ES2671188T3

ES2671188T3 - Ratones Fc gamma R humanizados

Info

Publication number: ES2671188T3
Application number: ES10791039.0T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Naxin Tu; Cagan Gurer; Sean Stevens; Andrew J. Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: US20140157445A1; US8658154B2; TR201808011T4; PL2516457T3; IL242719A; SI2516457T1; KR20190045404A; HRP20180911T1; IL261257B; JP2013514778A; KR102092744B1; SG181690A1; SG10201408415PA; AU2014210646A1; CY1120316T1; JP2014132909A; KR20200033981A; US20200061213A1; CN104232589B; AU2010339863A1

Abstract

Un ratón que comprende una modificación genética, en el que la modificación genética comprende un reemplazo de un fragmento genómico del locus de gen FcγR de baja afinidad de ratón endógeno, en el que dicho fragmento genómico comprende los genes de ratón codificantes de las subunidades α de FcγRIIB, FcγRIV y FcγRIII, con un fragmento genómico humano que codifica al menos dos genes FcγR humanos de baja afinidad seleccionados entre FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA y FcγRIIIB humanos, y comprendiendo el ratón una cadena γ de FcR funcional.

Description

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del hospedador para eliminar eficazmente los antígenos foráneos unidos por un anticuerpo. Los FcR también desempeñan un papel importante en el equilibrio tanto de la respuesta de activación como de la respuesta de inhibición de las células auxiliares del sistema inmune. Los FcR participan en la fagocitosis por macrófagos, en la desgranulación de los mastocitos, la captación de complejos de anticuerpo-antígeno y la modulación de la respuesta

5 inmune, así como en otros procesos del sistema inmune.

En ratones y en seres humano, diferentes FcR se expresan diferencialmente en la superficie de diferentes células auxiliares, siendo cada una específica de los isotipos de inmunoglobulina presentes en el repertorio de anticuerpos expresados. Por ejemplo, los anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) median en las funciones efectoras a través de los receptores de IgG (FcγR). Los FcγR se han clasificado en tres grupos: FcγRI de activación de alta afinidad (CD64), FcγRII de inhibición de baja afinidad (CD32) y FcγRIII de activación de baja afinidad (CD16). Aunque cada grupo está presente tanto en ratones como en seres humanos, el número de isoformas y subconjuntos de células inmunes en los que están presentes es diferente. Por ejemplo, FcγRIIA y FcγRIIIB se expresan en células auxiliares en seres humanos, pero, según se ha informado, están ausentes en ratones. Además, las afinidades de los

15 diferentes isotipos de IgG (por ejemplo, IgG1) para cada FcγR son diferentes en ratones y en seres humanos.

Se cree que la activación o inhibición de la señalización celular a través de los FcγR y las funciones efectoras asociadas con la unión de anticuerpos a los FcγR están mediadas por motivos de secuencias específicos de dominios intracelulares de FcγR o de las subunidades de correceptores. Los receptores de activación se asocian más comúnmente con la cadena γ común (cadena γ de FcR), que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM). Los ITAM contienen una secuencia específica de aproximadamente 9-12 aminoácidos, que incluyen restos de tirosina que se fosforilan en respuesta a la unión de anticuerpos a un FcR. La fosforilación conduce a una cascada de transducción de señales. Se ha informado de ratones que carecen de un gen codificante de una cadena γ de FcR (desactivación de la cadena γ de FcR) (por ejemplo, Véase Takai et al.

25 (1994) «FcR γ Chain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects», Cell 76:519-529; van Vugt et al. (1996) FcR γ-Chain Is Essential for Both Surface Expression and Function of Human FcγRI (CD64) In Vivo, Blood 87(9):3593-3599; y Park et al. (1998) Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. 102(6):1229-1238). La cadena γ de FcR es, según se ha informado, esencial para la función y la expresión en la superficie adecuadas (por ejemplo, la transducción de señales, la fagocitosis, etc.) de la mayoría de los FcR; de acuerdo con algunos informes, los ratones con desactivación de la cadena γ de FcR carecen de FcγRI. Sin embargo, otros informes revelan que los ratones con desactivación de la cadena γ de FcR expresan FcγRI en la superficie de ciertas células auxiliares, y el FcγRI expresado parece ser funcional, en tanto en cuanto se une a IgG en ratones en ausencia de la cadena γ de FcR expresada (Barnes et al. (2002) «FcγRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses», Immunity 16:379-389).

35 Por el contrario, FcγRIIB es un receptor inhibidor que contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. Como los ITAM, los ITIM son motivos de secuencia que incluyen restos de tirosina fosforilables. Sin embargo, los eventos cadena abajo de la fosforilación de un ITM conducen a la inhibición, y no a la activación, de las funciones de las células inmunes. Según se ha informado, los ratones deficientes en FcγRIIB muestran una mayor respuesta de anticuerpos en comparación con los ratones de tipo silvestre (Takai et al. (1996) «Augmented humoral and anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice», Nature

379: 346-349), una observación que respalda el papel de FcγRIIB como un regulador a la baja de la respuesta de anticuerpos de linfocitos B.

45 En seres humanos, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA y FcγRIIIB se consideran los genes FcγR de baja afinidad clásicos, y están situados juntos en el mismo cromosoma (Su et al. (2002) «Genomic organization of classical human low-affinity Fcγ receptor genes», Genes and Immunity 3 (Supl. 1):S51-S56). Estos genes presentan varios polimorfismos asociados con distintos fenotipos, por ejemplo, una alteración de la unión a ligandos y de la función del receptor. Algunos polimorfismos están asociados con enfermedades autoinmunes, por ejemplo, lupus eritematoso diseminado (LED), artritis reumatoide (AR) y esclerosis múltiple (EM). Se han desarrollado ratones transgénicos para diferentes FcγR humanos (hFcγR) y se han usado como modelos de enfermedades, generando anticuerpos de alta afinidad, ensayando los anticuerpos terapéuticos para determinar la capacidad de generar respuestas celulares específicas, detectando los compuestos que mejoran las respuestas inmunes aberrantes, etc., por ejemplo, Véase Heijnen et al. (1996) «A Human FcgRI/CD64 Transgenic Model for In Vivo Analysis of (Bispecific)

55 Antibody Therapeutics», J. Hematother. 4:351-356); Heijnen y van de Winkel (1996) «Antigen Targeting to Myeloidspecific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced Antibody Responses in Transgenic», J. Clin. Invest. 97(2):331-338; patentes de EEE.UU. n.º 6.111.166, 6.676.927, 7.351.875, 7.402.728 y 7.416.726).

A pesar de las funciones importantes de los FcR en proporcionar el puente entre los anticuerpos y las células auxiliares del sistema inmune, en la actualidad, no existe ningún sistema modelo en el que se expresen todos los hFcγR de baja afinidad. En diversas realizaciones, se podría usar un ratón en el que se expresaran conjuntamente todos los hFcγR de baja afinidad - incluyendo los ratones que carecen de FcγR de ratón endógenos - para reflejar con exactitud los efectos de un anticuerpo humano terapéutico, incluyendo los efectos mediados por la ADCC. Dicho ratón serviría como una herramienta vital en el diseño, el análisis y la evaluación de anticuerpos terapéuticos para el 65 tratamiento de enfermedades humanas tales como, por ejemplo, AR, diabetes de tipo I, LED y autoinmunidad, proporcionando un modelo animal capaz de lograr una evaluación más precisa de los procesos inmunológicos en los

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seres humanos, en particular, en el contexto del ensayo de anticuerpos terapéuticos humanos. El ratón también será una valiosa fuente de células portadoras de receptores de baja afinidad, células que se pueden usar en ensayos in vitropara evaluar la destrucción celular dependiente de agentes terapéuticos para agentes terapéuticos que se unen a los receptores de baja afinidad y, por lo tanto, para la identificación de agentes terapéuticos humanos útiles.

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Ratones deficientes en genes FcγR de baja afinidad endógenos

Se proporcionan animales no humanos modificados genéticamente que no expresan genes endógenos de FcγR de ratón de baja afinidad, pero que expresan una cadena γ de FcR de ratón endógena. En diversas realizaciones, la 10 cadena γ de FcR se expresa en una distribución (es decir, en tipos de células) y a un nivel en el ratón que es igual o esencialmente igual al de un ratón de tipo silvestre. Los genes endógenos de FcγR de baja afinidad se pueden expresar bien en la superficie de las células inmunes o, de una manera soluble, en la periferia de los animales. Las modificaciones genéticas para crear un animal no humano que no exprese genes endógenos de FcγR de ratón de baja afinidad se describen convenientemente usando el ratón de modo ilustrativo. Un ratón modificado

15 genéticamente de acuerdo con la invención se puede crear de varias formas, cuyas realizaciones particulares se analizan en el presente documento.

En la Figura 1, se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de un locus de gen FcγR de ratón de baja afinidad (parte superior) para mostrar la disposición de los genes FcγR en el locus endógeno. Como se ilustra, los

20 genes FcγR de ratón de baja afinidad FcγRIIB, FcγRIV y FcγRIII se presentan conjuntamente en estrecha proximidad en un cromosoma. Cada uno de estos genes comprende la cadena α o el dominio de unión al ligando responsable de la unión de la parte Fc de una molécula de anticuerpo.

Los ratones modificados genéticamente que carecen de una secuencia de nucleótidos codificante de una cadena α

25 de los genes FcγR de baja afinidad endógenos se pueden crear mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede crear un vector de dirección que elimine los genes de cadena α de FcγR de ratón de baja afinidad con gen marcador seleccionable. La Figura 1 ilustra un genoma de ratón (parte inferior) dirigido por una construcción de dirección que tiene un brazo de homología 5’ que contiene la secuencia de cadena arriba del locus endógeno de cadena α de FcγR de baja afinidad, seguido de un casete de selección de fármacos (por ejemplo, gen

30 de resistencia a la neomicina flanqueado por secuencias loxP), y un brazo de homología 3’ que contiene la secuencia de cadena abajo del locus de cadena α de FcγR endógeno de baja afinidad. Tras la recombinación homóloga en el locus, el locus de la cadena α de FcγR endógeno de baja afinidad se reemplaza por un casete de selección de fármaco (parte inferior de la Figura 1). El locus de gen de cadena α FcγR endógeno de baja afinidad se elimina de este modo dando lugar a una célula o a un animal no humano que no expresa genes de la cadena α de

35 FcγR endógeno de ratón de baja afinidad. El casete de selección de fármacos se puede eliminar opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).

La modificación genética de un ratón para volver no funcionales uno o varios genes de la cadena α de FcγR endógeno de ratón de baja afinidad, en diversas realizaciones, da lugar a un ratón que presenta defectos en la 40 respuesta inmune, haciendo que el ratón sea útil para la evaluación de las funciones cooperativas, así como individuales, de los genes endógenos de FcγR de ratón de baja afinidad en la función inmune normal y anómala, de los procesos mediados por IgG y de la enfermedad autoinmune. En diversas realizaciones, la modificación de las cadenas α de los genes endógenos de FcγR de ratón de baja afinidad, pero no de la cadena γ de FcR, evita una posible reducción de otros genes FcR endógenos (por ejemplo, FcγRI de alta afinidad) que requieren la cadena γ de

45 FcR para la expresión en la superficie y la función, manteniendo así otras diversas funciones y procesos inmunológicos mediados por procesos dependientes de la cadena γ.

De acuerdo con algunos informes, los ratones deficientes en la cadena γ de FcR carecen de la expresión superficial de FcγRIII y FcγRI. Sin embargo, según se ha informado, se ha detectado FcγRI en la superficie celular de ratones

50 deficientes en la cadena γ de FcR, y se informa que es al menos parcialmente funcional. Por el contrario, los ratones de acuerdo con la presente invención contienen la cadena γ de FcR endógena no modificada, que preserva los patrones de expresión superficial celular natural y las funciones celulares de otros genes FcR que requieren la cadena γ de FcR.

55 En diversas realizaciones, los ratones de la presente invención presentan la ventaja frente a otros ratones deficientes en el gen FcγR de que las modificaciones genéticas que portan producen el mantenimiento de otros genes necesarios para otras funciones inmunológicas no enteramente dedicadas a los genes FcγR de baja afinidad. Por ejemplo, con una cadena γ de FcR funcional, otras proteínas dependientes de la cadena γ (por ejemplo, FcγRI) podrán asociarse con la cadena γ de FcR y participar en funciones de células efectoras en la respuesta inmune. En

60 diversos ratones modificados genéticamente de acuerdo con la invención, se cree que el mantenimiento de dichas funciones (debido a la presencia de una cadena γ de FcR funcional) mientras se eliminan los genes FcγR endógenos de baja afinidad (una o más subunidades α) permite una dilucidación más exacta de las funciones de los FcR en la autoinmunidad.

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Ratones FcγR humanizados de baja afinidad

Se proporcionan animales no humanos modificados genéticamente que expresan genes FcγR humanos de baja afinidad. Los genes FcγR humanos de baja afinidad se pueden expresar bien en la superficie de células auxiliares 5 del sistema inmune del animal o, de una manera soluble, en la periferia de los animales.

La modificación genética, en diversas realizaciones, comprende la eliminación de una cadena α funcional de genes FcγR de ratón de baja afinidad y, en algunas realizaciones, una modificación adicional que comprende un reemplazo por dos o más, por tres o más, por cuatro o más, o por cinco genes de subunidad α de FcγR humano de baja afinidad, de manera que el animal no humano exprese un gen de la cadena γ de FcR funcional de ratón. Por lo tanto, se proporciona un ratón que comprende una modificación genética, en el que la modificación genética comprende un reemplazo de un fragmento genómico del locus de gen FcγR de baja afinidad de ratón endógeno, en el que dicho fragmento genómico comprende los genes de ratón codificantes de subunidades α de FcγRIIB, FcγRIV y FcγRIII, con un fragmento genómico humano que codifica al menos dos genes FcγR humanos de baja afinidad

15 seleccionados entre FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA y FcγRIIIB, y en el que el ratón comprende una cadena γ de FcR funcional. También se describen embriones de ratones modificados genéticamente, células y construcciones de dirección para fabricar los ratones, los embriones de ratón y las células.

Se describen las composiciones y los métodos de creación de un ratón que exprese un gen FcγR humano, incluyendo formas polimórficas o variantes alélicas específicas (por ejemplo, diferencias de un solo aminoácido), incluyendo composiciones y el método de creación de un ratón que expresa dichos genes de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. Los métodos incluyen volver selectivamente no funcional un gen FcγR endógeno de ratón de baja afinidad (por ejemplo, mediante la eliminación de su cadena α), y emplear una cadena α de un gen FcγR de humano de baja afinidad en el locus de gen FcγR endógeno de ratón de baja afinidad para expresar un gen

25 de la subunidad α de FcγR humano de baja afinidad en un ratón. La eliminación del gen FcγR de ratón de baja afinidad se realiza mediante la eliminación de uno o más genes de cadena α, pero no de un gen de cadena γ de FcR. El enfoque vuelve selectivamente a los genes endógenos de la cadena α de FcγR de baja afinidad no funcionales, mientras se conserva una cadena γ de FcR endógena funcional.

El enfoque de reemplazo de la cadena α de FcR endógena emplea una interrupción relativamente mínima de la transducción de señales natural mediada por FcγR en el animal, en diversas realizaciones, debido a que la secuencia genómica de las cadenas α de FcγR se reemplaza en un solo fragmento y, por lo tanto, conserva la funcionalidad normal al incluir secuencias reguladoras necesarias. De este modo, en dichas realizaciones, la modificación de cadena α de FcγR no afecta a otros FcR endógenos que dependen de las moléculas funcionales de

35 cadena γ de FcR. Además, en diversas realizaciones, la modificación no afecta al ensamblaje de un complejo receptor funcional que implica una cadena α de FcγR y la cadena γ de FcR endógena, que se cree que es necesaria para la expresión adecuada de algunas cadenas α de FcγR en la superficie celular y para la señalización cadena abajo resultante de un receptor activado. Debido a que no se elimina la cadena γ de FcR, en diversas realizaciones, los ratones que contienen un reemplazo de genes endógenos de cadena α de FcγR por genes de cadena α de FcγR humanos deben ser capaces de procesar las funciones efectoras normales de anticuerpos a través de la unión de la parte Fc de las inmunoglobulinas IgG a las cadenas α de FcγR humanos presentes en la superficie de células auxiliares.

En la Figura 4 (parte superior), se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de un gen FcγR de ratón de

45 baja afinidad endógeno eliminado. Como se ilustra, se introducen los genes FcγR humanos de baja afinidad FcγRIIA y FcγRIIIA en el locus de gen FcγR de ratón de baja afinidad endógeno eliminado mediante una construcción de dirección (vector de dirección de FcγRIIIA-IIA humano) con un fragmento genómico que contiene los genes FcγRIIA y FcγRIIIA humanos de baja afinidad humanos. Cada uno de estos genes comprenden la cadena α o el dominio de unión al ligando de los genes FcγR humanos responsables de la unión de la parte Fc de una molécula de anticuerpo.

Los ratones modificados genéticamente que expresan genes FcγR humanos de baja afinidad en el locus de FcγR de ratón de baja afinidad endógeno se pueden crear mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede crear un vector de dirección que introduzca genes FcγR humanos de baja afinidad (por ejemplo, FcγRIIA y FcγRIIIA) con gen marcador seleccionable. La Figura 4 ilustra un genoma de ratón que comprende una eliminación 55 del locus de FcγR de baja afinidad endógeno (parte superior). Como se ilustra, la construcción de dirección contiene un brazo de homología 5’ que contiene la secuencia de cadena arriba del locus de FcγR de ratón de baja afinidad endógeno, seguido de un casete de selección de fármacos (por ejemplo, un gen de resistencia a la higromicina flanqueado por ambos lados por secuencias loxP), un fragmento genómico que contiene un gen FcγRIIA humano, un gen HSP76 humano y un gen FcγRIIIA humano, y un brazo de homología 3’ que contiene la secuencia de cadena abajo del locus de FcγR de ratón de baja afinidad endógeno. Tras la recombinación homóloga en el locus eliminado, se reemplaza el casete de selección de fármacos por la secuencia contenida en el vector de dirección (parte inferior de la Figura 4). El locus de gen FcγR endógeno de baja afinidad se reemplaza por genes FcγR humanos de baja afinidad, dando lugar a una célula o a un animal que expresa genes FcγR humanos de baja afinidad. El casete de selección de fármacos se puede eliminar opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por

65 ejemplo, mediante tratamiento con Cre).

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anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo antitumoral), lo que determinaría las funciones de ADCC y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en el agotamiento de las células tumorales in vivo.

Se proporcionan ratones modificados genéticamente que comprenden un reemplazo de los genes FcγR endógenos

5 de baja afinidad por genes FcγR humanos de baja afinidad. Dichos animales son útiles para estudiar la farmacocinética de anticuerpos completamente humanos y la ADCC mediada por hFcγR. Además, se ha demostrado que los genes FcγR humanos presentan polimorfismos o variantes alélicas asociadas con la enfermedad (por ejemplo, SLE, AR, Ganulomatosis de Wegener, síndrome de Guillain-Barré y esclerosis múltiple). De este modo, los animales no humanos modificados genéticamente que comprenden un reemplazo de los genes

10 FcγR endógenos de baja afinidad por formas alélicas o polimórficas específicas de genes FcγR humanos se pueden usar para estudiar enfermedades autoinmunes humanas y rasgos asociados con los polimorfismos, en el animal. En una realización específica, las formas alélicas de los genes FcγR humanos están asociadas con una eficacia potenciada para la IgG humana.

15 En otro caso específico, se determina el efecto de un polimorfismo de FcγR de baja afinidad humano sobre la eficacia de un anticuerpo terapéutico humano. En un caso específico, se administra un anticuerpo antitumoral a un primer ratón humanizado que comprende un primer polimorfismo de un FcγR humano y también a un segundo ratón humanizado que comprende un segundo polimorfismo de un FcγR humano, en el que el primer y el segundo ratón comprenden cada uno una célula tumoral humana; y se evalúa la actividad antitumoral del anticuerpo antitumoral en

20 el primer ratón y en el segundo ratón. En un caso específico, un médico selecciona una opción de tratamiento con respecto al tratamiento de un ser humano que tiene el primer o el segundo polimorfismo, y que tiene un tumor correspondiente a la célula tumoral humana, basándose en la evaluación de la eficacia del anticuerpo antitumoral en el primer ratón y en el segundo ratón.

25 Los polimorfismos adecuados de genes FcγR humanos incluyen todos los conocidos en la técnica. Para el gen FcγRIIA humano, los polimorfismos incluyen, por ejemplo, el fenotipo de respuesta alta y de respuesta baja informado por la capacidad de los linfocitos T para proliferar en respuesta a IgG. El polimorfismo de respuesta alta se caracteriza por un resto de arginina en la posición 131 (131Arg), mientras que el de respuesta baja se caracteriza por un resto de histidina en la posición 131 (131 His). En una realización específica, la secuencia de FcγRIIA

30 humana comprende el polimorfismo de 131 His. En SEQ ID NO: 32, se muestra una secuencia de proteína representativa de la cadena α de FcγRIIA humana.

Las sustituciones de un solo nucleótido del gen FcγRIIB humano dan lugar a sustituciones de sentido erróneo en el dominio de unión al ligando (cadena α), y afectan putativamente a la capacidad de unión de una parte Fc de una IgG

35 para unirse a la cadena α de FcγRIIB en la superficie celular. Por ejemplo, se ha demostrado que la sustitución de una isoleucina con un resto de treonina en la posición 232 (IIe232Thr) dentro del dominio transmembrana del gen FcγRIIB en ratones afecta a la capacidad de señalización del receptor. En una realización específica, el gen FcγRIIB humano comprende la variante de isoleucina (232IIe). En SEQ ID NO:33, se muestra una secuencia de proteína representativa de la cadena α de FcγRIIB humana.

40 Se propone que las variantes alélicas del gen FcγRIIIA humano participan en la susceptibilidad al LED y a la AR. Esta variante alélica incluye una sustitución de valina por fenilalanina en la posición 158 (Val158Phe). La variante alélica de valina (158Val) se caracteriza por tener una mayor afinidad por IgG1 e IgG3 que la variante alélica de fenilalanina (158Phe). Se ha propuesto que la variante alélica 158Phe conduce a una eliminación reducida de los

45 complejos inmunes. En una realización específica, el gen FcγRIIIA humano comprende la variante alélica 158Val. En SEQ ID NO: 35, se muestra una secuencia de proteína representativa de la cadena α de FcγRIIIA humana.

Las variantes alélicas del gen FcγRIIIB humano incluyen los alelos del antígeno de neutrófilos 1 (NA1) y del antígeno de neutrófilos 2 (NA2). Se ha propuesto que estas variantes alélicas participan en reacciones de transfusión de

50 sangre, neutropenia aloinmune, LED y granulomatosis de Wegener. La variante alélica NA2 se caracteriza por una capacidad disminuida para mediar en la fagocitosis. En una realización específica, el gen FcγRIIIB humano comprende la variante alélica NA2. En SEQ ID NO: 36, se muestra una secuencia de proteína representativa de la cadena α de FcγRIIIB humana.

55 En un aspecto, los ratones modificados genéticamente son útiles para optimizar funciones mediadas por FcγR desencadenadas por la parte Fc de anticuerpos terapéuticos. Las regiones Fc de los anticuerpos se pueden modificar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden modificar los restos de aminoácidos de dentro de la parte Fc (por ejemplo, los dominios CH2 y CH3) para potenciar selectivamente la afinidad de unión a FcγRIIIA humano. De este modo, el anticuerpo resultante debería tener una ADCC dependiente

60 de FcγRIIIA potenciada. En una realización específica, se usa un ratón que expresa FcγRIIIA humano de la presente invención para evaluar la capacidad de ADCC potenciada de un anticuerpo humano modificado administrando un anticuerpo humano modificado al ratón, detectando (por ejemplo, in vitro) la unión del anticuerpo a células que expresan FcγRIIIA y comparando la actividad de ADCC observada con la actividad de ADCC observada según lo determinado en un animal de tipo silvestre.

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Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de ratones deficientes en genes FcγR de baja afinidad

5 Se construyó una construcción de dirección para la introducción de una eliminación del locus de FcγR de ratón de baja afinidad endógeno (descrito a continuación) (Figura 1).

La construcción de la dirección se preparó usando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) «High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis», Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar el cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-395f6 (Invitrogen). Se modificó el ADN del BAC RP23-395f6 para eliminar los genes FcγRIIB, FcγRIV yFcγRIII endógenos de baja afinidad que comprenden la cadena α de cada uno de los FcγR.

En resumen, se crearon brazos de homología cadena arriba y cadena abajo empleando los cebadores mFcR 5-up-1

15 (5'-ACCAGGATAT GACCTGTAGA G; SEQ ID NO: 1) y mFcR 3-up-1a (GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A; SEQ ID NO: 2), y mFcR 5-DN (ATGCGAGCTC ATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCTTGCCCAATAC TTAC; SEQ ID NO:3) y mFcR 3-DN (ACTCATGGAG CCTCAACAGG A; SEQ ID NO: 4), respectivamente. Se usaron estos brazos de homología para crear un casete que eliminara las cadenas α de los genes FcγRIIB, FcγRIV y FcγRIII endógenos de baja afinidad. La construcción de dirección incluía un gen de resistencia a la neomicina flanqueado por lox, que comprendía brazos de homología que comprendían una secuencia homóloga a una región 5’ y una región 3' con respecto al locus endógeno. Los genes y/o las secuencias cadena arriba del gen FcγRIIB endógeno y cadena abajo del gen FcγRIII endógeno (véase la Figura 1) no se modificaron mediante la construcción de dirección.

25 La eliminación dirigida se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores fuera de la región eliminada y dentro de la construcción de dirección. La región de cadena arriba del locus eliminado se confirmó mediante PCR usando cebadores mFcR-up-detect (ATCCTGAGTA TACTATGACA AGA; SEQ ID NO: 5) y PGK-up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C; SEQ ID NO: 6), mientras que la región de cadena abajo del locus eliminado se confirmó usando los cebadores pA-DN-detect (CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO: 7) y mFcR-DN-detect (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO: 8). La secuencia de nucleótidos a través del punto de eliminación cadena arriba incluía lo siguiente, que indica la secuencia de ratón endógena cadena abajo del gen FcγRIIB (contenida entre paréntesis a continuación) unida contiguamente a la secuencia de casete presente en el punto de eliminación: (GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA (SEQ ID NO: 9). La secuencia de nucleótidos a través del punto de eliminación cadena abajo incluía lo siguiente, que indica la secuencia

35 de casete contigua con la secuencia de ratón endógena cadena arriba del gen FcγRIII (contenida entre paréntesis a continuación): CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACT TA) (SEQ ID NO: 10).

Se generaron ratones deficientes en FcγRIIB, FcγRIII y FcγRIV a través de la electroporación de un ADN de BAC diana (descrito anteriormente) en células ES de ratón. Los clones de células ES positivas se confirman mediante exploración con Taqman™ y cariotipado. A continuación, se usaron clones de células ES positivas para implantarlos en ratones hembra, dando lugar a una camada de crías deficientes en genes FcγR de baja afinidad.

Ejemplo 2: Caracterización de ratones deficientes en genes FcγR de baja afinidad

45 Se recogieron bazos de ratones deficientes en FcγR y de tipo silvestre, y se perfundieron 10 ml de colagenasa-D en bolsas desechables estériles. A continuación, se dispuso cada bolsa que contenía un solo bazo en un Stomacher® (Seward) y se homogeneizó en un ajuste medio durante 30 segundos. Se transfirieron los bazos homogeneizados a placas Petri de 10 cm y se incubaron durante 25 minutos a 37 ºC. Se separaron las células con una pipeta usando una dilución 1:50 de EDTA 0,5 M, seguido de otra incubación durante cinco minutos a 37 ºC. Se sedimentaron las células con una centrífuga (1000 rpm durante 10 minutos) y se sometieron a lisis los glóbulos rojos en 4 ml de tampón ACK (Invitrogen) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con RPMI-1640 (Sigma) y se centrifugaron de nuevo. Se volvieron a suspender las células granuladas en 10 ml de RPMI-1640, y se filtraron con un filtro de células de 0,2 µm.

55 Citometría de flujo. Se identificaron las poblaciones de linfocitos mediante FAC en el sistema BD LSR II (BD Bioscience) con los siguientes marcadores de superficie celular conjugados con flourocromo: anti-CD19 (linfocitos B), anti-CD3 (linfocitos T), anti-NKp46 (linfocitos NK) y anti-F4/80 (macrófagos). Se seleccionaron linfocitos para linajes celulares específicos y se analizaron para determinar la expresión de FcγRIII y FcγRIIB endógenos con un anticuerpo de rata anti-FcγRIII/II de ratón (clon 2.4G2, BD Biosciences). El clon 2.4G2 reconoce un epítopo polimórfico común en los dominios extracelulares de FcγRIII y FcγRII murinos. Los resultados muestran que no había FcγRIII ni FcγRII murinos de baja afinidad detectables en los linfocitos B, linfocitos NK y macrófagos en m ratones FcγR KO (Figura 2).

Ensayo de ADCC Se analizaron esplenocitos aislados de ratones deficientes en genes FcγR y de tipo silvestre para 65 determinar su capacidad de realizar la ADCC en un ensayo de destrucción celular. Se aislaron poblaciones celulares y se separaron usando tecnología MACS® (Miltenyi Biotec). En resumen, se empobrecieron los esplenocitos de

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