ES2249291T3

ES2249291T3 - Metodos y composiciones para la clonacion y subclonacion dirigidas utilizando recombinacion homologa.

Info

Publication number: ES2249291T3
Application number: ES00954461T
Authority: ES
Inventors: Francis A. Stewart; Youming Zhang; Joep Pieter Paul Muyrers
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2020-07-10
Also published as: HK1046926A1; JP4312981B2; HUP0201963A3; AU6691100A; IL147385A0; JP5067970B2; CN101492694A; CN1373803A; EP1204740B1; ZA200200152B; JP2003504053A; CA2377938A1; BR0012283A; AU781379B2; MX252928B; MXPA02000233A; DK1204740T3; KR20020033726A; KR100751587B1; YU1502A

Abstract

Método para introducir una secuencia de ADN diana bicatenaria en un vector mediante recombinación homóloga, secuencia de ADN diana que está flanqueada por un primer término de ADN bicatenario por un lado, y por un segundo término de ADN bicatenario por el otro lado, secuencia diana y primer y segundo términos que residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente o cualquier fuente de ADN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: a)construir un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario; (ii) un origen de replicación; y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario, siendo la secuencia de una cadena del primer brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN delsegundo término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de las secuencias homólogas con relación al ADN diana de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos da como resultado que se inserte la secuencia diana deseada entre los brazos de homología, b)introducir dicho ADN vector en una célula; y c)cultivar dicha célula en condiciones de forma que la secuencia de ADN diana se introduzca en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, bajo dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicho ADN diana y (ii) expresa una recombinasa bacteriana, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano y siendo capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.

Description

Métodos y composiciones para la clonación y subclonación dirigidas utilizando recombinación homóloga.

1. Introducción

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la clonación y subclonación de ADN utilizando recombinación homóloga mediada por recombinasa bacteriana. En una forma de realización específica, se usan las recombinasas RecE/T o Red\alpha/\beta, o cualquier sistema funcionalmente equivalente para iniciar la recombinación homóloga bacteriana, tal como erf del fago P22. En particular, la invención se refiere a métodos de clonación, métodos de diagnóstico, a composiciones que comprenden polinucleótidos útiles como vectores para la clonación, a células que comprenden tales composiciones polinucleotídicas, y a kits útiles para la clonación mediada por RecE/T y Red\alpha/\beta.

2. Antecedentes de la invención

La clonación y la subclonación de ADN en E. coli son fundamentales para la biología molecular. La clonación de ADN se refiere al proceso mediante el cual se enlaza de forma operable un origen de replicación a un fragmento de ADN bicatenario, y se propaga en E. coli, u otro hospedante adecuado. La subclonación de ADN se refiere al proceso mediante el cual se toma un fragmento de ADN bicatenario, a partir de una molécula de ADN que ya se ha amplificado, ya sea in vitro, por ejemplo mediante PCR, o in vivo mediante propagación en E. coli u otro hospedante adecuado, y después se enlaza a un origen de replicación operable. La clonación y la subclonación en E. coli se realiza típicamente ligando los extremos de un fragmento de ADN a los extremos de un vector linealizado que contiene un origen de replicación de E. coli y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable se incluye en el vector para asegurarse de que el producto recientemente clonado, el plásmido que contiene el inserto, se retiene y se propaga cuando se introduce en su célula hospedante de E. coli.

Los métodos de clonación convencionales tienen ciertas limitaciones. Por ejemplo, puesto que la clonación convencional requiere el uso de enzimas de restricción, la elección de fragmentos de ADN está limitada por la disponibilidad de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción en la región de ADN de interés. Se deben encontrar sitios de restricción que corten las fronteras, pero no el interior, del fragmento de ADN deseado. Puesto que las enzimas de restricción más útiles cortan de forma bastante frecuente, el tamaño del fragmento de ADN lineal obtenido también está limitado.

El uso creciente de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para generar fragmentos de ADN presenta un segundo inconveniente principal para la subclonación convencional. Los extremos de los productos de la PCR son ineficaces en reacciones de ligación debido a nucleótidos que no forman parte del molde, añadidos mediante polimerasa termoestable a los términos 3' de los productos de la PCR amplificados. Además, el uso de PCR implica un riesgo elevado de mutaciones. De este modo, los biólogos moleculares han buscado nuevos métodos más eficaces para clonar fragmentos de ADN, particularmente cuando tales fragmentos son más largos que aquellos convenientemente accesibles mediante metodologías con enzimas de restricción o PCR.

La recombinación homóloga es un enfoque alternativo para la clonación y la subclonación de fragmentos de ADN. Se han descrito métodos para subclonar productos de PCR en E. coli que explotan los sistemas de recombinación homóloga del hospedante (Oliner et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:5192-97; Bubeck et al., 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602). En tales métodos, se usan cebadores de PCR, diseñados para contener secuencias terminales homólogas a las secuencias localizadas en los extremos de un vector linealizado, para amplificar un fragmento de ADN de interés. El producto de la PCR y el vector linealizado se introducen entonces en E. coli. La recombinación homóloga con la célula hospedante de E. coli da como resultado la inserción de las secuencias del producto de la PCR en el vector plasmídico. Aunque estos métodos han demostrado ser útiles para subclonar fragmentos de PCR, no se han aplicado para subclonar fragmentos largos de ADN, o para clonar fragmentos de ADN de cualquier tamaño.

Otro método describe un método de subclonación in vivo en el que se usan dos moléculas de ADN lineales, una de las cuales tiene un origen de replicación, y que tienen largas regiones de homología en sus extremos, para transformar una célula hospedante sbcBC de E. coli. La recombinación homóloga se produce in vivo, y da como resultado la circularización y la propagación del plásmido recientemente formado (Degryse, 1996, Gene 170:45). Subsiguientemente, la capacidad de las células hospedantes sbcBC de E. coli para mediar la recombinación homóloga se ha aplicado a la subclonación de grandes fragmentos de ADN procedentes de ADN genómicos de adenovirus y de virus del herpes (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70:4805; Messerle, et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763; He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514). Como se ha descrito, cada subclonación mediante recombinación homóloga en células hospedantes sbcBC de E. coli requiere al menos dos etapas de subclonación preparatorias para situar largas regiones de homología a cada lado de un origen de replicación de E. coli. Además, no se ha descrito la clonación de ADN en cepas sbcBC de E. coli.

Recientemente, se ha demostrado que la recombinación homóloga, mediada por RecE/RecT (RecE/T) o Red\alpha/Red\beta (Red\alpha/\beta), es útil para manipular moléculas de ADN en E. coli (Zhang et al., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128; Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:1555-1557, y el documento WO 99/29837). Estos documentos muestran que, en E. coli, cualquier molécula de ADN circular intacta, que se replica independientemente, se puede alterar mediante recombinación homóloga mediada por RecE/T o Red\alpha/\beta con un fragmento de ADN lineal flanqueado por regiones cortas de secuencia de ADN idénticas a regiones presentes en la molécula circular. La integración del fragmento de ADN lineal en la molécula circular, mediante recombinación homóloga, sustituye las secuencias entre sus secuencias de flanqueo y las secuencias correspondientes en la molécula de ADN circular.

La citación de una referencia en este documento no se debe interpretar como una admisión de que constituye la técnica anterior a la presente invención.

3. Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la clonación y subclonación de ADN utilizando recombinación homóloga mediada por recombinasa bacteriana. La presente invención proporciona un método para producir una secuencia de ADN diana bicaternario en un vector mediante recombinación homóloga, secuencia de ADN diana la cual está flanqueada por un primer término de ADN bicatenario en un lado y por un segundo término de ADN bicatenario en el otro lado, secuencia diana la cual, y primer y segundo términos los cuales, residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente, o en cualquier fuente de ADN, comprendiendo dicho método:

a): construir un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena del ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario; (ii) un origen de replicación; y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario, siendo la secuencia de una cadena del primer brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea a la secuencia de ADN diana, siendo la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del segundo término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de las secuencias homólogas con relación al ADN diana, de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos da como resultado que la secuencia diana deseada se inserte entre los brazos de homología,

b): introducir dicho ADN vector en una célula; y

c): cultivar dicha célula en condiciones tales que la secuencia de ADN diana se introduce en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, bajo dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicho ADN diana y (ii) expresa una recombinasa bacteriana, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano y capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.

La recombinasa bacteriana es preferiblemente RecE/T y/o Red\alpha/\beta. Se pueden usar métodos para clonar, subclonar, propagar y amplificar un polinucleótido o una mezcla de polinucleótidos de interés usando un vector que comprende regiones cortas de ADN homólogas a las secuencias que flanquean una secuencia de ADN diana designada de interés y un origen de replicación.

En una forma de realización, la invención proporciona un método para introducir un ADN diana bicatenario en un vector, que comprende cultivar una célula bacteriana que expresa una recombinasa funcional, conteniendo dicha célula bacteriana (a) el ADN diana que comprende un primer término bicatenario y un segundo término bicatenario, y (b) un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario, (ii) un origen de replicación, y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario, de forma que la secuencia de una cadena de ADN vector del primer brazo de homología es homóloga a la secuencia de una cadena de ADN diana del primer término, y la secuencia de una cadena de ADN vector del segundo brazo de homología es homóloga a la secuencia de la cadena de ADN diana del segundo término, de forma que el ADN diana se inserta en el ADN vector entre los brazos de homología.

En otra forma de realización, se proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir un vector bicatenario en una célula, conteniendo dicha célula un ADN diana bicatenario y que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, una cadena del origen de replicación, y un segundo brazo de homología; comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, la secuencia de ADN diana, y un segundo término, de forma que la secuencia del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en dicha cadena de ADN diana, y la secuencia del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En otra forma de realización, se proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir un vector bicatenario y un primer y un segundo oligonucleótido bicatenario en una célula, conteniendo dicha célula un ADN diana bicatenario y que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología bicatenarios, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación, y un segundo brazo de homología; comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos bicatenarios, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, una secuencia de ADN diana, y un segundo término; comprendiendo dicho primer oligonucleótido una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia nucleotídica y una segunda secuencia nucleotídica, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer término en dicha cadena de ADN diana; comprendiendo dicho segundo oligonucleótido una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En otra forma de realización, se proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir una molécula de ADN diana bicatenaria en una célula, conteniendo dicha célula un vector y que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos bicatenarios, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, una secuencia de ADN diana, y un segundo término; comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden, desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de replicación y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en dicha cadena de ADN diana, y la secuencia del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En otra forma de realización, se proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir una molécula de ADN diana bicatenaria y un primer y un segundo oligonucleótido bicatenario en una célula, conteniendo dicha célula un vector y que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, una secuencia de ADN diana, y un segundo término; comprendiendo dicho primer oligonucleótido una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia nucleotídica y una segunda secuencia nucleotídica, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer término en dicha cadena de ADN diana; comprendiendo dicho segundo oligonucleótido una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5', una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden, desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación y un segundo brazo de homología; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En otra forma de realización, se proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir un vector bicatenario y un ADN diana bicatenario en una célula que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación y un segundo brazo de homología, comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, una secuencia de ADN diana, y un segundo término; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del primer término en dicha cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En una forma de realización específica de este método, la célula hospedante contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una recombinasa específica del sitio operablemente enlazada a un promotor, y el vector comprende además un primer y un segundo sitio de reconocimiento para la recombinasa específica del sitio, un primer sitio de reconocimiento localizado fuera de los primer y segundo brazos de homología, y un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y durante o después de la etapa b), induce la expresión de la recombinasa específica del sitio.

En otra forma de realización específica de este método, la célula hospedante contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa específica del sitio ligada operativamente a un promotor, y el vector comprende además un sitio de reconocimiento para la endonucleasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y durante o después de la etapa b) induce la expresión de la endonucleasa específica del sitio.

En otra forma de realización, la invención proporciona un método para obtener una molécula de ADN recombinante, que comprende: a) introducir un vector bicatenario, una molécula de ADN diana bicatenaria, y un primer y un segundo oligonucleótido bicatenario en una célula que expresa una recombinasa bacteriana, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología bicatenarios, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de replicación y un segundo brazo de homología; comprendiendo dicho ADN diana una secuencia de ADN diana y dos términos bicatenarios, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5' a lo largo de una cadena de ADN diana: un primer término, una secuencia de ADN diana, y un segundo término; comprendiendo dicho primer oligonucleótido una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia nucleotídica y una segunda secuencia nucleotídica, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia del primer término en dicha cadena de ADN diana; comprendiendo dicho segundo oligonucleótido una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5', una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y b) someter a la célula a condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga intracelular.

En una forma de realización específica de este método, la célula hospedante contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una recombinasa específica del sitio operativamente enlazada a un promotor, y el vector comprende además un primer y un segundo sitio de reconocimiento para la recombinasa específica del sitio, un primer sitio de reconocimiento localizado fuera de los primer y segundo brazos de homología, y un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y durante o después de la etapa b), induce la expresión de la recombinasa específica del sitio.

En otra forma de realización específica de este método, la célula hospedante contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa específica del sitio ligada operativamente a un promotor, y el vector comprende además un sitio de reconocimiento para la endonucleasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y durante o después de la etapa b), induce la expresión de la endonucleasa específica del sitio.

En realizaciones específicas, el vector comprende además un marcador seleccionable localizado fuera de los brazos de homología, de forma que el vector comprende, en cualquiera de los siguientes dos órdenes desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: i) el primer brazo de homología, el marcador seleccionable, el origen de la replicación, y el segundo brazo de homología, o ii) el primer brazo de homología, el origen de la replicación, el marcador seleccionable, y el segundo brazo de homología. En una forma de realización específica, el marcador seleccionable confiere resistencia a antibióticos a las células que contienen el vector.

En diversas realizaciones específicas, la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta, o ambas RecE/T y Red\alpha/\beta. En otra forma de realización específica, la célula es una célula bacteriana. En otras realizaciones específicas, la célula es una célula de E. coli. En otras realizaciones específicas, la célula es una célula eucariota que expresa de forma recombinante la proteína RecE/T y/o Red\alpha/\beta. En otras realizaciones específicas, el método comprende además aislar una molécula de ADN recombinante que comprende el ADN diana insertado en el vector.

En otra forma de realización, la invención proporciona un vector de ADN bicatenario útil para la clonación o subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en una primera cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en la primera cadena de ADN diana. En una forma de realización específica del vector, el origen de replicación es un origen de replicación bacteriano. En otra forma de realización específica, el origen de la replicación funciona en E. coli. En otra forma de realización específica, el origen de la replicación funciona en una célula de mamífero.

La invención proporciona además una célula que comprende un vector de ADN bicatenario útil para la clonación o subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación, y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en una primera cadena de ADN diana, la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término sobre la primera cadena de ADN diana. En una forma de realización específica, la célula es una célula bacteriana.

La invención proporciona además un kit útil para la clonación o subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana, que comprende en uno o más recipientes: a) un vector de ADN bicatenario útil para la clonación o subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación, y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en una primera cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en la primera cadena de ADN diana; y b) una célula que contiene una recombinasa bacteriana. En una forma de realización específica del kit, los brazos de homología tienen homología de secuencia con un vector de clonación a base de BAC, PAC, lambda, plásmido o YAC. En otra forma de realización específica del kit, el primer y segundo oligonucleótido bicatenario tiene homología de secuencia nucleotídica con un vector de clonación a base de BAC, PAC, lambda, plásmido o YAC.

En otra forma de realización, se proporciona un kit útil para la clonación o subclonación dirigida de una molécula de ADN diana, que comprende en uno o más recipientes: a) un vector de ADN bicatenario útil para la clonación y la subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de la replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación, y un segundo brazo de homología; b) un primer oligonucleótido bicatenario que comprende una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia y una segunda secuencia, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer término en una cadena de ADN diana; c) un segundo oligonucleótido bicatenario que comprende una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en dicha cadena de ADN diana; y d) una célula que contiene una recombinasa bacteriana. En una forma de realización específica del kit, la célula es una célula de E. coli. En otra forma de realización específica del kit, la célula es una célula congelada competente para captar ADN.

En otra forma de realización, la invención proporciona un kit útil para la clonación o subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana, que comprende en uno o más recipientes: a) un vector de ADN bicatenario útil para la clonación y la subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de la replicación, y un segundo brazo de homología; b)un primer oligonucleótido bicatenario que comprende una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia nucleotídica y una segunda secuencia nucleotídica, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica de un primer término en una cadena de ADN diana; y c) un segundo oligonucleótido bicatenario que comprende una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica de un segundo término en dicha cadena de ADN diana. En una forma de realización específica del kit, el vector de ADN se purifica. En otra forma de realización del kit, el vector de ADN, el primer oligonucleótido bicatenario, y el segundo oligonucleótido bicatenario, se purifican.

En otras realizaciones específicas de kits proporcionados por la invención, la molécula de ADN diana comprende ADN bacteriano, vírico, parasitario, o de protozoos. En otras realizaciones específicas, la molécula de ADN diana comprende una mutación genética o polimorfismo que se sabe o se sospecha que está asociado con un trastorno o enfermedad. En otras realizaciones específicas, la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta, o ambas recombinasas RecE/T y Red\alpha/\beta.

Los métodos de la invención se pueden usar en diagnóstico. Por ejemplo, los fragmentos de ADN lineales o los plásmidos se pueden diseñar para capturar una diana de ADN específica para detectar su presencia en una muestra procedente de un sujeto, por ejemplo, un ADN vírico presente en una muestra de un paciente. En una forma de realización, la invención proporciona métodos para la detección de ADN diana que se sabe o se sospecha que está asociado con un trastorno o enfermedad cuando se muta genéticamente. En realizaciones específicas, el ADN diana es una ADN bacteriano, vírico, parasitario, o de protozoos. En una forma de realización específica, se proporciona un método que comprende además detectar una molécula de ADN recombinante que comprende el ADN diana insertado en el vector. En otra forma de realización, el método comprende además detectar una molécula de ADN recombinante que comprende el ADN diana insertado en el vector.

En otra forma de realización, la invención proporciona un método para detectar la presencia de un agente infeccioso, en el que el ADN diana deriva de un paciente que se sospecha que tiene la enfermedad infecciosa, y las secuencias de los primer y segundo brazos de homología son homólogas a las secuencias presentes en el ADN del agente infeccioso. En una forma de realización específica, el ADN diana deriva de un paciente que se sospecha que tiene la enfermedad infecciosa, y dichas segunda y cuarta secuencias nucleotídicas son homólogas a las secuencias presentes en el ADN del agente infeccioso. En otras realizaciones específicas, el agente infeccioso es un virus, una bacteria, un protozoo, un hongo o un parásito.

En otra forma de realización, se proporciona un método para detectar la presencia de una alteración genética, una enfermedad, un trastorno, o un rasgo polimórfico, en el que el ADN diana deriva de un paciente que se sospecha que tiene una alteración genética, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico, y la secuencia del primer brazo de homología es homóloga a la secuencia en dirección corriente abajo a partir de un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico, y la secuencia del segundo brazo de homología es homóloga a la secuencia en dirección 3' desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, la enfermedad, el trastorno, o el rasgo polimórfico. En una forma de realización específica, se proporciona un método para detectar la presencia de una alteración genética, una enfermedad genética, un trastorno genético, o un rasgo polimórfico, en el que el ADN diana deriva de un paciente que se sospecha que tiene la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico, y la secuencia del primer oligonucleótido bicatenario es homóloga a la secuencia en dirección corriente abajo desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico, y la secuencia del segundo oligonucleótido bicatenario es homóloga a la secuencia en dirección corriente abajo desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico. En una forma de realización específica, la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico es o predispone al paciente a cáncer, asma, artritis, resistencia a fármacos, toxicidad a fármacos, o a una alteración, enfermedad o trastorno neuronal, neuropsiquiátrico, metabólico, muscular, cardiovascular, o de la piel.

4. Descripción de las figuras

Figura 1A-C. Componentes de los métodos de clonación y de subclonación mediante recombinación homóloga.

A. El vector, que comprende un origen de replicación (origen), un marcador seleccionable (Sm), y dos brazos de homología (etiquetados A y B).

B. Adaptadores oligonucleotídicos bicatenarios opcionales. Cada adaptador comprende una región de homología (etiquetada A' y B') con los brazos de homología (A y B, respectivamente); y una segunda región de homología (etiquetada C' y D') con un término del ADN diana (respectivamente, etiquetado C y D).

C. ADN diana. Las secuencias nucleotídicas terminales que flanquean el ADN diana (C y D) pueden ser homólogas a las secuencias nucleotídicas de uno de los brazos de homología del vector (respectivamente etiquetados A y B), o a las secuencias nucleotídicas de los oligonucleótidos adaptadores opcionales (respectivamente, etiquetados C' y D').

Figura 2. Trazado experimental del Enfoque 1. El vector para la subclonación mediante recombinación homóloga se introduce, por ejemplo mediante transformación, en un hospedante de E. coli en el que ya están presentes el ADN diana y las proteínas RecE/T o Red\alpha/\beta. El diagrama muestra una molécula de ADN lineal que tiene un origen de replicación de E. coli, y un gen de un marcador seleccionable (Sm), que es preferiblemente un gen cuyo producto confiere resistencia a un antibiótico, flanqueado por "brazos de homología". Los brazos de homología se muestran como bloques grises gruesos en los extremos de la molécula de ADN lineal, son regiones cortas de secuencia homóloga a dos regiones que flanquean la región de ADN a subclonar, denominadas términos del ADN diana, que se muestran como líneas gruesas flanqueadas por los brazos de homología. Después de la transformación, se impone una selección para la expresión del gen de Sm, para identificar aquellas células que contienen el producto de recombinación homóloga entre los brazos de homología de la molécula de ADN lineal y la diana.

Figura 3. Representación en diagrama del Enfoque 2. El enfoque es similar al usado en la Figura 1, excepto que, en este caso, la molécula de ADN diana ya no está presente en el hospedante de E. coli, sino, más bien, se cointroduce con la molécula del vector de ADN lineal. El ADN diana puede ser de cualquier fuente, ya sea, según se ilustra, una mezcla a partir de la cual se clona la región de ADN de interés, o una molécula de ADN muy rica a partir de la que se subclona la región de ADN. Al igual que en la Figura 1, los brazos de homología se muestran en bloques grises gruesos.

Figura 4. Representación en diagrama de un ejemplo del Enfoque 3. El vector de clonación o de subclonación incluye un origen de replicación de E. coli y un gen marcador seleccionable (Sm) flanqueado por dos brazos cortos de homología, mostrados como bloques grises gruesos. Adicionalmente, el vector incluye dos sitios diana de recombinación (SSRT), uno de los cuales se encuentra entre el origen y el gen marcador seleccionable. De forma más simple, el vector se construye primero como un fragmento de ADN lineal como se muestra en la figura. Con la circularización, el segundo SSRT está localizado entre los brazos de homología orientado como una repetición directa con respecto al primer SSRT, de forma que la recombinación específica del sitio, entre los dos SSRT, da como resultado la producción de dos moléculas circulares diferentes, separando de ese modo el origen y el gen marcador seleccionable. El vector circularizado se transforma en una cepa de E. coli en la cual se expresan, o se pueden expresar, las proteínas RecE/T o Red\alpha/\beta. La cepa de E. coli también tiene un gen de recombinasa específica del sitio (SSR) inducible, cuyo producto reconoce los SSRT en el vector, de forma que la recombinación específica del sitio, entre los SSRT, no se produce hasta que se induce el gen de recombinasa específica del sitio para la expresión. Las células de E. coli que tienen el vector y el gen de recombinasa específica del sitio regulado se preparan de forma que contienen las proteínas RecE/T o Red\alpha/\beta y son competentes para la transformación. Las moléculas de ADN que contienen la región a clonar se introducen entonces en una célula hospedante. Después de la recombinación homóloga entre los brazos de homología, se induce la expresión de la proteína de recombinasa específica del sitio, y se impone una selección para la expresión del gen marcador seleccionable. Antes de la recombinación específica del sitio, las células contendrán un vector no recombinado que tiene dos SSRT, o bien el producto de la recombinación homóloga pretendido, que tiene sólo un SSRT, puesto que la recombinación homóloga da como resultado la supresión del SSRT localizado entre los brazos de homología. Después de que se induce la expresión de la recombinasa específica del sitio, y se impone una selección para la expresión del marcador seleccionable, las células que contienen el producto de la recombinación homóloga sobrevivirán, puesto que este producto ya no es un sustrato para la recombinación específica del sitio.

Figura 5. Uso de oligonucleótidos adaptadores para la clonación y la subclonación mediante recombinación homóloga con RecE/T o Red\alpha/\beta. El diagrama ilustra una variación del Enfoque 2, mostrado en la Figura 3, anteriormente. Dos oligonucleótidos adaptadores contienen cada uno dos regiones de homología, en correspondencia mutua con los brazos de homología del vector, y una segunda región de homología en correspondencia mutua con dos términos de la región de interés del ADN diana. La circularización del vector y la clonación de la región de interés del ADN se logra mediante recombinación homóloga entre el vector y los adaptadores, y entre los adaptadores y el ADN diana. En esta forma de realización, el vector y el ADN diana no comparten homología de secuencia. De este modo, el mismo vector se puede usar para clonar o subclonar diferentes ADN dianas, usando oligonucleótidos adaptadores específicos de la diana, para cada ADN diana. Los oligonucleótidos adaptadores también se pueden usar en los métodos de los Enfoques 1 y 3, como se traza en las Figuras 1 y 3, anteriormente.

Figura 6. Un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que representa ADN digerido con EcoRI aislado de 9 colonias independientes (líneas 1-9) obtenidas del experimento mAF4 BAC. Línea M, patrones de tamaño de ADN de 1 kb (BRL, Bethesda, MD). Línea 10, digestión con EcoRI del vector de partida. El experimento se describe con detalle en el Ejemplo en la Sección 6.

Figura 7A-B. Clonación de una región de ADN a partir de un ADN genómico de levadura total.

A. Se ilustra un fragmento de PCR obtenido para amplificar el origen p15A, y flanqueado por brazos de homología de 98 ó 102 pb a 98 ó 102 pb en cada lado de un gen de resistencia a ampicilina integrado, en la cepa MGD 353-13D de levadura. El producto de la PCR (0,5 mg) se mezcló con ADN genómico de levadura total (4,0 mg), y se coelectroporó en JC5519 de E. coli que contiene Red\alpha/\beta expresado a partir de pBAD\alpha\beta\gamma. Los clones se identificaron mediante selección por resistencia a ampicilina.

B. Un gel teñido con bromuro de etidio para confirmar los productos correctos a partir de 10 colonias escogidas.

Figura 8A-C. Efecto de repeticiones o 5' fosfatos presentes en los extremos del vector lineal en la subclonación de ET.

A. Se muestran las secuencias de los oligonucleótidos usados para amplificación mediante PCR del vector lineal. La secuencia en itálica indica la parte del oligonucleótido que se requiere para la amplificación mediante PCR del vector lineal; los otros nucleótidos constituyen el brazo de homología del gen lacZ de E. coli. Las secuencias en negrita estaban presentes en ambos extremos del vector lineal, y de este modo forman las repeticiones terminales. Los constructos a-x del vector lineal tienen repeticiones de secuencia de longitudes diversas. El vector lineal contiene el origen de la replicación p15A más el gen de resistencia a cloranfenicol Cm^{r}, flanqueado por brazos de homología y las repeticiones terminales indicadas.

B. Diagrama esquemático de la estrategia usada para ensayar los constructos vectoriales que contienen las diversas repeticiones de secuencia del panel A para determinar la eficacia en la subclonación de ET del gen lacZ de E. coli.

C. Tabla que muestra el efecto de la longitud de la repetición y de la fosforilación sobre la eficacia de la subclonación de ET. Se muestran los resultados de los ensayos que usan los vectores que contienen las secuencias repetidas mostradas en el panel A.

Figura 9A-B. Subclonación mediante recombinación de ET usando pBAD-\alpha\beta\gamma(tet)

A. Diagrama del plásmido pR6K/BAD/\alpha\beta\gamma, que contiene el origen R6K, el replicón pir-116, el gen de resistencia a tetraciclina de pBR322 (tet^{r}), y el represor de arabinosa (araC).

B. Comparación de la subclonación mediante recombinación de ET usando pBAD-\alpha\beta\gamma(tet) (CoIE1 ori) frente a pR6K/BAD/\alpha\beta\gamma.

Figura 10A-B. Subclonación de un fragmento de 19 kb del gen AF-4 presente en un BAC.

A. Constructos plasmídicos y estrategia de subclonación. tet^{r}, el gen de resistencia a tetraciclina. araC, represor de arabinosa.

B. Análisis de 5 colonias independientes. Un gel teñido con bromuro de etidio de ADN digerido mediante HindIII preparado a partir de 5 colonias correctas e independientes, y el vector lineal solo. Los subclones correctos se confirmaron mediante secuenciación de ADN. M, escalera de ADN de 1 kb.

Figura 11A-B. Subclonación de ET usando ADN genómico como una fuente para el ADN diana.

A. El ADN genómico aislado de E. coli se prelinealizó mediante digestión con XhoI. El vector lineal consistió en el origen CoIE1 y en el gen de resistencia a canamicina kan, flanqueado por brazos de homología que dirigen la recombinación al lugar lacI/lacZ presente en el cromosoma de E. coli.

B. Análisis de restricción de 16 colonias independientes. La línea 17 muestra el vector lineal. M, escalera de ADN de 1 kb.

Figura 12A-B. Subclonación del gen de neomicina neo a partir de ADN genómico de célula ES de ratón.

A. Diagrama de la estrategia de subclonación.

B. Análisis de restricción de colonias resistentes a canamicina.

Figura 13. Combinación de la clonación y de la subclonación de ET.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a métodos y composiciones para la clonación y la subclonación de ADN utilizando recombinación homóloga mediada por recombinasa bacteriana. Se ha descubierto que las recombinasas bacterianas se pueden utilizar, de manera particular, para lograr una clonación y una subclonación dirigidas con eficacia elevada.

Preferiblemente, la recombinasa bacteriana usada es RecE/T y/o Red\alpha/\beta. La vía RecE/T en E. coli se ha descrito previamente, y sus componentes se ha caracterizado parcialmente (Hall y Kolodner, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3205-3209; Gillen et al., 1981, J. Bacteriol. 145:521-532). La recombinación vía la ruta RecE/T requiere la expresión de dos genes, recE y recT, cuyas secuencias de ADN se han publicado (Hall et al., 1993, J. Bacteriol. 175:277-278). La proteína RecE es funcionalmente similar a \lambda exo, que también se denomina Red\alpha, y la proteína RecT es funcionalmente similar a Red\beta y erf de fago P22 (Gillen et al., 1977, J. Mol. Biol. 113:27-41; Little, 1967, J. Biol. Chem. 242:679-686; Radding y Carter, 1911, J. Biol. Chem. 246:2513-2518; Joseph y Kolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10411-17; Joseph y Kolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10418-24; Muniyappa y Radding 1986, J. Biol. Chem. 261:7472-7478; Kmiec y Hollomon, 1981, J. Biol. Chem. 256:12636-12639; Poteete y Fenton, 1983, J. Mol. Biol. 163:257-275; Passy et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4279-4284, y referencias citadas allí).

Se describen aquí métodos y composiciones que se refieren al uso de recombinasas bacterianas para la clonación y la subclonación de ADN dirigidas. Como se usa en este documento, la expresión "clonación de ADN" se refiere al proceso de insertar ADN procedente de cualquier fuente en un vector que se replica de forma autónoma, de forma que se puede propagar en la célula hospedante. La expresión "subclonación de ADN" se refiere al proceso de transportar fragmentos de ADN ya presentes en un vector que se replica de forma autónoma a otro vector que se replica de forma autónoma, o transportar fragmentos de ADN a partir de una molécula de ADN muy rica, tal como un genoma vírico purificado o un fragmento de ADN previamente amplificado mediante PCR, a un vector que se replica de forma autónoma. La expresión clonación y subclonación "dirigidas" o "seleccionadas" se refiere al uso de brazos de homología y, en diversas realizaciones, de oligonucleótidos adaptadores, para seleccionar un ADN diana, y para dirigir la orientación de la inserción del ADN diana mediante la elección y la orientación de los brazos de homología. Se debe señalar que todas las aplicaciones de los métodos de la presente invención se aplican a métodos tanto para la clonación como para la subclonación de ADN.

La construcción de las composiciones y los métodos de la invención se describen con detalle en este documento. En particular, la Sección 5.1 describe métodos de clonación por recombinación mediada de la invención para la clonación dirigida de fragmentos de ADN mediante recombinación homóloga. La Sección 5.2, más abajo, describe composiciones de la invención, que incluyen constructos de ADN diseñados para dirigirse, capturar y clonar fragmentos de ADN diana de interés. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican recombinasas bacterianas tales como las proteínas RecE/T y/o Red\alpha/\beta, células que comprenden tales composiciones, y los métodos para construir tales ácidos nucleicos y células. La Sección 5.3, más abajo, describe el uso de métodos de clonación dirigidos a recombinasa bacteriana, y kits para la detección de la expresión génica y diagnóstico de enfermedades.

5.1 Métodos para la clonación y la subclonación mediante recombinación homóloga

Los diversos métodos descritos en este documento se pueden usar para la clonación eficaz y dirigida de cualquier ADN de interés mediante recombinación homóloga mediada por recombinasa bacteriana. Los tres enfoques descritos en este documento tienen, como componentes comunes, una célula que expresa proteínas de recombinación mediante recombinasa bacteriana, y un vector. Un ejemplo del vector se muestra en la Figura 1A. El vector comprende tres elementos esenciales: un origen de replicación y dos regiones cortas de ADN bicatenario, denominadas aquí "brazos de homología".

Los brazos de homología están diseñados específicamente para permitir que el vector "capture" un ADN diana de interés entre los brazos de homología mediante recombinación homóloga. La secuencia, la posición y la orientación de los brazos de homología son importantes para la inserción correcta del ADN diana entre los brazos. En una forma de realización, en la que los brazos de homología tienen homología de secuencia con los términos que flanquean al ADN diana, los dos brazos de homología corresponden en secuencia a ADN que flanquea el ADN diana de interés, correspondiendo un brazo (indicado como A en la Figura 1) a una secuencia de ADN en dirección corriente arriba desde el ADN diana (indicado como C en la Figura 1), y correspondiendo el segundo brazo (indicado como B en la Figura 1) a una secuencia localizada en dirección corriente abajo desde el ADN diana (indicado como D en la Figura 1). La orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado debe ser la misma que la orientación de la secuencia homóloga con relación al ADN diana (véase la Figura 1), de forma que la recombinación entre los brazos de homología y el ADN diana dé como resultado que el ADN diana se inserte entre, o "en el interior" (véase la Figura 1), los dos brazos de homología. Como se usa en este documento, una posición se define como "interior" de los brazos de homología si está situada entre los dos brazos de homología, de forma que un primer brazo de homología está entre el origen de la replicación y la propia posición en una dirección, y un segundo brazo de homología está situado entre el origen de la replicación y la propia posición en la otra dirección. Por otro lado, una posición se define como "exterior" de los brazos de homología si, en una dirección, ningún brazo de homología la separa del origen de replicación. De este modo, por definición, el origen de la replicación y el marcador seleccionable están localizados en el vector "de forma exterior" de los brazos de homología (véase la Figura 1), de forma que la inserción de la secuencia diana conserva el origen de la replicación y el marcador seleccionable en el plásmido. Por otro lado, el ADN diana, por definición, se inserta "en el interior" de los brazos de homología. La Figura 1A representa en forma de dibujo el significado de "interior" y "exterior" de los brazos de homología.

En una forma de realización alternativa, los brazos de homología tienen homología de secuencia con un conjunto de oligonucleótidos adaptadores bicatenarios. Tales oligonucleótidos adaptadores se ilustran en la Figura 1B. La secuencia de cada oligonucleótido adaptador comprende la secuencia de uno de los brazos de homología del vector, y adicionalmente una secuencia homóloga a una secuencia que flanquea el gen diana de interés (véase la Figura 1C). De este modo, un oligonucleótido adaptador contiene homología con la secuencia de ADN de un brazo de homología (indicado como A' en la Figura 1), y con una secuencia nucleotídica en dirección corriente arriba del ADN diana (indicada como C' en la Figura 1). El segundo oligonucleótido adaptador contiene homología con una secuencia de ADN de un brazo de homología (indicado como B' en la Figura 1), así como con una secuencia nucleotídica localizada en dirección corriente abajo del ADN diana (indicada como D' en la Figura 1). De este modo, los oligonucleótidos adaptadores se pueden usar para adaptar un vector de clonación de homología genética para dirigirse a una secuencia génica específica de interés, variando la secuencia del oligonucleótido adaptador (véase la Figura 5). Los métodos y las composiciones que se pueden usar para llevar a cabo las diversas realizaciones de la invención se describen con detalle en este documento.

Los métodos descritos a continuación incluyen tres enfoques alternativos para la clonación dirigida mediante recombinación homóloga. Como se describe con detalle a continuación, cada uno de los tres enfoques tiene sus propias ventajas que los hacen preferidos para una aplicación de clonación particular. Estos métodos y las aplicaciones se describen con detalle a continuación. En un enfoque, representado en la Figura 2, el vehículo de la clonación se introduce en una célula que contiene el ADN diana de interés. Este primer enfoque se puede usar para transportar convenientemente un inserto desde un replicón a otro, sin la necesidad de un análisis de restricción y manipulaciones in vitro tediosos. Este enfoque es útil para aplicaciones en las que el ADN diana ya existe en un replicón de E. coli, y su uso posterior requiere la subclonación de una parte escogida. Por ejemplo, el uso de un clon de ADN aislado de un cósmido, de un fago o de una librería BAC, se facilita subclonando las porciones escogidas en un nuevo vector a fin de secuenciar el inserto o expresar la proteína codificada por el gen. En un segundo enfoque, representado en la Figura 3, el vector de clonación y el ADN diana de interés se preparan y después se añaden juntos a una célula. Como alternativa, como se muestra en la Figura 4, el ADN de interés se puede añadir a una célula que ya contiene el vector de clonación. Estos dos últimos enfoques son útiles para aplicaciones en las que el ADN diana deriva de cualquier fuente externa, tal como, por ejemplo, ADN derivado de una célula de cáncer.

5.1.1 Enfoque 1: introducción del vector en la mayor parte de la célula que contiene el ADN diana

En una forma de realización, como se representa en la Figura 2, la secuencia de ADN diana ya está presente en una célula hospedante que expresa una recombinasa bacteriana. Por ejemplo, el ADN diana puede residir en una molécula de ADN que se replica independientemente, tal como, pero sin limitarse a, un plásmido, un fago, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma de E. coli, en una célula hospedante de E. coli. Los métodos para construir células hospedantes que expresen una recombinasa bacteriana tal como la recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta se describen con detalle en la Sección 5.2.2.

El ADN vector, que comprende un origen de replicación y dos brazos de homología localizados a cada lado del origen y del marcador, se introduce en la célula hospedante. Preferiblemente, el vector es una molécula lineal, y los brazos de homología están localizados en los extremos respectivos de la molécula lineal, aunque pueden estar en el interior. Después de la entrada en la célula, la recombinación homóloga entre los brazos de homología del ADN vector y las secuencias diana da como resultado la inserción del ADN diana entre los brazos de homología, y la formación resultante de un episoma circular. Las células se colocan entonces en placas sobre medios selectivos para seleccionar el marcador selectivo presente en el vector. Puesto que sólo las moléculas circularizadas son capaces de replicarse y de ser seleccionadas en la célula hospedante, muchas de las células que crecen en medios selectivos contendrán moléculas recombinadas que incluyen el ADN diana.

En una forma de realización, los extremos del fragmento de ADN vector lineal se pueden bloquear con nucleótidos modificados, para reducir el número de sucesos producidos mediante la unión de los extremos de los fragmentos lineales por cualquier medio distinto de la recombinación homóloga, es decir, recombinación ilegítima. Tales nucleótidos modificados, por ejemplo nucleótidos de fosfotionato, se pueden incorporar en el nucleótido de extremo 5' del brazo de homología. Los nucleótidos modificados se pueden incorporar durante la síntesis oligonucleotídica de un cebador usado para construir el vector (véase la Sección 5.2.1, a continuación), o, como alternativa, se pueden añadir mediante modificación enzimática o química del oligonucleótido o del ADN vector lineal después de la síntesis. Los métodos para tal modificación de oligonucleótidos y de fragmentos de ADN lineales son bien conocidos en la técnica, y se describe con detalle en la Sección 5.2.2, a continuación.

5.1.2 Enfoque 2: cointroducción de vector y ADN diana en la célula hospedante

En otra forma de realización, como se representa en la Figura 3, el ADN vector y el ADN diana se mezclan in vitro y se cointroducen en una célula que contiene las recombinasas RecE/T o Red\alpha/\beta. El ADN diana puede derivar de cualquier fuente. Por ejemplo, el ADN diana se puede obtener a partir de una muestra biológica, tal como, pero sin limitarse a, sangre completa, plasma, suero, piel, saliva, orina, fluido linfático, células obtenidas de aspirado de biopsia, células de cultivos de tejidos, medios, o muestras no biológicas tales como comida, agua, u otro material. Los métodos para la preparación de ADN a partir de tales fuentes son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

El ADN vector y el ADN diana se preparan, se mezclan in vitro, y entonces se cointroducen en células que expresan proteínas recombinasas bacterianas, preferiblemente mediante transformación en E. coli mediante coelectroporación. El ADN vector puede estar en forma de ADN lineal o en forma de ADN plasmídico circular. En una forma de realización preferida, el vector es una molécula de ADN lineal. La fuente de ADN diana se mezcla en exceso en peso, o en exceso, con relación al ADN vector, a fin de introducir tantas copias de región de ADN diana de interés en la célula como sea posible, maximizando de ese modo la producción de productos recombinantes. Las células se hacen crecer en medios selectivos para seleccionar productos circularizados. En una forma de realización preferida, el vector contiene un marcador de resistencia a antibióticos, y las células se hacen crecer en presencia de antibiótico. Las colonias que son capaces de crecer en tal selección contendrán formas recombinadas, circularizadas, del fragmento lineal.

En una forma de realización, los extremos del fragmento de ADN vector lineal se pueden bloquear con nucleótidos modificados, como se describe más abajo en la Sección 5.2.1. Los métodos para tal modificación de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica, como se describe más abajo en la Sección 5.2.2.

Este enfoque es particularmente útil cuando el ADN diana se obtiene a partir de una fuente externa a E. coli, tal como levadura o células eucariotas. En una forma de realización, este método se puede usar con fines de diagnóstico para detectar la presencia de un ADN particular en una muestra biológica dada. Por ejemplo, el método se puede usar para detectar la presencia de un receptor de estrógeno específico o un alelo BRCA 1 en una muestra de biopsia extraída de un paciente con cáncer de mama.

En otra forma de realización, el método se puede usar para amplificar regiones de ADN como una alternativa a la amplificación mediante técnicas con reacción en cadena de polimerasa (PCR). La amplificación mediante recombinación homóloga, la clonación y la propagación en E. coli ofrece varias ventajas con respecto a las técnicas a base de PCR. En primer lugar, el error de la PCR puede ser un inconveniente sustancial para muchos fines. Las combinaciones de pares de cebadores de PCR tienden a generar falsos productos de reacción. Además, el número de errores en el producto final de reacción aumenta exponencialmente con cada ronda de amplificación mediante PCR después de que se introduce un error en una muestra de ADN. Por otro lado, la amplificación mediante clonación por recombinación homóloga tiene la ventaja de una maquinaria correctora celular en E. coli y, de este modo, es al menos 1000 veces más fiable. En segundo lugar, hay muy pocas restricciones en el tamaño de la región de ADN que se puede amplificar usando el presente método. La amplificación de regiones de ADN mayores que unas pocas kilobases (mayores que 5-10 kb) es difícil usando las técnicas a base de PCR. El presente método es adecuado para la clonación de regiones mucho más grandes, al menos hasta aproximadamente 100 kilobases. Actualmente, la clonación de un genoma implica los procesos tediosos de crear una gran librería aleatoria, seguido de la selección y ordenamiento de los clones individuales. Usando este método, se pueden diseñar brazos de homología y se pueden construir vectores para dirigir la clonación de un genoma en clones contiguos grandes, no redundantes, denominados "contigs". En tercer lugar, incluso después de que se produce ADN mediante una técnica a base de PCR, los productos de la PCR tienen que ser clonados en una etapa de procesamiento adicional. Las técnicas de clonación mediante recombinación homóloga obvian la necesidad de la etapa extra de subclonación. La región de ADN que se va a amplificar se inserta simplemente entre los brazos de homología, y se transforma con el ADN vector en un hospedante de E. coli.

La recombinación homóloga en esta forma de realización se puede llevar a cabo in vitro, antes de la adición del ADN a las células. Por ejemplo, se pueden añadir RecE y RecT aislados, o extractos celulares que contienen RecE/T, a la mezcla de ADN. Cuando la recombinación se produce in vitro, la selección de las moléculas de ADN se puede lograr transformando la mezcla de recombinación en una célula hospedante adecuada, y seleccionando clones positivos como se describe anteriormente.

5.1.3 Enfoque 3: introducción de ADN diana en células hospedantes que contienen ADN vector

En otra forma de realización, se introduce ADN diana en una célula que ya contiene ADN vector. El ADN diana puede provenir de cualquier fuente, como se describe en 5.1.2 anteriormente, y puede tener forma lineal o circular. Como se describe anteriormente, una vez que el ADN diana está en el interior de las células, la recombinación homóloga entre los brazos de homología y el ADN diana da como resultado la inserción del ADN diana entre los brazos de homología. Sin embargo, en este caso, es necesaria una contraselección para seleccionar frente a un vector no recombinado, puesto que tanto el producto deseado como el vector no recombinado expresan el gen marcador seleccionable. Aquí se describen con detalle diversas realizaciones para lograr esta contraselección. En una forma de realización, por ejemplo, se puede usar un método que utiliza una recombinación específica del sitio y una reacción de escisión. Este enfoque se representa en la Figura 5. En otra forma de realización, se induce una nucleasa inducible que rompe el vector no recombinado. En ambas realizaciones, los vectores que no contienen los productos de recombinación se eliminan.

El vector se construye primero como un plásmido, después se introduce en la célula hospedante, en la que se puede propagar. Como se muestra en la Figura 5, el vector contiene (i) un origen de replicación (cualquier origen); (ii) un marcador seleccionable (Sm); (iii) los dos brazos de homología; y (iv) un marcador contraseleccionable, tal como, pero sin limitarse a, un par de reconocimiento para una recombinasa específica del sitio, un primer sitio de reconocimiento localizado fuera de los brazos de homología y un segundo sitio de reconocimiento localizado en el interior de los brazos de homología, o un sitio de reconocimiento para una endonucleasa, que se puede usar para la selección frente al vector plasmídico de partida. Como se usa en este documento, un sitio está localizado "en el interior" de los brazos de homología si está situado entre los dos brazos de homología, de forma que un primer brazo de homología está entre el origen de replicación y el propio sitio en una dirección, y un segundo brazo de homología está situado entre el origen de la replicación y el propio sitio en la otra dirección. Por otro lado, una posición se define como "exterior" de los brazos de homología si, en una dirección, ningún brazo de homología separa a la propia posición del origen de replicación. (Véase la Figura 1 para una representación gráfica del significado de "interior" frente a "exterior" de los brazos de homología). El origen de la replicación y el marcador seleccionable deben estar localizados fuera de los brazos de homología, como se describe en la Sección 5.1 anteriormente, de forma que la inserción de la secuencia diana conserva el origen de la replicación y el marcador seleccionable, en el plásmido. El marcador contraseleccionable, el sitio de endonucleasa o uno de los dos sitios diana de recombinasa específica del sitio está localizado preferiblemente en el "interior" de los brazos de homología (véase la Figura 5), al otro lado del origen de la replicación y del marcador seleccionable.

Se puede usar cualquier método conocido en la técnica que permita la contraselección frente al vector no recombinado. Por ejemplo, en una forma de realización, la contraselección se puede lograr mediante una recombinasa específica del sitio inducible (SSR). Las recombinasas específicas del sitio son enzimas que reconocen dos sitios diana, denominados sitios diana de recombinasa específica del sitio (SSRT), y actúan en estos sitios para mediar un intercambio de cadena de ADN y una reacción de escisión (Hallet et al., FEMS Microbiol. Rev., 1997, 21:157-78; Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:521-7; Stark et al., 1992, Trends Genet., 8:432-9). En la técnica se conocen ejemplos de recombinasas específicas del sitio, incluyendo, pero sin limitarse a, recombinasas Cre, Flp, Kw o R (Nunes-Duby et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:391-406; Ringrose et al., 1997, Eur. J. Biochem. 248:903-912; Utatsu et al., 1987, J. Bacterial. 169:5537-5545). Cuando dos SSRT directamente repetidos residen en un plásmido circular, la recombinación específica del sitio entre los dos SSRT da como resultado la formación de dos plásmidos circulares. Sólo el producto que contiene el origen de la replicación se mantiene en la célula. De este modo, la recombinación específica del sitio entre dos SSRT directamente repetidos, en un plásmido circular, da como resultado la supresión de la secuencia de ADN localizada entre los dos SSRT en el lado que no incluye el origen de la replicación.

Se construye un vector de ADN que contiene dos SSRT, orientados como repeticiones directas, uno situado en el interior de los brazos de homología, y un segundo situado en el exterior de los brazos y entre el marcador seleccionable (SM) y el origen de la replicación. La recombinación entre los SSRT situados de esta manera da como resultado la separación, con respecto al marcador seleccionable, del origen de la replicación (véase la Figura 5). De este modo, la SSR actuará en vectores de ADN no recombinados, que contienen dos SSRT, dando como resultado la pérdida de tales plásmidos de la célula hospedante.

Las células hospedantes se transforman entonces con ADN vector mediante métodos estándares. En esta forma de realización, la célula hospedante debe contener: 1) genes de RecE/T y/o Red\alpha/\beta, y 2) un gen que codifica una SSR. Preferiblemente, la expresión de los genes de RecE/T y/o Red\alpha/\beta es inducible, pero también es posible la expresión constitutiva. El gen que codifica una recombinasa específica del sitio (SSR) que reconoce los SSRT debe ser inducible. Los promotores inducibles y constitutivos son bien conocidos en la técnica; los métodos para su uso en la construcción y en la expresión de genes recombinantes se describen en la Sección 5.2.3, más abajo. Si los genes de RecE/T y/o Red\alpha/\beta requieren la inducción para la expresión, las células que contienen el vector se hacen crecer en condiciones para inducir la expresión inmediatamente antes de que se preparen las células competentes. Las células hospedantes que contienen ADN vector se seleccionan y se mantienen colocándolas en placa y haciéndolas crecer en medios selectivos.

Las células competentes se preparan entonces a partir de las células hospedantes que contienen el vector. Las células se transforman con el ADN diana, que se puede preparar a partir de cualquier fuente, por ejemplo ADN genómico total preparado a partir de cualquier célula. Las células se cultivan brevemente, para permitir que se produzca la recombinación homóloga. La recombinación homóloga da como resultado la supresión de la secuencia entre los brazos de homología que contienen un SSRT, y la inserción de la secuencia del gen diana. Entonces se induce la expresión de la SSR. La SSR actuará sobre los SSRT directamente repetidos en el vector sin recombinar, separando el marcador seleccionable del origen de replicación del plásmido. Los plásmidos que contienen dianas insertadas tienen sólo un SSRT, y permanecen intactos. La selección se puede mantener, o no, durante esta etapa, pero se debe imponer pronto después de la inducción de la SSR, es decir, pronto después de que tiene lugar la recombinación específica del sitio. De esta manera, la inducción de la SSR da como resultado la selección de plásmidos que contienen genes diana insertados.

En una forma de realización alternativa, se puede usar una endonucleasa para linealizar in vivo el vector entre los brazos de homología, ya sea justo antes, durante o después de la recombinación homóloga. La linealización del vector antes de la recombinación seleccionará productos de recombinación correctos, puesto que un plásmido lineal no sobrevivirá en la célula excepto que se circularice. Después de la recombinación, la actividad continuada de la endonucleasa ayudará a seleccionar plásmidos que contienen insertos, debido a que durante la recombinación homóloga la SSR suprime el sitio de reconocimiento de endonucleasa, e inserta en su lugar el ADN diana. Puesto que la endonucleasa romperá sólo vectores no recombinados, dejando plásmidos con secuencias diana insertadas intactas, la actividad continuada de la endonucleasa tras la recombinación selecciona frente a productos no recombinados. Para esta forma de realización, se debe usar una endonucleasa con un sitio de reconocimiento muy raro, de forma que no habrá otros sitios en el ADN de la célula hospedante. Los ejemplos de tales "cortadores raros" son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la lambda cos, HO de levadura o una endonucleasa codificada por intrón, tal como PI-Sce1. El sitio de reconocimiento para la endonucleasa se debe clonar entre los dos brazos de homología, de forma que la digestión enzimática por la endonucleasa dé como resultado la linealización del vector entre los brazos de homología. La expresión del gen de endonucleasa debe ser inducible. Los constructos y los métodos para la expresión inducible de proteína se describen más abajo, en la Sección 5.2.3.

En otra forma de realización, se puede usar una SSR, por ejemplo la recombinasa Cre, en lugar de una endonucleasa, para linealizar in vivo el vector no recombinado (véase Mullins et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:2539-40). En este caso, el vector se construye con un solo sitio SSRT localizado en el interior de los brazos de homología. Se mezcla un exceso de oligonucleótido, que contiene una copia del mismo SSRT, con el ADN diana, y se cotransforma en el hospedante con el ADN diana. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula de ADN bicatenaria corta. Cuando una de las moléculas recombinantes tiene un SSRT que reside en un oligonucleótido corto, la recombinasa específica del sitio linealizará el vector en su SSRT (Mullins et al., 1997, supra).

En otra forma de realización, se pueden combinar los enfoques de recombinación específica del sitio y de la endonucleasa, descritos anteriormente. En este caso, se obtiene un vector no recombinado que contiene tanto un SSRT y un sitio de endonucleasa en el interior de los brazos de homología. En una forma de realización de este enfoque, la SSR y la endonucleasa se podrían corregular bajo el control de un único promotor inducible. Los constructos y los métodos para tal expresión inducible, corregulada, de proteínas se discute en la Sección 5.2.3, más abajo.

En otra forma de realización, se puede emplear una combinación de estos usos de recombinación específica del sitio para la contraselección. En esta forma de realización, se emplean dos pares de SSR/SSRT, por ejemplo Cre/Iox y Flp/FRT. El vector contiene dos sitios para la primera SSR, SSR1, uno localizado en el interior de los brazos de homología, y el segundo localizado en el exterior de los brazos de homología, entre el origen de replicación y el marcador seleccionable. Además, el vector contiene un sitio para la segunda SSR, SSR2, localizado en el interior de los brazos de homología. Otro sitio para SSR2 está localizado en oligonucleótidos bicatenarios cortos, y se añaden junto con el ADN diana durante la transformación celular, en una cantidad en exceso con respecto al ADN diana. En una forma de realización específica, por ejemplo, un par de SSR/SSRT, para la etapa de linealización, es Cre/IoxP, y el segundo par, para la etapa de supresión, es Flp/FRT.

En otra forma de realización, se puede usar una contraselección directa contra la célula. En este caso, el origen de replicación del plásmido se dirige al mantenimiento de una única copia (o una copia muy baja) en E. coli. Los orígenes de replicación de esta clase incluyen la clase de orígenes iterón, tal como el origen P1 de fago, y plásmidos basados en el origen cromosómico de E. coli, oriC. Para orígenes de replicación adecuados, véase Helinski, D.R., Toukdarian, A.E., Novick, R.P. Capítulo 122, p. 2295-2324 en "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" 2ª edición, Frederick C. Niedhardt, Ed. ASM Press, Washington, 1996, ISBN 1-55581-084-5. En este caso, el vector se puede construir sin ningún SSRT, y en vez de esto se incluye un gen contraseleccionable entre los brazos de homología. Tales genes marcadores contraseleccionables son conocidos en la técnica, por ejemplo se pueden usar los genes sacB, ccdB o los genes resistentes a tetraciclina (véase también Reyrat et al., 1998, Infect. Immun. 66:4011-7 para un listado de genes contraseleccionables adecuados y para métodos). La reacción de recombinación homóloga pretendida suprimirá el gen contraseleccionable, de forma que las células que tienen el producto de recombinación pretendido sobrevivirán bajo la presión de la contraselección, mientras que se exterminarán las células que tienen el vector sin recombinar.

5.2 Composiciones para la clonación y subclonación mediante recombinación homóloga

En este documento se describen composiciones para la clonación mediante recombinación homóloga en diversas realizaciones. Para cada uno de los métodos de clonación descritos en la Sección 5.2 más abajo, se requiere que coexistan tres componentes en una única célula: en primer lugar, un vector que contenga dos regiones cortas de ADN (denominadas aquí "brazos de homología"), teniendo cada región una homología de secuencia con una secuencia nucleotídica que flanquea la secuencia diana; en segundo lugar, pares de proteínas RecE/T y/o Red\alpha/\beta, u otra recombinasa bacteriana; y en tercer lugar, la secuencia de ADN diana. La recombinación entre estas secuencias homólogas presentes en los brazos de homología y las regiones que flanquean al gen diana, mediada por una recombinasa bacteriana, da como resultado que se inserte o se "capture" el ADN diana entre los dos brazos de homología. Las composiciones y los métodos para su construcción se describen con detalle en este documento.

5.2.1 El vector de clonación de homología

El vector de clonación de homología puede ser un vector de ADN lineal o circular que comprende un origen de replicación, un marcador seleccionable, y dos regiones cortas de ADN diseñadas para capturar un ADN diana de interés. Son posibles varias formas de vehículos de clonación, dependiendo del enfoque o del método usado. Las formas y métodos preferidos para su construcción se representan en las Figuras 1 a 5, y se describen con detalle en este documento.

5.2.1.1 El origen de la replicación

El vector requiere un origen de replicación, que es necesario para la replicación y la propagación del plásmido. Para la clonación y la propagación en E. coli, se puede usar cualquier origen de replicación de E. coli, cuyos ejemplos son bien conocidos en la técnica (véase Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y referencias citadas allí). Los ejemplos no limitantes de orígenes de replicación plasmídicos fácilmente disponibles son orígenes de replicación derivados de CoIE1 (Bolivar et al., 1977, Gene 2:95-113; véase Sambrook et al., 1989, más arriba), orígenes p15A presentes en plásmidos tales como pACYC184 (Chang y Cohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56; véase también Miller, 1992, p. 10.4-10.11), y el origen pSC101 disponible para la expresión de pocas copias de plásmidos, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, en una forma de realización, se usa el origen de replicación de un plásmido de copia elevada, tal como un plásmido que contiene un origen de replicación derivado de CoIE1, cuyos ejemplos son conocidos en la técnica (véase Sambrook et al., 1989, más arriba; véase también Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y referencias en el mismo). Un ejemplo es un origen de pUC19 y sus derivados (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103-119). Los vectores pUC existen en cantidades de 300-500 copias por célula, y tienen sitios de clonación convenientes para inserción de genes ajenos. Para una expresión muy elevada, se pueden usar vectores \lambda, tales como \lambdagt11 (Huynh et al., 1984, en "DNA Cloning Techniques, Vol I: A Practical Approach", D. Glover, ed., p. 49-78, IRL Press Oxford), o los promotores fágicos T7 o SP6 en células que contienen sistemas de expresión de polimerasa T7 y Sp6 (Studier et al., 1990, Methods Enzymol. 185:60-89).

Cuando se desee un menor nivel de expresión, se puede usar un origen de replicación de una copia media o baja. Los plásmidos de copia media son bien conocidos en la técnica, tales como pBR322, que tiene un origen de replicación derivado de CoIE1 y 20-100 copias por célula (Bolivar et al., 1977, Gene 2:95-113; véase Sambrook et al., 1989, más arriba), o pACYC184, uno de la serie pACYC100 de plásmidos, que tiene un origen de replicación p15A y que existe en una cantidad de 10-12 copias por célula (Chang y Cohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56; véase también Miller, 1992, p. 10.4-10.11). Los plásmidos de pocas copias son bien conocidos también en la técnica, por ejemplo pSC101, que tiene un origen pSC101, y aproximadamente 5 copias por célula. Tanto los vectores plasmídicos pACYC como pSC101 tienen sitios de clonación convenientes y pueden coexistir en la misma célula como plásmidos pBR y pUC, puesto que tienen orígenes de replicación compatibles y marcadores antibióticos selectivos únicos. Otros orígenes de replicación plasmídicos adecuados incluyen los plásmidos a base del fago lambda o del replicón del fago P1, por ejemplo la serie Lorist (Gibson et al., 1987, Gene 53:283-286).

Cuando se desee incluso una menor expresión, el origen de replicación se puede obtener a partir del cromosoma bacteriano (véase Miller, 1992, más arriba; Niedhardt, F.C., ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Yarmolinsky, M.B. y Stemberg, N., 1988, p. 291-438, en Vol. 1 de The Bacteriophages, R. Calendar, ed., Plenum Press, New York). Además, se pueden usar orígenes de replicación sintéticos.

5.2.1.2 El marcador seleccionable

Para mantener el vector plasmídico en la célula, el vector contiene típicamente un marcador seleccionable. Se puede usar cualquier marcador seleccionable conocido en la técnica. Para la construcción de un vector en E. coli, se puede usar cualquier gen que comunique resistencia a cualquier antibiótico eficaz en E. coli, o cualquier gen que comunique un cambio fenotípico fácilmente identificable o seleccionable. Preferiblemente, se usan marcadores de resistencia a antibióticos, tales como el gen de resistencia a canamicina de TN903 (Friedrich y Soriano, 1991, Genes. Dev. 5:1513-1523), o genes que confieran resistencia a otros aminoglicósidos (incluyendo, pero sin limitarse a, dihidroestreptomicina, gentamicina, neomicina, paromicina y estreptomicina), el gen de \beta-lactamasa de IS1, que confiere resistencia a penicilinas (incluyendo, pero sin limitarse a, ampicilina, carbenicilina, meticilina, penicilina N, penicilina O y penicilina V). Otras secuencias génicas seleccionables incluyen, pero no se limitan a, secuencias génicas que codifican polipéptidos que confieren resistencia a zeocina (Hegedus et al., Gene 207:241-249). Otros antibióticos que se pueden usar son genes que confieren resistencia a anfenicoles, tales como cloranfenicol, por ejemplo se puede utilizar la secuencia codificante para cloranfenicol transacetilasa (CAT) (Eikmanns et al., 1991, Gene 102:93-98). Como observará el experto en la técnica, también se pueden usar otros métodos sin antibióticos, a seleccionar para el mantenimiento del plásmido, tales como, por ejemplo, una variedad de marcadores auxotróficos (véase Sambrook et al., 1989, más arriba; Ausubel et al., más arriba).

5.2.1.3 Los brazos de homología

Un componente requerido del vector son dos regiones cortas de ADN bicatenario, denominadas aquí como "brazos de homología". En una forma de realización, como se muestra en la Figura 1, los dos brazos de homología (etiquetados "A" y "B") son homólogos a la secuencia del ADN que flanquea el ADN diana de interés (etiquetada A' y B'), siendo un brazo homólogo a una secuencia de ADN en dirección corriente abajo del ADN diana, y siendo el segundo brazo homólogo a una secuencia localizada en dirección corriente arriba del ADN diana. Como se usa en este documento, las moléculas de ADN bicatenarias son "homólogas" si comparten una región común de identidad, opcionalmente interrumpida por diferencias de uno o más pares de bases, y son capaces de funcionar como sustratos para la recombinación homóloga. En una forma de realización preferida, los brazos de homología contienen aproximadamente 22 a 100 pares de bases o más de identidad continua con una región bicatenaria que flanquea al ADN diana de interés. Las regiones de homología se pueden interrumpir mediante uno o más restos no idénticos, con la condición de que los brazos de homología sigan siendo sustratos eficaces para recombinación homóloga. En una forma de realización preferida, para una eficacia óptima de recombinación, los brazos de homología tienen una longitud de aproximadamente 50 nucleótidos, con una identidad de secuencia continua, sin interrumpir, en el intervalo de 20-30 (por ejemplo, 25) pares de bases. Aunque también son posibles regiones más cortas de identidad continua (por ejemplo, al menos 6, 8 ó 10 pares de bases), es de esperar unas menores eficacias de recombinación usando tales regiones más cortas de identidad continua. Por ejemplo, en una forma de realización, la longitud de la identidad continua puede ser tan corta como 6 pb (Keim y Lark, 1990, 1. Structural Biology 104:97-106). No existe ningún límite superior a la longitud de los brazos de homología, o a la longitud de su identidad continua con la secuencia de ADN diana flanqueante.

Las secuencias nucleotídicas que flanquean un ADN diana también se denominan aquí como los "términos" que flanquean el ADN diana. De este modo, un ADN diana tendrá dos términos, un primer término y un segundo término. La orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado debe ser la misma que la orientación de la secuencia homóloga con relación al ADN diana (véase la Figura 1), de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos del ADN diana dé como resultado que el ADN diana se inserte entre los dos brazos de homología.

Las secuencias de los dos brazos de homología se escogen según el diseño experimental. Las únicas limitaciones en la elección de un brazo de homología es que no debe ser una secuencia encontrada más de una vez en el ADN diana, y no debe estar presente en ninguna otra parte en la célula hospedante durante la reacción de recombinación homóloga. En este caso, todavía se puede obtener el producto de recombinación homóloga pretendido, sin embargo entre un ambiente de sucesos de recombinaciones homólogas alternativos. En una forma de realización, la secuencia de los brazos de homología son dos secuencias que flanquean el poliligador de un vehículo de clonación usado habitualmente, tal como un BAC, PAC, YAC (cromosoma artificial de levadura), vectores de clonación fágicos tales la serie \lambdaEMBL o \lambdaGT, vectores fagémidos, cosmídicos, pBR322, pGEM, pGEX, pET, vectores de baculovirus, vectores víricos tales como vectores adenovíricos y vectores víricos asociados a adenovirus. De este modo, se puede usar un único vector para subclonar cualquier inserto que se ha clonado en estos vectores. Los vectores que contienen tales brazos de homología son particularmente útiles para subclonar insertos derivados de clones positivos de una librería de ADN, tal como una librería de BAC, PAC, YAC, cosmídica o lambda.

En diversas realizaciones, como se describe aquí más abajo, los brazos de homología están situados en los extremos de una molécula de ADN lineal, o dentro de una molécula de ADN lineal o un vector plasmídico de ADN circular.

Los brazos de homología están orientados en la misma orientación con relación a su orientación en la secuencia nucleotídica diana. En otras palabras, están orientados de forma que la secuencia de ADN deseada se inserta entre los brazos después de que tiene lugar la recombinación. Cuando los brazos de homología están situados en los extremos del ADN lineal, la secuencia de ADN insertada se captura y se inserta entre los dos brazos, creando de ese modo un plásmido circular y replicable.

5.2.1.4 Brazos de homología de oligonucleótidos adaptadores

En una forma de realización alternativa, la secuencia nucleotídica de los brazos de homología es homóloga a las secuencias nucleotídicas presentes en oligonucleótidos adaptadores. Cada uno de los dos oligonucleótidos adaptadores comprende una secuencia nucleotídica homóloga a las secuencias nucleotídicas presentes en uno de los brazos de homología, y una segunda región de homología que es homóloga a uno de los dos términos que flanquean el ADN diana. En la Figura 1 se representan oligonucleótidos adaptadores. Los brazos de homología del vector están etiquetados "A" y "B", y las regiones del oligonucleótido adaptador homólogas a estas secuencias están etiquetadas A' y B'. Los dos términos que flanquean el ADN diana están etiquetados "C" y "D", y las secuencias homólogas correspondientes, presentes en los oligonucleótidos adaptadores, están etiquetadas como C' y D'. En esta forma de realización, la recombinación mediada por RecE/T o Red\alpha/\beta entre los brazos de homología del vector, la región de homología en los oligonucleótidos adaptadores, y los términos de flanqueo del gen diana, da como resultado que el ADN diana se inserte o se "capture" entre los brazos de homología del vector.

5.2.1.5 Construcción del vector

El fragmento lineal o el vector circular se puede construir usando métodos estándares conocidos en la técnica (véase Sambrook et al., 1989, más arriba; Ausubel et al., más arriba). Por ejemplo, se puede usar tecnología de ADN sintético o recombinante. En una forma de realización, el fragmento lineal se obtiene mediante amplificación por PCR. En este método, los oligonucleótidos se sintetizan para incluir las secuencias de los brazos de homología en sus extremos 5', y las secuencias de los cebadores de PCR en sus extremos 3'. Estos oligonucleótidos se usan entonces como cebadores en una reacción de amplificación mediante PCR, para amplificar una región de ADN que incluye un origen de replicación y un marcador genético seleccionable. En otra forma de realización, se puede construir un plásmido para que comprenda dos brazos de homología apropiadamente orientados que flanquean un origen de replicación y un marcador genético seleccionable, mediante técnicas de ADN recombinante estándares (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, 1987, Volumen 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, New York; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). El plásmido se linealiza entonces, por ejemplo, mediante digestión con endonucleasa de restricción.

En otra forma de realización, por ejemplo, se puede usar el siguiente método para construir el ADN vector usado en la Sección 5.1.3, más arriba. Se sintetizan dos oligonucleótidos, uno de los cuales incluye, desde el extremo 5' hasta el extremo 3', un sitio de restricción único para el vector, un brazo de homología izquierdo y un cebador de PCR. El otro oligonucleótido incluye, desde el extremo 5' al extremo 3', el mismo sitio de restricción único para el vector, un SSRT, un brazo de homología derecho, y un cebador de PCR. Los dos brazos de homología se escogen para que flanqueen el ADN diana. El SSRT es un sitio reconocido por cualquier recombinasa específica del sitio (SSR), tales como las recombinasas Cre, Flp, Kw o R. La síntesis del oligonucleótido se debe diseñar de forma que los dos SSRT estén orientados como repeticiones dirigidas en el vector. Se usan dos cebadores de PCR para amplificar un molde de ADN que incluye un origen plasmídico, un gen seleccionable y un SSRT idéntico entre el origen y el gen seleccionable. El producto de la reacción de PCR se corta entonces con la enzima de restricción que reconoce los sitios incluidos en los extremos 5' de los oligonucleótidos, para permitir la circularización eficaz mediante ligación. El producto circular se transforma entonces en E. coli para amplificación para producir grandes cantidades del vector.

En otra forma de realización, se construye un fragmento lineal tomando un plásmido con un marcador seleccionable, un origen y dos sitios de clonación, y clonándolo en un brazo de homología oligonucleotídico en cada sitio de clonación. Entonces se usan enzimas de restricción para cortar el ADN plasmídico para producir un fragmento lineal unido por los brazos de homología. Este método es el preferido para la construcción de plásmidos más complejos - por ejemplo, plásmidos que contienen elementos potenciadores y promotores eucariotas a fin de incluir elementos de expresión eucariotas. Adicionalmente, se pueden subclonar otros elementos de secuencia en el vector.

El vector también puede contener secuencias nucleotídicas adicionales de interés para la expresión proteínica, la manipulación o el mantenimiento del ADN diana insertado. Por ejemplo, se pueden incluir, en la posición apropiada en el vector, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, secuencias de traducción tales como las secuencias de Shine y Dalgamo, sitios de reconocimiento de factores de transcripción, secuencias de consenso de Kozak, y señales de terminación. Para la clonación mediante recombinación en células distintas de las células bacterianas, tales como células vegetales, de insectos, de levadura o de mamíferos, pueden ser necesarios otros elementos de secuencia, tales como orígenes de replicación, transcripción, procesamiento, y señales de traducción, específicos de la especie. Tales elementos pueden incluir, pero no se limitan a, orígenes de replicación, potenciadores, sitios de reconocimiento de factores de transcripción, cajas de CAT, o cajas de Pribnow eucariotas.

En una forma de realización en la que la recombinasa RecE/T y/o Red\alpha/\beta, u otra recombinasa bacteriana, se produce de forma recombinante a partir de un plásmido de expresión en la célula, el vector escogido debe ser compatible con el plásmido de expresión de recombinasa bacteriana descrito en la Sección 5.2.3, más abajo. El experto en la técnica advertirá fácilmente los requisitos de compatibilidad necesarios para expresar múltiples plásmidos en una única célula. Los métodos de propagación de dos o más constructos en células procariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células que contienen múltiples replicones se pueden seleccionar y se pueden mantener utilizando vectores que comprenden orígenes de replicación apropiadamente compatibles y sistemas de selección independientes (véase Miller et al., 1992, más arriba; Sambrook et al., 1989, más arriba).

5.2.2 Recombinasas bacterianas

La invención descrita aquí se describe principalmente con referencia al uso de RecE/T y/o Red\alpha/\beta. Sin embargo, como será claro para el experto, la invención es igualmente aplicable al uso de otras recombinasas bacterianas que tengan la capacidad para mediar la recombinación homóloga usando un par de moléculas de ADN bicatenarias homólogas, como sustratos. Como se usa en este documento, una recombinasa bacteriana es una recombinasa que se expresa de forma endógena en bacterias, ya sea de origen fágico o bacteriano, y es capaz de mediar la recombinación homóloga. En diversas realizaciones, la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T y/o Red\alpha/\beta. En otra forma de realización específica, un sistema funcionalmente equivalente para iniciar la recombinación homóloga comprende la proteína erf del fago P22. Además, se pueden sustituir componentes proteínicos individuales de recombinasas bacterianas por otros componentes funcionales, para uso en la presente invención.

"RecE" y "RecT", como se usan aquí, se refieren en primer lugar a E. coli, por ejemplo RecE o RecT de K12 de E. coli. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de RecE y RecT de E. coli son bien conocidas (RecE, número de acceso GenBank M24905 y número de acceso SWISS-PROT P15033; RecT número de acceso GenBank L23927 y SWISS-PROT P33228). "Red\alpha" y "Red\beta" se refiere a las proteínas codificadas por el fago lambda. Red\alpha tiene una actividad de exonucleasa de 5' a 3' similar a la exonucleasa de 5' a 3' de RecE, y Red\beta tiene una actividad de hibridación de ADN similar a la de RecT. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos son bien conocidas para ambas proteínas lambda (véanse los números de acceso GenBank J02459; M17233).

Como será claro para el experto, la referencia a RecE/T y/o Red\alpha/\beta, en este documento, también se debe aplicar a una combinación de RecE/T y Red\alpha/\beta, excepto que se indique explícitamente de otro modo o por el contexto. En una forma de realización específica, la combinación de los dos complejos enzimáticos tiene un efecto sinérgico sobre la eficacia de la recombinación.

Las recombinasas bacterianas que se pueden usar también incluyen variantes alélicas de los componentes de las recombinasas. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos utilizadas en los sistemas de recombinación mediada por RecE/T y Red\alpha/\beta de la invención también pueden comprender secuencias de aminoácidos codificadas por cualesquiera variantes alélicas de RecE, RecT, Red\alpha o Red\beta, en tanto que tales variantes alélicas sean variantes funcionales, al menos hasta el grado en que muestren actividad de recombinación homóloga. Las variantes alélicas se pueden identificar de forma habitual, y se pueden obtener usando técnicas de ADN recombinante estándares (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, 1987, volumen 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, New York; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York), o enfoques de evolución de proteínas (Jermutus et al., 1988, Curr. Opin. Biotechnol. 9:534-548).

En general, el ácido nucleico que codifica tales variantes alélicas debe ser capaz de hibridar el complemento de la secuencia codificante de RecE, RecT, Red\alpha o Red\beta en condiciones moderadamente restrictivas (usando, por ejemplo, condiciones de hibridación de transferencia Southern estándares, con el lavado final en 0,2 x SSC/0,1% de SDS a 42ºC; Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., New York, en la p. 2.103), o condiciones de hibridación muy restrictivas (usando, por ejemplo, condiciones de hibridación de transferencia Southern estándares, con el lavado final en 0,1 x SSC/0,1% de SDS a 68ºC; Ausubel et al., más arriba).

RecE, RecT, Red\alpha y Red\beta, como se usan en este documento, también incluyen homólogos de RecE, RecT, Red\alpha y Red\beta derivados de los fagos hospedados por, o las células de, células procariotas de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero no se limitan a, especies de Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Klebsiellae, y Proteus. Tal homólogo de RecE, RecT, Red\alpha o Red\beta está codificado generalmente por un gen presente en un genoma fágico cuyo producto participa en una etapa, mediada por recombinación, en el ciclo vital del fago, tal como Red\alpha y Red\beta en el ciclo vital del fago lambda.

Los homólogos de RecE/T se pueden identificar rutinariamente, y se pueden obtener usando técnicas de ADN recombinante y genéticas procariotas estándares (véase, por ejemplo, Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al., más arriba). El ADN recombinante se puede obtener a partir de una librería genómica clonada o de ADNc, o mediante amplificación por PCR. Por ejemplo, una librería genómica se puede producir mediante técnicas de biología molecular estándares, o se puede obtener a partir de fuentes comerciales o no comerciales. La librería genómica o de ADNc se puede cribar entonces mediante hibridación de ácidos nucleicos a una sonda recE o recT de E. coli marcada (Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961), y los clones positivos se pueden aislar y secuenciar.

En un ejemplo específico, un homólogo de RecE o RecT se puede identificar de forma rutinaria en Salmonella typhimurium. Los genes recE y recT están bien caracterizados en K-12 de E. coli; las secuencias nucleotídicas y proteínicas de tanto RecE (número de acceso GenBank M24905 y número de acceso SWISS-PROT P15033) como de RecT (número de acceso GenBank L23927 y número de acceso SWISS-PROT P33228) son conocidas; (véase también Bachmann, 1990, Microbiol. Rev. 54:130-197; Rudd, 1992, en Miller, 1992, más arriba, p. 2.3-2.43). Se puede usar una librería \lambda o de cósmido genómico de S. typhimurium completa. La librería S. typhimurium se puede cribar entonces mediante hibridación con una sonda de RecE o RecT de E. coli utilizando condiciones de hibridación tales como las descritas anteriormente. Por ejemplo, puesto que es de esperar que los dos genes sean muy homólogos, se prefieren condiciones de hibridación estándares moderadamente restrictivas.

En una forma de realización, tales condiciones pueden incluir lo siguiente: los filtros que contienen ADN se pueden pretratar durante 6 horas a 55ºC en una disolución que contiene 6 X SSC, 5 X de disolución de Denhart, 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.

Las hibridaciones se pueden realizar en la misma disolución, y se usa 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Los filtros se pueden incubar en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55ºC, y después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una disolución que contiene 1 X SSC y 0,1% de SDS. Las manchas de los filtros se secan entonces y se exponen a película de rayos X para autorradiografía. Otras condiciones de restricción moderada que se pueden usar son conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una disolución que contiene 2 X SSC, 0,1% de SDS. El aislamiento subsiguiente, la purificación y la caracterización de los clones que contienen el S. typhimurium se puede realizar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase Ausubel et al., más arriba). Tales secuencias se pueden usar para construir las RecE/T de S. typhimurium de la invención.

Como alternativa, el gen de S. typhimurium se puede aislar de ARNm de S. typhimurium. El ARNm se puede aislar de células que expresan la proteína RecE o RecT. Una librería de ADNc se pueden producir mediante transcripción inversa de ARNm, y se puede cribar por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos anteriormente para el cribado de una librería genómica (véase Ausubel et al., más arriba). Como alternativa, el ADNc de recE o recT se puede identificar mediante técnicas a base de PCR, tales como RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc; Ausubel et al., más arriba), usando dos cebadores diseñados a partir de la secuencia de recE o recT de E. coli: un cebador "directo" que tiene la misma secuencia que el extremo 5' del ARNm de recE o recT de E. coli, y un cebador "inverso" complementario a su extremo 3'. El producto de la PCR se puede verificar mediante secuenciación, se puede subclonar, y se puede usar para construir la RecE/T de la invención. Tales secuencias de ADNc también se pueden usar para aislar secuencias de recE o recT genómicas de S. typhimurium, usando métodos bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989, más arriba; Ausubel et al., más arriba).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las enzimas de recombinación RecE/T de la invención se pueden sintetizar y/o construir adicionalmente según medios recombinantes y sintéticos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, más arriba y Ausubel et al., más arriba).

Como se expone más abajo, la capacidad para controlar la expresión de las secuencias, de forma que la expresión pueda ser regulable (por ejemplo inducible), y de forma que se pueda lograr un amplio intervalo de niveles de expresión, es beneficiosa para la forma de realización de los métodos de la invención.

Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, se pueden mantener de forma extracromosómica, por ejemplo en un plásmido, cósmido o en un bacteriófago. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico se pueden integrar en el cromosoma, por ejemplo en el cromosoma de E. coli, utilizando, por ejemplo, transducción o transposición fágicas. De este modo, las secuencias que codifican RecE/T se pueden manipular por ingeniería mediante técnicas estándares para que estén presentes en una copia elevada, una copia baja o una única copia en cada célula. También se puede utilizar una variedad de diferentes secuencias reguladoras para llevar a cabo la expresión de las proteínas de recombinación. Cada uno de estos aspectos de la expresión y construcción de cepas se puede manipular para producir células que muestren un amplio intervalo de niveles de expresión de proteínas de recombinación. Se ha de señalar que las versiones cromosómicas de una única copia de las secuencias que codifican proteínas de recombinación son adicionalmente ventajosas por cuanto tal configuración facilita la construcción de cepas.

5.2.2.1 Expresión de la proteína

La recombinasa bacteriana se puede expresar tanto constitutiva como induciblemente en células bacterianas, de levadura, de insectos, o de mamíferos. En una forma de realización preferida, las proteínas de recombinación se expresan en una cepa bacteriana, lo más preferible en una cepa de E. coli. Por ejemplo, la célula hospedante puede comprender los genes recE y recT localizados en el cromosoma de la célula hospedante. Se conocen ejemplos de cepas de E. coli en las que la expresión de RecE/T es endógena, por ejemplo cepas sbcA de E. coli (Zhang et al., 1998, más arriba). Como alternativa, RecE/T se puede expresar de forma recombinante a partir de ADN no cromosómico, preferiblemente en un vector plasmídico, por ejemplo, pBADET\gamma (Zhang et al., 1998, más arriba) o pGETrec (Narayanan et al., 1999, Gene Ther. 6:442-447). De forma similar, Red\alpha/\beta puede ser endógena en cepas que tienen el profago \lambda integrado, o se pueden expresar a partir de plásmidos, por ejemplo pBAD\alpha\beta\gamma (Muyrers et al., 1999, más arriba). Los constructos de expresión de RecE/T y/o Red\alpha/\beta se pueden construir según técnicas estándares de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, 1987, volumen 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, New York; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad).

En una forma de realización, RecE/T y/o Red\alpha/\beta se expresa en E. coli a partir de un plásmido de copia elevada, tal como un plásmido que contiene un origen de replicación derivado de CoIE1, cuyos ejemplos son bien conocidos en la técnica (véase Sambrook et al., 1989, más arriba; véase también Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y las referencias en el mismo), tales como pUC19 y sus derivados (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103-119).

Con respecto a los controles reguladores que permiten la expresión (ya sea regulada o constitutiva) en un intervalo de niveles de expresión diferentes, es bien conocida por los expertos en la técnica una gran variedad de tales secuencias reguladoras. La capacidad para generar un amplio intervalo de expresión es ventajosa para utilizar los métodos de la invención, como se describe más abajo. Tal expresión se puede lograr de una manera constitutiva así como también de una manera regulada, o inducible.

La expresión inducible que produce un amplio intervalo de expresión se puede obtener utilizando una variedad de secuencias reguladoras inducibles. En una forma de realización, por ejemplo, el gen lacI, y su inductor gratuito IPTG, se puede utilizar para producir niveles elevados de expresión inducible de RecE/T cuando las secuencias que codifican tales polipéptidos se transcriben vía las secuencias reguladoras lacOP.

RecE y RecT se pueden expresar a partir de diferentes promotores, o como alternativa los genes recE y recT se pueden expresar en un ARNm policistrónico a partir de un único promotor. Tales promotores heterólogos pueden ser inducibles o constitutivos. Preferiblemente, la expresión se controla mediante promotores inducibles. La expresión inducible que produce un amplio intervalo de expresión se puede obtener utilizando una variedad de secuencias reguladoras inducibles. En una forma de realización, por ejemplo, el gen lacI, y su inductor gratuito IPTG, se puede utilizar para producir niveles elevados de expresión inducible de RecE/T cuando las secuencias que codifican tales polipéptidos se transcriben vía las secuencias reguladoras lacOP. También se pueden utilizar una variedad de otros sistemas promotores inducibles, bien conocidos por los expertos en la técnica. Los niveles de expresión a partir de constructos de RecE/T o Red\alpha/\beta también se pueden variar usando promotores de diferentes fuerzas.

Otros sistemas de expresión regulada que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, el promotor araC que es inducible por arabinosa (AraC), el sistema TET (Geissendorfer y Hillen, 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663), el promotor p_{L} de temperatura del fago \lambda, y el represor lambda inducible CI_{857} (Pinotta, 1975, Nature 254:114-117; Petrenko et al., 1989, Gene 78:85-91), el sistema de promotor trp y represor trp (Bennet et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:2351-55; Wame et al., 1986, Gene 46:103-112), el promotor lacUV5 (Gilbert y Maxam, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:1559-63), lpp (Nokawa et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:289-299), el promotor T7 del gen 10, phoA (fosfatasa alcalina), recA (Horii et al., 1980), y el promotor tac, un promotor de fusión trp-lac, que es inducible por triptófano (Amann et al., 1983, Gene 25:167-778), por ejemplo, todos los cuales son promotores potentes usados habitualmente, que dan un nivel acumulado de alrededor de 1 a 10% de la proteína celular total para una proteína cuyo nivel está controlado por cada promotor. Si se desea un promotor más potente, el promotor tac es aproximadamente unas diez veces más potente que lacUV5, pero dará como resultado niveles basales de expresión elevados, y se debe usar sólo cuando se requiera una sobreexpresión. Si se necesita un promotor más débil, en la técnica se conocen muy bien otros promotores bacterianos, por ejemplo maltosa, galactosa, u otro promotor deseable (las secuencias de tales promotores están disponibles en Oenbank (Burks et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19:2227-2230)).

Las células útiles para los métodos descritos en este documento son cualquier célula que contenga recombinasas RecE/T y/o Red\alpha/\beta. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula bacteriana gram-negativa. Más preferiblemente, la célula hospedante es una célula enterobacteriana. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero no se limitan a, especies de Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Klebsiellae y Proteus. Lo más preferible, la célula hospedante es una célula de Escherichia coli. Las células también pueden derivar de cualquier organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, células de levadura, de mosca, de ratón, o de humanos, con la condición de que se puedan manipular mediante ingeniería para expresar una recombinasa adecuada. La recombinasa es preferiblemente recombinasa RecE/T derivada de E. coli, o recombinasa Red\alpha/\beta derivada del fago \lambda, o un sistema de recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta funcionalmente equivalente derivado de Enterobacteriaceae o de un fago de Enterobacteriaceae, en el que tales sistemas pueden mediar la recombinación entre regiones de homología de secuencia.

Las células que expresan proteínas de RecE/T y/o Red\alpha/\beta se pueden hacer electrocompetentes previamente, y se pueden almacenar a -70ºC.

Como alternativa, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en cualquier otro tipo celular en el que sea posible la expresión de RecE/T y/o Red\alpha/\beta. Por ejemplo, se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores hospedantes para expresar la secuencia que codifica la proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus de la vacuna, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos, infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN plasmídico, o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de vectores varían en sus potencias y especificidades. Dependiendo del sistema de vector hospedante utilizado, se puede usar uno cualquiera de un número de elementos de transcripción y de traducción adecuados. En realizaciones específicas, se expresan los genes de RecE/T y/o Red\alpha/\beta, o una secuencia que codifica una porción funcionalmente activa de RecE/T y/o Red\alpha/\beta. En aún otra forma de realización, se expresa un fragmento de RecE/T o Red\alpha/\beta que comprende un dominio de las proteínas RecE/T y/o Red\alpha/\beta.

Se puede usar cualquiera de los métodos previamente descritos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales de control transcripcionales/de traducción apropiadas, y las secuencias que codifican la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína RecE/T o Red\alpha/\beta, o fragmento peptídico, se puede regular mediante una secuencia de ácidos nucleicos de forma que la proteína RecE/T o Red\alpha/\beta, o péptido, se expresa en un hospedante transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína RecE/T o Red\alpha/\beta se puede controlar mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden usar para controlar la expresión de RecE/T o Red\alpha/\beta incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana de SV40 (Bemoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga de 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión vegetales, que comprenden la región promotora de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 303:209-213) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature, 310:115-120); elementos promotores procedentes de levadura o de otros hongos, tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfogliceroil quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcionales de animales, que muestran especificidad por el tejido y que se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I, que es activa en células acinosas pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de insulina, que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), la región de control del gen de inmunoglobulina, que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), la región de control del virus de tumor mamario de ratón, que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), la región de control del gen de albúmina, que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), la región de control del gen de alfa-fetoproteína, que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); la región de control del gen alfa 1-antitripsina, que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), la región de control del gen de beta-globina, que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica mielínica, que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina, que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica, que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

En una forma de realización específica, se usa un vector que comprende un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica una recombinasa bacteriana (por ejemplo, RecE o RecT), uno o más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos).

El vector escogido debe ser compatible con el plásmido vector descrito en la Sección 5.2.1, anteriormente. El experto en la técnica estará fácilmente al tanto de los requisitos de compatibilidad necesarios para mantener múltiples plásmidos en una única célula. Los métodos para la propagación de dos o más constructos en células procariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células que contienen múltiples replicones se pueden seleccionar rutinariamente y se pueden mantener utilizando vectores que comprenden orígenes de replicación apropiadamente compatibles y sistemas de selección independientes (véase Miller et al., 1992, más arriba; Sambrook et al., 1989, más arriba).

5.2.3 Células hospedantes

La célula hospedante usada para los métodos de clonación de la presente invención, y para la preparación del ADN clonado, puede ser cualquier célula que exprese los productos génicos recE y recT y/o red\alpha y red\beta, o cualquier célula en la que sea posible la expresión heteróloga de estos genes. Los ejemplos de tipos celulares posibles que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, células procariotas/eucariotas, tales como células bacterianas, de levadura, vegetales, de roedores, de ratones, de seres humanos, de insectos, o de mamíferos. En una forma de realización preferida, la célula hospedante es una célula bacteriana. En la forma de realización más preferida, la célula hospedante es una célula de E. coli. Los ejemplos de cepas específicas de E. coli que se pueden usar son JC 8679 y JC 9604. El genotipo de JC 8679 y JC 9604 es Sex (Hfr, F+, F-, o F): F-. JC 8679 comprende las mutaciones: recBC 21, recC 22, sbcA 23, thr-1, ara-14, leu B 6, DE (gpt-proA) 62, lacY1, tsx-33, gluV44 (AS), galK2 (Oc), LAM-his-60, relA 1, rps L31 (strR), xyl A5, mtl-1, argE3 (Oc) y thi-1. JC 9604 comprende las mismas mutaciones y la mutación adicional recA 56.

En una forma de realización alternativa, se puede usar una célula eucariota como célula hospedante para los métodos de clonación y de subclonación descritos aquí. Se puede usar cualquier célula que exprese o que se pueda manipular mediante ingeniería para que exprese una recombinasa bacteriana, o equivalentes funcionales de la misma. Se pueden usar estirpes celulares derivadas de ser humano, de ratón, de mono, o de cualquier otro organismo. Por ejemplo, los ejemplos no limitantes de estirpes celulares útiles para los métodos de la invención incluyen células CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, y WI38.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores hospedantes para introducir y expresar la secuencia codificante de proteína de RecE/T, Red\alpha/\beta, o un sistema funcionalmente equivalente. Tales métodos son bien conocidos en la técnica (véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Estos incluyen, pero no se limitan a, sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus de la vacuna, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos, infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN plasmídico, o ADN cosmídico. En la Sección 5.2.2, anterior, también se exponen métodos para la expresión de la proteína.

5.2.4 ADN diana

El ADN diana se escoge según diseño experimental, y puede ser cualquier ADN bicatenario tan corto como un par de bases, o de alrededor de una centena de kilobases de longitud. En una forma de realización específica, la diana tiene una longitud de hasta 100, 125, 200 ó 300 kb. En otra forma de realización específica, el ADN diana tiene 25 a 100 kilobases, por ejemplo, como está presente en un vector BAC. En la Sección 6, en los Ejemplos, se exponen otras realizaciones específicas de ADN diana. El ADN diana puede residir en cualquier molécula de ADN que se replique independientemente, tal como, pero sin limitarse a, un plásmido, BAC o el cromosoma de E. coli. El ADN diana también puede residir en cualquier fuente de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN procedente de cualquier célula procariota, arqueobacteriana o eucariota, o a partir de orígenes sintéticos, víricos o fágicos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos se pueden obtener a partir de las siguientes fuentes: humana, porcina, bovina, felina, aviar, equina, canina, de insecto (por ejemplo, Drosophila), de invertebrado (por ejemplo, C. elegans), vegetal, etc. El ADN se puede obtener mediante procedimientos estándares conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II).

5.3 Métodos para uso de la invención 5.3.1 Introducción de ADN en células hospedantes

Cualquier método conocido en la técnica para introducir una preparación de ADN, que comprende el ADN diana en una célula hospedante es adecuado para uso con los métodos descritos anteriormente. Tales métodos son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, electroporación de células, preparación de células competentes con cloruro de calcio o de rubidio, transducción de ADN con ADN diana empaquetado en partículas víricas. Para células eucariotas, los métodos incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transfección con fosfato de calcio, precipitación de ADN, y empaquetamiento vírico. En una forma de realización preferida, se usa la electroporación. Las células que contienen las proteínas RecE/T o Red\alpha/\beta se tratan para hacerlas competentes para la electroporación mediante métodos estándares (véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Preferiblemente, para la electroporación mediante procedimientos estándares se usan alrededor de 50 \mul de una preparación estándar de células electrocompetentes. En los experimentos que requieren la transformación de un vector lineal o circular, Preferiblemente se usa 0,3 \mug o más del vector. En experimentos que requieran la transformación de una preparación de ADN que contiene el ADN diana, preferiblemente se usan 0,3 \mug o más. Para experimentos de cotransformación, los ADN se mezclan preferiblemente antes de la electroporación. Después de la electroporación, las células se diluyen preferiblemente en medio de cultivo y se incuban durante un período de recuperación de aproximadamente hora y media antes de cultivar en condiciones para identificar el cambio fenotípico transportado por el gen marcador seleccionable.

En experimentos que utilizan la ruptura del vector mediante recombinación específica del sitio o mediante endonucleasa, la expresión de la SSR o de la endonucleasa, o combinaciones de una SSR y una endonucleasa, o de dos SSR, se induce ya sea antes de la preparación de células electrocompetentes, durante el período de recuperación tras la electroporación, o durante el cultivo para identificar el marcador seleccionable.

De forma óptima, el cambio fenotípico es la resistencia a un antibiótico, y las células se cultivan en placas que contienen el antibiótico correspondiente. En este caso, las colonias resistentes al antibiótico que aparecen después de un cultivo durante toda la noche contendrán predominantemente el producto de la subclonación deseado.

En otra forma de realización, el ADN se introduce en la célula hospedante mediante transducción de ADN que se ha empaquetado en partículas de fagos. Los protocolos de transducción y de empaquetamiento en P1 o \lambda son conocidos en la técnica. Los extractos de empaquetamiento en \lambda están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Promega, Madison, WI).

5.3.2 Oligonucleótidos

Los brazos de homología oligonucleotídicos, los cebadores, y los oligonucleótidos adaptadores usados en conjunción con los métodos de la invención a menudo son oligonucleótidos que oscilan desde 10 hasta alrededor de 100 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, un oligonucleótido tiene una longitud de 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos, 50 nucleótidos, o 100 nucleótidos, o hasta una longitud de hasta 200 nucleótidos. En una forma de realización preferida, el oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 90 nucleótidos.

Los oligonucleótidos se pueden sintetizar usando cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, la química estándar con fosforamidito en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 392/394). Adicionalmente, los reactivos para la síntesis se pueden obtener a partir de cualquiera de muchos proveedores comerciales.

Un oligonucleótido o derivado del mismo usado en combinación con los métodos de esta invención se puede sintetizar usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tales como los comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato se pueden sintetizar mediante el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209), los oligonucleótidos de metilfosfonato se pueden preparar mediante uso de soportes poliméricos de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451), etc.

Un oligonucleótido puede comprender al menos una base modificada, con la condición de que tal modificación no interfiera con la recombinación homóloga. Por ejemplo, tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitoxina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetila-minometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, y 2,6-diaminopurina.

Un oligonucleótido puede comprender al menos una cadena principal de fosfato modificada, con la condición de que tal modificación no interfiera con la recombinación homóloga. Tal modificación puede incluir, pero no se limita a, un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster de alquilo, y un formacetal o análogo de los mismos.

5.3.3 Amplificación de ADN

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se usa opcionalmente en relación con la invención para amplificar una secuencia deseada a partir de una fuente (por ejemplo, una muestra de tejido, una librería genómica o ADNc). Los cebadores oligonucleotídicos que representan secuencias conocidas se pueden usar como cebadores en PCR. La PCR se lleva a cabo típicamente mediante uso de un aparato de ciclos térmicos (por ejemplo, de Perkin-Elmer Cetus) y una polimerasa termoestable (por ejemplo, una marca Gene Amp^{TM} de polimerasa de Taq). El molde de ácido nucleico a amplificar puede incluir, pero no se limita a, ARNm, ADNc o ADN genómico de cualquier especie. El método de amplificación mediante PCR es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes U.S. n^{os} 4.683.202, 4.683.195 y 4.889.818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120, 621-623; Loh et al., 1989, Science 243, 217-220).

5.4 Métodos para aplicaciones de diagnóstico

Los métodos de la presente invención se pueden usar para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorizar diversas infecciones, alteraciones, enfermedades y trastornos asociados con la presencia de un ADN ajeno o variante de ADN, o monitorizar su tratamiento. Por ejemplo, como se describe en la Sección 5.4.1, a continuación, los métodos se pueden usar para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorizar diversas infecciones y enfermedades, tales como las enfermedades asociadas con una infección vírica, una infección bacteriana, o una infección por un protozoo, parásito, u otro patógeno conocido. Como se describe en la Sección 5.4.2, a continuación, los métodos también se pueden usar para detectar, pronosticar, diagnosticar, o monitorizar diversas infecciones, alteraciones, enfermedades y trastornos asociados con la presencia de una variante de ADN, tal como una mutación genética o un polimorfismo nucleotídico individual (SNP). Los métodos para tales fines de diagnóstico se describen con detalle más abajo.

5.4.1 Detección de ADN ajeno

Los métodos de la invención descritos anteriormente en este documento se pueden usar para detectar ADN ajeno, tal como un ADN vírico o bacteriano, que es el resultado de la exposición a un patógeno, en un paciente expuesto al patógeno. El paciente puede mostrar, o no, los síntomas de infección por el patógeno, o la presencia de una enfermedad o trastorno asociado por la presencia del patógeno. En una forma de realización, por ejemplo, una muestra de ADN diana se puede preparar a partir del ADN de un paciente que tiene o que se sospecha que tiene tal enfermedad o infección. Se pueden diseñar y preparar brazos de homología que tienen homología de secuencia con un ADN diana ajeno. El ADN de la muestra se puede introducir entonces en una célula hospedante de E. coli que expresa una recombinasa bacteriana y que contiene el ADN vector, mediante cualquiera de los métodos descritos en la Sección 5.1, anterior. En una forma de realización alternativa, se pueden diseñar oligonucleótidos adaptadores que comprenden una primera secuencia homóloga a una secuencia vector, y una segunda secuencia homóloga al ADN diana ajeno, orientados como se describe con detalle en la Sección 5.1, anterior. Tales oligonucleótidos adaptadores se pueden usar ya sea para cotransfectar, junto con el ADN de la muestra y el ADN vector, una célula hospedante de E. coli que expresa RecE/T o Red\alpha/\beta, o se pueden transfectar directamente en células que ya comprenden el ADN vector y el ADN de la muestra. Las células se hacen crecer entonces en medios selectivos, como se describe en la Sección 5.1 anterior, y las células que resisten la selección se pueden analizar para determinar la presencia de un inserto del tamaño apropiado.

El ADN diana se puede aislar de un paciente o de una muestra biológica de la persona, tal como, pero sin limitarse a, sangre completa, plasma, suero, piel, saliva, orina, fluido linfático, células obtenidas de aspirado de biopsia, células de cultivo de tejidos, medios, o de muestras no biológicas tales como comida, agua, u otro material. Los métodos para la preparación de ADN a partir de tales fuentes son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

En una forma de realización, por ejemplo, cuando se desee detectar o diagnosticar una infección o enfermedad vírica, los brazos de homología pueden comprender secuencias de ADN homólogas a las secuencias de ADN de un ADN vírico conocido. Los métodos se pueden usar para detectar y aislar ADN vírico ya sea como una cadena de ADN vírico, o como un intermedio replicativo de ADN de un virus de ADN o de ARN.

En una forma de realización, por ejemplo, los genomas de ADN o intermedios replicativos de virus de ADN se pueden seleccionar como dianas directamente usando secuencias de brazos de homología diseñadas para ser homólogas con secuencias víricas de tales virus de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, virus de la hepatitis tipo B, parvovirus, tales como virus asociados a adenovirus y citomegalovirus, parvovirus tales como virus del papiloma, virus de poliomas, y SV40, adenovirus, virus del herpes tales como el virus del herpes simple tipo I (HSV-I), el virus del herpes simple tipo II (HSV-II), y el virus de Epstein-Barr, y poxvirus, tales como el virus variólico (viruela) y el virus de la vacuna. En otra forma de realización, los intermedios replicativos de virus de ARN retrovíricos que se replican a través de un intermedio de ADN se pueden seleccionar como dianas directamente usando secuencias de brazos de homología diseñadas para ser homólogas con secuencias víricas de tales virus de ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (HIV-I), virus de la inmunodeficiencia humana tipo II (HIV-II), virus linfotrópico de células T humanas tipo I (HTLV-I), y virus linfotrópico de células T humanas tipo II (HTLV-II). En otra forma de realización, a fin de detectar y aislar los intermedios genómicos o replicativos de virus de ARN que se replican a través de un intermedio de ARN, el ARN se puede aislar y transcribir en una copia de ADNc del ARN usando transcriptasa inversa, según métodos bien conocidos en la técnica. Tales copias de ADNc se pueden usar como ADN diana para detectar la presencia de virus de ARN tales como virus de la gripe, virus del sarampión, virus de la rabia, virus de Sendai, picomavirus tales como el virus de la poliomelitis, virus Coxsackie, rinovirus, reovirus, togavirus tales como el virus de la rubéola (sarampión alemán) y el virus del bosque de Semliki, arbovirus, y el virus de la hepatitis tipo A.

En otra forma de realización preferida, cuando se desee diagnosticar o detectar infecciones bacterianas, los brazos de homología pueden comprender secuencias de ADN homólogas a secuencias de ADN de bacterias conocidas. Por ejemplo, en una forma de realización, tales secuencias de ADN de los brazos de homología pueden ser homólogas a ADNc o a ADN genómico de bacterias patógenas, incluyendo, pero sin limitarse a, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudo-tuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp., y Helicobacter pylori.

En otra forma de realización, tales secuencias de ADN de los brazos de homología pueden ser homólogas a ADNc o a ADN genómico de hongos patógenos incluyendo, pero sin limitarse a, Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, y Histoplasma capsulatum.

En otra forma de realización preferida, cuando se desee diagnosticar o detectar infecciones por protozoos, los brazos de homología pueden comprender secuencias de ADN homólogas a secuencias de ADN de protozoos conocidos. Por ejemplo, tales secuencias de ADN de los brazos de homología pueden ser homólogas a ADNc o a ADN genómico de cualquier protozoo conocido. Especialmente interesantes son los protozoos patógenos tales como Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, y Plasmodium malaria.

En aún otra forma de realización preferida, cuando se desee diagnosticar o detectar infecciones parasitarias, los brazos de homología pueden comprender secuencias de ADN homólogas a secuencias de ADN de un parásito conocido. Por ejemplo, tales secuencias de ADN de los brazos de homología pueden ser homólogas a ADNc o a ADN genómico de cualquier parásito conocido, incluyendo helmintos tales como Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, y anquilostomas.

5.4.2 Diagnóstico de mutaciones y polimorfismos en ADN celular

Los métodos de la invención también se pueden usar para aislar y detectar trastornos genéticos en una muestra de un paciente, y para pronosticar, diagnosticar o monitorizar diversas alteraciones, enfermedades y trastornos asociados con la presencia de una variante de ADN, tal como una mutación genética o un polimorfismo nucleotídico individual (SNP), así como para detectar una disposición genética a desarrollar una enfermedad o trastorno.

En una forma de realización, por ejemplo, una muestra de ADN diana se puede preparar a partir de ADN aislado de una muestra de un paciente que tiene o que se sospecha que tiene tal enfermedad o trastorno genético. En una forma de realización preferida, un vector que comprende brazos de homología que tienen secuencia homóloga a un gen particular de interés o región genómica de interés se puede diseñar o preparar y se puede introducir en una célula hospedante de E. coli que expresa una recombinasa bacteriana tal como RecE/T y/o Red\alpha/\beta. El ADN de la muestra se puede introducir entonces en la célula hospedante. En una forma de realización alternativa, se pueden diseñar oligonucleótidos adaptadores que comprenden una primera secuencia homóloga a una secuencia de vector, y una segunda secuencia homóloga al ADN del gen diana de interés, orientados como se describe con detalle en la Sección 5.1, anterior. En una forma de realización preferida, tales oligonucleótidos adaptadores se pueden usar ya sea para cotransfectar, junto con el ADN de la muestra, una célula hospedante de E. coli que expresa RecE/T y/o Red\alpha/\beta y que contiene el ADN vector. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los otros métodos para la clonación mediante recombinación homóloga descritos con detalle en la Sección 5.1, anterior. Las células se hacen crecer entonces en medios selectivos, como se describe en la Sección 5.1 anterior, y las células que resisten la selección se pueden analizar para determinar la presencia de un inserto del tamaño apropiado. El ADN se puede analizar entonces para determinar la presencia de una mutación o una variación de ADN de interés, mediante análisis de restricción o técnicas de secuenciación bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

En una forma de realización alternativa, el brazo de homología o el oligonucleótido adaptador puede contener la secuencia de la mutación genética o polimorfismo de ADN de interés. En esta forma de realización, la recombinación sólo se producirá si el ADN de la muestra contiene la mutación. Esto puede ser útil par el cribado de diagnóstico de un gran número de muestras para una mutación particular o polimorfismo de ADN, puesto que sólo las células que contienen una mutación particular serán resistentes a la selección.

El ADN diana se puede obtener a partir de cualquier muestra de ADN, tal como ADN genómico, ADNc, o ADN mitocondrial. En una forma de realización, por ejemplo, el ADN diana puede ser una región de un cromosoma humano. En otra forma de realización, el ADN diana está presente en una población mixta, por ejemplo, una población de ADN genómicos derivados de una pluralidad de sujetos de interés, por ejemplo sujetos que padecen un trastorno particular. Tal ADN diana se puede obtener a partir de una muestra biológica, tal como, pero sin limitarse a, sangre completa, plasma, suero, piel, saliva, orina, fluido linfático, células obtenidas de aspirado de biopsia, células de cultivos de tejidos, medios, o muestras no biológicas tales como comida, agua, u otro material. Los métodos para la preparación de ADN a partir de tales fuentes son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

Los ejemplos no limitantes de trastornos genéticos que se pueden ensayar usando este método incluyen mutaciones y SNP asociados con tales enfermedades hereditarias, tal como Brca-1 asociado con cáncer de mama, mutaciones implicadas en fibrosis cística, enfermedad de Tay-Sachs, anemia drepanocítica, hemofilia, aterosclerosis, diabetes, leucemia, cáncer de próstata y otros cánceres, y obesidad. Tales enfermedades hereditarias pueden incluir enfermedades neurológicas degenerativas y no degenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Wilson, ataxia espinocerebelosa, ataxia de Friedreich y otras ataxias, enfermedades priónicas incluyendo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, atrofia dentatorrubro palidoluisiana, encefalopatías espongiformes, distrofia miotónica; depresión, esquizofrenia, y epilepsia. Las enfermedades hereditarias también pueden incluir enfermedades metabólicas tales como, por ejemplo, hipoglicemia o fenilcetonuria. También se incluyen enfermedades y alteraciones cardiovasculares, cuyos ejemplos no limitantes incluyen aterosclerosis, infarto de miocardio, y tensión arterial elevada. La invención también se puede usar además para la detección y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme, tuberculosis, y enfermedades transmitidas sexualmente.

En otra forma de realización, los métodos de clonación mediante recombinación homóloga de la invención se pueden usar para determinar la base genética de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, se puede aislar ADN diana de una muestra de un paciente o pacientes que sufren un trastorno cuya base genética es desconocida. En una forma de realización, los métodos de clonación se podrían usar para aislar una región de un cromosoma que se sabe o se sospecha que está implicado en tal enfermedad o trastorno, de un grupo de pacientes que se sabe o se sospecha que tienen tal trastorno. El ADN recuperado se puede aislar entonces y se puede analizar posteriormente para determinar la presencia de mutaciones genéticas o polimorfismos, usando técnicas bien conocidas en la técnica para variaciones cartográficas en el ADN, tal como polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, u otras técnicas de detección de SNP (véase, por ejemplo, Nikiforov et al., Patente U.S. nº 5.679.524 expedida el 21 de octubre de 1997; McIntosh et al., publicación PCT WO 98/59066 de 30 de diciembre de 1998, Goelet et al., publicación PCT WO 95/12607 de 11 de mayo de 1995; Wang et al., 1998, Science 280:1077-1082; Tyagi et al., 1998, Nature Biotechnol 16:49-53; Chen et al., 1998, Genome Res. 8:549-556; Pastinen et al., 1996, Clin. Chem. 42:1391-1397; Chen et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10756-10761; Shuber et al., 1997, Hum. Mol. Gen. 6:337-347; Liu et al., 1997, Genome Res. 7:389-398; Livak et al., 1995, Nature Genet. 9:341-342; Day y Humphries, 1994, Annal. Biochem. 222:389-395).

Los ejemplos no limitantes de trastornos diana de interés clínico incluyen asma, artritis, psoriasis, eccema, alergias, resistencia a fármacos, toxicidad a fármacos, y cánceres tales como, pero sin limitarse a, sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma escamoso, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, papiloma, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia); leucemia crónica (leucemia mielocítica (granulocítica) crónica y leucemia linfocítica crónica); y policitemia verdadera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström, y enfermedad de cadena pesada. Los métodos de clonación mediante recombinación homóloga pueden ser útiles además diagnosticando y detectando diferencias genéticas, y en el diagnóstico de pacientes con enfermedades autoinmunitarias, incluyendo, pero sin limitarse a, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, escleroderma, polimiositis, hepatitis activa crónica, enfermedad de tejido conjuntivo mixta, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison idiopática, vitíligo, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Graves, miastenia grave, neutropenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, artritis reumatoide, cirrosis, pénfigo vulgar, infertilidad autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, penfigoide vesicular, lupus discoide, colitis ulcerosa, y enfermedad de depósito denso.

Los métodos de clonación mediante recombinación homóloga también se pueden usar para aislar, diagnosticar y detectar mutaciones, alteraciones, variaciones y SNP de ADN no asociados con enfermedad. Los ejemplos no limitantes incluyen tales mutaciones, alteraciones, variaciones y SNP de ADN presentes en secuencias genómicas no co-
dificantes, o mutaciones, alteraciones, variaciones y SNP de ADN asociados con diferentes grupos de sangre humanos.

En un aspecto preferido de la invención, los métodos de la invención pueden tener utilidad particular en el aislamiento, en la detección, el diagnóstico, el pronóstico o la monitorización de mutaciones, alteraciones, variaciones y SNP de ADN humano. Sin embargo, se observará que los métodos descritos en este documento serán útiles en el aislamiento, la detección, el diagnóstico, el pronóstico o en la monitorización de enfermedades de otros mamíferos, por ejemplo animales de granja que incluyen ganado, caballos, ovejas, cabras, y cerdos, animales domésticos que incluyen gatos y perros; y plantas, incluyendo plantas importantes desde el punto de vista agrícola y plantas de jardín.

5.5 Kits

La invención proporciona además kits que facilitan el uso de los métodos de clonación y subclonación mediante recombinación homóloga descritos aquí. En una forma de realización, se proporciona un kit que comprende, en uno o más recipientes: A) un vector ADN bicatenario útil para la clonación y subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de replicación y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en una primera cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en la primera cadena de ADN diana; y b) una célula que contiene una recombinasa bacteriana. La célula puede expresar de forma endógena o recombinantemente la recombinasa.

En otra forma de realización, se proporciona un kit útil para la clonación o subclonación dirigida de una molécula de ADN diana en uno o más recipientes, que comprende: a) un vector de ADN bicatenario útil para la clonación y subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de replicación, y un segundo brazo de homología, de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en una primera cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en la primera cadena de ADN diana; y b) un primer oligonucleótido bicatenario que comprende una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia y una segunda secuencia, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica de un primer término en una cadena de ADN diana; c) un segundo oligonucleótido que comprende una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica de un segundo término en dicha cadena de ADN diana; y d) una célula que contiene proteínas de recombinasas bacterianas, por ejemplo, proteínas RecE/T y/o Red\alpha/\beta. En una forma de realización específica, la célula es una célula de E. coli.

En otra forma de realización, se proporciona un kit con uno o más recipientes, que comprende: a) un vector de ADN bicatenario útil para la clonación y subclonación dirigidas de una molécula de ADN diana de interés, comprendiendo dicho vector un origen de replicación y dos brazos de homología, en el siguiente orden desde 5' hasta 3' a lo largo de una cadena de ADN vector: un primer brazo de homología, el origen de replicación y un segundo brazo de homología; de forma que la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en una primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia del primer término en dicha primera cadena de ADN diana, y la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en la primera cadena de ADN vector es homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo término en la primera cadena de ADN diana; b)un primer oligonucleótido bicatenario que comprende una primera cadena de ADN oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una primera secuencia nucleotídica y una segunda secuencia nucleotídica, siendo dicha primera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha segunda secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del primer término en una cadena de ADN diana; y c) un segundo oligonucleótido que comprende una segunda cadena oligonucleotídica que comprende, en el siguiente orden, desde 3' hasta 5': una tercera secuencia nucleotídica y una cuarta secuencia nucleotídica, siendo dicha tercera secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del segundo brazo de homología en dicha cadena de ADN vector, y siendo dicha cuarta secuencia homóloga a la secuencia nucleotídica de un segundo término en dicha cadena de ADN diana.

En diversas realizaciones específicas, el ADN diana del kit es ADN bacteriano, vírico, parasitario, de protozoo, o patógeno. En otras realizaciones específicas, el ADN diana del kit puede comprender una mutación genética o polimorfismo que se sabe o que se sospecha que está asociado con un trastorno o enfermedad. En otra forma de realización específica, las secuencias de adaptadores oligonucleotídicos o los brazos de homología del vector tienen homología de secuencia con vectores de clonación a base de BAC, PAC, lambda, plásmido o YAC.

6. Ejemplo Clonación y subclonación mediante RecE/T y Red\alpha/\beta

Los Ejemplos presentados en esta sección describen un número de experimentos que demuestran la clonación y subclonación exitosa usando los métodos de recombinación homóloga de la invención. Se muestran diferentes enfoques para los métodos de subclonación. De particular interés, un ejemplo muestra la clonación exitosa de un inserto más grande que cualquiera descrito previamente - la subclonación directa de un fragmento de ADN de 25 kb a partir de un vector BAC de aproximadamente 150 kg.

6.1 Métodos y materiales Preparación de fragmentos lineales

Se usaron condiciones estándares de reacción o PCR para amplificar fragmentos de ADN lineales. Se amplificaron los 1972 pb del origen p15A más el gen de resistencia a canamicina (de Tn903) a partir de pACYC177. El origen p15A permite a este plásmido o recombinante coexistir en células con otros plásmidos que tienen un origen de grupo con compatibilidad con CoIE1. Los 1934 pb de gen resistente a cloranfenicol (de Tn9) más el origen p15A se amplificó a partir de pACYC184.

Los oligonucleótidos usados en la reacción de PCR comprendieron, en sus extremos 3', una secuencia de 18-30 nucleótidos que sirve como cebador en plásmidos pACYC, y, en los extremos 5', un tramo de secuencia de 50 a 60 nucleótidos homóloga a los flancos de la región de ADN diana. Para oligonucleótidos largos, la temperatura de hibridación de la reacción de PCR usada fue 62ºC. Los productos de la PCR se purificaron usando un kit de purificación para PCR QIAGEN (QUIAGEN), y se eluyeron con dH_{2}O. El ADN molde se eliminó digiriendo los productos de la PCR con Dpn I. Tras la digestión, los productos de la PCR se precipitaron mediante etanol y se resuspendieron en dH_{2}O a 0,5 \mug/ul.

Preparación de células competentes

Se prepararon células competentes para electroporación mediante métodos estándares. De forma resumida, los cultivos de toda la noche se diluyeron 100 veces en medio LB con los antibióticos apropiados. Las células de E. coli se hicieron crecer hasta una densidad óptica de OD_{600} = 0,25-0,4, y se congelaron en hielo durante 15 minutos. Las células bacterianas se centrifugaron a 7.000 rpm durante 10 minutos a -5ºC. El pelete de célula bacteriana se resuspendió en glicerina al 10% enfriado en hielo, y se peletizó mediante centrifugación a 7.000 rpm a -5ºC durante 10 minutos. Después de lavar 3 veces en glicerina al 10% enfriada en hielo, y tras la recentrifugación, el pelete celular se suspendió en un volumen de glicerina al 10% enfriada en hielo igual al volumen de las células. Las células competentes se diluyeron en partes alícuotas de 50 \mul en tubos de eppendorf, se congelaron de forma repentina en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -70ºC.

Los experimentos con los plásmidos pBAD-ET\gamma o pBAD-\alpha\beta\gamma implicaron la transformación de estos plásmidos en hospedantes de E. coli por medios estándares, seguido de un crecimiento durante toda la noche hasta saturación en medio LB más 0,2% de glucosa, 50 \mug/ml de ampicilina, y después los cultivos se diluyeron 100 veces en LB más 50 \mug/ml de ampicilina, y se hicieron crecer hasta OD_{600} de 0,15. Después se añadió L-arabinosa hasta una concentración final de 0,1%. Las células se hicieron crecer hasta OD_{600} de 0,25-0,4 antes de congelar en hielo durante 15 minutos.

Electroporación

Una disolución de ADN en 1 \mul (que contiene aproximadamente 0,5 \mug de ADN o más para cotransformación, o aproximadamente 0,3 \mug o más de ADN vector solo para células que contienen la diana, o aproximadamente 0,5 \mug o más de ADN que contiene la diana para células que tienen el vector) se mezcló con células competentes. La mezcla de células y ADN se transfirió en una cubeta enfriada en hielo. La electroporación se realizó usando un pulsador génico Bio-Rad ajustado a 25 \muFD, 2,3 kV con un controlador de pulso ajustado a 200 ohmios. Después de la electroporación se añadió medio LB (1 ml). Las células se incubaron a 37ºC durante 1-1,5 horas con agitación, y después se extendieron sobre placas que contienen el antibiótico que corresponde al gen marcador seleccionable en el vector.

6.2 Resultados

La Tabla 1 resume seis experimentos en los que se subclonaron diversas regiones de ADN diana de interés usando fuentes diferentes de expresión mediante RecE/T o Red\alpha/\beta. La primera columna, titulada "expresión ET" se refiere a la fuente de RecE/T o Red\alpha/\beta, ya sea RecE/T endógena en hospedantes JC8679 o JC9604 de E. coli, o a partir de plásmidos pBAD-recE/T o pBAD\alpha\beta\gamma, según se indica. La segunda columna indica el hospedante de E. coli usado. La tercera columna indica los genes diana.

En el primer experimento, el gen de recE/T residente en el cromosoma de E. coli se subclonó en la cepa JC8679 de E. coli, en la que la expresión de RecE/T es constitutiva. Esto se logró usando la estrategia esquematizada en la Figura 2. Se diseñaron y se sintetizaron oligonucleótidos que tienen la siguiente secuencia:

: 5'-TTCCTCTGTATTAACCGGGGAATACAGTGTAATCGATAATTCAGAGGAATAGCTCGAGTTA ATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3' (SEQ ID NO:1)

y

: 5'-CAGCAATGTCATCGAGCTGAGACTTACTGATACCGGGACCCGCGTGGTAATTCTCGAGTGA TTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3' (SEQ ID NO:2)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen resistente a canamicina Tn903 presente en pACYC177. Los resultados de este experimento se resumen en la primera fila de la Tabla 1.

TABLA 1

Expresión ET	Hospedante	Genes diana	Colonias	% correcto
	de E. coli		totales	(de 18)
recE/T endógena	JC8679	recE/T en cromosoma de E. coli	540	89
recE/T endógena	JC8679	lacZ en cromosoma de E. coli	760	94
recE/T endógena	JC9604	lacZ en cromosoma de E. coli	290	100
pBAC-recE/T	JC5519	Gentamicina en plásmido de	>3000	100
		copia elevada
pBAD-\alphaB\gamma	HB101	lacZ en cromosoma de E. coli	370	94
pBAD-\alphaB\gamma	HS996	Intron3 de mAF4 en BAC	160	83

En el segundo experimento, el gen lacZ residente en el cromosoma de E. coli se subclonó en la cepa JC8679 de E. coli, en la que la expresión de RecE/T es constitutiva. Esto se logró usando la estrategia perfilada en la Figura 2. El vector se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATT CTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG -3' (SEQ ID NO:3)

y

: 5'-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAAT AAGATGATCTTCTTGAGATCG-3' (SEQ ID NO:4)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a canamicina Tn903 presente en pACYC177. Los resultados se resumen en la segunda fila de la Tabla 1.

En el tercer experimento, el gen lacZ residente en el cromosoma de E. coli se subclonó en la cepa JC9604 de E. coli, en la que la expresión de RecE/T es constitutiva. Esto se logró usando la estrategia representada en la Figura 2. El vector se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAAT TCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG -3' (SEQ ID NO:5)

y

: 5'-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAAT AAGATGATCTTCTTGAGATCG-3' (SEQ ID NO:6)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a canamicina Tn903 presente en pACYC177. Los resultados se resumen en la tercera fila de la Tabla 1.

En el cuarto experimento, el gen de gentamicina residente en el plásmido pFastBAC1 de copia elevada (Gibco) se subclonó en la cepa JC5519 de E. coli usando la estrategia representada en la Figura 3. La expresión de RecE/T se proporcionó mediante el plásmido pBAD-recE/T después de que este plásmido se hubo transformado en JC5519, seguido de la inducción con arabinosa antes de la preparación de células competentes. El vector se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TCGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGGATCCTTA ATAAGATCATCTTCTGAGATCGTTTTGG-3' (SEQ ID NO:7)

y

: 5'-TGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCAGAATTCTG ATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG- 3' (SEQ ID NO:8)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a canamicina Tn903 presente en pACYC177, el producto de la PCR se mezcló con pFastBAC1 digerido con BamHI para cotransformación y cultivo en placas que contienen gentamicina más canamicina.

En el quinto ejemplo, el gen lacZ residente en el cromosoma de E. coli se subclonó en la cepa HB101 de E. coli usando la estrategia representada en la Figura 2. La expresión de Red\alpha/\beta se proporcionó mediante el plásmido pBAD\alpha\beta\gamma después de que este plásmido se hubo transformado en HB101, seguido de la inducción con arabinosa antes de la preparación de células competentes. El vector se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATT CTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG -3' (SEQ ID NO:9)

y

: 5'-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAAT AAGATGATCTTCTTGAGATCG-3' (SEQ ID NO:10)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a canamicina Tn903 en pACYC177. Los resultados de este experimento se resumen en la quinta fila de la Tabla 1.

En el sexto experimento, una región de 25 kb de un clon de BAC de aproximadamente 150 kb que tiene el gen AF4 de ratón se subclonó en la cepa HS996 de E. coli usando la estrategia representada en la Figura 3. La expresión de Red\alpha/\beta se proporcionó mediante el plásmido pBAD\alpha\beta\gamma después de que este plásmido se hubo transformado en HS996, seguido de la inducción con arabinosa antes de la preparación de células competentes. El vector se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TGTAGCTGAGCCCAGGGGCAAGGCTGCTTTGTACCAGCCTGCTGTCTGCGGGGGCATCAC CTGGAATTCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3' (SEQ ID NO: 11)

y

: 5'-TGGGTGTCAACCTCAGGCTTTCTCACACGCAATACAGGTAGGGACTTGCACCCCTACACAC CGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3' (SEQ ID NO:12)

para amplificar el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a canamicina Tn903 presente en pACYC177. El producto de la PCR se mezcló con 0,5 \mug de ADN de BAC purificado, para cotransformación. Los resultados de este experimento se resumen en la sexta fila de la Tabla 1. También, en la Figura 6 se muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que representa ADN digerido con EcoRI aislado de 9 colonias independientes (líneas 1-9) obtenidas del experimento de mAF4 BAC, usando como control la digestión con EcoRI del vector de partida (línea 10).

En el séptimo experimento, se clonó una región de ADN genómico que contiene un gen de resistencia a ampicilina procedente de la cepa MGD 353-13D de levadura usando la estrategia representada en la Figura 7. Como se representa en el panel A, un fragmento de ADN que contiene el origen p15A de replicación, flanqueado por brazos de homología de 98 ó 102 pb, seleccionó como diana a las regiones flanqueantes de 98 y 102 pb de un gen de resistencia a ampicilina integrado en la cepa MGD353-13D de levadura. Se usó la cepa JC5519 de E. coli, y la expresión de red\alpha/\beta se proporcionó mediante el plásmido pBAD\alpha\beta\gamma-TET, seguido de la inducción con arabinosa antes de la preparación de células competentes. El pBAD\alpha\beta\gamma-TET es un derivado de pBAD\alpha\beta\gamma en el que el gen de resistencia a ampicilina ha sido sustituido por el gen de resistencia a tetraciclina. El vector de clonación se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos de la siguiente secuencia:

: 5'-TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAA AGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTA AGCAGACAG-3'(SEQ ID NO:13)

y

: 5'-TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATC GTTTGG-3' (SEQ ID NO:14)

para amplificar el origen p15A de replicación presente en pACYC177. El producto de la PCR se mezcló con 4 \mug de ADN genómico de levadura MGD 353-13D digerido con NcoI para cotransformación en JC5519 que contiene Red\alpha/\beta expresada a partir de pBAD\alpha\beta\gamma, y para el cultivo en placas de cultivo que contienen ampicilina después de un período de recuperación de 90 minutos, en caldo L a 37ºC. Los clones se identificaron mediante selección por resistencia a ampicilina. Se tomaron dieciocho colonias para el análisis de ADN. En la Figura 7B se muestra un gel teñido con bromuro de etidio de los diez que fueron correctos.

El ejemplo descrito aquí ilustra el éxito de los métodos de clonación mediante recombinación homóloga con RecE/T y Red\alpha/\beta usando una amplia variedad de dianas circulares - desde un plásmido de copia elevada hasta una diana grande de copia baja (un BAC) hasta el cromosoma de E. coli.

7. Efecto de repeticiones y de fosforilación del vector sobre la eficacia de clonación

El Ejemplo presentado en esta sección describe la optimización de condiciones para una eficacia elevada de la clonación y la subclonación utilizando recombinación homóloga mediada por RecE/T o Red\alpha/\beta ("clonación ET"). En particular, como se muestra en la Figura 8, la eliminación de las repeticiones de secuencia en el vector mejoró las eficacias de clonación. Por otro lado, la presencia de 5' fosfatos en los extremos del vector lineal tuvo muy poco efecto sobre la eficacia de la clonación ET.

En primer lugar, se examinó el efecto de las repeticiones sobre la eficacia de clonación en el siguiente experimento. Como se muestra en la Figura 8, el vector lineal usado como vehículo de clonación comprendió el origen de replicación p15A, el gen de resistencia a cloranfenicol (cm^{r}), una secuencia nucleotídica requerida para la amplificación mediante PCR del vector lineal (en itálica en la Figura 8), flanqueados por los brazos de homología al gen lacZ de E. coli, y secuencias repetidas terminales de diversas longitudes (indicadas en negrita), presentes en ambos extremos del vector lineal. Los vectores lineales se transformaron en JC8679 (endógenamente capaz de ET; Clark, 1974, Genetics, 78, 259-271) o JC 5519 (Willets y Clark, 1969, J. Bacteriol. 100:231-239) que expresa pBADRed\alpha/\beta (Zhang et al., 1998, Nat. Genet. 20:123-128). En la Figura 8, en la tabla, se muestra el número de colonias obtenido en placas de LB (con 50 \mug/ml de cloranfenicol) después de la subclonación ET usando los oligonucleótidos indicados para la amplificación mediante PCR del vector lineal. De estos, 18 se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción. La eficacia indicada se determinó dividiendo el número de recombinantes correctos entre el número total de colonias obtenidas. De este modo, la presencia de repeticiones terminales > 6 nucleótidos reduce significativamente la eficacia de la subclonación ET. Todas las colonias de fondo contenían vector lineal religado.

También se examinó el efecto de la fosforilación, y los resultados se muestran en la Figura 8. Los extremos del vector lineal se fosforilaron usando ADN quinasa de T4 y \gamma-ATP. Como se muestra en la Figura 8, última columna, no se observó ningún efecto en la subclonación ET o en la religación del vector.

Este Ejemplo demuestra que la presencia de secuencias repetidas en los extremos del vector lineal, o entre el brazo de homología y los elementos esenciales del vector, es decir, el origen de replicación y el marcador seleccionable, da como resultado una recombinación que reduce muchísimo las eficacias de la clonación y subclonación ET. De este modo, en una forma de realización preferida, la secuencia del vector de clonación por homología no contiene ninguna secuencia directamente repetida de cinco (5) o más bases fuera de las secuencias que codifican el origen de replicación y el marcador seleccionable.

8. Ejemplos adicionales de clonación y subclonación mediante RecE/T y Red\alpha/\beta

Estos ejemplos presentados en esta sección describen experimentos adicionales que demuestran los enfoques de clonación y subclonación exitosos utilizando recombinación homóloga mediada por RecE/T- o Red\alpha/\beta-.

El hospedante de E. coli

Como se describe aquí anteriormente, un "hospedante competente de ET" se refiere a cualquier célula de E. coli capaz de expresar RecE/RecT y/o Red\alpha/Red\beta. Esto se puede lograr en una variedad de formas, tal como (1) una cepa que expresa endógenamente RecE/RecT o Red\alpha/Red\beta, o (ii) una cepa en la que RecE/RecT o Red\alpha/Red\beta se expresan a partir de un plásmido introducido exógenamente. Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión a base de plásmido basado en JC9604 y JC8679 y sus derivados (principalmente YZ2000 e YZ2001). Para otras variaciones y ejemplos de hospedantes competentes para ET, véase Murphy et al., 2000, Gene 246:321-330; Yu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5978-5983; y Datsenko y Wanner, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645.

En la primera categoría, se han usado dos cepas, que tienen la mutación sbcA y que por lo tanto expresan endógenamente RecE/RecT en un fondo de RecA^{-} (JC9604; Gillen et al., 1981, J. Bacteriology 145:521-532) o en un RecA^{+} (JC8679; Gillen et al., más arriba). La ventaja de usar estas cepas reside en el hecho de que se pueden usar directamente, sin la necesidad de introducir primero un plásmido para hacer a la cepa competente para la clonación ET. La desventaja es que RecE y RecT se expresan constitutivamente durante todo el procedimiento de clonación, lo que potencia el riesgo de una recombinación intramolecular indeseada, especialmente en un fondo de recA^{+}. Una segunda desventaja es que estas cepas JC no se han modificado para uso como hospedantes de clonación y de propagación. Contienen un sistema de restricción/modificación totalmente activo, lo que, en consecuencia, reduce enormemente la eficacia de introducción de grandes moléculas tales como los BAC en estos hospedantes.

La elección de si usar una cepa hospedante con un suministro de RecE/T o Red\alpha/\beta endógeno o con un suministro de RecE/T o Red\alpha/\beta introducido mediante plásmido depende de la naturaleza de la diana circular. Independientemente de la estrategia escogida, la preparación de buenas células competentes es de crucial importancia. Si la cepa hospedante carece de un potencial de clonación ET endógena, la cepa necesita ser transformada primero con pBAD-\alpha\beta\gamma o pBAD-ET\gamma. Es necesario entonces hacer crecer a la cepa resultante inducida con L-arabinosa hasta una concentración final de 0,1%, y se debe preparar para electroporación. Empíricamente, el punto óptimo de cosecha de las células se produce a una OD_{600} de alrededor de 0,35, especialmente cuando se seleccionan como dianas grandes sustratos de ADN. Si las células han alcanzado una OD_{600} mayor que 0,5, no se deben usar. El tiempo óptimo de inducción es alrededor de 1 hora. Es necesario usar una electroporación, puesto que no se ha encontrado ningún otro método de introducción de ADN para trabajar. La obtención de buenas células electrocompetentes es esencial para obtener recombinantes de ET. Durante la preparación de células electrocompetentes, todas las etapas se deben realizar en hielo y en cubetas y rotores. Las células electrocompetentes se concentran mucho: a partir de un cultivo de 250 ml que se cosecha a OD_{600} = 0,35, se preparan rutinariamente no más de 10 partes alícuotas de 50 \mul de células competentes. La eficacia de la transformación resultante depende enormemente de la cepa hospedante usada, pero varía típicamente alrededor de 10^{9} cfu/\mug. En http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/stewart/index.html se puede obtener un protocolo detallado de cómo preparar células electrocompetentes y cómo realizar la electroporación.

El plásmido pR6K/BAD-\alpha\beta\gamma(tet), mostrado en la Figura 9A, se construyó para conferir, en la cepa HS996 hospedante de BAC (Invitrogen), la capacidad para llevar a cabo la recombinación ET. Este plásmido se basa en la estructura de pBAD24 (Guzman, et al., 1995, J. Bacteriol. 177:4121-4130). Red\alpha (o RecE) se expresa a partir del promotor pBAD inducible por L-arabinosa, y Red\beta (o RecT) se expresa a partir del promotor EM-7 constitutivo. La sobreexpresión de RecT con relación a RecE, o de Red\beta con relación a Red\alpha, potencia la eficacia de la clonación ET (en términos de cantidad de colonias en las placas de selección). Finalmente, este plásmido expresa constitutivamente la proteína Red\gamma, en este caso a partir del promotor Tn5 constitutivo, que es necesario para inhibir la actividad de la enzima RecBCD presente en la mayoría de las cepas hospedantes usadas Habitualmente (Murphy, 1991, J. Bacteriology 173:5808-5821). Si no se inactiva, RecBCD inhibe completamente la clonación ET, probablemente debido a que su actividad de exonucleasa degrada el ADN lineal antes de que tenga la oportunidad de recombinarse. De este modo, pBAD-\alpha\beta\gamma(tet) constituye un sistema móvil que puede conferir habilidad de clonación ET regulable con la transformación de la cepa hospedante receptora. Dada la capacidad de inducción de la expresión de RecE o Red\alpha, y el requisito absoluto de que ambos componentes de los sistemas recE/T y red\alpha/\beta se coexpresen a fin de que se produzca la recombinación, la ventana recombinogénica está limitada al tiempo de inducción con arabinosa, y a la semivida del componente menos estable. Tomado junto con el hecho de que se usarán de la forma más habitual hospedantes recA, y de que los hospedantes también serán recBC, o una fenocopia de recBC^{-} (debido a la expresión de Red\gamma), esto significa que se reduce enormemente el riesgo de recombinación intramolecular indeseada. Una característica útil adicional de pBAD-\alpha\beta\gamma(tet) es que estos plásmidos tienden a perderse rápidamente cuando no son seleccionados durante el cultivo. Esto es debido probablemente a la expresión constitutiva de Red\gamma, y también puede variar según los factores de las células hospedantes, por ejemplo la presencia de RecBCD.

La replicación de pR6K/BAD-\alpha\beta\gamma requiere el origen R6K y la proteína Pir-116 (Metcalf et al., 1994, Gene 138, 1-7). El plásmido pR6K/BAD/\alpha\beta\gamma tiene el origen R6K, que se obtiene a partir de pJP5603 (Penfold y Pemberton, 1992, Gene 118:145-6), el gen replicón pir-116, que controla la replicación del R6K ori plasmídico en bacterias, y el gen de resistencia a tetraciclina tet a partir de pBR322. Pir-116 es un mutante de copia hacia arriba que permite que un plásmido que contiene el origen R6K exista en una cepa de E. coli en una cantidad mayor que 200 copias por célula. El gen pir-116 se amplificó mediante PCR a partir de la cepa BW3647 de E. coli, y se clonó detrás del promotor
lacZ.

Para generar pR6K/BAD/\alpha\beta\gamma, se introdujeron el origen R6K, pir-116 y tet^{r} en pBAD-\alpha\beta\gamma (Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27:1555-1557) mediante recombinación ET, sustituyendo de ese modo el origen CoIE1 y el gen de resistencia a ampicilina presente originalmente en pBAD-\alpha\beta\gamma. De forma similar, se generaron pR6K/BAD/ET\gamma y pR6K/BAD/recT. El número de copias de cualquier plásmido a base de R6K fue de aproximadamente dos veces mayor en comparación con el respectivo plásmido progenitor a base de CoIE1. En una comparación lado con lado de pR6K/BAD/\alpha\beta\gamma y pBAD-\alpha\beta\gamma en un ejercicio de subclonación en BAC estándar, se encontró que el plásmido a base de R6K funciona más eficazmente (véase la Figura 9B). El sistema de replicación de R6K presente en estos plásmidos pR6K no contiene ninguna homología de secuencia significativa distinta de otros orígenes de replicación, incluyendo p15A y CoIE1. Además, los plásmidos a base de R6K son compatibles con cualquier otro origen de replicación. De este modo, los orígenes de replicación tales como CoIE1 y p15A se pueden incluir en el vector lineal usado para la subclonación ET.

Subclonación ET

En la Figura 10 se muestra la subclonación de un fragmento de 19 kb que incluye exones 2 y 3 del gen AF-4 presente en un BAC. En primer lugar, pR6K/BAD-\alpha\beta\gamma se transformó en la cepa que contiene BAC. Subsiguientemente, la cepa transformada se hizo crecer en medio LB que contiene 15 \mug/ml de tetraciclina y 12,5 \mug/ml de cloranfenicol. Las células en crecimiento se indujeron con L-arabinosa durante 1 hora, después de lo cual se prepararon células electrocompetentes. Estas células se transformaron mediante electroporación con el vector lineal, que contenía el origen p15A de replicación y el gen de resistencia a ampicilina, \beta-lactamasa (bla), flanqueados por dos brazos de homología de 50 nucleótidos que dirigen la recombinación homóloga al ADN diana en el AF-4 BAC. Los recombinantes se obtuvieron después del crecimiento en placas de LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina.

Como se muestra en la Figura 10B, se seleccionaron para análisis 5 colonias independientes. El ADN se preparó a partir de 5 colonias independientes, se digirió con HindII, y se analizó en un gel teñido con bromuro de etidio. Las colonias correctas digeridas con HindIII y el vector lineal solo se usaron como marcadores, así como una escalera de ADN de 1 kb (Gibco BRL). Los subclones correctos se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

Clonación ET

El ADN genómico también puede ser la fuente directa de ADN diana, como se muestra en el experimento en la Figura 11. En este experimento, el vector lineal consistió en el origen CoIE1 y el gen de resistencia a canamicina (kan), flanqueados por brazos de homología que dirigen la recombinación al locus lacI/lacZ presente en el cromosoma de E. coli (véase la Figura 11A). El ADN genómico se aisló de E. coli prelinealizada mediante digestión con XhoI. El vector lineal y el ADN genómico prelinealizado se mezclaron y se coelectroporaron en YZ2000, que expresa de forma endógena RecE/RecT. Seleccionando en placas de LB que contienen 50 \mug/ml de canamicina, se obtuvo el subclón deseado que consiste en los genes lacI y lacZ, el origen CoIE1 y kan. Como se muestra en la Figura 11B, el análisis de restricción de 16 colonias independientes contenía el producto correcto (líneas 1-16). La línea 17 muestra el vector lineal; la línea M muestra una escalera de ADN de 1 kb como marcador (Gibco BRL).

En la Figura 12 se muestra otro ejemplo de clonación exitosa mediante recombinación ET. En este experimento, se clonó directamente un fragmento a partir de ADN genómico de células ES de ratón usando un vector de clonación con brazos de homología. Como se muestra en la Figura 12A, que representa la estrategia de clonación, se empleó como ADN diana un gen de resistencia a neomicina (neo) a partir de ADN genómico de células ES de ratón. El vector lineal consistió en el origen de replicación CoIE1 más el gen de resistencia a cloranfenicol Cm^{r} flanqueados por dos brazos que fueron homólogos al gen Tn5-neo. La estirpe celular ES de ratón requerida se generó transfectando un fragmento que contiene Tn5-neo bajo control del promotor PGK más una cola polyA. El ADN genómico se preparó a partir de colonias de resistencia a G418, y se cizallaron con una aguja y mediante extracción con fenol/cloroformo, creando fragmentos lineales de alrededor de 20-40 kb.

La clonación ET se realizó coelectroporando el vector lineal y el ADN genómico cizallado en YZ2000, un derivado de JC8679 (Clark, más arriba) en el que el sistema de restricción, que degrada ADN metilado ajeno, está parcialmente alterado por supresión de los genes mcrA, mcrBC, hsdRMS y mrr. Debido a que la sobreexpresión de RecT potencia enormemente la eficacia global de la recombinación ET, se transformó YZ2000 con el plásmido pR6K/BAD/recT. Las células YZ2000 que tienen pR6K/BAD/recT, que se indujeron con L-arabinosa durante 1 hora antes de la cosecha, se cotransformaron mediante electroporación con 0,5 \mug de vector lineal y 5,0 \mug de ADN genómico de células ES de ratón cizalladas. Se obtuvo una media de 25-35 colonias en placas de LB que contienen 50 \mug/ml de cloranfenicol. Volviendo a rayar estas colonias sobre placas que contienen 50 \mug/ml de canamicina, se encontró que crecen 6 de 30 colonias ensayadas, mediante el ensayo de la expresión de Tn5-neo. En la Figura 12, panel B, el análisis de las colonias resistentes a canamicina demostró que las 6 colonias ensayadas eran correctas (líneas 2-7). El patrón de restricción de un positivo falso, que se hizo crecer en presencia de cloranfenicol pero que no creció en presencia de canamicina, se muestra en la línea 1. Todos estos positivos falsos contenían el vector religado.

En la Figura 13 se presenta un experimento que muestra una combinación de subclonación y clonación ET. El vector lineal consistió en el origen de replicación CoIE1 más el gen de resistencia a canamicina Km^{r}. Cada término del vector lineal consistió en un sitio BstZ17I y 2 brazos de homología. Los brazos de homología presentes en los extremos del vector lineal (indicados por las pequeñas cajas en la Figura 13) son homólogos al ADN diana del fago \lambda. El segundo conjunto de brazos de homología (indicados mediante las cajas más grandes) es homólogo a los genes lacI-lacZ presentes en el cromosoma de E. coli.

En la primera etapa de subclonación, el vector lineal se coelectroporó con ADN diana linealizado de fago \lambda en la cepa JC8679\DeltalacZ de E. coli hábil para ET. Esto dio como resultado la subclonación de un fragmento de ADN\lambda de 6,7 kb que incluye los genes exo, bet, gam, rexA y cI857, en el vector lineal, generando de ese modo pYZN/\lambda-PR. Para la siguiente etapa de recombinación ET, se usó un nuevo vector lineal, que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol cat flanqueado por sitios laxP mutados (loxP^{*}, Araki et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:868-872), así como brazos terminales que fueron homólogos al ADN de \lambda presente en pYZN/\lambda-PR. Este vector lineal se coelectroporó con pYZN/\lambda-PR en la cepa JC8679\DeltalacZ hábil para ET, dando como resultado la formación de pYZN/\lambda-PR/Cm. A partir de este plásmido, el fragmento de ADN de \lambda que contiene cat, flanqueado por los dos brazos terminales que fueron homólogos a lacI-lacZ, se liberó mediante digestión con BstZ17I. Este fragmento se usó para seleccionar como diana el cromosoma de la cepa JC5519 de E. coli (Willets y Clark, 1969, J. Bacteriol., 100:231-239) que expresó RecE y RecT a partir de pBADRecE/T (Zhang et al., 1998, Nature Genetics 20:123-128). Tras la recombinación ET y la selección mediante crecimiento en presencia de 20 \mug/ml de cloranfenicol, se generó la cepa YZ2001/Cm. La supresión de cat para generar YZ2001 se realizó usando el plásmido 706-Cre, que es idéntico a 705-Cre excepto que tiene el gen de resistencia a tetraciclina (tet^{r}) en lugar del gen de resistencia a cloranfenicol, como se describe (Buchholz et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24:3118-3119). De este modo, YZ2001 portó el fragmento de ADN de \lambda de 6,7 kb (exo---el857) más un sitio loxP mutado en el cromosoma. Puesto que YZ2001/Cm permite la expresión inducible por calor de los genes exo, bet y gam de \lambda, es condicionalmente hábil para ET. Se puede usar una estrategia similar para generar constructos a los que le falte una característica génica, o para realizar modificaciones de BAC, por ejemplo.

De este modo, los ejemplos presentados anteriormente demuestran varios enfoques para la clonación y subclonación exitosas utilizando recombinación homóloga mediada por RecE/T y Red\alpha/\beta.

Claims

1. Método para introducir una secuencia de ADN diana bicatenaria en un vector mediante recombinación homóloga, secuencia de ADN diana que está flanqueada por un primer término de ADN bicatenario por un lado, y por un segundo término de ADN bicatenario por el otro lado, secuencia diana y primer y segundo términos que residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente o cualquier fuente de ADN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

a): construir un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario; (ii) un origen de replicación; y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario, siendo la secuencia de una cadena del primer brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del segundo término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de las secuencias homólogas con relación al ADN diana de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos da como resultado que se inserte la secuencia diana deseada entre los brazos de homología,

b): introducir dicho ADN vector en una célula; y

c): cultivar dicha célula en condiciones de forma que la secuencia de ADN diana se introduzca en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, bajo dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicho ADN diana y (ii) expresa una recombinasa bacteriana, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano y siendo capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende introducir dicha secuencia de ADN diana en la célula que contiene el ADN vector.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula en la que se introduce dicho ADN vector es una célula que contiene una secuencia de ADN diana bicatenaria.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN diana se introduce en la célula con dicho ADN vector.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la célula contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una recombinasa específica del sitio operativamente enlazada a un promotor, y dicho vector comprende además un primer y un segundo sitio de reconocimiento para la recombinasa específica del sitio, estando dicho primer sitio de reconocimiento localizado fuera de los primer y segundo brazos de homología, y estando un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y dichas condiciones de cultivo comprenden además la expresión de dicha recombinasa específica del sitio.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa específica del sitio operativamente enlazada a un promotor, y dicho vector comprende además un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y dichas condiciones de cultivo comprenden además la expresión de dicha endonucleasa específica del sitio.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicho vector comprende además un marcador seleccionable localizado fuera de dichos primer y segundo brazos de homología bicatenarios, de forma que dicho vector comprende, en cualquiera de los siguientes dos órdenes a lo largo de una cadena de ADN vector: i) dicho primer brazo de homología, dicho marcador seleccionable, dicho origen de replicación y dicho segundo brazo de homología, o ii) dicho primer brazo de homología, dicho origen de replicación, dicho marcador seleccionable, y dicho segundo brazo de homología.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el marcador seleccionable confiere resistencia a antibióticos a dicha célula que contiene el vector.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta, o ambas recombinasas RecE/T y Red\alpha/\beta.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula es una célula bacteriana.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la célula es una célula de E. coli.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula es una célula eucariota que expresa de forma recombinante la recombinasa RecE/T y/o Red\alpha/\beta.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además aislar de la célula una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN diana introducida en el vector.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha secuencia de ADN diana es un miembro de una librería de ADN.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha librería de ADN es una librería de BAC, PAC, YAC, cosmídica o lambda.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se sabe o se sospecha que dicha secuencia de ADN diana está asociada con un trastorno o enfermedad cuando se muta genéticamente.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha secuencia de ADN diana es un ADN bacteriano, vírico, de parásito, o de protozoo.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además detectar una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN diana introducida en el vector.

19. Método para detectar la presencia de un agente infeccioso, que comprende llevar a cabo el método según la reivindicación 18 en el que dicha secuencia de ADN diana se obtiene de un paciente que se sospecha que tiene la enfermedad infecciosa, y las secuencias de los primer y segundo brazos de homología son homólogas a las secuencias presentes en ADN del agente infeccioso.

20. Método según la reivindicación 18, en el que el agente infeccioso es un virus, una bacteria, un protozoo, un hongo o un parásito.

21. Método para detectar la presencia de una alteración, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico genético, que comprende llevar a cabo el método según la reivindicación 18, en el que la secuencia de ADN diana se obtiene a partir de un paciente que se sospecha que tiene una alteración, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico genético, y la secuencia del primer brazo de homología es homóloga a la secuencia en dirección corriente arriba desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico genético, y la secuencia del segundo brazo de homología es homóloga a la secuencia en dirección corriente abajo desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración, enfermedad, trastorno, o rasgo polimórfico
genético.

22. Método según la reivindicación 21, en el que la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico es o predispone al paciente a cáncer, asma, artritis, resistencia a fármacos, toxicidad a fármacos, o una alteración, enfermedad o trastorno neuronal, neuropsiquiátrico, metabólico, muscular, cardiovascular, o de la piel.

23. Método para obtener un vector de ADN bicatenario para uso en la clonación o subclonación dirigida de una secuencia de ADN diana, secuencia de ADN diana que está flanqueada por un primer término bicatenario por un lado, y por un segundo término bicatenario por el otro lado, secuencia diana y primer y segundo términos que residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente como cualquier fuente de ADN: que comprende incorporar los primer y segundo brazos de homología en una molécula de ADN bicatenaria, en el que dicha molécula de ADN bicatenaria comprende un origen de replicación, para proporcionar un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario, (ii) el origen de la replicación, y (iii) un segundo brazo de homología, siendo la secuencia de una cadena del primer brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea a la secuencia de ADN diana, siendo la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del segundo término que flanquea a la secuencia de ADN diana, siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de las secuencias homólogas con relación al ADN diana, de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos da como resultado que se inserte la secuencia diana deseada entre los brazos de homología.

24. Método según la reivindicación 23, en el que el origen de replicación es un origen de replicación bacteriano.

25. Método según la reivindicación 23, en el que el origen de replicación funciona en E. coli.

26. Método según la reivindicación 23, en el que el origen de replicación funciona en una célula de mamífero.

27. Método para obtener una molécula de ADN recombinante que comprende obtener un vector bicatenario según el método de la reivindicación 23, que comprende además las etapas de:

a): introducir dicho vector en una célula,

b): cultivar dicha célula en condiciones de forma que la secuencia de ADN diana se introduce en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, en dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicha secuencia de ADN diana y (ii) expresa una recombinasa funcional, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano, y siendo capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicho vector es un vector lineal.

29. Método para introducir una secuencia de ADN diana bicatenaria en un vector mediante recombinación homóloga, secuencia de ADN diana que está flanqueada por un primer término de ADN bicatenario por un lado, y por un segundo término de ADN bicatenario por el otro lado, secuencia diana y primer y segundo términos que residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente como cualquier fuente de ADN, comprendiendo dicho método:

a): proporcionar un ADN vector, un primer oligonucleótido adaptador bicatenario y un segundo oligonucleótido adaptador bicatenario, en el que

-: el ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario; (ii) un origen de replicación; y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario,

-: comprendiendo el primer oligonucleótido adaptador bicatenario una primera y una segunda secuencia nucleotídica, en el que dicha primera secuencia nucleotídica es homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer brazo de homología del vector, y la segunda secuencia nucleotídica es homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea a la secuencia de ADN diana; y

-: comprendiendo el segundo oligonucleótido adaptador bicatenario una tercera y una cuarta secuencia nucleotídica, en el que dicha tercera secuencia nucleotídica es homóloga a la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del vector, y dicha cuarta secuencia nucleotídica es homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del segundo término que flanquea a la secuencia de ADN diana;

\quad: siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de los primer y segundo términos de flanqueo con relación al ADN diana, de forma que la recombinación entre los brazos de homología del vector, la región de homología en los oligonucleótidos adaptadores, y los primer y segundo términos que flanquean al ADN diana da como resultado que la secuencia diana deseada se inserte entre los brazos de homología;

b): introducir dicho ADN vector y dichos primer y segundo oligonucleótidos bicatenarios en una célula; y

c): cultivar dicha célula, en condiciones tales que la secuencia de ADN diana se introduzca en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, bajo dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicha secuencia de ADN diana y (ii) expresa una recombinasa bacteriana, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano, y siendo capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.

30. Método según la reivindicación 29, que comprende introducir dicha secuencia de ADN diana en la célula que contiene el ADN vector.

31. Método según la reivindicación 29, en el que dicha célula en la que se introduce dicho ADN vector es una célula que contiene una secuencia de ADN diana bicatenaria.

32. Método según la reivindicación 29, en el que dicha secuencia de ADN diana se introduce en la célula con dicho ADN vector.

33. Método según la reivindicación 29, en el que la célula contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una recombinasa específica del sitio operativamente enlazada a un promotor, y dicho vector comprende además un primer y un segundo sitio de reconocimiento para la recombinasa específica del sitio, estando dicho primer sitio de reconocimiento localizado fuera de los primer y segundo brazos de homología, y estando un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y dichas condiciones de cultivo comprenden además la expresión de dicha recombinasa específica del sitio.

34. Método según la reivindicación 29, en el que dicha célula contiene además una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa específica del sitio operativamente enlazada a un promotor, y dicho vector comprende además un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa específica del sitio localizado en el interior de los primer y segundo brazos de homología; y dichas condiciones de cultivo comprenden además la expresión de dicha endonucleasa específica del sitio.

35. Método según la reivindicación 29, en el que dicho vector comprende además un marcador seleccionable localizado fuera de dichos primer y segundo brazos de homología bicatenarios, de forma que dicho vector comprende, en cualquiera de los siguientes dos órdenes a lo largo de una cadena de ADN vector: i) dicho primer brazo de homología, dicho marcador seleccionable, dicho origen de la replicación y dicho segundo brazo de homología, o ii) dicho primer brazo de homología, dicho origen de replicación, dicho marcador seleccionable, y dicho segundo brazo de homología.

36. Método según la reivindicación 35, en el que el marcador seleccionable confiere resistencia a antibióticos a dicha célula que contiene el vector.

37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta, o ambas recombinasas RecE/T y Red\alpha/\beta.

38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que la célula es una célula bacteriana.

39. Método según la reivindicación 38, en el que la célula es una célula de E. coli.

40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que la célula es una célula eucariota que expresa recombinantemente la recombinasa RecE/T y/o Red\alpha/\beta.

41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, que comprende además aislar de la célula una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN diana introducida en el vector.

42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que dicha secuencia de ADN diana es un miembro de una librería de ADN.

43. Método según la reivindicación 42, en el que dicha librería de ADN es una librería de BAC, PAC, YAC, cosmídica o de lambda.

44. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el se sabe o se sospecha que dicha secuencia de ADN diana está asociada con un trastorno o enfermedad cuando muta genéticamente.

45. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que dicha secuencia de ADN diana es un ADN bacteriano, vírico, de parásito, o de protozoo.

46. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, que comprende además detectar una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN diana introducida en el vector.

47. Método para detectar la presencia de un agente infeccioso que comprende llevar a cabo el método de la reivindicación 46, en el que dicha secuencia de ADN diana se obtiene de un paciente que se sospecha que tiene la enfermedad infecciosa, y las secuencias de los primer y segundo oligonucleótidos adaptadores bicatenarios son homólogas a las secuencias presentes en ADN del agente infeccioso.

48. Método según la reivindicación 47, en el que el agente infeccioso es un virus, una bacteria, un protozoo, un hongo o un parásito.

49. Método para detectar la presencia de una alteración genética, enfermedad genética, trastorno genético, o rasgo polimórfico, que comprende llevar a cabo el método de la reivindicación 46, en el que la secuencia de ADN diana se obtiene de un paciente que se sospecha que tiene la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico, y la secuencia del primer oligonucleótido adaptador bicatenario es homóloga a la secuencia en dirección corriente arriba desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico, y la secuencia del segundo oligonucleótido adaptador bicatenario es homóloga a la secuencia en dirección corriente abajo desde un sitio que se sabe o se sospecha que está asociado con la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico.

50. Método según la reivindicación 49, en el que la alteración genética, la enfermedad genética, el trastorno genético, o el rasgo polimórfico es o predispone al paciente a cáncer, asma, artritis, resistencia a fármacos, toxicidad a fármacos, o una alteración, enfermedad o trastorno neuronal, neuropsiquiátrico, metabólico, muscular, cardiovascular, o de la piel.

51. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 50, en el que dicho vector es un vector lineal.

52. Kit útil para la clonación o subclonación dirigida de una secuencia de ADN diana, que comprende en uno o más recipientes:

a): un vector de ADN bicatenario según la reivindicación 29; y

b): un primer oligonucleótido adaptador bicatenario según la reivindicación 29; y

c): un segundo oligonucleótido adaptador bicatenario según la reivindicación 29.

53. Kit según la reivindicación 52, que comprende además d) una célula que contiene una recombinasa bacteriana.

54. Kit según la reivindicación 53, en el que la célula es una célula de E. coli.

55. Kit según la reivindicación 54, en el que la célula es una célula congelada competente para captar ADN.

56. Kit según la reivindicación 52, en el que el vector de ADN se purifica.

57. Kit según la reivindicación 52, en el que el vector de ADN, el primer oligonucleótido bicatenario, y el segundo oligonucleótido bicatenario se purifican.

58. Kit según la reivindicación 52, en el que la secuencia de ADN diana comprende ADN bacteriano, vírico, de parásito, o de protozoo.

59. Kit según la reivindicación 52, en el que la secuencia de ADN diana comprende una mutación genética o polimorfismo que se sabe o se sospecha que está asociado con un trastorno o enfermedad.

60. Kit según la reivindicación 52, en el que la recombinasa bacteriana es recombinasa RecE/T o Red\alpha/\beta, o ambas recombinasas RecE/T y Red\alpha/\beta.

61. Kit según la reivindicación 52, en el que el primer y el segundo oligonucleótido bicatenario tienen homología de secuencia nucleotídica con un vector de clonación a base de BAC, PAC, lambda, plásmido o YAC.

62. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 61, en el que dicho vector es un vector lineal.