DE60022766T2 - Verfahren und verbindungen nützlich in der gezielten klonierung durch homologe rekombination - Google Patents

Verfahren und verbindungen nützlich in der gezielten klonierung durch homologe rekombination Download PDF

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Description

  • 1. Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen für die DNA-Klonierung und Subklonierung unter Verwendung bakterieller Rekombinase-vermittelter homologer Rekombination gerichtet. In einer spezifischen Ausführungsform werden die RecE/T- oder die Redα/β-Rekombinasen oder jedes funktionelle äquivalente System für die Initiierung einer bakteriellen homologen Rekombination wie das erf aus dem Phagen P22 verwendet. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren, diagnostische Verfahren, Zusammensetzungen, die Polynukleotide umfassen, die für Klonierungsvektoren nützlich sind, Zellen, die solche Polynukleotidzusammensetzungen umfassen, und Kits, die für die RecE/T- und Redα/β-vermittelte Klonierung nützlich sind.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Die DNA-Klonierung und Subklonierung in E. coli ist für die Molekularbiologie von grundsätzlicher Bedeutung. Die DNA-Klonierung bezeichnet das Verfahren, bei dem ein Replikationsursprung wirksam mit einem doppelsträngigen DNA-Fragment verknüpft wird und in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt vermehrt wird. Die DNA-Subklonierung bezeichnet das Verfahren, bei dem ein doppelsträngiges DNA-Fragment aus einem DNA-Molekül, das bereits entweder in vitro beispielsweise durch PCR oder in vivo durch Vermehrung in E. coli oder einem geeigneten anderen Wirt vervielfältigt worden ist, genommen wird und dann mit einem wirksamen Replikationsursprung verknüpft wird. Die Klonierung und Subklonierung in E. coli wird üblicherweise durch Ligation der Enden eines DNA-Fragments and Enden eines linearisierten Vektors, der den E. coli-Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker enthält, durchgeführt. Der selektierbare Marker wird in dem Vektor aufgenommen, um sicherzustellen, daß das neu klonierte Produkt, das Plasmid, das die Einfügung enthält, erhalten und fortgepflanzt wird, wenn es in die E. coli Wirtszelle eingeführt wird.
  • Übliche Klonierungsverfahren haben bestimmte Beschränkungen. Beispielsweise ist die Wahl der DNA-Fragmente durch die Verfügbarkeit von Restriktionsenzymserkennungsstellen in der interessierenden DNA-Region beschränkt, da übliche Klonierung die Verwendung von Restriktionsenzymen erfordert. Restriktionsstellen müssen gefunden werden, die an den Grenzen aber nicht innerhalb des gewünschten DNA-Fragments schneiden. Da die meisten nützlichen Restriktionsenzyme relative häufig schneiden, ist die Größe des linearen DNA-Fragments, das hergestellt werden kann, begrenzt.
  • Die zunehmende Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR = „polymerase chain reaction") für die Erzeugung von DNA-Fragmenten stellt einen zweiten Hauptnachteil der üblichen Subklonierung dar. Die Enden der PCR-Produkte sind in Ligationsreaktionen aufgrund von Nukleotiden, die an die 3'-Termini der vervielfältigten PCR-Produkte durch die thermostabile Polymerase nicht-Vorlagen-gesteuert angefügt werden, ineffizient. Des weiteren beinhaltet die Verwendung von PCR ein hohes Mutationsrisiko. Daher haben Molekularbiologen nach neuen, wirksameren Verfahren für die Klonierung von DNA-Fragmenten gesucht insbesondere wenn solche Fragmente länger als die sind, die üblicherweise durch Restriktionsenzym- oder PCR-Verfahren zugänglich sind.
  • Die homologe Rekombination ist ein alternativer Ansatz für die Klonierung und Subklonierung von DNA-Fragmenten. Verfahren für die Subklonierung von PCR-Produkten in E. coli, die die homologen Rekombinationssysteme des Wirts auszunutzen, sind beschrieben worden (Oliner et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:5192–97; Bubeck et al., 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601–3602). In solchen Verfahren werden PCR-Primer verwendet, die entworfen werden, so daß sie Endsequenzen enthalten, die homolog zu Sequenzen sind, die an den Enden des linearisierten Vektors angeordnet sind, um ein interessierendes DNA-Fragment zu vervielfältigen. Das PCR-Produkt und der linearisierte Vektor werden dann in E. coli eingeführt. Die homologe Rekombination innerhalb der E. coli-Wirtszelle führt zur Insertion der PCR-Produktsequenzen in den Plasmidvektor. Obwohl für diese Verfahren gezeigt worden ist, daß sie für die Subklonierung von PCR-Fragmenten nützlich sind, sind sie nicht auf die Subklonierung langer DNA-Fragmente oder auf die Klonierung von DNA-Fragmenten beliebiger Größe angewendet worden.
  • Ein anderes Verfahren beschreibt ein Verfahren der in vivo-Subklonierung, in dem zwei lineare DNA-Moleküle, von denen das eine einen Replikationsursprung aufweist, und die an ihren Enden lange Homologieregionen aufweisen, verwendet werden, um ein E. coli sbcBC Wirtszelle zu transformieren. Die homologe Rekombination tritt in vivo auf und führt zur Zirkularisierung und Vervielfältigung des neugebildeten Plasmids (Degryse, 1996, Gene 170:45). Anschließend ist die Fähigkeit, der E. coli sbcBC-Wirtszellen eine homologe Re kombination zu vermitteln, auf die Subklonierung großer DNA-Fragmente aus der genomischen Adenovirus- und Herpesvirus DNA angewendet worden (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70: 4805; Messerle, et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759–14763; He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509–2514). Wie beschrieben, erfordert jede Subklonierung durch homologe Rekombination in E. coli sbcBC-Wirtszellen mindestens zwei vorbereitende Subklonierungsschritte, um lange Homologiebereiche an jeder Seite des E. coli Replikationsursprungs zu positionieren. Des weiteren ist eine DNA-Klonierung in E. coli sbcBC-Stämmen nicht beschrieben worden.
  • Kürzlich wurde für die homologe Rekombination, die durch RecE/RecT (RecE/T) oder Redα/Redβ (Redα/β) vermittelt wird, gezeigt worden, daß sie für die Handhabung von DNA-Molekülen in E. coli nützlich ist (Zhang et al., 1998, Nature Genetics, 20, 123–128; Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:1555–1557, und WO 99/29837). Diese Publikationen zeigen, daß in E. coli jedes intakte, unabhängig replizierende, zirkuläre DNA-Molekül durch RecE/T- oder Redα/β-vermittelte homologe Rekombination mit einem linearen DNA-Fragment, das durch kurze DNA-Sequenzregionen, die identisch zu Regionen sind, die im zirkulärem Molekül vorhanden sind, verändert werden kann. Die Integrationen des linearen DNA-Fragments in das zirkuläre Molekül durch homologe Rekombination ersetzt Sequenzen zwischen seinen flankierenden Sequenzen und den korrespondierenden Sequenzen in dem zirkulären DNA-Molekül.
  • Die Zitierung einer Publikation hierin soll nicht als ein Zugeständnis verstanden werden, daß eine solche Stand der Technik für die vorliegende Erfindung ist.
  • 3. Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die DNA-Klonierung und Subklonierung unter Verwendung bakterieller Rekombinase-vermittelter homologer Rekombination. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für das Einfügen einer doppelsträngigen Ziel-DNA-Sequenz in einen Vektor durch homologe Rekombination zur Verfügung, wobei die Ziel-DNA-Sequenz durch einen ersten doppelsträngigen DNA-Terminus und einen zweiten Terminus der auf einem beliebigen unabhängig replizierenden DNA-Molekül oder einer beliebigen DNA vorhanden ist, wobei das Verfahren umfaßt:
    • a) Konstruieren einer Vektor-DNA, die in der nachfolgenden Reihenfolge entlang des Vektor-DNA-Strangs aufweist: (i) einen ersten doppelsträngigen Homologiearm; (ii) einen Replikationsursprung; und (iii) einen zweiten doppelsträngigen Homologiearm, wobei die Sequenz eines Strangs des ersten Homologiearms der Vektor-DNA homolog zur Sequenz eines DNA-Strangs des ersten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, die Sequenz eines Strangs des zweiten Homologiearms der Vektor-DNA homolog zur Sequenz eines DNA-Strangs des zweiten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, wobei die Orientierung der beiden Arme relativ zu dem gewünschten Insert die gleiche ist, wie die Orientierung der homologen Arme relativ zu der Ziel-DNA, so daß eine Rekombination zwischen dem Homologiearm und dem ersten und zweiten Termini dazu führt, daß die gewünschte Zielsequenz zwischen den Homologiearmen eingefügt wird;
    • b) Einführen der Vektor-DNA in eine Zelle; und
    • c) Kultivieren der Zelle unter solchen Bedingungen, daß die Ziel-DNA-Sequenz in die Vektor-DNA zwischen den Homologiearmen eingeführt wird, wobei unter den genannten Kultivierungsbedingungen, die Zelle (i) die Ziel-DNA aufweist und (ii) eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei eine derartige Rekombinase von Phagen-oder bakterieller Herkunft ist und in der Lage ist, eine homologe Rekombination zu vermitteln oder ein funktionelles Äquivalent davon.
  • Die bakterielle Rekombinase ist vorzugsweise RecE/T und/oder Redα/β. Es können Verfahren verwendet werden, um ein interessierendes Polynukleotid oder Polynukleotidgemische unter Verwendung eines Vektors, der kurze DNA-Regionen aufweist, die homolog zu Sequenzen sind, die eine ausgewählte interessierende Ziel-DNA-Sequenz und einen Replikationsursprung flankieren, zu klonieren, zu subklonieren, zu vermehren und zu vervielfältigen.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für das Einführen einer doppelsträngigen Ziel-DNA in einen Vektor zur Verfügung, umfassend das Kultivieren einer bakteriellen Zelle, die eine funktionelle Rekombinase exprimiert, wobei die bakterielle Zelle (a) die Ziel-DNA, die einen ersten doppelsträngigen Terminus und einen zweiten doppelsträngigen Terminus umfaßt, (b) eine Vektor-DNA, die in der nachfolgenden Reihenfolge entlang des Vektor-DNA-Strangs aufweist: (i) einen ersten doppelsträngigen Homologiearm; (ii) einen Replikationsursprung und (iii) einen zweiten doppelsträngigen Homologiearm, wobei die Sequenz eines Vektor-DNA-Strangs des ersten Homologiearms homolog zu der Se quenz eines Ziel-DNA-Strangs des ersten Terminus ist und die Sequenz eines Vektor-DNA-Strangs des zweiten Homologiearms homolog zu der Sequenz des Ziel-DNA-Strangs des zweiten Terminus ist, so daß die Ziel-DNA in die Vektor-DNA zwischen den Homologiearm eingeführt wird, umfaßt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Vektors in eine Zelle, wobei die Zelle eine doppelsträngige Ziel-DNA enthält und eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, einen Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm; wobei die Ziel-DNA eine erste Ziel-DNA-Sequenz und zwei Termini in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang des Ziel-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz und einen zweiten Terminus, wobei das erste Oligonukleotid, das einen ersten Oligonukleotidstrang umfaßt, in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' aufweist: eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist; wobei das zweite Oligonukleotide einen zweiten Oligonukleitd-Strang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' umfaßt: eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz, wobei die dritte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang und die vierte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf den Ziel-DNA-Strang ist; und b) und Aussetzen der Zelle gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß eine intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Vektors und eines ersten und eines zweiten doppelsträngigen Oligonukleotids in eine Zelle, wobei die Zelle eine doppelsträngige Ziel-DNA enthält und eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei doppelsträngige Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfasst: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, wobei die Ziel-DNA eine Ziel-DNA-Sequenz und zwei doppelsträngige Ter mini in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang des Ziel-DNA-Strangs umfasst: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz und einen zweiten Terminus, wobei das erste Oligonukleotid einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfasst, der in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' umfasst: eine erste Nukleotid-Sequenz und eine zweite Nukleotid-Sequenz, wobei die erste Nukleotid-Sequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologieams auf den Vektor-DNA-Strang ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist, wobei das zweite Oligonukleotid einen zweiten Oligonukleotid-Strang umfasst, der in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' eine dritte Nukleotid-Sequenz und eine vierte Nukleotid-Sequenz umfasst, wobei die dritte Nukleotid-Sequenz homolog zu der Nukleotid-Sequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die vierte Nukleotid-Sequenz homolog zu der Nukleotid-Sequenz des zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist; und b) Aussetzen der Zelle gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß eine intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküls in eine Zelle, wobei die Zelle einen Vektor enthält und eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei die Ziel-DNA eine Ziel-DNA-Sequenz und zwei doppelsträngige Termini in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang des Ziel-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz und einen zweiten Terminus, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, so daß die Sequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist und die Sequenz des zweiten Homologiearms auf den Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist; und b) Aussetzen der Zelle gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß eine intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküls und eines ersten und zweiten doppelsträngigen Oligonukleotids in eine Zelle, wobei die Zelle einen Vektor enthält und eine bakterielle Rekombinase ex primiert, wobei die Ziel-DNA eine Ziel-DNA-Sequenz und zwei Termini in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang eines Ziel-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz, und einen zweiten Terminus, wobei das erste Oligonukleotid einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' umfaßt: eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf den Vektor-DNA-Strang homolog ist und die zweite Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang homolog ist; wobei das zweite Oligonukleotid einen zweiten Oligonukleotidstrang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die dritte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die vierte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang homolog ist; und der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm und b) Aussetzen der Zelle gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß die intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Vektors, eines doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküls und eines ersten und zweiten Oligonukleotids in eine Zelle, die eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei doppelsträngige Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, wobei die Ziel-DNA eine Ziel-DNA-Sequenz und zwei doppelsträngige Termini in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang eines Ziel-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz und einen zweiten Terminus, wobei das erste Oligonukleotid einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfaßt, der in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang eines Ziel-DNA-Strangs umfaßt: eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog ist und die zweite Nukleotidsequenz zu der Sequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang homolog ist; wobei das zweite Oligonukleotid einen zweiten Oligonukleotidstrang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die dritte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog ist und die vierte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz auf dem zweiten Terminus homolog ist; und b) Aussetzen der Zelle gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß die intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens enthält die Wirtszelle des weiteren eine Nukleotidsequenz, die für eine Orts-spezifische Rekombinase kodiert, die wirksam mit einem Promotor verknüpft ist und der Vektor enthält des weiteren eine erste und zweite Erkennungssequenz für die Orts-spezifische Rekombinase, wobei eine erste Erkennungssequenz außerhalb des ersten und zweiten Homologiearms angeordnet ist und eine zweite Erkennungssequenz der Orts-spezifischen Rekombinase innerhalb der ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und währen oder nach dem Schritt b) das Induzieren der Expression der Orts-spezifischen Rekombinase.
  • In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieses Verfahren, bei dem die Wirtszelle des weiteren eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Orts-spezifische Endonuklease kodiert, die wirksam mit einem Promotor verknüpft ist und der Vektor des weiteren eine Erkennungsstelle für eine Orts-spezifische Endonuklease enthält, die innerhalb der ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und während oder nach dem Schritt b) Induzieren der Orts-spezifischen Endonuklease.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfügung, umfassend: a) Einführen eines doppelsträngigen Vektors, eines doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküls und eines ersten und zweiten doppelsträngigen Oligonukleotids in eine Zelle, die eine bakterielle Recombinase exprimiert, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei doppelsträngige Homologie-Arme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologie-Arm, den Replikaitonsursprung und einen zweiten Homologie-Arm; wobei die Ziel-DNA eine Ziel-DNA-Sequenz und zwei doppelsträngige Termini in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' entlang eines Ziel-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Terminus, eine Ziel-DNA-Sequenz und einen zweiten Terminus; wobei das erste Oligonukleotid einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfaßt, da in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' umfaßt: eine erste Nukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologie-Arms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist, wobei das zweite Oligonukleotid, das einen zweiten Oligonukleotid-Strang umfaßt in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5' eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die dritte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologie-Arms auf dem Vektor DNA-Strang ist und die vierte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz auf dem zweiten Terminus ist; und b) Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die es erlauben, daß die intrazelluläre homologe Rekombination auftritt.
  • In einer spezifischen Ausführungsform dieses Verfahrens enthält die Wirtszelle desweiteren eine Nukleotidsequenz, die für eine ortsspezifische Rekombinase kodiert, die operativ mit einem Promotor verknüpft ist und der Vektor desweiteren eine erste und zweite Erkennungssequenz für die ortsspezifische Rekombinase, eine erste Erkennungssequenz, die außerhalb des ersten und zweiten Homologie-Arms angeordnet ist, und eine zweite ortsspezifische Rekombinase-Erkennungssequenz umfaßt, die innerhalb der ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und während oder nach Schritt b) induzieren der Expression der ortsspezifischen Rekombinase.
  • In einer weiteren spezifischen Ausführungsform dieses Verfahren, bei der die Wirtszelle desweiteren eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine ortsspezifische Endonuklease kodiert, die operativ mit einem Promotor verknüpft ist und der Vektor desweiteren eine Erkennungssequenz für die Orts-spezifische Endonuklease umfaßt, die innerhalb des ersten und zweiten Homologiearms angeordnet ist; und während oder nach dem Schritt b) induzierende Expression der Orts-spezifischen Rekombinase.
  • In besonderen Ausführungsformen umfaßt der Vektor des weiteren einen selektierbaren Marker, der außerhalb der Homologiearme angeordnet ist, so daß der Vektor in einer der beiden nachfolgenden zwei Reihenfolgen von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs umfaßt: (i) den ersten Homologiearm, den selektierbaren Marker, den Replikationsursprung und den zweiten Homologiearm oder (ii) den ersten Homologiearm, den Replikationsursprung, den selektierbaren Marker und den zweiten Homologiearm. In einer besonderen Ausführungsform verleiht der selektierbare Marker der Zelle, die den Vektor enthält, eine Antibiotikaresistenz.
  • In verschiedenen besonderen Ausführungsformen ist die bakterielle Rekombinase RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase oder sowohl RecE/T als auch Redα/β. In anderen besonderen Ausführungsformen ist die Zelle eine bakterielle Zelle. In anderen besonderen Ausführungsformen ist die Zelle eine E. coli-Zelle. In anderen besonderen Ausführungsformen ist die Zelle eine eukaryontische Zelle, die RecE/T- und/oder Redα/β-Proteine rekombinant exprimiert. In anderen besonderen Ausführungsformen umfaßt das Verfahren des weiteren die Isolierung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die Ziel-DNA in den Vektor eingeführt, umfaßt.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung einen doppelsträngigen DNA-Vektor zur Verfügung, der für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls zur Verfügung, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt, einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf einem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang ist und die Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem ersten Vektor-DNA-Strang zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf dem ersten DNA-Strang homolog ist. In einer besonderen Ausführungsform des Vektors ist der Replikationsursprung ein bakterieller Replikationsursprung. In einer anderen besonderen Ausführungsform funktioniert der Replikationsursprung in E. coli. In einer weiteren besonderen Ausführungsform funktioniert der Replikationsursprung in einer Säugetierzelle.
  • Die Erfindung stellt des weiteren eine Zelle zur Verfügung, die einen doppelsträngigen-DNA-Vektor umfaßt der für die gesteuerte Klonierung- oder Subklonierung eines interessierenden DNA-Moleküls nützlich ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf den ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang ist und die Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem ersten Vektor-DNA-Strang zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf den ersten Ziel-DNA-Strang homolog ist. In einer besonderen Ausführungsform ist die Zelle eine bakterielle Zelle.
  • Die Erfindung stellt des weiteren ein Kit zur Verfügung, daß für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist, umfassend in einem oder mehreren Behältern: a) einen doppelsträngigen DNA-Vektor, der für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls geeignet ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm; so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf einem ersten Vektor-DNA-Strang zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang homolog ist und die Nukleotidsequenz auf dem zweiten Homologiearm auf dem ersten Vektor-DNA-Strang zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf dem ersten Ziel-DNA-Strang homolog ist und b) eine Zelle, die eine bakterielle Rekombinase enthält. In einer besonderen Ausführungsform des Kits weisen die Homologiearme eine Sequenzhomologie zu einem auf BAC-, PAC-, Lambda-, Plasmid oder YAC-beruhendem Klonierungsvektor auf. In einer anderen besonderen Ausführungsform des Kits weist das erste und das zweite doppelsträngige Oligonukleotid eine Nukleotidsequenzhomologie zu einem auf BAC-, PAC-, Lambda-, Plasmid- oder YAC-beruhendem Klonierungsvektor auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Kit für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines Ziel-DNA-Moleküls zur Verfügung gestellt, umfassend in einem oder mehreren Behältern: a) einen doppelsträngigen DNA-Vektor, der für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls geeignet ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm; b) ein erstes doppelsträngiges Oligonukleotid, das einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfaßt, umfassend in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine erste Sequenz und eine zweite Sequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog ist und die zweite Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz eines ersten Terminus auf einen Ziel-DNA-Strang homolog ist; c) ein zweites doppelsträngiges Oligonukleotid, das einen zweiten Oligonukleotidstrang umfaßt, umfassend in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz, wobei die dritte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologie arms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog ist und die vierte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz eines zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang homolog ist und d) eine Zelle, die eine bakterielle Rekombinase enthält. In einer besonderen Ausführungsform des Kits ist die Zelle eine E. coli-Zelle. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform des Kits ist die Zelle eine gefrorene Zelle, die zur Aufnahme von DNA in der Lage ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Kit, daß für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist, zur Verfügung, das in einem oder in mehreren Behältern umfaßt: a) einen doppelsträngigen DNA-Vektor, der für die gerichtete Klonierung und Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls geeignet ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der nachfolgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs umfaßt: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm; b) ein erstes doppelsträngiges Oligonukleotid, das einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' umfaßt: eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz homolog zur Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms des Vektor-DNA-Strangs ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Terminus auf einem Ziel-DNA-Strang ist; und c) ein zweites doppelsträngiges Oligonukleotid, das einen zweiten Oligonukleotidstrang umfaßt, der in der nachfolgenden Reihenfolge von 3' bis 5' : eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die dritte Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang homolog ist und die vierte Sequenz zu der Nukleotidsequenz eines zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang homolog ist. In einer besonderen Ausführungsform des Kits ist der DNA-Vektor gereinigt. In einer anderen Ausführungsform des Kits sind der DNA-Vektor, das erste doppelsträngige Oligonukleotid und das zweite doppelsträngige Oligonukleotid gereinigt.
  • In weiteren durch die Erfindung zur Verfügung gestellten spezifischen Ausführungsformen des Kits umfaßt das Ziel-DNA-Molekül bakterielle, virale, parasitäre oder protozoische DNA. In anderen besonderen Ausführungsformen umfaßt das Ziel-DNA-Molekül eine genetische Mutation oder Polymorphismen, für die bekannt ist oder von denen vermutet wird, daß sie mit einer Störung oder Erkrankung in Verbindung stehen. In anderen besonderen Ausführungsformen ist die bakterielle Rekombinase die RecE/T- oder die Redα/β-Rekombinase oder sowohl die RecE/T- als auch die Redα/β-Rekombinasen.
  • Die Verfahren der Erfindung können bei der Diagnose verwendet werden. Beispielsweise können Plasmide oder lineare DNA-Fragmente entworfen werden, um ein spezifisches DNA-Ziel einzufangen, um dessen Gegenwart in einer Probe von einer Person nachzuweisen, zum Beispiel eine virale DNA, die in einer Patientenprobe vorhanden ist. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren für den Nachweis von Ziel-DNA zur Verfügung, für die bekannt ist oder für die vermutet wird, daß sie mit einer Störung oder Erkrankung in Verbindung steht, wenn sie genetisch mutiert ist. In besonderen Ausführungsformen ist die Ziel-DNA eine bakterielle, virale, parasitäre oder protozoische DNA. In einer besonderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, das des weiteren den Nachweis eines rekombinanten DNA-Moleküls umfaßt, das die Ziel-DNA in einen Vektor eingefügt, umfaßt. In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren des weiteren den Nachweis eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die Ziel-DNA in einen Vektor eingefügt, umfaßt.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für den Nachweis der Gegenwart eines infektiösen Mittels zur Verfügung, wobei die Ziel-DNA aus einem Patienten abgeleitet ist, von dem vermutet wird, daß er eine infektiöse Erkrankung aufweist und die Sequenzen des ersten und zweiten Homologiearms homolog sind zu den Sequenzen, die in der DNA des infektiösen Mittels vorhanden sind. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Ziel-DNA aus einem Patienten gewonnen, von dem vermutet wird, daß er die infektiöse Erkrankung aufweist und die zweiten und vierten Nukleotidsequenzen sind homolog zu den Sequenzen, die in der DNA des infektiösen Mittels vorhanden sind. In anderen spezifischen Ausführungsformen ist das infektiöse Mittel ein Virus, ein Bakterium, eine Protozoe, ein Pilz oder ein Parasit.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren für den Nachweis der Gegenwan eines genetischen Zustandes, einer genetischen Erkrankung, einer genetischen Störung oder einer polymorphen Anlage zur Verfügung gestellt, wobei die Ziel-DNA aus einem Patienten erhalten wurde, von dem vermutet wird, daß er einen genetischen Zustand, eine genetische Erkrankung, eine genetische Störung oder eine polymorphe Anlage aufweist, wobei die Sequenz des ersten Homologiearms zu der Sequenz stromaufwärts von einer Stelle, von der bekannt ist oder von der vermutet wird, daß sie mit dem genetischen Zustand, der genetischen Erkrankung, der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage in Verbindung steht, homolog ist und die Sequenz des zweiten Homologiearms zu der Sequenz stromabwärts von einer Stelle, für die bekannt ist oder von der vermutet wird, daß sie mit dem genetischen Zustand, der genetischen Erkrankung der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage in Verbindung steht, homolog ist. In einer besonderen Ausführungsform wird ein Verfahren für den Nachweis der Gegenwart eines genetischen Zustands, einer genetischen Erkrankung, einer genetischen Störung oder einer polymorphen Anlage zur Verfügung gestellt, wobei die Ziel-DNA von einem Patienten erhalten wird, von dem vermutet wird, daß er den genetischen Zustand, die genetische Erkrankung, die genetische Störung oder die polymorphe Anlage aufweist und die Sequenz des ersten doppelsträngigen Oligonukleotids ist zu der Sequenz stromaufwärts von einer Stelle, von der bekannt ist oder von der vermutet wird, daß sie mit dem genetischen Zustand, der genetischen Erkrankung, der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage in Verbindung steht, homolog und die Sequenz des zweiten doppelsträngigen Oligonukleotids ist zu der Sequenz stromabwärts von einer Stelle von der bekannt ist oder von der vermutet wird, daß sie mit dem genetischen Zustand, der genetischen Erkrankung, der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage in Verbindung steht, homolog. In einer spezifischen Ausführungsform ist der genetische Zustand, die genetische Erkrankung, die genetische Störung oder die polymorphe Anlage Krebs, Asthma, Arthritis, Arzneimittelresistenz, Arnzeimitteltoxizität oder ein neuraler, ein neuropsychatrischer, ein metabolischer, ein muskulärer, ein kardiovaskulärer oder ein Hautzustand, eine solche Erkrankung oder Störung oder disponiert den Patienten dafür.
  • 4. Beschreibung der Abbildungen
  • 1A–C. Bestandteile der homologen Rekombinationsklonierungs- und -subklonierungsverfahren.
    • A. Der Vektor, der einen Replikationsursprung (Ursprung), einen selektierbaren Marker (Sm) und zwei Homologiearme (als A und B markiert) umfaßt.
    • B. Gegebenenfalls doppelsträngige Oligonukleotidadaptoren. Jeder Adaptor umfaßt einen Homologiebereich (als A' und B' markiert) zu den Homologiearmen (A bzw. B); und einen zweiten Homologiebereich (als C' und D' markiert) zu einem Terminus der Ziel-DNA (als C bzw. D markiert).
    • C. Die Ziel-DNA. Die terminalen Nukleotidsequenzen, die die Ziel-DNA (C und D) flankiert, kann entweder homolog zu den Zielsequenzen eines der Homologiearme des Vektors (jeweils als A bzw. B markiert) oder zu den Nukleotidsequenzen der optionalen Adaptoroligonukleotide sein (jeweils als C' und D' markiert).
  • 2. Experimentelle Skizze der Vorgehensweise 1. Der Vektor für die Subklonierung durch homologe Rekombination wird zum Beispiel durch Transformation in einen E. coli-Wirt eingeführt, in dem die Ziel-DNA und die RecE/T- oder Redα/β-Proteine bereits vorhanden sind. Das Diagramm zeigt ein lineares DNA-Molekül, das einen E. coli-Replikationsursprung und ein selektierbares Markergen (Sm), das vorzugsweise ein Gen ist, dessen Produkt eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, flankiert von zwei „Homologiearmen". Die Homologiearme, die als dicke graue Blöcke an den Enden des linearen DNA-Moleküls gezeigt werden, sind kurze Bereiche mit Sequenzhomologie zu zwei Regionen, die die DNA-Regionen, die subkloniert werden sollen, flankieren, die Ziel-DNA-Termini genannt werden, die als dicke Linien flankiert durch die Homologiearme dargestellt werden. Nach der Tranformation, wird eine Selektion auf Expression des Sm-Gens auferlegt, um die Zellen zu identifizieren, die das Produkt der homologen Rekombination zwischen den Homologiearmen des linearen DNA-Moleküls und dem Ziel enthalten.
  • 3. Diagrammartige Wiedergabe der Vorgehensweise 2. Die Vorgehensweise ist der in der 1 verwendeten ähnlich, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall das Ziel-DNA-Molekül nicht bereits in dem E. coli-Wirt vorhanden ist, sondern vielmehr mit dem linearen Vektormolekül zusammen eingeführt wird. Die Ziel-DNA kann von jeder Quelle stammen, entweder, wie dargestellt, ein Gemisch aus dem die interessierende DNA-Region kloniert wird oder ein stark angereichertes DNA-Molekül aus dem die DNA-Region subkloniert wird. Wie in der 1 werden die Homologiearme als dicke graue Blöcke gezeigt.
  • 4. Diagrammartige Wiedergabe eines Beispiels nach Vorgehensweise 3. Der Klonierungs- oder Subklonierungsvektor umfaßt einen E. coli-Replikationsursprung und ein selektierbares Markergen (Sm), das von zwei kurzen Homologiearmen flankiert wird, die als dicke graue Blöcke gezeigt werden. Zusätzlich umfaßt der Vektor zwei Rekombinationszielstellen (SSRT), von denen die eine zwischen dem Ursprung und dem selektierbaren Markergen liegt. In der einfachsten Form wird der Vektor zuerst als ein lineares DNA-Fragment, wie in der Figur, gezeigt konstruiert. Nach der Zirkularisierung ist die zweite SSRT zwischen dem Homologiearmen im Hinblick auf die erste SSRT als direkte Wiederholung angeordnet, so daß die Orts-spezifische Rekombination zwischen den zwei SSRTs zur Herstellung von zwei ver schiedenen zirkulären Molekülen führt, wodurch der Ursprung und das selektierbare Markergen getrennt werden. Der zirkularisierte Vektor wird in einen E. coli-Stamm transformiert, in dem RecE/T- oder Recα/β-Proteine exprimiert werden oder exprimiert werden können. Der E. coli-Stamm trägt auch ein induzierbare Orts-spezifisches Rekombinasegen (SSR), dessen Produkt die SSRTs in dem Vektor erkennen, so daß die Orts-spezifische Rekombination zwischen den SSRTs nicht auftritt, bevor das Orts-spezifische Rekombinasegen zur Expression induziert wird. Die E. coli-Zellen, die den Vektor und das regulierte Orts-spezifische Rekombinasegen tragen, werden so hergestellt, daß sie die RecE/T- oder Redα/β-Proteine enthalten und zur Transformation in der Lage sind. Die DNA-Moleküle, die die zu klonierende Region enthalten, werden dann in eine Wirtszelle eingeführt. Nach der homologen Rekombination zwischen den Homologiearmen wird die Expression des Orts-spezifischen Rekombinaseproteins induziert und eine Selektion auf die Expression des selektierbaren Markergens wird auferlegt. Vor der Orts-spezifischen Rekombination werden die Zellen entweder nicht rekombinierten Vektor enthalten, der zwei SSRTs trägt oder das gewünschte homologe Rekombinationsprodukt, das nur ein SSRT trägt, da die homologe Rekombination zur Deletion des SSRTs führt, das zwischen den Homologiearmen angeordnet ist. Nachdem die Expression der Ortsspezifischen Rekombinase induziert wird und Selektion auf die Expression des Selektionsmarkers auferlegt wird, werden die Zellen, die das Produkt der homologen Rekombination enthalten, überleben, da dieses Produkt nicht mehr Substrat für die Orts-spezifische Rekombination ist.
  • 5. Verwendung der Adapteroligonukleotide für die Klonierung und Subklonierung durch RecE/T- oder Redα/β-homologe Rekombination. Das Diagramm stellt eine Variation der Vorgehensweise 2, der in 3 oben gezeigt wurde, dar. Zwei Adaptoroligonukleotide, wobei jedes zwei Homologieregionen enthält, eine zu einem der Homologiearme des Vektors und eine zweite Region mit Homologie zu einem der zwei Termini der interessierenden Ziel-DNA-Regionen. Die Zirkularisierung des Vektors und die Klonierung der interessierenden DNA-Regionen werden durch die homologe Rekombination zwischen dem Vektor und den Adaptern und zwischen den Adaptern und der Ziel-DNA erreicht. In dieser Ausführungsform teilen der Vektor und die Ziel-DNA keine Sequenzhomologie. Somit kann derselbe Vektor verwendet werden, um verschiedene Ziel-DNAs unter Verwendung Ziel-spezifischer Adapteroligonukleotide für jede Ziel-DNA zu klonieren oder zu subklonieren. Die Adapteroligonukleotide können auch in den Verfahren der Vorgehensweisen 1 und 3, wie in den 1 und 3 oben dargestellt verwendet werden.
  • 6. Ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel, das mit EcoRI verdaute DNA darstellt, die aus neuen unabhängigen Kolonien isoliert wurden (Spuren 1–9), die aus dem mAF4 BAC-Experiment erhalten wurden. Spur M ist ein 1 kb DNA Größenstandard (BRL, Bethesda, MD). Spur 10, EcoRI Verdau des Ausgangsvektors. Das Experiment wird detailliert im Beispiel im Abschnitt 6 beschrieben.
  • 7A–B. Klonierung einer DNA-Region aus genomischer Hefe gesamt DNA.
    • A. Ein PCR-Fragment wurde hergestellt, um den p15A-Ursprung zu vervielfältigen flankiert durch 98 oder 102 bp Homologiearmen zu 98 oder 102 bp an jeder Seite eines integrierten Ampicillin-Resistenzgens des Hefestammes. MGD 353-13D ist dargestellt. Das PCR-Produkt (0,5 mg) wurde mit genomischer Hefe gesamt DNA (4,0 mg) gemischt und in JC5519 E. coli, die Redα/β, da von pBADαβγ exprimiert wird, enthalten, koelektroporiert. Die Klone wurden durch Selektion auf Ampicillin-Resistenz ausgewählt.
    • B. Ein Ethidiumbromid-gefärbtes Gel, um die korrekten Produkte aus 10 ausgewählten Kolonien zu bestätigen.
  • 8A–C. Wirkung von Wiederholungen oder 5'-Phosphaten, die an den Enden des linearen Vektors vorhanden sind, auf die ET-Subklonierung.
    • A. Die Sequenzen der Oligonukleotide, die für die PCR-Vervielfältigung des linearen Vektors verwendet wurden, werden gezeigt. Die kursive Sequenz deutet den Teil des Oligonukleotids an, der für die PCR-Vervielfältigung des linearen Vektors erforderliche ist; die anderen Nukleotide stellen Homologiearme zu dem E. coli lacZ-Gen dar. Fett-gedruckte Sequenzen waren an beiden Enden des linearen Vektors vorhanden und bilden daher die terminalen Wiederholungen. Die linearen Vektorkonstrukte α-x weisen Sequenzwiederholungen verschiedener Längen auf. Der lineare Vektor enthält den p15A-Replikationsursprung zuzüglich des Chloramphenicol-Resistenzgens Cmr, flankiert durch die Homologiearme und die angedeuteten terminalen Wiederholungen.
    • B. Ein schematisches Diagramm der Strategie, die verwendet wurde, um die Vektorkonstrukte, die die verschiedenen Sequenzwiederholungen der A ent halten, auf ihre Effizienz bei der ET-Subklonierung des E. coli lacZ-Gens hinzutesten.
    • C. Tabelle, die die Wirkung der Länge der Wiederholungen und der Phosphorylierungen auf die Effizienz der ET-Subklonierung zeigt. Die Ergebnisse der Tests, die Vektoren verwenden, die die wiederholten Sequenzen enthalten, werden in der A gezeigt.
  • 9A–B. ET-Recombinationssubklonierung unter Verwendung von pBAD-αβγ(tet).
    • A. Diagramm des pR6K/BAD/αβγ-Plasmids, das den R6K-Ursprung, das pir-116-Replikon, das Tetryclin-Resistenzgen aus pBR322 (tetr) und den Arabinose-Repressor (araC) enthält.
    • B. Vergleich der ET-Rekombinationssubklonierung unter Verwendung von pBAD-αβγ(tet) (ColE1 ori) im Vergleich zu pR6K/BAD/αβγ.
  • 10A–B. Subklonierung eines 19 kb Fragments aus den AF-4-Gene, das auf BAC vorhanden ist.
    • A. Plasmidkonstrukte und Subklonierungsstrategie. Tetr, das Tetracyclin-Resistenzgen. araC, Arabinose-Repressor.
    • B. Analse von 5 unabhängigen Kolonien. Ein Ethidiumbromid-gefärbtes Gel einer HindIII verdauten DNA, die aus 5 unabhängigen, gerichteten Kolonien zubereitet wurde und richtige Kolonien und der lineare Vektor allein. Richtige Subklone wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. M, 1kb DNA-Leiter.
  • 11A–B. ET-Subklonierung unter Verwendung von genomischer DNA als Quelle für die Ziel-DNA.
    • A. Genomische DNA aus E. coli isoliert wurde, durch XhoI-Verdau vorlinearisiert. Der lineare Vektor bestand aus dem ColE1-Ursprung und den Kanamycin-Resistenzgen kan, flankiert von zwei Homologiearmen, die die Rekombination mit dem lacI/lacZ-Lokus, der auf dem E. coli-Chromosom vorhanden ist, steuern.
    • B. Restriktionsanalyse von 16 unabhängigen Kolonien. Die Spur 17 zeigt den linearen Vektor. M, 1 kb DNA-Leiter.
  • 12A–B. Subklonierung des Neomycingens neo aus genomischer Mäuse-ES-Zell-DNA.
    • A. Diagramm der Subklonierungsstrategie.
    • B. Restriktionsanalyse der Kanamycin-restistenten Kolonien.
  • 13. Kombination der ET-Klonierung und Subklonierung.
  • 5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen für die DNA-Klonierung und Subklonierung unter Verwendung bakterieller Rekombinase-vermittelter homologer Rekombination gerichtet. Der Erfinder hat entdeckt, daß bakterielle Rekombinasen in bestimmter Weise verwendet werden können, um hocheffiziente gerichtete Klonierung und Subklonierung zu erreichen.
  • Vorzugsweise ist die verwendete Rekombinase RecE/T und/oder Redα/β. Der RecE/T-Weg in E. coli ist zuvor beschrieben worden und seine Bestandteile sind zum Teil charakterisiert worden (Hall und Kolodner, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3205–3209; Gillen et al., 1981, J. Bacteriol. 145: 521–532). Die Rekombination über den RecE/T-Weg erfordert die Expression von zwei Genen, recE und recT, deren DNA-Sequenzen publiziert worden sind (Hall et al., 1993, J. Bacteriol. 175:277–278). Das RecE-Protein ist dem λ exo funktionell ähnlich, das auch Redα genant wird und das RedT-Protein ist dem Redβ und dem erf des Phagen P22 ähnlich (Gillen et al., 1977, J. Mol. Biol. 113:27–41; Little, 1967, J. Biol. Chem. 242:679–686; Radding und Carter, 1911, J. Biol. Chem. 246:2513–2518; Joseph und Kolodner, 1983; BioL Chem. 258:10411–17; Joseph und Kolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10418–24; Muniyappa und Radding; 1986. J. Biol. Chem. 261:7472–7478; Kmiec und Hollomon, 1981, J. Biol. Chem. 256:12636–12639; Poteete und Fenton 1983, J. Mol. Biol. 163:257–275; Passy et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 96:4279–4284, und darin zitierte Verweise).
  • Hierin werden Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die die Verwendung bakterieller Rekombinasen für die gestörte DNA-Klonierung und -Subklonierung betreffen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „DNA-Klonierung" das Verfahren der Einführung von DNA aus jeder Quelle in einen autonom-replizierbaren Vektor, so daß er in einer Wirtszelle vermehrt werden kann. Der Begriff „DNA-Subklonierung" bezeichnet ein Verfahren für den Transport von DNA-Fragmenten, die bereits in einem autonom-replizierenden Vektor vorhanden sind, in einen anderen autonom-replizierenden Vektor oder der Transport von DNA-Fragmenten aus einem hoch-angereicherten DNA-Molekül wie einem gereinigten viralen Genom oder einem DNA-Fragment, das zuvor durch PCR amplifiziert wurde, in einen autonom-replizierenden Vektor. Der Begriff „gesteuerte" oder „gezielte" Klonierung und Subklonierung bezeichnet die Verwendung von Homologiearmen und in verschiedenen Ausführungsformen von Adapteroligonukleotiden, um eine Ziel-DNA auszuwählen und die Orientierung der Insertion der Ziel-DNA durch die Wahl der Orientierung der Homologiearme zu bestimmen. Es sollte bemerkt werden, daß alle Anwendungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung sowohl auf Verfahren der Klonierung als auch der Subklonierung der DNA Anwendung finden.
  • Die Konstruktion der Zusammensetzungen in Verfahren der Erfindung wird hierin im Detail beschrieben. Insbesondere beschreibt der Abschnitt 5.1 vermittelte rekombinante Klonierungsverfahren der Erfindung für die gezielte Klonierung von DNA-Fragmenten durch homologe Rekombination. Der Abschnitt 5.2 unten beschreibt Zusammensetzungen der Erfindung, die DNA-Konstrukte umfassen, die entworfen wurden, um auf interessierende Ziel-DNA-Fragmente abzuzielen, sie zu fangen und zu klonieren. Beschrieben werden auch Nukleinsäuremoleküle, die für bakterielle Rekombinasen wie RecE/T- und/oder Redα/β-Proteine kodieren, Zellen enthaltend solche Zusammensetzungen und Verfahren für die Konstruktion solcher Nukleinsäuren und Zellen. Der Abschnitt 5.3 unten beschreibt die Verwendung von bekteriellen Klonierungsverfahren durch abgezielte Rekombinase und Kits für den Nachweis von Genexpression und Diagnose von Krankheitszuständen.
  • 5.1 Verfahren zur Klonierung und Subklonierung durch homologe Rekombination
  • Die verschiedenen hierin beschriebenen Verfahren können für die wirksame und gezielte Klonierung jeder interessierenden DNA durch bakterielle Rekombinase-vermittelte homologe Rekombination verwendet werden. Die drei hierin beschriebenen Ansätze haben als gemeinsame Bestandteile eine Zelle, die bakterielle Rekombinase Rekombinationsproteine exprimieren und einen Vektor. Ein Beispiel eines Vektors wird in der 1A gezeigt. Der Vektor enthält drei wesentliche Elemente: einen Replikationsursprung und zwei kurze Regionen doppelsträngiger DNA, die hierin „Homologiearme" genannt werden.
  • Die Homologiearme sind besonders entworfen, um es dem Vektor zu erlauben, eine interessierende Ziel-DNA durch homologe Rekombination zwischen dem Homologiearmen zu „fangen". Die Sequenz, Position und Orientierung der Homologiearme ist für die korrekte Insertion der Ziel-DNA zwischen den Armen wichtig. In einer Ausführungsform, bei der die Homologiearme eine Sequenzhomologie zu den Termini aufweisen, die die Target-DNA flankieren, korrespondieren die zwei Homologiearme in der Sequenz zu der DNA, die die interessierende Ziel-DNA flankiert, ein Arm (in der 1 als A angezeigt) korrespondiert zu einer DNA-Sequenz stromaufwärts von der Ziel-DNA (in der 1 als C angezeigt) und der zweite Arm (in der 1 als B angezeigt) korrespondiert zu einer Sequenz, die stromabwärts von der Ziel-DNA angeordnet ist (in der 1 als D angezeigt). Die Orientierung der zwei Arme relativ zu dem gewünschten Insert müssen dieselbe Orientierung sein, wie die der homologen Sequenz relativ zu der Ziel-DNA (siehe 1), so daß die Rekombination zwischen den Homologiearmen und der Ziel-DNA zu einer Ziel-DNA führt, die zwischen oder „innerhalb" (siehe 1) den zwei Homologiearmen eingeführt wird. Wie hierin verwendet, wird eine Position als innerhalb „der Homolgoiearme" definiert, wenn sie zwischen den zwei Homologiearmen positioniert ist, so daß ein erster Homologiearm zwischen dem Replikationsursprung und sich selbst positioniert ist und ein zweiter Homologiearm zwischen dem Replikationsursprung und sich selbst in der anderen Richtung positioniert ist. Auf der anderen Seite wird eine Position als „außerhalb" der Homologiearme definiert, wenn sich in einer Richtung keine der Homologiearme selbst vom Replikationsursprung abtrennt. Somit ist definitionsgemäß der Replikationsursprung und der selektierbare Marker auf dem Vektor „außerhalb" der Homologiearme (siehe 1) angeordnet, so daß die Insertion der Zielsequenz den Replikationsursprung und den selektierbaren Marker auf dem Plasmid bewährt. Auf der anderen Seite wird die Ziel-DNA definitionsgemäß „innerhalb" der Homologiearme eingefügt. Die 1A verdeutlicht bildlich die Bedeutung von „innerhalb" und „außerhalb" der Homologiearme.
  • In einer alternativen Ausführungsform weisen die Homologiearme eine Sequenzhomologie zu einem Satz doppelsträngiger Adapteroligonukleotide auf. Solche Adapteroligonukleotide werden in der 1B dargestellt. Die Sequenz jedes Adapteroligonukleotids umfaßt die Sequenz eines der Homologiearme des Vektors und zusätzlich eine Sequenz, die homolog zu einer Sequenz ist, die das interessierende Zielgen flankiert (siehe 1C). Somit enthält ein Adapteroligonukleotid eine Homologie zu einer DNA-Sequenz eines Homologiearms (in der 1 als A' angezeigt) und eine Nukleotidsequenz stromaufwärts von der Ziel-DNA (in der 1 als C' angedeutet). Das zweite Adaptor-Oligonukleotid enthält eine Homologie zu einer DNA-Sequenz eines Homologie-Armes (als B' in der 1 angedeutet) sowie eine Nukleotidsequenz, die stromabwärts von der Ziel-DNA angeordnet ist (in der 1 als D' angezeigt). In dieser Weise können Adaptor-Oligonukleotide verwendet werden, um einen genetischen Homologie-Klonierungsvektor anzupassen, um auf eine spezifische interessierende Gensequenz durch die Variation der Sequenz des Adaptor-Oligonukleotids abzuzielen (siehe 5). Die Verfahren und Zusammensetzungen, die verwendet werden können, um die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung auszuführen, werden hierin im Detail beschrieben.
  • Die unten beschriebenen Verfahren umfassen drei alternative Ansätze, um die Klonierung durch homologe Rekombination zu steuern. Wie im Detail unten beschrieben hat jeder dieser drei Ansätze seiner Vorteile, die ihm bei einer besonderen Klonierungsanwendung bevorzugt machen. Diese Verfahren und Anwendungen werden unten detailliert beschrieben. In einem Ansatz der in der 2 dargestellt wird, wird das Klonierungsvehikel in eine Zelle eingeführt, die die interessierende Ziel-DNA enthält. Dieser erste Ansatz kann verwendet werden, um bequem ein Insert von einem Replikon zu einem anderen zu transportieren ohne die Notwendigkeit für schwierige Restriktionsanalyse und in vitro Handhabungen. Dieser Ansatz ist für die Anwendungen nützlich in denen die Ziel-DNA bereits in einem E. coli Replicon vorliegt und seine weitere Verwendung die Subklonierung eines ausgewählten Teils erfordert. Beispielsweise wird die Verwendung eines DNA-Klons, der aus einer Kosmid-, einem Phagen- oder einer BAC-Bibliothek isoliert wird, durch die Subklonierung gewählter Teile in einen neuen Vektor ermöglicht, um das Insert zu sequenzieren oder das durch das Gen kodierte Protein zu exprimieren. In einem zweiten Ansatz der in der 3 dargestellt wird, werden der Klonierungsvektor und die interessierende Ziel-DNA vorbereitet und dann zusammen zu einer Zelle hinzugefügt. Alternativ kann, wie in der 4 gezeigt die interessierende DNA zu einer Zelle hinzugefügt werden, die bereits den Klonierungsvektor enthält. Die letzteren zwei Ansätze sind für die Anwendungen nützlich in denen die Ziel-DNA aus einer externen Quelle abgeleitet ist wie beispielsweise DNA, die aus einer Krebszelle abgeleitet wird.
  • 5.1.1 Vorgehensweise 1: Einführung des Vektors in die Wirtszelle, die Ziel-DNA enthält
  • In einer Ausführungsform wie in der 2 dargestellt ist die Ziel-DNA-Sequenz bereits in einer Wirtszelle vorhanden, die eine bakterielle Rekombinase exprimiert. Beispielsweise kann die Ziel-DNA auf einem unabhängig replizierenden DNA-Molekül , wie, aber nicht darauf beschränkt, auf einem Plasmid, einem Phagen, einem bakteriellen artifiziellen Chromosom (BAC) oder dem Beginn E. coli Chromosom in eine E. coli Wirtszelle liegen. Verfahren für die Konstruktion von Wirtszellen, die eine bakterielle Rekombinase wie die RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase exprimieren werden im Detail im Abschnitt 5.2.2 beschrieben.
  • Die Vektor DNA, die einen Replikationsursprung umfaßt und zwei Homologie-Arme, die auf jeder Seite des Ursprungs angeordnet sind, und der Marker wird in die Wirtszelle eingeführt. Vorzugsweise ist der Vektor ein lineares Molekül und die Homologie-Arme sind an den jeweiligen Enden des linearen Moleküls angeordnet obwohl sie auch innen liegen können. Nach dem Eintreten in die Zelle führt die homologe Rekombination zwischen den Homologie-Armen der Vektor-DNA und der Zielsequenzen zu einer Einführung der Ziel-DNA zwischen die Homologie-Arme und der sich daraus ergebenden Bildung eines zirkulären Episoms. Die Zellen werden dann auf selektivem Medium ausplatziert, um auf die Gegenwart des selektiven Markers auf dem Vektor hinzu selektieren. Da nur zirkularisierte Moleküle zur Replikation und zur Selektion der Wirtszelle in der Lage sind, werden viele Zellen, die auf selektivem Medium wachsen, die rekombinierten Moleküle, die die Ziel-DNA enthalten, umfassen.
  • In einer Ausführungsform können die Enden des linearen DNA-Vektorfragments mit modifizierten Nukleotiden blockiert werden, um die Anzahl der Ereignisse zu verringern, die durch die Verbindung der Enden des linearen Fragments durch jedes andere Mittel als die homologe Rekombination d.h. die unzulässige Rekombination, zu verringern. Solche modifizierten Nukleotide z.B. Phosphothionat-Nukleotide können in das 5'-Endnukleotid des Homologie-Arms aufgenommen werden. Die modifizierten Nukleotide können hier mit der Oligonukleotid-Synthese eines Primers aufgenommen werden, der verwendet wird um den Vektor (siehe Abschnitt 5.2.1 unten) zu konstruieren und alternativ durch enzymatische oder chemische Modifikation des Oligonukleotids oder des linearen DNA-Vektors nach der Synthese hinzugefügt werden. Verfahren für die Modifikation von Oligonukleotiden und linearer DNA-Fragmente sind im Stand der Technik gut bekannt und werden im Detail im Abschnitt 5.2.2 unten beschrieben.
  • 5.1.2 Vorgehensweise 2: Gleichzeitige Einführung eines Vektors und der Ziel-DNA in die Wirtszelle
  • In einer weiteren Ausführungsform, wie in der 3 dargestellt, wird die Vektor-DNA und die Ziel-DNA in vitro gemischt und dann gemeinsam in eine Zelle, die RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase enthält, eingeführt. Die Ziel-DNA kann aus jeder Quelle abgeleitet werden. Beispielsweise kann die Ziel-DNA aus einer biologischen Probe erhalten werden, wie, aber nicht eingeschränkt auf, Gesamtblut, Plasma, Serum, Haut, Speichel, Urin, Lymphflüssigkeitszellen, die aus einem Biopsie-Aspirat gewonnen werden Gewebekulturzellen, Medien oder nicht-biologischen Proben wie Lebensmittel, Wasser oder andere Materialien. Verfahren für die Zubereitung von DNA aus solchen Quellen sind dem Fachmann wohlbekannt (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology Serien der Labortechnikhandbücher, 1987–1994 Current Protocols, 1994–1997 John Wiley and Sons, Inc.).
  • Der Vektor und die Ziel-DNA werden vorbereitet und in vitro gemischt und dann in die Zellen, die die bakteriellen Rekombinase-Proteine exprimieren, gemeinsam eingeführt, vorzugsweise durch Transformation in E. coli durch Co-Elektroporation. Die Vektor-DNA kann in der Form einer linearen DNA oder einer zirkularen Plasmid-DNA vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein lineares DNA-Molekül. Die Quelle der Ziel-DNA wird im Überschuß zu oder im relativen Überschuß zu der Vektor-DNA gemischt, um so viele Kopien der interessierenden Ziel-DNA-Region in die Zellen einzführen, wie möglich wodurch die Ausbeute der rekombinanten Produkte maximiert wird. Die Zellen werden im selektiven Medium wachsen gelassen, um auf zirkularisierte Produkte zu selektionieren. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor einen antibiotischen Resistenzmarker und die Zellen werden in der Gegenwart eines Antibiotikums wachsengelassen. Die Kolonien, die dazu in der Lage sind unter einer solchen Selektion zu wachsen, enthalten zirkularisierte, rekkombinierte Formen des linearen Fragments.
  • In einer Ausführungsform können die Enden des linearen Vektor-DNA-Fragments mit modifizierten Nukleotiden, wie unten in Abschnitt 5.2.1 beschrieben, blockiert werden. Ver fahren für solche Modifikationen von Oligonukleotiden sind im Stand der Technik wohlbekannt wie in Abschnitt 5.2.2 unten beschrieben.
  • Dieser Ansatz ist besonders nützlich, wenn die Ziel-DNA aus einer Quelle gewonnen wird, die außerhalb von E. coli liegt, wie Hefe oder eukaryotische Zellen. In einer Ausführungsform kann dieses Verfahren für diagnostische Zwecke verwendet werden, um die Gegenwart einer bestimmten DNA in jeder biologischen Probe nachzuweisen. Beispielsweise kann das Verfahren verwendet werden, um die Gegenwart eines spezifischen Östrogenrezeptors oder eines BRCA 1 Allels in einer Biopsieprobe, die aus einer Brustkrebspatientin entnommen wurde, nachzuweisen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Verfahren verwendet werden, um DNA-Regionen zu vervielfältigen, als eine Alternative zur Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR). Die Vervielfältigung durch homologe Rekombination, Klonierung und Vermehrung in E. coli bietet mehrere Vorteile gegenüber auf PCR-beruhenden Verfahren. Zuerst können die Fehler der PCR einen wesentlichen Nachteil für viele Zwecke darstellen. Die Verbindungen von PCR-Primerpaaren neigen dazu zufällige Reaktionsprodukte zu erzeugen. Darüberhinaus erhöht sich die Zahl der Fehler im Endprodukt exponentiell mit jeder PCR-Vervielfältigungsrunde nachdem ein Fehler in eine DNA-Probe eingeführt worden ist. Auf der anderen Seite hat die Vervielfältigung durch die homologe Rekombination den Vorteil, der zellulären Korrekturlesemaschine in E. coli, die daher mindestens bis zu tausendmal genauer ist. Zweitens gibt es weniger Beschränkungen im Hinblick auf die Größe der DNA-Region, die unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens vervielfältigt werden kann. Die Vervielfältigung von DNA-Regionen, die länger als einige wenige Kilo-Basen sind (größer als 5–10 kb) ist unter Verwendung von PCR-Verfahren schwierig. Das vorliegende Verfahren ist für die Klonierung viel größerer Regionen mindestens für etwa 100 Kilo-Basen geeignet. Gegenwärtig beinhaltet die Klonierung eines Genoms die langwierigen Prozesse der Erzeugung großer zufälliger Bibliotheken gefolgt von dem Durchsortieren und Anordnen der individuellen Klone. Unter Verwendung dieses Verfahrens können Homologie-Arme entworfen werden und Vektoren konstruiert werden, um die Klonierung eines Genoms in große nicht-redundante zusammenhängende Klone, die „Contigs" genannt werden, zu steuern. Drittens müssen, selbst nachdem die DNA durch ein PCR-Verfahren hergestellt wurde, die PCR-Produkt ein einem zusätzlichen Bearbeitungsschritt kloniert werden. Die homologe Rekombinations-Klonierungstechnik beseitigt das Erfordernis für einen zusätzlichen Subklonie rungsschritt. Die DNA-Region, die vervielfältigt vervielfältigt werden soll, wird einfach zwischen den Homologie-Armen eingeführt und mit der Vektor-DNA in einem E. coli-Wirt transformiert.
  • Die homologe Rekombination in dieser Ausführungsform kann vor dem Hinzufügen der DNA zu den Zellen in vitro ausgeführt werden. Beispielsweise kann isoliertes RecE und RecT oder Zellextrakte die RecE/T enthalten, zu der gemischten DNA hinzugefügt werden. Wenn die Rekombination in vitro erfolgt, kann die Selektion der DNA-Moleküle durch Transformation des Rekombinationsgemisches in eine geeignete Wirtszelle und Auswahl auf positive Klone, wie oben beschrieben, erreicht werden.
  • 5.1.3 VORHERGEHENSWEISE 3: EINFÜHRUNG EINER ZIEL-DNA IN WIRTSZELLEN, DIE VEKTOR-DNA ENTHALTEN
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Ziel-DNA in eine Zelle eingeführt, die bereits eine Vektor-DNA enthält. Die Ziel-DNA kann von jeder Quelle stammen wie in 5.1.2 oben beschrieben und entweder von linearer oder zirkulärer Form sein. Wie oben beschrieben führt die homologe Rekombination zwischen den Homologie-Armen und der Ziel-DNA sobald die Ziel-DNA innerhalb der Zelle ist zur Insertion der Ziel-DNA zwischen die Homologie-Arme. In diesem Fall ist jedoch Gegenselektion erforderlich, um gegen nichtrekombinierten Vektor zu selektionieren, da sowohl das gewünschte Produkt und der nicht rekombinierte Vektor das selektierbare Markergen exprimieren. Verschiedene Ausführungsformen werden hierin im Detail beschrieben, um die Gegenselektion zu erreichen. In einer Ausführungsform kann ein Verfahren, das eine ortsspezifische Rekombination und eine Ausschnittsreaktion verwendet, benutzt werden. Dieser Ansatz ist in der 5 dargestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird eine induzierbare Nuklease induziert, die den unrekombinierten Vektor schneidet. In beiden Ausführungsformen werden Vektoren, die keine Rekombinationsprodukte enthalten, eliminiert.
  • Der Vektor wird zuerst als Plasmid konstruiert, dann in die Wirtszelle eingeführt, wo er vermehrt werden kann. Wie in der 5 gezeigt enthält der Vektor (i) einen Replikationsursprung (von jeder Quelle); (ii) einen selektierbaren Marker (Sm); (iii) zwei Homologie-Arme; und (iv) einen gegenselektierbaren Marker, wie, aber nicht beschränkt auf, ein Paar Erkennungsstellen für eine Orts-spezifische Rekombinase, eine erste Erkennungsstelle, die außerhalb der Homologie-Arme angeordnet ist, und eine zweite Erkennungsstelle, die innerhalb der Homologie-Arme angeordnet ist, oder eine Erkennungsstelle für eine Endonuklease, die verwendet werden kann, um gegen den Ausgangs-Plasmidvektor zu selektionieren. Wie hierin verwendet ist eine Stelle „innerhalb der Homologie-Arme" angeordnet, wenn sie zwischen zwei Homologie-Armen angeordnet ist, so daß ein erster Homologie-Arm zwischen dem Replikationsursprung und sich selbst in einer Richtung liegt und ein zweiter Homologie-Arm ist zwischen dem Replikationsursprung und sich selbst in der anderen Richtung angeordnet ist. Auf der anderen Seite wird eine Position als „außerhalb" der Homologie-Arme definiert, wenn sich in einer Richtung keiner der Homologie-Arme selbst von dem Replikations-Ursprung trennt (siehe 1 für eine bildliche Darstellung der Bedeutung von „innerhalb" im Vergleich zu „außerhalb" der Homologie-Arme). Der Replikationsursprung und der selektierbare Marker muß außerhalb der Homologie-Arme angeordnet sein wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, so daß die Insertion der Zielsequenz den Replikationsursprung und den selektierbaren Marker auf dem Plasmid erhält. Der gegenselektierbare Marker, die Endonukleasestelle oder eine oder zwei der Orts-spezifischen Rekombinase-Zielstellen ist vorzugsweise „innerhalb" der Homologiearme angeordnet (siehe 5) auf der anderen Seite des Replikationsursprungs und des selektierbaren Markers.
  • Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das die Gegenselektion gegen den nicht rekombinierten Vektor erlaubt, kann verwendet werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform die Gegenselektion durch eine induzierbare Orts-spezifische Rekombinase (SSR = „site-specific recombinase") erreicht werden. Orts-spezifische Rekombinaseenzyme, die zwei Zielstellen erkennen, die Orts-spezifische Rekombinasezielstellen genannt werden (SST = „site-specific recombinase target sites) und die als Orte dienen, um einen DNA-Strang-Austausch und eine Ausschneidereaktion zu vermitteln (Hallet et al., FEMS Microbiol. Rev., 1997, 21:157–78; Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:521–7; Stark et al., 1992, Trends Genet., 8: 432–9). Beispiele Orts-spezifischer Rekombinasen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Cre-, Flp-, Kw- oder R-Rekombinasen (Nunes-Duby et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:391–406; Ringrose et al., 1997, Eur. J. Biochem. 248: 903–912; Utatsu et al., 1987, J. Bacterial. 169: 5537–5545). Wenn zwei gerichtete SSRTs auf einem zirkulären Plasmid liegen, führt die Orts-spezifische Rekombination zwischen den zwei SSRTs zur Bildung zweier zirkulärer Plasmide. Nur das Produkt, das den Replikationsursprung enthält, wird in der Zelle erhalten. Somit führt die Ortsspezifische Rekombination zwischen zwei direkt wiederholten SSRTs in einem zirkulären Plasmid zur Deletion der DNA-Sequenz, die zwischen den SSRTs auf der Seite liegt, die nicht den Replikationsursprung umfaßt.
  • Ein DNA-Vektor wird konstruiert, der zwei SSRTs enthält, die als gerichtete Wiederholung angeordnet sind. Eine wird innerhalb der Homologiearme positioniert und eine zweite außerhalb der Arme und zwischen dem selektierbaren Marker (SM) und im Replikationsursprung positioniert. Die Rekombination zwischen dem SSRT, die in dieser Weise positioniert sind, führt zur Trennung des Replikationsursprungs vom selektierbaren Marker (siehe 5). Somit wird die SSR auf nicht rekombinierte DNA-Vektoren wirken die zwei SSRTs enthalten, was zum Verlust eines solchen Plasmides aus der Wirkzelle führt.
  • Wirtszellen werden dann mit der Vektor-DNA durch Standardverfahren transformiert. In dieser Ausführungsform muß die Wirtszelle enthalten: 1) RecE/T und/oder Redα/β-Gene und 2) ein Gen, das für ein SSR kodiert. Vorzugsweise ist die Expression der RecE/T- und/oder Redα/β-Gene induzierbar aber die konstitutive Expression ist auch möglich. Das Gen, das für eine Orts-spezifische Kinase (SSR) kodiert, die die SSRTs erkennt, muß induzierbar sein. Induzierbare konstitutive Promotoren sind im Stand der Technik wohl bekannt; Verfahren für deren Verwendung bei der Konstruktion Expression-rekombinanter Gene werden im Abschnitt 5.2.3 unten beschrieben. Wenn die RecE/T- und/oder Redα/β-Gene für die Expression eine Induktion erfordern, werden die Vektor-enthaltenden Zellen unter Bedingungen wachsen gelassen, um die Expression unmittelbar bevor die kompetenten Zellen hergestellt werden zu induzieren. Die Wirtszellen, die Vektor-DNA enthalten werden durch das Plazieren und Wachsenlassen in selektivem Medium ausgewählt und erhalten.
  • Die kompetenten Zellen werden dann aus den Wirtszellen, die den Vektor enthalten, zubereitet. Die Zellen werden mit der Ziel-DNA transformiert die aus jeder Quelle zubereitet werden kann z.B. genomische Gesamt-DNA, die aus einer beliebigen Zelle zubereitet wird. Die Zellen werden kurz kultiviert, um es der homologischen Kombination zu erlauben, aufzutreten. Die homologe Kombination führt zu der Deletion zwischen den Homologiearmen, die ein SSRT enthalten, und zur Insertion der Zielgensequenz. Die Expression der SSR wird dann induziert. Die SSR wird auf die direkt wiederholten SSRTs in dem nicht rekominierten Vektor wirken, die den selektierbaren Marker von dem Replikationsursprung des Plasmids trennen. Plasmide, die ein Einfügungsziel tragen, weisen nur ein SSRT auf und bleiben intakt. Die Selektion kann während dieses Schrittes aufrecht erhalten werden oder nicht, muß aber bald nach der Induktion der SSR auferlegt werden, d.h. bald nach dem die Orts-spezifische Rekombination stattfindet. In dieser Weise führt die Induktion der SSR zur Auswahl von Plasmiden, die die Einfügungszielgene enthalten.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann eine Endonuklease verwendet werden, um den Vektor zwischen den Homologiearmen in vivo zu linearisieren, entweder kurz vor, während oder nach der homologen Rekombination. Die Linearisierung des Vektors vor der Rekombination wird die korrekten Rekombinationsprodukte auswählen, da ein lineares Plasmid in den Zellen nicht überleben wird, wenn es nicht zirkularisiert wird. Nach der Rekombination wird die fortdauernde Aktivität der Endonuklease dabei helfen Plasmide auszuwählen, die Einfügungen enthalten, da während der homologen Rekombination die SSR die Endonuklease-Erkennungsstelle erkennt und die Ziel-DNA an ihrer Stelle einfügt. Da die Endonuklease nur nicht-rekombinierte Vektoren spalten wird, wobei Plasmide mit eingeführten Zielsequenzen intakt bleiben, wird die fortgesetzte Aktivität der Endonuklease nach der Rekombination gegen nicht rekombinierte Produkte selektionieren. Für diese Ausführungsform muß eine Endonuklease mit einer sehr seltenen Erkennungssequenz verwendet werden, so daß keine andere Stelle in der Wirtszellen-DNA vorhanden ist. Beispiele solcher „seltenen Schneider" sind im Stand der Technik bekannt, umfassen, sind aber nicht beschränkt, auf Lambda cos, Hefe HO oder eine Intron-kodierte Endonuklease wie PI-SceI. Die Erkennungstelle für die Endonuklease sollte zwischen zwei Homologiearme kloniert werden, so daß der enzymatische Verdau durch die Endonuklease zur Linearisierung des Vektors zwischen den Homologiearmen führt. Die Expression des Endonukleasegens muß induzierbar sein. Konstrukt und Verfahren für die induzierbare Proteinexpression werden unten im Abschnitt 5.2.4 diskutiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine SSR, beispielsweise die Cre-Rekombinase statt einer Endonuklease verwendet werden, um den nicht-rekombinierten Vektor in vivo zu linearisieren (siehe Mullins et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:2539–40). In diesem Fall wird der Vektor nur mit einer SSRT-Stelle, die innerhalb der Homologiearme angeordnet ist, konstruiert. Ein Überschuß des Oligonukleotids, der eine Kopie des selben SSRT-Oligonukleotids enthält, wird mit der Ziel-DNA gemischt und in die Wirtszelle mit der Ziel-DNA ko-transformiert. Vorzugsweise ist das Oligonukelotid ein kurzes doppelsträngiges DNA-Molekül. Wenn eines der rekombinierten Moleküle ein SSRT aufweist, das auf einem kurzen Oligonukleotid liegt, wird die orts-spezifische Rekombinase den Vektor an seinen SSRTs linarisieren (Mullin et al., 1997, supra).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Orts-spezifischen Rekombination können die oben beschriebenen Orts-spezifischen Rekombinase-Endonukleaseansätze kombiniert werden. In diesem Fall wird der unrekombinierte Vektor hergestellt, so daß er sowohl ein SSRT oder eine Endonuklease-Stelle innerhalb der Homologiearme aufweist. In einer Ausführungsform dieses Ansatzes könnte die SSR und die Endonuklease unter Kontrolle eines einzelnen induzierbaren Promotors ko-reguliert werden. Konstrukt und Verfahren für eine solche koregulierte Expression der Proteine wird im Abschnitt 5.2.3 unten diskutiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine Kombination dieser Verwendung der Orts-spezifischen Rekombination für die Gegenselektion eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform werden zwei SSR/SSRT-Paare beispielsweise Cre/lox und Flp/FRT verwendet. Der Vektor enthält zwei Stellen für die erste SSR, SSR1, eine innerhalb der Homologiearme angeordnet und die zweite außerhalb der Homologiearme zwischen dem Replikationsursprung und dem selektierbaren Marker angeordnet. Zusätzlich enthält der Vektor eine Stelle für die zweite SSR, SSR2, die innerhalb der Homologiearme angeordnet ist. Eine weitere Stelle für SSR2 ist auf einem kurzen doppelsträngigen Oligonukleotid angordnet und wird zusammen mit der Ziel-DNA während der Zelltransformation in einer Menge, die im Überschuß zur Ziel-DNA ist, zugefügt. In einer besonderen Ausführungsform ist beispielsweise ein SSR/SSRT-Paar für den Linearisierungsschritt Cre/loxP und das zweite für den Selektionsschritt Flp/FRT.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine direkte Gegenselektion gegen die Zelle verwendet werden. In diesem Fall steuert der Replikationsursprung des Plasmids den Einzelkopie- (oder sehr niedrigen Kopie) Erhalt in E.coli. Die Replikationsursprünge dieser Klasse umfassen die Iteron-Klasse der Ursprünge wie den Phage PI-Ursprung und Plasmide, die auf dem E. coli chromosomalen Ursprung, oriC beruhen. Für geeignete Replikationsursprünge siehe Helinski, D.R., Toukdarian, A.E., Novick, R.P. Kapitel 122, S. 2295–2324 in „Escherichia Coli und Salmonella, Cellular and Molecular Biology", zweite Ausgabe Frederick C. Niedhardt, Heraus. ASM Press, Washington, 1996, ISBN 1-55581-084-5. In diesem Fall kann der Vektor ohne SSRTs konstruiert werden, stattdessen wird ein gegenselektierbares Gen zwischen den Homologiearmen aufgenommen. Solche Gen-selektierbaren Markergene, wie beispielsweise die sacB-, ccdB- oder Tetracyclin-Resistenzgene, sind im Stand der Technik bekannt und können verwendet werden (siehe auch Reyrat et al., 1998. Infect. Immun. 66:4011–7 für eine Auflistung geeigneter gegenselektierbarer Gene und Verfahren). Die beabsichtigte homologe Rekombinationsreaktion wird das gegenselektierbare Gen entfernen, so daß die Zellen, die das beabsichtigte Rekombinationsprodukt tragen, unter Gegenselektionsdruck überleben werden wobei die Zellen, die den unrekombinierten Vektor tragen, getötet werden.
  • 5.2 ZUSAMMENSEZTUNG FÜR DIE KLONIERUNG UND SUBKLONIERUNG DURCH HOMOLOGE REKOMBINATION
  • Zusammensetzung für die Klonierung durch homologe Rekombination in verschiedenen Ausführungsformen werden hierin beschrieben. Für das in Abschnitt 5.2 unten beschriebene Klonierungsverfahren ist es erforderlich, daß drei Bestandteile in einer einzelnen Zelle ko-existieren: Zuerst ein Vektor, der zwei kurze DNA-Regionen trägt (hierin „Homologiearme" genannt) von denen jeder eine Sequenzhomologie zu einer Nukleotidsequenz aufweist, die die Zielsequenz flankiert; Zweitens RecE/T- und/oder Redα/β-Proteinpaare oder einer andere bakterielle Rekombinase; und drittens die Ziel-DNA-Sequenz. Die Rekombination zwischen diesen homologen Sequenzen, die auf dem Homologiearm vorhanden sind, und den Regionen, die das Zielgen flankieren, vermittelt durch eine bakterielle Rekombinase führt dazu, daß die Ziel-DNA zwischen die Homologiearme eingeführt oder dazwischen „gefangen" wird. Die Zusammensetzung und die Verfahren für die Konstruktion werden hierin im Detail beschrieben.
  • 5.2.1 HOMOLOGIE-KLONIERUNGSVEKTOR
  • Der Homologie-Klonierungsvektor kann ein linearer oder ein zirkulärer DNA-Vektor sein, der einen Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker und zwei kurze DNA-Regionen umfaßt, die entworfen sind, um eine interessierende Ziel-DNA zu fangen. Mehrere Formen der Klonierungsvehikel sind möglich, abhängig von dem zu verwendenden Ansatz oder Verfahren. Die bevorzugten Formen und Verfahren für deren Konstruktion werden in den 1–5 dargestellt und werden hierin im Detail beschrieben.
  • 5.2.1.1 REPLIKATIONSURSPRUNG
  • Der Vektor erfordert ein Replikationsursprung der für die Replikation und die Fortpflanzung des Plasmids erforderlich ist. Für die Klonierung und Fortpflanzung in E.coli, kann jeder E.coli-Replikationsursprung verwendet werden, Beispiele davon sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and darin enthalten). Nicht einschränkende Beispiele von ohne weiteres erhältlichen Plasmid-Replikationsursprünge sind die ColE1-abgeleiteten Replikationsursprünge (Bolivar et al., 1977, Gene 2:95–113; siehe Sambrook et al., 1989, supra), die p15A-Ursprünge, die in Plasmiden wie pACYC184 vorhanden sind (Chang und Cohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56; siehe auch Miller, 1992, p. 10.4–10.11), und der pSC101-Ursprung, der für die Expression für Plasmide mit niedriger Kopienzahl erhältlich ist, sind alle gut im Stand der Technik bekannt.
  • Beispielsweise wird in einer Ausführungsform der Replikationsursprung von einem Plasmid mit hoher Kopienzahl verwendet wie ein Plasmid, das einen ColE-1-Replikationsursprung enthält, von dem Beispiele im Stand der Technik wohl bekannt sind (siehe Sambrook et al., 1989, supra; siehe auch Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, und darin enthaltene Zitate). Ein Beispiel ist ein Ursprung aus pUC 19 und seinen Derivaten (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103–119). pUC-Vektoren existieren in Mengen von 300–500 Kopien pro Zelle und haben günstige Klonierungsstellen für die Insertion fremder Gene. Für sehr hohe Expression können λ-Vektoren, wie λgt 11 (Huynh et al., 1084 in „DNA Klonierungstechniken:, Band I: A Practical Approach", D. Glover, hir., S. 49–78, IRL Press, Oxford), oder die T7- oder SP6-Phagepromotoren in Zellen, die T7- und SP6-Polymerase-Expressionssysteme enthalten (Studier et al., 1990, Methods Enzymol. 185:60–89) verwendet werden.
  • Wenn ein niedrigerer Expressionslevel erwünscht ist, kann ein Replikationsursprung mittlerer oder niedriger Kopienzahl verwendet werden. Plasmide mittlerer Kopien-Zahl sind im Stand der Technik gut bekannt, wie pBR322 das einen ColE1-abgeleiteten Replikationsursprung und 20–100 Kopien pro Zelle aufweist (Bolivar et al., 1977, Gene 2:95–113; siehe Sambrook et al., 1989, supra) oder pACYC 184 eines der pACYC 100-Plasmidserie, das einem p15A-Replikationsursprung aufweist, und mit 10–12 Kopien pro Zelle vorliegt (Chang and Cohen, 1987, J. Bacteriol. 134:1141-56; siehe auch Miller, 1992, S. 10.4–10.11). Plasmide niedriger Kopienzahl wie beispielsweise pSC101, das einen pSC101-Ursprung und ungefähr 5 Kopien pro Zelle aufweist, sind auch im Stand der Technik gut bekannt. Sowohl die pACYC- und die pSC101-Plasmidvektoren haben günstige Klonierungsstellen und können in der selben Zelle als pBR- und pUC-Plasmide ko-existieren, da sie einen kompatiblen Replikationsursprung und einzigartige selektive antibiotische Marker aufweisen. Andere geeignete Plasmid-Replikationsursprünge umfassen auf Lambda oder Phage-P1-beruhende Plasmide, beispielsweise die Lorist-Serie (Gibson et al., 1987 Gene 53:283-286).
  • Wenn noch weniger Expression erwünscht ist, kann der Replikationsursprung aus dem bakteriellen Chromosom erhalten werden (siehe Miller, 1992, supra; Niedhardt, F.C., ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Yarmolinsky, M.B. and Stemberg, N., 1988, S. 291–438, in Band. 1 des The Bacteriophages, R. Calender, Heraus. Plenum Press, New York). Zusätzlich können synthetische Replikationsursprünge verwendet werden.
  • 5.2.1.2 DER SELEKTIERBARE MARKER
  • Um den Plasmidvektor in der Zelle zu bewahren, enthält der Vektor typischerweise einen selektierbaren Marker. Jeder selektierbare Marker, der im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Für die Konstruktion eines E.coli-Vektors kann jedes Gen, das eine Resistenz gegenüber einem beliebigen Antibiotikum vermittelt, das in E.coli wirksam ist, oder es kann jedes Gen, das ohne weiteres identifizierbare oder selektierbare phänotypische Änderung vermittelt, verwendet werden. Vorzugsweise werden antibiotische Resistenzmarker, wie das Kanamycin-Resistenzgen aus TN903 (Friedrich und Soriano, 1991, Genes. Dev. 5:1513–1523) oder Gene, die eine Resistenz gegenüber Aminoglykosiden (umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Dihydrostreptomycin, Gentamycin, Neomycin, Paramocin und Streptomycin) vermitteln, das β-Laktamasegen aus IS1, das eine Resistenz gegenüber Penicillin vermittelt (umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Ampicillin, Carbenicillin, Methicillin, Penicillin N, Penicillin O und Penicillin V), verwendet. Andere selektierbare Gensequenzen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Gensequenzen, die für Polypeptide kodieren, die Zeocin-Resistenzen vermitteln (Hegedus et al. 1998, Gene 207:241–249). Andere Antibiotika, die verwendet werden können, sind Gene, die eine Resistenz gegenüber Amphenicol vermitteln, wie Chloramphenicol, beispielsweise kann die kodierende Sequenz für die Chloramphenicol-Transacetylase (CAT) verwendet werden (Eikmanns et al. 1991, Gene 102:93–98). Wie vom Fachmann erkannt werden wird, können andere nicht-antibiotische Verfahren verwendet wer den, um auf den Erhalt des Plasmids zu selektieren, wie beispielsweise eine Vielzahl von auxotrophen Markern (siehe Sambrook et al., 1989, supra; Ausubel et al., supra).
  • 5.2.1.3 DIE HOMOLOGIEARME
  • Ein erforderlicher Bestandteil des Vektors sind zwei kurze Regionen doppelsträngiger DNA, die hierin als „Homologiearme" bezeichnet werden. In einer Ausführungsform, wie in der 1 gezeigt, sind die Homologiearm (markiert als „A" und „B") homolog zu der Sequenz der DNA, die die interessierende Ziel-DNA flankiert (markiert als „A" und „B"), wobei ein Arm zu einer DNA-Sequenz stromaufwärts von der Ziel-DNA ist und der zweite Arm homolog zu einer Sequenz ist, die stromabwärts von der Ziel-DNA angeordnet ist. Wie hierin verwendet sind zwei doppelsträngige DNA-Moleküle „homolog", wenn sie einen gemeinsamen Bereich der Identität aufweisen, der ggf. durch eine oder mehrere Basenpaarunterschiede unterbrochen ist und wenn sie dazu in der Lage sind, als Substrate für die homologe Rekombination zu wirken. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Homologiearme ungefähr 22 bis 100 Basenpaare oder mehr mit kontinuierlicher Identität zu einer doppelsträngigen Region, die die interessierende Ziel-DNA flankiert. Die Homologieregionen können durch eine oder mehrere nicht-identische Reste unterbrochen sein unter der Voraussetzung, daß die Homologiearme immer noch wirksame Substrate für die homologe Rekombination darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Homologiearme für eine optimale Rekombinationseffizienz eine Länge von etwa 50 Nukleotiden auf, mit im Bereich von 20–30 (z.B. 25) Basenpaaren kontinuierlicher ununterbrochener Sequenzidentiät. Obwohl auch große Regionen der kontinuierlichen Identität möglich sind (z.B. mindestens 6, 8 oder 10 Basenpaare), können niedrigere Rekombinationseffizienzen bei Verwendung solch kürzerer Regionen kontinuierlicher Identität erwartetet werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform die Länge der kontinuierlichen Identität so kurz wie 6 bp sein (Keim und Lark, 1990, 1. Structural Biology 104:97–106). Es gibt keine obere Grenze für die Länge der Homologiearme oder für die Länge ihrer kontinuierlichen Identität zu der flankierenden DNA-Sequenz.
  • Nukleotidsequenzen, die eine Ziel-DNA flankieren, werden hierin auch als die „Termini" bezeichnet, die die Ziel-DNA flankieren. Somit wird eine Ziel-DNA zwei Termini aufweisen, einen ersten Terminus und einen zweiten Terminus. Die Orientierung der zwei Arme relativ zu dem gewünschten Insert muß die selbe sein, wie die Orientierung der homologen Sequenz relativ zur Ziel-DNA (siehe 1), so daß die Rekombination zwischen den Homologiearmen und dem ersten und zweiten Termini der Ziel-DNA dazu führt, daß die Ziel-DNA zwischen die zwei Homologiearme eingeführt wird.
  • Die Sequenzen der zwei Homologiearme werden gemäß dem experimentellen Design gewählt. Die einzigen Beschränkungen bei der Wahl des Homologiearms besteht darin, daß er keine Sequenz aufweisen sollte, die mehr als einmal innerhalb der Ziel-DNA gefunden wird und während der homologen Rekombinationsreaktion nirgendwo sonst in der Wirtszelle vorhanden sein sollte. In diesem Fall kann das gewünschte Rekombinationsprodukt immer noch erhalten werden, jedoch gegen einen Hintergrund alternativer homologer Rekombinationsereignisse. In einer Ausführungsform ist die Sequenz der Homologiearme zwei Sequenzen, die den Polylinker eines üblicherweise verwendeten Klonierungsvehikels, wie BAC, PAC, YAC (Hefe artifizielles Chromosom = „yeast artificial chromosome"), Phagenklonierungsvektoren wie die λ-EMBL oder λGT-Serien, Phagemid, Cosmid, pBR322, pGEM, pGEX, pET, Baclovirus-Vektoren, wie Viral-Vektoren, wie adenovirale Vektoren und Adeno-assoziierte virale Vektoren flankieren. Daher kann ein einzelner Vektor verwendet werden, um jedes Insert, das in diesen Vektoren kloniert worden ist, zu subkloniern. Vektoren, die solche Homologiearme enthalten, sind besonders für die Sub-Klonierung von Einfügung, die aus positiven Klonen aus einer DNA-Bibliothek, wie einer BAC-, PAC-, YAC-, Cosmid- oder λ-Bibliothek abgeleitet sind, nützlich.
  • Wie im folgenden beschrieben wird, sind die Homologiearme in verschiedenen Ausführungsformen an den Enden eines linearen DNA-Moleküls oder innerhalb eines linearen DNA-Moleküls oder innerhalb eines linearen DNA-Moleküls oder eines zirkulären DNA-Plasmid-Vektors angeordnet.
  • Die Homologiearme sind in derselben Orientierung relativ zu der Orientierungen der Ziel-Nukleotidsequenz orientiert. In anderen Worten sind sie so orientiert, daß die orientierte DNA-Sequenz zwischen die Arme eingeführt wird, nachdem die Rekombination stattfindet. In den Fällen, in denen die Homologiearme an den Enden der linearen DNA angeordnet sind, wird die eingeführte DNA-Sequenz gefangen und zwischen die zwei Arme eingeführt, wodurch ein zirkuläres und replizierbares Plasmid erzeugt wird.
  • 5.2.1.4 ADAPTEROLIGONUKLEOTID-HOLOGIEARME
  • In einer alternativen Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der Homologiearme homolog zu der Nukleotidsequenz, die auf den Adapteroligonukleotiden vorhanden ist. Jedes dieser zwei Adapteroligonukleotide umfaßt eine Nukleotidsequenz, die homolog zu Nukleotidsequenzen ist, die auf einem der Homologiearme vorhanden ist und eine zweite Region der Homologie, die homolog zu einem der zwei Termini ist, die die Ziel-DNA flankieren. Die Adapteroligonukleotide werden in der 1 dargestellt. Die Homologiearme des Vektors sind als „A" und „B" markiert und die Regionen der Adapteroligonukleotide, die zu diesen Sequenzen homolog sind, sind als A' und B' markiert. Die zwei Termini, die die Ziel-DNA flankieren, sind als „C" und „D" markiert und die korrespondierenden homologen Sequenzen, die auf den Adapteroligonukleotiden vorhanden sind, sind als C' und D' markiert. Diese Ausführungsform führt die durch RecE/T oder Redα/β vermittelte Rekombination zwischen den Vektorhomologiearmen, der Homologieregion auf den Adapteroligonukleotiden und den flankierenden Termini des Zielgens zur Einführung oder dem „Fangen" der Ziel-DNA zwischen den Homologiearmen des Vektors.
  • 5.2.1.5 KONSTRUKTION DES VEKTORS
  • Das lineare Fragment oder der zirkuläre Vektor können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren konstruiert werden (siehe Sambrook et al., 1989, supra; Ausubel et al., supra). Beispielsweise kann synthetische oder rekombinante DNA-Technologie verwendet werden. In einer Ausführungsform wird das lineare Fragment durch PCR-Vervielfältigung hergestellt. In diesem Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, um die Homologiearmsequenzen an ihren 5'-Enden und PCR-Primersequenzen an ihren 3'-Enden zu umfassen. Diese Oligonukleotide werden dann als Primer in einer PCR-Vervielfältigungsreaktion verwendet, um eine DNA-Region zu vervielfältigen, die einen Replikationsursprung und einen selektierbaren genetischen Marker umfaßt. In einer anderen Ausführungsform kann ein Plasmid durch rekombinante Standard-DNA-Verfahren so konstruiert werden, daß es zwei geeignet orientierte Homologiearme, die einen Replikationsursprung flankieren, und einen selektierbaren genetischen Marker enthält (siehe z.B. Methods in Enzymology, 1987, Band 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, New York; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Das Plasmid wird dann beispielsweise durch Restriktionsendonukleaseverdau linearisiert.
  • Beispielsweise wird in einer weiteren Ausführungsform das folgende Verfahren verwendet, um die Vektor-DNA, die oben im Abschnitt 5.1.3. verwendet wird, zu konstruieren. Zwei Oligonukleotide werden synthetisiert von dem das eine von 5'- bis zum 3'- Ende eine Restriktionsstelle, die einmalig für den Vektor ist, einen linken Homologiearm und einen PCR-Primer enthält. Das andere Oligonukleotid umfaßt vom 5'- bis zum 3'-Ende die selbe Restriktionsstelle, die einzigartig für den Vektor ist, ein SSRT, einen rechten Homologiearm und einen PCR-Primer. Die zwei Homologiearme werden gewählt, um die Ziel-DNA zu flankieren. Das SSRT ist eine Stelle, die durch jede ortspezifische Rekombinase (SSR) wie Cre-, Flp-, Kw- oder R-Kombinasen erkannt wird. Die Synthese des Oligonukleotids muß so entworfen werden, daß die zwei SSRTs als direkte Wiederholung in dem Vektor orientiert sind. Zwei PCR-Primer werden verwendet, um eine DNA-Vorlage zu vervielfältigen, die einen Plasmidursprung, ein selektierbares Gen und einen identisches SSRT zwischen dem Ursprung und dem selektierbaren Gen enthält. Das Produkt der PCR-Reaktion wird dann mit dem Restriktionsenzym geschnitten, das die Stelle, die in den 5'-Enden der Oligonukleotide enthalten war, erkennt, um die wirksame Zirkularisierung durch Ligation zu erlauben. Das zirkuläre Produkt wird dann für die Vervielfältigung in E.coli transformiert, um große Vektormengen zu ergeben.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein lineares Fragment durch das Nehmen eines Plasmids mit einem selektierbaren Marker, einem Ursprung und zwei Klonierungsstellen und der Einklonierung eines Oligonukleotidhomologiearms in jede Klonierungsstelle konstruiert. Die Restriktionsenzyme werden dann verwendet, um das Plasmid zu schneiden, um ein lineares Fragment zu erzeugen, das durch die Homologiearme verbunden wird. Dieses Verfahren ist für die Konstruktion komplexerer Plasmide, z.B. von Plasmiden, die eukaryotische Enhancer- and Promotorelemente enthalten, um eukaryotische Expressionselemente zu umfassen, bevorzugt. Zusätzlich können andere Sequenzen in den Vektor subkloniert werden.
  • Der Vektor kann auch zusätzlich interessierende Nukleotidsequenzen für die Proteinexpression, Manipulation oder den Erhalt der eingeführten Ziel-DNA enthalten. Beispielsweise können Promotorsequenzen, Enhancersequenzen, Translationssequenzen wie Shine-und-Dalgamo-Sequenzen, Transkriptionsfaktorerkennungssequenzen, Kozak-Konsensussequenzen und Terminierungssignale an einer angemessenen Position in dem Vektor enthalten sein. Für die Rekombinationsklonierung in anderen Zellen als bakteriellen Zellen wie Pflanzen, Insekten, Hefe oder Säugetierzellen können andere Sequenzelemente wie speziesspezifische Replikationsursprünge, Transkriptions-, Prozessierungs- und Translationssignale notwendig sein. Solche Elemente können enthalten sein, sind aber nicht eingeschränkt auf eukaryotische Replikationsursprünge, Enhancer, Transkriptionsfaktorerkennungsstellen, CAT-Boxen oder Priobnowboxen.
  • In einer Ausführungsform bei der RecE/T und/oder Redα/β oder eine andere bakterielle Rekombinase rekombinant von einem Expressionsplasmid in der Zelle hergestellt wird, muß der gewählte Vektor mit dem bakteriellen Rekombinaseexpressionsplasmid, das unten im Abschnitt 5.2.3 beschrieben wird, kompatibel sein. Der Fachmann würde sich ohne weiteres der Kompatibilitätsforderungen bewußt sein, die für die Expression mehrer Plasmide in einer einzelnen Zelle notwendig sind. Verfahren für die Vervielfältigung von zwei oder mehr Konstrukten in prokaryotischen Zellen sind dem Fachmann wohl bekannt. Beispielsweise können Zellen, die mehrere Replikons enthalten, routinemäßig durch die Verwendung von Vektoren, die geeignete kompatible Replikationsursprünge und unabhängige Selektionssysteme enthalten, selektioniert und erhalten werden (siehe Miller et al., 1992, supra; Sambrook et al., 1989, supra).
  • 5.2.2 BAKTERIELLE REKOMBINASEN
  • Die hierin beschriebene Erfindung wird in erster Linie im Hinblick auf RecE/T und/oder Redα/β beschrieben. Es wird jedoch für den Fachmann klar sein, daß die Erfindung gleichermaßen auf die Verwendung anderer bakterieller Rekombinasen anwendbar ist, die die Fähigkeit aufweisen, homologe Rekombination unter Verwendung eines Paars homologer doppelsträngiger DNA-Moleküle als Substrate, zu vermitteln. Wie hierin verwendet, ist eine Rekombinase, eine Rekombinase, die endogen in Bakterien exprimiert wird, ob aus Phagen- oder Bakterienursprung, und dazu in der Lage ist, eine homologe Rekombination zu vermitteln. In verschiedenen Ausführungsformen ist die bakterielle Rekombinase eine RecE/T- und/oder Redα/β-Rekombinase. In einer anderen besonderen Ausführungsform umfaßt ein funktionell äquivalentes System für die Initiation homologer Rekombination das REF-Protein aus dem Phagen P22. Des weiteren können einzelne Proteinkomponenten bakterieller Re kombinasen durch andere funktionelle Komponenten für die Verwendung der vorliegenden Erfindung ersetzt werden.
  • „RecE" und „RecT" wie hierin verwendet bezeichnet E. coli, z.B. E. coli K12, RecE oder RecT. Die E. coli RecE und RecT Nukleoid- oder Aminosäuresequenzen sind wohlbekannt (RecE, GenBank Zugangsnr. M24905 und SWISS-PROT Zugangsnr. P15033; RecT, GenBank Zugangsnr. L23927 und SWISS-PROT Zugangsnr. P33228). „Redα" und „Redβ" bezeichnen Lambdaphagen-kodierte Proteine. Redα besitzt eine 5'- bis 3'-Exonukleaseaktivität die der 5'- bis 3'-Exonuklease des RedE ähnlich ist und Redβ weist eine DNA-Anlagerungsaktivität auf, die der des RecT ähnlich ist. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind für diese beiden Lambdaproteine wohl bekannt (siehe GenBank Zugangsnr. J02459; M17233).
  • Wie dem Fachmann klar sein wird, soll ein Verweis auf RecE/T und/oder Redα/β hierin auch auf eine Kombination von RecE/T und Redα/β hinweisen, falls es nicht anders explizit oder durch den Zusammenhang aufgezeigt wird. In einer besonderen Ausführungsform hat die Kombination von zwei Enzymkomplexen auf die Effizienz der Rekombination einen synergistischen Effekt.
  • Die bakteriellen Rekombinasen, die verwendet werden können, umfassen allelische Varianten der Bestandteile der Rekombinasen. Beispielsweise können die Aminosäuresequenzen wie in dem RecE/T- und Redα/β-Rekombinationssystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auch Aminosäuresequenzen umfassen, die durch allelische Varianten von RecE, RecT, Redα oder Redβ kodiert werden, solange die allelischen Varianten funktionelle Varianten sind, zumindest in dem Umfang, in dem sie homologe Rekombinationsaktivität zeigen. Allelische Varianten können routinemäßig identifiziert werden und unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardverfahren erhalten werden (siehe z.B. Methods in Enzymology, 1987, Band 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, New York; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) oder durch Proteinevolutionsansätze (Jermutus et al., 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:534–548).
  • Im allgemeinen sollten Nukleinsäuren, die dazu in der Lage sind für solche allelischen Varianten zu kodieren, dazu in der Lage sein, mit dem Komplement der kodierenden Sequenz von RecE, RecT, Redα oder Redβ unter moderat stringenten Bedingungen zu hybridisieren (unter Verwendung von z.B. Standard Southern Blotting Hybridisierungsbedingungen mit der letzten Waschung in 0,2 × SSC/0,1%SDS bei 42°C; Ausubel et al., Heraus. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Band I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & sons, Inc., New York, auf s. 2.103) oder hochstringenten Hybridisierungsbedingungen (unter Verwendung von z.B. Standard Southern Blotting Hybridisierungsbedingungen mit der letzten Waschung in 0,1 × SSC/0,1%SDS bei 68°C; Ausubel et al., supra).
  • Wie hierbei verwendet, umfassen RecE, RecT, Redα oder Redβ auch RecE-, RecT-, Redα- und Redβ-Homloge, die aus Phagen abgeleitet sind, die durch prokaryotische Zellen der Familie Entereobacteriaceae unterhalten werden oder die Zellen davon. Mitglieder der Familie der Entereobacteriaceae umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf die Spezies Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Klebsiellae und Porteus. So ein RecE-, RecT-, Redα- oder Redβ-Homolog wird im allgemeinen durch ein Gen kodiert, das in einem Phagengenom vorhanden ist, dessen Produkt an einem Rekombinations-vermittelten Schritt in den Lebenszyklus des Phagen teilnimmt wie Redα und Redβ im Lebenszyklus des Lambda-Phagen.
  • Die RecE/T-Homologe können routinemäßig identifiziert werden und unter Verwendung von prokaryotischen genetischen und rekombinanten DNA-Standardverfahren erhalten werden (siehe z.B. Sambrook et al., supra und Ausubel et al., supra). Die rekombinante DNA kann aus einer klonierten genomischen oder einer cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Vervielfältigung gewonnen werden. Beispielsweise kann eine genomische Bibliothek durch molekularbiologische Standardverfahren hergestellt werden oder aus kommerziellen oder nicht-kommerziellen Quellen erhalten werden. Die genomische oder die cDNA-Bibliothek kann dann durch Nukleinsäurehybridisierung gegen eine markierte E.coli recE- oder recT-Sonde durchsucht werden (Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961) und positive Klone können isoliert und sequenziert werden.
  • In einem spezifischen Beispiel kann ein RecE- oder RecT-Homolog routinemäßig in Salmonella typhimurium isoliert werden. Die recE- und recT-Gene sind in E. coli K-12 gut charakterisiert; die Nukleotid- und Proteinsequenzen sowohl von RecE (GenBank Zugangsnr. M24905 und SWISS-PROT Zugangsnr. P15033) als auch RecT (GenBank Zugangsnr. L23927 und SWISS-PROT Zugangsnr. P33228) sind bekannt; (siehe auch Bachmann, 1990, Micorbiol. Rec. 54:130–197; Rudd, 1992, in Miller, 1992, supra, ss. 21.3–2.43). Eine vollständige S. ryphimurium genomische Kosmid- oder λ-Bibliothek kann verwendet werden. Die S. typhimurium-Bibliothek kann durch Hybridisierung mit einer E.coli RecE- oder RecT-Sonde unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen wie denen oben beschriebenen, durchsucht werden. Beispielsweise sind, da für die zwei Gene erwartet wird, daß sie zueinander hoch homolog sind, moderat stringente Standardhybridisierungsbedingungen bevorzugt.
  • In einer Ausführungsform können solche Bedingungen das folgende umfassen: Filter, die DNA enthalten können für 6 Stunden bei 55°C in einer Lösung vorbehandelt werden, die 6X SSC, 5X Denhart's Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthält.
  • Die Hybridisierungen können in derselben Lösung ausgeführt werden und eine 5–20 × 106 cpm 32P-markierte Sonde wird verwendet. Die Filter können in einem Hybridisierungsgemisch für 8–20 Stunden bei 55°C inkubiert werden und dann zweimal für 30 Minuten bei 60°C in einer Lösung gewaschen werden, die 1X SSC und 0,1% SDS enthält. Die Filter werden dann trockengetupft und gegenüber Röntgenfilm für die Autoradiographie ausgesetzt. Andere Bedingungen der moderaten Stringenz, die verwendet werden können, sind im Stand der Technik gut bekannt. Das Waschen der Filter bei 37°C für 1 Stunde in einer Lösung, 2X SSC, 0,1% SDS enthält, ausgeführt. Die anschließende Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der Klone, die das S. typhimurium enthalten, kann durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren durchgeführt werden (siehe Ausubel et al., supra). Solche Sequenzen können verwendet werden, um die S. typhimurium RecE/T der Erfindung zu konstruieren.
  • Alternativ kann das S. typhimurium-Gen aus S. typhimurium-mRNA isoliert werden. Die mRNA kann aus Zellen isoliert werden, die das RecE- oder RecT-Protein exprimieren. Eine cDNA-Bibliothek kann durch reverse Transkription der mRNA hergestellt werden und mit im Stand der Technik bekannten Verfahren durchsucht werden wie die, die oben für die Durchsuchung einer genomischen Biblithek beschrieben wurden (siehe Ausubel et al., supra). Alternativ kann die recE- oder recT-cDNA durch PCR-Verfahren wie RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends; Ausubel et al., supra) unter Verwendung von zwei Primern, die auf Grundlage der E. coli recE- oder recT-Sequenz entworfen wurden: ein „vorwärts"-Primer, der dieselbe Sequenz wie das 5'-Ende der E. coli recE- oder recT-mRNA aufweist und ein „um gekehrter" Primer, der zu seinem 3'-Ende komplementär ist. Das PCR-Produkt kann durch Sequenzierung bestätigt, subkloniert und verwendet werden, um das RecE/T der Erfindung zu konstruieren. Solche cDNA-Sequenzen können auch verwendet werden, um genomische S. typhimurium recE- oder recT-Sequenzen unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren, zu isolieren (Sambrook et al., 1989, supra; Ausubel et al., supra).
  • Die Nukleinsäuremoleküle, die für die RecE/T-Rekombinationsenzyme der Erfindung kodieren, können des weiteren gemäß rekombinanten und synthetischen Mitteln, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, synthetisiert und/oder konstruiert werden (siehe z.B. Sambrook, supra und Ausubel et al., supra).
  • Wie unten diskutiert, kann die Möglichkeit, die Expression von Sequenzen zu kontrollieren, so daß die Expression regulierbar ist (z.B. induzierbar) und so daß ein weiter Bereich der Expressionsmengen erreicht werden kann, für die Leistungsfähigkeit der Verfahren der Erfindung vorteilhaft sein.
  • Die Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise extrachromosomal erhalten werden, z.B. auf einem Plasmid, Kosmid oder einem Bakteriophagen. Alternativ können Nukleinsäuremoleküle in das Chromosom integriert werden, z.B. das E. coli Chromosom unter Verwendung von beispielsweise Phagentransduktion oder -transposition. Somit können die RecE/T kodierenden Sequenzen mit Standardverfahren bearbeitet werden, so daß sie innerhalb jeder Zelle in hoher Kopienzahl, niedriger Kopienzahl oder Einzelkopie vorliegen. Eine Vielzahl von verschiedenen regulatorischen Sequenzen kann für die Steuerung der Expression der rekombinanten Proteine verwendet werden. Jeder dieser Aspekte der Expression/der Stammkonstruktion kann verändert werden, um Zellen zu ergeben, die einen weiten Bereich rekombinanter Proteinexpressionsmengen aufweisen. Es soll bemerkt werden, daß Einzelkopiechromosomale Versionen der rekombinanten Protein-kodierenden Sequenzen zusätzlich dadurch vorteilhaft sind, daß eine solche Konfiguration die Konstruktion von Stämmen ermöglicht.
  • 5.2.2.1 PROTEIN EXPRESSION
  • Die bakterielle Rekombinase kann entweder konstitutiv oder induzierbar in bakteriellen, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform werden die rekombinanten Protein in einem Bakterium, am meisten bevorzugt einem E. coli-Stamm exprimiert. Beispielsweise kann die Wirtszelle die recE- und recT-Gene auf dem Wirtszellchromosom angeordnet, umfassen. Beispiele von E. coli-Stämmen, in denen die Expression des RecE/T endogen ist, sind beispielsweise E.coli sbcA-Stämme (Zhang et al., 1998, supra). Alternativ kann RecE/T rekombinant von nicht-chromosomaler DNA vorzugsweise auf einem Plasmidvektor, z.B. pBADETγ (Zhang et al., 1998, supra) oder pGE-Trec (Narayanan et al., 1999, Gene Ther. 6:442–447) exprimiert werden. Gleichermaßen kann Redα/β für die Stämme endogen sein, die den λ-Prophagen integriert aufweisen oder von Plasmiden, die beispielsweise pBADETαβγ exprimieren (Muyrers et al., 1999, supra). Die RecE/T- und/oder Redα/β-Expressionskonstrukte können gemäß rekombinanten DNA-Standardverfahren konstruiert werden (siehe z.B. Methods in Enzymology, 1987, Band 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, New York; und Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, von denen jedes hierin in seiner Gesamtheit durch Verweis aufgenommen wird).
  • In einer Ausführungsform wird das RecE/T und/oder Redα/β in E. coli von einem Plasmid hoher Kopiezahl wie einem Plasmid, das einen ColE1-abgeleiteten Replikationsursprung enthält, von denen Beispiele im Stand der Technik bekannt sind (siehe Sambrook et al., 1989, supra; siehe auch Miller 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 und Verweise darin) wie pUC 19 und seinen Derivaten (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103–119) exprimiert.
  • Im Hinblick auf die regulatorischen Kontrollen, die die Expression (entweder reguliert oder konstutiv) in einem Bereich unterschiedlicher Expressionsmengen erlauben, sind eine Vielzahl solcher regulatorischer Sequenzen den Fachleuten gut bekannt. Die Fähigkeit, einen weiten Expressionsbereich zu erzeugen, ist für die Nutzung der Verfahren der Erfindung wie unten beschrieben, vorteilhaft. Eine solche Expression kann sowohl in einer dauerhaften als auch in einer regulierten oder induzierbaren Weise erreicht werden.
  • Eine induzierbare Expression, die zu einem weiteren Expressionsbereich führt, kann durch die Verwendung einer Vielzahl induzierbarer regulatorischer Sequenzen erreicht werden. In einer Ausführungsform kann beispielsweise das lacI-Gen und sein grundloses Induktionsmittel IPTG verwendet werden, um induzierbare, hohe Expressionsmengen des RecE/T zu erhalten, wenn Sequenzen, die solche Polypeptide kodieren, über die lacOP-regulatorischen Sequenzen transkribiert werden.
  • Die RecE und RecT können von verschiedenen Promotoren exprimiert werden oder alternativ können die RecE und RecT-Gene auf einer polycistronischen mRNA von einem einzelnen Promotor exprimiert werden. Solche heterologen Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Vorzugsweise wird die Expression durch einen induzierbaren Promotor kontrolliert. Die induzierbare Expression, die einen weiten Bereich der Expression ergibt, kann durch die Verwendung einer Vielzahl induzierbarer regulatorischer Sequenzen erhalten werden. In einer Ausführungsform kann beispielsweise das lacI-Gen und sein grundloses Induktionsmittel IPTG verwendet werden, um eine induzierbare, hohe Expressionsmenge des RecE/T zu ergeben, wenn Sequenzen, die für solche Polypeptide kodieren, über die lacOP-regulatorischen Sequenzen transkribiert werden. Eine Vielzahl anderer induzierbarer Promotorsysteme sind dem Fachmann wohl bekannt, die auch verwendet werden können. Die Expressionsmengen der RecE/T- oder Redα/β-Konstrukte können auch durch die Verwendung von Promotoren verschiedener Stärke variiert werden.
  • Andere regulierte Expressionssysteme, die verwendet werden können, umfaßen, sind aber nicht eingeschränkt auf den araC-Promotor, der durch Arabinose (AraC) induzierbar ist, das TET-System (Geissendorfer und Hillen, 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657–663), der durch Temperatur-induzierbare pL-Promotor des Phagen λ und der induzierbare Lambda-Repressor CI857 (Pinotta, 1975, Nature 254:114–117; Petrenko et al., 1989, Gene 78:85–91), der trp-Promotor und das trp-Repressorsystem (Bennett et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:2351–55; Wame et al., 1986, Gene 46:103–112), der ZacUV5-Promotor (Gilbert und Maxam, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:1559–63), lpp- (Nokawua et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen 1:289–299), der T7-Gen-10-Promotor, der phoA- (Alkalische Phosphatase), recA- (Horii et al., 1980), und der tac-Promotor, ein trp-lac-Fusionspromotor, der durch Tryptophan induzierbar ist (Amann et al., 1983, Gene 25:167–78) sind beispielsweise alle üblicherweise verwendete starke Promotoren, die für ein Protein, dessen Menge durch jeden Promotor kontrolliert wird, zu akkumulierten Mengen von etwa 1 bis 10 % des gesamten zellulären Proteins führen. Wenn ein starker Promotor gewünscht wird, ist der tac-Promotor ungefähr zehnmal stärker als lacUV5, aber wird zu einer hohen Menge der Hintergrundexpressionsmengen führen und sollte daher nur verwendet werden, wenn eine Überexpression erforderlich ist. Wenn ein schwächerer Promotor erforderlich ist, sind andere bakterielle Promotoren im Stand der Technik gut bekannt, wie beispielsweise der Maltose-, der Galactose- und andere wünschenswerte Promotoren (Sequenzen solcher Promotoren sind von Genbank erhältlich (Burks et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19:2227–2230).
  • Die für die hierin beschriebenen Verfahren nützlichen Zellen sind alle Zellen, die RecE/T- und/oder Redα/β-Rekombinasen enthalten. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine gramnegative bakterielle Zelle. Noch bevorzugter ist die Wirtszelle eine entero-bakterielle Zelle. Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die Spezies Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Klebsiellea, und Proteus. Am meisten bevorzugt ist die Wirtszelle eine Escherichia coli-Zelle. Die Zellen können auch von anderen Organismen abgeleitet werden, umfaßend, aber nicht eingeschränkt auf Hefe-, Fliege-, Mäuse- oder menschliche Zellen unter der Voraussetzung, daß sie verändert werden können, um eine geeignete Rekombinase zu exprimieren. Die Rekombinase ist vorzugsweise die RecE/T-Rekombinase, die von E. coli abgeleitet ist oder die Redα/β-Rekombinase, die vom Phagen λ abgeleitet ist oder ein funktionelles Äquivalent des RecE/T oder Redα/β-Rekombinasesystems, das von Enterobacteriaceae oder einem Enterobacteriaceae-Phagen abgeleitet ist, wobei solche Systeme die Rekombination zwischen Regionen mit Sequenzhomologie vermitteln können.
  • Zellen, die RecE/T-und/oder Redα/β-Proteine exprimieren, können zuvor elektrokompetent gemacht werden und bei –70°C aufbewahrt werden.
  • Alternativ können die Verfahren der Erfindung in jedem anderen Zelltyp ausgefüllt werden, in dem die Expression von RecE/T und/oder Redα/β möglich ist. Beispielsweise kann eine Vielzahl von Wirts-Vektorsystemen verwendet werden, um die proteinkodierenden Sequenzen zu exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Säugetierzellsysteme, die mit Viren infiziert sind (e.g. Vaccinia Virus, Adenovirus, etc.); Insektenzellsysteme, die mit Virus infiziert sind (e.g., Baculovirus); Mikroorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder Bakterien, die mit einem Bacteriophagen, DNA, einer Plasmid-DNA oder einer Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente der Vektoren variieren in ihrer Stärke und Spezifität. Abhängig von dem verwendeten Wirt-Vektorsystem kann jeder einer Vielzahl von geeigneter Transkripitons- und Translationselemente verwendet werden. In spezifischen Ausführungsformen werden die RecE/T und/oder Redα/β-Gene exprimiert oder eine Sequenz, die für einen funktionell aktiven Teil des RecE/T und/oder Redα/β kodiert. In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein Fragment des RecE/T und/oder Redα/β, das eine Domäne der RecE/T- und/oder Redα/β-Proteine umfaßt, exprimiert.
  • Jede der zuvor beschriebenen Verfahren für die Einführung von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um Expressionsvektoren, die ein chimeres Gen enthalten, die aus geeigneten transkriptionellen/translationellen Kontrollsignalen und den proteinkodierten Sequenzen bestehen, zu konstruieren. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und synthetische Techniken und in vivo Rekombinanten (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für RecE/T- oder Redα/β-Protein oder ein Peptidfragment kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so daß RecE/T- oder Redα/β-Protein oder Peptid in einer Wirtszelle mit dem rekombinanten DNA-Molekül exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression von RecE/T- oder Redα/β-Protein durch jedes Promotor/Enhancer-Element, das im Stand der Technik bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die verwendet werden, können, um die RecE/T- oder Redα/β-Expression zu kontrollieren, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die SV40 frühe Promotorregion (Benoist und Chambon, 1981, Nature 290:304–310), der in der 3'-langen terminalen Wiederholung des Rous sarcoma Virus gelegene Promotor (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787–797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al.,1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioningens (Brinster et al., 1982, Nature 296:39–42); Pflanzenexpressionsvektoren, die die Nopalinsynthetase-Promotorregion umfassen (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 303:209–213) oder der Blumenkohlmosaikvirus 35S RNA-Promotor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), und der Promotor des photosynthetischen Enzyms Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115–120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase)promotor, den PGK(Phosphoglyceroylkinase)promotor, den alkalische Phosphatasepromotor und die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die eine Gewebspezifität zeigen und die in transgenen Tieren verwendet worden sind: die Elastase I Gen-Kontrollregion, die in Bauchspeicheldrüsen-Acinarzellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425–515); die Insulingenkontrollregion, die in Bauchspeichelbetazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115–122), die Immunglobulingenkontrollregion, die in Lymphoidenzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647–658; Adames et al., 1985, Nature 318:533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436–1444), die Kontrollregion des Mäusebrusttu morvirus („Mouse mammary tumor virus"), die in testikulären, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485–495), die Albumingenkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268–276), die Alpha-Fetoproteingenkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53–58); die Alpha 1-Antitrypsingenkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161–171), die Beta-Globingenkontrollregion, die in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315:338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89–94); die Kontrollregion des Myelin-basischen Proteins, die in oligodendrozytischen Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703–712); die Myosin leichte Kette-2 Genkontrollregion, die im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314:283–286), und die Gonadotrophin-freisetzende Hormongenkontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234:1372–1378).
  • In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der einen Promotor umfaßt, der wirksam mit einer bakteriellen Rekombinase (z. B. einer RecE oder einer RecT- kodierenden Nukleinsäure), oder einer oder mehreren Replikationsursprüngen und gegebenenfalls einem oder mehreren selektierbaren Markern (z. B. einem antibiotischen Resistenzgen) verknüpft ist.
  • Der gewählte Vektor muss mit dem im Abschnitt 5.2.1 oben beschriebenen Vektorplasmid kompatibel sein. Ein Fachmann würde sich der Kompatibilitätsanforderung bewußt sein, die notwendig ist, um mehrere Plasmide in einer einzelnen Zelle zu erhalten. Verfahren für die Vermehrung von zwei oder mehr Konstrukten in prokaryotischen Zellen sind dem Fachmann gut bekannt. Beispielsweise können Zellen, die mehrere Replikons enthalten, routinemäßig selektiert werden und durch Vektoren, die geeignete, kompatible Replikationsursprünge umfassen und unabhängige Selektionssysteme enthalten, bewahrt werden (siehe Miller et al., 1992, supra, Sambrook et al., 1989, supra).
  • 5.2.3 Wirtszellen
  • Die Wirtszelle, die für die Klonierungsverfahren der vorliegenden Erfindung und für die Vermehrung der klonierten DNA verwendet wird, kann jede Zelle sein, die die recE- und recT- und/oder redα- und redβ-Genprodukte exprimiert oder jede Zelle, in der die heterologe Expression dieser Gene möglich ist. Beispiele möglicher Zelltypen, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf prokaryontische, eukaryontische Zellen wie Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Nagetiere-, Mäuse-, menschliche, Insekten oder Säugetierzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine bakterielle Zelle. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine E. coli-Zelle. Beispiele spezifischer E. coli-Stämme, die verwendet werden können, sind JC 8679 und JC 9604. Der Genotyp von JC 8679 und JC 9604 ist Sex (Hfr, F+, F– oder F): F–. JC 8679 umfasst die Mutation: recBC 21, recC 22, sbcA 23, thr-1, ara-14, leu B6, DE (gpt-proA) 62, lacY1, tsx-33, gluV44 (AS), galK2 (Oc), LAM-his-60, relA 1, rps L31 (strR), xyl A5, mtl-1, argE3 (Oc) und thi-1. JC 9604 umfasst dieselben Mutationen und des weiteren die Mutation recA 56.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann eine eukaryontische Zelle für die hierin beschriebenen Klonierungs- und Subklonierungsverfahren verwendet werden. Jede Zelle, die eine bakterielle Rekombinase oder funktionelle Äquivalente davon exprimiert oder entworfen werden kann, um eine zu exprimieren, kann verwendet werden. Zellinien, die vom Menschen, der Maus, dem Affen oder jedem anderen Organismus abgeleitet sind, können verwendet werden. Beispielsweise umfassen nicht beschränkende Beispiele von Zellinien, die für die Verfahren der Erfindung nützlich sind, CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3- und WI38-Zellen.
  • Eine Vielzahl von Wirts-Vektorsystemen können verwendet werden, um die proteinkodierende Sequenz des RecE/T, des Redα/β oder eines funktionell äquivalenten Systems einzuführen und zu exprimieren. Solche Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, New York). Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Säugetierzellsysteme, die mit Viren infiziert sind (z. B. Vaccinia Virus, Adenovirus, etc.); Insektenzellsysteme, die mit Virus infiziert sind (z. B. Baculovirus); Mikroorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthalten oder Bakterien, die mit Bacteriophagen, DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Verfahren für die Proteinexpression werden auch im Abschnitt 5.2.2, oben, diskutiert.
  • 5.2.4 Ziel-DNA
  • Die Ziel-DNA wird gemäß dem experimentellen Design ausgewählt und kann jede doppelsträngige DNA sein, die so kurz wie ein Basenpaar ist oder eine Länge von über 100 Kilobasen aufweist. In einer spezifischen Ausführungsform weist die Ziel-DNA eine Länge von 100, 125, 200 oder 300 kb auf. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist die Ziel-DNA 25 bis 100 Kilobasen, z. B. wie sie in einem BAC-Vektor vorhanden ist. Andere spezifische Ausführungsformen der Ziel-DNA sind in den Beispielen im Abschnitt 6 dargestellt. Die Ziel-DNA kann auf einem unabhängig replizierenden DNA-Molekül, wie auf einem Plasmid, einem BAC oder dem E. coli-Chromosom, aber nicht darauf beschränkt, liegen. Die Ziel-DNA kann auch auf jeder DNA-Quelle liegen, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, DNA aus prokaryotischen, archaebakteriellen oder eukaryotischen Zellen oder aus einem Virus, Phagen oder synthetischen Ursprüngen. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen aus den folgenden Quellen erhalten werden: Mensch, Schwein, Rind, Katze, Vogel, Pferd, Hund, Insekt (z. B. Drosophila), Wirbellose (z. B. C. elegans), Pflanze, etc. Die DNA kann durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren erhalten werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover (Heraus.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Band I, II).
  • 5.3 Verfahren für die Verwendung der Erfindung
  • 5.3.1 Einführung der DNA in die Wirtszellen
  • Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren für die Verabreichung einer DNA-Zubereitung umfassend die Ziel-DNA in eine Wirtszelle ist für die Verwendung mit dem hierin beschriebenen Verfahren geeignet. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Elektroporation von Zellen, die Zubereitung von kompetenten Zellen mit Kalzium oder Rubidiumchlorid, die Transduktion von DNA mit Ziel-DNA, die in virale Partikel verpackt ist. Für eukaryotische Zellen umfassen die Verfahren, sind aber nicht eingeschränkt auf die Elektroporation, die Transfektion mit Kalziumphosphatpräzipitation der DNA und die virale Verpackung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Elektroporation verwendet. Die Zellen, die RecE/T- oder Redα/β-Proteine enthalten, werden durch Standardverfahren behandelt, um sie für die Elektroporation kompetent zu machen (siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, New York). Vorzugsweise werden etwa 50 μl einer Standard zubereitung elektrokompetenter Zellen für die Elektroporation durch Standardverfahren verwendet. In Experimenten, die die Transformation eines linearen oder zirkulären Vektors erfordern, werden vorzugsweise 0,3 μg oder mehr Vektor verwendet. In Experimenten, die die Transformation einer DNA-Zubereitung erfordern, die die Ziel-DNA enthält, werden vorzugsweise 0,3 μg oder mehr verwendet. Für Co-Transformationsexperimente werden die DNAs vorzugsweise vor der Elektroporation gemischt. Nach der Elektroporation werden die Zellen vorzugsweise in Kulturmedium verdünnt und für eine Wiedererholungsperiode von ungefähr 1 ½ Stunden inkubiert, bevor sie unter Bedingungen kultiviert werden, um die phänotypischen Änderungen zu identifizieren, die durch das selektierbare Markergen vermittelt werden.
  • In Experimenten, die die ortspezifische Rekombination oder die Endonukleasespaltung des Vektors verwenden, wird die Expression der SSR oder der Endonuklease oder Kombination einer SSR und einer Endonuklease oder zwei SSRs, entweder vor der Zubereitung der elektrokompetenten Zellen, während der Erholungsperiode nach der Elektroporation oder während der Kultivierung, um den selektierbaren Marker zu identifizieren, induziert.
  • Idealerweise ist die phänotypische Veränderung gegenüber einem Antibiotikum beständig und die Zellen werden auf Platten kultiviert, die das korrespondierende Antibiotikum enthalten. In diesem Fall werden die Antibiotika-resistenten Kolonien, die nach Übernacht-Kultivierung erscheinen, in erster Linie das gewünschte Subklonierungsprodukt enthalten.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA in die Wirtszelle durch die Transduktion einer DNA, die in einen Phagenpartikel verpackt worden ist, verabreicht. Die P1- oder λ-Transduktion oder Verpackungsprotokolle sind im Stand der Technik bekannt. Die λ-Verpackungsextrakte sind kommerziell erhältlich (z. B. von Promega, Madison, WI).
  • 5.3.2 Oligonukleotide
  • Die Oligonukleotidhomologie-arme, Primer und Adapteroligonukleotide, die im Zusammenhang mit dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, sind häufig Oligonukleotide, die in einer Länge von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden reichen. In spezifischen Aspekten weist ein Oligonukleotid eine Länge von 10 Nukleotiden, 15 Nukleotiden, 20 Nukleotiden, 50 Nukleotiden oder 100 Nukleotiden oder eine Länge von bis zu 200 Nukleotiden auf.
  • In der bevorzugten Ausführungsform weist das Oligonukleotid eine Länge von etwa 90 Nukleotiden auf.
  • Oligonukleotide können durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden (z. B. Standardphosphoramiditchemie auf einem Applied Biosystems 392/394-DNA-Synthesizer). Des weiteren können Reagenzien für die Synthese von jedem einer Vielzahl kommerzieller Anbieter erhalten werden.
  • Ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das im Zusammenhang mit dem Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden, z. B. durch die Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers (wie die kommerziell von Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich sind). Als Beispiele können Phosphorothioat-Oligonukleotide durch die Verfahren von Stein et al., synthetisiert werden (1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209), Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch die Verwendung von Glaspolymerträgern kontrollierter Porengröße zubereitet werden (Sarin et al., 1988, Proc. Nat'1 Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448–7451), etc.
  • Ein Oligonukleotid kann mindestens eine modifizierte Base umfassen, unter der Voraussetzung, daß eine solche Modifikation nicht mit der homologen Rekombination interferiert. Beispielsweise können solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Choruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Pseudouracil, Queosin, 2-thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuemethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil und 2,6-Diaminopurin.
  • Ein Oligonukleotid kann unter der Voraussetzung, daß eine solche Modifikation nicht mit der homologen Rekombination interferiert, mindestens ein modifiziertes Phosphorrück grad aufweisen. Solche Modifikationen können umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf ein Phosporothioat, ein Phosphorodithioat, ein Phosphoramidothioat, ein Phosphoramidothioat ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, ein Alkylphosphotriester und ein Formacetal oder ein Analog davon.
  • 5.3.3 DNA-Vervielfältigung
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird gegebenenfalls im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet, um eine gewünschte Sequenz aus einer Quelle (z. B. einer Gewebeprobe, einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek) zu vervielfältigen. Die Oligonukleotidprimer, die bekannte Sequenzen wiedergeben, können als Primer in der PCR verwendet werden. PCR wird üblicherweise durch Verwendung eines Thermocyclers (z. B. von Perkin-Elmer Cetus) und einer thermostabilen Polymerase (z. B. die Gene AmpTM-Marke der Taq-Polymerase) ausgeführt. Die zu vervielfältigende Nukleinsäure kann umfassen, ist aber nicht eingeschränkt auf mRNA, cDNA oder genomische DNA von jeder Spezies. Das PCR-Vervielfältigungsverfahren ist im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. U.S. Patente Nrn. 4,683,202, 4,683,195 und 4,889,818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Nat'1. Acac. Sci. U.S.A. 85, 7652–7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120, 621–623; Loh et al., 1989, Science 243, 217–220).
  • 5.4 Verfahren für die die diagnotischen Anwendungen
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um verschiedene Infektionen, Zustände, Erkrankungen und Störungen, die mit der Gegenwart fremder DNA oder abgewandelter DNA in Verbindung stehen, nachzuweisen, zu prognostizieren, zu diagnostizieren oder zu überwachen oder die Behandlung davon zu überwachen. Beispielsweise können, wie in 5.4.1 unten beschrieben, die Verfahren verwendet werden, um verschiedene Infektionen und Erkrankungen, wie Erkrankungen, die mit einer viralen Infektion, einer bakteriellen Infektion oder Infektion durch eine Protozoe, einen Parasiten oder ein anderes bekanntes Pathogen in Verbindung stehen, nachzuweisen, zu prognostizieren, zu diagnostizieren oder zu überwachen, verwendet werden. Wie in Abschnitt 5.4.2 unten beschrieben, können die Verfahren auch verwendet werden, um verschiedene Infektionen, Zustände, Erkrankungen und Störungen, die mit der Gegenwart veränderter DNA wie einer genetischen Mutation oder einem einzelnen Polymorphismus (SNP) in Verbindung stehen, nachzuweisen, vorherzusa gen, zu diagnostizieren oder zu überwachen. Verfahren für solche diagnostischen Zwecke sind im Detail hierin unten beschrieben.
  • 5.4.1 Nachweis fremder DNA
  • Die hierin oben beschriebenen Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um fremde DNA wie virale oder bakterielle DNA, die aus der Aussetzung gegenüber einem Pathogen stammen, in einem Patienten, der gegenüber dem Pathogen ausgesetzt wurde, nachzuweisen. Der Patient kann die Symptome der Infektion durch das Pathogen oder die Gegenwart einer Erkrankung oder Störung, die mit der Gegenwart des Pathogens in Verbindung steht, zeigen oder nicht zeigen. In einer Ausführungsform kann die Ziel-DNA-Probe beispielsweise aus der DNA eines Patienten zubereitet werden, der eine solche Erkrankung oder eine Infektion aufweist oder von ihm vermutet wird, eine solche zu haben. Homologiearme, die eine Sequenzhomologie zu einer fremden Ziel-DNA aufweisen, können entworfen und zubereitet werden. Die Proben-DNA kann durch jedes der hierin im Abschnitt 5.1 oben beschriebene Verfahren in eine E. coli-Wirtszelle, die eine bakterielle Rekombinase exprimiert und die die Vektor-DNA enthält, eingeführt werden. In einer alternativen Ausführungsform können Adapter-Oligonukleotide entworfen werden, die eine erste zu einer Vektorsequenz homologe Sequenz enthalten, und eine zweite Sequenz, die homolog zu einer fremden Ziel-DNA-Sequenz ist, enthalten, die, wie im Detail im Abschnitt 5.1 oben beschrieben, orientiert ist. Solche Adapter-Oligonukleotide können entweder verwendet werden, um sie zusammen mit der Test-DNA und der Vektor-DNA einer E. coli-Wirtszelle, die RecE/T oder Redα/β exprimiert, cozutransfizieren oder sie können direkt in Zellen transfiziert werden, die bereits die Vektor-DNA und Proben-DNA enthalten. Die Zellen werden dann in selektivem Medium, wie oben im Abschnitt 5.1 beschrieben, wachsen gelassen und Zellen, die der Selektion widerstehen können, auf die Gegenwart eines Inserts geeigneter Größe hin untersucht werden.
  • Die Ziel-DNA kann aus einem Patienten oder der biologischen Probe einer Person wie beispielsweise, aber nicht eingeschränkt auf, Gesamtblut, Plasma, Serum, Haut, Speichel, Urin, Lymphflüssigkeit, Zellen, die aus einem Biopsieaspirat gewonnen wurden, Gewebekulturzellen, Medium oder nicht-biologischen Proben wie Essen, Wasser oder anderen Materialien isoliert werden. Verfahren für die Zubereitung von DNA aus solchen Quellen sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology Serie der Labortechnik-Handbücher, 1987–1994 Current Protocols, 1994–1997 John Wiley and Sons, Inc.).
  • Beispielsweise können in einer Ausführungsform bei der es gewünscht wird, eine virale Infektion oder Erkrankung nachzuweisen oder zu diagnostizieren, die Homologiearme DNA-Sequenzen umfassen, die homolog zu DNA-Sequenzen bekannter viraler DNA sind. Die Verfahren können verwendet werden, um die virale DNA entweder als einen viralen DNA-Strang oder als ein DNA-Replikationsintermediat eines DNA- oder eines RNA-Virus nachzuweisen und zu isolieren.
  • In einer Ausführungsform kann beispielsweise direkt auf DNA-Genome oder Replikationsintermediate von DNA-Viren unter Verwendung von Homologiearmsequenzen abgezielt werden, die entworfen worden sind, um zu viralen Sequenzen solche DNA-Viren homolog zu sein, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Hepatitis Typ B-Virus, Parvovirus, wie Adeno-assoziierter Virus und Cytomegalovirus, Papovaviren wie Papillomaviren, Polyomaviren und SV 40, Adenovirus, Herpes Virus wie Herpes simplex Typ I (HSV-I), Herpes simplex Typ II (HSV-II) und Epstein-Barr Virus, und Pockenvirus wie Variola (Windpocken) und Vacciniavirus. In einer anderen Ausführungsform kann auf die replikativen Intermediate retroviraler RNA-Viren, die durch DNA-Intermediate replizieren, direkt unter Verwendung von Homologiearmsequenzen abgezielt werden, die entworfen wurden, um homolog zu viralen Sequenzen von solchen RNA-Viren zu sein, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf das humane Immundefizienzvirus Typ I (HTV-I), das humane Immundefizienzvirus Typ II (HTV-II), das humane T-Zellymphotrope Virus Typ I (HTLV-I) und das humane T-Zellymphotrope Virus Typ II (HTLV-II). In einer weiteren Ausführungsform kann, um die genomischen oder replikativen Intermediate des RNA-Virus, der durch ein RNA-Intermediat repliziert, nachzuweisen und zu isolieren, die RNA isoliert werden und in eine cDNA-Kopie der RNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase gemäß im Stand der Technik gut bekannter Verfahren transkribiert werden. Solche cDNA-Kopien können als Ziel-DNA verwendet werden, um die Gegenwart von RNA-Viren wie Influenzavirus, Masernvirus, Tollwutvirus, Sendaivirus, Picomaviren wie Poliomyelitisvirus, Coxsackieviren, Rhinoviren, Reoviren, Togaviren wie Rubellavirus (Deutsche Masern) und Semliki forest-Virus, Arboviren und Hepatitis Typ A-Viren nachzuweisen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei der es erwünscht ist, bakterielle Infektionen zu diagnostizieren oder nachzuweisen, können die Homologiearme DNA-Sequenzen umfassen, die homolog zu DNA-Sequenzen bekannter Bakterien sind. Beispiels weise können in einer Ausführungsform solche Homologiearm-DNA-Sequenzen zu der cDNA oder genomischer DNA eines pathogenen Bakteriums homolog sein, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rikkettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp., und Helicobacter pylori.
  • In einer weiteren Ausführungsform können solche Homologiearm DNA-Sequenzen homolog zu cDNA oder genomischer DNA eines pathogenen Pilzes sein, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, und Histoplasma capsulatum.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei der es erwünscht ist, eine Protozoninfektion zu diagnostizieren oder nachzuweisen, können die Homologiearme DNA-Sequenzen umfassen, die homolog zu DNA-Sequenzen bekannter Protozonen sind. Beispielsweise können solche Homologiearm-DNA-Sequenzen homolog zu der cDNA oder der genomischen DNA bekannter Protozonen sein. Insbesondere sind pathogene Protozonen interessant, wie Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, und Plasmodium malaria.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei der es erwünscht ist, eine parasitäre Infektion zu diagnostizieren oder nachzuweisen, können die Homologiearme DNA-Sequenzen umfassen, die homolog zu DNA-Sequenzen bekannter Parasiten sind. Beispielsweise können solche Homologiearm-DNA-Sequenzen homolog zu der cDNA oder der geno mischen DNA jedes bekannten Parasiten sein, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Helminthen, umfassend Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, und Hakenwürmer.
  • 5.4.2 Diagnose von Mutationen und Polymorphismen in zellulärer DNA
  • Die Verfahren der Erfindung können auch verwendet werden, um genetische Erkrankungen in einer Patientenprobe zu isolieren und nachzuweisen, und verschiedene Zustände, Erkrankungen und Störungen, die mit der Gegenwart veränderter DNA wie einer genetischen Mutation oder eines einzelnen Nukleotidpolymorphismus (SNP) („single nucleotide polymorphism") in Verbindung stehen, zu prognostizieren, zu diagnostizieren oder zu überwachen, sowie eine genetische Anlage für die Entwicklung einer Erkrankung oder Störung nachzuweisen.
  • In einer Ausführungsform kann beispielsweise eine Ziel-DNA-Probe aus DNA hergestellt werden, die aus einer Probe von einem Patienten hergestellt wurde, der eine genetische Erkrankung oder Störung aufweist oder von dem vermutet wird, eine solche aufzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Vektor entworfen und hergestellt werden, der Homologiearme umfasst, die eine Sequenzhomologie zu einem bestimmten interessierenden Gen oder einer interessierenden genomischen Region aufweisen und in eine E. coli-Wirtszelle eingeführt werden, die eine bakterielle Rekombinase wie RecE/T- und/oder Redα/β exprimiert. Die Proben-DNA kann dann in die Wirtszelle eingeführt werden. In einer alternativen Ausführungsform können Adaptoroligonukleotide, die eine erste Sequenz, die zu einer Vektorsequenz homolog ist, und eine zweite Sequenz, die zu der DNA des interessierenden Zielgens homolog ist, umfassen, die wie im Detail im Abschnitt 5.1 oben beschrieben, orientiert ist, entworfen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können solche Adapteroligonukleotide entweder zusammen mit der Proben-DNA, einer E. coli-Wirtszelle, die RecE/T und/oder Redα/β exprimiert und die Vektor-DNA enthält, co-transfiziert werden. Alternativ können alle anderen Verfahren für die homologe Rekombinationsklonierung die im Detail im Abschnitt 5.1 oben beschrieben wurde, verwendet werden. Die Zellen werden im selektiven Medium, wie im Abschnitt 5.1 oben beschrieben, wachsen gelassen und die Zellen, die der Selektion widerstehen, können auf die Gegenwart des Inserts einer geeigneten Größe hin analysiert werden. Die DNA kann dann auf die Gegenwart einer interessierenden Mutation der DNA-Variation hin durch Restriktionsanalysen oder Sequenzierungstechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, analysiert werden (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Serie der Laboratortechnik-Handbücher, 1987–1994 Current Protocols, 1994–1997 John Wiley and Sons, Inc.).
  • In einer alternativen Ausführungsform kann der Homologiearm oder das Adaptoroligonukleotid die Sequenz der interessierenden genetischen Mutation oder des DNA-Polymorphismus enthalten. In dieser Ausführungsform wird die Rekombination auftreten, wenn die Proben-DNA die Mutation enthält. Dies kann für das diagnostische Durchsuchen einer großen Anzahl von Proben auf eine bestimmte Mutation oder einen DNA-Polymorphismus hin, nützlich seien, da nur die Zellen, die eine bestimme Mutation enthalten gegenüber der Selektion resistent sein werden.
  • Die Ziel-DNA kann aus jeder DNA-Probe erhalten werden, wie aus genomischer DNA, cDNA oder mitochondrialer DNA. In einer Ausführungsform kann die Ziel-DNA beispielsweise die Region eines menschlichen Chromosoms sein. In einer anderen Ausführungsform liegt die Ziel-DNA in einer gemischten Population vor, z. B. einer Population genomischer DNA, die von einer Vielzahl interessierender Personen abgeleitet wurde, beispielsweise von Personen, die von einer bestimmten Erkrankung betroffen sind. Eine solche Ziel-DNA kann aus einer biologischen Probe, wie, aber nicht eingeschränkt auf Gesamtblut, Plasma, Serum, Speichel, Urin, Lymphflüssigkeit, Zellen, die aus einem Biopsieaspirat erhalten wurden, Gewebekulturzellen, Medium oder nicht biologischen Proben wie Nahrung, Wasser oder anderen Materialien erhalten werden. Verfahren für die Zubereitung von DNA aus solchen Quellen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology Reihe der Laboratortechnik-Handbücher, 1987–1994 Current Protocols, 1994–1997 John Wiley and Sons, Inc.).
  • Nicht beschränkende Beispiele genetischer Erkrankungen, die unter der Verwendung dieses Verfahrens getestet werden können, umfassen Mutationen und SNPs, die mit Erberkrankungen wie Brca-1 assoziierten Brustkrebs in Verbindung stehen, Mutationen, die mit zystischer Fibrose, Tay-Sachs-Erkrankung, Sichelzellenanämie, Hämophilie, Atherosclerose, Diabetes, Leukämie, Prostata und andere Krebsarten und Fettleibigkeit in Verbindung stehen. Solche Erberkrankungen können degenerative und nicht-degenerative neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, amyotrophe Lateralsclerose, Huntington Syndrom, Wilson-Erkrankung, spinalcerebellare Ataxie, Friedreichs Ataxie und andere Ataxieen, Prion-Erkrankungen, umfassend Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung, Dentatorubralpallidoluysian-Atrophie, spongiforme Encephalopathieen, myotone Dystrophie; Depression, Schizophrenie und Epilepsie. Erberkrankungen können auch metabolische Erkrankungen wie beispielsweise Hypoglykämie oder Phenylketonurie umfassen. Die kardiovasculären Erkrankungen und Zustände umfassen auch die nicht-einschränkenden Beispiele Atherosclerose, Myocardialinfarkt und hohen Blutdruck. Die Erfindung kann des weiteren für den Nachweis und die Diagnose von Lyme-Erkrankung, Tuberkulose und sexuell übertragenen Erkrankungen verwendet werden.
  • In anderen Ausführungsformen können die homologen Rekombinationsklonierungsverfahren der Erfindung für die Bestimmung der genetischen Grundlage einer Erkrankung oder Störung verwendet werden. Beispielsweise kann eine Ziel-DNA aus einer Probe eines Patienten oder von Patienten, die von einer Erkrankung, deren genetische Grundlage nicht bekannt ist, betroffen sind, isoliert werden. In einer Ausführungsform könnten die Klonierungsverfahren verwendet werden, um eine Region eines Chromosoms zu isolieren, von der bekannt ist oder von der vermutet wird, daß es mit einer solchen Erkrankung oder Störung in Verbindung steht, aus einer Patientengruppe, für die bekannt ist oder für die vermutet wird, daß sie eine solche Erkrankung aufweist. Die gewonnene DNA kann dann isoliert werden und weiter auf die Gegenwart der genetischen Mutation oder der Polymorphismen hin unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren für die Kartierung von Variationen in der DNA wie dem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus oder anderen SNP-Detektionsverfahren analysiert werden (siehe z. B. Nikiforov et al., U.S. Patent Nr. 5,679,524, erteilt am 21. Oktober 1997; McIntosh et al., PCT-Publikation WO 98/59066, mit Datum vom 30. Dezember 1998; Goelet et al., PCT-Publikation WO 95/12607, mit Datum vom 11. Mai 1995; Wang et al., 1998, Science 280:1077–1082; Tyagi et al., 1998, Nature Biotechnol. 16:49–53; Chen et al., 1998, Genome Res. 8:549–556; Pastinen et al., 1996, Clin. Chem. 42:1391–1397; Chen et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10756–10761; Shuber et al., 1997, Hum. Mol. Gen. 6:337–347; Liu et al., 1997, Genome Res. 7:389–398; Livak et al., 1995, Nature Genet. 9:341–342; Day und Humphries, 1994, Annal. Biochem. 222:389–395).
  • Nicht beschränkende Beispiele von Zielerkrankungen mit klinischem Interesse umfassen Asthma, Arthritis, Psoriasis, Ekzem, Allergien, Arzneistoffresistenz, Arzneistofftoxizität und Krebse wie, aber nicht eingeschränkt auf, menschliche Sarcome und Carcinome, z. B. Fibrosarcom, Myxosarcom, Liposarcom, Chondrosarcom, osteogenes Sarcom, Chordom, Angiosarcom, Endotheliosarcom, Lymphangiosarcom, Lypmhangioendotheliosarcom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's Tumor, Leiomyosarcom, Rhabdomyosarcom, Coloncarcinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Squamouszellcarcinom, Basalzellcarcinom, Adenocarcinom, Schweißdrüsencarcinom, Sebaceousdrüsencarcinom, papilläre Adenocarcinome, Cystadenocarcinom, medullares Carcinom, bronchiogenes Carcinom, Nierenzellcarcinom, Hepatom, Gallengangcarcinom, Choriocarcinom, Seminom, embryonales Carcinom, Wilms' Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodenkrebs, Lungencarcinom, kleinzelliges Lungencarcinom, Blasencarcinom, Epithelialcarcinom, Gliom, Astrocytom, Medulloblastom, Craniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akkustisches Newom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom; Leukämien, z. B. akute lymphozytische Leukämie und akute myelocytische Leukämie (myeloblastische, promyelozytische, myelomonozytische, monozytische und Erythroleukämie); chronische Leukämie (chronische myelozytische (granulozytische) Leukämie und chronische lymphozytische Leukämie); und Polycythemia vera, Lymphom (Hodgkin's Erkrankung und nicht-Hodgkin's Erkrankung), multiples Myelom, Waldenström's Macroglobulinämie und Schwere-Kettenerkrankung. Die homologen Rekombinations-Klonierungsverfahren können des weiteren bei der Diagnose und dem Nachweis genetischer Unterschiede und der Diagnose von Patienten mit Autoimmunerkrankungen nützlich sein, umfassend, aber nicht beschränkt auf insulinabhängige Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematosus, Sjogren's Syndrom, Skleroderm, Polymyositis, chronische aktive Hepatitis, gemischte Bindegewebserkrankung, primäre Gallenblasenzirrhose, Perniciousanämie, Autoimmunthyroiditis, idiopathische Addison's Erkrankung, Vitiligo, Gluten-sensitive Enteropathie, Graves' Erkrankung, Myasthenia gravis, autoimmune Neutropenie, idiopathische Thrombocytopenie purpura, rheumatoide Arthritis, Zirrhosis, Pemphigus vulgaris, autoimmune Infertilität, Goodpasture-Syndrome, bullöser Pemphigoid, discoider Lupus, ulcerative Colitis und dichte Ablagerungserkrankung.
  • Homologe Rekombinationsklonierungsverfahren können auch für die Isolierung, Diagnose und den Nachweis von DNA-Mutation, Veränderungen, Variationen und SNPs, die nicht mit der Erkrankung in Verbindung stehen, verwendet werden. Nicht einschränkende Beispiele umfassen DNA-Mutationen, Veränderungen, Variationen und SNPs, die in nicht kodierenden genomischen Sequenzen vorhanden sind, oder DNA-Mutationen/- veränderungen, -variationen und SNPs, die mit verschiedenen menschlichen Blutgruppen in Verbindung stehen.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung können die Verfahren der Erfindung besondere Nützlichkeit bei der Isolierung, der Detektion, der Diagnose, der Prognose oder der Überwachung menschlicher DNA-Mutationen, Veränderungen, Variationen und SNPs haben. Es wird jedoch erkannt werden, daß die hierin beschriebenen Verfahren bei der Isolierung, dem Nachweis, der Diagnose, der Prognose oder der Überwachung von Erkrankungen anderer Tiere, beispielsweise von Nutztieren, die Vieh, Pferde, Schafe, Ziegen und Schweine, und Haustiere umfassen, die Katzen und Hunde umfassen, und Pflanzen, die in der Landwirtschaft wichtige Pflanzen und Gartenpflanzen umfassen, nützlich sein werden.
  • 5.5 Kits
  • Die Erfindung stellt des weiteren Kits zur Verfügung, die die Verwendung der hierin beschriebenen homologen Rekombinationsklonierungs- und subklonierungsverfahren ermöglichen. In einer Ausführungsform wird ein Kit zur Verfügung gestellt, umfassend in einem oder mehreren Behältern: A) einen doppel-strängigen DNA-Vektor, der für die direkte Klonierung und Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist, wobei der Vektor ein Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs aufweist: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm; so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang ist und die Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearns des ersten Vektor-DNA-Strangs homologisch zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf dem ersten Ziel-DNA-Strang ist; und b) eine Zelle, die eine bakterielle Rekombinase enthält. Die Zelle kann die Rekombinase endogen oder rekombinant exprimieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Kit, das für die gerichtete Klonierung oder Subklonierung eines Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist in einem oder mehreren Containern zur Verfügung gestellt, umfassend: a) einen doppelsträngige DNA-Vektor, der für die gerichtete Klonierung und Subklonierung eines interessierenden Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang des Vektor-DNA-Strangs umfasst: einen ersten Homologie arm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf einem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang ist und die Nukleotid-Sequenz des zweiten Homologiearms auf dem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Nukleotid-Sequenz des zweiten Terminus auf dem ersten Ziel-DNA-Strang ist; und b) ein erstes doppelsträngiges Oligonukleotid, umfassend einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang umfassend in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine erste Sequenz und eine zweite Sequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz eines ersten Terminus auf einem Ziel-DNA-Strang ist; c) ein zweites Oligonukleotid, umfassend einen zweiten Oligonukleotidstrang, umfassend in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz, wobei die dritte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die vierte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz eines zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist; und d) eine Zelle, die bakterielle Rekombinaseproteine enthält, z. B. RecE/T- und/oder Redα/β-Proteine. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Zelle eine E. coli-Zelle.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Kit mit einem oder mehreren Behältern zur Verfügung gestellt, umfassend: a) einen doppelsträngigen DNA-Vektor, der für die gerichtete Klonierung und Subklonierung eines Ziel-DNA-Moleküls nützlich ist, wobei der Vektor einen Replikationsursprung und zwei Homologiearme in der folgenden Reihenfolge von 5' bis 3' entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfasst: einen ersten Homologiearm, den Replikationsursprung und einen zweiten Homologiearm, so daß die Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf einem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Sequenz des ersten Terminus auf einem ersten Ziel-DNA-Strang ist und die Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem ersten Vektor-DNA-Strang homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Terminus auf dem ersten Ziel-DNA-Strang ist; b) ein erstes doppelsträngiges Oligonukleotid, umfassend einen ersten Oligonukleotid-DNA-Strang, umfassend in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die erste Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des ersten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die zweite Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz auf einem ersten Terminus auf einem Ziel-DNA-Strang ist; und c) ein zweites Oligonukleotid, umfassend einen zweiten Oligonukleotidstrang, umfassend in der folgenden Reihenfolge von 3' bis 5': eine dritte Nukleotidsequenz und eine vierte Nukleotidsequenz, wobei die dritte Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz des zweiten Homologiearms auf dem Vektor-DNA-Strang ist und die vierte Sequenz homolog zu der Nukleotidsequenz eines zweiten Terminus auf dem Ziel-DNA-Strang ist.
  • In verschiedenen spezifischen Ausführungsformen ist die Ziel-DNA des Kits bakterielle, virale, parasitäre, protozoen oder pathogene DNA. In anderen spezifischen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA des Kits eine genetische Mutation oder ein Polymorphismus umfassen, für den bekannt ist oder von dem vermutet wird, daß er mit einer Erkrankung oder Störung in Verbindung steht. In einer anderen spezifischen Ausführungsform haben Oligonukleotidadaptor-Sequenzen oder Vektor-Homologiearme eine Sequenzhomologie zu auf BAC-, PAC-, Lambda-, Plasmid- oder YAC-beruhenden Klonierungsvektoren.
  • 6. Beispiel:RECE/T und REDα/β-Klonierung und Subklonierung
  • Die in diesem Abschnitt gezeigten Beispiele beschreiben eine Anzahl von Experimenten, die die erfolgreiche Klonierung und Subklonierung unter der Verwendung homologer Rekombinationsverfahren der Erfindung aufzeigen. Verschiedene Ansätze für die Subklonierungsverfahren werden gezeigt. Es ist besonders zu beachten, daß ein Beispiel die erfolgreiche Klonierung eines Inserts, das größer als jedes zuvor beschriebene zeigt – die direkte Subklonierung eines 25 kb DNA-Fragments aus einem ungefähr 150 kb BAC-Vektor.
  • 6.1 Verfahren und Materialien
  • Zubereitung linearer Fragmente
  • Standard PCR-Reaktionsbedingungen wurden verwendet, um lineare DNA-Fragmente zu vervielfältigen. Die 1972 bp des p15A-Ursprungs zuzüglich des Kanamycin-Resistenzgens (aus Tn903) aus pACYC177 wurde vervielfältigt. Der Ursprung p15A erlaubt es dem Plasmid oder der Rekombinanten in Zellen mit anderen Plasmiden, die einen Ursprung der ColE1-kompatiblen Gruppe tragen, co zu existieren. Die 1934 bp des Chloramphenicols-resistenten Gens (aus Tn9) zuzüglich des p15A-Ursprungs wurde aus pACYC184 vervielfältigt.
  • Die in der PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide umfassen an ihren 3'-Enden eine 18–30-Nukleotidsequenz, um als Primer der pACYC-Plasmide zu dienen und an den 5'-Enden einen 50–60-Nukleotid-langen Sequenzbereich, der homolog zu den Flanken der Ziel-DNA-Region ist. Für lange Oligonukleotide war die verwendete PCR-Reaktionsanlagerungstemperatur 62°C. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAGEN PCR-Reinigungskit (QIAGEN) gereinigt und mit dH2O eluiert. Die Vorlagen-DNA wurde durch die Verdau-PCR-Produkte Dpn I eliminiert. Nach dem Verdau wurden die PCR-Produkte mit Ethanol präzipitiert und in dH2O mit 0,5 μg/μl resuspendiert.
  • Zubereitung der kompetenten Zellen
  • Elektroporationskompetente Zellen wurden durch Standardverfahren zubereitet. In kürze: Es wurden über-Nacht-Kulturen 100-fach in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika verdünnt. Die E. coli-Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von OD600 = 0,250~4 wachsen gelassen und wurden für 15 Minuten auf Eis gekühlt. Die Bakterienzellen wurden bei 7000 upm für 10 Minuten bei 4–5°C zentrifugiert. Das bakterielle Zellpellet wurde in eiskaltem 10 %igem Glycerin resuspendiert und durch Zentrifugation bei 7000 upm bei –5°C für 10 Minuten niedergeschlagen. Nach dreimaligem Waschen in eiskaltem 10%igen Glycerin und erneuter Zentrifugation wurde der Zellniederschlag in einem Volumen eiskaltem 10%igen Glycerol, das dem Volumen der Zellen entsprach, suspendiert. Die kompetenten Zellen wurden in 50 μl Teilmengen in Eppendorfröhrchen aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei –70°C aufbewahrt.
  • Die Experimente mit dem Plasmid pBAD-ETγ oder pBAD-αβγ beinhalteten die Transformation dieser Plasmide in E. coli-Wirte durch Standardverfahren, gefolgt vom Wachstum über Nacht bis zur Sättigung im LB-Medium zuzüglich 0,2% Glucose, 50 μg/ml Ampicillin, die Kulturen wurden dann 100-fach in LB plus 50 μg/ml Ampicillin verdünnt und bis zu einem OD600 von 0,15 wachsen gelassen. L-Arabinose wurde dann zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzugefügt. Die Zellen wurden bis zu einem OD600 von 0,25–0,4 wachsen gelassen, bevor sie für 15 Minuten auf Eis gekühlt wurden.
  • Elektroporation
  • Eine Lösung von DNA in 1 μl (die ungefähr 0,5 μg DNA oder mehr für die Cotransformation enthält oder ungefähr 0,3 μg Vektor-DNA oder mehr für Zellen, die nur das Ziel enthalten oder ungefähr 0,5 μg DNA oder mehr, für Zellen, die den Vektor enthalten) wurde mit kompetenten Zellen gemischt. Das Zell-DNA-Gemisch wurde in eiskalte Cuvetten überführt. Die Elektroporation wurde unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser durchgeführt, der auf 25 μFD, 2,3 kV gestellt war, wobei der Pulse Controller auf 200 Ohm eingestellt war. LB-Medium (1 ml) wurde nach der Elektroporation hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37°C für 1–1,5 Stunden unter Schütteln inkubiert und dann auf Platten, die das zu dem in dem Vektor enthaltene selektierbare Markergen korrespondierende Antibiotikum enthielten, verteilt.
  • 6.2 Ergebnisse
  • Die Tabelle 1 fasst sechs Experimente zusammen, in denen verschiedene interessierende Ziel-DNA-Regionen unter Verwendung verschiedener Quellen für die RecE/T- oder Redα/β-Expression subkloniert wurden. Die erste Spalte, als „ET-Expression" bezeichnet, gibt die Quelle des RecE/T- oder Redα/β entweder als endogenes RecE/T in E. coli-Wirten JC8679 oder JC9604 oder von den Plasmiden pBAD-recE/T von pBADαβγ, wie angezeigt, wieder. Die zweite Spalte deutet den verwendeten E. coli-Wirt an. Die dritte Spalte deutet die Zielgene an.
  • Im ersten Experiment wurde das RecE-Gen, das in dem E. coli-Chromosom enthalten war, in den E. coli-Stamm JC8679 subkloniert, in dem die RecE/T-Expression konstitutiv ist. Dies wurde unter Verwendung der in 2 dargestellten Strategie erreicht. Oligonukleotide, die folgende Sequenz aufwiesen:
    Figure 00640001
    wurden entworfen und synthetisiert, um den p15A-Replikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das auf pACYC177 vorhanden war, zu vervielfältigen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der ersten Reihe von Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Tabelle 1
    Figure 00650001
  • In einem zweiten Experiment wurde das lacZ-Gen, das im E. coli-Chromosom liegt, in den E. coli-Stamm JC8679 subkloniert, in dem die Expression von recE/T konstitutiv ist. dies wurde unter Verwendung der in der 2 dargestellten Strategie erreicht. Der Vektor wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotide der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00650002
    um den p15A-R eplikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das in pA-CYC 177 vorhanden war, zu vervielfältigen. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 2 in der zweiten Reihe zusammengefaßt.
  • In dem dritten Experiment wurde das lacZ-Gen, das in dem E. coli-Chromosom liegt, in den E. coli-Strang JC9604, in dem die Expression von RecE/T konstitutiv ist, subkloniert.
  • Dies wurde unter Verwendung der in 2 dargestellten Strategie erreicht. Der Vektor wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00660001
    um den p15A-Replikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das in pA-CYX177 vorhanden ist, zu vervielfältigen, und die Ergebnisse werden in der dritten Reihe der Tabelle 1 zusammengefasst.
  • In dem vierten Experiment wurde das Gentamcingen, das auf dem Hochkopieplasmid pFastBAC1 (Gibco) lag, in dem E. coli-Stamm JC5519 unter Verwendung der in der 3 dargestellten Strategie subkloniert. Die Expression von RecE/T wurde durch das Plasmid pBAD-recE/T zur Verfügung gestellt, nachdem dieses Plasmid in den JC5519 transformiert worden war, gefolgt von Arabinoseinduktion vor der Zubereitung der kompetenten Zellen. Der Vektor wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden mit der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00660002
    um den p15A-Replikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das in pA-CYC 177 vorhanden ist, zu vervielfältigen, das PCR-Produkt wurde mit BamHI verdaut pFastBAC1 für die Cotransformation gemischt und auf Gentamicin Plus Kanamycin enthaltenden Platten plattiert.
  • Im fünften Experiment wurde das lacZ-Gen, das auf dem E. coli-Chromosom lag, in den E. coli-Stamm HB101 unter Verwendung der in der 2 dargestellten Strategie subkloniert. Die Expression von Redα/β wurde durch das Plasmid pBADαβγ zur Verfügung gestellt, nachdem dieses Plasmid in HB101 transformiert worden war, gefolgt von Arabinoseinduktion vor der Zubereitung der kompetenten Zellen. Der Vektor wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00670001
    um den p15A-Replikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das in pA-CYC 177 vorhanden war, zu vervielfältigen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in der fünften Reihe der Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Im sechsten Experiment wurde eine 25 kb-Region eines ungefähr 150 kb BAC-Klons, der das Mäuse AF4-Gen trägt, in den E. coli-Stamm HS996 unter Verwendung der in der 3 dargestellten Strategie subkloniert. Die Expression von Redα/β wurde durch das Plasmid pBADαβγ zur Verfügung gestellt, nachdem dieses Plasmid in HS996 transformiert worden war, gefolgt von Arabinoseinduktion vor der Zubereitung der kompetenten Zellen. Der Vektor wurde durch PCR unter der Verwendung von Oligonukleotiden der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00670002
    um den p15A-Replikationsursprung und das Tn903-Kanamycinresistenzgen, das in pA-CYC177 vorhanden ist, zu vervielfältigen. Das PCR-Produkt wurde mit 0,5 μg gereinigter BAC-DNA für die Cotransformation gemischt. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in der sechsten Reihe der Tabelle 1 zusammengefasst. In der 6 wird auch ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel gezeigt, das die mit EcoRI verdaute DNA wiedergibt, die aus 9 unabhängigen Kolonien (Spuren 1–9) isoliert wurde, die aus dem mAF4 BAC-Experiment erhalten wurden unter Verwendung eines EcoRI-Verdaus des Ausgangsvektors als Kontrolle (Spur 10).
  • Im siebten Experiment wurde eine genomische DNA-Region, die ein Ampicillin-Resistenzgen aus dem Hefestamm MGD 353-13D enthielt, unter Verwendung der in der 7 dargestellten Strategie kloniert. Wie in der Abbildung A dargestellt, wurde ein DNA-Fragment, das den p15A-Replikationsursprung flankiert durch 98 oder 102 bp Homologiearme enthielt, wurde auf die 98 und 102 bp flankierenden Regionen des integrierten Ampicillin-Resistenzgens in dem Hefestamm MGD 353-13D abgezielt. Der E. coli-Stamm JC5519 wurde verwendet und die Expression von Redα/β wurde durch das Plasmid pBADαβγ-TET zur Verfügung gestellt, gefolgt von der Arabinoseinduktion vor der Zubereitung der kompetenten Zellen. Das pBADαβγ-TET ist ein Derivat von pBADαβγ, in dem das Ampizillin-Resistenzgen durch das Tetracycline-Resistenzgen ersetzt worden ist. Der Klonierungsvektor wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden der folgenden Sequenz hergestellt:
    Figure 00680001
    um den p15A-Replikationsursprung, der in pACYC 177 vorhanden ist, zu vervielfältigen. Das PCR-Produkt wurde mit 4 μg NcoI verdauter MGD 353-13D genomischer Hefe-DNA für die Cotransformation in JC5519, das Redα/β-von pBADαβγ exprimiert, enthielt, gemischt und nach einer 90 Minuten Erholungs-Kultivierungsphase in L-Brühe bei 37°C auf Ampicillinenthaltenden Platten plattiert. Die Klone wurden durch Selektion auf Ampicillinresistenz hin identifiziert. Achtzehn Kolonien wurden für die DNA-Analyse entnommen. Ein Ethidiumbromid-gefärbtes Gel der zehn, die richtig waren, wird in der 7B gezeigt.
  • Das hierin gezeigte Beispiel verdeutlicht den Erfolg der RecE/T- und Redα/β-homologen Rekombinationklonierungsverfahren unter Verwendung einer großen Vielzahl zirkulärer Ziele von einem Hochkopienplasmid bis zu einem großen Niedrigkopienzahlziel (einem BAC) bis hin zum E. coli-Chromosom.
  • 7. Wirkung von Vektorwiederholungen und Phosphorylierung auf die Klonierungseffizienz
  • Das in diesem Abschnitt gezeigte Beispiel beschreibt die Optimierung der Bedingungen für hoch effiziente Klonierung und Subklonierung unter Verwendung von RecE/T- oder Redα/β-vermittelter homologer Rekombination („ET-Klonierung"). Wie insbesondere in der 8 gezeigt, verbesserte die Eliminierung von Sequenzwiederholung im Vektor die Klonierungseffizienz. Auf der anderen Seite hatte die Gegenwart von 5'Phosphaten an den Enden des linearen Vektors einen sehr geringen Effekt auf die Effizienz der ET-Klonierung.
  • Zuerst wurde die Wirkung der Wiederholung auf die Klonierungseffizienz in dem folgenden Experiment untersucht. Wie in der 8 gezeigt, enthielt der lineare Vektor, der als Klonierungsvehikel verwendet wurde, den p15A-Replikationsursprung, das Chloramphenicolresistenzgen (CmR), eine Nukleotidsequenz, die für die PCR-Vervielfältigung des linearen Vektors erforderlich ist, (in der 8 kursiv dargestellt) flankiert durch Homologiearme zu dem E. coli lacZ-Gen und terminalen Wiederholungssequenzen verschiedener Längen (in Fettdruck angezeigt), die an beiden Enden des linearen Vektors vorhanden sind. Die linearen Vektoren wurden in JC8679 (endogen ET-fähig; Clark, 1974, Genetics, 78, 259–271) oder JC5519 (Willetts und Clark, 1969, J. Bacteriol. 100: 231–239), das pBAD Redα/β exprimiert (Zhang et al., 1998, Nat. Genet. 20:123–128), transformiert. Die Anzahl der auf LB-Platten erhaltenen Kolonien (mit 50 μg/ml Chloramphenicol) nach der ET-Subklonierung unter Verwendung der angezeigten Oligonukleotide für die PCR-Vervielfältigung des linearen Vektors wird in der Tabelle in der 8 gezeigt. Von diesen wurden 18 durch Restriktionsverdau analysiert. Die aufgezeigte Effizienz wurde durch das Teilen der Anzahl der korrekten Rekombinanten durch die Gesamtzahl der erhaltenen Kolonien bestimmt. Somit verringert die Gegenwart terminaler Wiederholungen > 6 Nukleotide deutlich die ET-Subklonierungseffizienz. Alle Hintergrundkolonien enthielten re-ligierten linearen Vektor.
  • Die Wirksamkeit der Phosphorylierung wurde auch untersucht, und die Ergebnisse werden in der 8 gezeigt. Die Enden des linearen Vektors wurden unter Verwendung der T4-DNA-Kinase und von γ-ATP phosphoryliert. Wie in der 8, letzte Spalte, gezeigt, wurde keine Wirkung auf die ET-Subklonierung oder auf die Vektor-Religation beobachtet.
  • Dieses Beispiel zeigt, daß die Gegenwart von Wiederholungssequenzen an den Enden des linearen Vektors oder zwischen den Homologiearmen und den wesentlichen Elementen des Vektors, d. h. dem Replikationsursprung und dem selektierbaren Marker zur Rekombination mit dramatisch verringerten ET-Klonierungs- und Subklonierungseffizienzen führt. Somit enthält in einer bevorzugten Ausführungsform die Sequenz des Homologieklonierungsvektors keine direkt wiederholte Sequenz mit fünf (5) oder mehr Basen außerhalb der Sequenz, die für den Replikationsursprung und den selektierbaren Marker kodieren.
  • 8. Zusätzliche Experimente für die RecE/T- und Redα/β-Klonierung und Subklonierung
  • Die in diesem Abschnitt gezeigten Beispiele beschreiben weitere Experimente, die die erfolgreiche Klonierung und Subklonierungsansätze unter Verwendung von RecE/T- oder Redα/β-vermittelter homologer Rekombination verdeutlichen.
  • Der E. coli-Wirt
  • Wie hierin oben beschrieben, bezeichnet ein „ET-kompetenter Wirt" eine E. coli-Zelle, die dazu in der Lage ist, RecE/T und/oder Redα/β zu exprimieren. Dies kann in einer Vielzahl von Weisen erreicht werden, entweder durch (i) einen Stamm, der endogen RecE/T oder Redα/β exprimiert, oder durch (ii) einem Stamm, in dem RecE/T oder Redα/β von einem exogen eingeführten Plasmid exprimiert werden. Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines auf einem Plasmid beruhenden Expressionsvektors, beruhend auf JC9604 und JC8679 und seinen Derivaten (in erster Linie YZ2000 und YZ2001). Für andere Variationen und Beispiele von ET-kompetenten Wirten siehe Murphy et al., 2000, Gene 246:321–330; Yu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5978–5983; und Datsenko und Wanner, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640–6645.
  • In der ersten Kategorie sind zwei Stämme verwendet worden, die die sbcA-Mutation tragen und die daher endogen RecE/RecT in einem RecA–-Hintergrund tragen (JC 9604; Gillen et al., 1981, J. Bacteriology 145:521–532 oder in einem RecA+ (JC8679; Gillen et al., supra). Der Vorteil der Verwendung dieser Stämme liegt in der Tatsache, daß sie direkt verwendet werden können, ohne die Notwendigkeit, zuerst ein Plasmid einzuführen, um den Stamm ET-klonierungskompetent zu machen. Der Nachteil besteht darin, daß RecE und RecT während der gesamten Klonierungsprozedur konstitutiv exprimiert werden, was das Risiko unerwünschter intramolekularer Rekombination, insbesondere in einem RecA+-Hintergrund erhöht. Ein zweiter Nachteil besteht darin, daß diese JC-Stämme nicht für die Verwendung als Klonierungs- und Vermehrungswirte modifiziert worden sind. Sie enthalten ein vollständig aktives Restriktions-/Modifikationssystem, was als Konsequenz die Wirksamkeit der Einführung großer Moleküle, wie BACs in diese Wirte stark reduziert.
  • Die Wahl, ob ein Wirtsstamm mit einem endogenen oder einem Plasmid-eingeführten Vorrat von RecE/T- oder Redα/β verwenden wird, hängt von der Natur des zirkulären Ziels ab. Unabhängig davon, welche Strategie gewählt wird, ist die Zubereitung guter kompetenter Zellen von entscheidender Bedeutung. Wenn dem Wirtsstamm ein endogenes ET-Klonierungspotential fehlt, muss der Stamm zuerst mit pBAD-αβγ oder pBAD-ETγ transformiert werden. Der sich ergebende Stamm muss dann mit L-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % induziert wachsen gelassen werden und für die Elektroporation zubereitet werden. Empirisch tritt der optimale Erntepunkt für die Zellen bei einen OD600 von ungefähr 0,35 auf, insbesondere, wenn auf große DNA-Substrate abgezielt wird. Wenn die Zellen ein OD600 von größer als 0,5 erreicht haben, sollten sie nicht verwendet werden. Der optimale Induktionszeitpunkt liegt um eine Stunde. Die Elektroporation muss verwendet werden, da es für kein anderes DNA-Einführungsverfahren gefunden wurde, daß es funktioniert. Das Herstellen guter elektrokompetenter Zellen ist für das Erhalten von ET-Rekombinanten wesentlich. Während der Zubereitung elektrokompetenter Zellen sollten alle Schritte auf Eis und in vorbereiteten Behältern und Rotoren durchgeführt werden. Die elektrokompetenten Zellen werden in einem hohen Grad konzentriert: von einer 250 ml-Kultur, die bei OD600 = 0,35 geerntet wird, stellen wir routinemäßig nicht mehr als 10 Teilmengen mit 50 μl kompetenter Zellen her. Die sich ergebende Transformationseffizienz hängt im großen Maße von dem verwendeten Wirtsstamm ab, aber variiert typischerweise um 109 cfu/μg. Ein detailliertes Protokoll, wie man elektrokompetente Zellen zubereitet und wie man die Elektroporation durch führt, kann von http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/stewart/index.html erhalten werden.
  • Das Plasmid pR6K/BAD-αβγ(tet), das in der 9A gezeigt wird, wurde hergestellt, um den BAC-Wirtsstamm HS996 (Invitrogen) die Fähigkeit zu verleihen, die ET-Rekombination auszuführen. Dieses Plasmid beruht auf dem pBAD24-Rückgrad (Guzman et al., 1995, J Bacteriol 177:4121–4130). Das Redα (oder RecE) wird von dem L-Arabinoseinduzierbaren pBAD-Promotor exprimiert und Redβ (oder RecT) wird von dem konstitutiven EM-7-Promotor exprimiert. Die Überexpression von RecT relativ zu RecE oder von Redβ relativ zu Redα, verstärkt die ET-Klonierungseffizienz (im Hinblick auf die Menge der Kolonien auf den Selektionsplatten). Schließlich exprimiert dieses Plasmid konstitutiv das Redγ-Protein, in diesem Fall von dem konstitutivenTn5-Promotor, der notwendig ist, um die Aktivität des RecBCD-Enzyms, das in dem am häufigsten verwendeten Wirtsstämmen vorhanden ist, zu unterdrücken (Murphy, 1991, J. Bacteriology 173:5808–5821). Wenn es nicht aktiviert ist, verhindert RecBCD die ET-Klonierung vollständig, wahrscheinlich da seine Exonukleaseaktivität die lineare DNA abbaut, bevor sie eine Chance zur Rekombination erhält. Somit stellt pBAD-αβγ (tet) ein mobiles System dar, das nach Transformation des Empfängerwirtsstamms regulierbare ET-Klonierungsfähigkeit vermittelt. Im Hinblick auf die Induzierbarkeit der Expression von RecE oder Redα und auf das absolute Erfordernis beide Komponenten des RecE/T und redα/β-Systems cozuexprimieren, damit eine Rekombination auftritt, ist das Rekombinations-Fenster auch durch die Arabinoseinduktionszeit und die Halbwertzeit der am wenigsten stabilen Komponente beschränkt. Zusammengenommen mit den Tatsache, daß die RecA-Wirte am häufigsten verwendet werden, und daß die Wirte auch entweder recBC oder eine phenotypische Kopie von recBC- sein werden (aufgrund der Expression von Redγ), bedeutet dies, daß das Risiko einer unerwünschten intramolekularen Rekombination deutlich verringert ist. Eine weitere nützliche Charakteristik von pBAD-αβγ (tet) ist die, daß diese Plasmide dazu neigen, schnell verloren zu gehen, wenn während der Kultivierung nicht auf sie selektiert wird. Dies liegt wahrscheinlich an der konstitutiven Expression von Redγ und kann auch abhängig von Wirtszellfaktoren variieren, beispielsweise abhängig von der Gegenwart von RecBCD.
  • Die Replikation von pR6K/BAD-αβγ erfordert den R6K-Ursprung und das Pir-116-Protein (Metcalf et al., 1994, Gene 138, 1–7). Das pR6K/BAD-αβγ trägt den R6K-Ursprung, der aus pJP5603 erhalten wurde (Penfold und Pemberton, 1992, Gene 118:145–6), das pir- 116-Replikongen, das die R6K-Ori-Plasmid-Replikation in Bakterien kontrolliert und das Tetracyclin-Resistenzgen tet aus pBR322. Pir-116 ist eine Mutante mit erhöhter Kopienzahl, die es dem R6K-Ursprung-enthaltendem Plasmid erlaubt, in einem E. coli-Stamm mit mehr als 200 Kopien pro Zelle zu existieren. Das pir-116-Gen wurde aus dem E. coli-Stamm BW3647 vervielfältigt und hinter dem lacZ-Promotor kloniert.
  • Um pR6K/BAD/αβγ zu erzeugen, wurde der R6K-Ursprung pir-116 und tetr in pBAD-αβγ durch ET-Rekombination (Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27:1555-1557) durch Ersatz des ColE1-Ursprungs und des ursprünglich in pBAD-αβγ vorhandenen Ampincillin-Resistenzgens eingeführt. In gleicher Weise wurden die R6K/BAD-ETγ und pR6K/BAD/recT erzeugt. Für die Kopienzahl jedes auf R6K-beruhenden Plasmids wurde gefunden, daß sie ungefähr zweimal höher im Vergleich zu dem jeweiligen auf ColElberuhendem Plasmid war. In einem Seite-an-Seite-Vergleich von pR6K/BAD/αβγ und pBAD-αβγ in einem Standard-BAC-Subklonierungstest wurde für das auf R6K-beruhende Plasmid gefunden, daß es effizienter arbeitete (siehe 9B). Das R6K-Replikationssystem, das auf dem pR6K-Plasmid vorhanden war, enthält keine signifikante Sequenzhomologie zu anderen Replikationsursprüngen, umfassend p15a und ColE1. Darüber hinaus sind die auf R6K-beruhenden Plasmide mit jedem anderen Replikationsursprung kompatibel. Somit können Replikationsursprünge wie ColE1 und p15A in den für die ET-Subklonierungen verwendeten linearen Vektor aufgenommen werden.
  • ET-Subklonierung
  • Die Subklonierung eines 19 kb-Fragments, umfassend die Exons 2 und 3 des AF-4-Gens, das auf dem BAC vorhanden ist, wird in der 10 gezeigt. Zuerst wurde pR6K/BAD-αβγ in den BAC-tragenden Stamm transformiert. Die wachsenden Zellen wurden für eine Stunde mit L-Arabinose induziert, worauf elektrokompetente Zellen zubereitet wurden. Diese Zellen wurden durch Elektroporation mit dem linearen Vektor, der p15A-Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen enthielt, β-Lactamase (bla), flankiert durch zwei Homologiearme mit 50 Nukleotiden, die die homologe Rekombination auf die Ziel-DNA auf dem AF-4 BAC steuert, transformiert. Die Rekombinanten wurden nach Wachstum auf LB-Platten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, erhalten.
  • Wie in der 10B gezeigt, wurden 5 unabhängige Kolonien für die Analyse ausgewählt. Die DNA wurde aus 5 unabhängigen Kolonien zubereitet mit HindIII verdaut und auf einem Ethidiumbromid gefärbten Gel analysiert. Die HindIII-verdauten richtigen Kolonien und der lineare Vektor allein wurden als Marker verwendet sowie eine 1 kb-DNA-Leiter (GibcoBRL). Die richtigen Subklone wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • ET-Klonierung
  • Genomische DNA kann auch die direkte Quelle der Ziel-DNA sein, wie in dem Experiment in 11 gezeigt. In diesem Experiment besteht der lineare Vektor aus dem ColE1-Ursprung und dem Kanamycinresistenzgen (kan), flankiert durch Homologiearme, die die Rekombination des dacI/lacZ-Locus, der auf dem E. coli-Chromosom vorhanden ist, steuert (siehe 11A). Die genomische DNA wurde aus E. coli, die durch XhoI-Verdau vorlinearisiert wurde, isoliert. Der lineare Vektor und die vorlinearisierte genomische DNA wurden gemischt und in YZ2000 co-elektroporiert, die endogen RecE/RecT exprimieren. Durch die Auswahl von LB-Platten, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, wurde der gewünschte Subklon, bestehend aus den lacI und lacZ-Gen, dem ColE1-Ursprung und kan erhalten. Wie in der 11B gezeigt, enthielt die Restriktionsanalyse von 16 unabhängigen Kolonien das korrekte Produkt (Spuren 1–16). Die Spur 17 zeigt den linearen Vektor; die Spur M zeigt eine 1 kb DNA-Leiter als Marker (Gibco BRL).
  • Ein weiteres Beispiel einer erfolgreichen ET-Rekombinationsklonierung wird in der 12 gezeigt. In diesem Experiment wurde ein Fragment direkt aus Mäuse-ES-genomische DNA unter Verwendung einer Homologie im Klonierungsvektor kloniert. Wie in der 12A gezeigt, die die Klonierungsstrategie darstellt, wurde ein Neomycin-Resistenzgen (neo) aus Mäuse-ES-Zellen genomischer DNA als Ziel-DNA eingesetzt. Der lineare Vektor bestand aus dem ColE1-Replikationsursprung zuzüglich des Chloramphenicol-Resistenzgens Cmr, flankiert von zwei Armen, die homolog zu dem Tn5-neo-Gen waren. Die erforderliche Mäuse-ES-Zelllinie wurde durch die Transfektion eines Fragmentes, das Tn5-neo unter Kontrolle des PGK-Promotors zuzüglich eines polyA-Schwanzes enthielt, erzeugt. Die genomische DNA wurde aus G418-resistenten Kolonien zubereitet und mit einer Nadel geschert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion zubereitet, was zu linearen Fragmenten von ungefähr 20–40 kb führte.
  • Die ET-Klonierung wurde durch die Co-Elektroporation des linearen Vektors und der gescherten genomischen DNA in YZ2000, ein JC 8679-Derivat (Clark, supra), indem das Restriktionssystem, das fremde methylierte DNA abbaut, durch die Deletion von mcrA, mcrBC, hsdRMS und mrr-Gene zum Teil ausgeschaltet ist, durchgeführt. Da die Überexpression von RecT die gesamt ET-Rekombinationseffizienz in großem Umfang verstärkt, wurde YZ2000 mit dem pR6K/BAD/recT-Plasmid transformiert. Die YZ2000-Zellen, die pR6K/BAD/recT trugen, wurden vor dem Ernten für eine Stunde mit L-Arabinose induziert, wurden durch Elektroporation mit 0,5 μg linearem Vektor und 5,0 μg gescherter Maus ES-Zell genomischer DNA co-transformiert. Ein Durchschnitt von 25–35 Kolonien wurde auf LB-Platten, die 50 μg/ml Chloramphenicol enthielten, erhalten. Durch das Wiederausstreichen dieser Kolonien auf Platten, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, wurde für 6 von 30 getesteten Kolonien, durch das Messen der Tn5-neo-Expression gefunden, daß sie wuchsen. In der 12, Bild B zeigte die Restriktionsanalyse von Kanamycin-resistenten Kolonien, daß für alle 6 getesteten Kolonien gefunden wurde, daß sie richtig waren (Spuren 2–7). Das Restriktionsmuster einer falsch-Positiven, die in der Gegenwart von Chloramphenicol wuchs, aber nicht in Gegenwart von Kanamycin wuchs, wird in der Spur 1 gezeigt. Alle diese falsch-Positiven enthielten religierten Vektor.
  • Ein Experiment, das eine Kombination von ET-Subklonierung und Klonierung zeigt, ist in der 13 gezeigt. Der lineare Vektor bestand aus dem ColE1-Replikationsursprung zuzüglich des Kanamycin-Resistenzgens Kmr. Jeder Terminus des linearen Vektors bestand aus einer BstZ17I-Stelle und 2 Homologiearmen. Die Homologiearme, die an den Enden des linearen Vektors vorhanden sind (in der 13 durch kleine Kästchen angedeutet) sind zu der λ-Phagen Ziel-DNA homolog. Die zweite Gruppe der Homologiearme (durch die größeren Kästchen angedeutet) ist zu den lacI-lacZ-Genen homolog, die in dem E. coli-Chromosom vorhanden sind.
  • In dem ersten Subklonierungsschritt wurde der lineare Vektor mit linearer λ-Phagen Ziel-DNA in den ET-fähigen E. coli-Stamm JC8679 der ΔlacZ co-elektroporiert. Dies führte zur Subklonierung eines 6,7 kb λDNA-Fragments, umfassend die exo-, bet-, gam-, rexA- und cI857-Gene in den linearen Vektor, wodurch pYZN/λ-PR erzeugt wurde. Für den nächsten ET-Rekombinationsschritt wurde ein neuer linearer Vektor verwendet, der das Chloramphenicol-Resistenzgen cat, flankiert durch mutierte laxP-Stellen (loxP*, Araki et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:868–872), sowie terminale Arme, die homolog zu der λ-DNA, die auf pYZN/λ-PR vorhanden sind, enthielt. Dieser lineare Vektor wurde mit pYZN/λ-PR in einen ET-fähigen Stamm JC8679ΔlacZ co-elektroporiert, was zur Bildung von pYZN/λ-PR/Cm führte. Aus diesem Plasmid wurde das cat-enthaltende λ DNA-Fragment, das durch zwei terminale Arme flankiert wurde, die homolog zu dem lacI-lacZ waren, durch BstZ17I-Verdau freigesetzt. Dieses Fragment wurde verwendet, um auf das Chromosom des E. coli-Stamms JC559 (Willetts und Clark, 1969, J. Bacteriol, 100:231–239) der RecE und RecT vom pBADRecE/T (Zhang et al., 1998, Nature Genetics 20:123–128) exprimiert, abzuzielen. Nach der ET-Rekombination und der Selektion auf das Wachstum in Gegenwart von 20 μg/ml Chloramphenicol wurde der YZ2001/Cm-Stamm erzeugt. Die Deletion des cat, um YZ2001 zu erzeugen, wurde durch die Verwendung des 705-Cre-Plasmids, das identisch zu dem 705-Cre mit dem Unterschied war, daß es das Tetracyclin-Resistenzgen (tetr) statt des Chloramphenicol-Resistenzgens trägt, wie beschrieben, ausgeführt (Buchholz et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24:3118–3119). Somit trug YZ2001 das 6,7 kb λ DNA -Fragment (exo----eI857) zuzüglich einer mutierten loxP-Stelle auf dem Chromosom. Da YZ2001/Cm die Hitzeinduzierbare Expression der λ-Gene exo, bet und gam erlaubt, ist er konditionell ET-fähig. Eine ähnliche Strategie kann beispielsweise verwendet werden, um Knock-out-Konstrukte herzustellen oder um BAC-Modifikationen durchzuführen.
  • Somit stellen die oben dargestellten Beispiele mehrere Ansätze für die erfolgreiche Klonierung und Subklonierung unter Verwendung von RecE/T- und Redα/β-vermittelter homologer Rekombination dar.

Claims (62)

  1. Verfahren zur Einführung einer doppelsträngigen Ziel-DNA-Sequenz in einen Vektor durch homologe Rekombination, wobei die Ziel-DNA-Sequenz auf einer Seite von einem ersten doppelsträngigen DNA-Terminus und von einem zweiten doppelsträngigen DNA-Terminus auf der anderen Seite flankiert ist, wobei die Zielsequenz und der erste und zweite Terminus auf irgendeinem unabhängig replizierenden DNA-Molekül oder irgendeiner DNA-Quelle vorhanden sind, wobei das Verfahren umfasst: a) Konstruieren einer Vektor-DNA, die, in der nachfolgenden Reihenfolge längs des Vektor-DNA-Strangs, aufweist: (i) einen ersten doppelsträngigen Homologiearm; (ii) einen Replikationsstartpunkt; und (iii) einen zweiten doppelsträngigen Homologiearm, wobei die Sequenz eines Strangs des ersten Homologiearms der Vektor-DNA homolog zu der Sequenz eines DNA-Strangs des ersten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, die Sequenz eines Strangs des zweiten Homologiearms der Vektor-DNA homolog zu der Sequenz eines DNA-Strangs des zweiten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, wobei die Orientierung der beiden Arme relativ zu dem gewünschten Insert die gleiche ist wie die Orientierung der homologen Arme relativ zu der Ziel-DNA, so daß eine Rekombination zwischen den Homologiearmen und den ersten und zweiten Termini dazu führt, daß die gewünschte Zielsequenz zwischen die Homologiearme eingeführt wird; b) Einführen der Vektor-DNA in eine Zelle; und c) Kultivieren der Zelle unter solchen Bedingungen, daß die Ziel-DNA-Sequenz in die Vektor-DNA zwischen den Homologiearmen eingeführt wird, wobei, unter den genannten Kultivierungsbedingungen, die Zelle (i) die Ziel-DNA aufweist und (ii) eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei eine derartige Rekombinase von Phagen- oder Bakterien-Herkunft ist und in der Lage ist, eine homologe Rekombination zu vermitteln, oder ein funktionelles Äquivalent davon.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, das das Einführen der Ziel-DNA-Sequenz in die Zelle, die die Vektor-DNA enthält, umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle, in die die Vektor-DNA eingeführt wird, eine Zelle ist, die eine doppelsträngige Ziel-DNA-Sequenz enthält.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ziel-DNA-Sequenz mit der Vektor-DNA in die Zelle eingeführt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle außerdem eine Nukleotid-Sequenz enthält, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, die funktionsgerecht mit einem Promotor verknüpft ist, wobei der Vektor außerdem eine erste und zweite Erkennungssstelle für die ortsspezifische Rekombinase umfasst, wobei die erste Erkennungssstelle außerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist, und eine zweite Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase innerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und wobei die Kultivierungsbedingungen außerdem die Expression der ortsspezifischen Rekombinase umfassen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle außerdem eine Nukleotid-Sequenz enthält, die für eine ortsspezifische Endonuklease codiert, die funktionsgerecht mit einem Promotor verknüpft ist, wobei der Vektor außerdem eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Endonuklease umfaßt, die innerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und die Kultivierungsbedingungen außerdem die Expression der ortsspezifischen Endonuklease umfassen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor außerdem einen selektierbaren Marker umfaßt, der außerhalb der beiden ersten und zweiten doppelsträngigen Homologiearme angeordnet ist, so daß der Vektor, in einer der beiden folgenden Anordnungen entlang eines Vektor-DNA-Strangs umfaßt: (i) den ersten Homologiearm, den selektierbaren Marker, den Replikationsstartpunkt und den zweiten Homologiearm, oder (ii) den ersten Homologiearm, den Replikationsstartpunkt, den selektierbaren Marker und den zweiten Homologiearm.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der selektierbare Marker der Zelle, die den Vektor enthält, eine Antibiotikaresistenz verleiht.
  9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die bakterielle Rekombinase RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase oder sowohl RecE/T- als auch Redα/β-Rekombinasen ist.
  10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine E. coli-Zelle ist.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zell eine eukaryotische Zelle ist, die rekombinant RecE/T- und/oder Redα/β-Rekombinase exprimiert.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, das außerdem das Isolieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die in den Vektor eingeführte Ziel-DNA-Sequenz aufweist, aus der Zelle umfaßt.
  14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Ziel-DNA-Sequenz ein Mitglied einer DNA-Bank ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die DNA-Bank eine BAC-, PAC-, YAC, Cosmid- oder Lambda-Bank ist.
  16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei für die Ziel-DNA-Sequenz bekannt ist oder vermutet wird, daß sie mit einer Störung oder Erkrankung assoziiert ist, wenn sie genetisch mutiert ist.
  17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Ziel-DNA-Sequenz eine bakterielle, virale, parasitäre oder protozoische DNA ist.
  18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, das außerdem den Nachweis eines rekombinanten DNA-Moleküls umfaßt, das die in Vektor eingeführte Ziel-DNA-Sequenz aufweist.
  19. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines infektiösen Mittels, das die Durchführung des Verfahrens von Anspruch 18 umfaßt, wobei die Ziel-DNA-Sequenz von einem Patienten erhalten wurde, der im Verdacht steht, die infektiöse Erkrankung zu haben, und wobei die Sequenzen der beiden ersten und zweiten Homologiearme homolog zu Sequenzen sind, die in der DNA des infektiösen Mittelns vorhanden sind.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das infektiöse Mittel ein Virus, eine Bakterium, ein Protozoon, ein Pilz oder ein Parasit ist.
  21. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines genetischen Zustands, einer genetischen Krankheit, einer Störung oder einer polymorphen Anlage, das die Durchführung des Verfahrens von Anspruch 18 umfaßt, wobei die Ziel-DNA-Sequenz von einem Patienten erhalten wurde, der im Verdacht steht, daß er einen genetischen Zustand, eine genetische Krankheit, Störung oder polymorphe Anlage aufweist, und wobei die Sequenz des ersten Homologiearms homolog zu der Sequenz stromaufwärts von einem Ort ist, von dem bekannt ist oder vermutet wird, daß er mit dem genetischen Zustand, der genetischen Krankheit, Störung oder polymorphen Anlage assoziiert ist, und die Sequenz des zweiten Homologiearms homolog zu der Sequenz stromabwärts von einem Ort liegt, von dem bekannt ist, oder vermutet wird, daß er mit dem genetischen zustand, der genetischen Krankheit, Störung oder polymorphen Anlage assoziiert ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der genetische Zustand, die genetische Krankheit, die genetische Störung oder die polymorphe Anlage Krebs, Asthma, Arthritis, Arzneimittelresistenz, Arzneimitteltoxizität oder ein neutraler, neuropsychiatrischer, metabolischer, muskulärer, kardiovaskulärer oder Haut-Zustand, eine solche Erkrankung oder Störung ist oder den Patienten dafür disponiert.
  23. Verfahren zur Herstellung eines doppelsträngigen DNA-Vektors zur Verwendung beim gerichteten Klonieren oder Subklonieren einer Ziel-DNA-Sequenz, wobei die Ziel-DNA-Sequenz von einem ersten doppelsträngigen Terminus auf einer Seite und von einem zweiten doppelsträngigen Terminus auf der anderen Seite flankiert ist, wobei die Ziel-Sequenz und die ersten und zweiten Termini auf irgendeinem unabhängig replizierenden DNA-Molekül, oder irgendeiner DNA-Quelle vorhanden sind, das das Inkorporieren von einem ersten und einem zweiten Homologiearm in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umfaßt, wobei das doppelsträngige DNA-Molekül einen Replikationsstartpunkt umfaßt, um auf diese Weise eine Vektor-DNA zu erhalten, die, über die Länge des Vektor-DNA-Strangs, in der folgenden Reihenfolge aufweist: (i) einen ersten doppelsträngigen Homologiearm, (ii) den Replikationsstartpunkt, und (iii) einen zweiten Homologiearm, wobei die Sequenz eines Strangs des ersten Homologiearms der Vektor-DNA- homolog zu der Sequenz eines DNA-Strangs des ersten Terminus, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, ist, und die Sequenz eines Strangs des zweiten Homologiearms der Vektor-DNA homolog zur Sequenz eines DNA-Stranges des zweiten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, wobei die Orientierung der beiden Arme relativ zu dem gewünschten Insert die gleiche ist wie die Orientierung der homologen Arme relativ zu der Ziel-DNA, so daß eine Rekombination zwischen den Homologiearmen und den ersten und zweiten Termini dazu führt, daß die gewünschte Ziel-Sequenz zwischen die Homologiearme inseriert wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Replikationsstartpunkt ein bakterieller Replikationsstartpunkt ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Replikationsstartpunkt in E. coli funktioniert.
  26. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Replikationsstarlpunkt in einer Säugetierzelle funktioniert.
  27. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die Herstellung eines doppelsträngigen Vektors nach dem Verfahren von Anspruch 23 umfaßt, das außerdem die Schritte umfaßt: a) Einführen des Vektors in eine Zelle, b) Kultivieren der Zelle unter solchen Bedingungen, daß die Ziel-DNA-Sequenz in die Vektor-DNA zwischen den Homologiearmen eingeführt wird, wobei, unter den Kultivierungsbedingungen, die Zelle (i) die genannte Sequenz-DNA aufweist und (ii) eine funktionelle Rekombinase exprimiert, wobei eine derartige Rekombinase von Phagen- oder Bakterien-Herkunft ist und in der Lage ist, eine homologe Rekombination zu vermitteln, oder ein funktionelles Äquivalent davon.
  28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27, bei dem der Vektor ein linearer Vektor ist.
  29. Verfahren zur Einführung einer doppelsträngigen Ziel-DNA-Sequenz in einen Vektor durch homologe Rekombination, wobei die Ziel-DNA-Sequenz auf einer Seite von einem ersten doppelsträngigen DNA-Terminus und auf der anderen Seite von einem zweiten doppelsträngigen DNA-Terminus flankiert wird, wobei die Ziel-Sequenz und beide ersten und zweiten Termini auf irgendeinem unabhängig replizierenden DNA-Molekül oder irgendeiner DNA-Quelle vorhanden sind, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bereitstellen einer Vektor-DNA, eines ersten doppelsträngigen Adaptor-Oligonukleotids und eines zweiten doppelsträngigen Adaptor-Oligonukleotids, wobei – die Vektor-DNA, in der folgenden Reihenfolge über die Länge des Vektor-DNA-Stranges, aufweist: (i) einen ersten doppelsträngigen Homologiearm, (ii) einen Replikationsstarlpunkt; und (iii) einen zweiten doppelsträngigen Homologiearm, – das erste doppelsträngige Adaptor-Oligonukleotid eine erste und zweite Nukleotid-Sequenz aufweist, wobei die erste Nukleotid-Sequenz homolog zu der Sequenz eines DNA-Strangs des ersten Homologiearms des Vektors ist, die die Ziel-DNA-Sequenzen flankieren; – und das zweite doppelsträngige Adaptor-Oligonukleotid eine dritte und eine vierte Nukleotid-Sequenz aufweist, wobei die dritte Nukleotid-Sequenz homolog zu der Sequenz eines Strangs des zweiten Homologiearms des Vektors ist, und die vierte Nukleotid-Sequenz homolog zur Sequenz eines DNA-Strangs des zweiten Terminus ist, der die Ziel-DNA-Sequenz flankiert; wobei die Orientierung der beiden Arme relativ zu dem gewünschten Insert die gleiche ist wie die Orientierung der homologen Arme relativ zu der Ziel-DNA, so daß die Rekombination zwischen den Homologiearmen und den ersten und zweiten Termini dazu führt, daß die gewünschte Ziel-Sequenz zwischen den Homologiearmen eingeführt wird, b) Einführen der Vektor-DNA und der ersten und zweiten doppelsträngigen Oligonukleotide in eine Zelle; und c) Kultivieren der Zelle unter solche Bedingungen, daß die Ziel-DNA-Sequenz in die Vektor-DNA zwischen den Homologiearmen eingeführt wird, wobei, unter den Kultivierungsbedingungen, die Zelle (i) die Ziel-DNA-Sequenz aufweist und (ii) eine bakterielle Rekombinase exprimiert, wobei eine solche Rekombinase von Phagen- oder Bakterien-Herkunft ist und in der Lage ist, eine homologe Rekombination zu vermitteln, oder ein funktionelles Äquivalent davon.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, das das Einführen der Ziel-DNA-Sequenz in die Zelle, die die Vektor-DNA enthält, umfaßt.
  31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zelle, in die die Vektor-DNA eingeführt wird, eine Zelle ist, die eine doppelsträngige Ziel-DNA-Sequenz enthält.
  32. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Ziel-DNA-Sequenz mit der Vektor-DNA in die Zelle eingeführt wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zelle außerdem eine Nukleotid-Sequenz enthält, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, die funktionsgerecht mit einem Promotor verknüpft ist, und wobei der Vektor außerdem eine erste und zweite Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase umfaßt, wobei die erste Erkennungsstelle außerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist, sowie eine zweite Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Rekombinase, die innerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist; und wobei die Kultivierungsbedingungen außerdem die Expression der ortsspezifischen Rekombinase umfassen.
  34. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zelle außerdem eine Nukleotid-Sequenz enthält, die für eine ortsspezifische Endonuklease codiert, die funktionsgerecht mit einem Promotor verknüpft ist, und wobei der Vektor außerdem eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Endonukleae aufweist, die innerhalb der beiden ersten und zweiten Homologiearme angeordnet ist, und wobei die Kultivierungsbedingungen außerdem die Expression der genannten ortsspezifischen Endonuklease umfassen.
  35. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Vektor außerdem einen selektierbaren Marker umfaßt, der so außerhalb der beiden ersten und zweiten doppelsträngigen Homologiearme angeordnet ist, daß der Vektor, in irgendeiner der folgenden beiden Reihenfolgen über die Läge eines Vektor-DNA-Strangs, aufweist: i) den ersten Homologiearm, den selektierbaren Marker, den Replikationsstartpunkt und den zweiten Homologiearm, oder ii) den ersten Ho mologiearm, den Replikationsstartpunkt, den selektierbaren Marker und den zweiten Homologiearm.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei der selektierbare Marker der Zelle, die den Vektor enthält, eine Antibiotikaresistenz verleiht.
  37. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die bakterielle Rekombinase RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase oder sowohl RecE/T- als auch Redα/β-Rekombinasen ist.
  38. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle eine E. coli-Zelle ist.
  40. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist, die rekombinant RecE/T- und/oder Redα/β-Rekombinase exprimiert.
  41. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, das außerdem das Isolieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die in den Vektor eingeführte Ziel-DNA-Sequenz aufweist, aus der Zelle umfaßt.
  42. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die Ziel-DNA-Sequenz ein Mitglied einer DNA-Bank ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei die DNA-Bank eine BAC-, PAC-, YAD-, Cosmid- oder Lambda-Bank ist.
  44. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei für die Ziel-DNA-Sequenz bekannt ist oder vermutet wird, daß sie mit einer Störung oder einer Erkrankung assoziiert ist, wenn sie genetisch mutiert ist.
  45. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die Ziel-DNA-Sequenz eine bakterielle, virale, parasitäre oder protozoische DNA ist.
  46. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 36, das außerdem den Nachweis eines rekombinanten DNA-Moleküls umfaßt, das die in den Vektor eingeführte Ziel-DNA-Sequenz aufweist.
  47. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines infektiösen Mittels, das das Durchführen des Verfahrens von Anspruch 46 umfaßt, wobei die Ziel-DNA-Sequenz von einem Patienten erhalten wurde, der im Verdacht steht, die infektiöse Erkrankung aufzuweisen, und wobei die Sequenzen der ersten und zweiten doppelsträngigen Adaptor-Oligonukleotide homolog zu den Sequenzen sind, die in der DNA des infektiösen Mittels vorhanden sind.
  48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei das infektiöse Mittel ein Virus, ein Bakterium, ein Protozoon, ein Pilz oder ein Parasit ist.
  49. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines genetischen Zustands, einer genetischen Erkrankung, genetischen Störung oder einer polymorphen Anlage, das das Durchführen des Verfahrens von Anspruch 46 umfaßt, wobei die Ziel-DNA-Sequenz von einem Patienten erhalten wurde, von dem man vermutet, daß er den genetischen Zustand, die genetische Krankheit, die genetische Störung oder polymorphe Anlage aufweist, und wobei die Sequenz des ersten doppelsträngigen Adaptor-Oligonukleotids homolog zu der Sequenz stromaufwärts von einem Ort ist, für den bekannt ist oder vermutet wird, daß er mit dem genetischen Zustand, der genetischen Krankheit, der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage assoziiert ist, und die Sequenz des zweiten doppelsträngigen Adaptor-Oligonukleotids homolog zu der Sequenz stromabwärts eines Orts ist, für den bekannt ist oder vermutet wird, daß er mit dem genetischen Zustand, der genetischen Erkrankung, der genetischen Störung oder der polymorphen Anlage assoziiert ist.
  50. Verfahren nach Anspruch 49, wobei der genetische Zustand, die genetische Erkrankung, die genetische Störung oder die polymorphe Anlage Krebs, Asthma, Arthritis, Arzneimittelresistenz, Arzneimitteltoxizität oder ein neuraler, neuropsychiatrischer, metabolischer, muskulärer, kardiovaskulärer oder Haut-Zustand, eine solche Erkrankung oder Störung ist oder den Patienten dafür disponiert.
  51. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29 bis 50, bei dem der Vektor ein linearer Vektor ist.
  52. Kit, der für das gerichtete Klonieren oder Subklonieren einer Ziel-DNA-Sequenz nützlich ist, der in einem oder mehreren Behältern umfaßt: a) einen doppelsträngigen DNA-Vektor, wie er im Anspruch 29 definiert ist; und b) ein erstes doppelsträngiges Adaptor-Oligonukleotid, wie es in Anspruch 29 definiert ist; und c) ein zweites doppelsträngiges Adaptor-Oligonukleotid, wie es in Anspruch 29 definiert ist.
  53. Kit nach Anspruch 52, der außerdem d) eine Zelle umfaßt, die eine bakterielle Rekombinase enthält.
  54. Kit nach Anspruch 53, wobei die Zelle eine E. coli Zelle ist.
  55. Kit nach Anspruch 54, wobei die Zelle eine gefrorene Zelle ist, die für die DNA-Aufnahme kompetent ist.
  56. Kit nach Anspruch 52, wobei der DNA-Vektor gereinigt ist.
  57. Kit nach Anspruch 52, wobei der DNA-Vektor, das erste doppelsträngige Oligonukleotid, und das zweite doppelsträngige Oligonukleotid gereinigt sind.
  58. Kit nach Anspruch 52, wobei die Ziel-DNA-Sequenz bakterielle, virale, parasitische oder protozoische DNA umfasst.
  59. Kit nach Anspruch 52, wobei die Ziel-DNA-Sequenz eine genetische Mutation oder einen Polymorphismus umfaßt, für die (den) bekannt ist oder vermutet wird, daß sie (er) mit einer Störung oder Erkrankung assoziiert ist.
  60. Kit nach Anspruch 52, wobei die bakterielle Rekombinase RecE/T- oder Redα/β-Rekombinase oder sowohl RecE/T- als auch Redα/β-Rekombinasen ist.
  61. Kit nach Anspruch 52, wobei das erste und zweite doppelsträngige Oligonukleotid eine Nukleotid-Sequenz-Homologie zu einem Klonierungsvektor auf BAC-, PAC-, Lambda-, Plasmid- oder YAC-Basis aufweist.
  62. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 52 bis 61, wobei der Vektor ein linearer Vektor ist.
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