CN102762590B - 人源化的FcγR小鼠 - Google Patents
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Abstract
提供了遗传修饰的非人动物和用于产生和使用它们的方法和组合物，其中所述遗传修饰包括内源低亲和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能够表达功能性FcRγ链。描述了遗传修饰的小鼠，包括从内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ链。提供了在宿主免疫系统的辅助细胞上表达至多5个低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠。
Description
发明领域
本发明领域是缺失内源鼠FcγR基因的遗传修饰的非人动物，包括内源FcγR基因被人FcγR基因替代的遗传修饰的动物，包括能够表达至少2、3、4或5种功能性人低亲和力FcγR基因的小鼠，以及包括包含不表达内源低亲和力FcγR基因的免疫细胞的遗传修饰的小鼠。
背景
Fc受体(FcR)是在哺乳动物的进行免疫系统的多种功能的免疫系统的细胞的表面上发现的蛋白质。FcR以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，例如结合附着至被感染的细胞或侵袭性病原体的抗体、刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)破坏微生物或感染的细胞。
ADCC是这样的过程：免疫系统的效应细胞裂解被抗体结合的靶细胞。该过程依赖于对外源抗原或细胞的先行接触，从而产生抗体应答。ADCC可通过效应细胞例如天然杀伤(NK)细胞，通过效应细胞表面上表达的FcR对本身结合至外源抗原或细胞的抗体的Fc部分的结合来介导。由于FcR在免疫应答中起着中心作用，因此需要有共表达多种人FcR的有用的非人动物，包括共表达多种人低亲和力FcR的非人动物。存在对用于研究和阐明人疾病治疗(特别是抗肿瘤治疗和用于治疗自身免疫疾病的治疗)和药物开发(特别是在人抗体药剂的开发、设计和测试中)的人FcR功能和人的ADCC过程的非人动物模型。
附图概述
图1是小鼠的野生型低亲和力FcγR基因座的示意图，显示了小鼠FcγRIIB,FcγRIV和FcγRIII基因以及用于这些基因的靶向缺失的小鼠FcγR靶向载体，其包括侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒。
图2显示了就B细胞(抗-CD19),NK细胞(抗-NKp46)和巨噬细胞(抗-F4/80)门控的脾细胞的直方图，包括野生型和低亲和力FcγRα链基因缺陷型小鼠(mFcγRKO)的内源mFcγRII和mFcγRIII基因的表达。
图3A-3D显示了在人源化CD20小鼠(hCD20)和培育成FcγR敲除小鼠的人源化CD20小鼠(hCD20/FcγRKO)中在几个淋巴细胞区室(lymphocytecompartment)：骨髓(图3A)、血液(图3B)、淋巴结(图3C)和脾(图3D)中利用具有小鼠Fc(Ab168)或人Fc(Ab735)的人抗-人CD20抗体对B细胞进行的体内耗尽。对于每一个图，y-轴显示门控的B细胞(B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，x-轴显示每一个动物组的抗体剂量：10mg/kg对照抗体(C)，2mg/kg人抗-人CD20抗体(2Ab和10mg/kg人抗-人CD20抗体(10Ab)。
图4是低亲和力小鼠FcγR基因座的新霉素靶向缺失和用于将两个人低亲和力FcγR基因(hFcγRIIIA和hFcγRIIA)插入缺失的小鼠基因座的第二靶向载体的示意性描述，所述第二靶向载体包括侧翼连接有位点特异性重组位点的潮霉素盒。为了在血小板上表达hFcγRIIA，使用了可操作地连接于人FcγRIIIA-IIA靶向载体的hFcγRIIA基因的延长的启动子区域；为了阻止在血小板上表达hFcγRIIA，删除或实质上删除所述启动子区域。
图5A显示针对NK细胞(抗-NKp46和巨噬细胞(抗-F4/80)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人FcγRIIIA-IIA纯合子小鼠(人FcγRIIIA/FcγRIIAHO)的人FcγRIIIA的表达。
图5B显示针对嗜中性粒细胞(抗-Ly6G)和巨噬细胞(抗-F4/80)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人FcγRIIIA-IIA纯合子小鼠(人FcγRIIIA/FcγRIIAHO)的人FcγRIIA的表达。
图6为包括两个低亲和力人FcγR基因(hFcγRIIIA和hFcγRIIA)的插入的低亲和力小鼠FcγR基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3个额外的低亲和力人FcγR基因(hFcγRIIB、hFcγRIIIB和hFcγRIIC)的第三靶向载体和侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒的示意图。
图7显示针对B细胞(抗-CD19)和嗜中性粒细胞(抗-Ly6G)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人FcγRIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC纯合子小鼠(人FcγRIIIA/FcγRIIIB/FcγRIIA/FcγRIIB/FcγRIICHO)的人FcγRIIB和人FcγRIIIB的表达。
概述
提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物以及用于产生和使用它们的方法和组合物。在不同的方面，非人动物包含人FcγR受体、内源低亲和力FcγR受体的缺失和/或人FcγR受体在内源小鼠低亲和力FcγR基因座上对内源FcγR受体的替代。
在一个方面，提供了包含功能性FcRγ链的遗传修饰的细胞、非人胚胎和非人动物，其中所述细胞、胚胎和动物包含进一步修饰，包括用一个或多个低亲和力人FcγR基因序列(例如，选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB及其组合)对低亲和力内源非人FcγR基因序列(例如，FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII)的替代。
在一个实施方案中，细胞、非人胚胎和非人动物为鼠。在一个实施方案中，功能性FcRγ链为小鼠FcRγ链。在一个实施方案中，小鼠FcRγ链为对于小鼠、细胞或胚胎而言是内源性的FcRγ链。
在一个实施方案中，细胞、胚胎和动物为小鼠，并且小鼠表达人低亲和力FcγR受体的功能性α链和功能性内源小鼠γ链。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠不表达选自FcγRIIBα链、FcγRIVα链、FcγRIIIα链及其组合的内源α链；其中小鼠表达功能性内源小鼠γ链。
在具体的实施方案中，小鼠不表达功能性FcγRIIBα链，不表达功能性FcγRIVα链，并且不表达功能性FcγRIIIα链。
在一个实施方案中，小鼠基因组包含内源FcγRIIBα链的缺失、内源FcγRIVα链的缺失和内源FcγRIIIα链的缺失。
在一个实施方案中，小鼠包括内源FcγRIIBα链的缺失、内源FcγRIVα链的缺失和内源FcγRIIIα链的缺失，并且还包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较减小的对抗原产生免疫应答的能力。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括减小的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括在细胞杀伤测定中减小的实现抗体依赖性NK细胞杀伤的能力。在具体的实施方案中，ADCC或抗体依赖性NK细胞杀伤的减小为至少50%，在一个实施方案中是至少75%，在一个实施方案中是至少90%。
在一个实施方案中，小鼠包含内源FcγRIIBα链的缺失、内源FcγRIVα链的缺失和内源FcγRIIIα链的缺失，以及还包括在用抗原免疫后与野生型小鼠例如不包含缺失的相同或相似品系的小鼠相比较，增强的体液抗体应答。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的2倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的3倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的5倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的7倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的10倍。在具体的实施方案中，体液抗体应答通过每微克小鼠的血清蛋白特异性结合抗原(已用其免疫小鼠的)的抗体的微克数来测量。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答是就野生型小鼠对其展示耐受性的抗原或野生型小鼠对其展示较弱或最小的体液免疫应答的抗原而言的。在具体的实施方案中，抗原是小鼠抗原。在具体的实施方案中，抗原是展示与小鼠蛋白具有至少约95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。
在一个方面，提供了包含低亲和力人FcγRα链基因对低亲和力小鼠FcγRα链基因的替代的遗传修饰的小鼠，其中所述替代在内源小鼠FcγRα链基因基因座上。在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcγRα链基因选自FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIIIα链基因。在具体的实施方案中，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达内源FcRγ链，并且其中低亲和力人FcγRα链基因为FcγRIIIAα链。在另一个具体的实施方案中，遗传修饰的小鼠在NK细胞上表达内源FcRγ链和功能性人FcγRIIIAα链。在具体的实施方案中，NK细胞上的FcγRIIIAα链的功能性反映在人抗体介导的NK杀伤(例如，由人抗体介导的ADCC)。
在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中所述遗传修饰包括人FcγRα链基因对至少一个内源低亲和力FcγRα链基因的替代，并且所述细胞、胚胎或动物表达功能性FcRγ链。在一个实施方案中，功能性FcRγ链为内源FcRγ链。在一个实施方案中，低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIAα链基因、FcγRIIIAα链基因及其组合。在具体的实施方案中，人FcγRIIA基因包含多态性，其中多态性选自131His低应答者多态性和131Arg高应答者多态性。在具体的实施方案中，FcγRIIA多态性为131His低应答者多态性。在一个实施方案中，FcγRIIIA基因为特定等位基因变体，其中等位基因变体选自158Val变体和158Phe变体。在具体的实施方案中，FcγRIIIA等位基因变体为158Val变体。
在一个实施方案中，低亲和力人FcγR基因选自FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIB基因及其组合。在具体的实施方案中，人FcγRIIB基因包含氨基酸置换，其中所述置换选自232Ile或232Thr置换。在另一个具体的实施方案中，氨基酸置换为232Ile置换。在具体的实施方案中，FcγRIIIB基因为特定等位基因变体，其中所述等位基因变体选自NA1变体和NA2变体。在另一个具体的实施方案中，FcγRIIIB等位基因变体为NA2变体。
在一个实施方案中，低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIBα链基因及其组合。
在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcγRIVα链基因和FcγRIIIα链基因被至少一个低亲和力人FcγRα链基因替代。在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcγRIVα链基因和FcγRIIBα链基因被至少一个低亲和力人FcγRα链基因替代。在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcγRIIBα链基因和FcγRIIIα链基因被至少一个低亲和力人FcγRα链基因替代。在具体的实施方案中，至少一个低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIBα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少一个低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIAα链基因、FcγRIIIAα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少一个低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIBα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，低亲和力小鼠FcγR基因被人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因替代。在另一个具体的实施方案中，低亲和力人FcγRIIA和FcγRIIIAα链基因包含变体，其中FcγRIIAα链基因包含131His变体并且FcγRIIIAα链基因包含158Val变体。在另一个具体的实施方案中，低亲和力小鼠FcγRα链基因被下列低亲和力人FcγRα链基因替代：FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB。在另一个具体的实施方案中，低亲和力人FcγRIIBα链基因和FcγRIIIBα链基因包含变体，其中FcγRIIBα链基因包含232Ile变体并且FcγRIIIBα链基因包含NA2变体。
在一个实施方案中，遗传修饰包括小鼠和人染色体1的共线(syntenic)基因组序列的替代。在具体的实施方案中，遗传修饰包括：包含低亲和力人FcγR基因的基因组片段对包含内源低亲和力小鼠FcγR基因的基因组片段的替代。在另一个具体的实施方案中，来自染色体1:172,889,983至染色体1:172,989,911的小鼠基因组被包含人染色体1:161,474,729至染色体1:161,620,458的人基因组片段替代。
在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中遗传修饰包括一个或多个内源低亲和力受体α链基因的敲除、包含一个或多个人FcγRα链基因的附加体的存在。在具体的实施方案中，所述细胞、胚胎或动物表达功能性FcRγ链。在具体的实施方案中，附加体为微小染色体。在一个实施方案中，功能性FcRγ链对于所述细胞、胚胎或动物是内源的。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，包括用低亲和力人FcγRα链基因替代低亲和力小鼠FcγRα链基因，小鼠包含小鼠FcRγ链基因，并且小鼠表达功能性人低亲和力FcγR受体。在一个实施方案中，功能性低亲和力FcγR受体在其中低亲和力FcγR受体在人中表达的细胞类型上表达。在具体的实施方案中，功能性人低亲和力FcγR受体为FcγRIIIA并且FcγRIIIA在NK细胞上表达。
在一个实施方案中，小鼠包含两个小鼠FcγRα链基因的缺失。在另一个实施方案中，小鼠包含3个小鼠FcγRα链基因的缺失。
在一个实施方案中，小鼠包括用至少1个人FcγRα链基因对3个小鼠FcγRα链基因的替代。在另一个实施方案中，小鼠包括用至少1个FcγRα链基因对2个小鼠FcγRα链基因的替代。在具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人FcγRα链基因对3个小鼠FcγRα链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用3个人FcγRα链基因替代3个小鼠FcγRα链基因。在另一个具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人FcγRα链基因对2个小鼠FcγRα链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用至少3个人FcγRα链基因替代2个小鼠FcγRα链基因。
在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcγRα链基因选自FcγRIIB、FcγRIV、FcγRIIIα链基因及其组合。
在一个实施方案中，低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIBα链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIA、链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人FcγRα链基因选自FcγRIIB,FcγRIIC、FcγRIIIBα链基因及其组合。
在一个实施方案中，用至少1个人FcγRα链基因替代低亲和力小鼠FcγRIVα链基因和FcγRIIIα链基因。在一个实施方案中，用至少1个人FcγRα链基因替代低亲和力小鼠FcγRIVα链基因和FcγRIIBα链基因。在一个实施方案中，用至少1个人FcγRα链基因替代低亲和力小鼠FcγRIIBα链基因和FcγRIIIBα链基因。在具体的实施方案中，至少1个人FcγRα链基因选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIBα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少1个人FcγRα链基因选自FcγRIIA、FcγRIIIAα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少1个人FcγRα链基因选自FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIBα链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，用下列人FcγRα链基因:FcγRIIA和FcγRIIIA替代小鼠α链基因。在另一个具体的实施方案中，用下列人FcγRα链基因:FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB替代小鼠α链基因。
在一个方面，提供了包含低亲和力人FcγRα链和小鼠FcRγ链亚基的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠在选自嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、朗格汉斯细胞、树突细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞及其组合的细胞上表达人FcγRα链。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人FcγRIIAα链。在一个实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人链起始或介导的吞噬作用、ADCC和细胞活化。在一个实施方案中，小鼠表达在选自巨噬细胞、NK细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、至少一种T细胞类型及其组合的细胞上表达人FcγRIIIAα链。在一个实施方案中，小鼠能够进行通过在NK细胞上表达的人链介导的ADCC。在具体的实施方案中，小鼠展示响应于包含人Fc的抗体的hFcγRIIIA-介导的ADCC。
在一个实施方案中，小鼠表达人FcγRIIAα链和人FcγRIIIAα链。在一个实施方案中，人FcγRIIAα链在血小板上表达并且人FcγRIIIAα链在NK细胞上表达。在一个实施方案中，小鼠能够进行由包含人Fc的抗体介导的ADCC，其中所述介导通过在辅助细胞表面上表达的人FcγRIIAα链或人FcγRIIIAα链来进行。在一个实施方案中，人FcγRIIAα链不在血小板上表达。在其中人FcγRIIAα链不在血小板上表达的具体实施方案中，小鼠缺失或实质上缺失可操作地连接于人基因组中的人FcγRIIAα链的人启动子序列。
在一个实施方案中，小鼠在选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人FcγRIIBα链。在具体的实施方案中，小鼠在B细胞和肥大细胞上表达人FcγRIIBα链。在另一个具体的实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人FcγRIIBα链介导的免疫复合物的吞噬作用。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人FcγRIICα链。在具体的实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人FcγRIICα链启始的吞噬作用、ADCC和细胞活化。
在一个实施方案中，小鼠在嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达人链。在具体的实施方案中，小鼠能够进行细胞活化、吞噬作用、ADCC和脱粒，其中活化、吞噬作用、ADCC和脱粒通过表达的人链介导。
在一个方面，提供了包含内源FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII基因的缺失和人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠包含功能性小鼠FcRγ链基因。
在一个实施方案中，小鼠包含由内源FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII基因编码的α链的缺失和由人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB基因编码的α链的插入。
在一个实施方案中，人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIBα链基因的插入位于小鼠基因组的随机位置。
在一个实施方案中，人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIBα链基因的插入位于内源小鼠低亲和力FcγRα链基因座。
在一个实施方案中，小鼠在NK细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIIA。在具体的实施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有NK细胞表达人FcγRIIIA。在具体的实施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有巨噬细胞表达人FcγRIIIA。
在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞及其组合的细胞类型上表达选自人FcγRIIA、人FcγRIIIA及其组合的人FcγR。在具体的实施方案中，小鼠在小鼠的脾细胞样品的全部或大体上全部嗜中性粒细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIA和人FcγRIIIA。
在一个实施方案中，小鼠在来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的B细胞和B细胞的嗜中性粒细胞上表达人FcγRIIB和人FcγRIIIB。在具体的实施方案中，小鼠在来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的全部或大体上全部B细胞和嗜中性粒细胞上表达FcγRIIIB和FcγRIIB。
在一个实施方案中，小鼠还包含人源化CD20基因。在一个实施方案中，还包含人源化CD20基因的小鼠在用包含Fc的抗-CD20结合蛋白处理后展示B细胞的(体内)耗尽。在一个实施方案中，所述耗尽存在于选自骨髓、血液、淋巴结、脾及其组合的区室中。在一个实施方案中，Fc为人Fc。在一个实施方案中，Fc为小鼠Fc。在一个实施方案中，抗-CD20结合蛋白为抗-CD20抗体。
在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的细胞。在一个实施方案中，所述细胞选自胚胎干细胞(ES)、多能细胞、诱导的多能细胞和全能细胞。在一个实施方案中，细胞选自小鼠细胞和大鼠细胞。在具体的实施方案中，细胞为ES细胞。在更具体的实施方案中，细胞为小鼠ES细胞。
在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的非人胚胎。在一个实施方案中，非人胚胎选自小鼠胚胎和大鼠胚胎。
在一个方面，提供了测定治疗剂的功效的方法。在一个实施方案中，治疗剂为包含人Fc的抗体(例如，单、双、三、多特异性的)。在一个实施方案中，治疗剂为人抗体。在一个实施方案中，功效为治疗剂介导的细胞杀伤(例如，ADCC)的功效。在具体的实施方案中，人治疗剂是包含人免疫球蛋白重链的Fc的融合蛋白。在一个实施方案中，给本文中描述的小鼠施用治疗剂并且测量治疗剂依赖性ADCC的水平。在一个实施方案中，通过给小鼠施用治疗剂，随后检测(例如，从获自动物的样品(例如，血液)进行体外检测)治疗剂对表达FcγR的细胞上的人低亲和力FcγR的结合来将小鼠用于评估治疗剂的ADCC活性。在具体的实施方案中，从小鼠分离小鼠的辅助细胞，并且测试其在治疗剂存在和不存在的情况下介导治疗剂依赖性ADCC的能力。
在一个方面，提供了用于确定低亲和力FcγR是否与人疾病或障碍相关的方法，包括测定根据本发明的小鼠的与人疾病或障碍相关的性状的步骤。在一个实施方案中，所述性状为与一个或多个低亲和力FcγR的功能的不存在或丧失相关的表型。在具体的实施方案中，疾病或障碍为自身免疫疾病或障碍。在具体的实施方案中，自身免疫疾病或障碍选自类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barré综合征、硬化症、多发性硬化、Goodpasture’s综合征、Wegener’s肉芽肿病和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。在具体的实施方案中，小鼠包含低亲和力FcγR中的多态性，并且性状选自与大部分不具有多态性的人群相比较增强的介导ADCC的能力以及与大部分不具有多态性的人群相比较减小的介导ADCC的能力。
在一个方面，提供了用于在小鼠中产生抗-人FcRα链抗体的方法，包括将根据本发明的小鼠与本文中描述的人FcR接触。在一个实施方案中，识别人的FcR的抗体分离自小鼠。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码识别人FcR的抗体的全部或部分可变区的核酸序列。
在一个方面，提供了用于测定抗-人FcR抗体将分子靶向表达FcR的细胞以吞噬靶分子的能力的方法，包括将本文中描述的小鼠与包含抗-人FcR抗体的试剂接触，并且测量靶分子的吞噬。
在一个方面，提供了用于在小鼠中产生针对抗原的抗体的方法，所述抗原在对于一种或多种FcγR为野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括将本文中描述的缺失小鼠低亲和力FcR但表达FcγRγ链的小鼠与在对于一种或多种FcγR为野生型的小鼠中具有差免疫原性的抗原接触，并鉴定识别所述差抗原性的抗原的抗体。在一个实施方案中，所述方法包括从小鼠分离抗体。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码抗体的全部或部分可变区的核酸序列。
在一个方面，提供了用于产生能够产生包含人可变区的抗体的小鼠的方法，包括将本文中描述的第一小鼠与第二小鼠交配的步骤，所述第二小鼠包含(a)一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段和一个或多个人恒定区基因；或(b)可操作地连接于小鼠恒定区基因的一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段，其中所述人基因区段在小鼠可变区基因区段的基因座上替代可变区基因区段。
在一个实施方案中，第二小鼠(a)包含含有一个或多个人免疫球蛋白轻链可变区基因区段和人轻链恒定基因的转基因和含有一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区段和一个或多个人重链恒定基因的转基因。在一个实施方案中，包含一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区段的转基因包两个或更多个重链恒定基因并且能够进行类别转换(classswitching)。在具体的实施方案中，小鼠包含失活的内源轻链基因座和/或失活的内源重链基因座。在具体的实施方案中，小鼠包含内源轻链基因座的缺失和/或内源重链基因座的缺失。
在一个实施方案中，第二小鼠(b)分别在小鼠重链和轻链基因座上包含人重链和人轻链可变区基因区段。
在一个方面，提供了用于选择抗肿瘤抗体的方法，包括测定抗体介导ADCC的能力的步骤，其中通过测定由本文中描述的小鼠的细胞介导的ADCC来测试抗体介导ADCC的能力，如果抗体利用本文中描述的遗传修饰的小鼠的细胞介导ADCC，则选择该抗体。在具体的实施方案中，测定抗体对遗传修饰的小鼠的细胞的结合，并且就其结合细胞上的人FcγR的能力选择抗肿瘤抗体。在具体的实施方案中，人FcγR为低亲和力FcγR。
在一个实施方案中，抗肿瘤抗体通过与抗肿瘤抗体通过野生型小鼠的细胞介导ADCC的能力相比较的增强的通过小鼠的细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施方案中，抗肿瘤抗体通过其通过NK细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施方案中，所述NK细胞表达人FcγRIIIA。
在一个实施方案中，提供了用于选择抗肿瘤试剂的方法，包括给第一非人动物施用包含人Fc或修饰的人Fc的试剂的步骤，其中第一非人动物按照本发明进行了遗传修饰并且包含人肿瘤；给包含肿瘤的第二非人动物施用试剂的步骤；和测定第一非人动物和第二非人动物在施用试剂后延缓人肿瘤生长的能力，其中如果试剂在第一非人动物中但非在第二非人动物中展示增强的延缓人肿瘤生长的能力，则其被选择为抗肿瘤试剂。
在一个实施方案中，第一非人动物经修饰包含内源FcRα-亚基的缺失，并且经修饰包含选自FcγRIIAα-亚基、-亚基、-亚基、FcγRIIIAα-亚基、FcγRIIIBα-亚基及其组合的人FcRα-亚基。在一个实施方案中，第二动物为野生型动物。在一个实施方案中，第一非人动物表达内源FcRγ链。
在一个实施方案中，第一非人动物表达功能性内源FcγRI。
在一个方面，提供了用于产生小鼠的方法，所述小鼠缺失低亲和力小鼠FcγR，表达功能性FcRγ链并且包含编码人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB的α链的基因，包括用人FcγRα链在小鼠FcγRα链基因座上替代低亲和力小鼠FcγRα链的步骤。
在一个实施方案中，第一步骤包括缺失内源FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII基因的α链和插入人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的α链；第二步骤包括将人FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB基因的α链插入由第一步骤产生的小鼠的基因组；其中所述小鼠包含功能性小鼠FcRγ链基因.在具体的实施方案中，第二步骤的人FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB基因的α链插入在相对于第一步骤的人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的α链的5’。
在一个方面，提供了用于测定人治疗剂在非灵长类动物中的细胞杀伤的方法，包括将细胞、非人胚胎或非人动物与包含人Fc的人治疗剂接触的步骤，其中所述细胞、胚胎或动物包含功能性FcRγ链并包含一个或多个人FcγRα链对一个或多个内源低亲和力FcγRα链基因的替代，以及测定人治疗剂通过细胞、胚胎或动物的低亲和力人FcγR介导细胞杀伤的能力。
在一个实施方案中，非灵长类动物为小鼠。在具体的实施方案中，内源小鼠FcγRα链基因FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII被人FcγRα链基因FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB替代。
在一个实施方案中，细胞选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合。在具体的实施方案中，细胞为NK细胞并且测定通过人或人源化抗体产生的NK细胞介导的ADCC。在具体的实施方案中，低亲和力人FcγR为人FcγRIIIA。
在一个方面，提供了用于测定治疗剂依赖性血栓形成的方法，包括将在血小板上表达人FcγRIIA的第一非人动物与治疗剂接触；将不在血小板上表达人FcγRIIA的第二非人动物与所述治疗剂接触；在第一非人动物和第二非人动物中测量治疗剂依赖性血栓形成的量；和测定治疗剂依赖性血栓形成的差异。
在一个实施方案中，非人动物选自小鼠和大鼠。
在一个实施方案中，将治疗剂依赖性血栓形成的测定的差异用于鉴定与向人施用该治疗剂相关的风险。在一个实施方案中，测定的差异导致治疗剂给有此需要的人患者的施用的改变。
发明详述
本发明不限于描述的特定方法和实验条件，因为这样方法和条件可改变。本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案，无意起限制作用，因为本发明的范围将仅由权利要求限定。
除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物通过引用方式全文并入本文。
短语“靶向构建体”包括含有靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列实质上同源的序列并且提供了靶向构建体至细胞、组织或动物的基因组内的位置的整合。在具体的实施方案中，靶向构建体还包括特定目标核酸序列或基因、选择标记、控制和/或调节序列以及允许通过蛋白质的外源添加介导的重组的其它核酸序列，所述蛋白质帮助或促进牵涉这类序列的重组。在另一个具体的实施方案中，靶向构建体还包含目标基因，其中所述目标基因为编码与由内源序列编码的蛋白质具有相似功能的蛋白质的异源基因。
除非另外明确地指出，否则术语“替代”包括其中将DNA序列以这样的方式置于细胞的基因组内：用异源序列(例如，小鼠中的人序列)在基因组序列的基因座上替代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可包括作为用于获得这样放置的序列的源DNA的一部分的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区等)。例如，在不同的实施方案中，替代是异源序列对内源序列的置换，该置换导致基因产物从这样放置的DNA序列(包括异源序列)产生，但不表达内源序列；替代是用DNA序列置换内源基因组序列，所述DNA序列编码具有与内源基因组序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质(例如，内源基因组序列编码低亲和力小鼠FcγR受体，DNA片段编码一种或多种人低亲和力FcγR受体，例如FcγRIIC和/或FcγRIIIB)。
术语“FcγR”包括Fc、例如IgG免疫球蛋白的Fc部分的受体。FcγR基因包括α链，所述α链在细胞表面上表达并且用作配体结合结构域，并与FcRγ链的同二聚体或FcRγ链与δ链的异二聚体结合。存在几种不同的FcγR基因并且可根据在免疫复合物中与IgG的优先结合将它们分成低亲和力和高亲和力类型。人的低亲和力FcγR基因包括FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB，并且已在患有自身免疫疾病的人受试者中描述了在大多数此类基因内天然存在的遗传差异或多态性。在阅读本公开内容后本领域技术人员将认识到基因组中的一个或多个内源低亲和力FcγR基因(或全部)可被一个或多个异源低亲和力FcγR基因(例如，变体或多态性例如等位基因形式、来自另一物种的基因、嵌合形式等)替代。
术语“等位基因变体”包括基因的正常序列的变异，其导致同一基因的一系列不同形式。所述不同形式可在来自基因的蛋白质序列中包含至多20个氨基酸的差异。例如，等位基因可被理解为相同物理基因基因座上的可选择的DNA序列，其可以导致或可以不导致不同的性状(例如，可遗传的表型特征)、例如对某些疾病或病况的易感性，其不导致相同基因的其它等位基因或在不同程度上导致其它等位基因。
“辅助细胞”包括参与免疫应答的效应子功能的免疫细胞。示例性免疫细胞包括淋巴样或骨髓样来源的细胞，例如淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、郎格汉斯细胞、树突细胞、肥大细胞等。辅助细胞通过在它们的表面上表达的受体例如FcR进行免疫系统的特定功能。在具体的实施方案中，辅助细胞能够触发通过在细胞表面上表达的FcR例如低亲和力FcγR介导的ADCC。例如，表达FcR的巨噬细胞参与吞噬作用和破坏抗体包被的细菌。辅助细胞还可能能够释放介导其它免疫过程的试剂。例如，肥大细胞可被结合至FcR的抗体激活以在感染的部位释放颗粒例如炎症分子(例如，细胞因子)。在不同的其它实施方案中，FcR在辅助细胞上的表达可受其它因子(例如，细胞因子)调节。例如，FcγRI和FcγRIII表达可通过利用干扰素-γ(IFN-γ)的刺激诱导。
小鼠和人FcR
免疫球蛋白的Fc区(即，恒定区)的受体(FcR)在免疫应答的调节中起着重要作用。FcR存在于宿主免疫系统的辅助细胞上以有效地除去被抗体结合的外源抗原。FcR也在平衡免疫系统的辅助细胞的激活和抑制应答中起着重要作用。FcR参与巨噬细胞的吞噬作用、肥大细胞的脱粒、抗体-抗原复合物的摄取和免疫应答的调节以及其它免疫系统过程。
在小鼠和人中，不同的FcR在不同辅助细胞的表面上差异性表达，所述辅助细胞各自对于存在于表达的抗体库中的免疫球蛋白同种型是特异性的。例如，免疫球蛋白G(IgG)抗体通过IgG受体(FcγR)介导效应子功能。FcγR已被分成3类：高亲和力激活性FcγRI(CD64)、低亲和力抑制性FcγRII(CD32)和低亲和力激活性FcγRIII(CD16)。虽然每一类都存在于小鼠和人中，但它们所存在于的免疫细胞的同种型和亚组的数目不同。例如，FcγRIIA和FcγRIIIB在人的辅助细胞上表达但据报道不存在于小鼠中。此外，不同IgG同种型(例如，IgG1)对每一种FcγR的亲和力在人和小鼠中不同。
通过FcγR的细胞信号转导的激活或抑制和与抗体对FcγR的结合相关的效应子功能据认为由FcγR的细胞内结构域的特定序列基序或共受体(co-receptor)的亚基的特定序列基序介导。激活受体最常见地与包含免疫受体基于酪氨酸活化基序(ITAM)的常见γ链(FcRγ链)相关。ITAM包含约9-12个氨基酸的特定序列，该序列包括响应于抗体对FcR的结合而被磷酸化的酪氨酸残基。磷酸化导致信号转导级联。已报道了缺失编码FcRγ链的基因的小鼠(FcRγ链KO)(例如，参见Takai等人(1994)FcRγchainDepletionResultsinPleiotrophicEffectorCellDefects,Cell76:519-529;vanVugt等人(1996)FcRγ-chainIsEssentialforBothSurfaceExpressionandFunctionofHumanFcγRI(CD64)InVivo,Blood87(9):3593-3599；和Park等人(1998)ResistanceofFcReceptor-deficientMicetoFatalGlomerulonephritis,J.Clin.Invest.102(6):1229-1238)。FcRγ链据报道为大多数FcR的正确表面表达和功能(例如，信号转导、吞噬作用等)所必需的；根据一些报道FcRγ链KO小鼠缺失FcγRI。然而，其它报道显示FcRγ链KO小鼠确实在某些辅助细胞的表面上表达FcγRI，并且表达的FcγRI据报道显示具有功能，功能在于其在表达的FcRγ链不存在的情况下在小鼠中结合IgG(Barnes等人(2002)FcγRI-DeficientMiceShowMultipleAlterationstoInflammatoryandImmuneResponses,Immunity16:379-389)。
相反地，FcγRIIB是在其细胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的抑制性受体。与ITAM一样，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸残基的序列基序。然而，在ITM的磷酸化后的下游事件导致免疫细胞功能的抑制而非激活。FcγRIIB缺陷型小鼠据报道展示与野生型小鼠相比较增强的抗体应答(Takai等人(1996)AugmentedhumoralandanaphylacticresponsesinFcgRII-deficientmice,Nature379:346-349)，此为支持FcγRIIB作为B细胞抗体应答的下游调节剂的观察。
在人中，FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB被认为是经典低亲和力FcγR基因并且一起位于相同染色体上(Su等人(2002)Genomicorganizationofclassicalhumanlow-affinityFcγreceptorgenes,GenesandImmunity3(Supple1):S51-S56)。这些基因展示出几个与独特表型例如受体的配体结合和功能的改变相关的多态性。一些多态性与自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和多发性硬化(MS)相关。针对不同的人FcγR(hFcγR)的转基因小鼠已被开发并且用作疾病模型、产生高亲和力抗体、测试治疗性抗体引发特异性细胞应答的能力、筛选缓解异常免疫应答的化合物(例如，参见Heijnen等人(1996)AHumanFcgRI/CD64TransgenicModelforInVivoAnalysisof(Bispecific)AntibodyTherapeutics,J.Hematother.4:351-356;Heijnen和vandeWinkel(1996)AntigenTargetingtoMyeloid-specificHumanFcgRI/CD64TriggersEnhancedantibodyResponsesinTransgenic,J.Clin.Invest.97(2):331-338;美国专利No.6,111,166、6,676,927、7,351,875、7,402,728和7,416,726)。
尽管FcR在提供免疫系统的抗体与辅助细胞之间的桥梁中起着重要作用，但目前仍然不存在其中所有低亲和力hFcγR都表达的模型系统。其中所有低亲和力hFcγR共表达的小鼠(包括缺失内源小鼠FcγR的小鼠)在不同的实施方案中可用于精确地反映人抗体治疗剂的效应，包括ADCC介导的效应。这样的小鼠可在用于治疗人疾病例如RA、I型糖尿病、SLE和自身免疫性的治疗性抗体的工程改造、分析和评估中用作至关重的工具：提供能够实现人的免疫过程的更精确评估(特别地在测试人抗体治疗剂的情景中)的动物模型。小鼠还可以是具有低亲和力受体的细胞的有价值的来源，所述细胞可在体外测定中用于评估结合低亲和力受体的治疗剂的治疗剂依赖性细胞杀伤，并因此而被用于鉴定有用的人治疗剂。
内源低亲和力FcγR基因缺陷型小鼠
提供了不表达内源低亲和力小鼠FcγR基因但表达内源小鼠FcRγ链的遗传修饰的非人动物。在不同的实施方案中，FcRγ链以与野生型小鼠中相同或大体上相同的分布(即，在细胞类型中)和水平在小鼠中表达。内源低亲和力FcγR基因可在免疫细胞的表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。用于产生不表达内源低亲和力小鼠FcγR基因的非人动物的遗传修饰通过使用小鼠为例子来方便地说明。可以以多种方式，特别是实施方案已在本文中进行了描述的方式产生根据本发明的遗传修饰的小鼠。
图1中(顶部)提供了显示FcγR基因在内源基因座中的排列的低亲和力小鼠FcγR基因基因座的示意图(未按比例的)。如图所示，低亲和力小鼠FcγR基因FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII一起紧密地存在于一条染色体上。这些基因中的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fc部分的α链或配体结合结构域。
缺失编码内源低亲和力FcγR基因的α链的核苷酸序列的遗传修饰的小鼠可通过本领域已知的任何方法来产生。例如，可制备缺失低亲和力小鼠FcγRα链基因的具有选择标记基因的靶向载体。图1举例说明了被靶向构建体靶向的小鼠基因组(底部)，所述构建体具有包含内源低亲和力FcγRα链基因座的上游序列的5’同源臂，后接药物选择盒(例如，侧翼连接有loxP序列的新霉素抗性基因)和包含内源低亲和力FcγRα链基因座的下游序列的3’同源臂。于基因座上同源重组后，内源低亲和力FcγRα链基因座被药物选择盒替代(图1的底部)。内源低亲和力FcγRα链基因基因座因此被缺失，从而产生不表达内源低亲和力小鼠FcγRα链基因的细胞或非人动物。可作选地通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)除去药物选择盒。
在不同实施方案中，遗传修饰小鼠以使内源低亲和力小鼠FcγRα链基因失去功能，产生展示免疫应答的缺陷的小鼠，从而使得小鼠对于评估内源低亲和力小鼠FcγR基因在正常和紊乱的免疫功能、IgG-介导的过程以及自身免疫疾病中的协同以及单独的作用是有用的。在不同的实施方案中，修饰内源低亲和力小鼠FcγR基因的α链但非FcRγ链，避免了需要FcRγ链以进行表面表达和功能的其它内源FcR基因(例如，高亲和力FcγRI)的潜在减少，从而维持通过γ链依赖性过程介导的各种其它免疫功能和过程。
根据一些方面，FcRγ链缺陷型小鼠缺失FcγRIII和FcγRI的表面表达。然而，已报道在FcRγ链缺陷型小鼠的细胞表面上检测到FcγRI，所述FcγRI据报道具有至少部分功能。相反地，根据本发明的小鼠包含未修饰的内源FcRγ链，其保持天然细胞表面表达模式和需要FcRγ链的其它FcR基因的细胞功能。
在不同的实施方案，本发明的小鼠显示了优于其它FcγR基因-缺陷小鼠的有利方面，所述有利方面在于它们所具有的遗传修饰导致不完全贡献于低亲和力FcγR基因的其它免疫功能所必需的其它基因的维持。例如，通过功能性FcRγ链，其它γ链依赖性蛋白(例如，FcγRI)将能够与FcRγ链结合并且在免疫应答中参与效应细胞功能。在根据本发明的各种遗传修饰的小鼠中，据认为维持此类功能(归因于功能性FcRγ链的存在)同时缺失内源低亲和力FcγR基因(一个或多个α-亚基)使得能够更精确地阐明FcR在自身免疫中的作用。
低产和力FcγR人源化小鼠
提供了表达低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的非人动物。低亲和力人FcγR基因可在动物免疫系统的辅助细胞的表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。
在不同的实施方案中，遗传修饰包含一个或多个低亲和力小鼠FcγR基因的功能性α链的缺失，并且在一些实施方案中包含含有以两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个低亲和力人FcγRα亚基基因的替代的其它修饰，其中非人动物表达功能性小鼠FcRγ链基因。还提供了遗传修饰的非人胚胎、细胞和用于产生非人动物、非人胚胎和细胞的靶向构建体。
提供了用于制备表达人FcγR基因(包括特定多态性形式或等位基因变体(例如，单个氨基酸的差异))的小鼠的组合物和方法，包括用于制备从人启动子和人调控序列表达此类基因的的小鼠的组合物和方法。所述方法包括选择性地使内源低亲和力小鼠FcγR基因失去功能(例如，通过其α链的缺失)以及在内源低亲和力小鼠FcγR基因的基因座上利用低亲和力人FcγR基因的α链在小鼠中表达低亲和力人FcγRα-亚基基因。通过缺失一个或多个α链基因但非FcRγ链基因来产生低亲和力小鼠FcγR基因的缺失。所述方法选择性地使一个或多个内源低亲和力FcγRα链基因失去功能而同时保留功能性内源FcRγ链。
在不同的实施方案中，内源FcγRα链替代方法对动物中的天然FcγR介导的信号转导产生的破坏相对最小，因为FcγRα链的基因组序列在单个片段中被替代，从而通过包含必需调控序列保留正常功能性。因此在这样的实施方案中，FcγRα链修饰不影响其它依赖于功能性FcRγ链分子的内源FcR。此外，在不同实施方案中，修饰不影响包括FcγRα链和内源FcRγ链的功能性受体复合物的装配，所述复合物据认为是一些FcγRα链在细胞表面上的正确表达以及由激活的受体产生的下游信号转导所需要的。因为FcRγ链未缺失，在不同实施方案中，包含人FcγRα链基因对内源FcγRα链基因的替代的动物应当能够通过IgG免疫球蛋白的Fc部分对存在于辅助细胞表面上的人FcγRα链的结合来处理来自抗体的正常效应子功能。
在图4中(上部)提供了缺失的内源低亲和力小鼠FcγR基因的示意图(未按比例的)。如图所示，通过用包含人低亲和力人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的基因组片段以靶向构建体(人FcγRIIIA-IIA靶向载体)将人低亲和力人FcγR基因FcγRIIA和FcγRIIIA插入缺失的内源低亲和力小鼠FcγR基因的基因座。这些基因的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fc部分的人FcγR基因的α链或配体结合结构域。
在内源低亲和力小鼠FcγR基因座上表达低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠可通过本领域内已知的任何方法来制图。例如，可制备引入低亲和力人FcγR基因(例如，FcγRIIA和FcγRIIIA)和选择标记基因的靶向载体。图4(顶部)举例说明了包含内源低亲和力FcγR基因座的缺失的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲和力小鼠FcγR基因座的上游序列的5’同源臂、后接药物选择盒(例如，两侧连接有loxP序列的潮霉素抗性基因)、包含人FcγRIIA基因、人HSP76基因和人FcγRIIIA基因的基因组片段以及包含内源低亲和力小鼠FcγR基因座的下游序列的3’同源臂。于缺失的基因座上同源重组后，药物选择盒被包含在靶向载体中的序列替代(图4的底部)。内源低亲和力FcγR基因基因座因此被低亲和力人FcγR基因替代，产生表达低亲和力人FcγR基因的细胞或动物。可任选地通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)除去药物选择盒。
为了在血小板上表达hFcγRIIA，靶向构建体人hFcγRIIA-IIA靶向载体包含延长的序列，该序列包括例如与人基因组中的hFcγRIIA基因可操作地连接的全部或大体上全部人启动子区域。为了阻止hFcγRIIA在血小板上表达，靶向构建体缺失可操作地连接于人的hFcγRIIA基因的全部或大体上全部启动子区域。
可使用对于利用两个人FcγR基因的替代所描述的相似技术实现对嵌合基因座的其它修饰(图4的底部)。用两个人FcγR基因替代内源低亲和力FcγR基因基因座的修饰还可提供用于整合其它低亲和力人FcγR基因的起始点。例如，图6(顶部)中提供了用两个人低亲和力FcγR基因替代的内源低亲和力FcγR基因座的示意图(未按比例的)。如图所示，通过另一个具有包含低亲和力人FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB基因的基因组片段的靶向构建体(人FcγRIIB-IIIB-IIC靶向载体)将低亲和力人FcγR基因FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB插入修饰的内源低亲和力小鼠FcγR基因的基因座。这些基因的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fc部分的人FcγR基因的α链或配体结合结构域。
在内源低亲和力小鼠FcγR基因座上表达5个低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠可通过本领域已知的任何方法来产生。例如，可制备引入低亲和力人FcγR基因(例如，FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIB)的具有选择标记基因的靶向载体。图6(顶部)举例说明了包含以2个低亲和力人FcγR基因对内源低亲和力FcγR基因座的替代的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲和力小鼠FcγR基因座的上游序列的5’同源臂、后接药物选择盒(例如，两侧连接有loxP序列的新霉素抗性基因)、包含人FcγRIIB基因、人FcγRIIIB、人HSP77基因、人FcγRIIC基因的基因组片段，后跟含有存在于内源基因座上的低亲和力人FcγRIIIA基因的下游序列的3’同源臂。于修饰的基因座上同源重组后，人FcγRIIB、FcγRIIIB和FcγRIIC基因通过靶向载体中包含的序列被插入先前存在于内源低亲和力FcγR基因基因座上的人FcγRIIIA和FcγRIIA基因的5’(图6的底部)。因此对修饰的内源低亲和力FcγR基因基因座进一步修饰以整合3个额外的低亲和力人FcγR基因，从而产生表达5个低亲和力人FcγR基因的细胞或动物。药物选择盒可任选通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)来除去。图6(底部分)显示所得的基因座的结构，其将表达可在动物的免疫系统的辅助细胞的表面上检测到的并且适当时与内源FcRγ链独立结合的5个低亲和力人FcγR基因。
FcγR缺陷型小鼠和FcγR人源化小鼠的实验模型
不表达内源低亲和力小鼠FcγR基因的遗传修饰的非人动物是有用的，其用于例如阐明单个低亲和力FcγR基因在免疫应答中的各种功能、通过细胞介导的免疫(例如，ADCC)测量人治疗性抗体的功效、测定FcγR在免疫疾病或障碍中的作用、用作免疫疾病或障碍的模型、产生抗一种或多种FcγR蛋白的抗体、以及用作产生其它目标遗传修饰的小鼠的交配配偶。
在一个实施方案中，根据本发明的小鼠可用于通过给不表达低亲和力FcγR基因的小鼠施用试剂来测定这样的小鼠的细胞毒性效应的丧失(与野生型小鼠相比较)，其中已知所述试剂在野生型小鼠中触发FcγR-依赖性细胞毒性效应。在一个实施方案中，将肿瘤细胞植入本发明的小鼠，在随后的一段时间后，用特异于在肿瘤细胞表面上表达的抗原的抗体注射小鼠。抗体的同种型在注射前是已知的并且通过与在野生型动物中观察到的ADCC相比较来分析动物的FcγR-依赖性ADCC的减弱。
在另一个方面，可将内源低亲和力受体缺陷型小鼠与其它免疫缺陷型小鼠组合(例如，通过交配)以产生自身免疫疾病的体内模型。例如，重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠在本领域常规地用作用于研究免疫系统的模型生物。SCID小鼠具有受损的产生Ｔ或Ｂ淋巴细胞或激活补体系统的一些组分的能力，并且不能高效地抵抗感染、排斥肿瘤和排斥移植物。可将本发明的低亲和力FcγRα-亚基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以确定宿主动物响应于抗体治疗剂(例如，抗肿瘤抗体)的施用的细胞耗尽，这可测定ADCC和补体依赖的细胞毒性(CDC)在体内肿瘤细胞耗尽中的作用。
在另一个方面，提供了包含低亲和力人FcγR基因对内源低亲和力FcγR基因的替代的遗传修饰的非人动物。此类动物对于研究完全人抗体和hFcγR介导的ADCC的药代动力学是有用的。此外，已显示人FcγR基因展示与疾病(例如，SLE,RA,Wegener’s肉芽肿病、Guillain-Barré综合征和多发性硬化)相关的多态性或等位基因变体。因此，包含人FcγR基因的特定等位基因或多态性形式对内源低亲和力FcγR基因的替代的遗传修饰的非人动物可用于在动物中研究人自身免疫疾病和与多态性相关的性状。在具体的实施方案中，人FcγR基因的等位基因形式与对于人IgG的增强的功效相关。
在另一个具体的实施方案中，测定人低亲和力FcγR多态性对人抗体治疗剂的功效的影响。在具体的实施方案中，给包含人FcγR的第一多态性的第一人源化小鼠施用抗肿瘤抗体，也给包含人FcγR的第二多态性的第二人源化小鼠施用抗肿瘤抗体，其中第一和第二小鼠各自包含人肿瘤细胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中评估抗肿瘤抗体的抗肿瘤活性。在具体的实施方案中，由医生基于抗肿瘤抗体在第一小鼠和第二小鼠中的功效的评估选择关于治疗具有第一或第二多态性和具有相应于人肿瘤细胞的肿瘤的人的治疗选择。
人FcγR基因的适当多态性包括本领域已知的全部多态性。对于人FcγRIIA基因，多态性包括例如通过T细胞响应于IgG增殖的能力报道的高应答者表型和低应答者表型。高应答者多态性的特征在于位点131上的精氨酸残基(131Arg)，而低应答者的特征在于位点131上的组氨酸残基(131His)。在具体的实施方案中，人FcγRIIA序列包含131His多态性。人FcγRIIAα链的代表性蛋白质序列示于SEQIDNO:32中。
人FcγRIIB基因的单核苷酸置换在配体结合结构域(α链)中导致错义置换并且推定其影响IgG的Fc部分结合细胞表面上的FcγRIIB的α链的结合能力。例如，已显示小鼠的FcγRIIB基因的跨膜结构域内的位点232上的苏氨酸对异亮氨酸的置换(Ile232Thr)削弱了受体的信号转导能力。在具体的实施方案中，人FcγRIIB基因包含异亮氨酸变体(232Ile)。人FcγRIIBα链的代表性蛋白质序列示于SEQIDNO:33中。
有人提出人FcγRIIIA基因的等位基因变体牵涉SLE和RA的易感性。该等位基因变体包括位点158上苯丙氨酸对缬氨酸的置换(Val158Phe)。缬氨酸等位基因变体(158Val)经表征具有比苯丙氨酸等位基因变体(158Phe)更高的对IgG1和IgG3的亲和力。已有人提出158Phe等位基因变体导致减少的免疫复合物的清除。在具体的实施方案中，人FcγRIIIA基因包含158Val等位基因变体。人FcγRIIIAα链的代表性蛋白质序列示于SEQIDNO:35中。
人FcγRIIIB基因的等位基因变体包括嗜中性粒细胞抗原1(NA1)和嗜中性粒细胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出这些等位基因变体牵涉输血反应、同种免疫嗜中性白血球减少症(alloimmuneneutropaenia)、SLE和Wegener’s肉芽肿病。NA2等位基因变体的特征在于减小的介导吞噬作用的能力。在具体的实施方案中，人FcγRIIIB基因包含NA2等位基因变体。人FcγRIIIBα链的代表性蛋白质序列示于SEQIDNO:36中。
在一个方面，遗传修饰的非人动物对于最优化通过治疗性抗体的Fc部分触发的FcγR介导的功能是有用的。可利用本领域已知的任何方法修饰抗体的Fc区域。例如，可修饰Fc部分(例如，CH2和CH3结构域)中的氨基酸残基以选择性增强对人FcγRIIIA的结合亲和力。因此，所得的抗体应当具有增强的FcγRIIIA依赖性ADCC。在具体的实施方案中，将表达本发明的人FcγRIIIA的动物用于评估修饰的人抗体的增强的ADCC能力(通过给动物施用修饰的人抗体，检测(例如，体外)抗体对表达FcγRIIIA的细胞的结合和将观察到的ADCC活性与从野生型动物的测定观察到的ADCC活性相比较)。
实施例
实施例1:低亲和力FcγR基因缺失型小鼠的产生
构建用于引入内源低亲和力小鼠FcγR基因座的缺失的靶向构建体(下文中描述的)(图1)。
使用技术(参见，例如，美国专利No.6,586,251和Valenzuela等人(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,NatureBiotech.21(6):652-659)制备靶向构建体以修饰细菌人工染色体(BAC)RP23-395f6(Invitrogen)。修饰RP23-395f6BACDNA以缺失内源低亲和力FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII基因(包括每一个FcγR的α链)。
简而言之，分别利用引物mFcR5-up-1(5’-ACCAGGATATGACCTGTAGAG;SEQIDNO:1)和mFcR3-up-1a(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA;SEQIDNO:2)以及mFcR5-DN(ATGCGAGCTCATGCATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGCATTCTTGCCCAATACTTAC;SEQIDNO:3)和mFcR3-DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGGA;SEQIDNO:4)产生上游和下游同源臂。这些同源臂被用于产生缺失内源低亲和力FcγRIIB、FcγRIV和FcγRIII基因的α链的盒。靶向构建体包括lox化的新霉素抗性基因，其包含相对于内源基因座的5’和3’区域同源的序列的同源臂。内源FcγRIIB基因的上游和内源FcγRIII基因的下游的基因和/或序列(参见图1)不被该靶向构建体修饰。
使用在缺失区域外部和在靶向构建体内部的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)来确认靶向缺失。使用针对mFcR-up-detect(ATCCTGAGTATACTATGACAAGA;SEQIDNO:5)和PGK-up-detect(ACTAGTGAGACGTGCTACTTC;SEQIDNO:6)的引物通过PCR来确认缺失的基因座的上游区域；使用引物pA-DN-detect(CTCCCACTCATGATCTATAGA;SEQIDNO:7)和mFcR-DN-detect(TGGAGCCTCAACAGGACTCCA;SEQIDNO:8)来确认缺失的基因座的下游区域。横跨上游缺失点的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示与存在于缺失点上的盒序列连续连接的FcγRIIB基因的下游内源小鼠序列(包括在下面的括号内)：(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA)TTCGCTACCTTAGGACCGTTA(SEQIDNO:9)。横跨下游缺失点的核苷酸序列包括下列序列，其表示与FcγRIII基因上游的内源小鼠序列(包括在下面的括号内)连续的盒序列：CGGGTGCGGAGAAAGAGGTAAT(GCATTCTTGCCCAATACTTA)(SEQIDNO:10)。
通过将靶向BACDNA(上文中描述的)电穿孔入小鼠ES细胞来产生FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIV缺陷小鼠。通过TaqmanTM筛选和核型分析确认阳性ES细胞克隆。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝低亲和力FcγR基因缺陷幼鼠。
实施例2:低亲和力FcγR基因缺陷型小鼠的表征
从FcγR缺陷型小鼠和野生型小鼠收获脾，在无菌一次性袋中用10mL的胶原酶-D灌注。随后将每一只包含单个脾的袋子置于(Seward)中，在培养基环境中匀浆30分钟。将匀浆的脾转移至10cm培养皿，在37°C温育25分钟。使用1:50稀释度的0.5MEDTA，利用移液器分离细胞，随后在37°C再温育另外5分钟。随后通过离心(1000rpm进行10分钟)沉淀细胞，将红细胞在4mLACK缓冲液(Invitrogen)中裂解3分钟。用RPMI-1640(Sigma)稀释脾细胞，再次离心。将沉淀的细胞重悬浮于10mLRPMI-1640中，利用0.2μm细胞滤过器进行过渡。
流式细胞术。利用下列缀合有荧光团的细胞表面标记物：抗-CD19(B细胞)、抗-CD3(T细胞)、抗-NKp46(NK细胞)和抗-F4/80(巨噬细胞)在BDLSRII系统(BDBioscience)上通过FACS鉴定淋巴细胞群体。针对特定细胞谱系门控淋巴细胞，利用大鼠抗-小鼠FcγRIII/II抗体(克隆2.4G2,BDBiosciences)分析内源FcγRIII和FcγRIIB的表达。克隆2.4G2识别鼠FcγRIII和FcγRII的细胞外结构域上的共同多态性表位。结果显示在mFcγRKO小鼠的B-细胞、NK细胞和巨噬细胞上不存在可检测的鼠低亲和力FcγRIII或FcγRII(图2)。
ADCC测定。从FcγR基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分离脾细胞，在细胞杀伤测定中分析它们进行ADCC的能力。使用技术(MiltenyiBiotec)分离和分开细胞群体。简而言之，使用磁性标记的抗-小鼠CD3珠粒从脾细胞耗尽T细胞。随后使用磁性标记的抗-小鼠CD49B珠粒就NK细胞富集T细胞耗尽的脾细胞。单独地，用不同浓度(范围从0.1至10μg/mL)的小鼠抗-人CD20抗体(克隆B1;BeckmanCoulter)在4°C包被Raji细胞(表达人CD20)30分钟。以100:1和50:1的比率(NK:Raji)将抗体包被的Raji细胞与富集的NK细胞在37°C温育4小时。使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定法(Promega)测量细胞死亡。发光信号来源于裂解的细胞并且与死亡细胞的数目成正比。就每一个比率的本底死亡细胞计数测定来自对照(无抗-CD20抗体)的发光，从野生型和KO小鼠的测量扣除该发光。计算平均细胞死亡，通过与野生型相比较测定细胞杀伤的百分比减少(%ADCC)。结果示于表1中。
表1
实施例3:低亲和力FcγR基因缺陷型小鼠的B细胞的体内耗尽
使用人抗-人CD20抗体，对于经工程改造以表达人CD20的低亲和力FcγR基因缺陷小鼠的不同B细胞区室测定人或鼠Fc同种型通过ADCC途径对B细胞耗尽的作用。使用本领域已知的技术对表达人CD20的小鼠单独进行工程改造。通过两个工程品系的标准交配技术产生在B细胞上表达人CD20并且缺失低亲和力FcγR基因(如实施例1中描述)的小鼠。
表达人CD20并且具有内源低亲和力FcγR基因的完全互补序列的小鼠的单独组各自施用下列试剂之一：(1)10mg/kg对照抗体(N=4；非特异于具有小鼠IgG2a的人CD20的人抗体)；(2)2mg/kgAb168(N=3；具有小鼠IgG2a的人抗-hCD20抗体；分别在美国专利公布No.2009/0035322的SEQIDNO:339和347中记载其重链和轻链可变区序列)；(3)10mg/kgAb168;(4)2mg/kgAb735(N=3;具有人IgG1的Ab168);(5)10mg/kgAb735。在相似组的实验中，给表达人CD20并且具有内源低亲和力FcγR基因的缺失的小鼠的组施用对照和人抗-hCD20抗体(上文中描述的)。
通过腹膜内注射给每一个组中的小鼠施用抗体。注射后7天，无痛处死动物，通过在LSR-II流式细胞仪上进行多色FACS鉴定骨髓(B220+/IgM+)、外周血(B220+/CD19+)、淋巴结(B220+/CD19+)和脾(B220+/CD19+)中的剩余B细胞含量，使用Flow-Jo软件(如上所述的)进行分析。B细胞耗尽实验的结果示于图3A-3D中。
如图3A-3D中显示的，Ab735在包含低亲和力FcγR基因的完全互补序列的小鼠中以比Ab168更低的效率耗尽B细胞。此外，对于两种抗体(小鼠和人Fc)，B细胞耗尽在缺失低亲和力FcγR基因的完全互补序列的小鼠中显著减少。本实施例显示通过ADCC途径耗尽B细胞的能力需要低亲和力FcγR并且显示测量包含人恒定区的抗体在小鼠中的ADCC效率更适合通过使用包含人低亲和力FcγR基因的完全互补序列的遗传工程化的小鼠来进行。
实施例4:FcγRIIIA/FcγRIIA人源化小鼠的产生
构建用于将两个低亲和力人FcγR基因引入缺失的内源低亲和力小鼠FcγR基因座的靶向构建体(如下所述的)(图4)。
使用类似的方法(见实施例1)通过修饰BACRP23-395f6和CTD-2514j12(Invitrogen)来制备包含人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的靶向构建体。修饰两种BAC的BACDNA以将低亲和力人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的α链的缺失引入缺失的内源低亲和力FcγR基因座。
以类似的方式，分别利用引物h14(GCCAGCCACAAAGGAGATAATC;SEQIDNO:11)和h15(GCAACATTTAGGACAACTCGGG;SEQIDNO:12)以及h4(GATTTCCTAACCACCTACCCC;SEQIDNO:13)和h5(TCTTTTCCAATGGCAGTTG;SEQIDNO:14)制备上游和下游同源臂。将这些同源臂用于制备将低亲和力人FcγRIIA和FcγRIIIA基因的α链引入内源小鼠低亲和力FcγR基因座的盒。靶向构建体包括5’同源臂(包括相对于缺失的内源低亲和力FcγR基因座在5’的序列)、FRT’ed潮霉素抗性基因，后跟来自BACCTD-2514j12的人基因组片段(其包含低亲和力人FcγRIIA和FcγRIIIAα链基因)和3’同源臂(包含相对于缺失的内源低亲和力FcγR基因座在3’的小鼠序列)(图4的中间)。对于在小鼠血小板上表达FcγRIIA的小鼠，除构建体包含可操作地连接于人基因组的人FcγRIIA基因的延长的启动子序列(例如达到约18kb或更长)外，以相似的方式(使用相同的BAC)，使用在两侧连接有lox2372位点的潮霉素盒来制备靶向构建体，其中启动子区域与第一lox2372位点的连接为ATCGGGGATAGAGATGTTTG(CC)GCGATCGCGGTACCGGGC(括号内为SEQIDNO:37人/lox2372连接)，并且其中第二lox2372位点与小鼠序列的连接为TTATACGAAGTTATACCGG(TG)CATTCTTGCCCAATACTTA(括号内为SEQIDNO:38lox2372/小鼠连接)。使用适当的引物对包含启动子区域的人源化进行基因分型。
利用PCR确认人FcγRIIA和FcγRIIIAα链基因的靶向插入(如上所述的)。使用引物h16(CCCAGGTAAGTCGTGATGAAACAG;SEQIDNO:15)和pA-DN-检测(CTCCCACTCATGATCTATAGA;SEQIDNO:16)通过PCR确认部分人源化的基因座的上游区域；使用引物mFcRDN-detect-9(TGGAGCCTCAACAGGACTCCA;SEQIDNO:17)和h6(CACACATCTCCTGGTGACTTG;SEQIDNO:18)确认部分人源化的基因座的下游区域。横跨下游连接的核苷酸序列包括下列序列，其表示与缺失的低亲和力FcγR基因座的3’的内源小鼠序列连续的hFcγRIIA基因的上游内源人序列(包含于下面的括号内)的新型插入点：(CAACTGCCATTGGAAAAGA)CTCGAGTGCCATTTCATTACCTC(SEQIDNO:19)。上游连接包括两个新型序列。上游连接的一个点包括下列序列，其表示与包含插入的hFcγRIIIA基因的上游区域的人基因组序列(包含于下面括号中)连续的潮霉素盒的核苷酸序列：TAAACCCGCGGTGGAGCTC(GCCAGCCACAAAGGAGATAATCA)(SEQIDNO:20)。上游连接的第二个点包括下列序列，其表示与潮霉素盒内的核苷酸序列连续的缺失的低亲和力FcγR基因座的上游区域的内源小鼠序列(包含于下面括号中)的核苷酸序列：(CCATGGGTAAGTAGAAAC)TCTAGACCCCCGGGCTCGATAACT(SEQIDNO:21)。
通过将靶向的BACDNA(如上所述的)电穿孔入小鼠ES细胞来产生包含替代内源低亲和力小鼠FcγR基因座的2个低亲和力人FcγR基因(hFcγRIIA，缺失延长的启动子区域，和hFcγRIIIA)的小鼠。通过TaqmanTM筛选和核型分析确认阳性ES细胞克隆。随后使用法(在下文中描述的)将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝包含2个人低亲和力FcγR基因对内源低亲和力FcγR基因的替代的幼鼠。
将上述靶向的ES细胞用作供体ES细胞，通过法(参见，例如，美国专利No.7,294,754和Poueymirou等人(2007)F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalysesNatureBiotech.25(1):91-99)将其引入8细胞期小鼠胚胎。使用检测hFcγR基因之存在的等位基因测定的改进法(Valenzuela等人，同上)通过基因分型鉴定具有hFcγRIIA和hFcγRIIIA的(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。
可将具有hFcγR基因的小鼠与Cre删除小鼠品系(例如参见，国际专利申请公布No.WO2009/114400)交配以除去通过靶向构建体引入的、在例如ES细胞阶段或胚胎中未被除去的任何lox化的neo盒。任选地，新霉素盒保留在小鼠中。
对幼鼠进行基因分型，选择对于hFcγR基因是杂合的幼鼠用于表征FcγRIIA和FcγRIIIA人源化。
实施例5:FcγRIIIA/FcγRIIA人源化小鼠的表征
从人源化FcγRIIIA/FcγRIIA(杂合子，不存在延长的FcγRIIA启动子区域)和野生型小鼠收获脾，将其制备用于FACS(如上文中所述的)。
流式细胞术。就特定细胞谱系门控淋巴细胞，分别使用小鼠抗-人FcγRII抗体(克隆FLI8.26;BDBiosciences)和小鼠抗-人FcγRIII抗体(克隆3G8;BDBiosciences)分析hFcγRII和hFcγRIII的表达。对于每一个淋巴细胞亚群体观察到的相对表达(++,+)或无表达(-)示于表2中。
表2
| 淋巴细胞谱系 | hFcγRIII | hFcγRII |
| B细胞 | - | - |
| NK细胞 | ++ | - |
| 巨噬细胞 | + | + |
| 嗜中性粒细胞 | - | + |
在相似的细胞中，从人源化FcγRIIIA/FcγRIIA(纯合子，不存在延长的FcγRIIA启动子区域)和野生型小鼠收获脾，将其制备用于FACS(如上所述的)。结果示于图5A和5B中。FcγRIIIA/FcγRIIA纯合子小鼠中表达人FcγRIIIA、FcγRIIA或两者的单独的淋巴细胞群体的百分比示于表3中。
表3
| 淋巴细胞谱系 | hFcγRIII | hFcγRII | hFcγRII/hFcγRIII |
| NK细胞 | 97 | - | - |
| 巨噬细胞 | 26 | 14 | 39 |
| 嗜中性粒细胞 | - | 94 | - |
如本实施例中显示的，按照实施例3产生的遗传修饰的小鼠(杂合子和纯合子基因型)在NK细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIIA；在嗜中性粒细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIA，但不在血小板上表达FcγRIIA。人FcγRIIIA在NK细胞上高度表达。本实施例中显示的人FcγR基因的表达模式与这些基因在人辅助细胞中的表达模式一致。
实施例6:低亲和力FcγR人源化小鼠的产生
构建用于将3个额外的低亲和力人FcγR基因引入部分人源化的内源低亲和力FcγR基因座的靶向构建体(下文中描述的)(图6)。
使用类似的方法(参见实施例1)通过BACRP-23395f6和RP-11697e5(Invitrogen)的修饰制备包含人FcγRIIB、FcγRIIIB和FcγRIIC基因的靶向构建体。修饰两个BAC的BACDNA以将低亲和力人FcγRIIB,FcγRIIIB和FcγRIIC基因的α链引入包含两个人低亲和力FcγR基因的部分人源化的内源低亲和力FcγR基因座。
以相似的方式，分别利用引物mFcRup-1(ACCAGGATATGACCTGTAGAG;SEQIDNO:22)和mFcR2bNheI-2(GTTTCTACTTACCCATGGAC;SEQIDNO:23)，以及h10(AAATACACACTGCCACAGACAG;SEQIDNO:24)和h11(CCTCTTTTGTGAGTTTCCTGTG;SEQIDNO:25)来制备上游和下游同源臂。将这些同源臂用于制备引入编码低亲和力人FcγRIIB、FcγRIIIB和FcγRIIC的α链的DNA序列的盒。靶向构建体包括5’同源臂(包括相对于缺失的内源低亲和力FcγR基因座在5’的小鼠序列)、lox化的新霉素抗性基因，后跟来自BACRP-11697e5的人基因组片段(其包含低亲和力人FcγRIIB、FcγRIIIB和FcγRIICα链基因)和3’同源臂(包含相对于低亲和力人FcγRIIIAα链基因在5’的人序列)(图6的中间)。
通过PCR确认3个额外低亲和力人FcγR基因的靶向插入(如上所述的)。使用引物mFcRup-detect-3(GAGTATACTATGACAAGAGCATC;SEQIDNO:26)和PGKup-detect(ACTAGTGAGACGTGCTACTTC;SEQIDNO:27)通过PCR确认完全人源化基因座的上游区域；使用引物neodetect(CTCCCACTCATGATCTATAGA;SEQIDNO:28)和h12(CTTTTTATGGTCCCACAATCAG;SEQIDNO:29)确认完全人源化基因座的下游区域。横跨下游连接的核苷酸序列包括hFcγRIIAα链基因的上游的相同人基因组序列(参见实施例3;SEQIDNO:19)。横跨上游连接的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示小鼠序列与盒序列以及盒序列与插入位点上的人基因组序列的两个新连接。基因组小鼠序列(包含于下面括号中)与neo盒序列的上游区域的连接为：(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA)TTCGCTACCTTAGGACCGTTA(SEQIDNO:30)。第二新型连接包括neo盒的3’末端(包含于下面括号中)与hFcγRIIBα链基因的下游的人基因组序列的连接：(GCTTATCGATACCGTCGAC)AAATACACACTGCCACAGACAGG;SEQIDNO:31)。这些连接示于图6中，在靶向构建体内。所得的完全人源化的低亲和力FcγR基因座的修饰的基因组示于图6(底部)中。
通过将靶向的BACDNA(如上所述的)电穿孔引入小鼠ES细胞产生了包含替代内源低亲和力小鼠FcγR基因座的5个低亲和力人FcγR基因的小鼠。通过TaqmanTM筛选和核型分析确认阳性ES细胞克隆。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠(如上所述的)以产生一窝包含5个人低亲和力FcγR基因对内源低亲和力FcγR基因的替代的幼鼠。
实施例7:低亲和力FcγR人源化小鼠的表征
从完全人源化的FcγR(杂合子)和野生型小鼠收获脾，将其制备用于FACS(如上文中所述的)。
流式细胞术。就特定细胞谱系门控淋巴细胞，分别使用小鼠抗-人FcγRII抗体(克隆FLI8.26;BDBiosciences)和小鼠抗-人FcγRIII抗体(克隆3G8;BDBiosciences)分析人FcγRIIA和FcγRIIIA的表达。对于每一个淋巴细胞亚群体观察到的相对表达(++,+)或无表达(-)示于表4中。
表4
| 淋巴细胞谱系 | hFcγRIII | hFcγRII |
| B细胞 | - | + |
| NK细胞 | + | + |
| 巨噬细胞 | + | + |
| 嗜中性粒细胞 | + | + |
在类似的实验中，从完全人源化的FcγR(纯合子)和野生型小鼠收获脾，将其制备用于FACS(如上所述的)。结果示于图7中。完全人源化的FcγR纯合子小鼠中表达人FcγRIIIA、人FcγRIIIB、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC或其组合的单独的淋巴细胞群体的百分比示于表5中。
表5
| 淋巴细胞谱系 | hFcγRIII | hFcγRII | hFcγRII/hFcγRIII |
| B细胞 | 100 | ||
| NK细胞 | 30 | - | - |
| 巨噬细胞 | <1 | 55 | 26 |
| 嗜中性粒细胞 | - | 100 |
如本实施例中显示的，根据实施例5产生的遗传修饰的小鼠(杂合子和纯合子基因型)在NK细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIIA，在嗜中性粒细胞上表达人FcγRIIIB，在嗜中性粒细胞和巨噬细胞上表达人FcγRIIA，在B细胞上表达人FcγRIIB，在NK细胞细胞上表达人FcγRIIC。本实施例中显示的人FcγR基因的表达模式与这些基因在人辅助细胞中的表达模式一致。
实施例8:人源化FcγR小鼠中的ADCC
在细胞杀伤测定(如实施例2的上文中所述的)中分析从FcγR基因缺陷型(即敲除)、FcγRIIIA/FcγRIIA(纯合子)、FcγRIIIA/FcγRIIIB/FcγRIIA/FcγRIIB/FcγRIIC(纯合子)和野生型小鼠分离的脾细胞进行ADCC的能力。
简而言之，使用技术(MiltenyiBiotec)分离和分开细胞群。简而言之，在小鼠IL-2(500U/mL)存在的情况下将T和B细胞耗尽的脾细胞培养2周。以50:1(NK:Raji)的比率在ADCC测定中将所得的扩增的NK细胞用作效应细胞。用10ug/mL的Ab168或Ab735(如实施例3的上文中所述的)包被Raji细胞。结果示于表6中。
表6
本发明不限于由本文中描述的特定实施方案确定的范围。事实上，根据上述说明和附图，除了本文中描述的变化外的本发明的各种变化对于本领域技术人员来说是显然的。此类变化意欲落在所附权利要求的范围内。
Claims (26)
1.制备包含遗传修饰的小鼠的方法，包括以置于内源小鼠低亲和力FcγR基因基因座上的至少两个低亲和力人FcγRα链基因替代内源低亲和力FcγRα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链。
2.权利要求1所述的方法，其中至少两个低亲和力人FcγRα链基因选自下组：人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因。
3.权利要求1所述的方法，其中至少两个低亲和力人FcγRα链基因为人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因。
4.权利要求3所述的方法，其中人FcγRIIIAα链基因在小鼠的NK细胞上表达。
5.权利要求1所述的方法，其中所述至少两个低亲和力人FcγR基因为人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因和人FcγRIIIBα链基因。
6.权利要求3所述的方法，其中所述FcγRIIAα链基因包含131His低应答者多态性或131Arg高应答者多态性，和FcγRIIIAα链基因包含158Val或158Phe等位基因变体。
7.权利要求2所述的方法，其中所述小鼠包含人低亲和力FcγR等位基因变体，并且所述等位基因变体选自(a)人FcγRIIAα链等位基因变体131H，(b)人FcγRIIIAα链基因等位基因变体158V，(c)人FcγRIIBα链基因等位基因变体232I，(d)人FcγRIIIBα链基因等位基因变体NA2，及(e)它们的组合。
8.制备遗传修饰的小鼠的方法，包括以编码人FcγRIIIAα链和人FcγRIIAα链的基因替代编码FcγRIIBα链、FcγRIIIα链和FcγRIVα链的内源小鼠基因，其中所述小鼠表达人FcγRIIIAα链蛋白、人FcγRIIAα链蛋白和内源小鼠FcRγ亚基，其中所述人FcγRIIIAα链蛋白和所述人FcγRIIAα链蛋白与所述内源小鼠FcRγ亚基结合，其中所述人FcγRIIIAα链蛋白在小鼠NK细胞的表面上表达。
9.权利要求8的方法，其中小鼠NK细胞是小鼠血液中的循环NK细胞，并且在小鼠NK细胞表面上表达的人FcγRIIIAα链蛋白结合包含人Fc或修饰的人Fc的免疫粘附素或抗体，其中免疫粘附素或抗体特异性结合小鼠中的靶细胞，并且免疫粘附素或抗体对NK细胞表面上的人FcγRIIIAα链蛋白的结合介导靶细胞的NK细胞杀伤。
10.权利要求9的方法，其中用人病原体感染靶细胞，并且免疫粘附素或抗体特异性结合人病原体的表位。
11.权利要求9的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞，并且免疫粘附素或抗体特异性结合肿瘤细胞的表位。
12.遗传修饰的小鼠在制备用于测量治疗剂依赖性NK细胞杀伤的动物模型中的用途，其中所述测量包括：
(a)给遗传修饰的小鼠施用特异性结合小鼠中的不是NK细胞的靶细胞的治疗剂，其中所述治疗剂包含人Fc；
(b)测量小鼠或小鼠的组织样品中的NK介导的靶细胞杀伤的水平；和
(c)测定由所述治疗剂介导的靶细胞杀伤的量，从而测量治疗依赖性细胞杀伤；
其中所述遗传修饰的小鼠的基因组包含：
(a)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因；或者
(b)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因，
并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链。
13.权利要求12的用途，其中所述靶细胞为人病原体，并且所述治疗剂特异性结合人病原体的表位。
14.权利要求12的用途，其中靶细胞为被人病原体感染的小鼠细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人病原体的表位。
15.权利要求12的用途，其中所述靶细胞为被人病原体感染的人细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人病原体的表位。
16.权利要求12的用途，其中靶细胞为人肿瘤细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人肿瘤细胞的表位。
17.权利要求12的用途，其中所述组织样品为血液样品。
18.权利要求12的用途，其中所述治疗剂为抗体。
19.权利要求18的用途，其中所述抗体为人抗体。
20.在内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠在制备用于测定低亲和力FcγR是否与人疾病或障碍相关的动物模型中的用途，其中所述测定包括测定所述小鼠中与人疾病或障碍相关的性状的步骤，其中在所述遗传修饰的小鼠中，以置于内源小鼠低亲和力FcγR基因基因座上的至少两个低亲和力人FcγRα链基因替代内源低亲和力FcγRα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链。
21.在小鼠中制备抗-人FcRα链抗体的方法，包括将在内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠与人FcR接触，其中在所述遗传修饰的小鼠中，以置于内源小鼠低亲和力FcγR基因基因座上的至少两个低亲和力人FcγRα链基因替代内源低亲和力FcγRα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链。
22.遗传修饰的小鼠在制备用于测定抗-人FcR抗体将分子靶向表达FcR的细胞以吞噬靶分子的能力的动物模型中的用途，所述遗传修饰的小鼠的基因组包含(a)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因；或者(b)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链；其中所述测定包括将所述小鼠与包含抗-人FcR抗体的试剂接触，并且测量靶分子的吞噬。
23.用于在遗传修饰的小鼠中产生针对抗原的抗体的方法，所述抗原在对于表达一种或多种内源FcγRα链基因的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括将缺失小鼠低亲和力FcR但表达FcγRγ链的遗传修饰的小鼠与抗原接触，并鉴定识别所述差抗原性的抗原的抗体，其中在所述遗传修饰的小鼠中，以置于内源小鼠低亲和力FcγR基因基因座上的至少两个低亲和力人FcγRα链基因替代内源低亲和力FcγRα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链。
24.用于产生能够产生包含人可变区的抗体的小鼠的方法，包括将第一小鼠与第二小鼠交配的步骤，所述第一小鼠的基因组包含(a)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因；或者(b)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因，并且其中所述第一小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链；所述第二小鼠的基因组包含(a)一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段和一个或多个人恒定区基因；或(b)可操作地连接于小鼠恒定区基因的一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段，其中所述人基因区段在小鼠可变区基因区段的基因座上替代可变区基因区段。
25.遗传修饰的小鼠在制备用于选择抗肿瘤抗体的动物模型中的用途，所述遗传修饰的小鼠的基因组包含(a)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因；或者(b)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链；其中所述选择包括测定抗体介导ADCC的能力的步骤，其中通过测定所述小鼠的细胞介导的ADCC来测试抗体介导ADCC的能力，如果抗体利用所述遗传修饰的小鼠的细胞介导ADCC，则选择该抗体。
26.遗传修饰的小鼠在制备用于鉴定抗肿瘤抗体的动物模型中的用途，所述遗传修饰的小鼠的基因组包含(a)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因和人FcγRIIIAα链基因；或者(b)替代内源FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIVα链基因的人FcγRIIAα链基因、人FcγRIIBα链基因、人FcγRIICα链基因、人FcγRIIIAα链基因和人FcγRIIIBα链基因，并且其中所述小鼠包含功能性内源小鼠FcRγ链；其中与通过野生型小鼠细胞的抗肿瘤抗体介导ADCC的能力相比较，通过所述小鼠细胞的增强的介导ADCC的能力，来进行鉴定所述抗肿瘤抗体。
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