RU2290441C2 - Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование - Google Patents
Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование Download PDFInfo
- Publication number
- RU2290441C2 RU2290441C2 RU2003116125/13A RU2003116125A RU2290441C2 RU 2290441 C2 RU2290441 C2 RU 2290441C2 RU 2003116125/13 A RU2003116125/13 A RU 2003116125/13A RU 2003116125 A RU2003116125 A RU 2003116125A RU 2290441 C2 RU2290441 C2 RU 2290441C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- gene
- chromosomal locus
- endogenous gene
- genetically modified
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 121
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 title claims abstract description 79
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 108
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 73
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 73
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 65
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 109
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 79
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 61
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 61
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 41
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 28
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 25
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 23
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 23
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 15
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 14
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 3
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 3
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 28
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 25
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 108090000333 Transgelin Proteins 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 6
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 6
- 102000003932 Transgelin Human genes 0.000 description 6
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101100356230 Escherichia coli (strain K12) recT gene Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-KPBUCVLVSA-N (3'r,3as,4s,4'r,5'r,6r,6'r,7s,7as)-4-[(1r,2s,3r,5s,6r)-3-amino-2,6-dihydroxy-5-(methylamino)cyclohexyl]oxy-6'-[(1s)-1-amino-2-hydroxyethyl]-6-(hydroxymethyl)spiro[4,6,7,7a-tetrahydro-3ah-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran-2,2'-oxane]-3',4',5',7-tetrol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2OC3([C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@@H](N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-KPBUCVLVSA-N 0.000 description 1
- MTIRIKBRVALRPJ-NTMALXAHSA-N (Z)-[3-aminopropyl(propan-2-yl)amino]-hydroxyimino-oxidoazanium Chemical compound CC(C)N(CCCN)[N+](\[O-])=N\O MTIRIKBRVALRPJ-NTMALXAHSA-N 0.000 description 1
- 101100355997 Bacillus subtilis (strain 168) recA gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100301301 Escherichia coli (strain K12) recE gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100040669 F-box only protein 32 Human genes 0.000 description 1
- 101710191029 F-box only protein 32 Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013264 metal-organic assembly Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010073131 oligoastrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- -1 phospho Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 101150061231 recE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087770 recT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии. Предложен способ модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса в эукариотических клетках. Способ предусматривает получение большого клонированного геномного фрагмента, размером более 20 т.п.н., и создание на его основе с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации большого нацеливающего вектора (LTVEC). Далее проводят введение LTVEC в эукариортические клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса. В заключение проводят количественный анализ для определения модификации аллеля (МОА) в этих клетках. Способ позволяет осуществлять модификацию большими последовательностями ДНК. Описано также применение этих клеток для генерирования организмов, несущих эту генетическую модификацию. 15 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.
Description
Данная заявка заявляет приоритет Патентной заявки США №09/732234, поданной 7 декабря 2000 года, и Предварительной заявка США №60/244665, поданной 31 октября 2000 года. Во всей данной заявке делаются ссылки на различные публикации. Описания этих публикаций в их полном виде включены тем самым в качестве ссылки в данную заявку.
Область изобретения
Областью данного изобретения является способ конструирования и использования больших ДНК-векторов для нацеливания, через гомологичную рекомбинацию, на эндогенные гены и хромосомные локусы в эукариотических клетках и модификации этих генов и локусов любым желаемым образом. Эти большие нацеливающие на ДНК векторы для эукариотических клеток, названные LTVEC, получают из фрагментов клонированной геномной ДНК, более крупных, чем фрагменты, обычно используемые в других подходах, предназначенных для выполнения гомологичного нацеливания в эукариотических клетках. Кроме того, область данного изобретения обеспечивает быстрый и удобный способ обнаружения эукариотических клеток, в которых этот LTVEC был правильно нацелен, и модифицировал желательный эндогенный ген (гены) или хромосомный локус (локусы). Эта область включает в себя также применение этих клеток для генерирования организмов, несущих данную генетическую модификацию, сами эти организмы и способы их применения.
Введение
Применение LTVEC обеспечивает существенные преимущества над существующими в настоящее время способами. Например, поскольку их получают из ДНК-фрагментов, более крупных, чем фрагменты, используемые в настоящее время для генерирования нацеливающих векторов, LTVEC могут быть более быстро и более удобным образом генерированы из доступных библиотек больших геномных ДНК-фрагментов (таких как библиотека ВАС, библиотека бактериальных искусственных хромосом и библиотека РАС), чем нацеливающие векторы, полученные с использованием существующих в настоящее время технологий. Кроме того, могут быть генерированы более удобным образом, чем при использовании существующих в настоящее время технологий, большие модификации, а также модификации, охватывающие большие районы генома.
Кроме того, данное изобретение использует преимущество длинных районов гомологии для увеличения частоты нацеливания на "трудные для нацеливания" локусы, а также уменьшает выгоду, если она вообще имеется, использования изогенной ДНК в этих нацеливающих векторах.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает быстрый, удобный и улучшенный способ для системной модификации фактически всех эндогенных генов и хромосомных локусов конкретного организма.
Предпосылки изобретения
Было показано, что нацеливание на гены посредством гомологичной рекомбинации между гомологичной экзогенной ДНК и эндогенными хромосомными последовательностями является чрезвычайно ценным путем создания делеций, инсерций, сконструированных мутаций, точных мутаций генов, введения трансгенов или создания других генетических модификаций у мышей. Существующие в настоящее время способы включают в себя применение стандартных нацеливающих векторов, причем их районы гомологии относительно эндогенной ДНК обычно имеют общую длину менее чем 10-20 т.п.н., для введения желаемой генетической модификации в мышиные эмбриональные стволовые (ES) клетки с последующей инъекцией этих измененных ES-клеток в мышиные эмбрионы для передачи этих сконструированных генетических модификаций в мышиную зародышевую линию (Smithies et al., Nature, 317:230-234, 1985; Thomas et al., Cell, 51:503-512, 1987; Koller et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:8927-8931, 1989; Kuhn et al., Science, 254:707-710, 1991; Thomas et al., Nature, 346:847-850, 1990; Schwartzberg et al., Science, 246:799-803, 1989; Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987; Thomson et al., Cell, 5:313-321, 1989; DeChiara et al., Nature, 345:78-80, 1990; U.S. Patent No. 5789215, issued August 4, 1998 in the name of GenPhann International). В этих существующих в настоящее время способах обнаружение редких ES-клеток, в которых стандартные нацеливающие векторы были правильно нацелены и модифицировали желаемый эндогенный ген (гены) или хромосомный локус (локусы), требует информации последовательности вне гомологичных нацеливающих последовательностей, содержащихся в данном нацеливающем векторе. Анализы на успешное нацеливание включают в себя стандартный блоттинг по Саузерну или продолжительную ПЦР (Cheng, et al., Nature, 369:684-5, 1994; Foord and Rose, PCR Methods Appl, 3:S149-61, 1994; Ponce and Micol, Nucleic Acids Res, 20:623, 1992; U.S. Patent No. 5436149 issued to Takara Shuzo Co., Ltd.) от последовательностей вне нацеливающего вектора и простирающихся на все плечо гомологии (см. раздел Определения); таким образом, вследствие соображений по поводу размеров, которые ограничивают эти способы, размеры плеч гомологии ограничиваются размерами, меньшими, чем 10-20 т.п.н., в целом (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999).
Чрезвычайно полезной была бы возможность использовать нацеливающие векторы с плечами гомологии, большими, чем используемые в существующих способах. Например, такие нацеливающие векторы можно было бы более быстро и более удобным образом генерировать из доступных библиотек, содержащих большие геномные инсерты (например, библиотек ВАС или РАС), чем нацеливающие векторы, получаемые с использованием существующих в настоящее время технологий, в которых такие геномные инсерты должны быть широко охарактеризованы и приведены в порядок ("подрезаны") перед применением. Кроме того, большие модификации, а также модификации, включающие в себя большие геномные районы, могли бы быть более легко генерированы и с меньшим количеством стадий, чем при использовании существующих в настоящее время технологий. Кроме того, применение длинных районов гомологии могло бы увеличивать частоту нацеливания на "трудные для нацеливания" локусы в эукариотических клетках, так как нацеливание гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках является, по-видимому, связанным с общей гомологией, содержащейся в нацеливающем векторе (Deng and Capecchi, Mol Cell Biol, 12:3365-71, 1992). Кроме того, увеличенная частота нацеливания, получаемая с использованием длинных плеч гомологии, могла бы уменьшать любую потенциальную пользу, которая может быть получена из использования изогенной ДНК в этих нацеливающих векторах.
Проблема конструирования точных модификаций в очень больших геномных фрагментах, таких как фрагменты, клонированные в библиотеках ВАС, была в значительной степени решена посредством использования гомологичной рекомбинации в бактериях (Zhang, et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Yang, et al., Nat Biotechnol, 15:859-65, 1997; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27:e16, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999), позволяющей конструирование векторов, содержащих большие районы гомологии относительно эукариотических эндогенных генов или хромосомных локусов. Однако, после их конструирования, эти векторы обычно не были применимы для модификации эндогенных генов или хромосомных локусов посредством гомологичной рекомбинации вследствие трудности детектирования редких правильных событий нацеливания, когда плечи гомологии имеют больший размер, чем 10-20 т.п.н. (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). Таким образом, векторы, генерируемые с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации из геномных фрагментов ВАС, должны быть все еще приведены в порядок ("подрезаны") для применения в качестве нацеливающих векторов (Hill et al., Genomics, 64:111-3, 2000). Таким образом, все еще существует потребность в быстрой и удобной методологии, которая обеспечивает возможность применения нацеливающих векторов, содержащих большие районы гомологии, таким образом, чтобы модифицировать эндогенные гены или хромосомные локусы в эукариотических клетках.
В соответствии с данным изобретением, заявители обеспечивают новые способы, которые позволяют применять нацеливающие векторы, содержащие большие районы гомологии, таким образом, чтобы модифицировать эндогенные гены или хромосомные локусы в эукариотических клетках посредством гомологичной рекомбинации. Такие способы преодолевают вышеописанные ограничения существующих в настоящее время технологий. Кроме того, специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, способы данного изобретения легко адаптируются для применения с любой геномной ДНК любого эукариотического организма, в том числе, но не только, животных, таких как мышь, крыса, другой грызун, или человека, а также растений, таких как соя, кукуруза и пшеница.
Сущность изобретения
Согласно данному изобретению, заявители разработали новый, быстрый, улучшенный и эффективный способ для создания и скрининга эукариотических клеток, которые содержат модифицированные эндогенные гены или хромосомные локусы. Эти новые способы впервые объединяют:
1. Бактериальную гомологичную рекомбинацию для точного конструирования желаемой генетической модификации в большом клонированном геномном фрагменте, с получением таким образом большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC).
2. Прямое введение этих LTVEC в эукариотические клетки для модификации представляющего интерес эндогенного хромосомного локуса в этих клетках.
3. Анализ для определения редких эукариотических клеток, в которых аллель-мишень был модифицирован желательным образом, предусматривающий анализ на модификацию аллеля (МОА) исходного аллеля, не требующий информации последовательности вне нацеливающей последовательности, такой как, например, количественная ПЦР.
Предпочтительным вариантом данного изобретения является способ генетической модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в эукариотических клетках, предусматривающий: а) получение большого клонированного геномного фрагмента, содержащего представляющую интерес ДНК-последовательность; b) использование бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации этого большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC); с) введение LTVEC (b) в эукариотические клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; и d) использование количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации тех эукариотических клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован.
Другим вариантом данного изобретения является способ, в котором генетическая модификация в отношении эндогенного гена или хромосомного локуса включает в себя делецию кодирующей последовательности, генного сегмента или регуляторного элемента; изменение кодирующей последовательности, генного сегмента или регуляторного элемента; инсерцию новых кодирующей последовательности, генного сегмента или регуляторного элемента; создание условного аллеля; или замену кодирующей последовательности или генного сегмента из одного вида гомологичной или ортологичной кодирующей последовательностью из другого вида.
Альтернативным вариантом данного изобретения является способ, в котором изменение кодирующей последовательности, генного сегмента или регуляторного элемента предусматривает замену, добавление или слияние, где это слияние включает в себя эпитопную метку (тэг) или бифункциональный белок.
Еще одним вариантом данного изобретения является способ, в котором количественный анализ включает в себя количественную ПЦР, сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК, количественную гибридизацию с иммобилизованным зондом, Invader Probes®, или ММР-анализы®, или в котором количественная ПЦР включает в себя технологию с использованием зондов TaqMan®, Molecular Beacon или Eclipse™.
Другим предпочтительным вариантом данного изобретения является способ, в котором эукариотической клеткой является эмбриональная стволовая клетка млекопитающего и, в частности, в котором эта эмбриональная стволовая клетка является эмбриональной стволовой клеткой мыши, крысы или другого грызуна.
Другим предпочтительным вариантом данного изобретения является способ, в котором эндогенным геном или хромосомным локусом является ген или хромосомный локус млекопитающего, предпочтительно ген или хромосомный локус человека или ген или хромосомный локус мыши, крысы или другого грызуна.
Дополнительным предпочтительным вариантом является вариант, в котором LTVEC способен вмещать в себя большие ДНК-фрагменты величиной, большей, чем 20 т.п.н., и, в частности, большие ДНК-фрагменты величиной, большей, чем 100 т.п.н.
Другим предпочтительным вариантом является генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, который получают по способу данного изобретения.
Еще одним предпочтительным вариантом является генетически модифицированная эукариотическая клетка, которую получают по способу данного изобретения.
Предпочтительным вариантом данного изобретения является организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный по способу данного изобретения.
Предпочтительным также является организм (не человек), полученный из генетически модифицированных эукариотических клеток или эмбриональных стволовых клеток, полученных по способу данного изобретения.
Предпочтительным вариантом является организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный по способу, предусматривающему стадии: а) получения большого клонированного геномного фрагмента, содержащего представляющую интерес ДНК-последовательность; b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора (LTVEC) для применения в эмбриональных стволовых клетках; с) введения LTVEC (b) в эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; d) использования количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации тех эмбриональных стволовых клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован; е) введения эмбриональной стволовой клетки (d) в бластоцисту; и f) введения бластоцисты (е) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
Дополнительным предпочтительным вариантом данного изобретения является организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный по способу, предусматривающему стадии: а) получения большого клонированного геномного фрагмента, содержащего представляющую интерес ДНК-последовательность; b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC); с) введения LTVEC (b) в эукариотические клетки для генетической модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; и d) использования количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации тех эукариотических клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован; (е) удаления ядра из эукариотической клетки (d); f) введения ядра (е) в ооцит; и g) введения ооцита (f) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
Еще одним предпочтительным вариантом является организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный по способу, предусматривающему стадии: а) получения большого клонированного геномного фрагмента, содержащего представляющую интерес ДНК-последовательность; b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC); с) введения LTVEC (b) в эукариотические клетки для генетической модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; d) использования количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации тех эукариотических клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован; е) слияния эукариотической клетки (d) с другой эукариотической клеткой; f) введения слитой эукариотической клетки (е) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
В предпочтительных вариантах организмом (не человеком) является мышь, крыса или другой грызун; бластоцистой является бластоциста мыши, крысы или другого грызуна; ооцитом является ооцит мыши, крысы или другого грызуна; и суррогатным родителем является мышь, крыса или другой грызун.
Другим предпочтительным вариантом является вариант, в котором эмбриональная стволовая клетка является эмбриональной стволовой клеткой млекопитающего, предпочтительно эмбриональной стволовой клеткой мыши, крысы или другого грызуна.
Дополнительным предпочтительным вариантом является применение генетически модифицированных эукариотических клеток данного изобретения для получения организма (не человека) и, в частности, применение генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки данного изобретения для получения организма (не человека).
Предпочтительным вариантом данного изобретения является способ генетической модификации представляющего интерес эндогенного гена или хромосомного локуса в мышиных эмбриональных стволовых клетках, предусматривающий стадии: а) получения большого клонированного геномного фрагмента, большего, чем 20 т.п.н., который содержит представляющую интерес ДНК-последовательность, где этот большой клонированный ДНК-фрагмент является гомологичным эндогенному гену или хромосомному локусу; b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в мышиных эмбриональных стволовых клетках, где генетическая модификация является делецией кодирующей послеовательности, генного сегмента или регуляторного элемента; с) введения большого нацеливающего вектора (b) в мышиные эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; d) использования количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в мышиных эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации тех эмбриональных стволовых клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован, где количественным анализом является количественная ПЦР. Предпочтительным вариантом является также генетически модифицированная мышиная эмбриональная стволовая клетка, полученная этим способом; мышь, содержащая генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученная этим способом; и мышь, полученная из генетически модифицированной мышиной эмбриональной стволовой клетки.
Другим предпочтительным вариантом является мышь, содержащая генетически модифицированный представляющий интерес эндогенный ген или хромосомный локус, полученная по способу, предусматривающему стадии: а) получения большого клонированного геномного фрагмента, большего, чем 20 т.п.н., который содержит представляющую интерес ДНК-последовательность, где этот большой клонированный ДНК-фрагмент является гомологичным эндогенному гену или хромосомному локусу; b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в мышиных эмбриональных стволовых клетках, где генетическая модификация является делецией кодирующей последовательности, генного сегмента или регуляторного элемента; с) введения большого нацеливающего вектора (b) в мышиные эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках; d) использования количественного анализа для детектирования модификации аллеля (МОА) в мышиных эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации тех мышиных стволовых клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован, где количественным анализом является количественная ПЦР; е) введения мышиной эмбриональной стволовой клетки (d) в бластоцисту; и f) введения бластоцисты (е) в суррогатного роддителя женского пола для вынашивания плода.
Предпочтительным является также применение генетически модифицированной мышиной эмбриональной стволовой клетки, описанной выше, для получения мыши.
Предпочтительными являются также способы, в которых приблизительно 1-5 мкг большого нацеливающего ДНК-вектора вводят в приблизительно 1х107 эукариотических клеток.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Схематическая диаграмма генерирования типичного LTVEC с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации.
(hb1 = блок гомологии 1; hb2 = блок гомологии 2; RE - сайт рестриктазы).
Фигура 2: Схематическая диаграмма донорного фрагмента и LTVEC для мыши OCR10.
(hb1 = блок гомологии 1; lacZ = ORF β-галактозидазы; SV40 polyA = ДНК-фрагмент, полученный из обезьяньего вируса 40, содержащий сайт и сигнал полиаденилирования; PGKp = промотор мышиной фосфоглицераткиназы (PGK); ЕМ7 = бактериальный промотор; neo = неомицинфосфотрансфераза; PGK polyA = 3'-нетранслируемый район, полученный из гена PGK и содержащий сайт и сигнал полиаденилирования; hb2 = блок гомологии 2).
Фигура 3А-3D: Последовательность кДНК OCR10 мыши, блок гомологии 1 (hb1), блок гомологии 2 (hb2) и зонды TaqMan® и праймеры, используемые в количественном ПЦР-анализе для детектирования модификации аллеля (МОА) в ES-клетках с использованием LTVEC mOCR10.
hb1: пары оснований 1-211
hb2: пары оснований 1586-1801
Зонд TaqMan® и соответствующий набор ПЦР-праймеров, полученных из экзона 3 mOCR10:
Зонд TaqMan®: нуклеотиды 413-439 - верхняя цепь
Праймер ех3-5': нуклеотиды 390-410 - верхняя цепь
Праймер ех3-3': нуклеотиды 445-461 - нижняя цепь
Зонд TaqMan® и соответствующий набор праймеров, полученных из экзона 4 mOCR10:
Зонд TaqMan®: нуклеотиды 608-639 - верхняя цепь
Праймер ех4-5': нуклеотиды 586-605 - верхняя цепь
Праймер ех4-3': нуклеотиды 642-662 - нижняя цепь
Определения
"Нацеливающий вектор" представляет собой ДНК-конструкцию, которая содержит последовательности, "гомологичные" эндогенным хромосомным последовательностям нуклеиновых кислот, фланкирующие желаемую генетическую модификацию (модификации). Фланкирующие последовательности гомологии, называемые "плечами гомологии", направляют нацеливающий вектор в специфическое хромосомное местоположение в геноме вследствие гомологии, которая существует между плечами гомологии и соответствующей эндогенной последовательностью, и вводят желаемую генетическую модификацию посредством процесса, называемого "гомологичной модификацией".
"Гомологичные" означает две или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые являются либо идентичными, либо достаточно сходными, чтобы быть способными гибридизоваться друг с другом или подвергаться межмолекулярному обмену.
"Нацеливание на ген" является модификацией эндогенного хромосомного локуса инсерцией в него, делецией из него или заменой эндогенной последовательности посредством гомологичной рекомбинации с использованием нацеливающего вектора.
"Нокаут гена" является генетической модификацией, происходящей из разрушения генетической информации, кодируемой в хромосомном локусе.
"Присоединение ("вбивание гена") является генетической модификацией, происходящей из замены генетической информации в хромосомном локусе отличающейся ДНК-последовательностью.
"Организм с нокаутом" является организмом, в котором значительная доля клеток организма несет нокаут гена.
"Организм с присоединенным ("вбитым") геном" является организмом, в котором значительная доля клеток организма несет присоединенный ("вбитый") ген.
"Маркер" или "селектируемый маркер" является маркером отбора, который позволяет выделить редкие трансфицированные клетки, экспрессирующие этот маркер, из большинства обработанных клеток в популяции. Гены таких маркеров включают в себя, но не ограничиваются ими, гены неомицинфосфотрансферазы и гигромицин В-фосфотрансферазы или флуоресцирующих белков, таких как GFP.
"ES-клетка" является эмбриональной стволовой клеткой. Эту клетку обычно получают из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты.
"Клон ES-клеток" является субпопуляцией клеток, полученных из единственной клетки популяции ES-клеток после введения ДНК и последующего отбора.
"Фланкирующая ДНК" является сегментом ДНК, который является колинеарным и смежным с конкретной точкой ссылочной последовательности.
"LTVEC" являются большими нацеливающими векторами для эукариотических клеток, которые получают из фрагментов клонированной геномной ДНК большего размера, чем фрагменты, обычно используемые другими подходами, предназначенными для выполнения гомологичного нацеливания в эукариотических клетках.
"Организм (не человек)" является организмом, который обычно не воспринимается публично как являющийся человеком.
"Модификация аллеля" (МОА) означает модификацию точной ДНК-последовательности одного аллеля гена (генов) или хромосомного локуса (локусов) в геноме. Эта модификация аллеля (МОА) включает в себя, но не ограничивается ими, делеции, замены или инсерции всего лишь одного нуклеотида или делеции многих т.п.н., включающих в себя представляющий интерес ген (гены) или хромосомный локус (локусы), а также любые и все возможные модификации между этими двумя крайностями.
"Ортологичная последовательность" обозначает последовательность из одного вида, которая является функционально эквивалентной этой последовательности в другом виде.
Описание и примеры, представленные infra, обеспечены для иллюстрации данного изобретения. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что эти примеры обеспечены только в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения.
Подробное описание изобретения
Заявители разработали новый, быстрый, улучшенный и эффективный способ для создания и скрининга эукариотических клеток, которые содержат модифицированные эндогенные гены или хромосомные локусы. В этих клетках модификацией могут быть нокауты гена (генов), присоединения (вбивания) генов, точковые мутации или большие геномные инсерции или делеции или другие модификации. В качестве неограничивающего примера, эти клетки могут быть эмбриональными стволовыми клетками, которые применимы в создании организмов с нокаутом или присоединением генов и, в частности, мышей с нокаутом или присоединением генов, для цели определения функции гена (генов), которые были изменены, делетированы и/или инсертированы.
Эти новые способы впервые объединяют:
1. Бактериальную гомологичную рекомбинацию для точного конструирования желаемой генетической модификации в большом клонированном геномном ДНК-фрагменте, с получением таким образом большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC);
2. Прямое введение этих LTVEC в эукариотические клетки для модификации представляющего интерес соответствующего эндогенного гена (генов) или хромосомного локуса (локусов) в эти клетки; и
3. Анализ для определения редких эукариотических клеток, в которых аллель-мишень был модифицирован желательным образом, включающий в себя количественный анализ на модификацию аллеля (МОА) исходного аллеля.
Следует подчеркнуть, что предыдущие способы для детектирования успешной гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках не могут быть использованы вместе с LTVEC изобретения авторов, так как в этих LTVEC присутствуют длинные плечи гомологии. Использование LTVEC для преднамеренной модификации эндогенных генов или хромосомных локусов в эукариотических клетках посредством гомологичной рекомбинации становится возможным с использованием нового применения анализа для определения редких эукариотических клеток, в которых аллель-мишень был модифицирован желательным образом, причем такой способ предусматривает количественный анализ на модификацию аллеля (МОА) исходного аллеля, с применением, например, количественной ПЦР или других подходящих количественных анализов на МОА.
Возможность использования нацеливающих векторов с плечами гомологии, большими, чем плечи гомологии, используемые в существующих в настоящее время способах, является чрезвычайно ценной по следующим причинам:
1. Нацеливающие векторы являются более быстро и легко генерируемыми из доступных библиотек, содержащих большие геномные инсерты (например, библиотек ВАС или РАС), чем нацеливающие векторы, получаемые предыдущими технологиями, в которых геномные инсерты должны быть широко охарактеризованы и "приведены в порядок" (подрезаны) перед использованием (что объяснено более подробно ниже). Кроме того, должна быть известна лишь минимальная информация последовательности о представляющем интерес локусе, т.е. необходимо только знать приблизительно 80-100 нуклеотидов, которые требуются для генерирования блоков гомологии (описанных подробно ниже) и для генерирования зондов, которые могут быть использованы в количественных анализах на МОА (описанных подробно ниже).
2. Модификации большего размера, а также модификации, включающие в себя большие геномные районы, являются более легко и с меньшими стадиями генерируемыми, чем с использованием предыдущих технологий. Например, способ данного изобретения позволяет производить точную модификацию больших локусов, которые не могут быть вмещены традиционными нацеливающими векторами на основе плазмид вследствие ограничений их размеров. Он позволяет также модифицировать любой конкретный локус во множественных точках (например, введение специфических мутаций в различных экзонах мультиэкзонного гена) в одной стадии, уменьшая необходимость конструирования множественных нацеливающих векторов и выполнения множественных раундов нацеливания и скрининга на гомологичную рекомбинацию в ES-клетках.
3. Применение длинных районов гомологии (длинных плеч гомологии) увеличивает частоту нацеливания на "трудные для нацеливания" локусы в эукариотических клетках, что согласуется с прежними открытиями того, что нацеливание гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках связано, по-видимому, с общей гомологией, содержащейся в нацеливающем векторе.
4. Увеличенная частота нацеливания, получаемая с использованием длинных плеч гомологии, по-видимому, уменьшает полезность, если она имеется, использования изогенной ДНК в этих нацеливающих способах.
5. Применение количественных анализов МОА для скрининга эукариотических клеток на гомологичную рекомбинацию не только дает возможность использования LTVEC в качестве нацеливающих векторов (преимущества, очерченные выше), но также уменьшает время, требующееся для идентификации точно модифицированных эукариотических клеток, с обычных нескольких дней до нескольких часов. Кроме того, применение количественных МОА не требует применения зондов, локализованных вне эндогенного гена (генов) или хромосомного локуса (локусов), которые модифицируются, устраняя таким образом необходимость знания последовательности, фланкирующей модифицированный ген (гены) или локус (локусы). Это представляет собой важное улучшение в способе, которым выполняли скрининг в прошлом, и делает его гораздо менее трудоемким и гораздо более экономически эффективным подходом к скринингу на события гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках.
Способы
Многие из способов, используемых для конструирования ДНК-векторов, описанных здесь, являются стандартными способами молекулярной биологии, хорошо известными специалисту с квалификацией в данной области (см., например, Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Все секвенирования ДНК выполняются стандартными способами с использованием ДНК-секвенатора ABI 373A и набора для секвенирования Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
Стадия 1. Получение клона большой геномной ДНК, содержащий представляющий интерес ген (гены) или хромосомный локус (локусы).
Представляющие интерес ген (гены) или локус (локусы) могут быть выбраны на основании специфических критериев, таких как подробные структурные или функциональные данные, или он может быть выбран в отсутствие такой подробной информации, так как потенциальные гены или генные фрагменты становятся прогнозируемыми в результате усилий различных проектов секвенирования генома.
Важно отметить, что не является необходимым знание полной последовательности и структуры представляющих интерес гена (генов) для применения способа данного изобретения для получения LTVEC. Фактически, единственной информацией о последовательности, которая требуется, являются приблизительно 80-100 нуклеотидов, так чтобы получить представляющий интерес геномный клон, а также генерировать блоки гомологии, используемые в получении LTVEC (описанные подробно ниже), и изготовить зонды для применения в количественных анализах МОА.
После отбора представляющих интерес гена (генов) или локуса (локусов) получают большой геномный клон (клоны), содержащий этот ген (гены) или локус (локусы). Этот клон (клоны) может быть получен любым из нескольких путей, в том числе, но не только, скринингом подходящих библиотек ДНК (например, библиотек ВАС, РАС, YAC или космид) стандартными способами гибридизации или ПЦР или любыми другими способами, известными специалисту с квалификацией в данной области.
Стадия 2. Присоединение блоков гомологии 1 и 2 к модификационной кассете и генерирование LTVEC.
Блоки гомологии маркируют сайты бактериальной гомологичной рекомбинации, которые используют для генерирования LTVEC из больших клонированных геномных фрагментов (фигура 1). Блоки гомологии являются короткими сегментами ДНК, обычно двухцепочечными и имеющими длину по меньшей мере 40 нуклеотидов, которые являются гомологичными районам в большом клонированном геномном фрагменте, фланкируя "район, который подлежит модификации". Блоки гомологии присоединяют к модификационной кассете, так что после гомологичной рекомбинации в бактериях эта модификационная кассета заменяет район, подлежащий модификации (фигура 1). Способ создания нацеливающего вектора с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации может выполняться в различных системах (Yang et al, Nat Biotechnol, 15:859-65, 1997; Muyrers et al, Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Angrand et al., Nucleic Acids Res, 27:e16, 1999; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7,1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000). Одним из примеров предпочтительной используемой в настоящее время технологии является ЕТ-клонирование (Zhang et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999) и вариации этой технологии (Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000). ЕТ обозначает белки recE (Hall and Kolodner, Proc Natl Acad Sci USA, 91:3205-9, 1994) и recT (Kusano et al., Gene,138:17-25,1994), которые осуществляют реакцию гомологичной рекомбинации. RecE является экзонуклеазой, которая разрезает одну цепь линейной двухцепочечной ДНК (по существу донорный ДНК-фрагмент, описанный infra) 5' → 3', оставляя позади себя линейный двухцепочечный фрагмент с 3'-одноцепочечным выступом. Этот одноцепочечный выступ покрывается белком recT, который имеет активность связывания одноцепочечной ДНК (ssDNA) (Kovall and Matthews, Science, 277:1824-7, 1997). ЕТ-клонирование выполняют с использованием E. coli, которая временно экспрессирует продукты гена recE и recT E. coli (Hall and Kolodner, Froc Natl Acad Sci USA, 91:3205-9, 1994; Clark et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49:453-62, 1984; Noirot and Kolodner, J Biol Chem, 273:12274-80, 1998; Thresher et al., J Mol Biol, 254:364-71, 1995; Kolodner et al., Mol Microbiol, 11:23-30, 1994; Hall et al., J Bacteriol, 175:277-87, 1993), и белка λgam бактериофага лямбда (λ) (Murphy, J Bacteriol,173:5808-21, 1991; Poteete et al., J Bacteriol, 170:2012-21, 1988). Белок λgam необходим для защиты донорного ДНК-фрагмента от деградации системой экзонуклеазы recBC (Myers and Stahl, Annu Rev Genet, 28:49-70, 1994), и он необходим для эффективного ЕТ-клонирования в recBC+-хозяевах, таких как часто используемый штамм E. coli DH10b.
Район, подлежащий модификации и заменяемый с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации, может находиться в пределах от нуля нуклеотидов длиной (создавая инсерцию в первоначальный локус) до многих десятков т.п.н. (создавая делецию и/или замену первоначального локуса). В зависимости от модификационной кассеты, эта модификация может приводить к следующему:
(а) делеции кодирующих последовательностей, генных сегментов или регуляторных элементов;
(b) изменению (изменениям) кодирующей последовательности, генных сегментов или регуляторных элементов, в том числе заменам, добавлениям и слияниям (например, эпитопных меток или созданию бифункциональных белков, таких как белки с CFP);
(с) инсерции новых кодирующих районов, генных сегментов или регуляторных элементов, таких как кодирующие районы, генные сегменты или регуляторные элементы для селектируемых маркерных генов или репортерных генов, или помещению новых генов под эндогенный транскрипционный контроль;
(d) созданию условных аллелей, например, введением сайтов loxP, фланкирующих район, подлежащий вырезанию Cre-рекомбиназой (Abremski and Hoess, J Biol Chem, 259:1509-14, 1984), или сайтов FRT, фланкирующих район, подлежащий вырезанию Flp-рекомбиназой (Andrews et al., Cell, 40:795-803, 1985; Meyer-Leon et al., Cold. Spring Harb Symp Quant Biol, 49:797-804, 1984; Cox, Proc Natl Acad Sci USA, 80:4223-7, 1983); (е) замене кодирующих последовательностей или генных сегментов из одного вида ортологичными кодирующими последовательностями из отличающегося вида, например, замены мышиного генетического локуса ортологичным генетическим локусом человека для конструирования мыши, в которой этот конкретный локус является "гуманизированным".
Любая из всех этих модификаций может быть включена в LTVEC. Конкретным, неограничивающим примером, в котором эндогенная кодирующая последовательность полностью делетирована и одновременно заменена как репортерным геном, так и селектируемым маркером, обеспечена ниже в примере 1, так же, как и преимущества способа данного изобретения по сравнению с предыдущими технологиями.
Стадия 3 (необязательная). Подтверждение того, что каждый LTVEC был сконструирован правильно.
Подтверждение того, что каждый LTVEC был сконструирован правильно, получают посредством:
а. Диагностической ПЦР для подтверждения новых мест соединений, созданных введением донорного фрагмента в представляющий интерес ген (гены) или хромосомный локус (локусы). Полученные таким образом ПЦР-фрагменты могут быть секвенированы для дополнительного подтверждения новых мест соединений, созданных введением донорного фрагмента в представляющий интерес ген (гены) или хромосомный локус (локусы).
b. Диагностического расщепления рестриктазами для получения уверенности в том, что только желаемые модификации были введены в LTVEC во время процесса бактериальной гомологичной рекомбинации.
с. Прямого секвенирования LTVEC, в частности, районов, включающих в себя сайт модификации, для подтверждения новых мест соединений, созданных введением донорного фрагмента в представляющий интерес ген (гены) или хромосомный локус (локусы).
Стадия 4. Очистка, получение и линеаризация ДНК LTVEC для введения в эукариотические клетки.
а. Получение ДНК LTVEC:
Получите минипрепарат ДНК (Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Tillett and Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998; http://www.qiagen.com/ literature/handbooks/plkmmi/plm_399.pdf) выбранного LTVEC и повторно трансформируйте минипрепарат ДНК LTVEC в E. coli при помощи электропорации (Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989). Эта стадия необходима для удаления плазмиды, кодирующей рекомбиногенные белки, которые используются для стадии бактериальной гомологичной рекомбинации (Zhang et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999). От этой плазмиды полезно избавиться (а), так как она является высококопийной плазмидой и может снижать выходы, получаемые в крупномасштабных препаратах LTVEC; (b) для исключения возможности индукции экспрессии рекомбиногенных белков; и (с) так как она может затруднять физическое картирование LTVEC. Перед введением LTVEC в эукариотические клетки получают большие количества ДНК LTVEC стандартной методологией (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/ plklow.pdf; Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Tillett and Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998). Однако этой стадией можно пренебречь, если используют способ бактериальной гомологичной рекомбинации с применением рекомбиногенного профага, т.е. когда гены, кодирующие рекомбиногенные белки, интегрированы в бактериальную хромосому (Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000).
b. Линеаризация ДНК LTVEC:
Для получения LTVEC для введения в эукариотические клетки LTVEC предпочтительно линеаризуют таким способом, который оставляет ДНК модифицированного эндогенного гена (генов) или хромосомного локуса (локусов), фланкированную длинными плечами гомологии. Это может быть выполнено линеаризацией LTVEC, предпочтительно в векторном каркасе, любой из рестриктаз, которые расщепляют лишь редко. Примеры подходящих рестриктаз включают в себя NotI, PacI, SfiI, SrfI, SwaI, FseI и т.д. Выбор рестрикционного фермента может быть определен экспериментально (т.е. испытанием нескольких различных кандидатов в качестве редко расщепляющих рестриктаз) или, если последовательность данного LTVEC известна, анализом последовательности и выбором подходящего рестрикционного фермента на основании этого анализа. В ситуациях, где LTVEC имеет векторный каркас, содержащий сайты редкого расщепления, такие как сайты CosN, он может расщепляться ферментами, узнающими такие сайты, например, λ-терминазой (Shizuya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:8794-7, 1992; Becker and Gold, Proc Natl Acad Sci USA, 75:4199-203, 1978; Rackwitz et al., Gene, 40:259-66, 1985).
Стадия 5. Введение LTVEC в эукариотические клетки и отбор клеток, в которых имело место успешное введение LTVEC.
ДНК LTVEC может быть введена в эукариотические клетки с использованием стандартной методологии, такой как трансфекция, опосредованная фосфатом кальция, липидами, или электропорация (Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1,2, and 3, 1989). Клетки, в которые LTVEC был введен успешно, могут отбираться подверганием действию агентов отбора, в зависимости от селектируемого маркерного гена, который был встроен в LTVEC. В качестве неограничивающего примера, если селектируемым маркером является ген неомицинфосфотрансферазы (neo) (Beck, et al., Gene, 19:327-36, 1982), то клетки, которые включили в себя LTVEC, могут быть отобраны на G418-содержащей среде, клетки, которые не включили в себя LTVEC, будут погибать, тогда как клетки, которые включили в себя LTVEC, будут выживать (Santerre, et al., Gene, 30:147-56, 1984). Другие подходящие селектируемые маркеры включают в себя любое лекарственное средство, которое имеет активность в эукариотических клетках (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), так же как гидромицин В (Santerre, et al., Gene, 30:147-56, 1984; Bernard, et al., Exp Cell Res, 158:237-43, 1985; Giordano and McAllister, Gene, 88:285-8, 1990), Бластицидин S (Izumi, et al., Exp Cell Res, 197:229-33, 1991) и другие, которые известны специалистам с квалификацией в данной области.
Стадия 6. Скрининг на события гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках с использованием количественного анализа на модификацию аллеля (МОА).
Эукариотические клетки, которые были успешно модифицированы нацеливанием LTVEC в представляющий интерес локус, могут быть идентифицированы с использованием различных подходов, которые могут детектировать модификацию аллеля в представляющем интерес локусе и которые не зависят от анализов, охватывающих полное плечо гомологии или полные плечи гомологии. Такие подходы могут включать в себя, но не ограничиваются ими:
(а) количественную ПЦР с использованием TaqMan® (Lie and Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9:43-8, 1998);
(b) количественный анализ МОА с использованием молекулярных маяков (Tan, et al, Chemistry, 6:1107-11, 2000);
(с) гибридизацию с флуоресценцией in situ FISH (Laan, et al, Hum Genet, 96:275-80, 1995) или сравнительную геномную гибридизацию (CGH) (Forozan, et al, Trends Genet, 13:405-9, 1997; Thompson and Gray, J Cell Biochem Suppl, 139-43, 1993; Houldsworth and Chaganti, Am J Pathol, 145:1253-60, 1994);
(d) изотермическую амплификацию ДНК (Lizardi, et al, Nat Genet, 19:225-32, 1998; Mitra and Church, Nucleic Acids Res, 27:e34, 1999);
(е) количественную гибридизацию с иммобилизованным зондом (зондами) (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Kafatos FC; Jones CW; Efstratiadis A, Nucleic Acids Res 7(6):1541-52, 1979);
(f) Invader Probes® (зонды-захватчики) (Third Wave Technologies); (Технологии Третьей Волны);
(g) Eclipse™ и Молекулярные зонды-маяки (Synthetic Genetics); и
(h) ММР-анализы (High Throughput Genomics).
Авторы изобретения обеспечивают здесь пример, в котором количественную ПЦР с TaqMan® используют для скрининга на успешно нацеленные эукариотические клетки. В этом неограничивающем примере TaqMan® используют для идентификации эукариотических клеток, которые подверглись гомологичной рекомбинации, в результате которой часть одного их двух эндогенных аллелей в диплоидном геноме была заменена другой последовательностью. В противоположность традиционным способам, в которых различие в длине рестрикционных фрагментов, включающих в себя все плечо (или плечи) гомологии, указывает на модификацию одного из двух аллелей, количественный способ с использованием TaqMan® будет детектировать модификацию одного аллеля измерением уменьшения копийности (наполовину) немодифицированного аллеля. Конкретно, этот зонд детектирует немодифицированный аллель, а не модифицированный аллель. Таким образом, этот способ не зависит от точной природы модификации и не ограничивается заменой последовательности, описанной в этом примере. TaqMan® используют для количественного определения числа копий ДНК-матрицы в пробе геномной ДНК, в частности, сравнением со ссылочным геном (Lie and Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9:43-8, 1998). Ссылочный ген количественно определяют в той же самой геномной ДНК, в которой определяют ген-мишень (гены) или локус-мишень (локусы). Таким образом, выполняют две TaqMan®-амплификации (каждая с ее соответствующим зондом). Один зонд TaqMan® определяет "Ct" (пороговый цикл) ссылочного гена, тогда как другой зонд определяет Ct района гена-мишени (генов) или локуса-мишени (локусов), который заменен успешным нацеливанием. Ct является количеством, которое отражает количество стартовой ДНК для каждого из зондов TaqMan®, т.е. менее представленная последовательность требует больше циклов ПЦР для достижения порогового цикла. Уменьшение наполовину числа копий матричной последовательности для реакции TaqMan® будет приводить к увеличению на приблизительно одну Ct-единицу. Реакции TaqMan® в клетках, в которых один аллель гена-мишени (генов) или локуса-мишени (локусов) был заменен с помощью гомологичной рекомбинации, будет приводить к увеличению на одну Ct-единицу для TaqMan®-реакции гена-мишени без увеличения Ct для ссылочного гена при сравнении с ДНК из клеток без успешного нацеливания. Это позволяет легко детектировать модификацию одного аллеля представляющего интерес гена (генов) в эукариотических клетках с использованием LTVEC.
Как отмечалось выше, скрининг модификации аллеля (МОА) является применением любого способа, который детектирует модификацию одного аллеля, для идентификации клеток, которые подверглись гомологичной рекомбинации. Он не требует, чтобы аллели-мишени были идентичными (гомологичными) друг другу, и, фактически, они могут содержать полиморфизмы, как это имеет место в потомстве, происходящем из скрещивания двух разных штаммов мышей. Кроме того, одной особенной ситуацией, которая также охватывается скринингом МОА, является нацеливание на гены, которые в норме присутствуют в виде единственной копии в клетках, такие как некоторые из локализованных на половых хромосомах генов, и, в частности, на Y-хромосоме. В этом случае способы, которые будут детектировать модификацию этого единственного аллеля-мишени, такие как количественная ПЦР, блоттинги по Саузерну и т.д., могут быть использованы для детектирования события нацеливания. Ясно, что способ данного изобретения может быть использован для генерирования модифицированных эукариотических клеток даже в том случае, когда аллели являются полиморфными или когда они присутствуют в виде единственной копии в клетках-мишенях.
Стадия 8. Применения генетически модифицированных эукариотических клеток.
(а) Генетически модифицированные эукариотические клетки, генерируемые способами, описанными в стадиях 1-7, могут быть использованы в любом анализе in vitro или in vivo, где желательной является изменение фенотипа такой клетки.
(b) Генетически модифицированные эукариотические клетки, генерируемые способами, описанными в стадиях 1-7, могут быть также использованы для генерирования организма, несущего эту генетическую модификацию. Генетически модифицированные организмы могут быть получены несколькими различными способами, включающими, но не ограничивающимися ими: 1. Модифицированные эмбриональные стволовые (ES) клетки, такие как часто применяемые ES-клетки крысы и мыши. ES-клетки могут быть использованы для создания генетически модифицированных крыс или мышей стандартной технологией с инъекцией бластоцисты или способом агрегации (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Wood, et al., Nature, 365:87-9, 1993; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), инъекцией тетраплоидной бластоцисты (Wang, et al, Mech Dev, 62:137-45,1997),или переносом ядер и клонированием (Wakayama, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:14984-9, 1999). ES-клетки, полученные из других организмов, таких как кролики (Wang, et al., Mech Dev, 62:137-45, 1997; Schoonjans, et al., Mol Reprod Dev, 45:439-43, 1996) или куры (Pain, et al., Development, 122:2339-48, 1996) или другие виды, должны быть также пригодными для генетической модификации (модификаций) с использованием способов данного изобретения.
2. Модифицированные протопласты могут быть использованы для генерирования генетически модифицированных растений (например, см. патент США 5350689 "Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells", и патент США 5508189 "Regeneration of plants from cultured guard cell protoplasts" и ссылки в них).
3. Перенос ядер из модифицированных эукариотических клеток в ооциты для генерирования клонированных организмов с модифицированным аллелем (Wakayama, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:14984-9, 1999; Baguisi, et al., Nat Biotechnol, 17:456-61, 1999; Wilmut, et al., Reprod Fertil Dev, 10:639-43, 1998; Wilmut, et al., Nature, 385:810-3, 1997; Wakayama, et al., Nat Genet, 24:108-9, 2000; Wakayama, et al., Nature, 394:369-74, 1998; Rideout, et al., Nat Genet, 24:109-10, 2000; Campbell, et al., Nature, 380:64-6, 1996).
4. Слияние клеток для переноса модифицированного аллеля в другую клетку, включающее в себя перенос сконструированной хромосомы (хромосом), и применения такой клетки (клеток) для генерирования организмов, несущих модифицированный аллель или сконструированную хромосому (хромосомы) (Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 18:1086-1090, 2000).
5. Способ данного изобретения применим также для любых других подходов, которые были использованы или еще будут открыты.
Хотя многие из способов, используемых в применении на практике отдельных стадий способов данного изобретения, являются известными для специалиста с квалификацией в данной области, заявители утверждают, что новизна способа данного изобретения заключается в уникальном комбинировании этих стадий и способов, связанных с никогда ранее не описанным способом введения LTVEC непосредственно в эукариотические клетки для модификации хромосомного локуса, и использовании количественных МОА-анализов для идентификации эукариотических клеток, которые были подходящим образом модифицированы. Эта новая комбинация представляет важное усовершенствование по сравнению с прежними технологиями для создания организмов, обладающих модификациями эндогенных генов или хромосомных локусов.
Примеры
Пример 1: Конструирование мышиных ES-клеток, несущих делецию гена OCR10.
а. Отбор клона большой геномной ДНК, содержащей mOCR10.
Клон бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), несущий большой фрагмент геномной ДНК, который содержал кодирующую последовательность мышиного гена OCR10 (mOCR10), был получен скринингом матричной библиотеки ВАС мышиных геномных ДНК (Incyte Genomics) при помощи ПЦР. Праймеры, используемые для скрининга этой библиотеки, были произведены из кДНК-последовательности гена mOCR10.
Использовали две пары праймеров:
(а) OCR10.RAA (5'-AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG-3') и
OCR10.PVIrc (5'-CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAAGATGACG-3'), которая амплифицирует ДНК размером 102 п.н.; и
(b) OCR10.TDY (5'-GACCTCACTTGCTACACTGACTAC-3') и OCR10.QETrc (5'-ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG-3', которая амплифицирует ДНК размером 1500 п.н.
Эта mOCR10 ВАС содержала приблизительно 180 т.п.н. геномной ДНК, в том числе полную кодирующую последовательность mOCR10. Этот ВАС-клон использовали для генерирования LTVEC, который затем использовали для делеции части кодирующего района mOCR10 при одновременном введении репортерного гена, инициирующий кодон которого точно заменял инициирующий кодон OCR10, а также инсертировании гена селектируемого маркера, применимого для отбора как в E. coli, так и в клетках млекопитающих, после репортерного гена (фигура 2). Этот репортерный ген (в данном неограничительном примере LacZ, последовательность которого легко доступна для специалиста в данной области) кодирует фермент β-галактозидазу E. coli. Вследствие положения инсерции LacZ (его инициирующий кодон находится в том же самом положении, что и инициирующий кодон mOCR10) экспрессия lacZ должна имитировать экспрессию mOCR10, как наблюдалось в других примерах, где осуществляли подобные замены с применением LacZ с использованием прежних технологий (см. "Gene trap strategies in ES cells", by W Wurst and A. Gossler, in Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). Ген LacZ позволяет выполнять простой и стандартный ферментативный анализ, который может выявить картину его экспрессии in situ, обеспечивая таким образом суррогатный анализ, который отражает картину нормальной экспрессии замененного гена (генов) или хромосомного локуса (локусов).
b. Конструирование донорного фрагмента и генерирование LTVEC.
Модификационной кассетой, используемой в конструировании LTVEC mOCR10, является кассета lacZ-SV40 polyA-PGKp-EM7-neo-PGK polyA, где lacZ является маркерным геном, описанным выше, polyA SV40 является фрагментом, произведенным из обезьяньего вируса 40 (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19:157-64, 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem, 253:1613-8, 1978; Dhar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 71:371-5, 1974; Reddy, et al., Science, 200:494-502, 1978) и содержащим сайт и сигнал полиаденилирования (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19:157-64, 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem, 253:1613-8, 1978; Dhar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 71:371-5, 1974; Reddy, et al., Science, 200:494-502, 1978), PGKp является промотором мышиной фосфоглицераткиназы (PGK) (Adra, et al., Gene, 60:65-74, 1987) (который использовали широко для запуска экспрессии генов устойчивости к лекарственным средствам в клетках млекопитающих), EM7 является сильным бактериальным промотором, который имеет преимущество, заключающееся в том, что он позволяет производить положительный отбор в бактериях полной конструкции LTVEC посредством запуска экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы (neo), neo является селектируемым маркером, который придает устойчивость к канамицину в прокариотических клетках и устойчивость к G418 в эукариотических клетках (Beck, et al., Gene, 19:327-36, 1982), и polyA PGK является 3'-нетранслируемым районом, произведенным из гена PGK и содержащим сайт и сигнал полиаденилирования (Boer, et al., Biochem Genet, 28:299-308, 1990).
Для конструирования LTVEC mOCR10 сначала генерировали донорный фрагмент, состоящий из блока гомологии 1 (hb1) mOCR10, присоединенного слева от гена LacA в модификационной кассете, и блока гомологии 2 (hb2) mOCR10, присоединенного справа от последовательности polyA neo-PGK в модификационной кассете (фигура 2), с использованием стандартной технологии рекомбинантной генетической инженерии. Блок гомологии 1 (hb1) состоит из 211 п.н. нетранслируемой последовательности непосредственно слева от инициирующего метионина открытой рамки считывания mOCR10 (mOCR10 ORF) (фигура 3А-3D). Блок гомологии 2 (hb2) состоит из последних 216 п.н. ORF mOCR10, заканчивающихся стоп-кодоном (фигура 3А-3D).
Затем, с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации (Zhang, et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27:e16, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:5978-83, 2000), этот донорный фрагмент использовали для точной замены кодирующего района mOCR10 (от инициирующего метионина до стоп-кодона) инсерционной кассетой, что приводило к конструированию LTVEC mOCR10 (фигура 2). Таким образом, в этом LTVEC mOCR10 кодирующая последовательность mOCR10 была заменена инсерционной кассетой с созданием делеции размером приблизительно 20 т.п.н. в локусе mOCR10 с оставлением в то же время приблизительно 130 т.п.н. гомологии слева (левое плечо гомологии) и 32 т.п.н. гомологии справа (правое плечо гомологии).
Важно отметить, что LTVEC могут быть более быстро и легко генерированы из доступных библиотек ВАС, чем нацеливающие векторы, получаемые с использованием прежних технологий, так как требуется только одна стадия бактериальной гомологичной рекомбинации и единственной требующейся информацией о последовательности является информация последовательности, необходимая для генерирования блоков гомологии. В противоположность этому, прежние подходы для генерирования нацеливающих векторов с использованием бактериальной гомологичной рекомбинации требуют, чтобы большие нацеливающие векторы были "подрезаны" перед их введением в ES-клетки (Hill et al., Genomics, 64:111-3, 2000). Это подрезание является необходимым вследствие необходимости генерирования плеч гомологии, достаточно коротких для адаптации к способам скрининга, используемым прежними подходами. Одним из главных недостатков способа Hill et al. является то, что требуются две дополнительные стадии гомологичной рекомбинации просто для подрезания (одна для подрезания района слева от модифицированного локуса и одна для подрезания района справа от модифицированного локуса). Чтобы выполнить это, требуется существенно больше информации о последовательности, в том числе информации о последовательности, включающей в себя сайты подрезания.
Кроме того, другим очевидным преимуществом, иллюстрируемым приведенным выше примером, является то, что очень большая делеция, включающая в себя ген mOCR10 (приблизительно 20 т.п.н.), может быть легко генерирована с помощью единственной стадии. В противоположность этому, прежние технологии могут требовать для выполнения той же самой задачи нескольких стадий и могут включать в себя маркирование районов слева и справа от кодирующих последовательностей сайтами loxP для применения Cre-рекомбиназы для удаления последовательности, фланкированной этими сайтами, после введения модифицированного локуса в эукариотические клетки. Это может быть невыполнимым в одной стадии, и, следовательно, может требовать конструирования двух нацеливающих векторов, использующих различные маркеры отбора, и двух последовательных событий нацеливания в ES-клетках, одного для введения сайта lozP в районе слева от кодирующей последовательности и другого для введения сайта loxP в районе справа от кодирующей последовательности. Далее следует отметить, что создание больших делеций часто происходит с низкой эффективностью при использовании прежних технологий нацеливания в эукариотических клетках, так как частота получения гомологичной рекомбинации может быть низкой при использовании нацеливающих векторов, содержащих большую делецию, фланкированную относительно короткими плечами гомологии. Высокая эффективность, получаемая с использованием способа данного изобретения (см. ниже), обусловлена очень длинными плечами гомологии, присутствующими в LTVEC, которые увеличивают скорость гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках.
с. Подтверждение, получение и введение ДНК LTVEC mOCR10 в ES-клетки.
Последовательность, окружающую место соединения инсерционной кассеты, и последовательность гомологии подтверждали секвенированием ДНК. Размер LTVEC mOCR10 подтверждали рестрикционным анализом с последующим электрофорезом в пульсирующем (электрическом) поле (PFGE) (Cantor, et al., Annu Rev Biophys Biophys Chem, 17:287-304, 1988; Schwartz and Cantor, Cell, 37:67-75, 1984). Выполняли стандартное крупномасштабное получение плазмиды LTVEC mOCR10, плазмидную ДНК расщепляли рестриктазой NotI, которая производит разрез в каркасе вектора LTVEC mOCR10 с образованием линейной ДНК. Затем линеаризованную ДНК вводили в мышиные ES-клетки электропорацией (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999; Sambrook, et al., Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989). ES-клетки, успешно трансфицированные LTVEC mOCR10, отбирали в G418-содержащей среде с использованием стандартных способов отбора (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999).
d. Идентификация ES-клеток с успешным нацеливанием с использованием количественного анализа модификации аллеля (МОА).
Для идентификации ES-клеток, в которых один из двух эндогенных генов mOCR10 был заменен последовательностью модификационной кассеты, ДНК из отдельных клонов ES-клеток анализировали количественной ПЦР с использованием стандартной TaqMan®-методологии, как описано (Applied Biosystems, TaqMan® Universal PCR Master Mix, catalog number P/N 4304437; см. также http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04304449.pdf). Используемые праймеры и TaqMan®-зонды являются такими, как и описанные на фигуре 3А-3D. Были скринированы в целом 69 независимых клонов ES-клеток и 3 из них были идентифицированы как положительные, т.е. как клоны, в которых одна из эндогенных кодирующих mOCR10 последовательностей была заменена описанной выше модификационной кассетой.
Несколько преимуществ МОА-подхода являются очевидными:
(i) Он не требует применения зонда вне подлежащего модификации локуса, что устраняет необходимость знания последовательности, фланкирующей модифицированный локус.
(ii) Он требует небольшого времени для выполнения по сравнению с общепринятой методологией блоттинга по Саузерну, который был ранее предпочтительным способом (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), уменьшая, следовательно, время для идентификации правильно модифицированных клеток с обычных нескольких дней до всего лишь нескольких часов.
Это является существенным улучшением пути скрининга, выполняемого в прошлом, и делает этот способ менее трудоемким и более экономически эффективным подходом к скринингу на события гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках.
Другим преимуществом способа данного изобретения является то, что он превосходит также предыдущие технологии вследствие его способности производить нацеливание на трудные для нацеливания локусы. С использованием прежних технологий было показано, что для определенных локусов частота успешного нацеливания может быть такой низкой, как 1 на 2000 событий интеграции, возможно, даже более низкой. С использованием способа данного изобретения заявители продемонстрировали, что такие трудные локусы могут обнаруживать гораздо более эффективное нацеливание с использованием LTVEC, которые содержат длинные плечи гомологии (т.е. более длинные, чем плечи гомологии, возможные в случае прежних технологий). В качестве неограничивающего примера, вышеописанное демонстрирует, что заявители выполняли нацеливание на локус OCR10, локус, который, как было ранее показано, является не поддающимся для нацеливания с использованием общепринятой технологии. С использованием способа данного изобретения заявители показали, что они получили успешное нацеливание в 3 из 69 клонов ES-клеток, в которые был интегрирован LTVEC mOCR10 (содержащий более чем 160 т.п.н. плеч гомологии и вводящий делецию 20 т.п.н.), тогда как с применением прежней технологии для нацеливания на ES-клетки (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) с использованием вектора на основе плазмиды с плечами гомологии, более короткими, чем 10-20 т.п.н., делеция менее 15 т.п.н. хотя и вводилась, не были идентифицированы события нацеливания среди более чем 600 интегрантов этого вектора. Эти данные ясно демонстрируют превосходство способа данного изобретения над прежними технологиями.
Пример 2: Увеличенная частота нацеливания и отмена необходимости применения изогенной ДНК при использовании LTVEC в качестве нацеливающих векторов.
Как отмечалось выше, увеличенная частота нацеливания, получаемая с использованием длинных плеч гомологии, должна уменьшать выгоду, если она имеется, получаемую из применения геномной ДНК в конструировании LTVEC, которая является изогенной (т.е. идентичной по последовательности) с ДНК эукариотической клетки-мишени. Для испытания этой гипотезы заявители сконструировали несколько LTVEC с применением геномной ДНК, полученной из того же субштамма мыши, из которого получена эукариотическая клетка, подлежащая нацеливанию (предположительно изогенной), и большое число других LTVEC с применением геномной ДНК, полученной из мышиных субштаммов, отличающихся от субштамма эукариотической клетки, подлежащей нацеливанию (предположительно неизогенной). Неизогенные LTVEC проявляли среднюю частоту нацеливания 6% (в диапазоне 1-20%, таблица 1), тогда как изогенные LTVEC проявляли среднюю частоту нацеливания 3% (в диапазоне 2-5%), что свидетельствует о том, что частота успешного нацеливания с использованием LTVEC не зависит от изогенности.
Пример 3: Подробное описание анализа МОА на основе TaqMan® для идентификации ES-клонов с успешным нацеливанием.
Клоны ES-клеток, которые поглотили LTVEC и включили его в геном в локусе-мишени гомологичной рекомбинацией, идентифицируют анализом модификации аллеля (МОА), который использует количественную ПЦР реального времени для обнаружения различия между клонами ES-клеток с успешным нацеливанием, в которых один из двух аллелей-мишеней является модифицированным, и клонов ES-клеток без успешного нацеливания, в которых оба аллеля остаются немодифицированными. Анализ МОА состоит из первичного и вторичного скрининга. Первичный скрининг включает в себя следующие стадии: (1) выращивание LTVEC-трансфицированных клонов ES-клеток на покрытых желатином 96-луночных планшетах; (2) выделение геномной ДНК из каждого клона ES-клеток; (3) использование каждой пробы геномной ДНК в качестве матрицы в 8 отдельных количественных ПЦР на двух 384-луночных планшетах, в которых 2 из этих ПЦР используют набор специфических для локуса-мишени праймеров, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями на одной стороне геномного фрагмента, нацеленного на делецию ("левая ПЦР"), 2 из этих ПЦР используют набор специфических для локуса-мишени праймеров, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями на другой стороне геномного фрагмента, нацеленного на делецию ("правая ПЦР"), 4 из ПЦР используют набор праймеров, которые узнают четыре не имеющих нацеливания ссылочных локуса ("ссылочные ПЦР"), и каждая ПЦР включает в себя флуоресцентный зонд (например, TaqMan® [ABI], Eclipse™ или Молекулярный маяковый зонд [Synthetic Genetics]), который узнает амплифицированную последовательность и сигнал флуоресценции которого прямо пропорционален количеству ПЦР-продукта; (4) проведение этих ПЦР в устройстве, которое является комбинацией термоциклера и детектора флуоресценции (например, ABI 7900HT), которое определяет накопление продуктов амплификации во время ПЦР и определяет пороговый цикл (CТ), точку в ПЦР, в которой сигнал флуоресценции является детектируемым выше фонового шума; (5) для пробы ДНК каждого клона ES-клеток расчет различия в величинах CТ (ΔCТ) между "левыми" ПЦР и каждой из четырех ссылочных ПЦР и между "правыми" ПЦР и каждой из четырех ссылочных ПЦР для создания 8 таблиц из 96 величин ΔCТ; (6) нормализацию величин ΔCТ относительно положительных величин; (7) расчет медианы величины ΔCТ для каждой таблицы сравнения мишень-ссылочный локус; (8) определение доверительного уровня при помощи компьютерной программы, которая испытывает восемь таблиц ΔCТ и рассчитывает, в каком числе случаев конкретная проба ДНК клона ES-клеток дает более высокую величину ΔCТ в толерантных (допустимых) пределах 0,5-1,5, 0,25-1,5, 0,5-2,0, 0,25-2,0, 0,5-3,0 и 0,25-3,0 циклов, чем медиана ΔCТ (примеры языков компьютерного программирования, пригодных для создания или записи такой программы, включают в себя visual basics, Java или любой другой язык компьютерного программирования, известный специалисту с квалификацией в данной области); (9) построение этих величин и их медиан для каждой из восьми таблиц ΔCТ в виде гистограмм; и (10) идентификацию клонов-кандидатов ES-клеток с правильным нацеливанием из рассмотрения доверительных уровней и гистограмм ΔCТ. В предпочтительном примере величина ΔCТ для клонов-кандидатов с успешным нацеливанием находится в диапазоне на 0,5-1,5 циклов большем, чем медиана в 8 из 8 ссылочных сравнений.
Клоны-кандидаты, идентифицированные первичным скринингом анализа МОА, подтверждают или отвергают во вторичном скрининге, который включает в себя следующие стадии: (1) использование геномной ДНК из каждого из положительных клонов-кандидатов ES-клеток, из большего числа отрицательных клонов и из стандартов числа копий геномной ДНК из мышей, которые несут одну или две копии кассеты LacZ-Neo LTVEC на диплоидный геном, в качестве матриц в 8 отдельных количественных ПЦР на двух 384-луночных планшетах, в которых 1 реакция является "левой" ПЦР (как в первичном скрининге), одна реакция является "правой" ПЦР (как в первичном скрининге), 4 реакции являются ссылочными ПЦР с двумя ссылочными локусами, которые отличаются от ссылочных локусов, используемых в первичном скрининге, одна реакция является ПЦР с праймерами и зондом, которые являются специфическими для гена LacZ LTVEC, и одна реакция является ПЦР с праймерами и зондом, которые являются специфическими для гена Neo LTVEC; (2) проведение этих ПЦР в устройстве для количественной ПЦР, как в первичном скрининге; (3) расчет, как в первичном скрининге, величин (ΔCТ) между "левой" ПЦР и каждой из двух ссылочных ПЦР, между "правыми" ПЦР и каждой из двух ссылочных ПЦР, между ПЦР LacZ и каждой из ссылочных ПЦР и между ПЦР Neo и каждой из двух ссылочных ПЦР для создания восьми таблиц ΔCТ; (4) нормализацию величин ΔCТ относительно положительных величин; (5) расчет величины медианы для каждой таблицы ΔCТ; (6) расчет доверительных уровней, как в первичном скрининге; (7) построение этих величин и их медиан для каждой из восьми таблиц ΔCТ в виде гистограмм.
Из рассмотрения доверительных уровней и гистограмм ΔCТ как для первичного, так и для вторичного скринингов клоны-кандидаты ES-клеток с правильным нацеливанием либо подтверждаются, либо отвергаются. В предпочтительном примере величина ΔCТ для клонов-кандидатов с успешным нацеливанием находится в диапазоне на 0,5-1,5 циклов большем, чем медиана в 12 из 12 ссылочных сравнений из комбинированных первичного и вторичного скринингов.
Для оценки числа копий LTVEC на диплоидный геном в подтвержденных ES-клонах с правильным нацеливанием их величины ΔCТ из сравнений ПЦР LacZ и Neo с двумя ссылочными ПЦР сравнивают с величинами ΔCТ для стандартов числа копий LacZ-Neo. Каждый клон ES-клеток оценивают как имеющий 1, 2 или более 2 копий LTVEC. Для каждого модифицированного аллельного продукта клоны ES-клеток подвергают скринингу в группах из 96 (обычно меньше, чем 288 клонов в целом), пока не будут идентифицированы 3 клона, которые оцениваются как положительные в анализе МОА и имеют единственную копию кассеты LacZ-Neo.
Пример 4: Применение FISH (гибридизации с флуоресценцией in situ) для идентификации правильно нацеленных LTVEC в ES-клетках.
С использованием технологии LTVEC, описанной здесь, заявители разрушили ген SM22альфа в ES-клетках. SM22альфа является белком с Нг 22 кДа, ограниченным линией дифференцировки клеток гладких мышц (SMC), который физически связывает пучки филаментов актина цитоскелета в сократительных SMC. Затем ES-клетки с успешным нацеливанием подвергают стандартной гибридизации с флуоресценцией in situ (FISH) на метафазных хромосомных распределениях для подтверждения, что нацеливание на ген было правильным. Этот эксперимент выполняли с двумя зондами: 1) зондом гена SM22альфа, состоящим из немодифицированного клона ВАС SM22альфа, используемым для генерирования LTVEC, и 2) зондом ДНК LacZ и неомицина, который детектирует только модификацию гена, произведенную событием нацеливания (инсертирование кассет генов LacZ и Neo). Метафазные хромосомные распределения получали из клеток, и гибридизацию выполняли одновременно с обоими зондами, которые были помечены различными окрашенными флуорофорами для обеспечения возможности детектирования гибридизации каждого зонда в одном и том же хромосомном распределении. Линию ES-клеток без нацеливания анализировали параллельно в качестве контроля. Как и ожидалось, в контрольных хромосомных распределениях два аллеля SM22альфа детектировали на гомологичных хромосомных плечах, но не было гибридизации зонда LacZ-Neo. Как и в контролях, в распределениях ES-клеток с нацеливанием два аллеля детектировали только в одном и том же хромосомном положении и на гомологичных хромосомах, но двойное мечение зондом LacZ-Neo было заметным на одной из двух хромосом, что указывало на совместную локализацию ДНК-последовательностей SM22альфа и LacZ-Neo в этом аллеле SM22альфа. Важно, что последовательности ДНК гена SM22альфа или генов LacZ-Neo не детектировались в неправильных местоположениях в этих хромосомных распределениях. Отсутствие экстраинтеграции последовательностей гена SM22альфа и совместной локализации LacZ-Neo с SM22альфа в одной хромосоме гомологичной пары в значительной степени предполагает, что имело место правильное нацеливание LacZ-Neo на один из аллелей SM22альфа посредством гомологичной рекомбинации.
Пример 5: Снижение количества ДНК, используемой для электропорации ES-клеток, улучшает эффективность нацеливания.
Стандартные способы для нацеленной модификации генов в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клетках обычно используют 20-40 мкг нацеливающего вектора в процедуре электропорации. Авторы изобретения обнаружили, что с использованием LTVEC электропорация с гораздо более низкими количествами ДНК - в диапазоне от приблизительно 1 до 5 мкг на 1х107 клеток - удваивает частоту правильно нацеленных событий гомологичной рекомбинации, значительно уменьшая число вторичных, негомологичных инсерционных событий. Это явное улучшение эффективности нацеливания является важным, так как оно значительно уменьшает число клонов ES-клеток, которые необходимо подвергнуть скринингу для нахождения нескольких положительных клонов с правильно нацеленной однокопийной модификацией. Связанными с этим преимуществами являются уменьшенная стоимость и увеличенная производительность способа.
Пример 6: Применение способа изобретения для создания мышей с нокаутом МА61 для исследования мышечной атрофии.
МА61, также называемая MAFbx, является недавно открытой убиквитинлигазой, которая отрицательно регулируется при различных состояниях мышечной атрофии (См. Предварительную заявку США №60/264926, поданную 30 января 2001 года, Предварительную заявку США №60/311697, поданную 10 августа 2001 года, и Предварительную заявку США (регистрационный номер еще не известен), поданную 22 октября 2001 года, все переуступленные Regeneron Pharmaceuticals, Inc., каждая из которых включена здесь в ее полном виде в качестве ссылки). Для дополнительного исследования биологического значения этого гена в мышечной атрофии создавали мышей с нокаутом гена с использованием способа данного изобретения следующим образом.
Сначала для получения большого клонированного геномного фрагмента, содержащего ген МА61, библиотеку бактериальных искусственных хромосом (ВАС) подвергали скринингу с праймерами, произведенными из кДНК-последовательности МА61. Полученный таким образом клон ВАС использовали затем для создания Большого Нацеливающего Вектора для Эукариотических клеток (LTVEC) следующим образом. Конструировали модификационную кассету, содержащую 5'-блок гомологии/ген lacZ/polyA/промотор PGK/neo/polyA/3'-блок гомологии. Блоки гомологии присоединяли для маркирования сайтов бактериальной гомологичной рекомбинации во время генерирования LTVEC. LacZ является репортерным геном, который помещали таким образом, что его инициирующий кодон был в том же самом положении, что и инициирующий кодон МА61. После гомологичной рекомбинации в бактериях эта модификационная кассета заменяла ген МА61. Таким образом, создавали LTVEC МА61, где кодирующие последовательности МА61 в клоне ВАС заменяли модификационной кассетой, сконструированной как описано выше. Затем получали ДНК LTVEC, очищали и линеаризировали для введения в эукариотические клетки, как описано infra.
Получали минипрепарат ДНК LTVEC МА61 (Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Tillett and Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998; http://www.qiagen.com/ literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf) и повторно трансформировали в E. coli при помощи электропорации (Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989) для удаления плазмиды, кодирующей рекомбиногенные белки, которые используются для стадии бактериальной гомологичной рекомбинации (Zhang et al., Nat Genet, 20:123-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999). Перед введением LTVEC МА61 в эукариотические клетки большие количества LTVEC МА61 получали стандартной методологией (http:,,www.qiagen.com/literature/ handbooks/plk/plklow.pdf; Sambrook, J, E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2 and 3, 1989; Tillett and Neilan, Biotechniques, 24:568-70, 572, 1998).
Затем, для получения LTVEC МА61 для введения в эукариотические клетки LTVEC МА61 линеаризировали. Это выполняли расщеплением рестриктазой NotI, что приводит к получению ДНК модифицированного эндогенного гена (генов) или хромосомного локуса (локусов), фланкированной длинными плечами гомологии.
Затем LTVEC МА61 вводили в эукариотические клетки с использованием стандартной методологии электропорации (Sambrook, J, E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989). Клетки, в которых LTVEC МА61 вводился успешно, отбирали посредством подвергания действию селектирующего агента. Поскольку селектируемым маркером, используемым в модификационной кассете, был ген неомицинфосфотрансферазы (neo) (Beck, et al., Gene, 19:327-36, 1982), клетки, которые поглотили LTVEC МА61, отбирали в среде, содержащей G418; клетки, которые не имеют LTVEC МА61, погибали, тогда как клетки, которые поглощали LTVEC МА61, выживали (Santerre, et al., Gene, 30:147-56, 1984).
Эукариотические клетки, которые были успешно модифицированы нацеливанием LTVEC МА61 в локус МА61, идентифицировали с использованием способа количественной ПЦР с TaqMan® (Lie and Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9:43-8, 1998).
Наконец, генетически модифицированные ES-клетки использовали для создания генетически модифицированных, в этом случае имеющих нокаут гена, мышей стандартной инъекцией бластоцисты. Таким образом были созданы мыши с нокаутом МА61, т.е. мыши, в которых был делетирован ген МА61.
Как мышей с нокаутом, так и мышей дикого типа (WT) подвергали действию индуцирующих мышечную атрофию условий, создаваемых денервацией этих мышей, и уровни атрофии сравнивали. Сначала выделяли седалищный нерв в области середины бедра правой задней конечности и перерезали в мышах. Перерезание седалищного нерва ведет к денервации и, на протяжении 14-дневного периода, к атрофии в мышцах задней конечности, в частности передней большеберцовой и икроножной мышцах, на протяжении 14-дневного периода. При 7 и 14 днях после денервации животных умерщвляли ингаляцией диоксида углерода. Затем переднюю большеберцовую мышцу (ТА) и икроножный комплекс (GA) мышц удаляли из правой (денервированной) и левой (интактной) нижних конечностей, взвешивали и замораживали на определенном отрезке в охлажденном жидким азотом изопентане. Степень атрофии оценивали сравнением веса мышц из денервированной конечности с весом мышц из неденервированной конечности.
Мышечную атрофию оценивали спустя 7 и 14 дней после перерезания правого седалищного нерва. Сырые веса правых денервированных мышц сравнивали с сырыми весами левых, неденервированных мышц. Сравнения правые:левые приведены в таблице 2.
| 7 дней | Икроножный комплекс | Передняя большеберцовая | ||||||
| Генотип | Размер пробы | Среднее | SE | Размер пробы | Среднее | SE | ||
| WT | 7 | 0,76 | 0,016 | 11 | 0,68 | 0,033 | ||
| НОК | 6 | 0,84 | 0,022 | 11 | 0,80 | 0,015 | ||
| 14 дней | Икроножный комплекс | Передняя большеберцовая | ||||||
| Размер пробы | Среднее | SE | Размер пробы | Среднее | SE | |||
| WT | 5 | 0,55 | 0,024 | 5 | 0,62 | 0,023 | ||
| НОК | 5 | 0,80 | 0,019 | 5 | 0,80 | 0,012 | ||
В дни 7 и 14 мышцы из мышей с нокаутом обнаружили значимо (р<0,001) меньшую атрофию, чем мышцы из мышей дикого типа. Различие между мышами с нокаутом и дикого типа было большим при 14 днях, чем при 7 днях. Хотя мыши дикого типа обнаружили продолжающуюся атрофию между днями 7 и 14, мыши с нокаутом не обнаруживали дополнительной атрофии.
В целом, можно заключить, что подход создания LTVEC и прямого их использования в качестве нацеливающих векторов в комбинации со скринингом МОА на события гомологичной рекомбинации в ES-клетках создает новый способ для конструирования генетически модифицированных локусов, который является быстрым, недорогим и представляет собой существенное улучшение по сравнению с утомительными, трудоемкими способами, используемыми ранее. Таким образом, этот подход открывает возможность быстрого крупномасштабного функционального генетического анализа in vivo по существу любых и всех генов в геноме организма с использованием лишь части времени и затрат, необходимых для прежних методологий.
Хотя вышеизложенное изобретение было описано с некоторыми подробностями в качестве иллюстрации и примеров, специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что некоторые изменения и модификации могут быть произведены в отношении описанного изобретения без отклонения от сути или объема прилагаемой формулы изобретения.
Claims (36)
1. Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса в эукариотических клетках, предусматривающий:
a) получение большого клонированного геномного фрагмента размером более 20 т.п.н., содержащего представляющую интерес последовательность ДНК;
b) использование бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора (LTVEC) для применения в эукариотических клетках; суммарный размер плечей гомологии LTVEC составляет более 20 т.п.н.
c) введение LTVEC (b) в эукариотические клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках путем гомологичной рекомбинации и
d) использование количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации тех эукариотических клеток, в которых эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован.
2. Способ по п.1, где большой клонированный геномный фрагмент, содержащий последовательности ДНК, гомологичен интересующему эндогенному гену или хромосомному локусу.
3. Способ по п.1 или 2, где генетическая модификация эндогенного гена или хромосомного локуса включает в себя делецию кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента; изменение кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента; инсерцию новой кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента; создание условного аллеля или замену кодирующей последовательности или сегмента гена одного вида на гомологичную или ортологичную кодирующую последовательностью из того же самого или другого вида.
4. Способ по п.3, где изменение кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента включает в себя замену, добавление или слияние.
5. Способ по п.4, где слияние включает в себя эпитопную метку или бифункциональный белок.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где количественный анализ включает в себя количественную ПЦР, гибридизацию с использованием флуоресценции in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК или количественную гибридизацию с иммобилизованным зондом.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где эукариотические клетки являются эмбриональными стволовыми клетками млекопитающего.
8. Способ по п.7, где эмбриональными стволовыми клетками являются эмбриональные стволовые клетки мыши, крысы или другого грызуна.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где эндогенным геном или хромосомным локусом является ген или хромосомный локус млекопитающего.
10. Способ по п.9, где эндогенным геном или хромосомным локусом является ген или хромосомный локус человека.
11. Способ по п.9, где эндогенным геном или хромосомным локусом является ген или хромосомный локус мыши, крысы или другого грызуна.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где LTVEC способен вмещать в себя большие фрагменты ДНК размером более 100 т.п.н.
13. Способ по любому из пп.1-12, где приблизительно 1-5 мкг большого нацеливающего вектора (с) вводят в приблизительно 1×107 клеток.
14. Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса в мышиных эмбриональных стволовых клетках, предусматривающий:
a) получение большого клонированного геномного фрагмента размером более 20 т.п.н., который содержит интересующую последовательность ДНК, где большой клонированный фрагмент ДНК гомологичен эндогенному гену или хромосомному локусу;
b) использование бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в мышиных эмбриональных стволовых клетках, суммарный размер плечей более 20 т.п.н., где генетическая модификация является делецией кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента;
c) введение большого нацеливающего вектора (b) в мышиные эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках путем гомологичной рекомбинации и
d) использование количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в мышиных эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации эмбриональных стволовых клеток мыши, в которых эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован, где количественным анализом является количественная ПЦР.
15. Способ по п.14, где приблизительно 1-5 мкг большого нацеливающего вектора (с) вводят приблизительно 1×107 клеткам.
16. Генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус для применения для получения генетически модифицированного нечеловеческого организма, где ген или локус получен способом по любому из пп.1-13.
17. Генетически модифицированная эукариотическая клетка для применения для получения генетически модифицированного организма (не человек), где клетку получают способом по любому из пп.1-13.
18. Генетически модифицированная клетка по п.17, которая является эмбриональной стволовой клеткой.
19. Применение генетически модифицированной клетки по п.17 или 18 для получения организма (не человека).
20. Генетически модифицированная мышиная эмбриональная стволовая клетка для получения генетически модифицированной мыши, где клетку получают способом по п.14.
21. Применение генетически модифицированной мышиной эмбриональной стволовой клетки по п.20 для получения мыши.
22. Организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный способом по любому из пп.1-13.
23. Мышь, содержащая генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный способом по п.14.
24. Организм (не человек), полученный из генетически модифицированных эукариотических клеткок по п.17 или 18.
25. Мышь, полученная из генетически модифицированной мышиной эмбриональной стволовой клетки по п.20.
26. Организм (не человек), содержащий генетически модифицированный интересующий эндогенный ген или хромосомный локус, полученный способом, который предусматривает стадии:
a) получения большого клонированного геномного фрагмента размером более 20 т.п.н., содержащего интересующую последовательность ДНК;
b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора (LTVEC) с суммарным размером плечей гомологии, равным более 20 т.п.н., для применения в эмбриональных стволовых клетках;
c) введения LTVEC (b) в эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в клетках путем гомологичной рекомбинации;
d) использования количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации эмбриональных стволовых клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован;
e) введения эмбриональной стволовой клетки (d) в бластоцисту и
f) введения бластоцисты (е) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
27. Организм (не человек) по п.26, который является организмом мыши, крысы или другого грызуна.
28. Организм (не человек) по п.26 или 27, который получают способом по любому из пп.2-13.
29. Мышь, содержащая генетически модифицированный интересующий эндогенный ген или хромосомный локус, полученная способом, который предусматривает стадии:
a) получения большого клонированного геномного фрагмента, большего 20 т.п.н., который содержит интересующую последовательность ДИК, где большой клонированный фрагмент ДИК гомологичен эндогенному гену или хромосомному локусу;
b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в мышиных эмбриональных стволовых клетках, суммарный размер плечей гомологии большого нацеливающего вектора составляет более 20 т.п.н., где эта генетическая модификация является делецией кодирующей последовательности, сегмента гена или регуляторного элемента;
c) введения большого нацеливающего вектора (b) в мышиные эмбриональные стволовые клетки для модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках путем гомологичной рекомбинации и
d) использования количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в мышиных эмбриональных стволовых клетках (с) для идентификации мышиных эмбриональных стволовых клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован, где количественный анализ является количественной ПЦР;
e) введения мышиной эмбриональной стволовой клетки (d) в бластоцисту и
f) введения бластоцисты (е) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
30. Мышь по п.29, которую получают способом по пп.2-13.
31. Организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный способом, который предусматривает стадии:
a) получения большого клонированного геномного фрагмента размером более 20 т.п.н., содержащего представляющую интерес ДНК-последовательность;
b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC); суммарный размер плечей гомологии большого нацеливающего вектора составляет более 20 т.п.н.;
c) введения LTVEC (b) в эукариотические клетки для генетической модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках путем гомологичной рекомбинации;
d) использования количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации эукариотических клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован;
(е) удаления ядра из эукариотической клетки (d);
f) введения ядра (е) в ооцит и
g) введения ооцита (f) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
32. Организм (не человек) по п.31, который является организмом мыши, крысы или другого грызуна.
33. Организм (не человек) по п.31 или 32, который получают способом по пп.2-13.
34. Организм (не человек), содержащий генетически модифицированный эндогенный ген или хромосомный локус, полученный способом, который предусматривает стадии:
a) получения большого клонированного геномного фрагмента размером более 20 т.п.н., содержащего интересующую последовательность ДНК;
b) использования бактериальной гомологичной рекомбинации для генетической модификации большого клонированного геномного фрагмента (а) для создания большого нацеливающего вектора для применения в эукариотических клетках (LTVEC); суммарный размер плечей гомологии большого нацеливающего вектора составляет более 20 т.п.н.;
c) введения LTVEC (b) в эукариотические клетки для генетической модификации эндогенного гена или хромосомного локуса в этих клетках путем гомологичной рекомбинации;
d) использования количественного анализа для определения модификации аллеля (МОА) в эукариотических клетках (с) для идентификации эукариотических клеток, в которых этот эндогенный ген или хромосомный локус был генетически модифицирован;
e) слияния эукариотической клетки (d) с другой эукариотической клеткой и
f) введения слитой эукариотической клетки (е) в суррогатного родителя женского пола для вынашивания плода.
35. Организм (не человек) по п.34, где организмом является мышь, крыса или другой грызун.
36. Организм (не человек) по п.34 или 35, который получают способом по любому из пп.2-13.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24466500P | 2000-10-31 | 2000-10-31 | |
| US60/244,665 | 2000-10-31 | ||
| US09/732,234 | 2000-12-07 | ||
| US09/732,234 US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2000-12-07 | Methods of modifying eukaryotic cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003116125A RU2003116125A (ru) | 2005-01-20 |
| RU2290441C2 true RU2290441C2 (ru) | 2006-12-27 |
Family
ID=26936709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003116125/13A RU2290441C2 (ru) | 2000-10-31 | 2001-10-31 | Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6586251B2 (ru) |
| EP (1) | EP1399575B1 (ru) |
| JP (7) | JP5339566B2 (ru) |
| KR (1) | KR100833136B1 (ru) |
| CN (1) | CN100497642C (ru) |
| AT (1) | ATE332388T1 (ru) |
| AU (2) | AU2004802A (ru) |
| BR (1) | BRPI0115096B1 (ru) |
| CA (1) | CA2426398C (ru) |
| CZ (1) | CZ304856B6 (ru) |
| DE (1) | DE60121372T2 (ru) |
| HK (1) | HK1059802A1 (ru) |
| HU (1) | HU227639B1 (ru) |
| MX (1) | MXPA03003797A (ru) |
| NO (1) | NO332300B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ525511A (ru) |
| PL (1) | PL204759B1 (ru) |
| RU (1) | RU2290441C2 (ru) |
| WO (1) | WO2002036789A2 (ru) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514672C2 (ru) * | 2008-06-27 | 2014-04-27 | Эвоник Рем ГмбХ | Рекомбинантная клетка, продуцирующая 2-гидроксиизомасляную кислоту |
| RU2656158C2 (ru) * | 2012-09-07 | 2018-05-31 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Функциональные локусы fad2 и соответствующие специфичные для сайта-мишени связывающиеся белки, способные индуцировать направленные разрывы |
| RU2676708C2 (ru) * | 2013-04-16 | 2019-01-10 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Направленная модификация генома крысы |
| RU2685914C1 (ru) * | 2013-12-11 | 2019-04-23 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| RU2734770C2 (ru) * | 2014-11-21 | 2020-10-23 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленной генетической модификации с использованием парных гидовых рнк |
| RU2749717C2 (ru) * | 2015-11-24 | 2021-06-16 | Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед | Способ временной трансфекции для продуцирования ретровируса |
| RU2751237C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-07-12 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| RU2752498C2 (ru) * | 2015-11-24 | 2021-07-28 | Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед | Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов |
Families Citing this family (190)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6908744B1 (en) * | 2000-03-14 | 2005-06-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of stimulating cartilage formation |
| AU8337701A (en) * | 2000-08-14 | 2002-02-25 | Us Health | Enhanced homologous recombination mediated by lambda recombination proteins |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6586251B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
| WO2004098490A2 (en) | 2002-05-17 | 2004-11-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| DK2314629T4 (da) | 2002-07-18 | 2023-02-06 | Merus Nv | Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer |
| USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| CA2496233A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | California Institute Of Technology | Methods and compositions for the generation of humanized mice |
| WO2004067725A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying modulators of nmur2-mediated activity |
| US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| AU2004242614B2 (en) | 2003-05-30 | 2011-09-22 | Merus N.V. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
| ES2667169T3 (es) | 2004-10-19 | 2018-05-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética |
| US20060117396A1 (en) * | 2004-11-30 | 2006-06-01 | Murphy Andrew J | Assay methods for identifying modulators of OPSDL3 and transgenic knockouts |
| CA2681530C (en) | 2007-03-22 | 2017-03-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 |
| DK2602323T3 (en) | 2007-06-01 | 2018-04-16 | Open Monoclonal Tech Inc | Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies |
| KR20100103810A (ko) * | 2007-12-10 | 2010-09-28 | 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. | 동종 재조합에 의한 표적화된 영역의 순차적인 치환 방법 |
| JP2011518555A (ja) * | 2008-04-14 | 2011-06-30 | サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 標的組込みのための線形ドナーコンストラクト |
| US20090328240A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-31 | Sing George L | Genetically modified mice as predictors of immune response |
| KR102362774B1 (ko) | 2008-09-30 | 2022-02-15 | 아블렉시스, 엘엘씨 | 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물 |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| DK3622813T3 (da) | 2009-07-08 | 2021-05-03 | Kymab Ltd | Dyremodeller og terapeutiske molekyler |
| US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| ES2908587T3 (es) | 2009-10-06 | 2022-05-03 | Regeneron Pharma | Ratones modificados genéticamente e injerto |
| WO2011059799A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional alleles |
| DK2954779T3 (da) | 2009-12-10 | 2019-05-13 | Regeneron Pharma | Mus, der frembringer tungkædeantistoffer |
| RU2549695C2 (ru) | 2009-12-21 | 2015-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ FCγR МЫШИ |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| US10143186B2 (en) | 2010-02-08 | 2018-12-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| US20120021409A1 (en) | 2010-02-08 | 2012-01-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common Light Chain Mouse |
| KR20210010942A (ko) | 2010-03-31 | 2021-01-28 | 아블렉시스, 엘엘씨 | 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작 |
| US9242014B2 (en) | 2010-06-15 | 2016-01-26 | The Regents Of The University Of California | Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) single chain Fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof |
| KR20220150430A (ko) | 2010-06-22 | 2022-11-10 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 사람 람다 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 경쇄를 발현하는 마우스 |
| US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| DK2597945T3 (da) | 2010-07-26 | 2020-09-21 | Trianni Inc | Transgene dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| NZ707327A (en) | 2010-08-02 | 2017-01-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| WO2012063048A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Kymab Limited | Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination |
| DK2663579T3 (en) | 2011-01-14 | 2017-07-31 | Univ California | THERAPEUTIC ANTIBODIES AGAINST ROR-1 PROTEIN AND PROCEDURES FOR USE THEREOF |
| DK3375284T3 (da) | 2011-02-15 | 2023-06-12 | Univ Yale | Humaniserede M-CSF-mus og anvendelser deraf |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| DE12192727T1 (de) | 2011-02-25 | 2013-07-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | ADAM6 Mäuse |
| PT2631654E (pt) | 2011-05-12 | 2015-08-21 | Regeneron Pharma | Ensaio de libertação de neuropéptidos para canais de sódio |
| PT3572517T (pt) | 2011-08-05 | 2021-06-23 | Regeneron Pharma | Murganhos da cadeia leve universal humanizada |
| ES2612935T3 (es) | 2011-09-19 | 2017-05-19 | Kymab Limited | Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos |
| WO2013041845A2 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Animals, repertoires & methods |
| EP2761008A1 (en) | 2011-09-26 | 2014-08-06 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| PL2627773T3 (pl) | 2011-10-17 | 2017-11-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ograniczony łańcuch ciężki immonoglobuliny pochodzącej od myszy |
| US9043996B2 (en) | 2011-10-28 | 2015-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
| GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
| HUE048511T2 (hu) | 2011-10-28 | 2020-07-28 | Regeneron Pharma | Kiméra fõ hisztokompatibilitási komplex (MHC) II molekulákat expresszáló, genetikailag módosított egerek |
| RU2661106C2 (ru) | 2011-10-28 | 2018-07-11 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Генетически модифицированные в отношении т-клеточного рецептора мыши |
| US9591835B2 (en) | 2011-10-28 | 2017-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
| SI2770821T1 (en) | 2011-10-28 | 2018-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex of mice |
| CA2853470A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Nano-suspension process |
| GB201122047D0 (en) * | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| SI2793567T1 (sl) | 2011-12-20 | 2019-05-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanizirane lahkoverižne miši |
| ES2753774T3 (es) | 2012-02-01 | 2020-04-14 | Regeneron Pharma | Ratones humanizados que expresan cadenas pesadas que contienen dominios VL |
| MX353278B (es) | 2012-03-06 | 2018-01-05 | Regeneron Pharma | Raton con cadena ligera comun. |
| CN104302170B (zh) | 2012-03-16 | 2016-09-28 | 瑞泽恩制药公司 | 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠 |
| BR112014022855A2 (pt) | 2012-03-16 | 2017-07-18 | Regeneron Pharma | animal não humano geneticamente modificado, mamífero geneticamente modificado, e, método para fabricar um animal não humano |
| RS57414B1 (sr) | 2012-03-16 | 2018-09-28 | Regeneron Pharma | Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih |
| US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| WO2013144567A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies |
| PL2847335T3 (pl) | 2012-04-25 | 2019-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą |
| ME03551B (me) | 2012-06-12 | 2020-07-20 | Regeneron Pharma | Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca |
| AR091482A1 (es) * | 2012-06-21 | 2015-02-04 | Recombinetics Inc | Celulas modificadas geneticamente y metodos par su obtencion |
| PL2887959T3 (pl) | 2012-08-23 | 2019-04-30 | Agensys Inc | Koniugaty leków i przeciwciał (adc), które wiążą białka 158p1d7 |
| EP3838923B1 (en) | 2012-08-24 | 2024-05-01 | The Regents of The University of California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
| EP4193834A1 (en) | 2012-09-07 | 2023-06-14 | Yale University | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
| EP3556206B1 (en) | 2012-11-05 | 2021-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
| WO2014130690A1 (en) * | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
| EP2958990B1 (en) | 2013-02-20 | 2019-10-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetic modification of rats |
| HUE045478T2 (hu) | 2013-02-20 | 2019-12-30 | Regeneron Pharma | Humanizált T-sejt koreceptorokat expresszáló egerek |
| US20150342163A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
| JP6444321B2 (ja) | 2013-02-22 | 2018-12-26 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | ヒト化主要組織適合性遺伝子複合体を発現するマウス |
| KR102313053B1 (ko) | 2013-03-11 | 2021-10-18 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 키메라 주요 조직적합성 복합체(ｍｈｃ) 제ｉ 부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스 |
| CN108464278B (zh) | 2013-03-11 | 2021-05-04 | 瑞泽恩制药公司 | 表达嵌合的主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子的转基因小鼠 |
| WO2014160179A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
| PL3501272T3 (pl) | 2013-03-13 | 2023-07-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mysz eksprymująca ograniczony repertuar lekkiego łańcucha immunoglobuliny |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| AU2014296219A1 (en) | 2013-08-01 | 2016-02-25 | Agensys, Inc. | Antibody drug conjugates (ADC) that bind to CD37 proteins |
| KR102138723B1 (ko) | 2013-08-07 | 2020-07-29 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Lincrna-결핍 비인간 동물 |
| MY191512A (en) | 2013-09-18 | 2022-06-28 | Regeneron Pharma | Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same |
| RS64573B1 (sr) | 2013-09-23 | 2023-10-31 | Regeneron Pharma | Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom |
| CA2925723A1 (en) | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| JP6484237B2 (ja) | 2013-11-19 | 2019-03-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | ヒト化増殖誘導リガンド遺伝子を有する非ヒト動物 |
| WO2015077071A1 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene |
| EP4349980A2 (en) | 2013-12-11 | 2024-04-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
| US11160879B2 (en) | 2014-01-15 | 2021-11-02 | Masamichi Yamamoto | Transgenic animal for visualization of ATP and use thereof |
| CN106255410B (zh) | 2014-03-21 | 2020-01-10 | 瑞泽恩制药公司 | 产生单结构域结合蛋白的非人动物 |
| SG10201808083VA (en) | 2014-03-21 | 2018-10-30 | Regeneron Pharma | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
| DK3841877T3 (da) | 2014-05-19 | 2023-11-27 | Regeneron Pharma | Genetisk modificeret mus, der eksprimerer human EPO |
| US9497945B2 (en) | 2014-05-30 | 2016-11-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized dipeptidyl peptidase IV (DPP4) animals |
| LT3152312T (lt) | 2014-06-06 | 2020-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tikslinio lokuso modifikavimo būdai ir kompozicijos |
| RU2735958C2 (ru) | 2014-06-19 | 2020-11-11 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген 1 запрограммированной гибели клеток |
| HUE049405T2 (hu) | 2014-06-23 | 2020-09-28 | Regeneron Pharma | Nukleáz-közvetített DNS-összeállítás |
| HUE041584T2 (hu) | 2014-06-26 | 2019-05-28 | Regeneron Pharma | Célzott genetikai módosítások és alkalmazási módszerek és készítmények |
| WO2016044745A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric antigen receptors |
| PL3207124T3 (pl) | 2014-10-15 | 2019-11-29 | Regeneron Pharma | Sposoby i kompozycje do wytwarzania lub utrzymywania komórek pluripotencjalnych |
| RU2020122439A (ru) | 2014-11-24 | 2020-09-24 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3 |
| US20160345549A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-12-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene |
| PT3230320T (pt) | 2014-12-09 | 2021-01-08 | Regeneron Pharma | Animais não humanos tendo um gene do cluster humanizado de diferenciação 274 |
| RU2707137C2 (ru) | 2014-12-19 | 2019-11-22 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленной генетической модификации посредством одноэтапного множественного нацеливания |
| MY178919A (en) | 2015-03-09 | 2020-10-23 | Agensys Inc | Antibody drug conjugates (adc) that bind to flt3 proteins |
| KR102616160B1 (ko) | 2015-03-16 | 2023-12-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 저하된 상위 및 하위 운동 뉴런 기능 및 감각 지각을 나타내는 비-인간 동물 |
| CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| HRP20231039T1 (hr) | 2015-04-06 | 2023-12-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Imunosni odgovori posredovani humaniziranim t stanicama kod ne-humanih životinja |
| JP6752221B2 (ja) | 2015-04-13 | 2020-09-09 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化ｓｉｒｐａ−ｉｌ１５ノックインマウス及びその使用方法 |
| US10395759B2 (en) | 2015-05-18 | 2019-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for copy number variant detection |
| CA2986048C (en) * | 2015-05-29 | 2021-10-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus |
| US10412939B2 (en) | 2015-09-02 | 2019-09-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of prostate cancer |
| KR102454546B1 (ko) | 2015-11-20 | 2022-10-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 림프구 활성화 유전자 3을 갖는 비인간 동물 |
| US10813346B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-10-27 | Trianni, Inc. | Enhanced immunoglobulin diversity |
| KR102482103B1 (ko) | 2016-01-13 | 2022-12-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류 |
| US20170218398A1 (en) * | 2016-01-30 | 2017-08-03 | Markus Alexander Brown | Method to selectively target cancerous cells for genetic manipulation |
| KR102487839B1 (ko) | 2016-02-04 | 2023-01-12 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 angptl8 유전자를 갖는 비인간 동물 |
| US11053288B2 (en) | 2016-02-04 | 2021-07-06 | Trianni, Inc. | Enhanced production of immunoglobulins |
| CN109195443A (zh) | 2016-02-16 | 2019-01-11 | 雷杰纳荣制药公司 | 具有突变型犬尿氨酸酶基因的非人动物 |
| KR102493894B1 (ko) | 2016-02-29 | 2023-01-31 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 tmprss 유전자를 갖는 설치류 |
| CA3018186C (en) | 2016-03-29 | 2023-06-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetic variant-phenotype analysis system and methods of use |
| RU2745563C2 (ru) | 2016-05-20 | 2021-03-29 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк |
| SI3462853T1 (sl) | 2016-06-03 | 2023-05-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo |
| SG11201811559WA (en) | 2016-06-27 | 2019-01-30 | Univ California | Cancer treatment combinations |
| US10912287B2 (en) | 2016-06-28 | 2021-02-09 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd | Genetically modified mice expressing humanized PD-1 |
| KR20190041476A (ko) | 2016-07-29 | 2019-04-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | C-절단된 피브릴린-1의 발현을 유도하는 돌연변이를 포함하는 마우스 |
| WO2018064600A1 (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus |
| KR102319069B1 (ko) | 2016-11-04 | 2021-11-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 면역글로불린 람다 경쇄 유전자좌를 갖는 비인간 동물 |
| WO2018157058A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal models of retinoschisis |
| AU2018309716A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-01-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof |
| CN111182790A (zh) | 2017-07-31 | 2020-05-19 | 瑞泽恩制药公司 | Crispr报告体非人类动物及其用途 |
| SG11202002002XA (en) | 2017-09-29 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals expressing humanized c1q complex |
| CN109666701B (zh) * | 2017-10-13 | 2021-08-24 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| WO2019072241A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC |
| CN116064611A (zh) | 2017-11-30 | 2023-05-05 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化trkb基因座的非人动物 |
| PT3720279T (pt) | 2017-12-05 | 2022-10-06 | Regeneron Pharma | Ratinhos tendo uma cadeia leve lambda de imunoglobulina manipulada e seus usos |
| CA3089331A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| CA3093850A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
| EP3811364A1 (en) | 2018-06-01 | 2021-04-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for sparse vector-based matrix transformations |
| KR102444180B1 (ko) | 2018-06-14 | 2022-09-16 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 면역글로불린 중쇄 암호화 서열에서 dh-dh 재배열 가능한 비인간 동물 |
| CN116200426A (zh) | 2018-07-16 | 2023-06-02 | 瑞泽恩制药公司 | Ditra疾病的非人动物模型及其用途 |
| CN109504708A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-03-22 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法 |
| IL301193A (en) | 2018-12-20 | 2023-05-01 | Regeneron Pharma | Nuclease-mediated repeat expansion |
| US20220104468A1 (en) | 2019-01-22 | 2022-04-07 | St. Jude Children's Research Hospital | Modulation of lc3-associated endocytosis pathway and genetically modified non-human animals as a model of neuroinflammation and neurodegeneration |
| CN112400022B (zh) | 2019-02-18 | 2023-06-30 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 具有人源化免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物 |
| JP2022520819A (ja) | 2019-02-22 | 2022-04-01 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 遺伝子改変ナトリウムチャネルを有する齧歯類およびその使用方法 |
| IL286917B (en) | 2019-04-04 | 2022-09-01 | Regeneron Pharma | Methods for scar-free insertion of targeted modifications into targeted vectors |
| IL286905B1 (en) | 2019-04-04 | 2024-02-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals containing the human coagulation factor 12 locus |
| WO2020214690A1 (en) | 2019-04-15 | 2020-10-22 | Qwixel Therapeutics | Fusion protein composition(s) comprising targeted masked type i interferons (ifna and ifnb) and an antibody against tumor antigen, for use in the treatment of cancer |
| EP3801011A1 (en) | 2019-06-04 | 2021-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use |
| TW202110323A (zh) | 2019-06-05 | 2021-03-16 | 美商再生元醫藥公司 | 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途 |
| KR20220017939A (ko) | 2019-06-07 | 2022-02-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 알부민 좌위를 포함하는 비-인간 동물 |
| WO2020264339A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modeling tdp-43 proteinopathy |
| AU2020300002A1 (en) | 2019-07-01 | 2022-02-24 | Tonix Pharma Limited | Anti-CD154 antibodies and uses thereof |
| WO2021066869A1 (en) | 2019-10-04 | 2021-04-08 | TAE Life Sciences | Antibody compositions comprising fc mutations and site-specific conjugation properties |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| CN115175559A (zh) | 2020-01-28 | 2022-10-11 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化pnpla3基因座的非人动物及其使用方法 |
| EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
| US20230102342A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-03-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| EP4138550A1 (en) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cxcl13 gene |
| KR20230024822A (ko) | 2020-06-25 | 2023-02-21 | 주식회사 휴맵 | 이형접합성 형질전환 동물 |
| CA3187680A1 (en) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Yashu Liu | Identification and production of antigen-specific antibodies |
| CN116323651A (zh) | 2020-10-01 | 2023-06-23 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人cr1的啮齿动物 |
| IL303626A (en) | 2020-12-16 | 2023-08-01 | Regeneron Pharma | Mice expressing human FC alpha receptors |
| IL303724A (en) | 2020-12-21 | 2023-08-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals with a humanized TSLP gene, a humanized TSLP receptor gene, and/or a humanized IL7RA gene |
| TW202241934A (zh) | 2020-12-23 | 2022-11-01 | 美商再生元醫藥公司 | 編碼錨定修飾抗體之核酸及其用途 |
| US20240059781A1 (en) | 2021-01-06 | 2024-02-22 | Tonix Pharma Limited | Methods of inducing immune tolerance with modified anti-cd154 antibodies |
| KR20230164150A (ko) | 2021-03-31 | 2023-12-01 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | TCRβ 레퍼토리의 다양성이 개선된 인간화 세포 면역 시스템 성분을 포함하는 유전자 변형된 마우스 |
| WO2022220603A1 (ko) | 2021-04-16 | 2022-10-20 | 고려대학교 산학협력단 | 코로나-19 바이러스 표적 인간 항체 |
| CN117529330A (zh) | 2021-06-18 | 2024-02-06 | 纳米医疗有限公司 | 用于治疗癌症的包括所掩蔽的I型干扰素(IFNα和IFNβ)的融合蛋白组合物和其方法 |
| WO2023077053A2 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5 |
| CA3238939A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Gaurang Patel | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
| WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
| WO2023150798A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
| WO2023154861A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents |
| WO2023212560A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
| WO2023235677A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animal model of tdp-43 proteinopathy |
| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| US20230417899A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Oshkosh Corporation | Position tracking for a lift device |
| WO2024020057A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified animal model and its use to model the human immune system |
| WO2024064860A1 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice expressing components of human cellular immune system |
| US20240130341A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1993004169A1 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| WO1994002602A1 (en) * | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| DE4228162C1 (de) * | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
| US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
| AU6819494A (en) * | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO2000046251A2 (en) * | 1999-02-05 | 2000-08-10 | Buelow Jens Ulrich | Human polyclonal antibodies from transgenic nonhuman animals |
| US6586251B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
-
2000
- 2000-12-07 US US09/732,234 patent/US6586251B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-31 AT AT01992495T patent/ATE332388T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 EP EP01992495A patent/EP1399575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 NZ NZ525511A patent/NZ525511A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 AU AU2004802A patent/AU2004802A/xx active Pending
- 2001-10-31 DE DE60121372T patent/DE60121372T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 HU HU0301575A patent/HU227639B1/hu unknown
- 2001-10-31 CZ CZ2003-1197A patent/CZ304856B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-10-31 BR BRPI0115096A patent/BRPI0115096B1/pt active IP Right Grant
- 2001-10-31 CA CA2426398A patent/CA2426398C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 PL PL361927A patent/PL204759B1/pl unknown
- 2001-10-31 RU RU2003116125/13A patent/RU2290441C2/ru active
- 2001-10-31 CN CNB018216609A patent/CN100497642C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-31 WO PCT/US2001/045375 patent/WO2002036789A2/en active Application Filing
- 2001-10-31 MX MXPA03003797A patent/MXPA03003797A/es active IP Right Grant
- 2001-10-31 AU AU2002220048A patent/AU2002220048B2/en not_active Expired
- 2001-10-31 KR KR1020037005885A patent/KR100833136B1/ko active IP Right Grant
- 2001-10-31 JP JP2002539535A patent/JP5339566B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-04-28 NO NO20031897A patent/NO332300B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-04-08 HK HK04102503A patent/HK1059802A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-06-15 JP JP2010136321A patent/JP2010220628A/ja active Pending
-
2013
- 2013-05-23 JP JP2013108631A patent/JP5892975B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-11-29 JP JP2013247817A patent/JP5945263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-12-26 JP JP2014265082A patent/JP2015062432A/ja not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-02-14 JP JP2017024803A patent/JP6486979B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2017-02-14 JP JP2017024802A patent/JP2017123855A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YANG X.W. et al., "Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome", Nat Biotechnol. 1997 Sep; 15(9):859-65. * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514672C2 (ru) * | 2008-06-27 | 2014-04-27 | Эвоник Рем ГмбХ | Рекомбинантная клетка, продуцирующая 2-гидроксиизомасляную кислоту |
| RU2514672C9 (ru) * | 2008-06-27 | 2014-10-20 | Эвоник Рем ГмбХ | Рекомбинантная клетка, продуцирующая 2-гидроксиизомасляную кислоту |
| RU2656158C2 (ru) * | 2012-09-07 | 2018-05-31 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Функциональные локусы fad2 и соответствующие специфичные для сайта-мишени связывающиеся белки, способные индуцировать направленные разрывы |
| RU2656159C2 (ru) * | 2012-09-07 | 2018-05-31 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Локусы функциональности fad2 и соответствующие специфичные к участку-мишени связывающие белки, способные индуцировать направленные разрывы |
| RU2676708C2 (ru) * | 2013-04-16 | 2019-01-10 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Направленная модификация генома крысы |
| RU2685914C1 (ru) * | 2013-12-11 | 2019-04-23 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| RU2725520C2 (ru) * | 2013-12-11 | 2020-07-02 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| RU2734770C2 (ru) * | 2014-11-21 | 2020-10-23 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленной генетической модификации с использованием парных гидовых рнк |
| RU2749717C2 (ru) * | 2015-11-24 | 2021-06-16 | Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед | Способ временной трансфекции для продуцирования ретровируса |
| RU2752498C2 (ru) * | 2015-11-24 | 2021-07-28 | Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед | Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов |
| RU2751237C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-07-12 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2290441C2 (ru) | Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование | |
| US10344299B2 (en) | Compositions and methods for modifying cells | |
| AU2002220048A1 (en) | Methods of modifying eukaryotic cells | |
| US8791323B2 (en) | Hybrid antibodies comprising human variable regions and mouse constant regions produced in a genetically modified mouse | |
| IL155580A (en) | Ex vivo method for modifying endogenous gene or chromosomal locus in eukaryotic cells |