼의 가장 최근 버전이 본원에서 참고로 인용하고 있다.
다른 실시양태에서는, 에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 키메라 독소 분자는 증식성 질환(예: 암) 또는 바이러스성 질환(예: 아급성 경화 범뇌염)을 치료하기 위한 독소의 치료용 전달에 사용된 수 있다.
하기 표는 전술된 조직 보호 사이토카인에 의해 치료될 수 있는 다양한 상태 및 질환에 대한 추가의 예시적이고 비제한적인 지적사항을 열거한다.
세포, 조직 또는 기관 기능장애 또는 병증 상태 또는 질환 유형
심장 허혈 관상동맥 질환 급성, 만성, 안정성, 불안정성
심근경색 드레슬러(Dressler's) 증후군
협심증(angina)
선천성 심장병 판막 심근병증
프린즈메탈 협심증(Prinzmetal angina)
심장 파열 동맥류 사이막 구멍
관염
부정맥 빠른 부정맥, 느린 부정맥, 심실위, 심실 전도 이상 안정성, 불안정성과민 목동맥 굴 결절
선천성 심장기능 상실 좌심실, 우심실, 이심실, 심장수축, 확장 특발성 가족성, 감염성, 대사성, 저장 질환, 결핍, 결합조직 장애, 침윤 및 육아종, 신경혈관성 등의 심근병증
심근염 자가면역, 감염성, 특발성
폐심장증
둔기 위상 및 관통 외상
독성 코카인 독성
혈관 고혈압 원발성, 속발성
감압병
섬유근육과다형성
동맥류 박리, 파열, 확장
허파 폐색성 천식, 만성 기관지염, 기종 및 기도 폐색
허혈성 허파 질환 허파 색전증, 허파 혈전증, 지방 색전증
환경성 허파 질환
허혈성 허파 질환 허파 색전증허파 혈전증
간질 폐병 특발성 허파 섬유증
선천성 낭 섬유증
허파 심장증
외상
허파염 및 폐렴 감염성, 기생형, 독성, 외상성, 화상, 흡인
사르코이드(Sarcoidosis)
세포, 조직 또는 기관 기능장애 또는 병증 상태 또는 질환 유형
췌장 내분비 당뇨병, 유형 I 및 II 베타 세포 기능상실, 기능장애당뇨병성 신경병증
췌장의 다른 내분비 세포 기능상실
외분비 외분비 세포 기능상실 췌장염
뼈 골감소증 원발성속발성 생식샘 저하증부동화월경후연령-관련부갑상샘 항진증갑상샘 과다증칼슘, 마그네슘, 인 및/또는 비타민 D 결핍
골수염
무혈관 괴사
외상
파제트(Paget's)병
피부 탈모증 부분전체 원발성속발성남성형 대머리
백반증 국부전신 원발성속발성
당뇨병성 궤양
말초혈관 질환
화상 손상
자가면역 질환 홍반 루푸스,지오그렌(Sjiogren),류마티스성 관절염,사구체신염,관염
랑게르한스 조직구증
눈 시신경염
둔기 손상 및 관통상, 감염증, 사르코이드, 낫적혈구병, 망막 박리, 관자 동맥염
망막 허혈, 황반 변성, 망막 색소 변성, 동맥경화 망막병증, 고혈압성 망막병증, 망막 동맥 차단, 망막 정맥 차단, 저혈압, 당뇨병성 망막병증 및 황반 부종
배아 및 태아 질환 질식
허혈
세포, 조직 또는 기관 기능장애 또는 병증 상태 또는 질환 유형
CNS 만성 피로 증후군, 급성 및 만성 저삼투압 및 고삼투압 증후군, AIDS 치매, 감전사
뇌염 광견병, 헤르페스
수막염
경막하혈종
니코틴 탐닉
약물 남용 및 금단 상태 코카인, 헤로인, 크랙(crack), 마리화나, LSD, PCP, 복합 약물 남용, 엑스터시, 아편, 진정성 수면제, 암페타민, 카페인
강박 장애
척주관 협착증, 척수염, 길리안 바레(Guillian Barre), 외상, 신경뿌리 압박, 종양 압박, 열사병
ENT 이명뮤니에르(Meuniere's) 증후군청각 상실
외상성 손상,압력 손상
콩팥 신부전 급성, 만성 혈관/허혈성, 사이질 질환, 당뇨병성 콩팥 질환, 콩팥증후군, 감염증, 손상, 콘트라스트-유발, 화학요법-유발, CPB-유발 또는 예방
헤노흐 에스. 자색반(Henoch S. Purpura)
횡문근 자가면역 질환 중증 근무력증피부근육염다발 근육염
근육병증 유전 대사, 내분비 및 독성
열사병
압궤 손상
횡문근 용해
미토콘드리아 질환
감염증
세포, 조직 또는 기관 기능장애 또는 병증 상태 또는 질환 유형
성기능 장애 중추 및 말초(예: 발기 부전) 투약(당뇨병)에 수반되는 발기불능
간 간염 바이러스성, 세균성, 기생형
허혈성 질환
경화, 지방간
침윤성/대사성 질환
위장관 허혈성 장 질환
염증성 장 질환
괴사 소장 결장염
기관 이식 공여자와 수령자의 처치
생식계 불임 혈관자가면역자궁 이상이식 장애
내분비 샘 기능항진 및 기능저하
앞서 언급된 바와 같이, 이들 질환, 장애 또는 상태는 단지 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물에 의한 이점을 취할 수 있는 예시적인 범위일 뿐이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 기계적 외상의 결과 또는 인간 질환의 치료 또는 예방을 제공한다. CNS 및/또는 말초신경계의 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는 것이 바람직하다. 정신병적 요소가 있는 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방한다. 눈, 심혈관, 심폐, 호흡기, 콩팥, 비뇨기, 생식기, 소화관, 내분비 또는 대사적 요소가 있는 질환, 장애 또는 상태(이들로 한정되지는 않음)을 치료 또는 예방한다.
하나의 실시양태에서, 이들 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조정하는 화합물을 포함하는 약학 조성물은 전신 투여되어 표적 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향상시킬 수 있다. 이러한 투여는 비경구, 흡입 또는 점막 통과, 예컨대 경구, 비강, 직장, 질 내, 설하, 점막 하 또는 경피 투여일 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비경구, 예컨대 정맥 내 또는 복강 내 주사이고, 또한 동맥 내, 근육 내, 피부 내 및 피하 투여도 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
바람직한 유효 투여량의 선택은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 몇몇 인자들을 고려하여 숙련자가 쉽게 결정할 것이다. 이러한 인자는 에리트로포이에틴 및/또는 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물의 특정 형태, 및/또는 생체 내 이용률, 대사, 반감기 등과 같이 약동학적 파라미터(이는 약제 화합물의 규제 승인을 받는데 전형적으로 이용되는 통상적인 개발 과정 동안 얻어짐)를 포함한다. 투여 양을 고려하는데 있어서의 다른 인자는, 치료되는 상태 또는 질환, 또는 정상적인 개인에게서 얻어지는 이점, 환자의 체중, 투여 경로, 단기 또는 장기 투여 여부, 동시 투약, 및 투여되는 약제의 효능에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있는 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여 양은 표준 임상 기법에 따라, 개별 환자의 상태 및 면역 상태에 의존하는 각 환자의 환경 및 담당 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다.
본 발명은, 본 발명의 예로서 제공되는 하기 비제한적인 실시예를 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 더욱 자세히 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 광범위한 영역을 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
6.1. 실시예 1: 경쟁 EPO의 생체분석
아래 기술되는 경쟁적 결합 분석을 실시하여 카바밀화 EPO가 EPO-R에 결합하는지 여부를 측정하였다. EPO-R을 발현시키는 UT-7 세포를 이용하여 카바밀화 EPO가 EPO-R에 대한 rhEPO의 결합을 경쟁적으로 억제하는지 여부를 측정하였다. EPO-R에 대한 rhEPO의 결합에서, 세포는 증식을 나타냈다. 증식의 억제는 경쟁적 결합의 지표이다.
방법
경쟁적 결합 분석을 위해, 에리트로류케믹 UT-7 세포[고마츠(Komatsu, N.) 등의 문헌 "1991, Cancer Res., 51:341-8"]를 DSMZ(Braunschweig, Germany, ACC137)로부터 입수하였다. 카바밀화 EPO 및 rhEPO의 분석을 48시간에 걸쳐 레베크(Leveque) 등의 문헌 [1996, Hematol Oncol 14:137-46]에 기술된 바와 같이 수행하였다. WST-1 환원(Roche #1 644 807)을 사용하여 살아 있는 세포를 정량화시켰다. 분석의 소음 비율에 대한 신호는 8 내지 15이었으며, 농도 반응 곡선으로부터 6개 이상의 약물 농도를 사용하여 4개의 파라미터 정합(fit)에 의해 카바밀화 EPO 및 rhEPO의 최대 효과의 1/2 농도를 측정하였다. 이 특정 분석에서, 분석을 rhEPO, 그 다음 개별적으로 카바밀화 EPO를 사용하여 수행한 후, 이어서 rhEPO 및 카바밀화 EPO 모두를 사용하여 수행하였다.
결과에서는, 세포 증식은 rhEPO를 투여하는 경우 및 카바밀화 EPO 및 rhEPO 모두를 분석에 사용하는 경우 각각 0.6배 및 1.7배 높은 것으로 나타난다. 카바밀화 EPO 단독으로는 증가된 농도를 사용하는 경우에도 세포 증식에 대한 어떠한 효과도 입증되지 못했다.
도 1은, y축 상의 세포 증식에 대해 x축 상에 시험 화합물(rhEPO 및 카바밀화 EPO)의 농도를 플로팅하여 나타낸다. 도 1은, 카바밀화 EPO 및 rhEPO 모두를 사용하는 경쟁적 분석에서 세포 증식의 감소를 나타내지 않았기 때문에, 카바밀화 EPO의 존재가 분석 중에 UT-7 세포의 증식을 자극하려는 rhEPO의 능력에 대해 영향을 미치지 않음을 분명하게 나타낸다.
이들 결과는 카바밀화 EPO가 UT-7 세포 상에 존재하는 원래의 EPO-R 이량체 복합체에 결합하지 않는 것을 암시한다.
6.2. 실시예 2: 래트 뇌막의 웨스턴 블로팅
래트 뇌 세포는 EPO에 대해 반응적인 것으로 제시되어 있다. 래트 뇌 세포의 막 단백질을 단리시켜 이들 EPO 응답 세포가 βc 수용체 또는 IL-3 특정 수용체 성분과 관련된 βc 수용체를 발현시키는지 여부를 측정하였다.
방법
하기 프로토콜을 사용하여 래트 막 단백질을 단리시켰다. 래트 뇌를 프로테아제 억제제를 함유하는 PBS(25㎍/㎖ 류펩틴(Leupeptin)(원액 중 5㎎/㎖), 10㎍/㎖ 아프로틴(Aprotin)(원액 중 1㎎/㎖), 1mM PMSF(원액 중 100mM) 중에서 20회 균질화시켰다. 그 다음, 균질화된 조직을 4℃에서 5분 동안 3,800rpm에서 원심분리시켰다. 그 다음, 상청액을 수거하고, 4℃에서 30분 동안 14,000rpm에서 추가로 원심분리시켰다. 그 다음, 이로부터 생성된 펠릿을 원심분리시킨 후, 프로테아제 억제제 및 1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중에서 균질화시킨다. 그 다음, 이 균질화물을 4℃에서 30분 동안 14,000rpm에서 추가로 원심분리시켰다. 생성된 상청액은 막 단백질을 함유한다.
그 다음, 막 단백질을 겔 전기영동에 의해 분리시켰다. 막 단백질을 4℃에서 1X 카세인(Vector 10X Casein Soln., Cat#: SP-5020)으로 밤새도록 블로킹시켰다. 벡터 애비딘/바이오틴 블로킹 키트(Vector Avidin/Biotin Blocking Kit)(Cat #: SP-2001)를 사용하여 애비딘 및 바이오틴 블록이 발생되었다. 20분 동안 1X PBS-0.1% Tween-20/1X Casein 10㎖당 애비딘 2 방울 첨가하고, 블록을 간단하게 헹군 후, 10분 동안 1X PBS-0.1% Tween-20/1X Casein으로 블록을 세척함으로써 애비딘 블록이 생성된다. 유사한 방식으로, 20분 동안 1X PBS-0.1% Tween-20/1X Casein 10㎖당 바이오틴 2 방울 첨가하고, 블록을 간단하게 헹군 후, 10분 동안 1X PBS-0.1% Tween-20/1X Casein으로 블록을 세척함으로써 바이오틴 블록이 생성된다. 주요 항체[Common Unit K-17(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이트(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)), 1:200 희석]를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 10분 동안 1X PBS-0.1% Tween -20/1X Casein으로 각각 4회 세척하였다. 실온에서 1시간 동안, 1:1000 희석(1X PBS-0.1% Tween-20/1X Casein 60㎖ 중 1 방울)에서 VECTASTAIN ABC kit(Peroxidase Rabbit IgG, Cat#: PK-4001)로부터의 제 2 항온처리를 수행하였다. 그 다음, 1X PBS-0.1% Tween-20으로 각각 10분 동안 3회 세척하였다. 세척하는 동안, AB 시약을 1X PBS-0.1% Tween-20 중에서 제조하였다: 1X PBS-0.1% Tween-20 10㎖ 내로의 키트의 시약 A 2 방울을 잘 혼합하고, 시약 B 2 방울을 잘 혼합하고, 실온에서 30분 동안 항온처리하여 복합체를 형성시켰다. 그 다음, 막을 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 1X PBS-0.1% Tween-20로 각각 10분 동안 3회 세척하였다. 증류수 중의 Vector Peroxidase Substrate Kit DAB로부터의 기질 용액[Buffer Stock Solution 2 방울을 증류수 10㎖에 첨가하고, 혼합하고, DAB Stock Solution 4 방울을 혼합하고, Hydrogen Peroxide Solution 2 방울을 혼합함]을 블롯(blot)에 첨가하기 직전에 제조하였다. 그 다음, 기질과의 블롯을 10분 동안 또는 색 전개가 발생될 때까지 실온에서 항온처리하였다. 그 다음, 블롯을 증류수 2회 바꿔 세척하였다. 이 절차를, IL-3 특정 서브유닛을 위한 주유 항체(T-20, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이트)를 사용하여 다시 반복 실시하였다.
결과에서는 βc 수용체 또는 IL-3 특정 수용체 성분과 관련된 βc 수용체가 래트 뇌 세포 막 내에서 모두 동정되는 것으로 나타났다.
도 2는 분리된 막 단백질의 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 도시한다. 제 1 겔은 βc 수용체에 해당하는 130KD 단백질을 나타낸다. 제 2 겔은 IL-3 수용체 성분에 특이적인 βc 수용체에 해당하는 70KD 단백질을 나타낸다. 결과는 에리트로포이에틴-응답 세포(뇌)에서 βc 수용체(130KD에서의 대역)의 존재를 분명하게 입증한다. 이 발견은 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 뇌 세포 막 내에서 형성될 수 있음을 암시하는데, 이는 상기 막 내에 EPO 수용체 및 βc 수용체 모두가 존재하기 때문이다.
6.3. 실시예 3: 래트 척수 내의 β c 수용체에 대한 면역조직화학
βc 수용체의 존재에 대한 시험을 위해 래트 척수 섹션을 염색하였다.
방법
래트의 척수를 제거하고 파라핀 중에 고정시켰다. 그 다음, 매립된 조직을 절개하였다(6um). 그 다음, 안티-βc 수용체 항체(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이트)를 사용하여 척수의 섹션을 염색하였다.
도 3은 안티-βc 수용체 항체를 사용하여 βc 수용체에 대한 절개된 척수의 사진을 도시한다. 염색은 βc 수용체가 척수 내에 존재한다는 것을 나타낸다.
도 4는 안티-βc 수용체 항체와의 반응성을 입증하는 절개된 척수의 염색 영역의 확대 사진을 도시한다.
이 발견은 척수 조직 내의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 존재를 암시하는데, 이는 βc 수용체 및 EPO 수용체가 이들 조직 내에 존재하기 때문이다.
6.4. 실시예 4: EPO-R과 β c 수용체의 관계
EPO 수용체 및 βc 수용체가 세포 내에서 서로 관련되어 있는지 여부를 측정하기 위해, 수용체 항체를 사용하여 수용체 모두를 발현시키는 세포로부터의 복합체를 동시 침전시켰다. 폴리아크릴아마이드 겔 상의 전기영동에 의해 P-19 세포로부터의 막 단백질을 분리시키고, EPO 수용체 및 βc 수용체를 염색시키기 위해 웨스턴 블로팅을 실시하였다.
방법
주빈스키(Jubinsky) 등의 문헌 [1997, (Blood 90:1867-1873)]에 개략적으로 설명된 프로토콜을 사용하여, P-19 세포, 중성-유사 배아 암종 세포로부터의 EPO 수용체 및 βc 수용체의 면역침전(immunoprecipitation)을 실시하였다. 앞서 섹션 6.3에서 기술된 바와 같이 수용체에 특이적인 항체를 사용하였다. 그 다음, 면역침전물을 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 진행시키고, 웨스턴 블로팅에 의해 전달시키고, EPO 수용체 및 βc 수용체에 특이적인 항체를 사용하여 염색시켰다.
도 5는 EPO 수용체 및 βc 수용체 항체와 동시에 면역침전된 샘플의 웨스턴 블로팅을 나타낸다. 제 1 레인은 βc 수용체 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅(상부) 및 EPO 수용체를 사용하는 웨스턴 블로팅(하부)에 대해 EPO의 부재 하에 EPO-R의 면역침전의 결과를 나타내는 것이다. βc 수용체를 나타내는 대역이 겔 상에서 분명하게 관찰될 수 있다(적절한 대역을 가리키는 화살표, 상부). βc 수용체 항체로 염색된 상부 겔 상의 화살표는 EPO 수용체가 샘플 내에 존재하는 경우 이동되는 위치를 나타낸다. 제 2 레인은 βc 수용체 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅(상부) 및 EPO 수용체를 사용하는 웨스턴 블로팅(하부)에 대해 EPO의 존재 하에 EPO-R의 면역침전의 결과를 나타내는 것이다. 제 3 레인은 역면역침전을 나타내며, 대역(하부)은 βc 수용체 항체를 사용하여 면역침전된 샘플 내의 EPO-R의 존재를 나타낸다. EPO-R 항체로 염색된 하부 겔 상의 제 1 화살표는 뉴클레올린으로서 동정되는 약 103KD에서의 대역을 가리킨다(하기 실시예 10 참조). EPO-R 항체로 염색된 하부 겔 상의 제 2 화살표는 EPO 수용체로서 동정되는 약 68KD에서의 대역을 가리킨다(하기 실시예 10 참조).
결과는 EPO-R 및 βc 수용체가 이들 모두가 발형되는 세포 내에서 복합체를 형성한다는 것을 암시한다. 최종적으로, 복합체는 EPO 자체가 존재하든 존재하지 않든 상관없이 형성되며(제 1 레인과 제 2 레인을 비교함), 이는 EPO가 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 형성에 필수적이지 않음을 암시한다.
6.5. 실시예 5: β c 수용체의 존재 또는 부재 하의 심근 세포에서의 세포자멸
정상 마우스로부터의 야생형 심근 세포에서 및 βc 쇄 넉-아웃(-/-) 마우스로부터 심근 세포에서, 심근 세포에서의 세포자멸을 유도하여 βc 수용체가 세포자멸을 방지 또는 지연시키는데 있어 세포 상의 EPO의 보호 활성에서의 역할을 담당하는지를 측정하였다.
방법
피오르달리소(Fiordaliso) 등의 문헌 "2001, Diabetes 50:2363-2375"에 기술된 바와 같이, 야생형 또는 염색 매칭된 통상의 베타 체인 넉-아웃 βc (-/-) 마우스[로브(Robb) 등의 문헌 "1995, P.N.A.S. U.S.A. 92:9565-9569"]로부터 심근 세포를 단리시켰다. 에리트로포이에틴(100ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 스타우로스포린(시그마, 0.1μM) 중에 항온처리함으로써 세포자멸 세포 사멸을 유도시켰다. 야생형 및 βc (-/-) 심근 세포는 세포자멸이 유도되지 않은 대조군(도 7의 칼럼 1 및 2)으로서 제공하였다. 야생형 및 βc (-/-) 심근 세포(도 7의 칼럼 3 및 4)에서, EPO 또는 카바밀화 EPO 존재 하의 야생형 심근 세포(도 7의 칼럼 5 및 6), 및 EPO 존재 하의 βc (-/-) 심근 세포(도 7의 칼럼 7)에서, 세포자멸을 유도하였다.
16시간 동안 항온처리한 후, 세포들을 고정시키고, TUNEL(Roche Diagnostics)을 사용하여 분절된 DNA의 동일 반응계 검출을 위해 처리하였다.
결과를 도 7에 제시하며, 이는 EPO의 존재 및 부재 하에 정상 및 βc 수용체 넉-아웃 마우스로부터 단리된 심근 세포에서의 세포자멸(%)(y축)를 나타낸다(칼럼 3 내지 7). EPO의 존재 하에 세포자멸이 유도되는 βc (-/-) 심근 세포에 대한 세포자멸(%)(칼럼 7)는, EPO의 부재 하에서 야생형 및 βc (-/-) 심근 세포에서의 세포자멸(%)과 유의적으로 다르지 않았다(칼럼 3 및 4 참조).
결과는 EPO의 조직 보호 활성이 이들 세포 내의 βc 수용체의 존재에 의존적임을 암시한다.
6.6. 실시예 6: EPO 수용체를 통한 다운스트림 키나아제 활성
여러 농도의 EPO 및 카바밀화 EPO가 EPO 수용체를 발현시키는 세포 내의 다운스트림 키나아제 활성을 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, EPO 및 카바밀화 EPO의 존재 하에 활성화 키나아제, 포스포릴화 Jak2의 존재에 대해 EPO 수용체 발현 세포를 시험하였다.
방법
여러 농도에서 EPO 및 카바밀화 EPO를 사용하여 BaF/3/EPOR 세포를 10분 동안 자극시켰다. 항체 인지 티로신-포스포릴화 Jak2(PY-Jak2)를 사용하여 세포 용해물의 웨스턴 블로팅에 의해 Jak2의 활성화를 분석하였다. 막을 스트리핑하고, Jak2에 대한 항체로 다시 프로빙하여 동일 하중을 확인하였다.
도 8은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리되고 PY-Jak2 항체를 사용하여 염색된 세포 단백질의 웨스턴 블로팅을 나타낸다. 상부는 포스포릴화 Jak2가 5nM 및 50nM에서 EPO로 자극된 세포 내에 존재한다는 것을 나타낸다.
결과는 카바밀화 EPO가 EPO 수용체를 발현시키는 세포 내의 원래의 EPO 수용체 동종이량체(homodimer)의 다운스트림 활성화를 유도할 수 없음을 암시한다. 이는 카바밀화 EPO가 원래의 EPO 수용체 동종이량체에 결합하지 않음을 암시한다.
6.7. 실시예 7: BAF3/EPOR 세포-결합 분석
EPO 수용체를 발현시키는 세포가 EPO 및 카바밀화 EPO를 결합시키는지 여부를 측정하기 위해, BaF3 세포를 각각의 리간드와 접촉시키고, 결합 친화도를 경쟁적 결합 분석에서 측정하였다.
방법
0.1nM 125-I EPO 및 등급화 투여량의 비표지화된 EPO, 및 카바밀화 EPO를 각각 106개 웰 내에 PBS 중에서 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 막을 필터 상에서 세척하고, 감마카운터(gammacounter)에서 막 결합된 125-I EPO에 대해 계수하였다. 방사선리간드의 수용체 결합된 단편을 등급화 투여량의 비표지화된 리간드에 대한 결합된 125-I EPO로서 플로팅하였다.
도 9는 EPO 수용체를 발현시키는 BaF3 세포에 대한 리간드 결합 친화도의 그래프를 도시한다. EPO 수용체 리간드 EPO 및 카바밀화 EPO와 접촉하는 BaF3 EPO 수용체 발현 세포에 대한 결합(cpm)(y축)에 대해 리간드 농도(nM)(x축)를 플로팅하였다.
BaF3/EPO-R 세포는 EPO를 약 1nM의 친화도로 결합시키는 반면, 카바밀화 EPO 결합은 전혀 검출할 수 없었다. 결과에서는 카바밀화 EPO가 EPO 수용체를 발현시키는 세포에 대한 EPO의 결합을 경쟁적으로 억제시키지 않는 것으로 나타난다.
6.8. 실시예 8: UT-7 막 분석
원래의 EPO 수용체 이량체를 발현시키는 세포가 EPO 및 카바밀화 EPO를 결합시키는지 여부를 측정하기 위해, UT-7 세포 막을 각각의 리간드와 접촉시키고, 결합 친화도를 경쟁적 결합 분석에서 측정하였다.
방법
UT-7 막 100㎎을 200ul PBS 중 실온에서 30분 동안 0.1nM 125I EPO 및 등급화 투여량의 비표지화된 EPO, 및 카바밀화 EPO와 함께 항온처리하였다. 막을 필터 상에서 세척하고, 감마카운터에서 막 결합된 125I EPO에 대해 계수하였다. 방사선리간드의 수용체 결합된 단편을 등급화 투여량의 비표지화된 리간드에 대한 결합된 125I EPO로서 플로팅하였다.
UT-7 막은 EPO를 0.1 내지 0.5nM의 친화도로 결합시킨다. 반면, 카바밀화 EPO 결합은 전혀 검출되지 않았다.
도 10은 EPO 수용체를 갖는 UT-7 세포에 대한 리간드 결합 친화도의 그래프를 도시한다. EPO 수용체 리간드 EPO 및 카바밀화 EPO와 접촉하는 UT-7 EPO 수용체 발현 세포 막에 대한 결합(cpm)(y축)에 대해 리간드 농도(nM)(x축)를 플로팅하였다.
결과에서는 카바밀화 EPO가 원래의 EPO 수용체 이량체 모두를 발현시키는 세포에 대한 EPO의 결합을 경쟁적으로 억제시키지 않는 것으로 나타난다.
6.9. 실시예 9: 적혈구 용적률 및 헤모글로빈 농도
카바밀화 EPO 또는 아시알로EPO가 동일한 에리트로포이에틴 능력, 즉 증가된 적혈구 용적률 및 증가된 헤모글로빈(EPO로서)을 갖는지 여부를 측정하기 위해, 마우스를 EPO 및 개질된 EPO를 투여하였다.
방법
EPO, 카바밀화 EPO 및 아시알로EPO 50㎍/㎏을 4주 동안 매주 5회 마우스에 정맥 내 주사하였다. 아이소플루레인 마취 하에 안와후총(retroorbital plexus)으로부터 뺀 혈액(<50㎕)을 사용하는 혈색소계(hemoglobinometer)에 의해 혈청 헤모글로빈 농도 및 적혈구 용적률을 측정하였다.
도 11은, 대조군(비히클), EPO, 카바밀화 EPO 및 아시알로EPO(x축)의 투여 후의 마우스에서, 적혈구 용적률의 부피(%)에 의해 측정된 적혈구 용적률 수준(11A), 및 농도(mM)로 측정된 헤모글로빈 수준(11B)의 막대그래프를 도시한다.
결과에서는 마우스에 투여된 카바밀화 EPO 및 아시알로EPO가 EPO를 투여한 마우스에게 나타나는 증가된 적혈구 용적률 및 헤모글로빈을 유도하지 못하는 것으로 나타난다. 이는 카바밀화 EPO 및 아시알로EPO가 EPO에 비해 생체 내에서 세포와 상이하게 상호작용함을 암시한다. 상기 결합 분석의 실험 결과와 조합해 보면, 이들 결과는 카바밀화 EPO 및 아시알로EPO가 EPO 수용체를 결합시키지 않으며, 이로 인해 EPO의 에리트로포이에틴 활성에 영향을 미칠 수 없음을 확인시킨다.
6.10. 실시예 10: 뉴클레올린의 존재에 대한 검출
실시예 4에서 기술된 웨스턴 블로팅 및 βc 수용체 항체를 사용하는 침전을 추가로 분석하였다. 특히, 도 5의 제 1 레인(상부)에 제시된 103KD 대역에 해당하는 단백질을, 샘플 내에 침전된 다른 단백질의 정체를 측정하기 위해 추가로 분석하였다.
방법
완전 배지 내에 70% 합류가 되도록 P-19 세포를 성장시켰다. 이들을 15분 동안 10ng/㎖ EPO 또는 염수(C)로 처리한 후, 플라스크 상에서 태핑함으로써 탈착시키고, 700rpm에서 7분 동안 스피닝시키고, 용해 완충액(프로테아제 억제제를 갖는 TBS, 2mM CaCl, 1% 트리톤 및 1% NP40) 중에 재현탁시켜 1㎎ 단백질/㎖의 최종 농도를 수득하였다. CaCl이 용해 완충액 중에 존재하며, 동결 또는 와동되는 것을 방지하여 단백질 상호작용을 유지시켰다. 120000rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 파편을 제거한 후, 용해물을 실온에서 1시간 동안 단백질 A 세파로제(파마시아, 10㎕ 배수된 겔/㎖)로 항온처리하여 미특이적 결합을 제거하였다.
그 다음, 상청액을 1시간 동안 이전에 항체에 커플링된 단백질 A 세파로제(10㎕ 겔/㎖)로 항온처리하고, 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 베타 공통 쇄(K17, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 대한 항체, 또는 EPO-R(M20 및 h194, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 대한 2개의 항체들의 혼합물을 1:200의 최종 희석으로 사용하고, 4℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 그 다음, 단백질 A 세파로제 비이드를 낮은 세제 용해 완충액(0.5% 트리톤을 사용하고 NP40을 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일함)으로 5회 세척하고, 결합된 단백질을 2×라엠믈리(Laemmli) 샘플 완충액 30㎕를 5% 베타-머캅토에탄올과 함께 첨가함으로써 분해시키고, 10% SDS-PAGE 상에서 진행시켰다.
103kD 대역을 쿠마시에(Coomassie) 청색으로 염색된 겔로부터 절개하고, 25mM 암모늄 바이카보네이트/40% 에탄올 중에 수시간 동안 제거하고, 점차 증가하는 %의 아세토나이트릴로 세척하였다. 단백질을 25mM 암모늄 바이카보네이트/10% 아세토나이트릴 용액 중에 12ng/㎖의 농도에서 트립신(프로메가, 위스콘신주 매디손 소재)으로 30℃에서 밤새도록 겔-소화시켰다. 펩타이드 질량 지문(Peptide mass fingerprinting)(PMF)을 매트릭스로서 a-사이아노-4-하이드록시신남산(브루커 달토닉스 빌레리카(Bruker Daltonics Billerica), 메사추세츠주 소재)을 사용하는 Bruker ReflexIIITM 매트릭스-조력 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광계 상에서 실시하였다. 1000 내지 3000Da의 범위에서 질량 스펙트럼을 외부에서 7개의 표준 펩타이드들의 혼합물로 눈금조정하였다. 생성된 데이터에 대해 프로그램으로서 Mascot (http://www.matrixscience.com) 및 Profound (http://prowl.rockefeller.edu/)를 사용하여 데이터베이스(NCBInr)를 검색하였으며, 이로 인해 1 이하의 누락된 트립신 분할 및 ±0.2Da의 질량 공차가 허용되었다. 질량 분광계를 사용하여 뉴클레올린의 정보를 측정하였다.
결과에서는, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 형성하는 EPO 수용체 및 βc 수용체를 발현하는 P19 세포가, EPO의 투여에 대한 응답으로 뉴클레올린이 생성된다는 것을 암시한다. 도 12는 원형의 103KD 뉴클레올린 단백질을 이용한 SDS-PAGE 겔의 사진을 나타낸 것이다.
6.11. 실시예 11: β c 수용체 넉-아웃 마우스에서의 척수 손상
βc 넉-아웃 마우스로부터 심근 세포에서의 상기 결과를 추가로 연구하고 βc 수용체가 척수 손상 이후에 EPO의 보호 활성에서 역할을 담당하는지 여부를 측정하기 위해, 척수 손상을 βc 쇄 넉-아웃 (-/-) 마우스 및 정상(야생형) 마우스에서 유도하였다.
방법
Farooque(2000, Acta Neuropathol (Berl) 100:13-22)의 변형된 프로토콜을 사용하여 마우스에서 척수 손상을 수행하였다. 상기 기술은 손상된 흥분성 세포, 조직 및 기관의 치료를 시험하는데 사용되는 동물 모델을 EPO 및 카바밀화 EPO를 사용하여 만들었다. 구체적으로, 생후 8 내지 16주인 C57/b16(야생형) 또는 βc 수용체 넉-아웃(무표지(null)) 마우스를 사용하였다. 꼬리로부터 얻은 DNA의 PCR 분석에 의해 각각의 동물이 무표지임을 확인하였다. 4 내지 9마리 마우스를 각각 포함하는 마우스의 5개 군에서 척수 손상을 가하였다. 야생형 마우스 2개 군 및 무표지 마우스의 3개 군. 척수 손상 동안, 아이소플루레인으로 동물을 마취시키고, 정상 코어 온도를 유지시켰다. 추궁절제술(laminectomy)을 T3에서 실시하고, 2㎜ 스테인레스 스틸 막대를 4분 동안 15g의 힘으로 경질막(dura)에 적용한 후, 제거하였다.
손상시킨 후 곧바로, 단일 투여량의 카바밀화 EPO를 무표지 마우스의 제 1 군에 투여하고, 단일 투여량의 EPO를 무표지 마우스의 제 2 군에 투여하고, PBS를 무표지 마우스의 제 3 군에 대조군으로 투여하고, 단일 투여량의 카바밀화 EPO를 야생형 마우스의 제 1 군에 투여하고, 단일 투여량의 PBS를 야생형 마우스의 제 2 군에 투여하였다.
그 다음, 바소(Basso) 등의 문헌 (1995, J. Neurotrauma 12:1-21)의 등급 시스템을 사용하여 42일 동안 동물을 평가하였다. Basso, Beattie, Bresnahan(BBB) 등급은, 척수 손상 후 기능 회복을 측정하는데 통상적으로 사용되는 정상적인 체제적 운동성 이동(overground motor locomotion)을 시험하기 위한 21-지점 등급이다. BBB 점수는 정밀한 운동 결손을 검출하는데 매우 민감하며, 또한 척수 손상 후 회복 정도를 평가한다. BBB 운동 점수를 모든 군의 동물에 대해 손상 후 일수에 대해 플로팅시켰다. 그 다음, 손상 후 일수에 대해 BBB의 플롯의 곡선(AUC) 하의 면적을 측정함으로써 임상적 위중성을 계산하였다. 마우스 군 중 임상적 위중도 값을 차이에 대해 통계학적으로 분석하고, 각 군에 대한 임상적 위중도 값을 나타내는 막대 그래프를 만들었다.
결과에서는 심근 세포 내의 것이 확인되며, EPO의 조직 보호 활성이 동물 내의 βc 수용체의 존재에 의존한다는 것을 암시한다. 결과를 도 13에 제시하며, 이는 손상 후 날짜에서의 시간(x축)에 대한 BBB 운동 점수(y축)를 나타낸다. 카바밀화 EPO가 투여된 마우스의 야생형 군은 손상 후 42시간에 걸쳐 기타 모든 군에 비해 더욱 증가된 운동 점수를 나타냈다. 결과를 도 14에 제시하며, 이는 곡선 하 면적(AUC)에서 측정된 임상적 위중도(y축) 및 마우스 군(x축)을 나타낸다. 카바밀화 EPO가 투여된 마우스의 야생형 군(칼럼 1)은 기타 모든 군(칼럼 2 내지 5)에 비해 임상적 위중도 값에서 유의적인 증가(즉, 덜 위중함)를 나타냈다. EPO를 투여한 무표지 마우스 군(칼럼 5)은 기타 모든 군에 비해 매우 높은 치사율을 나타냈다. 결과는, βc 수용체가 손상의 치료에서 EPO의 치료적 이점을 달성하는데 필요하다는 것을 암시한다.
본 발명은 본 발명의 개별적인 양태의 하나의 설명으로 의도되어 기술된 특정 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 조성물이 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 사실상, 당해 분야의 숙련자에게는 본원에 제시 및 기술된 것뿐만 아니라 본 발명의 여러 변형들이 상기 기술 및 첨부 도면으로부터 더욱 명백해질 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구의 범위 내에 포함하도록 의도된다.
본원에 인용하는 모든 참고문헌은 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The Kenneth Warren Institute, Inc. <120> TISSUE PROTECTIVE CYTOKINE RECEPTOR COMPLEX, ASSAYS FOR IDENTIFYING TISSUE PROTECTIVE COMPOUNDS AND USES THEREOF <130> 10165-028-228 <140> <141> <150> 10/676,694 <151> 2003-09-30 <150> 60/465,891 <151> 2003-04-25 <160> 212 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Gln Arg Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Phe Leu Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutein <400> 5 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile 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Ala Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 117 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutein <400> 117 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Lys Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 118 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutein <400> 118 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser 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cagagtggtg aggctctcaa ggccactgac gg 32 <210> 126 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 126 cgcagcctca ccacttcgct tcgggctctg g 31 <210> 127 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 127 ccagagcccg aagcgaagtg gtgaggctgc g 31 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 128 gaatatcact gtcccagacg gtggtgcctg gaagaggatg 40 <210> 129 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 129 catcctcttc caggcaccac cgtctgggac agtgatattc 40 <210> 130 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 130 tacctcttgg aggccgcgga ggccgagaat atc 33 <210> 131 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 131 gatattctcg gcctccgcgg cctccaagag gta 33 <210> 132 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 132 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 133 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 133 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 134 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 134 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 135 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 135 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 136 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 136 ctccggggaa agctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 137 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 137 tcccctgtgt acagcgccag ctttccccgg ag 32 <210> 138 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 138 actgtcccag acaccgcagt 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of Artificial Sequence: primer <400> 145 aggggagatg gcttccgcct gggctcccag ag 32 <210> 146 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 146 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 147 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 147 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 148 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 148 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 149 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 149 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 150 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 150 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 151 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 151 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 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Sequence: primer <400> 158 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 159 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 159 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 160 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 160 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 161 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 161 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 162 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 162 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 163 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 163 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 164 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 164 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 165 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 165 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 166 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 166 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 167 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 167 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 168 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 168 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 169 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 169 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 170 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 170 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 171 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 171 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 172 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 172 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 173 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 173 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 174 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 174 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 175 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 175 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 176 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 176 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 177 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 177 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 178 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 178 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 179 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 179 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 180 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 180 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 181 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 181 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 182 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 182 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 183 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 183 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 184 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 184 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 185 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 185 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 186 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 186 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 187 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 187 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 188 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 188 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 189 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 189 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 190 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 190 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 191 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 191 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 192 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 192 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 193 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 193 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 194 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 194 ctccggggag cgctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 195 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 195 tcccctgtgt acagcgccag cgctccccgg ag 32 <210> 196 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 196 caaggaggcc gagaaaatca cgacgggctg t 31 <210> 197 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 197 acagcccgtc gtgattttct cggcctcctt g 31 <210> 198 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 198 actgcagctt gaatgagaaa atcactgtcc cagacac 37 <210> 199 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 199 gtgtctggga cagtgatttt ctcattcaag ctgcagt 37 <210> 200 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 200 aggccctgtt ggtcaaatct tcccagccgt g 31 <210> 201 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 201 cacggctggg aagatttgac caacagggcc t 31 <210> 202 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 202 atttcctccg gggatggctg aagctgtaca cag 33 <210> 203 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 203 ctgtgtacag cttcagccat ccccggagga aat 33 <210> 204 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 204 agccgagtcc tggaggcggc cctcttggag gccaa 35 <210> 205 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 205 ttggcctcca agagggccgc ctccaggact cggct 35 <210> 206 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 206 agccgagtcc tggagagggc cctcttggag gccaa 35 <210> 207 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 207 ttggcctcca agagggccct ctccaggact cggct 35 <210> 208 <211> 6059 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid <400> 208 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat 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taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 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cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 210 <211> 6059 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid <400> 210 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 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gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059

Claims (83)

  1. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉시키고,
    (b) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 측정하고,
    (c) 상기 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준과 비교하여, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하고,
    (d) 조직 보호 활성에 대해 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을, 시험 화합물과 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합도를 측정함으로써 측정하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    시험 화합물을 표지화하고, 상기 표지화된 시험 화합물과 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합을 시험 화합물에 부착된 표지를 검출함으로써 측정하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을, 시험 화합물과 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합도를 측정함으로써 측정하는 방법.
  5. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-발현 세포와 접촉시키고,
    (b) 세포 내의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 측정하고,
    (c) 상기 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준과 비교하여, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하고,
    (d) 조직 보호 활성에 대해 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 세포 증식 분석에 의해 측정하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    하나 이상의 EPO 수용체 또는 β 공통 수용체를 발현하도록 유전자 재조합에 의해 세포를 조작하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    세포가 EPO 수용체를 내생적으로 발현시키며,
    (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고 (ⅱ) β 공통 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된 핵산으로 형질전환시키는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    세포가 β 공통 수용체를 내생적으로 발현시키며,
    (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고 (ⅱ) EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된 핵산으로 형질전환시키는 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 서열을 세포와 동일한 종으로부터 유도하는 방법.
  11. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을 EPO 수용체를 발현하도록 재조합에 의해 조작된 세포와 접촉시키되, 상기 세포는 (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) β 공통 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되고,
    (b) 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 수준을 측정하고,
    (c) 대조군 세포에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성에 비하여 상기 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하되, 상기 대조군 세포는 상기 시험 화합물과 접촉하는 세포와 동일한 세포 유형이고, (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) β 공통 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되지 않으며,
    (d) 조직 보호 활성에 대해 상기 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  12. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을 β 공통 수용체를 발현하도록 재조합에 의해 조작된 세포와 접촉시키되, 상기 세포는 (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) EPO 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되고,
    (b) 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 수준을 측정하고,
    (c) 대조군 세포에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성에 비하여 상기 세포 내에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성의 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하되, 상기 대조군 세포는 상기 시험 화합물과 접촉하는 세포와 동일한 세포 유형이고, (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결되고, (ⅱ) β 공통 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환되지 않으며,
    (d) 조직 보호 활성에 대해 상기 동정된 시험 화합물을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  13. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-발현 세포와 접촉시키되, 상기 세포가 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성과 관련된 조절 요소에 작동적으로 연결된 리포터(reporter) 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 것이고,
    (b) 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 리포터 유전자 발현 수준에 비하여 리포터 유전자 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 시험 화합물을 동정하고,
    (c) 상기 동정된 시험 화합물의 조직 보호 활성을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    조절 요소가 혈청 응답 요소인 방법.
  15. 조직 보호 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을, (ⅰ) 전사 활성인자의 DNA 결합 도메인에 특이적인 결합 부위에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 포함하는 핵산 서열, (ⅱ) (A) 상기 전사 활성인자의 DNA 결합 도메인, 및 (B) 제 1 조직 보호 사이토카인 수용체 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 포함하는 제 1 융합 단백질, 및 (ⅲ) (A) 상기 전사 활성인자의 활성 도메인 및 (B) 제 2 조직 보호 사이토카인 수용체를 포함하는 제 2 융합 단백질을 포함하는 세포와 접촉시키고,
    (b) 리포터 유전자 발현을 검출하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 시험 화합물의 존재 하에 검출된 리포터 유전자의 발현이 시험 화합물의 부재 하에서 검출된 리포터 유전자의 발현과 비교하여 다르다면, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물이 동정되는 방법.
  16. 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 원핵 세포인 방법.
  17. 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 진핵 세포인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    진핵 세포가 인간 세포인 방법.
  19. 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 중 하나 이상의 수용체를 내생적으로 발현하는 방법.
  20. 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 BaF3 세포인 방법.
  21. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a)(ⅰ) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체-응답 프로모터에 작동적으로 연결되고 (ⅱ) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 효모 균주의 세포를 시험 화합물과 접촉시키고,
    (b) 리포터 유전자 발현 수준을 측정함으로써 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성 수준을 결정하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 화합물의 존재 하에서의 리포터 유전자 활성의 수준이 상기 화합물의 부재 하에서의 리포터 유전자 활성의 수준에 비하여 증가하거나 감소하면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물이 동정되는 방법.
  22. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대해 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 결합을 유도하는 조건들 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 (ⅰ) 제 1 표지에 부착된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 및 (ⅱ) 제 2 표지에 부착된 동량의 시험 화합물과 접촉시키고,
    (b) 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체로부터 비결합 물질을 제거하고,
    (c) 제 1 및 제 2 표지들의 수준을 검출하되, 여기서 제 2 표지가 나타나면 상기 화합물이 상기 복합체에 결합한 것이고, 상기 제 1 표지의 수준이 비결합 물질의 제거 후에 표지화된 리간드가 시험 화합물의 부재 하에서 결합을 유도하는 조건들 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉하게 되는 경우의 제 1 표지의 수준과 비교하여 감소하면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 화합물이 동정되는 방법.
  23. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 결합을 유도하는 조건들 하에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드를 하나 이상의 시험 화합물의 존재 하에 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 접촉시키고,
    (b) 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양을 측정하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 하나 이상의 시험 화합물들의 존재 하에 측정된 결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양이 하나 이상의 시험 화합물들의 부재 하에서 측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 양과 다르면, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합을 조절하는 화합물이 동정되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    결합된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 양을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드-특이적인 항체를 사용하여 측정하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드를 표지하고, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드의 결합을 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 부착된 표지를 검출함으로써 측정하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드를 표지하고, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 대한 표지화된 리간드의 결합을 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 부착된 표지를 검출함으로써 측정하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서,
    표지가 형광물질인 방법.
  28. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 조직 보호 사이토카인 수용체를 하나 이상의 시험 화합물들과 접촉시키고,
    (b) 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 측정하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 하나 이상의 시험 화합물들의 존재 하에서 측정된 상기 활성이 하나 이상의 시험 화합물들의 부재 하에서 측정된 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성과 다르면, 상기 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 및 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드 사이의 상호작용을 조절하는 화합물이 동정되는 방법.
  29. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 세포 증식 또는 세포 분화에 의해 측정하는 방법.
  30. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성이, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 상호작용하기 위한 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성인 방법.
  31. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 22 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 활성에 대해 동정된 화합물을 분석하는 단계가 세포 내 뉴클레올린의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 22 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 활성에 대해 동정된 화합물을 분석하는 단계가 세포 내 뉴로글로빈 또는 사이토글로빈의 증가된 수준을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 1 항, 제 22 항, 제 23 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 용액 중에 존재하는 방법.
  34. 제 1 항, 제 22 항, 제 23 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 세포 내에 존재하는 방법.
  35. 제 23 항 또는 제 28 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합을 억제하는 방법.
  36. 제 23 항 또는 제 28 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드와 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 결합을 향상시키는 방법.
  37. 제 1 항, 제 22 항, 제 23 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(a)에서 접촉된 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 세포 표면에 존재하는 방법.
  38. 제 1 항, 제 22 항, 제 23 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 단리된 세포 막에 존재하는 방법.
  39. 제 1 항, 제 22 항, 제 23 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체가 고체 표면에 부동화되는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    고체 표면이 미세역가 접시인 방법.
  41. 제 39 항에 있어서,
    고체 표면이 칩인 방법.
  42. 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 결합시키는 화합물을 동정하기 위한 방법으로서,
    (a) 시험 화합물을, 고체 지지체에 부착된 Fc 단편에 융합된 하나 이상의 β 공통 수용체 세포 외 도메인 및 하나 이상의 EPO 수용체 세포 외 도메인을 포함하는 리간드-결합 조직 보호 수용체 복합체 단편과 접촉시키고,
    (b) 상기 고체 지지체로부터 비결합된 시험 화합물을 제거하고,
    (c) 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 단편에 부착된 화합물을 동정하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합하는 화합물로서 고체 지지체에 결합된 화합물이 동정되는 방법.
  43. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체인 방법.
  44. 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 특이적인 항체인 방법.
  45. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 작은 분자인 방법.
  46. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 펩타이드인 방법.
  47. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 라이브러리(library)의 구성원인 방법.
  48. 제 16 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드가 EPO인 방법.
  49. 제 1 항, 제 5 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 결합시키는 방법.
  50. 제 16 항, 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드를 결합시키는 방법.
  51. 포유동물에서 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 내생적으로 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 발현하는 손상된 직후의 제 1 동물에게 상기 화합물을 투여하고,
    (b) 상기 화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 발현이 결손되고 동일한 종류의 손상이 가해진 직후의 제 2 동물에게 투여하는 것을 포함하며,
    이로 인해, 단계(a)의 동물에서의 손상으로부터의 회복이 단계(b)의 동물과 다르면, 조직 보호 활성을 조절하는 화합물이 동정되는 방법.
  52. 인간의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    이러한 치료 또는 예방이 필요한 인간에게 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 치료 효과량으로 투여하는 것을 포함하되, 상기 화합물이 EPO가 아닌 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 흥분성 조직의 질환 또는 장애, 또는 상기 조직에 영향을 미치는 질환 또는 장애인 방법.
  54. 흥분성 세포, 조직 또는 기관의 기능의 향상이 필요한 인간에게 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 치료 효과량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간의 상기 기능을 향상시키는 방법으로서,
    상기 흥분성 세포, 조직 또는 기관의 기능의 향상이 연상 학습 또는 기억이 향상되는 결과를 가져오되, 상기 화합물은 EPO가 아닌 방법.
  55. 인간의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 조절하는 방법으로서,
    이러한 치료 또는 예방이 필요한 인간에게 상기 복합체의 활성을 조절하는 화합물을 투여하는 것을 포함하되, 상기 화합물이 EPO가 아닌 방법.
  56. 인간의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    인간의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조절하는 것을 포함하는 방법.
  57. 인간의 흥분성 세포, 조직 또는 기관의 기능을 향상시키는 방법으로서,
    인간의 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체를 조절하는 것을 포함하는 방법.
  58. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물을 제 1 항 내지 제 5 항, 제 11 항 내지 제 15 항, 제 21 항 내지 제 23 항, 제 28 항 및 제 42 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 동정하는 방법.
  59. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 특이적인 항체인 방법.
  60. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체 리간드에 특이적인 항체인 방법.
  61. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 작은 분자, 펩타이드, 또는 라이브러리의 구성원인 방법.
  62. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물을 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체에 결합시키는 방법.
  63. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 향상시키는 방법.
  64. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 조직 보호 사이토카인 수용체 복합체의 활성을 방해하는 방법.
  65. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물을 EPO와 함께 투여하는 방법.
  66. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 결핍 과다활동 장애, 알츠하이머병, 노화 또는 인지 기능장애인 방법.
  67. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 저산소증, 발작성 장애, 신경변성 질환, 신경독소 중독, 다발성 경화증, 저혈압, 심박 정지, 방사선 또는 저혈당증에 의해 야기된 방법.
  68. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 허혈 또는 뇌졸증인 방법.
  69. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 신경변성 상태인 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    신경변성 상태가 뇌졸증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 인지력의 연령-관련 손실, 기억 손실, 근위축성 측삭경화증, 발작성 장애, 알코올 중독, 망막 허혈, 노화, 녹내장 또는 신경 세포 손실인 방법.
  71. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 신경근육 또는 근육 상태인 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    신경근육 또는 근육 상태가 심장 조직의 것인 방법.
  73. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 심장의 것인 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 충혈성 심장마비, 관상동맥 질환, 허혈, 심근 경색, 협심증, 선천성 심장 질환, 프린즈메탈 협심증(prinzmetal angina), 심장 파열, 맥관염, 부정맥, 서빈맥증후군(tachy-bradyarrhythmia), 심실위(supraventricular), 심실, 전도 이상, 심근염, 폐심장증(cor pulmonale), 또는 둔기 및 관통 외상인 방법.
  75. 제 52 항, 제 53 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 눈의 것인 방법.
  76. 제 73 항에 있어서,
    질환 또는 장애가 시신경염, 둔기 및 관통 손상, 감염, 유육종증(sarcoid), 낫적혈구병, 망막 박리, 일시적 동맥염, 망막 허혈, 황반 변성, 색소성망막염, 동맥경화성 망막병증, 고혈압 망막변증, 망막 동맥 폐색, 망막 정맥 폐색, 저혈압, 당뇨성 망막병증 또는 황반 부종인 방법.
  77. 제 54 항 또는 제 57 항에 있어서,
    흥분성 조직이 중추신경계 조직 또는 말초신경계 조직인 방법.
  78. 제 77 항에 있어서,
    말초신경계 조직이 태반조직, 망막조직 또는 심장조직인 방법.
  79. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여가 경구, 국소, 두개 내, 관 내, 흡입, 비경구, 정맥 내, 말초, 동맥 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 점막 하 또는 진피 내 투여인 방법.
  80. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    의료 절차, 수술 절차 또는 자연 과정 전에 투여하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서,
    수술 절차가 종양 절제술, 동맥류 회복 또는 심장동맥 우회술인 방법.
  82. 제 80 항에 있어서,
    의료 절차가 화학적 치료인 방법.
  83. 제 80 항에 있어서,
    자연 과정이 노동 또는 이동인 방법.
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