JP5067970B2 - 相同的組換えを用いた位置指定クローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物のキット - Google Patents

相同的組換えを用いた位置指定クローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物のキット Download PDF

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Description

１．序
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。特定の実施形態においては、RecE/TもしくはRedα/βリコンビナーゼ、または細菌の相同的組換えを開始させるための機能的に均等な系（例えば、ファージP22由来のerf）が使用される。特に、本発明はクローニング方法、診断方法、クローニングベクターとして有用なポリヌクレオチドを含む組成物、そのようなポリヌクレオチド組成物を含む細胞、ならびにRecE/TおよびRedα/β媒介クローニングに有用なキットに関する。
２．発明の背景
大腸菌におけるDNAのクローニングおよびサブクローニングは分子生物学の土台をなすものである。DNAクローニングとは、複製起点を二本鎖DNA断片に作動可能に連結して、大腸菌または他の適当な宿主内で増やすプロセスをいう。DNAサブクローニングとは、例えばPCRによってin vitroで、または大腸菌や他の適当な宿主内での増殖によりin vivoで、すでに増幅されているDNA分子から二本鎖DNA断片を取得し、次にその二本鎖DNA断片を作動可能な複製起点に連結するプロセスをいう。大腸菌でのクローニングおよびサブクローニングは、典型的には、DNA断片の末端を、大腸菌の複製起点と選択マーカーを含む線状化ベクターの末端にライゲートすることにより行なわれる。選択マーカーをベクター中に含めるのは、大腸菌宿主細胞に導入したとき、新たにクローン化された産物（その挿入物を含むプラスミド）が保持され増幅されることを確実にするためである。
従来のクローニング法にはいくつかの制限がある。例えば、通常のクローニングは制限酵素の使用を必要とするので、DNA断片の選択は、関心のあるDNA領域中の制限酵素認識部位の利用可能性によって制限される。所望のDNA断片の内部ではなく境界を切断する制限部位が存在しなければならない。最も有用な制限酵素はかなり頻繁に切断するので、作製される線状DNA断片のサイズも制限される。
DNA断片を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用が増えるにつれて、従来のサブクローニングには第２の大きな欠点が提起された。PCR産物の末端は、熱安定性ポリメラーゼにより増幅PCR産物の3'末端に付加された非鋳型ヌクレオチドのために、ライゲーション反応において非効率的である。さらに、PCRの使用は高リスクの突然変異を伴う。したがって、分子生物学者らは、DNAの断片を、特に制限酵素またはPCRの方法論によって都合よく利用できるものよりも長い断片を、クローニングするための新規で、より効率的な方法を探し求めてきた。
相同的組換えはDNA断片をクローニングおよびサブクローニングするための代替法である。宿主の相同的組換え系を利用する、大腸菌でのPCR産物のサブクローニング法はすでに開示されている(Olinerら, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5192-97（非特許文献１）; Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602（非特許文献２）)。そのような方法では、関心のあるDNA断片を増幅するために、線状化ベクターの両末端の配列に相同な末端配列を含むように設計されたPCRプライマーを使用する。次いで、PCR産物と線状化ベクターを大腸菌に導入する。大腸菌宿主細胞内での相同的組換えがプラスミドベクターへのPCR産物配列の挿入をもたらす。こうした方法はPCR断片をサブクローニングするには有用であると分かったが、長いDNA断片のサブクローニング、または任意のサイズのDNA断片のクローニングには応用されていない。
もう一つの方法として、末端に長い相同性領域をもつ２つの線状DNA分子（一方が複製起点を有する）を用いて大腸菌sbcBC宿主細胞を形質転換するin vivoサブクローニング法が開示されている。相同的組換えがin vivoで起こり、新たに形成されたプラスミドの環化と増幅をもたらす(Degryse, 1996, Gene 170:45（非特許文献３）)。その後、相同的組換えを媒介する大腸菌sbcBC宿主細胞の能力は、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスのゲノムDNA由来の大きなDNA断片をサブクローニングするために応用された(Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805（非特許文献４）; Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763（非特許文献５）; He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514（非特許文献６）)。記載されるように、大腸菌sbcBC宿主細胞における相同的組換えによるそれぞれのサブクローニングは、大腸菌の複製起点の両側に長い相同性領域を位置づけるために、少なくとも２つの調製的サブクローニング工程を必要とする。さらに、大腸菌sbcBC株におけるDNAクローニングは記載されていない。
最近、RecE/RecT(RecE/T)またはRedα/Redβ(Redα/β)のいずれかにより媒介される相同的組換えは、大腸菌においてDNA分子を操作するのに有用であることが見いだされた(Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128（非特許文献７）; Muyrersら, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557（非特許文献８）)。これらの論文は、大腸菌において、インタクトで自律複製性の環状DNA分子はどれも、該環状分子中に存在する領域と同一のDNA配列の短い領域によって挟まれた線状DNA断片とのRecE/TまたはRedα/β媒介相同的組換えにより、改変され得ることを示している。相同的組換えによる環状分子への線状DNA断片の組込みは、その隣接（フランキング）配列間の配列と環状DNA分子中の対応する配列を置き換える。
本明細書中での文献の引用は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
Olinerら, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5192-97 Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602 Degryse, 1996, Gene 170:45 Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805 Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763 He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514 Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128 Muyrersら, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557
３．発明の概要
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAのクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。細菌性リコンビナーゼは好ましくはRecE/Tおよび／またはRedα/βである。こうした方法は、指定された標的DNA配列に隣接する配列と相同な短いDNA領域および複製起点を含むベクターを用いて、関心のあるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの混合物をクローニング、サブクローニング、増殖または増幅するために使用することができる。
一つの実施形態において、本発明は、機能性リコンビナーゼを発現する細菌細胞を培養することを含んでなる、二本鎖標的DNAをベクターに導入する方法であって、該細菌細胞は、(a) 第１の二本鎖末端および第２の二本鎖末端を含む標的DNAと、(b) ベクターDNA鎖に沿って次の順序で、(i) 第１の二本鎖相同性アーム、(ii) 複製起点、(iii) 第２の二本鎖相同性アームを含むベクターDNAと、を含有し、そして、ベクターDNA鎖の第１の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第１の末端の配列に相同であり、かつベクターDNA鎖の第２の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第２の末端の配列に相同であり、その結果、標的DNAがベクターDNAの該相同性アーム間に挿入される、上記方法を提供する。
別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a) 細胞に二本鎖ベクターを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第１の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第２の末端の配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a) 細胞に二本鎖ベクターと第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と２つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、該第１のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第１のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第２のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第３のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a) 細胞に二本鎖標的DNA分子を導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第１の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第２の末端の配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a) 細胞に二本鎖標的DNA分子と第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、該第１のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第１のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第２のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第３のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であり、そして、該ベクターは複製起点と２つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a) 細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に二本鎖ベクターと二本鎖標的DNAを導入すること、ただし、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、該標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
この方法の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第１および第２の認識部位をさらに含み、第１の認識部位が第１および第２の相同性アームの外側に位置し、第２の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第１および第２の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する。
この方法の別の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが第１および第２の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。
別の実施形態において、本発明は、組換えDNA分子を作製する方法を提供し、該方法は、a) 細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に、二本鎖ベクターと二本鎖標的DNA分子と第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該ベクターは複製起点と２つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端の順序で含むものであり、該第１のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第１のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第２のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第３のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。
この方法の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第１および第２の認識部位をさらに含み、第１の認識部位が第１および第２の相同性アームの外側に位置し、第２の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第１および第２の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する。
この方法の別の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが第１および第２の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。
特定の実施形態において、該ベクターは相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該ベクターがベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の２つの順序のいずれかで、i) 第１の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第２の相同性アーム、またはii) 第１の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第２の相同性アームを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは該ベクターを含む細胞に抗生物質耐性を賦与する。
種々の特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼはRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である。他の特定の実施形態では、前記細胞が細菌細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞が大腸菌細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞がRecE/Tおよび／またはRedα/βタンパク質を組換え的に発現する真核細胞である。他の特定の実施形態では、前記方法が前記ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を単離することをさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターを提供し、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含んでなり、第１のベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第１のベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同である。該ベクターの特定の実施形態では、複製起点が細菌の複製起点である。別の特定の実施形態では、複製起点が大腸菌内で機能する。別の特定の実施形態では、複製起点が哺乳動物細胞内で機能する。
本発明はさらに、関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターを含有する細胞を提供し、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含んでなり、第１のベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第１のベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同である。特定の実施形態では、細胞が細菌細胞である。
本発明はさらに、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットを提供し、該キットは、１つ以上の容器内に、a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含んでなり、第１のベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第１のベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同である、該ベクター、および、b) 細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる。該キットの特定の実施形態では、相同性アームがBAC、PAC、ラムダ、プラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する。該キットの別の特定の実施形態では、第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドがBAC、PAC、ラムダ、プラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する。
別の実施形態においては、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットが提供され、該キットは、１つ以上の容器内に、a)関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含む該ベクター、b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第１の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第１のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第１のオリゴヌクレオチド、c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第２の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第３のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第２のオリゴヌクレオチド、および、d) 細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる。このキットの特定の実施形態では、前記細胞が大腸菌細胞である。該キットの特定の実施形態では、前記細胞がDNAを取り込む能力のある凍結細胞である。
別の実施形態において、本発明は標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットを提供し、該キットは、１つ以上の容器内に、a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含む該ベクター、b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第１の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第１のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第１のオリゴヌクレオチド、および、c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第２の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第３のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第２のオリゴヌクレオチド、を含んでなる。該キットの特定の実施形態では、DNAベクターが精製されている。該キットの特定の実施形態では、DNAベクター、第１の二本鎖オリゴヌクレオチド、および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドが精製されている。
本発明により提供されるキットの他の特定の実施形態では、標的DNA分子が細菌、ウイルス、寄生生物、または原生動物のDNAを含む。他の特定の実施形態では、標的DNA分子が障害または疾患に関連することが知られたまたは予想された遺伝的突然変異または多型を含む。他の特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼがRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である。
本発明の方法は診断に使用することができる。例えば、プラスミドまたは線状DNA断片は、特定のDNA標的を捕捉して被験者由来のサンプル中のその存在（例えば、患者のサンプル中に存在するウイルスDNA）を検出するように設計することができる。一つの実施形態において、本発明は、遺伝的に突然変異を起こしたとき、障害または疾患に関連することが知られたまたは予想された標的DNAの検出方法を提供する。特定の実施形態では、標的DNAが細菌、ウイルス、寄生生物、または原生動物のDNAである。特定の実施形態では、ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む方法が提供される。別の実施形態では、前記方法はベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む。
別の実施形態において、本発明は病原体の存在の検出方法を提供し、その際、標的DNAは感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第１および第２の相同性アームの配列は該病原体のDNA中に存在する配列に相同である。特定の実施形態では、標的DNAが感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第２および第４のヌクレオチド配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である。他の特定の実施形態では、病原体がウイルス、細菌、原生動物、真菌、または寄生生物である。
他の実施形態においては、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在を検出する方法が提供され、その際、標的DNAは遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第１の相同性アームの配列は遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第２の相同性アームの配列は遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である。特定の実施形態では、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在を検出する方法が提供され、その際、標的DNAは遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第１の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第２の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である。特定の実施形態では、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質が癌、喘息、関節炎、薬剤耐性、薬剤毒性、または神経的、神経精神的、代謝的、筋肉、心血管な、もしくは皮膚の状態、疾患または障害であるか、あるいはこれらに罹りやすくする。
４．図面の説明
本明細書の最後を参照のこと。
５．発明の説明
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAのクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。本発明者は、高効率の標的クローニングおよびサブクローニングを達成するために特定の方法で細菌性リコンビナーゼを利用できることを発見した。
好ましくは、用いる細菌性リコンビナーゼはRecE/Tおよび／またはRedα/βである。大腸菌におけるRecE/T経路は以前に記載されており、その構成成分は一部が特徴づけられている(HallおよびKolodner, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3205-3209; Gillenら, 1981, J. Bacteriol. 145: 521-532)。RecE/T経路を介した組換えは２個の遺伝子（すなわち、recEとrecT）の発現を必要とし、これらのDNA配列はすでに発表されている(Hallら, 1993, J. Bacteriol. 175: 277-278)。RecEタンパク質はRedαとも呼ばれているλexoと機能的に類似しており、RecTタンパク質はRedβおよびファージP22のerfと機能的に類似している(Gillenら, 1977, J. Mol. Biol. 113:27-41; Little, 1967, J. Biol. Chem. 242:679-686; RaddingおよびCarter, 1971, J. Biol. Chem. 246:2513-2518; JosephおよびKolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10411-17; JosephおよびKolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10418-24; MuniyappaおよびRadding, 1986, J. Biol. Chem. 261:7472-7478; KmiecおよびHollomon, 1981, J. Biol. Chem. 256:12636-12639; PoteeteおよびFenton, 1983, J. Mol. Biol. 163:257-275; Passyら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4279-4284、ならびにそこに引用された文献)。
本明細書には、位置指定DNAクローニングおよびサブクローニングのための細菌性リコンビナーゼの使用に関する方法および組成物が開示される。本明細書中で用いる「DNAクローニング」という用語は、宿主細胞内で増やすことができるように、任意の源からのDNAを自律複製ベクター中に挿入するプロセスを意味する。「DNAサブクローニング」という用語は、自律複製ベクター中にすでに存在するDNA断片を他の自律複製ベクター中に移すプロセス、または精製されたウイルスゲノムのような高度に濃縮されたDNA分子に由来するDNA断片またはPCRで増幅されたDNA断片を自律複製ベクター中に移すプロセスを意味する。「位置指定」(directed)または「標的」(targeted)クローニングおよびサブクローニングという用語は、標的DNAを選択するための、および、相同性アームの選択および方向づけによって標的DNAの挿入方向を指定するための、相同性アームの使用、そして種々の実施形態ではアダプターオリゴヌクレオチドの使用を意味する。本発明の方法は全て、DNAのクローニングとサブクローニングの両方法に適用されることに留意すべきである。
本発明の組成物および方法の構築を、以下で詳細に説明する。特に、第5.1節には、相同的組換えによりDNA断片を標的クローニングするための本発明の媒介組換えクローニング法を記載する。以下の第5.2節には、関心のある標的DNA断片をターゲッティングし、捕捉し、クローニングするように設計されたDNA構築物をはじめとする本発明の組成物を記載する。また、RecE/Tおよび／またはRedα/βタンパク質のような細菌性リコンビナーゼをコードする核酸分子、そのような組成物を含む細胞、ならびにそのような核酸および細胞を構築するための方法も開示する。以下の第5.3節には、遺伝子発現を検出し、疾病状態を診断するための細菌性リコンビナーゼ標的クローニングの方法およびキットの使用を開示する。
5.1 相同的組換えによるクローニングおよびサブクローニングの方法
ここに記載する種々の方法は、細菌性リコンビナーゼ媒介相同的組換えにより関心のある任意のDNAを効率よく標的クローニングするために使用することができる。ここに記載する３つのアプローチは、共通の構成成分として、細菌性リコンビナーゼ組換えタンパク質を発現する細胞、およびベクターを必要とする。ベクターの例は図1Aに示してある。このベクターは３つの必須エレメント、すなわち、複製起点と２つの二本鎖DNAの短い領域（本明細書中では「相同性アーム」と呼ぶ）を含んでいる。
相同性アームは、ベクターが、相同的組換えによって相同性アーム間で標的DNAを捕捉できるように特異的に設計される。相同性アーム間に標的DNAを正しく挿入するには、該アームの配列、位置および方向が重要となる。一つの実施形態において、相同性アームが標的DNAの末端に対する配列相同性を有する場合は、２つの相同性アームの配列は標的DNAに隣接するDNAの配列に対応する。すなわち、一方のアーム（図１ではＡとして表示）は標的DNAの上流のDNA配列（図１ではＣとして表示）に対応し、他方のアーム（図１ではＢとして表示）は標的DNAの下流に位置する配列（図１ではＤとして表示）に対応する。所望の挿入物に対する２つのアームの方向は、標的DNAに対する相同配列の方向と同じでなければならなず（図１参照）、こうして、相同性アームと標的DNAとの組換えにより、標的DNAが２つの相同性アームの間、つまり「内側」（図１参照）、に挿入される。本明細書中で用いるとき、位置が２つの相同性アームの間に位置づけられる場合、位置は２つの相同性アームの「内側」であると定義され、こうして、第１の相同性アームは一方向で複製起点とそれ自体の間に、そして第２の相同性アームは他方向で複製起点とそれ自体の間に位置づけられる。一方、一方向で、どちらの相同性アームもそれ自体を複製起点から隔離しない場合は、位置は２つの相同性アームの「外側」であると定義される。したがって、定義によれば、複製起点と選択マーカーはベクターの相同性アームの「外側」にあり（図１参照）、こうして、標的配列の挿入はプラスミド上に複製起点と選択マーカーを保存することとなる。他方、標的DNAは、定義によれば、相同性アームの「内側」に挿入される。図1Aは、相同性アームの「内側」と「外側」の意味を模式的に示したものである。
別の実施形態において、相同性アームは１セットの二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドに対する配列相同性を有する。そのようなアダプターオリゴヌクレオチドは図1Bに例示してある。各アダプターオリゴヌクレオチドの配列は、ベクターの相同性アームの一方の配列と、さらに、関心のある標的遺伝子に隣接する配列に相同な配列とを含む（図1C参照）。こうして、一つのアダプターオリゴヌクレオチドは、一方の相同性アームのDNA配列（図１にA'として表示）および標的DNAの上流のヌクレオチド配列（図１にC'として表示）に対する相同性を含む。二つ目のアダプターオリゴヌクレオチドは、他方の相同性アームのDNA配列（図１にB'として表示）および標的DNAの下流に位置するヌクレオチド配列（図１にD'として表示）に対する相同性を含む。この方法では、アダプターオリゴヌクレオチドの配列を変えることによって、関心のある特定の遺伝子配列をターゲッティングするように一般的相同性クローニングベクターを適合させることができる（図５参照）。本発明の各種実施形態を実行するために使用しうる方法ならびに組成物をここで詳しく説明する。
以下に記載する方法は、相同的組換えによる位置指定クローニングの３つのとりうるアプローチを含む。以下で詳述するように、３つのアプローチは、それぞれ、特定のクローニング用途にそれを優先させるような独自の利点を有する。これらの方法および用途を以下で詳しく説明する。図２に示すアプローチでは、標的DNAを含む細胞にクローニングベヒクルを導入する。この第１のアプローチを使用すると、煩雑な制限分析およびin vitro操作を必要とせずに、挿入物を１つのレプリコンから別のレプリコンに都合よく移すことができる。このアプローチは、標的DNAが大腸菌のレプリコン中にすでに存在し、それの更なる使用には選ばれた部分のサブクローニングが必要となる場合に有用である。例えば、コスミド、ファージまたはBACライブラリーから単離されたDNAクローンの使用は、挿入物を配列決定するために、または遺伝子によりコードされるタンパク質を発現させるために、選ばれた部分を新ベクターにサブクローニングすることによって促進される。図３に示す第２のアプローチでは、クローニングベクターおよび標的DNAを作製し、その後、一緒に細胞に導入する。あるいはまた、図４に示すように、クローニングベクターをすでに含む細胞に、関心のあるDNAを添加してもよい。後者の２つのアプローチは、例えば癌細胞由来のDNAのように、標的DNAがなんらかの外部源に由来するものである場合に有用である。
5.1.1 アプローチ１：標的DNAを含む宿主細胞へのベクターの導入
図２に示すように、一実施形態では、標的DNA配列は、細菌性リコンビナーゼを発現する宿主細胞内にすでに存在する。例えば、標的DNAは、独立して複製するDNA分子、例えば、限定するものではないが、プラスミド、ファージ、細菌人工染色体（BAC）、または大腸菌宿主細胞中の大腸菌染色体上に常在しうる。RecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼのような細菌性リコンビナーゼを発現する宿主細胞を構築する方法については、第５．２．２節に詳しく説明する。
複製起点と、この起点およびマーカーの両端に位置する２つの相同性アームを含むベクターDNAを宿主細胞に導入する。好ましくは、このベクターは、線状分子であり、上記相同性アームは、線状分子の各末端に位置するが、これらアームは、内側にあってもよい。細胞に入った後、ベクターDNAの相同性アームと、標的DNA配列との間の相同的組換えにより、相同性アーム間に標的DNAが挿入され、その結果、環状のエピソームが形成される。次に、細胞を選択培地上で培養することにより、ベクターに存在する選択マーカーを選択する。環状化された分子だけが複製する能力があり、宿主細胞中で選択が可能であることから、選択培地で成長した細胞の多くは、標的DNAを含む組換え分子を含有するだろう。
一実施形態では、線状ベクターDNA断片の末端を、修飾ヌクレオチドで遮断することにより、相同的組換え以外のあらゆる手段、すなわち、非正統的組換えで、線状断片の末端の接合によって発生する事象の数を減少させることができる。このような修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホチオネートヌクレオチドを、相同性アームの5’末端ヌクレオチドに組み込むことができる。修飾ヌクレオチドは、上記ベクターを構築するのに用いたプライマーのオリゴヌクレオチド合成中に組み込んでもよいし（以下の第５．２．１節を参照）、あるいは、合成後に、オリゴヌクレオチドまたは線状ベクターDNAの酵素的もしくは化学的修飾により付加してもよい。オリゴヌクレオチドおよび線状DNA断片のこのような修飾の方法は、当業者には公知であり、以下の第５．２．２節に詳しく説明する。
5.1.2. アプローチ２：ベクターおよび標的DNAの宿主細胞への共導入
図３に示すように、別の実施形態では、ベクターDNAおよび標識DNAをin vitroで混合した後、RecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼを含む細胞に共導入する。標的DNAは、いかなる供給源に由来するものでもよい。例えば、標的DNAは、限定するものではないが、全血液、血漿、血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液、生検吸引液、組織培養細胞、培地等の生物学的サンプル、あるいは、食品、水もしくはその他の材料等の非生物学的サンプルから取得することができる。このような供給源からDNAを調製する方法は、当業者には公知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照）。
ベクターおよび標的DNAを用意し、in vitroで混合した後、好ましくは、共電気穿孔による大腸菌中での形質転換により、細菌性リコンビナーゼタンパク質を発現する細胞に共導入する。このベクターDNAは、線状DNAまたは環状プラスミドDNAのいずれの形状をしていてもよい。好ましい実施形態では、該ベクターは、線状DNA分子である。標的DNAの供給源は、ベクターDNAに対して過剰の重量で、すなわち過多に、混合することにより、細胞に、目的とする標的DNA領域の可能な限り多数のコピーを導入し、これによって、組換え産物の収率を最大限にする。細胞を選択培地で成長させることにより、環状化した産物を選択する。好ましい実施形態では、上記ベクターは、抗生物質耐性マーカーを含み、細胞を抗生物質の存在下で成長させる。このような選択下で増殖可能なコロニーは、線状断片の環状化した、組換え形態を含む。
一実施形態では、線状ベクターDNA断片の末端は、以下の第５．２．１節で説明するように、修飾ヌクレオチドで遮断することができる。オリゴヌクレオチドのこのような修飾の方法は、当業者には公知であり、以下の第５．２．１節で説明する。
このアプローチは、標的DNAが、大腸菌以外の供給源、例えば、酵母または真核細胞から得られる場合に特に有用である。一実施形態では、この方法を診断目的に用いて、あらゆる生物サンプル中における特定のDNAの存在を検出することができる。例えば、この方法を用いて、乳癌患者から採取した生検サンプル中の特定のエストロゲン受容体またはBRCA 1対立遺伝子の存在を検出することができる。
別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法による増幅に代わるものとして、上記方法を用いることにより、DNAの領域を増幅することができる。大腸菌中での相同的組換え、クローニングおよび増殖による増幅によって、PCRに基づく方法に対比していくつかの利点が得られる。第１に、PCRのエラーは、多くの目的にとって大きな欠点となり得る。PCRプライマー対の組合わせは、擬似反応産物を産生する傾向がある。さらに、最終的反応産物におけるエラー数は、エラーがDNAサンプルに導入された後、PCR増幅のラウンド毎に、指数関数的に増加する。これに対し、相同的組換えクローニングによる増幅は、大腸菌中の細胞プルーフリーディング機構という利点があるため、これより少なくとも1,000倍忠実である。第２に、本方法を用いて増幅することのできるDNA領域のサイズに対する制限が少ないことである。数キロベースより長い（５〜10kb以上の）DNA領域の増幅は、PCR法を用いては困難である。本方法は、少なくとも約100キロベースまでの、はるかに大きい領域のクローニングに適している。現在、ゲノムのクローニングは、大きなランダムライブラリーを作製した後、個々のクローンを選別および順序付けするという長々とした工程を必要とする。本方法を用いて、相同性アームを設計し、そして大きく、非重複の、連続したクローン（「コンティグ」と呼ぶ）へのゲノムのクローニングを指令するためのベクターを構築することができる。第３に、DNAをPCR法で生成した後でも、PCR産物は、さらに別の処理工程でクローニングしなければならない。相同的組換えクローニング法では、この追加のサブクローニング工程の必要がなくなる。増幅しようとするDNAの領域を相同性アームの間に単に挿入し、大腸菌宿主中に、ベクターDNAで形質転換するだけでよい。
この実施形態における相同的組換えは、DNAを細胞に添加する前に、in vitroで実施することができる。例えば、単離したRecEおよびRecT、または、RecE/Tを含む細胞抽出物をDNAの混合物に添加してもよい。組換えをin vitroで行う場合には、DNA分子の選択は、適当な宿主細胞中に組換え混合物を形質転換し、前述したように、陽性クローンを選択することにより、達成される。
5.1.3 アプローチ３：ベクターDNAを含む宿主細胞への標的DNAの導入
別の実施形態では、ベクターDNAをすでに含む細胞に、標的DNAを導入する。標的DNAは、前記５．１．２節に記載したように、どんな供給源に由来するものでもよく、線状または環状のいずれの形態をしていてもよい。前述のように、いったん標的DNAが細胞内に入ると、相同性アームと標的DNA間の相同的組換えにより、相同性アーム間への標的DNAの挿入が起こる。しかし、この場合、所望の産物および非組換えベクターの両方が選択マーカー遺伝子を発現するので、逆選択（counter-selection）によって、非組換えベクターに対して選択する必要がある。本明細書中では、この逆選択を達成するため、様々な実施形態について詳述する。例えば、一実施形態では、部位特異的組換えおよび切除反応を用いた方法を使用することができる。このアプローチを図５に示す。別の実施形態では、非組換えベクターを切断する誘導可能なヌクレアーゼを誘導する。これらいずれの実施形態でも、組換え産物を含まないベクターは除去される。
上記ベクターを、まずプラスミドとして構築し、次に、宿主細胞に導入し、そこで、増殖させることができる。図５に示すように、上記ベクターは、(i)複製起点（任意の起点）と；(ii)選択マーカー（Sm）と；(iii)２つの相同性アームと；(iv)出発プラスミドベクターに対して選択するのに用いることができる逆選択マーカー、例えば、限定するものではないが、部位特異的リコンビナーゼの１対の認識部位（相同性アームの外側に位置する第１認識部位、および相同性アームの内側に位置する第２認識部位）、もしくはエンドヌクレアーゼの認識部位等を含む。本明細書で用いられるように、部位が２つの相同性アームの間に位置する場合、該部位は相同性アームの「内側」に位置するという。これによって、一方向で、第１相同性アームが、複製起点とそれ自体との間にあり、反対方向で、第２相同性アームが、複製起点とそれ自体との間に位置する。これに対し、一方向で、相同性アームのいずれも、それ自体と複製起点とを隔てていない場合には、位置は、相同性アームの「外側」であると定義する（相同性アームの「内側」と「外側」の意味を図式的に説明した図１を参照のこと）。前記の第５．１節に記載したように、複製起点と選択マーカーは、相同性アームの外側に配置し、これによって、標的配列の挿入が、プラスミド上の複製起点と選択マーカーを保存するようにしなければならない。好ましくは、逆選択マーカー、エンドヌクレアーゼ部位、もしくは、２つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位の１つは、複製起点および選択マーカーとは反対側で、相同性アームの「内側」に配置する（図５参照）。
非組換えベクターに対する逆選択を可能にする当業者には公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、一実施形態では、逆選択は、誘導可能な部位特異的リコンビナーゼ（SSR）により達成することができる。部位特異的リコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位（SSRTs）と呼ばれる２つの標的部位を認識する酵素であり、これら部位で、DNA鎖の交換および切除反応を媒介する働きをする（Halletら、FEMS Microbiol. Rev., 1997, 21:157-78；Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:521-7：Starkら、1992, Trends Genet., 8:432-9）。部位特異的リコンビナーゼの例は、当業者には公知であり、限定するものではないが、Cre、Flp、KwまたはRリコンビナーゼを含む（Nunes-Dubyら、1998, Nucleic Acids Res. 26:391-406；Ringroseら、1997, Eur. J. Biochem. 248:903-912；Utatsuら、1987, J. Bacteriol. 169：5537-5545）。２つの直接反復SSRTが環状プラスミドに常在する場合には、２つのSSRT間の部位特異的組換えにより、２つの環状プラスミドが形成される。複製起点を含む産物だけが、細胞内に維持される。従って、環状プラスミドにおける２つの直接反復SSRT間の部位特異的組換えにより、複製起点を含まない側では、２つのSSRT間に位置するDNA配列の欠失が起こる。
２つのSSRTを含むDNAベクターが構築されるが、両者は、直接反復配列として配向され、１つは、相同性アームの内側に位置し、他方は、該アームの外側で、かつ、選択マーカー（SM）と複製起点との間に位置する。このように位置するSSRT間の組換えにより、選択マーカーからの複製起点の分離が起こる（図５）。従って、SSRは、２つのSSRTを含む非組換えDNAベクターに作用し、その結果、宿主細胞からそのようなプラスミドが消失する。
次に、標準的方法により、宿主細胞をベクターDNAで形質転換する。この実施形態では、該宿主細胞は、1)RecE/Tおよび／またはRedα/β遺伝子と、2)SSRをコード化する遺伝子を含んでいなければならない。好ましくは、RecE/Tおよび／またはRedα/β遺伝子の発現は誘導性であるが、構成性発現も可能である。SSRTを認識する部位特異的リコンビナーゼ（SSR）をコードする遺伝子は誘導性でなければならない。誘導性および構成性プロモーターは当業者には公知であり、組換え遺伝子の構築および発現におけるそれらの使用方法は、以下の第５．２．３節に記載する。RecE/Tおよび／またはRedα/β遺伝子が、発現のために誘導を必要とする場合には、コンピテント細胞を作製する直前に、発現を誘導するような条件下で、ベクターを含む細胞を成長させる。ベクターDNAを含む宿主細胞を選択し、選択培地にプレートし、増殖させることにより維持する。
次に、ベクターを含む宿主細胞から、コンピテント細胞を作製する。細胞を標的DNAで形質転換する。その際、該標的DNAは、あらゆる供給源から作製することができ、例えば、任意の細胞から作製した全ゲノムのDNAでもよい。細胞を短時間培養して、相同的組換えを起こさせる。相同的組換えにより、１つのSSRTを含む相同性アーム間の配列が欠失され、標的遺伝子配列が挿入される。次に、SSRの発現を誘導する。このSSRは、非組換えベクターにおける直接反復SSRTに作用し、これによって、選択マーカーとプラスミドの複製起点を分離する。挿入標的を含むプラスミドは、唯１つのSSRTを有し、インタクトのままである。この工程全体を通じて、選択を維持しても、しなくてもよいが、SSRの誘導後間もなく、すなわち、部位特異的組換えが起こって間もなく、選択を課する必要がある。このようにして、SSRの誘導により、挿入標的遺伝子を含むプラスミドの選択が行われる。
別の実施形態では、エンドヌクレアーゼを用いて、相同的組換えの直前、その最中、あるいは、その後のいずれかに、in vivoで相同性アーム間のベクターを線状化することができる。線状プラスミドは、環状化されない限り、細胞中で生存し得ないため、組換え前のベクターの線状化は、正しい組換え産物を選択するだろう。組換え後、エンドヌクレアーゼの持続した活性が、挿入断片を含むプラスミドの選択を助ける。何故なら、相同的組換え中に、SSRは、エンドヌクレアーゼ認識部位を欠失し、その代わりに、標的DNAを挿入するからである。エンドヌクレアーゼは、非組換えベクターだけを切断し、挿入された標的配列を有するプラスミドはインタクトのままにしておくため、組換え後のエンドヌクレアーゼの持続した活性が、非組換え産物を逆選択する。この実施形態では、非常に稀有な認識部位を有するエンドヌクレアーゼを用いて、これ以外の部位が、宿主細胞DNAに存在しないようにしなければならない。このような「レアカッター（rare-cutter）」の例は、当業者には公知であり、限定するものではないが、λcos、酵母HO、またはPI-Sce1等のイントロンコード化エンドヌクレアーゼが含まれる。エンドヌクレアーゼの認識部位を２つの相同性アーム間にクローニングし、エンドヌクレアーゼによる酵素消化によって、相同性アーム間でのベクターの線状化が起こるようにする。エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は誘導性でなければならない。誘導性タンパク質発現のための構築物および方法については、以下の第５．２．３節で述べる。
別の実施形態では、エンドヌクレアーゼではなく、SSR、例えば、Creリコンビナーゼを用いて、in vivoで非組換えベクターを線状化することができる（Mullinsら、1997, Nucleic Acids Res. 25:2539-40）。この場合には、相同性アームの内側に位置する唯１つのSSRT部位を有するベクターを構築する。オリゴヌクレオチド中に１コピーの同じSSRTを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを標的DNAと混合し、標的DNAと共に宿主中に共形質転換する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、短い二本鎖DNA分子である。組換え用分子の１つが短いオリゴヌクレオチドに常在するSSRTを有する場合は、部位特異的リコンビナーゼが、そのSSRTで、ベクターを線状化する（Mullinsら、1997、前掲）。
別の実施形態では、前述した部位特異的組換えおよびエンドヌクレアーゼのアプローチを組み合わせることができる。この場合、非組換えベクターが、相同性アームの内側に、SSRTとエンドヌクレアーゼ部位の両方を含むようにする。このアプローチの一実施形態では、SSRTおよびエンドヌクレアーゼは、単一の誘導プロモーターの制御下で、共調節することができる。このようなタンパク質の共調節された誘導性発現のための構築物および方法については、以下の第５．２．３節に述べる。
別の実施形態では、逆選択のために、これらの部位特異的組換えを組み合わせて用いることが可能である。この実施形態では、２対のSSR/SSRT、例えば、Cre/loxとFlp/FRTを使用する。このベクターは、複製起点と選択マーカーとの間に、第１のSSR、すなわち、SSR1に対する２つの部位を含み、その一方は相同性アームの内側に位置し、他方は相同性アームの外側に位置する。さらに、該ベクターは、第２のSSR、すなわち、SSR2に対する１つの部位を含み、これは相同性アームの内側に位置している。SSR2に対するもう１つの部位は、短い二本鎖オリゴヌクレオチド上に位置し、標識DNAに対して過剰量が、細胞形質転換中、標的DNAと一緒に添加される。特定の実施形態では、例えば、線状化工程のための１つのSSR/SSRT対はCre/loxPであり、欠失工程のためのもう一方の対は、Flp/FRTである。
別の実施形態では、細胞に対する直接的逆選択を用いることができる。この場合には、プラスミドの複製起点が、大腸菌内での単一コピー（または非常に低いコピー）での維持を指令する。このクラスの複製起点は、ファージP1起点、ならびに、大腸菌染色体起点oriCに基づくプラスミド等のイテロン（iteron）クラスの起点を含む。適した複製起点については、Helinski, D.R, Toukdarian, A.E., Novick, R.P. “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” 第２版Frederick C. Niedhardt編、ASM press, Washington, 1996, ISBN 1-55581-084-5の第122章、pp2295-2324を参照されたい。この場合、SSRTを含まないベクターを構築してもよく、逆選択遺伝子は、相同性アームの間に含まれる。このような逆選択マーカー遺伝子は、当業者には公知であり、例えば、sacB、ccdB、もしくはテトラサイクリン耐性遺伝子を用いることができる（また、適した逆選択遺伝子および方法の一覧については、Reyratら、1988、Infect. Immun. 66:4011-7も参照されたい）。意図する相同的組換え反応は、逆選択遺伝子を欠失することにより、意図する組換え産物を保有する細胞が逆選択圧の下で生存すると同時に、非組換えベクターを保有する細胞は死滅するようにする。
5.2 相同的組換えによるクローニングおよびサブクローニングのための組成物
様々な実施形態における相同的組換えによるクローニングのための組成物をここに記載する。以下の第５．２節に記載するクローニング方法の各々については、次の３つの成分が、単一細胞に共存する必要がある：第１に、標的配列に対して配列相同性を有するDNAの２つの短い領域（本明細書では「相同性アーム」と呼ぶ）を保有するベクター；第２に、RecE/Tおよび／またはRedα/βタンパク質対、もしくはその他の細菌性リコンビナーゼ；第３に、標的DNA配列。細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同性アームに存在するこれら相同配列と、標的遺伝子の隣接した領域との間の組換えによって、標的DNAが２つの相同性アームの間に挿入もしくは「捕捉」される。これら組成物と、それらの構築方法については本明細書で詳しく説明する。
5.2.1 相同性クローニングベクター
相同性クローニングベクターは、複製起点と、選択マーカーと、目的とする標的DNAを捕捉するように設計されたDNAの２つの短い領域とを含む線状または環状DNAベクターでありうる。使用するアプローチもしくは方法に応じて、数種の形態のクローニングベクターが考えられる。好ましい形態およびそれらの構築方法は、図１〜５に示してあり、本明細書で詳しく説明する。
5.2.1.1 複製起点
ベクターは複製起点を必要とするが、これはプラスミドの複製および増殖のために必要である。大腸菌でのクローニングおよび増殖のためには、あらゆる大腸菌複製起点を用いることができ、その例は当業者には公知である（Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献を参照のこと）。容易に入手可能なプラスミド複製起点の非制限的例は、ColE1由来の複製起点（Bolivarら、1977, Gene 2:95-113；Sambrookら、1989、前掲）、pACYC184等のプラスミドに存在するp15A起点（ChangおよびCohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56；Miller、1992, p.10.4-10.11も参照）、ならびに、低コピープラスミド発現のために利用可能なpSC101起点であり、これらはすべて、当業者にはよく知られている。
例えば、一実施形態では、ColE1由来の複製起点を含むプラスミド等の高コピープラスミドからの複製起点を用いるが、その例は、当業者には公知である（Sambrookら、1989、前掲を参照；また、Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献も参照のこと）。一例は、pUC19およびその誘導体からの起点である（Yanisch-Perronら、1985, Gene 33:103-119）。pUCベクターは、1細胞当たり300〜500コピーのレベルで存在し、外来遺伝子の挿入には好都合のクローニング部位を有する。非常に高度の発現のためには、λgt11（Huynhら、1984、“DNA Cloning Techniques:, Vol I: A Practical Approach”, D. Glover編、 pp 49-78, IRL Press, Oxford）等のλベクター、あるいは、T7およびSp6ポリメラーゼ発現系（Studierら、1990, Methods Enzymol. 185:60-89）を含む細胞内のT7またはSP6ファージプロモーターを用いることができる。
これより低レベルの発現を所望する場合には、中または低コピープラスミドからの複製起点を用いることができる。中コピープラスミドは当業者には公知であり、例えば、ColE1由来の複製起点と、１細胞当たり20〜100コピーを有するpBR322（Bolivarら、1977, Gene 2:95-113；Sambrookら、1989、前掲を参照）、あるいは、pACYC100シリーズのプラスミドの１つであり、p15A複製起点を有し、１細胞当たり10〜12コピーで存在するpACYC184（ChangおよびCohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56；また、Miller、1992, p.10.4-10.11も参照）がある。また、低コピープラスミドも当業者には公知であり、例えば、pSC101起原と、１細胞当たり約５コピーとを有するpSC101がある。pACYCおよびpSC101プラスミドベクターは両者とも、適合性の複製起点と、選択抗生物質マーカーを有するため、好都合なクローニング部位を有し、pBRおよびpUCプラスミドと同じ細胞中に共存することができる。他の適したプラスミド複製起点は、λまたはファージP1レプリコンに基づくプラスミド、例えば、ロリスト（Lorist）シリーズ（Gibsonら、1987、Gene 53:283-286）を含む。
さらに低い発現を所望する場合には、複製起点は、細菌染色体から得ることができる（Miller、1992、前掲；Nieldardt, F.C., ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C.；Yarmolinsky, M.B.およびStemberg, N., 1988, pp.291-438, in Vol.1 of The Bacteriophages, R. Calendar, ed., Plenum Press, New Yorkを参照）。さらに、合成の複製起点を用いてもよい。
5.2.1.2 選択マーカー
プラスミドベクターを細胞内に維持するため、ベクターは、典型的には、選択マーカーを含む。当業者には公知のあらゆる選択マーカーを使用することができる。大腸菌ベクターの構築のため、大腸菌中で有効な抗生物質に対する耐性を送達するあらゆる遺伝子、あるいは、容易に識別可能または選択可能な表現型の変化を送達するあらゆる遺伝子を用いることができる。好ましくは、抗生物質耐性マーカーを用いるが、これらは、例えば、TN903からのカナマイシン耐性遺伝子（FriedrichおよびSoriano, 1991, Gene. Dev. 5:1513-1523）、あるいは、他のアミノグリコシド（限定するものではないが、ジヒドロストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、パロマイシンおよびストレプトマイシンを含む）に対する耐性を賦与する遺伝子、ペニシリン（限定するものではないが、アンピシリン、カルベニシリン、メチシリン、ペニシリンN、ペニシリンOおよびペニシリンVを含む）に対する耐性を賦与するβラクタマーゼ遺伝子等がある。他の選択遺伝子配列として、限定するものではないが、ゼオシン耐性を賦与するポリペプチドをコードする遺伝子配列がある（Hegedusら、1998, Gene 207:241-249）。使用することのできるその他の抗生物質は、クロラムフェニコール等のアンフェニコールに対する耐性を賦与する遺伝子、例えば、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）のコード配列を使用することができる（Eikmannsら、1991, Gene 102:93-98）。当業者には理解されるように、プラスミドの維持を選択するその他の非抗生物質的方法、例えば、多様な栄養要求性マーカーを使用してもよい（Sambrookら、1989、前掲；Ausbelら、前掲）。
5.2.1.3 相同性アーム
ベクターの必要な成分は、二本鎖DNAの２つの短い領域であり、本明細書では「相同性アーム」と呼ばれる。図１に示したように、一実施形態では、２つの相同性アーム（AおよびBと呼ぶ）は、目的とする標的DNA（A’およびB’と呼ぶ）に隣接するDNAの配列と相同であり、一方のアームは、標的DNAから上流のDNA配列と相同で、第２のアームは、標的DNAから上流のDNA配列と相同である。本明細書では、２つの二本鎖DNA分子が、共通の同一性領域（場合によっては、１つ以上の塩基対の差異により中断されていてもよい）を共有しており、相同的組換えのための基質として機能することができれば、両者は「相同」であるという。好ましい実施形態では、相同性アームは、目的とする標的DNAに隣接する二本鎖領域に対して、約22〜100以上の塩基対の連続的同一性を有する。相同性の領域は、相同性アームが依然として相同的組換えのための効率的基質である限り、１つ以上の非同一残基により中断されていてもよい。好ましい実施形態では、組換え効率を最適にするために、相同性アームは、長さが約50ヌクレオチドであり、20〜30（例えば、25）塩基対の連続して、中断されていない配列同一性を有する。連続的同一性はさらに短い領域でも可能であるが（例えば、少なくとも６、８もしくは10塩基対）、このような短い領域の連続的同一性を用いた場合、組換え効率の低下が予想される。例えば、一実施形態では、連続的同一性の長さは、６bpまで短くてもよい（KeimおよびLark, 1990, J, Structural Biology 104:97-106）。相同性アームの長さ、あるいは、隣接する標的DNA配列に対する連続的同一性の長さに上限はない。
標的DNAに隣接するヌクレオチド配列は、本明細書では、標的DNAの「末端」と呼ばれる。従って、標的DNAは、２つの末端、すなわち、第１末端と第２末端を有することになる。所望の挿入断片に対する２つのアームの配向は、標的DNAに対する相同配列の配向と同じにし（図１を参照）、これによって、相同性アームと、標的DNAの第１および第２末端との間の組換えにより、２つの相同性アーム間に標的DNAが挿入されるようにしなければならない。
２つの相同性アームの配列は、実験的設計に応じて選択する。相同性アームの選択に対する制限は、それが標的DNA内に１回より多く見出される配列であってはならないことと、相同的組換え反応の間、宿主細胞の他所で存在してはならないことだけである。この場合、目的とする相同的組換え産物はまだ得られるものの、代替の相同的組換え現象のバックグラウンドにおいてである。一実施形態では、相同性アームの配列は、BAC、PAC、YAC（酵母人工染色体）、λEMBLまたはλGTシリーズ、ファージミド、コスミド、pBR322、pGEM、pGEX、pGEX、pET等のファージクローニングベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクター等の通常用いられるクローニングベヒクルのポリリンカーに隣接する２つの配列である。従って、単一のベクターを用いて、これらベクター中にクローニングされたあらゆる挿入断片をサブクローニングすることができる。このような相同性アームを含むベクターは、BAC、PAC、YAC、コスミドまたはλライブラリー等のDNAライブラリーからの陽性クローンに由来する挿入断片をサブクローニングするのに特に有用である。
以下に説明するように、様々な実施形態において、相同性アームは、線状DNA分子の末端に位置するか、あるいは、線状DNA分子または環状DNAプラスミドベクターの内部に位置する。
相同性アームは、標的ヌクレオチド配列におけるそれらの方向に対して同じ方向で配向される。言い換えれば、相同性アームは、組換えが起こった後、所望のDNA配列が該アーム間に挿入されるように配向される。相同性アームが、線状DNAの末端に位置する場合には、挿入されたDNA配列は、捕捉され、両アームの間に挿入され、これによって、環状の複製可能なプラスミドを生成する。
5.2.1.4 アダプターオリゴヌクレオチド相同性アーム
別の実施形態では、相同性アームのヌクレオチド配列は、アダプターオリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド配列と相同的である。２つのアダプターオリゴヌクレオチドの各々は、相同性アームの一方に存在するヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列と、標的DNAの２つの末端の一方と相同的な第２相同性領域とを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、図１に示す。ベクターの相同性アームはAおよびBと呼び、これら配列と相同的なアダプターオリゴヌクレオチドの領域は、A’およびB’と呼ぶ。標的DNAの２つの末端は、CおよびDと呼び、アダプターオリゴヌクレオチドに存在する、対応する相同的配列は、C’およびD’と呼ぶ。この実施形態では、ベクター相同性アームと、アダプターオリゴヌクレオチドの相同性領域と、標的遺伝子の隣接末端との間で、RecE/TまたはRedα/βにより媒介される組換えの結果、標的DNAが、ベクターの相同性アーム間に挿入もしくは「捕捉」される。
5.2.1.5 ベクターの構築
上記の線状断片または環状ベクターは、当業者には公知の標準的方法を用いて構築することができる（Sambrookら、1989、前掲；Ausubelら、前掲参照）。例えば、合成または組換えDNA技術を用いてもよい。一実施形態では、線状断片がPCR増幅により作製される。この方法では、オリゴヌクレオチドが、それらの5’末端で相同性アーム配列を、また3’末端でPCRプライマー配列を有するように、合成する。次に、これらオリゴヌクレオチドを、PCR増幅反応で、プライマーとして用いることにより、複製起点と選択遺伝子マーカーを含むDNA領域を増幅する。別の実施形態では、標準的組換えDNA技術により、プラスミドが、複製起点および選択遺伝子マーカーに隣接する、２つの適切に配向された相同性アームを含むように構築することができる（例えば、Methods in Enzymology, 1987, Volume 154, Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照）。次に、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化により、このプラスミドを線状化する。
別の実施形態では、例えば、次の方法を用いて、前記の第５．１．３節で使用するベクターDNAを構築することができる。２つのオリゴヌクレオチドを合成するが、その１つは、5’から3’末端まで、該ベクターに固有の制限部位と、左相同性アームと、PCRプライマーとを含む。他方のオリゴヌクレオチドは、5’から3’末端まで、該ベクターに固有の同じ制限部位と、SSRTと、右相同性アームと、PCRプライマーとを含む。これら２つの相同性アームは、標的DNAに隣接するように選択する。SSRTは、Cre、Flp、KwまたはRリコンビナーゼ等の部位特異的リコンビナーゼ（SSR）のいずれかにより認識される部位である。オリゴヌクレオチドの合成は、２つのSSRTが、ベクターにおいて、定方向反復配列として配向されるように、設計しなければならない。２つのPCRプライマーを用いて、プラスミド起点と、選択遺伝子と、該起点および選択遺伝子間の同一SSRTとを含むDNA鋳型を増幅する。次に、PCR反応の産物を、オリゴヌクレオチドの5’末端に含まれる部位を認識する制限酵素で切断することにより、連結反応による効率的な環状化を可能にする。こうして得られた環状産物を増幅用の大腸菌中に形質転換することによって、多量のベクターを生産する。
別の実施形態では、選択マーカーと、起点と、２つのクローニング部位とを有するプラスミドを用いて、オリゴヌクレオチド相同性アームを各クローニング部位にクローニングすることにより、線状断片を構築する。次に、制限酵素を用いて、プラスミドDNAを切断し、相同性アームにより結合された線状断片を生成する。この方法は、より複雑なプラスミド、例えば、真核発現エレメントを含ませるために真核エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含むプラスミドの構築に好ましい。また、これ以外の配列をベクターにサブクローニングしてもよい。
該ベクターはまた、挿入された標的DNAのタンパク質発現、操作または維持のために、関心のある追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ベクター内の適した位置に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シャイン・ダルガルノ配列のような翻訳配列、転写因子認識部位、コザック共通配列、ならびに、終結シグナルを含むことができる。細菌細胞以外の細胞、例えば、植物、昆虫、酵母または哺乳動物細胞での組換えクローニングのためには、種特異的複製起点、転写、処理および翻訳シグナル等を含むその他の配列エレメントが必要となる場合もある。このようなエレメントは、限定するものではないが、真核複製起点、エンハンサー、転写因子認識部位、CATボックス、またはプリブナウボックスを含むことができる。
RecE/Tおよび／もしくはRedα/βまたはその他の細菌性リコンビナーゼが、細胞中で、発現プラスミドから組換えにより生成される実施形態においては、選択されるベクターは、以下の第５．２．３節に記載した細菌性リコンビナーゼ発現プラスミドと適合性でなければならない。当業者であれば、１細胞に多数のプラスミドを発現させるのに必要な適合性要件について容易に理解されるであろう。原核細胞における２つ以上の構築物の増殖方法は、当業者には公知である。例えば、多数のレプリコンを含む細胞を通常の手順で選択した後、適切に適合性の複製起点と、独立した選択系とを含むベクターを用いて、これらを維持する（Millerら、1992、前掲；Sambrookら、1989、前掲参照）。
5.2.2 細菌性リコンビナーゼ
本明細書中に記載する発明を、主に、RecE/Tおよび／またはRedα/βの使用に関して説明する。しかし、当業者には明らかなように、本発明は、基質として１対の相同的二本鎖DNA分子を用いて相同的組換えを媒介する能力があるその他の細菌性リコンビナーゼの使用にも、同様に適用可能である。本明細書では、細菌性リコンビナーゼとは、ファージまたは細菌のいずれに由来するかに拘わらず、細菌において内在的に発現されて、相同的組換えを媒介することができる、リコンビナーゼを意味する。様々な実施形態において、細菌性リコンビナーゼは、RecE/Tおよび／またはRedα/βリコンビナーゼである。別の具体的実施形態では、相同的組換えを開始するための機能的に同等の系は、ファージP22からのerfタンパク質を含む。さらに、細菌性リコンビナーゼの個々のタンパク質成分に代わり、本発明で使用するその他の機能的成分を用いてもよい。
本明細書で用いる「RecE」および「RecT」は、まず、大腸菌（例えば、大腸菌K12）のRecEまたはRecTを意味する。大腸菌RecEおよびRecTのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、よく知られている（RecE、GenBank受託番号M24905およびSWISS-PROT受託番号P15033；RecT、GenBank受託番号L23927およびSWISS-PROT受託番号P33228）。また、「Redα」および「Redβ」は、ファージλコード化タンパク質を意味する。Redαは、RecEの5’〜3’エキソヌクレアーゼに類似した5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、Redβは、RecTに類似したDNAアニーリング活性を有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、これら両方のラムダタンパク質についてよく知られている（GenBank受託番号J02459；M17233を参照）。
当業者には明らかなように、本明細書中でRecE/Tおよび／またはRedα/βと言及するとき、特に明瞭に、または文脈によって、指示されない限り、RecE/TおよびRedα/βの組合わせも含むものとする。特定の実施形態では、２つの酵素複合体の組合わせは、組換えの効率に共働作用をもたらす。
使用することのできる細菌性リコンビナーゼはまた、該リコンビナーゼの成分の対立遺伝子変異体も含む。例えば、本発明のRecE/TおよびRedα/β組換え系において使用するアミノ酸配列は、RecE、RecT、Redα、またはRedβのいずれかの対立遺伝子変異体が、機能的変異体であって、少なくとも、これら変異体が相同的組換え活性を示す限り、これら変異体によってコード化されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。対立遺伝子変異体は、標準的組換えDNA技術（例えば、Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York；およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）、または、タンパク質進化手法（Jermutusら、1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9：534-548）を用いて、通常の手順で同定および取得することができる。
一般に、このような対立遺伝子変異体をコード化する核酸は、中程度にストリンジェントな条件（例えば、標準的サザンブロッティングハイブリダイゼーション条件を用いて、最終的洗浄を0.2 x SSC/0.1% SDSで、42℃にて行う；Ausubelら、編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, p. 2.10.3）、もしくは、高度にストリンジェントな条件（例えば、標準的サザンブロッティングハイブリダイゼーション条件を用いて、最終的洗浄を0.1 x SSC/0.1% SDSで、68℃にて行う；Ausubelら、前掲）下で、RecE、RecT、Redα、またはRedβのコード配列の相補体にハイブリダイズすることが可能なものでなければならない。
また、本発明で用いられるRecE、RecT、RedαおよびRedβは、腸内菌（Enterobacteriaceae）科の原核細胞を宿主とするファージ、あるいは、これらの細胞に由来するRecE、RecT、RedαおよびRedβも含む。腸内菌科のメンバーは、限定するものではないが、各種のエシェリキア属、サルモネラ属、シトロバクター属、クレブシエラ属、ならびに、プロテオス属を含む。このようなRecE、RecT、Redα、またはRedβ相同体は、一般に、ファージゲノムに存在する遺伝子によってコード化され、その産物は、λファージの生活環におけるRedαおよびRedβのようなファージ生活環での組換え媒介段階に参加する。
RecE/T相同体は、標準的な原核遺伝子技術および組換えDNA技術（例えば、Sambrookら、前掲およびSusubelら、前掲参照）を用いて、通常の手順で同定および取得することができる。組換えDNAは、クローン化ゲノムまたはcDNAライブラリーから取得するか、もしくは、PCR増幅により得られる。例えば、ゲノムライブラリーは、標準的分子生物学的方法により作製するか、あるいは、市販されている、または市販されていない供給源から取得することができる。ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーは、標識大腸菌recEまたはrecTプローブとの核酸ハイブリダイゼーション（GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961）によりスクリーニングし、陽性クローンを単離して、配列決定することができる。
特定の実施形態では、RecEまたはRecT相同体は、ネズミチフス菌において、通常の手順で同定することができる。recEおよびrecT遺伝子は、大腸菌K-12において、よく特性付けされており；RecE（GenBank受託番号M24905およびSWISS-PROT受託番号P15033）およびRecT (GenBank受託番号L23927およびSWISS-PROT受託番号P33228)両者のヌクレオチド配列およびタンパク質配列が知られている；（Bachmann, 1990, Microbiol. Rev. 54:130-197；Rudd, 192, in Miller, 1992, 前掲、pp.2.3-2.43も参照されたい）。完全なネズミチフス菌ゲノムコスミドまたはλライブラリーを用いてもよい。次に、前述したようなハイブリダイゼーション条件を用いて、大腸菌RecTまたはRecTプローブとのハイブリダイゼーションにより、上記ネズミチフス菌ライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、２つの遺伝子は高度に相同的であると予想されることから、標準的な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。
一実施形態では、このような条件は以下を含むことができる：6X SSC, 5Xデンハーツ溶液と、0.5％SDSと、100μg/mlの変性サケ精子DNAとを含む溶液において、DNA含有フィルターを55℃で6時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液中で実施し、5〜20 X 106 cpm 32P-標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で18〜20時間55℃でインキュベートした後、1X SSCおよび0.1％SDSを含む溶液において、30分60℃で２回洗浄する。次に、フィルターの水分を吸い取り乾燥させて、X線フィルムに暴露してオートラジオグラフィーを実施する。用いることのできる中程度ストリンジェンシーの他の条件は当業者には公知である。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.1％SDSを含む溶液において、１時間37℃で実施する。後のネズミチフス菌を含むクローンの単離、精製および特性決定は、当業者には公知の手順（Ausubelら、前掲参照）により実施することができる。このような配列を用いて、本発明のネズミチフス菌Rec/Tを構築することができる。
あるいは、ネズミチフス菌遺伝子をネズミチフス菌mRNAから単離することができる。mRNAは、RecEまたはRecTタンパク質を発現する細胞から単離することができる。cDNAライブラリーは、mRNAの逆転写により作製し、ゲノムライブラリーをスクリーニングする前記の方法（Ausubelら、前掲参照）等、当業者には公知の方法によりスクリーニングすることができる。これ以外にも、RACE（cDNA 末端の高速増幅：Rapid Amplification of cDNA Ends；Ausubelら、前掲）等のPCR技術により、recEまたはrecT cDNAを同定することができる。その際、大腸菌recEまたはrecT配列から設計した２つのプライマー： 大腸菌recEまたはrecT mRNAの5’末端と同じ配列を有する「前進(forward）」プライマーと、その3’末端に相補的な「逆進(reverse)」プライマーとを用いる。PCR産物は、配列決定により確認し、サブクローン化した後、本発明のRecE/Tを構築するのに用いることができる。また、このようなcDNA配列を用いることにより、当業者には公知の方法（Sambrookら、1989、前掲；Ausubelら、前掲参照）を用いて、ネズミチフス菌recEまたはrecT配列を単離することも可能である。
本発明のRecE/T組換え酵素をコード化する核酸分子は、さらに、当業者には公知の組換えおよび合成手段（Sambrookら、1989、前掲；Ausubelら、前掲）に従い、合成および／または構築することができる。
以下に述べるように、発現が調節可能（例えば、誘導可能）であり、広い範囲の発現レベルが達成できるように、配列の発現を制御する能力が、本発明の方法の実施に有利である。
核酸分子は、例えば、染色体外（例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージ上）で維持することができる。あるいは、例えば、ファージ形質導入または転位を用いて、核酸分子を染色体（例えば、大腸菌染色体）に組み込むことも可能である。従って、RecE/Tコード配列は、各細胞内に、高コピー、低コピーもしくは単コピーで存在するように標準的技法により作製することができる。また、多様な調節配列を用いて、組換えタンパク質の発現を推進することも可能である。発現／株構築のこれら態様の各々は、広い範囲の組換えタンパク質発現レベルを示す細胞を生産するように操作することができる。組換えタンパク質コード配列の単コピー染色体は、その構成が、株の構築を容易にすることから、さらに有利である。
5.2.2.1 タンパク質発現
細菌性リコンビナーゼは、細菌、酵母、昆虫、もしくは哺乳動物細胞において、構成的または誘導的のいずれでも発現させることができる。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、細菌、最も好ましくは、大腸菌株において発現させる。例えば、宿主細胞は、宿主細胞染色体に位置するrecEおよびrecT遺伝子を含む。RecE/Tの発現が内在性である大腸菌株の例は公知であり、例えば、大腸菌sbcA株（Zhangら、1998、前掲）がある。あるいは、RecE/Tは、好ましくは、プラスミドベクター、例えば、pBADETγ（Zhangら、1998、前掲）またはpGETrec（Narayananら、1999, Gene Ther. 6:442-447）上で、非染色体DNAから組換えにより発現させることができる。同様に、Redα/βは、λプロファージを組み込んだ株に内在性であるか、あるいは、プラスミド、例えば、pBADαβγ（Muyrersら、1999、前掲）から発現させることができる。RecE/Tおよび／またはRedα/β発現構築物は、標準的組換えDNA技術に従って構築することができる（例えば、Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York；ならびに、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと、尚、これら文献は各々、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする）。
一実施形態では、RecE/Tおよび／またはRedα/βは、ColE1由来の複製起点を含むプラスミドのような高コピープラスミドから大腸菌中で発現させる。このようなプラスミドの例は当業者には公知であり（Sambrookら、1989、前掲を参照；また、Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献も参照）、例えば、pUC19およびその誘導体（Yanisch-Perronら、1985, Gene 33:103-119）がある。
様々な発現レベルで、発現（調節的または構成的発現のいずれか）を可能にする調節制御に関して、多様な調節配列が当業者にはよく知られている。広い範囲で発現させることができるということは、以下に説明するように、本発明の方法の使用には有利である。このような発現は、構成的、ならびに、調節的、あるいは、誘導的方式のいずれでも達成することができる。
広い範囲の発現をもたらす誘導性発現は、多様な誘導性調節配列を用いることによって得ることができる。一実施形態では、例えば、lacI遺伝子とその無償性誘導物質IPTGを用いることにより、このようなポリペプチドをコード化する配列を、lacOP調節配列を介して転写すると、誘導性で、高レベルのRecE/Tの発現を得ることができる。
RecEおよびRecTを異なるプロモーターから発現させることができる。あるいは、recEおよびrecT遺伝子を、単一プロモーターから、ポリシストロン性mRNAに発現させることもできる。このような異種プロモーターは、誘導性でも、構成性でもよい。好ましくは、発現は、誘導性プロモーターによって制御される。広い範囲の発現をもたらす誘導性発現は、様々な誘導性調節配列を用いることにより得ることができる。一実施形態では、例えば、lacI遺伝子とその無償性誘導物質IPTGを用いることにより、このようなポリペプチドをコード化する配列を、lacOP調節配列を介して転写すると、誘導性で、高レベルのRecE/Tの発現を得ることができる。使用することのできる他の様々な誘導性プロモーター系が、当業者には公知である。RecE/TまたはRedα/β構築物からの発現レベルは、強度の異なるプロモーターを用いることにより、変えることができる。
使用することのできる他の調節性発現系は、限定するものではないが、例えば、アラビノーズ（AraC）により誘導可能なaraCプロモーター、TET系（GeissendorferおよびHillen, 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663）、ファージλ温度のPLプロモーターおよび誘導性λリプレッサーCI857（Pirrotta, 1975, Nature 254:114-117；Petrenkoら、1989, Gene 78:85-91）、trpプロモーターおよびtrpリプレッサー系（Bennettら、1976, Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:2351-55；Wameら、1986, Gene 46:103-112）、lacUV5プロモーター（GilbertおよびMaxam, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:1559-63）、lpp（Nokamuraら、1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:289-299）、T7遺伝子−10プロモーター、phoA（アルカリホスファターゼ）、recA（Horiiら、1980）、ならびに、tacプロモーター、トリプトファンにより誘導可能なtrp-lac融合プロモーター（Amannら、1983, Gene 25:167-78）を含み、これらはすべて、一般的に用いられる強力なプロモーターであり、レベルが各プロモーターにより制御される１タンパク質について、全細胞タンパク質の約１〜10％の蓄積レベルをもたらす。より強力なプロモーターを所望する場合には、tacプロモーターはlacUV5の約10倍強力であるが、高いベースラインレベルの発現をもたらすため、過剰発現が必要な場合に限り使用すべきである。より弱いプロモーターが必要な場合には、他の細菌プロモーターが当業者にはよく知られており、例えば、マルトース、ガラクトース、あるいは、その他の望ましいプロモーター（このようなプロモーターの配列は、Genbankから入手可能である（Burksら、1991, Nucl. Acids Res. 19:2227-2230）。
本明細書に記載した方法に有用な細胞は、RecE/Tおよび／またはRedα/βリコンビナーゼを含むあらゆる細胞である。好ましくは、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞は、腸内細菌細胞である。腸内菌科のメンバーは、限定するものではないが、各種のエシェリキア属、サルモネラ属、シトロバクター属、クレブシエラ属およびプロテウス属を含む。最も好ましい宿主細胞は、大腸菌細胞である。細胞はまた、適したリコンビナーゼを発現するように作製できるものであれば、あらゆる生物に由来するものでよく、限定するものではないが、酵母、ハエ、マウス、またはヒト細胞を含む。リコンビナーゼは、好ましくは、大腸菌に由来するRecE/Tリコンビナーゼ、もしくはファージλに由来するRedα/βリコンビナーゼ、あるいは、腸内菌もしくは腸内菌ファージに由来する機能的に同等のRecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼ系であり、このような系が、配列相同性の領域間の組換えを媒介する。
RecE/Tおよび／またはRedα/βタンパク質を発現する細胞は、事前にエレクトロコンピテント（electrocompetent）にしておき、−70℃で保存することができる。
これ以外にも、本発明の方法は、RecE/Tおよび／またはRedα/βの発現が可能なその他のあらゆる細胞型で実施することができる。例えば、多様な宿主−ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらは、限定するものではないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母等の微生物、あるいは、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌を含む。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が変動する。使用する宿主−ベクター系に応じて、多数の適した転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか１つを用いることができる。特定の実施形態では、RecE/Tおよび／またはRedα/β遺伝子、あるいは、RecE/Tおよび／またはRedα/βの機能的に活性の部分をコードする配列を発現させる。さらに別の実施形態では、RecE/Tおよび／またはRedα/βタンパク質のドメインを含むRecE/TまたはRedα/βの断片を発現させる。
ベクターにDNA断片を挿入するために、既に記載されている方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと、タンパク質コード配列とから成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitro組換えDNAおよび合成方法、ならびに、in vivo組換え体（遺伝子組換え）を含む。RecE/TもしくはRedα/βタンパク質またはペプチド断片をコード化する核酸配列の発現は、第２の核酸配列によって調節することにより、組換えDNA分子で形質転換した宿主中で、RecE/TもしくはRedα/βタンパク質またはペプチドを発現させることができる。例えば、RecE/TまたはRedα/βタンパク質の発現は、当業者には公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御することができる。RecE/TまたはRedα/β発現を制御するのに用いることのできるプロモーターは、限定するものではないが、以下を含む：SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子（Brinsterら、1982, Nature 296:39-42）；ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含む植物性発現ベクター（Herrera-Estrellaら、1984, Nature 303:209-213）またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら、1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）、ならびに、光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら、1984, Nature 310:115-120）；Gal 4プロモーター等の酵母または他の菌類からのプロモーターエレメント、ADC（アルコールデヒドロギナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロイルキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に使用されてきた以下の動物性転写制御領域を含む：膵臓腺房細胞で活性のエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら、1984, Cell 38:639-646；Ornitzら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞で活性のインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ性細胞で活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658；Adamesら、1985, Nature 318:533-538；Alexanderら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、胸部、リンパ性および肥満細胞で活性のマウス乳癌ウイルス制御領域（Lederら、1986, Cell 45:485-495）、肝臓で活性のアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓で活性のαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammerら、1987, Science 235:53-58）；肝臓で活性のα1−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄細胞で活性のβグロビン遺伝子制御領域（Mogramら、1985, Nature 315:338-340；Kolliasら、1986, Cell 46:89-94）；脳の希突起神経膠細胞で活性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら、1987, Cell 48:703-712）；骨格筋で活性のミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）、および視床下部で活性の性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、1986, Science 234:1372-1378）。
特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼ（例えば、RecEまたはRecT）コード化核酸に機能的に連結されたプロモーターと、１つ以上の複製起点と、場合によっては、１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを用いる。
選択したベクターは、前記第５．２．１節に記載したベクタープラスミドと適合性でなければならない。当業者であれば、１細胞に多数のプラスミドを維持するのに必要な適合性要件について容易に理解されるであろう。原核細胞において２つ以上の構築物を増殖させる方法は、当業者には公知である。例えば、多数のレプリコンを含む細胞は、適切に適合性の複製起点と、独立した選択系とを含むベクター（Millerら、1992, 前掲、Sambrookら、1989、前掲参照）を用いて、通常の手順で選択および維持することができる。
5.2.3 宿主細胞
本発明のクローニング方法、ならびに、クローン化DNAの増殖に用いられる宿主細胞は、recEおよびrecTおよび／またはredαおよびredβ遺伝子産物を発現させるあらゆる細胞、あるいは、これら遺伝子の異種発現が可能なあらゆる細胞でよい。使用できると考えられる細胞型の例は、限定するものではないが、細菌、酵母、植物、げっ歯類、マウス、ヒト、昆虫または哺乳動物の細胞等の原核および真核細胞を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞である。最も好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞である。使用できる具体的大腸菌株の例は、JC 8679およびJC 9604である。JC 8679およびJC 9604の遺伝子型は、Sex（Hfr、F+、F-、またはF’）：F-である。JC8679は、次の突然変異を含む：recBC 21、recC 22、sdcA 23、thr-1、ara-14、leu B 6、DE(gpt-proA)62、lacY1、tsx-33、gluV44(AS)、galK2(Oc)、LAM-his-60、relA 1、rps L31(strR)、xyl A5、mtl-1、argE3(Oc)およびthi-1。JC 9604は、同じ突然変異と、さらに突然変異recA 56を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載したクローニングおよびサブクローニング方法の宿主細胞として、真核細胞を用いることができる。細胞リコンビナーゼ、もしくはそれらの機能的同等物を発現する、または、発現するように作製することができるあらゆる細胞を用いることができる。ヒト、マウス、サル、あるいは、その他のあらゆる生物に由来する細胞系を用いることができる。例えば、本発明の方法に有用な細胞系の非制限的例は、CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、ならびに、WI38細胞を含む。
多様な宿主−ベクター系を用いて、RecE/T、Redα/βのタンパク質コード配列、またはそれらの機能的に同等な系を導入し、発現させることができる。このような方法は、当業者には公知である（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York参照）。このような系には、限定するものではないが、下記を含む：ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母等の微生物、あるいは、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換した細菌。タンパク質発現の方法についても、前記第５．２．２節に記載されている。
5.2.4 標的DNA
標的DNAは、実験設計に応じて選択し、長さが、１塩基対という短いものから、100キロベースを超えるものまで、あらゆる二本鎖DNAでよい。特定の実施形態では、標的は、長さ100、125、200、または300kb以下である。別の具体的実施形態では、標的DNAは、例えば、BACベクターに存在するものと同様に、25〜100キロベースである。標的DNAの他の具体的実施形態は、第６節の実施例に記載されている。標的DNAは、限定するものではないが、プラスミド、BACまたは大腸菌染色体等の独立して複製する任意のDNA分子に常在しうる。標的DNAはまた、限定するものではないが、あらゆる原核、古細菌もしくは真核細胞、または、ウイルス、ファージまたは合成起原に由来するDNAを含むあらゆるDNA供給源に常在しうる。例えば、核酸配列は、次の供給源から取得することができる：ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌ、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、無脊椎動物（例えば、C. elegans）、植物等。DNAは、当業者には公知の標準的方法により得ることができる（例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Glover(編), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II）。
5.3 本発明の使用方法
5.3.1 宿主細胞へのDNAの導入
標的DNAを含むDNA調製物を宿主細胞に送達するための、当業者には公知のあらゆる方法が、以上説明してきた本発明の方法での使用に適している。このような方法は、当業者には公知であり、限定するものではないが、細胞の電気穿孔、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムを用いたコンピテント細胞の作製、ウイルス粒子にパッケージされた標的DNAによるDNAの形質導入を含む。真核細胞に対する方法は、限定するものではないが、電気穿孔、DNAのリン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション、ならびに、ウイルスパッケージングを含む。好ましい実施形態では、電気穿孔を用いる。RecE/TまたはRedα/βタンパク質を含む細胞を処理することによって、これらを標準的方法による電気穿孔に対し、コンピテントとする（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing AssociatesおよびWiley Interscience, New York）。好ましくは、約50μlの電気コンピテント細胞の標準調製物を用いて、標準的方法による電気穿孔を実施する。線状または環状ベクターの形質転換を必要とする実験では、好ましくは、0.3μg以上のベクターを用いる。標的DNAを含むDNA調製物の形質転換を必要とする実験では、好ましくは、0.3μg以上を用いる。共形質転換実験については、DNAは、電気穿孔の前に混合するのが好ましい。電気穿孔の後、好ましくは、細胞を培地中に稀釈し、約１時間半の修復時間の間インキュベートした後、選択マーカー遺伝子によりもたらされた表現型変化を確認する条件下で培養した。
ベクターの部位特異的組換えまたはエンドヌクレアーゼ切断を用いた実験では、SSRもしくはエンドヌクレアーゼの発現、または、SSRとエンドヌクレアーゼもしくは２つのSSRとの組合わせを、エレクトロコンピテント細胞の作製前、電気穿孔後の修復時間中、または、選択マーカーを確認する培養中のいずれかに導入する。
最適な形態では、表現型変化は、一抗生物質に耐性であり、対応する抗生物質を含むプレート上で細胞を培養する。この場合、一晩の培養後、出現した抗生物質耐性コロニーは、主として、所望のサブクローニング産物を含むはずである。
別の実施形態では、ファージ粒子にパッケージされたDNAの形質導入によって、DNAを宿主細胞に送達する。P1またはλ形質導入およびパッケージングプロトコルは、当業者には公知である。λパッケージング抽出物は、市販されている（例えば、Promega、ウィスコンシン州マジソン郡）。
5.3.2 オリゴヌクレオチド
本発明の方法と共に用いられるオリゴヌクレオチド相同性アーム、プライマー、ならびに、アダプターオリゴヌクレオチドは、多くの場合、長さが10〜約100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、長さが、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、50ヌクレオチド、もしくは100ヌクレオチド、または、200ヌクレオチド以下である。好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、長さが約90ヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドは、当業者には公知のあらゆる方法（例えば、Applied Biosystems 392/394 DNA合成装置を用いた標準的ホスホロアミダイト化学）を用いて、合成することができる。さらに、合成で用いる試薬は、多数の市場供給業者のいずれから入手してもよい。
本発明の方法と共に用いられるオリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、当業者には公知のあらゆる方法、例えば、自動DNA合成装置（Biosearch、Applied Biosystems等から市販されているもの等）を用いて、合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209）により合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された多孔質ガラスポリマー支持体（Sarinら、1988, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451）等を用いて、作製することができる。
オリゴヌクレオチドは、修飾が相同的組換えを妨害しない限り、少なくとも１つの修飾塩基を含んでよい。例えば、このような修飾は、限定するものではないが、下記を含む：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒロドキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、Ｎ6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、ならびに、2,6-ジアミノプリン。
オリゴヌクレオチドは、修飾が相同的組換えを妨害しない限り、少なくとも１つの修飾リン酸バックボーンを含んでよい。例えば、このような修飾は、限定するものではないが、下記を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ならびに、ホルムアセタールまたはその類似体。
5.3.3 DNA増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、場合により本発明とともに用いて、供給源（例えば、組織サンプル、ゲノムまたはcDNAライブラリー）から所望の配列を増幅する。既知の配列を呈示するオリゴヌクレオチドプライマーは、PCRにおけるプライマーと同様に用いることができる。PCRは、典型的に、サーマルサイクラー（例えば、Perkin-Elmer Cetus）や耐熱性ポリメラーゼ（例えば、商標Gene Amp（登録商標）のTaqポリメラーゼ）を用いて、実施する。増殖しようとする核酸鋳型は、限定するものではないが、あらゆる種に由来するmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを含みうる。PCR増幅方法は、当業者には公知である（例えば、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号および第4,889,818号；Gyllensteinら、1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7652-7656；Ochmanら、1988, Genetics 120, 621-623；Lohら、1989, Science 243, 217-220を参照）。
5.4 診断用途のための方法
本発明の方法を用いて、外来DNAまたは変異体DNAの存在に関連する様々な感染症、症状、疾患、および障害を検出、予知、診断、もしくはモニターする、または、その治療をモニターすることができる。例えば、以下の第５．４．１節に記載するように、この方法を用いて、ウイルス感染、細菌感染、または、原生動物、寄生生物もしくはその他公知の病原体による感染に関連する疾患等の様々な感染症および疾患を検出、予知、診断、またはモニターすることができる。また、以下の第５．４．２節に記載するように、この方法を用いて、遺伝的突然変異または単一ヌクレオチド多型（SNP）等の変異体DNAの存在に関連する様々な感染症、症状、疾患、および障害を検出、予知、診断、またはモニターすることができる。
5.4.1 外来DNAの検出
前述した本発明の方法を用いて、病原体にさらされた患者において、病原体への暴露に由来するウイルスまたは細菌DNA等の外来DNAを検出することができる。患者は、病原体による感染症の症候、または、病原体の存在に関連する疾患または障害の存在を示すこともあれば、示さない場合もある。一実施形態では、例えば、このような疾患または感染症を有する、または有すると予想される患者由来のDNAから、標的DNAサンプルを作製することができる。外来標的DNAに対して配列相同性を有する相同性アームを設計および作製することができる。次に、前記第５．１節に記載した方法のいずれかにより、細菌性リコンビナーゼを発現し、しかも、ベクターDNAを含む大腸菌宿主細胞に、上記サンプルDNAを導入する。別の実施形態では、ベクター配列に相同的な第１配列と、外来標的DNAに相同的な第２配列とを含み、前記第５．１節に詳しく記載したように配向されたアダプターオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、サンプルDNAおよびベクターDNA、RecE/TまたはRedα/βを発現する大腸菌宿主細胞と一緒に、共トランスフェクトするか、既にベクターDNAおよびサンプルDNAを含む細胞に直接トランスフェクトすることができる。次に、前記第５．１節に記載したように、選択培地で細胞を増殖させ、選択に耐えた細胞を、適切な大きさの挿入断片の存在について分析することができる。
標的DNAは、患者または被験者の生体サンプルから単離することができる。このようなサンプルとして、限定するものではないが、全血液、血漿、血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液、生検吸引液から得た細胞、組織培養細胞、培地、または、食品、水もしくはその他の材料等の非生体サンプルがある。このような供給源からDNAを調製する方法は、当業者には公知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.）。
例えば、ウイルス感染症または疾患を検出もしくは診断しようとする一実施形態では、相同性アームは、既知のウイルスDNAのDNA配列と相同的なDNA配列を含みうる。該方法を用いて、ウイルスDNA鎖、または、DNAもしくはRNAウイルスのDNA複製中間体のいずれかとして、ウイルスDNAを検出および単離することができる。
一実施形態では、DNAウイルスのDNAゲノムまたは複製中間体は、例えば、該DNAウイルスのウイルス配列と相同的になるよう設計された相同性アーム配列を用いて、直接ターゲッティングすることができる。このようなDNAウイルスは、限定するものではないが、下記を含む：B型肝炎ウイルス、アデノ関連ウイルスおよびサイトメガロウイルス等のパルボウイルス；パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、および、SV40等のパポバウイルス；アデノウイルス、I型単純ヘルペス（HSV-I）、II型単純ヘルペス（HSV-II）およびエプスタイン−バールウイルス等のヘルペスウイルス；ならびに、痘瘡（天然痘）およびワクシニアウイルス等のポックスウイルス。別の実施形態では、DNA中間体を介して複製するレトロウイルスRNAウイルスの複製中間体を直接ターゲッティングすることができる。その際、このようなRNAウイルスのウイルス配列に相同的となるように設計された相同性アーム配列を用いる。これらRNAウイルスは、限定するものではないが、下記を含む：I型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)、II型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-II)、I型ヒトT細胞向性ウイルス（HTLV-I）、および、II型ヒトT細胞向性ウイルス（HTLV-II）。別の実施形態では、RNA中間体を介して複製するRNAウイルスのゲノム中間体または複製中間体を検出および単離するために、RNAを単離し、当業者には公知の方法に従い、逆トランスクリプターゼを用いて、RNAのcDNAコピーに転写することができる。このようなcDNAコピーを標的DNAとして用いることにより、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイ（Sendai）ウイルス、ポリオウイルスのようなピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、風疹ウイルス（ドイツ麻疹）およびセムリキ森林熱ウイルスのようなトガウイルス、アルボウイルス、ならびに、A型肝炎ウイルス等のRNAウイルスの存在を検出することができる。
細菌感染症を診断または検出しようとする別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知細菌のDNA配列と相同的なDNA配列を含むことができる。例えば、一実施形態では、この相同性アームDNA配列は、病原細菌のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる。このような病原細菌は、限定するものではないが、下記を含む：化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウエルシュ菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻症菌、鼻硬腫菌、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、カンピロバクター（ビブリオ）フィタス（Campylobacter Vibrio fetus）、Campylobacter jejuni、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、セレウス菌（Baccilus cereus）、エドワージシエラ（Edwardsiella tarda）、エルシニアエンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソネ赤痢菌、ネズミチフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、ピンタトレポネーマ、ヴァンサンスピロヘータ（Borrelia vincentii）、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、黄疸出血性レプトスピラ(Leptospira icterohemorrhagiae)、ヒト結核菌、トキソプラズマ（T. gondii）、ニューモシスティス、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラズマ種、発疹チフスリケッチア、ツツガム病シリケッチア、クラミジア種、ならびに、ヘリコバクター・ピロリ。
別の実施形態では、このような相同性アームDNA配列は病原菌のcDNAまたはゲノムDNAと相同的である。これらの病原菌は、限定するものではないが、Coccidioides immitis、煙色コウジ菌（Aspergillus fumigatus）、鷲口瘡カンジダ、Blacstmyces dermatidis、Cryptococcus neoformans、ならびに、Histoplasma capsulatumを含む。
原生動物感染症を診断または検出しようとする別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知原生動物のDNA配列と相同的なDNA配列を含んでいてよい。例えば、このような相同性アームDNA配列は、あらゆる既知原生動物のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる。特に興味深い病原原生動物として、Entomoeba histolytica、口腔トリコモナス、腸トリコモナス、膣トリコモナス、ガンビア・トリパノソーマ、ローデシア・トリパノソーマ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノヴァン・リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジル・リーシュマニア、Pneumocystis pneumonia、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、ならびに、四日熱マラリア原虫等がある。
寄生生物感染症を診断または検出しようとするさらに別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知寄生生物のDNA配列と相同的なDNA配列を含むことができる。例えば、このような相同性アームDNA配列は、下記を含むあらゆる既知寄生生物のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる：ギョウチュウ、ヒトベンチュウ、カイチュウ、センモウチュウ、フン線虫、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫等の蠕虫、ならびに、鉤虫等。
5.4.2 細胞DNAにおける突然変異および多型の診断
また、本発明の方法を用いて、患者のサンプルにおける遺伝的障害を単離および検出することや、遺伝的突然変異または単一ヌクレオチド多型（SNP）のような変異体DNAの存在に関連する様々な症状、疾患および障害を予知、診断またはモニターすること、ならびに、疾患または障害を発現する遺伝的素因を検出することも可能である。
一実施形態では、例えば、このような遺伝的疾患または障害を有する、もしくは有すると予想される患者由来のサンプルから単離したDNAから、標的DNAを作製することができる。好ましい実施形態では、目的とする特定の遺伝子、または、目的とするゲノム領域に相同的な配列を有する相同性アームを含むベクターを設計および作製した後、RecE/Tおよび／またはRedα/β等の細菌性リコンビナーゼを発現する大腸菌宿主細胞に導入する。次に、このサンプルDNAを宿主細胞に導入する。別の実施形態では、ベクター配列と相同的な第１配列と、目的とする標的遺伝子のDNAと相同的な第２配列とを含み、前記の第５．１節に詳述したように配向されたアダプターオリゴヌクレオチドを設計することができる。好ましい実施形態では、このようなアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、サンプルDNAと一緒に、RecE/Tおよび／またはRedα/βを発現し、かつ、ベクターDNAを含む大腸菌宿主細胞を共トランスフェクトすることができる。あるいは、前記の第５．１節に詳しく記載したその他の相同的組換えクローニング方法のいずれを用いてもよい。次に、前記第５．１節に記載したように、細胞を選択培地で増殖させ、選択に耐えた細胞を分析して、適切な大きさの挿入断片の存在について調べることができる。次いで、当業者には公知の制限分析または配列決定技術（例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniques manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照）により、DNAを分析し、目的とする突然変異またはDNA変異の存在を調べることができる。
別の実施形態では、相同性アームまたはアダプターオリゴヌクレオチドは、目的とする遺伝的突然変異またはDNA多型の配列を含みうる。この実施形態では、サンプルDNAが突然変異を含む場合に限り、組換えが起こる。特定の突然変異を含む細胞だけが選択に対して耐性であることから、これは、特定の突然変異またはDNA多型について、多数のサンプルを診断目的でスクリーニングするのに有用でありうる。
標的DNAは、ゲノムDNA、cDNA、またはミトコンドリアDNA等の任意のサンプルから得ることができる。一実施形態では、例えば、標的DNAは、ヒト染色体の領域である。別の実施形態では、標的DNAは、混合集団、例えば、目的とする複数の被験者、例えば、特定の障害に罹患した被験者に由来するゲノムDNAの集団に存在する。このような標的DNAは、全血液、血漿、血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液、生検吸引液から取得した細胞、組織培養細胞、培地等の生物学的サンプル、または、食品、水もしくはその他の材料等の非生物学的サンプルから取得することができる。このような供給源からのDNAの作製方法は、当業者には公知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniques manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照）。
本発明の方法を用いて試験することのできる遺伝的障害の非制限的例は、乳癌に関連するBrca-1のような遺伝病に関連する突然変異およびSNP、嚢胞性線維症に関与する突然変異、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血、血友病、アテローム性動脈硬化病、糖尿病、白血病、前立腺癌およびその他の癌、ならびに、肥満症を含む。このような遺伝病としては、変形性および非変形性神経病、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ウイルソン病、脊髄小脳性運動失調、フリードライヒ運動失調およびその他の運動失調、クロイツフェルト・ヤコブ病を含むプリオン病、歯状核赤核淡瘡球ルイ体萎縮病、海綿状脳障害、筋萎縮性ジストロフィー、うつ病、精神分裂病、ならびに、てんかん等が挙げられる。遺伝病はまた、例えば、低血糖またはフェニルケトン尿症等の代謝疾患も含む。さらには、心臓血管疾患および症状も含まれ、その非制限的例として、アテローム性動脈硬化病、心筋梗塞、ならびに、高血圧が含まれる。本発明は、さらに、ライム病、結核、ならびに、性感染病の検出および診断にも使用することができる。
別の実施形態では、本発明の相同的組換えクローニング方法を用いて、疾患または障害の遺伝的根拠を決定することができる。例えば、遺伝的根拠がわかっていない障害に罹患した患者のサンプルから、標的DNAを単離することができる。一実施形態では、クローニング方法を用いて、このような障害を有することがわかっている、または予想される患者のグループから、疾患または障害に関与することがわかっている、もしくは予想される染色体の領域を単離することができる。次に、回収したDNAを単離した後、制限断片長多型やその他のSNP検出方法等、DNAにおける変異をマッピングするための、当業者には公知の技術を用いて、さらに分析することにより、遺伝的突然変異または多型の存在を調べることができる（例えば、Nikiforovら、1997年10月21日に発行された米国特許第5,679,524号；McIntochら、1998年12月30日付PCT国際公開WO98/59066；Goeletら、1995年５月11日付PCT国際公開WO95/12607；Wangら、1998, Science 280:1077-1082；Tyagiら、1998、Nature Biotechnol. 16:49-53；Chenら、1998、Genome Res. 8:549-556；Pastinenら、1996、Clin. Chem. 42:1391-1397；Chenら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10756-10761；Shuberら、1997、Hum. Mol. Gen. 6:337-347；Liuら、1997、Genome Res. 7:389-398；Livakら、1995, Nature Genet. 9:341-342；DayおよびHumpheries, 1994, Annal. Biochem. 222:389-395を参照）。
臨床的に興味深い標的障害の非制限的例は、喘息、関節炎、乾癬症、湿疹、アレルギー、薬物耐性、薬物中毒；ならびに、限定するものではないが、ヒト肉腫および癌腫などの癌、例えば、線維肉腫、粘液腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫、頚癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーム、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経腫、希突起グリオーム、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫等の癌；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）、ならびに、真性赤血球増加、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびH鎖病を含む。さらに、相同的組換えクローニング方法は、限定するものではないが、下記を含む自己免疫疾患を有する患者の遺伝的相違の診断および検出ならびに患者の診断をするのに有用である：インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮病、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合性結合組織疾患、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸症、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、ならびに、デンスデポジット病。
また、相同的組換えクローニング方法を用いて、疾患と関係のないDNA突然変異、改変、変異およびSNPを単離、診断、および、検出することもできる。その非制限的例として、非コードゲノム配列に存在するこのようなDNA突然変異、改変、変異およびSNP、または、様々なヒト血液型に関連するDNA突然変異、改変、変異およびSNPが含まれる。
本発明の好ましい態様では、本発明の方法は、ヒトDNA突然変異、改変、変異およびSNPの単離、検出、診断、予知、またはモニタリングに特に有用でありうる。しかし、本明細書に記載する方法は、他の動物、例えば、蓄牛、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタを含む家畜、ネコおよびイヌを含む家庭のペット；ならびに、農業的に重要な植物および園芸植物を含む植物の疾患の単離、検出、診断、予知、またはモニタリングにも有用であることに留意すべきである。
5.5 キット
本発明はさらに、本明細書に記載する相同的組換えクローニングおよびサブクローニング方法の使用を容易にするキットも提供する。一実施形態では、１つ以上の容器に、下記を含んで成るキットが提供される：A）目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第１相同性アーム、複製起点および第２相同性アームの順に、複製起点と、２つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第１ベクターDNA鎖上の第１相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第１末端の配列と相同的であり、しかも、第１ベクターDNA鎖上の第２相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第２末端のヌクレオチド配列と相同的である；B）細菌性リコンビナーゼを含む細胞。この細胞は、内在的に、または、組換えにより、リコンビナーゼを発現することができる。
別の実施形態では、１つ以上の容器において、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットで、下記を含んで成るキットを提供する：a）目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第１相同性アーム、複製起点および第２相同性アームの順に、複製起点と、２つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第１ベクターDNA鎖上の第１相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第１末端の配列と相同的であり、しかも、第１ベクターDNA鎖上の第２相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第２末端のヌクレオチド配列と相同的である；ならびに、b）上記ベクターDNA鎖上の第１相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第１ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第１末端のヌクレオチド配列と相同的な第２ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい第１配列および第２配列の順に有する第１オリゴヌクレオチドDNA鎖を含む第１二本鎖オリゴヌクレオチドと；c）上記ベクターDNA鎖上の第２相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第３ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第２末端のヌクレオチド配列と相同的な第４ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第３ヌクレオチド配列および第４ヌクレオチド配列の順に有する第２オリゴヌクレオチド鎖を含む第２オリゴヌクレオチドと；d）細菌性リコンビナーゼタンパク質、例えば、RecE/Tおよび／またはRedα/βを含む細胞。特定の実施形態では、上記細胞は、大腸菌細胞である。
別の実施形態では、１つ以上の容器を備え、下記を含んで成るキットを提供する：a）目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第１相同性アーム、複製起点および第２相同性アームの順に、複製起点と、２つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第１ベクターDNA鎖上の第１相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第１末端の配列と相同的であり、しかも、第１ベクターDNA鎖上の第２相同性アームのヌクレオチド配列が、第１標的DNA鎖上の第２末端のヌクレオチド配列と相同的である；b）上記ベクターDNA鎖上の第１相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第１ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第１末端のヌクレオチド配列と相同的な第２ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列の順に有する第１オリゴヌクレオチドDNA鎖を含む第１二本鎖オリゴヌクレオチドと；c）上記ベクターDNA鎖上の第２相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第３ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第２末端のヌクレオチド配列と相同的な第４ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第３ヌクレオチド配列および第４ヌクレオチド配列の順に、有する第２オリゴヌクレオチド鎖を含む第２オリゴヌクレオチド。
様々な具体的実施形態では、キットの標的DNAは、細菌、ウイルス、寄生生物、原生動物、または病原DNAである。その他の具体的実施形態では、キットの標的DNAは、障害または疾患に関連することが知られる、もしくは予想される遺伝的突然変異または多型を含んでいてよい。別の具体的実施形態では、オリゴヌクレオチドにおいて、アダプター配列またはベクター相同性アームが、BAC、PAC、λ、プラスミド、またはYACに基づくクローニングベクターを有する。
６．実施例：RecE/TおよびRedα/βクローニングおよびサブクローニング
本節に示す実施例では、本発明の相同的組換え方法を用いた好適なクローニングおよびサブクローニングを示す多数の実験を記載する。サブクローニング方法に対する多様な手法を示す。特に、１つの実施例が、これまで記載されているものより大きい挿入断片の好適なクローニング、すなわち、約150 kb BACベクターからの25 kb DNA断片の位置指定サブクローニングを示すことに留意されたい。
6.1 方法および材料
線状断片の作製
標準的PCR反応条件により、線状DNA断片を増幅することができる。pACYC177から、（Tn903由来の）カナマイシン耐性遺伝子を含む1972 bpのp15A起点を増幅した。起点p15Aにより、このプラスミドまたは組換え体を、ColE1適合性群起点を保有する他のプラスミドと共存させることができる。pACYC184から、p15A起点を含む1934 bpのクロラムフェニコール（Tn9由来）耐性遺伝子を増幅した。
PCR反応で用いたオリゴヌクレオチドは、その3’末端に、pACYCプラスミド上でプライマーとして働く18〜30ヌクレオチド配列と、5’末端に、標的DNA領域のフランクに相同的な50〜60ヌクレオチドの長さの配列とを含んでいた。長いオリゴヌクレオチドについては、用いたPCR反応アニーリング温度は、62℃であった。PCR産物は、QIAGEN PCR精製キット（QIAGEN）を用いて精製し、dH2Oで溶離した。DpnIでPCR産物を消化することにより、鋳型DNAを除去した。消化後、PCR産物をエタノールにより沈殿させ、0.5μg/ulのdH2Oで再懸濁させた。
コンピテント細胞の作製
標準的方法により、電気穿孔コンピテント細胞を作製した。つまり、一晩培養したものを、適当な抗生物質を含むLB培地に100倍稀釈した。大腸菌細胞をOD600＝0.25〜0.4の光学密度まで増殖させ、氷上で15分冷却した。細菌細胞を−5℃にて7,000 rpmで10分遠心分離した。細菌細胞ペレットを氷冷10％グリセロール中に再懸濁させた後、−5℃にて10分間7,000 rpmでの遠心分離によりペレット化した。氷冷10％グリセロール中での3回の洗浄および再遠心分離の後、細胞の量に等しい量の氷冷10％グリセロール中で、細胞ペレットを懸濁させた。コンピテント細胞をエッペンドルフ試験管中の50μlのアリコートに分割し、液体窒素で急速凍結した後、−70℃で保存した。
プラスミドpBAD-ETγまたはpBAD-αβγを用いた実験は、標準的手段により、大腸菌宿主にこれらプラスミドを形質転換した後、0.2％グルコース、50μg/mlアンピシリンを含むLB培地中で飽和まで一晩成長させ、得られた培養物を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地に100倍稀釈し、0.15のOD600まで成長させることから成る。次に、L-アラビノーズを0.1％の最終濃度まで添加した。0.25〜0.4のOD600まで細胞を増殖させた後、氷上で15分冷却した。
電気穿孔 １μlのDNA溶液（約0.5μg以上の共形質転換用DNA、または標的を保有する細胞専用の約0.3μg以上のベクターDNA、あるいは、ベクターを保有する細胞用の標的を含む約0.5μg以上のDNAを含有する）をコンピテント細胞と混合する。細胞−DNA混合物を氷冷キュベットに移した。25μFD、2.3kVに設定したバイオ−ラッド遺伝子パルサー（Bio-Rad Gene Pulser）と、200オームに設定したパルスコントローラー（Pulse Controller）を用いて、電気穿孔を実施した。電気穿孔後、LB培地（１ml）を添加した。細胞を37℃で１〜1.5時間振盪しながらインキュベートした後、ベクター中の選択マーカー遺伝子に対応する抗生物質を含むプレートに塗布した。
6.2 結果
表１は、RecE/TまたはRedα/β発現の様々な供給源を用いて、目的とする様々な標的DNA領域をサブクローニングした６つの実験の概要を示す。「ET発現」と称する第１行は、表示したように、大腸菌宿主JC8679またはJC9604中の内在性RecE/T、あるいは、pBADαβγのプラスミドpBAD-RecE/T由来のRecE/TまたはRedα/βの供給源を示す。第２欄は、使用した大腸菌宿主を示す。第３欄は、標的遺伝子を示す。
第１の実験では、大腸菌染色体に常在するRecE/Tの発現を大腸菌株JC8679中でサブクローニングした。そこでのRecE/Tの発現は、構成的（constitutive）である。これは、図２に概説したストラテジーにより実施した。pACYC177に存在するp15Aの複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子Tn903を複製するために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを設計および合成した：5’-TTCCTCTGTATTAACCGGGGAATACAGTGTAATCGATAATTCAGAGGAATAGCTCGAGTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’（配列番号１）
および5’-CAGCAATGTCATCGAGCTGAGACTTACTGATACCGGGACCCGCGTGGTAATTCTCGAGTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’（配列番号２）
この実験の結果は、表１の第１列にまとめる。
Figure 0005067970
第２の実験では、大腸菌染色体に常在するlacZ遺伝子を大腸菌株JC8679中でサブクローニングした。そこでのRecE/Tの発現は、構成的である。これは、図２に概説したストラテジーにより実施した。pACYC177に存在するp15A複製起点およびTn903カナマイシン耐性遺伝子を増幅するために、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’ （配列番号３）
および5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’（配列番号４）
この実験の結果は、表１の第２列にまとめる。
第３の実験では、大腸菌染色体に常在するlacZ遺伝子を大腸菌株JC9604中でサブクローニングした。そこでのRecE/Tの発現は、構成的である。これは、図２に概説したストラテジーにより実施した。pACYC177に存在するp15A複製起点およびTn903カナマイシン耐性遺伝子を増幅するために、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’ （配列番号５）
および5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’（配列番号６）
この実験の結果は、表１の第３列にまとめる。
第４の実験では、図３に概説したストラテジーにより、高コピーpFastBAC1(Gibco)に常在するゲンタマイシン遺伝子を大腸菌株JC5519中でサブクローニングした。RecE/Tの発現は、プラスミドpBAD-recE/Tを用いて実施した。すなわち、このプラスミドをJC5519に形質転換した後、アラビノーズ誘導して、コンピテント細胞を作製した。pACYC177に存在するp15A複製起点およびTn903カナマイシン耐性遺伝子を増幅するため、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGGATCCTTAATAAGATCATCTTCTGAGATCGTTTTGG-3’ （配列番号７）
および5’-TGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCAGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’（配列番号８）；
PCR産物をBamHI消化pFastBAC1と混合することにより、共形質転換させ、カナマイシンを加えたゲンタマイシン含有プレート上で培養した。
第５の実験では、図２に概説したストラテジーにより、大腸菌染色体に常在するlacZ遺伝子を大腸菌株HB101中でサブクローニングした。Redα/βの発現は、プラスミドpBADαβγにより実施した。すなわち、このプラスミドをJC5519に形質転換した後、アラビノーズ誘導して、コンピテント細胞を作製した。pACYC177に存在するp15A複製起点およびTn903カナマイシン耐性遺伝子を増幅するため、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’ （配列番号９）
および5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’（配列番号10）
この実験の結果は、表１の第５列にまとめる。
第６の実験では、図３に概説したストラテジーを用いて、マウスAF4遺伝子を保有する約150 kb BACクローンの25 kb領域を大腸菌株HS996中でサブクローニングした。Redα/βの発現は、プラスミドpBADαβγにより実施した。すなわち、このプラスミドをJC5519に形質転換した後、アラビノース誘導して、コンピテント細胞を作製した。
pACYC177に存在するp15A複製起点およびTn903カナマイシン耐性遺伝子を増幅するため、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TGTAGCTGAGCCCAGGGGCAAGGCTGCTTTGTACCAGCCTGCTGTCTGCGGGGGCATCACCTGGAATTCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3’ （配列番号11）
および5’-TGGGTGTCAACCTCAGGCTTTCTCACACGCAATACAGGTAGGGACTTGCACCCCTACACACCGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’（配列番号12）；
PCR産物を、精製したBAC DNAと混合することにより、共形質転換させた。この実験の結果は、表１の第６列にまとめる。また、図６には、対照（レーン10）として、出発ベクターのEcoRI消化物を用いて、mAF4 BAC実験から取得した９つの独立したコロニー（レーン１〜９）から単離したEcoRIで消化したDNAを示す臭化エチジウムで染色したアガロースゲルも示されている。
第７の実験では、図７に概説したストラテジーにより、酵母菌株MGD 353-13D由来のアンピシリン耐性遺伝子を含むゲノムDNAの領域をクローニングした。パネルAに示すように、98または102 bp相同性アームが隣接する、p15A複製起点を含むDNA断片を、酵母菌株MGD 353-13D中の組込みアンピシリン耐性遺伝子の98および102 bp隣接領域にターゲッティングした。大腸菌株JC5519を使用し、Redα/βの発現は、プラスミドpBADαβγ-TETにより実施し、アラビノーズ誘導した後、コンピテント細胞を作製した。pBADαβγ-TETは、pBADαβγの誘導体であり、ここで、アンピシリン耐性遺伝子は、テトラサイクリン耐性遺伝子により置換されている。pACYC177に存在するp15A複製起点を増幅するために、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、ベクターを作製した：5’-TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAG-3’（配列番号13）
および5’-TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3’ （配列番号14）
PCR産物を、４μg のNcoIで消化したMGD 353-13D酵母ゲノムDNAと混合することにより、pBADαβγから発現させたRedα/βを含むJC5519中で共形質転換させた後、L-肉汁中の培養物の37℃で90分間の回収時間後にアンピシリン含有プレート上で培養した。アンピシリン耐性に関する選択により、クローンを識別した。18のコロニーをDNA分析に付した。適正であった10コロニーの臭化エチジウム染色ゲルを図７Bに示す。
ここに記載した実施例は、大腸菌染色体に対し、非常に多様な環状標的（高コピープラスミドから、低コピー大型標的（BAC）まで）を用いるRecE/TおよびRedα/β相同性組換えクローニング方法の成功を明らかにするものである。
７．ベクター反復配列およびリン酸化のクローニング効率への効果
この節に示す実施例は、RecE/TおよびRedα/β媒介による相同性組換えを用いたクローニングおよびサブクローニング（「ETクローニング」）の高効率のための条件の最適化について記載する。特に、図８に示すように、ベクターにおける反復配列の排除は、クローニング効率を高めた。これに対し、線状ベクターの末端に5’リン酸基が存在しても、ETクローニングの効率にはほとんど影響を及ぼさなかった。
第一に、クローニング効率に対する反復配列の効果を次の実験で評価した。図８に示すように、クローニングベヒクルとして用いた線状ベクターは、p15A複製起点と、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Cm’）と、大腸菌lacZ遺伝子に対する相同性アームが隣接した、線状ベクターのPCR増幅に必要なヌクレオチド配列（図８にイタリック体で示す）と、上記線状ベクターの両端に存在する様々な長さの末端反復配列（ボールド体で示す）とを含んで成る。pBAD Redα/β（Zhangら、1998, Nat. Genet. 20:123-128）を発現するJC8679（内在的にET能力が高い；Clark, 1974, Genetics, 78, 259-271）またはJC5519（WillettsおよびClark, 1969, J. Bacteriol. 100:231-239）に、線状ベクターを形質転換した。線状ベクターのPCR増幅用の前記オリゴヌクレオチドを用いたETサブクローニング後に、LBプレート（50μg/mlクロラムフェニコールを含む）上で得られた多数のコロニーを図８の表に示す。これらのうち、18個を制限消化により分析した。前述した効率は、得られたコロニーの総数で、適正な組換え体の数を割ることにより決定した。この結果、末端反復配列の存在＞６ヌクレオチドが、ETサブクローニング効率を有意に低下させることがわかった。すべてのバックグラウンドコロニーが、再結合した線状ベクターを含んでいた。
また、リン酸化の効果を検定し、その結果を図８に示す。線状ベクターの末端は、T4 DNAキナーゼおよびγ-ATPを用いて、リン酸化した。図８の最後の行に示すように、ETサブクローニングもしくはベクター組換えに何の効果も認められなかった。
この実施例から、線状ベクターの末端に、あるいは、相同性アームと、ベクターの必須要素、すなわち、複製起点および選択マーカーとの間に、反復配列が存在すると、ETクローニングおよびサブクローニング効率を急激に低下することが明らかにされた。従って、好ましい実施形態では、相同性クローニングベクターの配列は、複製起点および選択マーカーをコード化する配列以外に、５つ以上の塩基が直接反復する配列を含まない。
８．RecE/TおよびREDα/βクローニングおよびサブクローニングの追加実施例
この文節に示す実施例は、RecE/TまたはRedα/β媒介による相同性組換えを用いた好適なクローニングおよびサブクローニング手法を証明する追加実験を記載する。
大腸菌宿主 前述したように、「ETコンピテント宿主」とは、RecE/RecTおよび／またはRedα/Redβを発現する能力があるあらゆる大腸菌細胞を意味する。これは、(i) RecE/TまたはRedα/βを内在的に発現する株、あるいは、(ii) RecE/RecTまたはRedα/Redβが、外から導入したプラスミドから発現される株のいずれかのように、多様な方法で達成することができる。この実施例は、JC9604およびJC8679に基づくプラスミドベースの発現ベクター、ならびに、それらの誘導体（主にYZ2000およびYZ2001）の構築について説明する。その他のETコンピテント宿主の変種および例については、Murphyら、2000, Gene 246:321-330；Yuら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5978-5983；ならびに、DatsenkoおよびWanner, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645を参照。
最初のカテゴリーでは、sbcA突然変異を保有する、従って、RecA-（JC9604；Gillenら、1981, J. Bacteriology 145:521-532）またはRecA+（JC8679；Gillenら、前掲）バックグラウンドで、RecE/RecTを内在的に発現する２つの株を用いた。これらの株を用いる利点は、ET−クローニングコンピテント株を作製するのに、最初にプラスミドを導入する必要がなく、直接使用できる点である。この欠点は、RecEおよびRecTが、全クローニング工程を通して構成的に発現され、これによって、特に、recA+バックグラウンドにおける不要な分子間組換えの危険性が高まることである。第２の欠点は、これらJC株は、クローニングおよび増殖宿主としての用途のためには修飾されていないことである。これらは、完全に活性の制限／修飾系を含むため、これが、これら宿主へのBACのような大型分子の導入の効率を著しく低下させる。
RecE/TまたはRedα/βを、内在する宿主株、またはプラスミド導入により供給する宿主株のいずれを用いるかの選択は、環状標的の種類によって異なる。どのストラテジーを選択するにしても、優れたコンピテント細胞の作製は極めて重要である。宿主株に、内在的ET-クローニング能力が欠如している場合には、この株を、初めにpBAD-αβγまたはpBAD-ETγで形質転換する必要がある。次に、得られた株を0.1％の最終濃度までL-アラビノースで誘導成長させ、電気穿孔用に作製しなればならない。経験的に、細胞の最適採取点は、特に、大きなDNA基質をターゲッティングする場合、0.35前後のOD600で起こる。細胞が、0.5より大きいOD600に達した場合には、使用すべきではない。最適誘導時間は、約1時間である。他に有効なDNA導入方法が見出されていないため、電気穿孔を用いる必要がある。優れた電気コンピテント細胞の作製は、ET-組換え体の取得には不可欠である。電気コンピテント細胞の作製中、全工程を、氷上で、しかも、予冷したバケツおよびローターにおいて、実施しなければならない。電気コンピテント細胞は、OD600＝0.35で収穫される250ml培養物から、高い濃度まで濃縮し、通常の手順で、10アリコート以下の50μlのコンピテント細胞を用意する。こうして得られた形質転換効率は、用いた宿主株によって大きく異なるが、典型的には、109 cfu/μg前後で変動する。電気コンピテント細胞の作製方法および電気穿孔の実施方法の詳細なプロトコルは、下記から入手することができる：http://www.emblheidelberg.de/Externallnfo/stewart/index.html。
図９Aに示すプラスミドpR6K/ BAD-αβγ(tet)は、BAC宿主株HS996（Invitrogen）に、ET組換えを実施する能力を賦与するように構築した。このプラスミドは、ｐBAD24バックボーン（Guzmanら、1995, J. Bacteriol 177:4121-4130）に基づく。Redα（またはRecE）は、L-アラビノーズ誘導性pBADプロモーターから発現させ、また、Redβ（またはRecT）は、構成性EM-7プロモーターから発現させる。RecEに対するRecT、またはRedαに対するRedβの過剰発現は、ET-クローニング効率を高める（選択プレート上のコロニーの量に関して）。最後にこのプラスミドが、この場合、構成性Tn5プロモーターから、Redγタンパク質を構成的に発現するが、これは、最も一般的に用いられる宿主株に存在するRecBCD酵素の活性を阻害するのに必要である（Murphy, 1991, J. Bacteriology 173:5805-5821）。不活性化されていなければ、RecBCDはET-クローニングを完全に阻害する。これは恐らく、そのエキソヌクレアーゼ活性が、線状DNAが組換えの機会を獲得する前に、該DNAを分解するためであろう。従って、pBAD-αβγ(tet)は、受容宿主株の形質転換時に、調節可能なET-クローニング能力を賦与することができる移動系を構成する。RecEまたはRedαの発現の誘導性と、組換えが起こるように、recE/Tおよびredα/β系の両成分を共発現させるための絶対要件を仮定すると、組換えを促進する時間は、アラビノーズ誘導時間と、最小安定成分の半減期に限定される。recA宿主が最も一般的に用いられること、また、宿主がrecBC-またはrecBC-の表型模写（Redγの発現により）のいずれかであることを共に考慮すると、これは、不要な分子間組換えの危険性が大幅に減少することを意味する。pBAD-αβγ(tet)のさらに有用な特徴は、これらプラスミドが、培養中に選択されないと、急速に消失する傾向があることである。これは、恐らく、Redγの構成性発現によるものであり、宿主細胞因子、例えば、RecBCDの存在に応じて変動する可能性がある。
pR6K/BAD-αβγの複製には、R6K起点とPir-116タンパク質が必要である（Metcalfら、1994, Gene 138, 1-7）。pR6K/BAD/αβγは、pJP5603（PenfoldおよびPemberton, 1992, Gene 118:145-6）から得られたR6K起点と、細菌中のR6K oriプラスミド複製を制御するpir-116レプリコン遺伝子と、pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子tetとを保有する。Pir-116は、コピーアップ（copy-up）突然変異体であり、これは、R6K起点を含むプラスミドを、１細胞当たり200以上のコピーで大腸菌株に存在できるようにする。pir-116遺伝子を、大腸菌株BW3647からPCR増幅し、lacZプロモーターの後ろでクローニングした。
pR6K/BAD/αβγを生成するため、ET組換えにより、R6K起点、pir-116およびtetをpBAD-αβγに導入し（Muyrersら、1999, Nucleic Acids Research, 27:1555-1557）、これによって、pBAD-αβγに元々存在するColE1起点およびアンピシリン耐性遺伝子を置換する。同様に、pR6K/BAD/ETγおよびpR6K/BAD/recTを生成した。あらゆるR6K-ベースのプラスミドのコピー数は、それぞれのColE1-ベースの親プラスミドと比較して、約２倍高いことがわかった。標準的BACサブクローニング実施に関するpR6K/BAD/αβγおよびpBAD-αβγの並列（side-by-side）比較では、R6K-ベースのプラスミドの方が効率よく働くことがわかった（図９B参照）。これらR6Kプラスミドに存在するR6K複製系は、p15aおよびColE1を含む他の複製起点に対して有意な配列相同性をまったく含まない。さらに、R6K-ベースのプラスミドは、他のあらゆる複製起点と適合性である。従って、ColE1およびp15A等の複製起点を、ETサブクローニングに用いられる線状ベクターに含ませることができる。
ETサブクローニング
BACに存在するAF-4遺伝子のエキソン２および３を含む19kb断片のサブクローニングを図10に示す。最初に、pR6K/BAD-αβγを、BAC保有株に形質転換した。次に、形質転換した株を15μg/mlテトラサイクリンと12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地上で成長させる。成長する細胞をL-アラビノーズで１時間誘導した後、電気コンピテント細胞を作製した。これらの細胞を、線状ベクターを用いた電気穿孔により形質転換した。その際、該ベクターは、p15A複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子と、AF-4 BAC上の標的DNAに対する相同的組換えを指定する50ヌクレオチドの２つの相同性アームが隣接したβラクタマーゼ（bla）とを含んでいた。50μg/mlアンピシリンを含むLBプレート上で成長させた後、組換え体を取得した。
図10Bに示すように、独立したコロニーを分析のため選択した。５つの独立したコロニーからDNAを作製し、HindIIで消化した後、臭化エチジウム染色ゲル上で分析した。1kb DNAラダー（Gibco BRL）と共に、HindIIIで消化した適正なコロニーと線状ベクターだけをマーカーとして用いた。適正なサブクローンをDNA配列決定により識別した。
ETクローニング
また、図11の実験に示すように、ゲノムDNAは、標的DNAの直接供給源であってもよい。この実験では、線状ベクターは、ColE1起点およびカナマイシン耐性遺伝子（kan）から構成され、該遺伝子は、大腸菌染色体上に存在するlacI/lacZ遺伝子座への組換えを指定する相同性アームと隣接している（図11A参照）。XhoI消化により予備線状化された大腸菌から、ゲノムDNAを単離した。線状ベクターと予備線状化ゲノムDNAとを混合した後、RecE/RecTを内在的に発現するYZ2000に共電気穿孔した。50μg/mlカナマイシンを含有するLBプレート上で選択することにより、lacIおよびlacZ遺伝子、ColE1起点およびkanから成る所望のサブクローンを取得した。図11Bに示すように、制限分析から、16個の独立したコロニーが、適正な産物を含む（レーン１〜16）ことがわかった。レーン17は、線状ベクターを示し、レーンMは、マーカーとしての１kbDNAラダーを示す（Gibco BRL）。
好適なET組換えクローニングの別の例を図12に示す。この実験では、相同性アームクローニングベクターを用いて、ES細胞ゲノムDNAから断片を直接クローニングした。クローニングストラテジーを概説する図12Aに示すように、マウスES細胞ゲノムDNA由来のネオマイシン耐性遺伝子（neo）を標的DNAとして用いた。線状ベクターは、ColE1起点およびクロラムフェノール耐性遺伝子Cm’から構成され、該遺伝子は、Tn5-neo遺伝子に相同的な２つのアームと隣接する。PGKプロモーターおよびpolyAテールの制御下で、Tn5-neoを含む断片をトランスフェクトすることにより、必要なマウスES細胞系を生成した。G418耐性コロニーからゲノムDNAを作製した後、針を用いて、フェノール／クロロホルム抽出により、せん断し、約20〜40kbの線状断片を形成した。
線状ベクターおよびせん断ゲノムDNAをYZ2000、JC8679誘導体（Clark、前掲）に共電気穿孔することにより、ETクローニングを実施した。尚、該誘導体において、外来メチル化DNAを分解する制限系は、mcrA、mcrBC、hsdRMSおよびmrr遺伝子の欠失により、部分的に損傷している。RecTの過剰発現は、全体的ET組換え効率を大幅に高めるため、pR6K/BAD/recTプラスミドで、YZ2000を形質転換した。収穫前に、１時間L-アラビノーズで誘導させたpR6K/BAD/recTを保有するYZ2000は、0.5μg線状ベクターと5.0μgせん断マウスES細胞ゲノムDNAを用いた電気穿孔により共形質転換した。50μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLBプレート上で、平均25〜35個のコロニーが得られた。50μg/mlのカナマイシンを含有するLBプレート上で、これらのコロニーを再ストリーキングすることにより、Tn5-neo発現のアッセイによって、試験した30コロニーのうちの６個が、成長することがわかった。図12のパネルBには、カナマイシン耐性コロニーの制限分析から、６つのコロニー（レーン２〜７）すべてが、適正であることが明らかにされた。クロラムフェニコールの存在下では成長したが、カナマイシンの存在下では成長できなかった偽陽性の制限パターンをレーン１に示す。これら偽陽性のすべては、再結合ベクターを含んでいた。
ETサブクローニングおよびクローニングの組み合わせを示す実験を図13に示す。線状ベクターは、ColE1複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子km’から構成される。また、線状ベクターの各末端は、BstZ17I部位と２つの相同性アームから成る。線状ベクターの末端に存在する相同性アーム（図13の小さい方の箱で示す）は、λファージ標的DNAと相同的である。相同性アームの第２セット（大きい方の箱で示す）は、大腸菌染色体に存在するlacI-lacZ遺伝子と相同的である。
第１のサブクローニング段階では、線状化λファージ標的DNAと一緒に、ET能力を有する（proficient）大腸菌株JC8679ΔlacZに、線状ベクターを共電気穿孔した。その結果、exo、bet、gam、rexAおよびcI857遺伝子を含む6.7kb λDNA断片の、線状ベクターへのサブクローニングが起こり、これにより、pYZN/λ-PRを産生した。次のET組換え段階では、新しい線状ベクターを用いた。このベクターは、突然変異したloxP部位（loxP*、Arakiら、1997, Nucleic Acids Research, 25:868-872）が隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子catと、pYZN/λ-PRに存在するλDNAに相同的な末端アームとを含む。ET能力を有する大腸菌株JC8679ΔlacZに、この線状ベクターを共電気穿孔することにより、pYZN/λ-PR/Cmを生成した。このプラスミドから、BstZ17I消化により、lacI-lacZと相同的な２つの末端アームが隣接する、cat含有λDNA断片が放出された。この断片を用いて、pBADRecE/T（Zhangら、1998, Nature Genetics 20:123-128）由来のRecEおよびRecTを発現する大腸菌株JC5519（WillettsおよびClark, 1969, J Bacteriol, 100:231-239）の染色体をターゲッティングした。ET組換え、ならびに、20μg/mlのクロラムフェニコール存在下での成長によって選択した後、YZ2001/Cm株を作製した。706-Creプラスミドを用いて、YZ2001を生成する目的で、catの欠失を実施した。尚、該プラスミドは、既述されている（Buchlholzら、1996, Nucleic Acids Research, 24:3119-3119）ように、クロラムフェニコール耐性遺伝子の代りに、テトラサイクリン耐性遺伝子（tet’）を保有する以外は、705-Creと同一である。従って、YZ2001は、染色体上の突然変異したloxP部位を含む6.7 kbλDNA断片（exo----cI857）を保有する。YZ2001/Cmは、λ遺伝子exo、betおよびgamの熱誘導性発現を可能にすることから、これは、条件により、ET能力を有する。類似したストラテジーにより、例えば、ノックアウト構築物の生成、あるいは、BAC修飾の実施が可能である。
このように、以上示した実施例は、RecE/TおよびRedα/β媒介による相同的組換えを用いた好適なクローニングおよびサブクローニングの複数の手法を明らかにする。
本明細書に記載され、クレームされた本発明は、本明細書に開示した特定の実施形態によりその範囲を制限されるものではない。何故なら、これらの実施形態は、本明細書のいくつかの態様を説明することを意図するものだからである。あらゆる同等の実施形態は本発明の範囲に含まれるものとする。実際、当業者であれば、以上の説明から、本明細書に開示および記載したものに加えて、本発明の様々な変更が明らかであろう。このような変更もまた、添付の請求の範囲に含まれるものとする。本明細書を通じて、様々な参照文献を引用したが、それぞれの内容は、あらゆる目的のために、その全文を本明細書に参照として組み込むものとする。
図１Ａ〜Ｃ： 相同的組換えクローニングおよびサブクローニング法の構成成分。Ａ．複製起点(origin)、選択マーカー(Sm)、および２つの相同性アーム(AおよびBで示す)を含有するベクター。Ｂ．任意の二本鎖オリゴヌクレオチドアダプター。各アダプターは、相同性アーム(それぞれAおよびB)に対する相同性領域(A'およびB'と表示)と、標的DNAの末端(それぞれCおよびDと表示)に対する第２の相同性領域(C'およびD'と表示)を含む。Ｃ．標的DNA。標的DNAの末端のヌクレオチド配列(CおよびD)は、ベクターの相同性アーム(それぞれAおよびBと表示)の一方のヌクレオチド配列に相同であっても、任意のアダプターオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列(それぞれC'およびD'と表示)に相同であってもよい。 アプローチ１の実験的概略。相同的組換えによるサブクローニングのためのベクターは、例えば形質転換によって、標的DNAとRecE/TまたはRedα/βタンパク質がすでに存在する大腸菌宿主に導入される。この図式は、「相同性アーム」によって挟まれた、大腸菌の複製起点および選択マーカー遺伝子(Sm)、好ましくは該遺伝子の産物が抗生物質耐性を賦与するもの、を担持する線状DNA分子を示す。相同性アームは、線状DNA分子の端部に太い灰色ブロックとして示されるもので、相同性アームによって挟まれた太線として示されるサブクローニングすべきDNA領域に隣接する標的DNA中の２つの領域（標的DNA末端と呼ばれる）に相同な配列の短い領域である。形質転換後、Sm遺伝子の発現について選択して、線状DNA分子の相同性アームと標的との相同的組換えの産物を含む細胞を同定する。 アプローチ２の図式的表示。このアプローチは図１で使用したものに類似しているが、この場合には、標的DNA分子が大腸菌宿主内に存在せず、線状DNAベクター分子とともに共導入される。標的DNAはどのような源であってもよく、例示されるように、混合物（該混合物からの関心のあるDNA領域がクローニングされる）または高度に濃縮されたDNA分子（該分子からのDNA領域がサブクローニングされる）であり得る。図１と同様に、相同性アームは太い灰色ブロックとして示される。 アプローチ３の一例の図式的表示。このクローニングまたはサブクローニングベクターは、太い灰色ブロックとして示される２つの短い相同性アームによって挟まれた大腸菌の複製起点と選択マーカー遺伝子(Sm)を含む。さらに、このベクターは２つの組換え標的部位(SSRT)を含み、該標的部位の１つは複製起点と選択マーカー遺伝子の間にある。最も簡便には、このベクターは最初に、図面に示したような線状DNA断片として構築される。環化後に、第２のSSRTが相同性アーム間に位置づけられ、第１のSSRTに関して直接的な反復として方向づけられる。その結果、２つのSSRT間の部位特異的組換えは２つの異なる環状分子の作製をもたらし、それにより複製起点と選択マーカー遺伝子を分離する。環化したベクターを、RecE/TまたはRedα/βタンパク質を発現するまたは発現し得る大腸菌株に形質転換する。大腸菌株はまた、誘導可能な部位特異的リコンビナーゼ(SSR)遺伝子（その産物はベクター中のSSRTを認識する）を含み、かくして、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が発現のために誘導されるまで、SSRT間の部位特異的組換えは起こらない。ベクターおよび調節された部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を担持する大腸菌細胞は、それらがRecE/TまたはRedα/βタンパク質を含みかつ形質転換を受容する能力をもつように調製する。その後、クローニングすべき領域を含むDNA分子を宿主細胞に導入する。相同性アーム間の相同的組換え後に、部位特異的リコンビナーゼタンパク質の発現が誘導され、選択マーカー遺伝子の発現について選択する。部位特異的組換えの前には、細胞は２つのSSRTを担持する非組換えベクターまたは意図した１つのSSRTのみを担持する相同的組換え産物のいずれかを含む。なぜならば、相同的組換えが相同性アーム間にあるSSRTの欠失をもたらすからである。部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導し、選択マーカー遺伝子の発現について選択した後には、相同的組換えの産物を含む細胞が生き残る。なんとなれば、この産物はもはや部位特異的組換えのための基質ではないからである。 RecE/TまたはRedα/β相同的組換えによるクローニングおよびサブクローニングのためのアダプターオリゴヌクレオチドの使用。この図式は上記の図３に示したアプローチ２の変法を示すものである。２つのアダプターオリゴヌクレオチドは、それぞれ、２つの相同性の領域を含み、一方の相同性領域はベクターの相同性アームの１つに相同であり、他方の相同性領域は標的DNA領域の２つの末端のうちの１つに相同である。ベクターの環化および標的DNA領域のクローニングは、ベクターとアダプター間およびアダプターと標的DNA間の相同的組換えにより達成される。この実施形態では、ベクターおよび標的DNAは配列相同性を持ち合わせない。したがって、それぞれの標的DNA用の標的特異的アダプターオリゴヌクレオチドを用いることによって様々な標的DNAをクローニングまたはサブクローニングするために、同一のベクターを使用することができる。また、アダプターオリゴヌクレオチドは、上記の図１および３に示されるような、アプローチ１および３の方法においても使用することができる。 mAF4 BAC実験から得られた９個の独立したコロニー（レーン１〜９）より単離された、EcoRIで消化したDNAを示すエチジウムブロミド染色アガロースゲル。レーンM、1kb DNAサイズ標準品(BRL, Bethesda, MD)。レーン10、出発ベクターのEcoRI消化。この実験は第６節に記載の実施例において詳しく説明する。 図７Ａ〜Ｂ： 全酵母ゲノムDNAからのDNA領域のクローニング。Ａ．酵母株MGD353-13D中の組み込まれたアンピシリン耐性遺伝子の両側の98または102bpに対する98または102bpの相同性アームによって挟まれた、p15A複製起点を増幅するために作製されたPCR断片を示す。PCR産物(0.5mg)を全酵母ゲノムDNA(4.0mg)と混合し、pBADαβγから発現されたRedα/βを含むJC5519大腸菌に共電気穿孔した。アンピシリン耐性を選択することによりクローンを同定した。 Ｂ．10個の選ばれたコロニーから正しい産物を確認するためのエチジウムブロミド染色ゲル。 図８Ａ〜Ｃ： ETサブクローニングに及ぼす線状ベクターの両末端に存在する反復または5'リン酸の影響。Ａ．線状ベクターのPCR増幅に使用したオリゴヌクレオチドの配列を示す。イタリック体の配列はPCR増幅に必要とされるオリゴヌクレオチドの部分を示し、その他のヌクレオチドは大腸菌lacZ遺伝子に対する相同性アームを構成する。太字の配列は線状ベクターの両末端に存在し、かくして、末端反復を構成する。線状ベクター構築物a-xはさまざまな長さの配列反復を有する。この線状ベクターは示した末端反復および相同性アームによって挟まれたp15A複製起点とクロラムフェニコール耐性遺伝子Cmrを含む。Ｂ．大腸菌lacZ遺伝子のETサブクローニングにおける効率について、パネルＡのさまざまな配列反復を含むベクター構築物を試験するために用いたストラテジーの模式図。Ｃ．ETサブクローニングの効率に及ぼす反復の長さおよびリン酸化の影響を示す表。パネルＡに示した反復配列を含むベクターを用いた試験の結果を示す。 図９Ａ〜Ｂ： pBAD-αβγ(tet)を用いたET組換えサブクローニング。Ａ．R6K起点、pir-116レプリコン、pBR322からのテトラサイクリン耐性遺伝子(tetr)、およびアラビノースリプレッサー(araC)を含むpR6K/BAD/αβγプラスミドの図。Ｂ．pR6K/BAD/αβγに対比してpBAD-αβγ(tet)(ColE1 ori)を用いたET組換えサブクローニングの比較。 図10Ａ〜Ｂ： BAC上に存在するAF-4遺伝子の19kb断片のサブクローニング。Ａ．プラスミド構築物およびサブクローニング戦略。tetr, テトラサイクリン耐性遺伝子。araC, アラビノースリプレッサー。 Ｂ．５個の独立したコロニーの分析。５個の独立した、正しいコロニーから調製したHindIII消化DNAおよび線状ベクターのみのエチジウムブロミド染色ゲル。正しいサブクローンはDNA配列決定により確認した。M, 1kb DNAラダー。 図11Ａ〜Ｂ： 標的DNA源としてゲノムDNAを用いたETサブクローニング。Ａ．大腸菌から単離したゲノムDNAをXhoI消化により予め線状化した。線状ベクターは、大腸菌染色体上に存在するlacI/lacZ遺伝子座への組換えを指令する相同性アームによって挟まれた、ColE1複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子kanから構成された。 Ｂ．16個の独立したコロニーの制限分析。レーン17は線状ベクターを示す。M, 1kb DNAラダー。 図12Ａ〜Ｂ： マウスES細胞のゲノムDNAからのネオマイシンgen neoのサブクローニング。Ａ．サブクローニング戦略の図。 Ｂ．カナマイシン耐性コロニーの制限分析。 ETクローニングおよびサブクローニングの比較。 ETクローニングおよびサブクローニングの比較。

Claims (26)

  1. 組換えDNA分子を作製する方法であって、
    a) 細胞に二本鎖標的DNA分子を導入すること、ただし、該細胞は線状ベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、独立して複製する任意のDNAまたはあらゆるDNA供給源に常在している、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端をこの順序で含むものであり、該ベクターは複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであり、
    該線状ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第１の末端の配列に相同であり、かつ該線状ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第２の末端の配列に相同であること、 および
    b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件に付すことによりベクターDNAは環状分子となること、を含んでなる上記方法。
  2. 組換えDNA分子を作製する方法であって、
    a) 細胞に二本鎖標的DNA分子と第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞は線状ベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と２つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、独立して複製する任意のDNAまたはあらゆるDNA供給源に常在している、第１の末端、標的DNA配列、第２の末端をこの順序で含むものであり、
    該第１のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第１のヌクレオチド配列が該線状ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第２のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第２のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第３のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第３のヌクレオチド配列が該線状ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第４のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であり、
    該線状ベクターは複製起点と２つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含むものであること、および
    b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件に付すことによりベクターDNAは環状分子となること、を含んでなる上記方法。
  3. 線状ベクターが第１および第２の相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該線状ベクターがベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の２つの順序のいずれかで、i) 第１の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第２の相同性アーム、またはii) 第１の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第２の相同性アームを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 選択マーカーが前記線状ベクターを含む細胞に抗生物質耐性を賦与する、請求項３に記載の方法。
  5. 細菌性リコンビナーゼがRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記細胞が細菌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記細胞が大腸菌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  8. 前記細胞がRecE/Tリコンビナーゼおよび／またはRedα/βリコンビナーゼを組換え的に発現する真核細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  9. 前記ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を単離することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  10. 請求項１または２の方法に使用される関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な線状二本鎖DNAベクターであって、該線状ベクターが複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含んでなり、第１の線状ベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第１の線状ベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該ベクターの配列は複製起点と選択マーカーの両方の5'側または3'側に、少なくとも５塩基対以上の直接反復配列を１以上含まない、上記ベクター。
  11. 複製起点が細菌の複製起点である、請求項１０に記載のベクター。
  12. 複製起点が大腸菌内で機能する、請求項１０に記載のベクター。
  13. 複製起点が哺乳動物細胞内で機能する、請求項１０に記載のベクター。
  14. 請求項１または２の方法に使用される関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な線状二本鎖DNAベクターを含有する細胞であって、該線状ベクターが複製起点と２つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第１の相同性アーム、複製起点、第２の相同性アームの順序で含んでなり、第１のベクターDNA鎖上の第１の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第１の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第１のベクターDNA鎖上の第２の相同性アームのヌクレオチド配列が、第１の標的DNA鎖上の第２の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該ベクターの配列は複製起点と選択マーカーの両方の5'側または3'側に、少なくとも５塩基対以上の直接反復配列を１以上含まない、上記細胞。
  15. 細菌の細胞である、請求項１４に記載の細胞。
  16. 標的DNAが、遺伝的に突然変異を起こしたとき、障害または疾患に関連することが知られているか、または障害または疾患に関連すると予想される、請求項１または２に記載の方法。
  17. 標的DNAが細菌、ウイルス、寄生生物、または原生動物のDNAである、請求項１または２に記載の方法。
  18. ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  19. ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  20. 請求項１８に記載の方法を実施することを含んでなる病原体の存在の検出方法であって、標的DNAが感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第１および第２の相同性アームの配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である、上記方法。
  21. 請求項１９に記載の方法を実施することを含んでなる病原体の存在の検出方法であって、標的DNAが感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第２および第４のヌクレオチド配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である、上記方法。
  22. 病原体がウイルス、細菌、原生動物、真菌、または寄生生物である、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 請求項１８に記載の方法を実施することを含んでなる遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在の検出方法であって、標的DNAが遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第１の相同性アームの配列が遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第２の相同性アームの配列が遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である、上記方法。
  24. 請求項１９に記載の方法を実施することを含んでなる遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在の検出方法であって、標的DNAが遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第１の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第２の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である、上記方法。
  25. 遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質が癌、喘息、関節炎、薬剤耐性、薬剤毒性、または神経的、神経精神的、代謝的、筋肉的、心血管的な、もしくは皮膚の状態、疾患または障害であるか、あるいはこれらに罹りやすくする、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記ベクターが第１および第２の相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該ベクターが、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の２つの順序のいずれかで、i) 第１の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第２の相同性アーム、またはii) 第１の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第２の相同性アームを含む、請求項１０に記載のベクター。
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