JP2023507163A - バクテロイデスにおけるゲノム編集 - Google Patents

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Abstract

本明細書において、バクテロイデス種のゲノム編集のための組成物および方法が提供される。ＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、標的細菌細胞の染色体ＤＮＡにおける特定の遺伝子座を標的とするように操作され、ここで標的細菌細胞のゲノムが修飾されることができる。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／９４９，３１４号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月１７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１９－２３５＿ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは３８，９１３バイトである。
本開示は、バクテロイデスにおけるゲノム編集のための組成物および方法に関する。
微生物ゲノム中のＤＮＡ配列を特異的に修飾する能力を制御することは、医学およびバイオテクノロジー研究の重要な側面である。最近の進歩は、微生物ゲノムの特定のＤＮＡ配列を標的とするようにＲＮＡ誘導系を設計できることを示すが、種々の微生物ゲノムが存在する独自のＤＮＡ修復状態および分子エピジェネティック構造は、特定のゲノム編集技術の有効性についての不確実性を生じさせる。ここでは、バクテロイデス種のゲノムを修飾するのに有効な組成物および方法について述べる。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な手数料の要求および支払いに応じて、特許庁によって提供される。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
図１は、ＣＲＩＳＰＲベース編集（ｄＳｐＣａｓ９－ＣＤＡ／ｓｇＲＮＡ）の概略モデルを示す。ｄＳｐＣａｓ９－ＣＤＡ／ｓｇＲＮＡ複合体は二本鎖ＤＮＡに結合し、ｓｇＲＮＡおよびＰＡＭ依存的にＲループを形成する。ＣＤＡは、ＰＡＭから上流の１５－２０塩基以内の下部（非相補的）鎖に位置するシトシンの脱アミノ化を触媒し、ＣからＴへの突然変異誘発を引き起こす。
図２は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのｔｄｋ（ＢＴ＿２２７５）を標的とするＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子組み込みプラスミド［ｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ］の模式図を示す。
図３Ａは、ｄＳｐＣａｓ９－ＣＤＡによって編集されたｔｄｋ＿Ｂｔ突然変異体の配列アラインメントを示す。ゲノム遺伝子座およびｔｄｋ＿ＢｔｓｇＲＮＡ（Ｎ２０）により標的化される部位は、ＰＡＭで示されている。ｔｄｋ＿Ｂｔのコード配列は、ＡＴＧ開始コドンから始まる上部に示されている。ａＴｃ１００寒天プレートから無作為に選んだ８つのコロニーから見いだされる変異部位を下に示す。変異した塩基（ＰＡＭの－１７位のＣからＴへ）により、ｔｄｋ＿Ｂｔコード配列の２８位に停止コドンが生じた。図３Ａは、出現順に配列番号１０～１３をそれぞれ開示する。
図３Ｂは、ｄＳｐＣａｓ９－ＣＤＡによって編集されたｓｕｓＣ＿Ｂｔ突然変異体の配列アラインメントを示す。ゲノム遺伝子座およびｓｕｓＣ＿ＢｔｓｇＲＮＡ（Ｎ２０）により標的化される部位は、ＰＡＭで表示される。ｓｕｓＣ＿Ｂｔのコード配列は上部に表示される。ａＴｃ１００寒天プレートから無作為に選んだ８つのコロニーから見いだされる変異部位を下に示す。変異した塩基（ＰＡＭからの－１７位および－１９位のＣからＴ）は、ｓｕｓＣ＿Ｂｔコード配列の４９１位および４９３位にアミノ酸置換および停止コドンを生成する。図３Ｂは、出現順に配列番号１４－１７をそれぞれ開示する。
図４は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ－５４８２ゲノムを標的としない非標的化ガイドＲＮＡスクランブルヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子安定維持プラスミド（ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ＮＴ）の概略図を、提示する。
図５Ａは、再構成された好気性大腸菌／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ－５４８２コンジュゲーションスラリー１ｍｌからの１：１０希釈液１００μｌで播種された、２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）および２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｍ）脳－心臓注入（ＢＨＩ）血液寒天プレートを示す。これらの再構成されたコンジュゲーションスラリーは、選択なしＢＨＩ血液寒天プレートからであった。左から右へのプレートは、非標的化試料、ＢＴ＿０３６２試料、およびＢＴ＿０３６４試料を示す。
図５Ｂは、２５μｇ／ｍｌのＥｍ、２００μｇ／ｍｌのＧｍおよび１００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）選択および誘導ＢＨＩ血液寒天プレート上の無菌ループ成長ストリークを示す。各プレートからの個々のコロニーを図５Ａに示す。図５Ａは、２５μｇ／ｍｌのＥｍ、２００μｇ／ｍｌのＧｍおよび１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを補充した５ｍｌの選択および誘導ＴＹＧ液体培地中で増殖させた。無菌ループ試料は、これらの選択および誘導ＴＹＧ液体培地培養から採取された。左から右へのプレートは、非標的化試料、ＢＴ＿０３６２試料、およびＢＴ＿０３６４試料を示す。
図６Ａは、「ＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅ」と呼ばれるＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ内部で開発されたソフトウェアを使用した定量的突然変異分析を示す。この解析ソフトウェアは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の形式（ＡＢＩ）ファイルに基づいて各塩基シグナルのピーク値を抽出し、「対照」および「試料」のサンガー配列決定データを比較して変異率を計算する。一番上のサンガートレースは、ガイドＲＮＡ配列に下線が引かれた非標的化試料である。赤い矢印は、ＣからＴへの突然変異誘発およびＢＴ＿０３６２コード配列を切り詰める停止コドンの導入につながるシトシン脱アミノ化の位置である、ＰＡＭに対する塩基－１７を示す。中央のサンガートレースはＢＴ＿０３６２で編集された試料を示し、下のグラフはＣからＴへの突然変異頻度を示す。図６Ａは、出現順に配列番号１８－２０をそれぞれ開示する。
図６Ｂは、「ＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅ」と呼ばれるＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ内部で開発されたソフトウェアを使用した定量的突然変異分析を示す。この解析ソフトウェアは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の形式（ＡＢＩ）ファイルに基づいて各塩基シグナルのピーク値を抽出し、「対照」および「試料」のサンガー配列決定データを比較して変異率を計算する。一番上のサンガートレースは、ガイドＲＮＡ配列に下線が引かれた非標的化試料である。赤い矢印は、ＰＡＭに対する塩基－１８、－１９、および－２０を示す。これはシトシン脱アミノ化の位置であり、ＣからＴへの突然変異誘発と、ＢＴ＿０３６４コード配列を切断する停止コドンの導入につながる。中央のサンガートレースはＢＴ＿０３６４で編集された試料を示し、下のグラフはＣからＴへの変異頻度を示す。図６Ｂは、出現順に配列番号２１－２３をそれぞれ開示する。
詳細な説明
本開示は、特定のＤＮＡ配列を修飾するために使用することができる、操作されたＲＮＡ誘導型ゲノム修飾系を提供する。特に、ＲＮＡ誘導ゲノム修飾系は、ドメイン細菌の標的化されたメンバー、具体的には、ゲノムＤＮＡ配列の修飾（例えばノックアウト、ノックイン）をもたらす宿主動物種（ホモ・サピエンスを含むがこれに限定されない）の１つまたは複数の身体生息地において存在するメンバーを含む、バクテロイデス属に属するバクテロイデス門のメンバーの染色体ＤＮＡ中の特定の遺伝子座を標的とするように操作される。
（Ｉ）タンパク質－核酸複合体
本開示の一態様は、標的細菌種（またはその種の株レベル変異体）の染色体と関連する操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系を含むタンパク質－核酸複合体を提供し、ここで、操作されたＲＮＡは、誘導核酸塩基修飾系は、生物の染色体の特定の遺伝子座を標的とし、生物の染色体は、配列番号１：（ＭＮＫＡＤＬＩＳＡＶＡＡＡＥＡＧＬＳＫＶＤＡＫＫＡＶＥＡＦＶＳＴＶＴＫＡＬＱＥＧＤＫＶＳＬＩＧＦＧＴＦＳＶＡＥＲＳＡＲＴＧＩＮＰＳＴＫＡＴＩＴＩＰＡＫＫＶＴＫＦＫＰＧＡＥＬＡＤＡＩＫ）のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードし、およびＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質に関連している種／株の染色体は、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有する。
種々の実施形態において、ＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、（ｉ）クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復（ＣＲＩＳＰＲ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系、および（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインを含み、ここでＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体（例えば、デッドＣＲＩＳＰＲ）またはＣＲＩＳＰＲニッカーゼである。ＣＲＩＳＰＲ系のｇＲＮＡは、細菌種／株の染色体の特定の遺伝子座にＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系の結合を指示するように操作される。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体またはＣＲＩＳＰＲニッカーゼであるため、細菌染色体の特定の遺伝子座における１つまたは複数の核酸塩基は、生物の染色体において致死的であることができる二本鎖切断の生成なしに修飾されることができる。細菌生物は、細菌染色体ＤＮＡと関連するＨＵファミリータンパク質を発現する。したがって、本明細書に開示されるタンパク質－核酸複合体は、ＤＮＡ／タンパク質複合体（細菌染色体ＤＮＡおよび関連するＨＵファミリータンパク質）に結合したリボ核タンパク質複合体（ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲタンパク質／核酸塩基修飾酵素）を含む。
（ａ）操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系
本明細書に開示されるタンパク質－核酸複合体は、典型的には、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系、ここでＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体またはＣＲＩＳＰＲニッカーゼである、および（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインを含む操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系を含む。
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ系
ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの細胞型における遺伝子編集に使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用された、細菌および古細菌における天然の防御機構である。たとえば、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）Ｃｈｅｎらの国際公開番号ＷＯ２０１４／０８９１９０を参照のこと。以下に詳述するように、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用するガイドＲＮＡは、目的の核酸の特定の配列と塩基対を形成するように操作することができ、それによって、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を目的の核酸の特定の配列に標的化することができる。
本明細書に開示されるＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系のＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ系、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系、またはタイプＶＩＣＲＩＳＰＲ系に由来することができる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型系などの単一サブユニットエフェクター系に由来することができる。様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、（以前はＣｐｆ１と呼ばれていた）Ｖ型Ｃａｓ１２タンパク質、（以前はＣ２ｃｄと呼ばれていた）ＶＩ型Ｃａｓ１３タンパク質、ＣａｓＸタンパク質、またはＣａｓＹタンパク質に由来することができる。１つの特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。別の特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｖ型Ｃａｓ１２タンパク質に由来する。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ種、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ種、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ種、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ種、Ａｎａｂａｅｎａ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ種、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ種、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ種、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ種、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ種、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ種、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ種、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ種、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ種、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ種、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ種、および／または、それぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれるMakarova, Kira S., et al. “An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.” Nature Reviews Microbiology 13.11 (2015): 722 および Koonin, Eugene V., Kira S. Makarova, and Feng Zhang. “Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems.” Current opinion in microbiology 37 (2017): 67-78に開示されるものなどのゲノムデータベースのバイオインフォマティクス調査において描写された種に由来することができる。
いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ１２ａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種Ｃａｓ１２ａ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃａｓ１３ｄ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣａｓＸ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ＣａｓＸ、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ ＣａｓYに由来することができる。
いくつかの態様において、誘導核酸塩基修飾系のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾された、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体であることができる。野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは一般に２つのヌクレアーゼドメインを含み、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼはＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、それぞれが二本鎖配列の１つの鎖を切断する。ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの１つまたは複数の変異により、すべてのヌクレアーゼ活性が、消失することができる。例えば、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体は、ＲｕｖＣドメインにＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａなどの変異、およびＨＮＨドメインにＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａなどの変異を含むことができる（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐｙＣａｓ９の番号付け系を参照）。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ１２変異体は、２つのヌクレアーゼドメインに同等の変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有する死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）変異体であることができる。
他の実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、二本鎖配列の一方の鎖を切断するＣＲＩＳＰＲニッカーゼであることができる。ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの１つを不活性化することで操作できる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、ｎＣａｓ９）を生成するために、上記のように１つまたは複数の変異によって不活化することができる。他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの同等の変異は、他のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ（例えば、ｎＣａｓ１２）を生成できる。
さらに、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、改善された標的化特異性、改善された忠実度、改変されたＰＡＭ特異性、および／または増大した安定性を有するように修飾されることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つまたは複数の変異（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入）を含むように修飾することができる。標的特異性を改善し、忠実度を改善し、および／またはオフターゲット効果を減少させる変異の非限定的な例は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、および／またはＤ１１３５Ｅを含む（ＳｐｙＣａｓ９の番号付け系を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドＲＮＡも含む。ガイドＲＮＡは、目的の核酸内のＣＲＩＳＰＲタンパク質および標的配列と相互作用し、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的配列に導く。標的配列には、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していることを除いて、配列の制限はない。異なるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を認識する。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質についてのＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ、５－ＮＮＮＮＲＹＡＣ、５’－ＮＮＮＮＣＡＡＡ、５’－ＮＧＡＡＡ、５’－ＮＮＡＡＴ、５’－ＮＮＮＲＴＡ、５’－ＮＮＧＧ、５’－ＮＮＮＲＴＡ、５’－ＭＭＡＣＣＡ、５’－ＮＮＮＮＧＲＹ、５’－ＮＲＧＮＫ、５’－ＧＧＧＲＧ、５’－ＮＮＡＭＭＭＣ、５’－ＮＮＧを含み、Ｃａｓ１２ａタンパク質についてのＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮおよび５’－ＴＴＴＶを含み、ここでＮは任意のヌクレオチドとして定義され、ＲはＧまたはＡのいずれかと定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかと定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかと定義され、ＶはＡ、Ｃ、またはＧと定義される。一般に、Ｃａｓ９ＰＡＭは標的配列の３’に位置し、Ｃａｓ１２ａＰＡＭは標的配列の５’に位置する。種々のＰＡＭ配列およびそれらを認識するＣＲＩＳＰＲタンパク質は、当技術分野、例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれるLeenay, Ryan T., et al. “Identifying and visualizing functional PAM diversity across CRISPR-Cas systems.” Molecular cell 62.1 (2016): 137-147; および Kleinstiver, Benjamin P., et al. “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.” Nature 523.7561 (2015): 481において既知である。
ガイドＲＮＡは、特定のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように操作される。一般に、ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的部位でハイブリダイズするガイドまたはスペーサー配列を５’末端に含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および（ｉｉ）ｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用するトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのガイドまたはスペーサー配列は異なる（つまり、配列特異的である）。ガイドＲＮＡ配列の残りの部分は、特定のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡと一般的に同じである。
ｃｒＲＮＡは、ガイド配列を５’末端に、およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列と塩基対合して二重鎖構造を形成する追加の配列を３’末端に含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する、少なくとも１つのステムループ構造を形成する追加の配列を含む。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結された単一分子（例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または１ピースｓｇＲＮＡ）であることができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、別個の分子、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重分子ｇＲＮＡであることができる。
ｃｒＲＮＡガイド配列は、目的の核酸中の標的配列（すなわち、プロトスペーサー）の補体とハイブリダイズするように設計される。「標的核酸」は二本鎖分子である。一方の鎖は標的配列を含み、「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、もう一方の相補鎖は「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれる。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する標的配列の逆補体にハイブリダイズすることを認識する。一般に、ガイド配列と標的配列との間の配列同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。特定の実施形態において、相補性は完全である（すなわち、１００％）。様々な実施形態において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であることができる。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であることができる。特定の実施形態において、ガイドは、約１９、２０、または２１ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する追加の３’配列を含むことができる。追加の配列は、約１０から約４０ヌクレオチドを含むことができる。ガイドＲＮＡが単一分子を含む実施形態において、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ループを形成する配列によって連結されることができる。ループを形成する配列は、長さが約４ヌクレオチドから約１０以上のヌクレオチドの範囲であることができる。
上述のように、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成する反復配列を含む。各ループおよびステムの長さはさまざまであることができる。例えば、ループは長さが約３から約１０ヌクレオチドの範囲であり、ステムは長さが約６から約２０塩基対の範囲であることができる。ステムは、１から約１０ヌクレオチドの１つまたは複数のバルジを含むことができる。ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般に、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に基づいている。野生型配列は、二次構造の形成、二次構造の安定性の向上などを促進するために修飾されることができる。例えば、１つまたは複数のヌクレオチド変化をガイドＲＮＡ配列に導入することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、長さが約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲であることができる。様々な実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが約５０から約９０ヌクレオチド、約９０から約１１０ヌクレオチド、約１１０から約１３０ヌクレオチド、約１３０から約１５０ヌクレオチド、約１５０から約１７０ヌクレオチド、約１７０から約２００ヌクレオチド、約２００から約２５０ヌクレオチド、または約２５０から約３００ヌクレオチドの範囲であることができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に所望の拡張を含むことができる。
ガイドＲＮＡは、標準リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、標準または修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。ガイドＲＮＡが酵素的に（すなわち、インビボまたはインビトロで）合成される実施形態において、ガイドＲＮＡは一般に標準リボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学的に合成される実施形態において、ガイドＲＮＡは、標準または修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾（例えば、プソイドウリジン、２－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）など）を含む。ガイドＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、またはペプチド核酸を含むように修飾することもできる。
所望のアプタマー配列。場合によっては、ガイドＲＮＡのＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｔｒａｃｒＲＮＡは、１つまたは複数のアプタマー配列をさらに含むことができる(Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50)。アプタマー配列は、核酸（例えば、ＲＮＡ）またはペプチドであることができる。アプタマー配列は、特定のアダプタータンパク質によって認識および結合される。適切なアプタマー配列の非限定的な例は、ＭＳ２／ＭＳＰ、ＰＰ７／ＰＣＰ、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、Ｆ１、Ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＧＡ、ＩＤ２、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＪＰ５０１、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＲＲ１、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、および７ｓを含む。当業者は、アプタマー配列の長さが変化することができることを理解する。アプタマー配列は、共有結合を介してＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｔｒａｃｒＲＮＡに直接連結することができる。あるいは、アプタマー配列は、リンカーを介してＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｔｒａｃｒＲＮＡに間接的に連結することができる。
リンカーは、少なくとも１つの共有結合を介して１つまたは複数の他の化学基を接続する化学基である。適切なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ－エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル－３，４’，５－トリカルボン酸、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニルなど）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない１つまたは複数のスペーシング基を含むことができる。リンカーは中性であるか、正または負の電荷を運ぶことができる。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであることができる。ペプチドリンカーは、柔軟なアミノ酸リンカー（例えば、小さい、非極性または極性アミノ酸を含む）であることができる。あるいは、ペプチドリンカーは、剛性アミノ酸リンカー（例えば、αヘリックス）であることができる。ペプチドライカーの長さは、約４アミノ酸から１００以上のアミノ酸までさまざまである。例えば、適切なリンカーは、１０－２０個のアミノ酸、２０－４０個のアミノ酸、４０－８０個のアミノ酸、または８０－１２０個のアミノ酸を含むことができる。適切なリンカーの例は当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは容易に入手できる(Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312)。
（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素
本明細書に開示される操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインも含む。
種々の核酸塩基修飾酵素が、本明細書に開示される系での使用に適している。核酸塩基修飾酵素は、ＤＮＡ塩基編集剤であることができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ塩基編集因子は、シチジンをウリジンに変換するシチジンデアミナーゼであることができ、これはポリメラーゼ酵素によってチミンとして読み取られる。シチジンデアミナーゼの非限定的な例は、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、シチジンデアミナーゼ２（ＣＤＡ２）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４）、ＡＰＯＢＥＣ１相補因子／ＡＰＯＢＥＣ１刺激因子（ＡＣＦ１／ＡＳＦ）シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、バクテリアロングアイソフォームシチジンデアミナーゼ（ＣＤＤＬ）、およびｔＲＮＡ（ＣＤＡＴ）に作用するシトシンデアミナーゼを含む。他の実施形態において、ＤＮＡ塩基編集因子は、アデノシンをグアノシンとしてポリメラーゼ酵素によって読み取られるイノシンに変換するアデノシンデアミナーゼであることができる。アデノシンデアミナーゼの非限定的な例は、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、およびｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）を含む。
核酸塩基修飾酵素（塩基編集因子）は、野生型またはそのフラグメント、その修飾されたバージョン（例えば、非必須ドメインを削除することができる）、またはその操作されたバージョンであることができる。核酸塩基修飾酵素（塩基編集因子）は、真核生物、細菌、または古細菌に由来することができる。
いくつかの実施形態において、核酸塩基修飾酵素（塩基編集因子）は、シチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインであることができる。シチジンデアミナーゼは、ヒト、マウス、ヤツメウナギ、アワビ、または大腸菌由来のものであることができる。核酸塩基修飾酵素がシチジンデアミナーゼである実施形態において、ＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、少なくとも１つのウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含むことができる。シトシン脱アミノ化の結果であるＤＮＡからのウラシルの除去は、ＵＧＩによって阻害される。適切なＵＧＩドメインは、当技術分野で既知である。
いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼおよびＵＧＩを使用する系は、これらの成分が過剰発現される場合、負の効果を有することができる。過剰発現を防ぐために、分解タグを追加することができる。分解タグは、タンパク質リサイクル系によってタンパク質が分解されることを知らせる。これらの分解タグにより、タンパク質の半減期が異なる。非限定的な分解タグの例は、ＬＶＡ、ＡＡＶ、ＡＳＶおよびＬＡＡである。
所望のアダプタータンパク質。いくつかの実施形態において、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインは、アプタマー配列を認識して結合するアダプタータンパク質に連結することができる。いくつかの実施形態において、アダプタータンパク質は、ＭＣＰアプタマー配列を認識して結合するＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質、またはＰＣＰアプタマー配列を認識して結合するＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質であることができる。他の実施形態において、アダプタータンパク質は、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、Ｆ１、Ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＧＡ、ＩＤ２、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＪＰ５０１、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＲＲ１、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、または７ｓアダプター配列を認識して結合することができる。
核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインとアダプタータンパク質との間の結合は、共有結合を介して直接的であることができる。あるいは、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインとアダプタータンパク質との間の結合は、リンカーを介して間接的であることができる。リンカーは、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記載されている。アダプタータンパク質は、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に連結することができる。
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ系および核酸塩基修飾酵素間の相互作用
本明細書に開示される操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、（ｉ）ヌクレアーゼ活性を有さないかまたはニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ系（上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記載）および（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素（塩基編集因子）またはその触媒ドメイン（上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉｉ）に記載）を含む。ＣＲＩＳＰＲ系および核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインは、さまざまな方法で相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインに連結することができる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインとの間の結合は、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して直接的であることができる。他の態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインとの間の連結は、リンカーを介することができる。リンカーは、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記載されている。核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に連結することができる。
他の実施形態において、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインは、アダプタータンパク質（上記セクション（Ｉ）（ａ）（ｉｉ）に記載）に連結することができ、ＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｇＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合することができるアプタマー配列（上記セクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記載）を含むことができる。例えば、核酸塩基修飾酵素（例えば、シチジン／アデノシンデアミナーゼ）をＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に連結することができ、ＣＲＩＳＰＲ系のｇＲＮＡは、ステムループ構造を形成するＭＣＰアプタマー配列を含むことができ、ここでＭＳ２タンパク質はＭＳＰアプタマー配列に結合することができ、それによってＣＲＩＳＰＲ－シチジン／アデノシンデアミナーゼ系を形成する。
（ｉｖ）操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系の発現
ＣＲＩＳＰＲ系のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系を細菌染色体ＤＮＡ中の特定の遺伝子座に標的化するように操作され、その結果、上記のように、タンパク質－核酸複合体が形成されることができる。一般に、タンパク質－核酸複合体は細菌細胞内で形成される。
いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、細菌の種または株の染色体に組み込まれた前記系をコードする少なくとも１つの核酸から発現されることができる。他の実施形態において、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、少なくとも１つの染色体外ベクター上に担持される前記系をコードする少なくとも１つの核酸から発現されることができる。細菌に核酸を導入するための技術は、核酸を細菌染色体に組み込むための手段と同様に、当技術分野で周知である。
操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系の発現は、調節することができる。例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系の発現は、セクション（ＩＩ）に後述するように、誘導性プロモーターによって調節することができる。
いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、プールされたガイドＲＮＡライブラリーとして形式化されて、多くのゲノム位置を並行して標的とし、バクテロイデス細胞の集団の作成を可能にすることができ、各細胞は異なるＲＮＡ誘導ゲノム修飾を有する。次いで、これらのプールされた細胞集団を選択圧下に置き、選択された細胞をＤＮＡ配列決定によって分析することができる。
（ｂ）細菌染色体
本明細書に開示されるタンパク質－核酸複合体は、細菌染色体をさらに含み、ここで細菌染色体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードし（配列番号１に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性）、細菌染色体ＤＮＡは、前記ＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質と会合している。ＤＮＡ結合タンパク質のＨＵファミリーは、配列特異性なしで二本鎖ＤＮＡに結合し、フォーク、３／４ウェイジャンクション、ニック、オーバーハング、およびバルジなどのＤＮＡ構造に結合する、小さな（－９０アミノ酸）塩基性ヒストン様タンパク質で構成される。ＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質の結合は、ＤＮＡを安定化し、極端な環境条件下での変性から保護することができる。バクテロイデスＨＵファミリーＤＮＡタンパク質と染色体ＤＮＡとの会合は、ＣＲＩＳＰＲ系などの他のＤＮＡ結合タンパク質が染色体標的に結合し、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、デアミナーゼまたは他のゲノム修飾モダリティなどとして機能するために適合しなければならない独自の構造環境を作り出す。
一般に、染色体（またはその染色体領域）は、バクテロイデスの任意のメンバー内にあることができる。 いくつかの実施形態において、ＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、生物はバクテロイデス属のメンバーである。バクテロイデス種は、哺乳類の腸内微生物叢の著名な嫌気性共生生物である。それらはさまざまな糖分解酵素を含有し、腸内の多糖類の主要な発酵槽である。それらは、腸内に保持されている場合、宿主との複雑で一般的に有益な関係を維持するが、この環境から逃れると重大な病状を引き起こすことができる。バクテロイデス種の非限定的な例は、Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｂａｒｎｅｓｉａｅｓ、Ｂ．ｃａｃｃａｅ、Ｂ．ｃａｅｃｉｃｏｌａ、Ｂ．ｃａｅｃｉｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂ．ｃａｐｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂ．ｃｌａｒｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏｐｒｏｃｏｌａ、Ｂ．ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ、Ｂ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂ．ｄｏｒｅｉ、Ｂ．ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ、Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｂ．ｆａｅｃｉｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ、Ｂ．ｆａｅｃｉｓ、Ｂ．ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ｂ．ｆｌｕｘｕｓ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ、Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ、Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂ．ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂ．ｈｅｌｃｏｇｅｎｅ、Ｂ．ｈｅｐａｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｂ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｂ．ｌｕｔｉ、Ｂ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｂ．ｎｅｏｎａｔｉ、Ｂ．ｎｏｒｄｉｉ、Ｂ．ｏｌｅｉｃｉｐｌｅｎｕｓ、Ｂ．ｏｒｉｓ、Ｂ．ｏｖａｔｕｓ、Ｂ．ｐａｕｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｐｒａｇｍａｔｕｓ、Ｂ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｂ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂ．ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ、Ｂ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂ．ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ、Ｂ．ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ、Ｂ．ｓａｒｔｏｒｉｉ、Ｂ．ｓｅｄｉｍｅｎｔ、Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｒｏｓｏｒｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、Ｂ．ｔｅｃｔｕｓ、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂ．ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．、およびＢ．ｚｏｏｇｌｅｏｆｏｒｍａｎｓおよびこれらの種の株レベル変異体を含む。例えば、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓの株レベル変異体は、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ １４８３８、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＷＨ２、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＣＬ０２Ｔ１２Ｃ１９、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＣＲＥ２１（Ｔ）、およびＢ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＪＣＭ １５６３２Ｔを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、染色体（またはその染色体領域）は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓおよびこれらの種の株レベル変異体から選択される。
いくつかの実施形態において、染色体（またはその染色体領域）は、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ種、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｖｉｓｃｅｒｉｃｏｌａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｐｈａｇａ種、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ種、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＳｃｈｌｅｉｆｅｒｉａ種およびこれらの種の株レベル変異体から選択される。
染色体領域は、例えば、プラスミドＤＮＡまたは細菌人工染色体に関連する長さ（およそ２，０００から３５０，０００塩基長）、または一次細菌染色体に関連する長さ（１３０，０００塩基から１４，０００，０００塩基長）であることができる。
したがって、例えば、染色体領域の長さは、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４０００、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、約３００００、約３１０００、約３２０００、約３３０００、約３４０００、約３５０００、約３６０００、約３７０００、約３８０００、約３９０００、約４００００、約４１０００、約４２０００、約４３０００、約４４０００、約４５０００、約４６０００、約４７０００、約４８０００、約４９０００、約５００００、約５１０００、約５２０００、約５３０００、約５４０００、約５５０００、約５６０００、約５７０００、約５８０００、約５９０００、約６００００、約６１０００、約６２０００、約６３０００、約６４０００、約６５０００、約６６０００、約６７０００、約６８０００、約６９０００、約７００００、約７１０００、約７２０００、約７３０００、約７４０００、約７５０００、約７６０００、約７７０００、約７８０００、約７９０００、約８００００、約８１０００、約８２０００、約８３０００、約８４０００、約８５０００、約８６０００、約８７０００、約８８０００、約８９０００、約９００００、約９１０００、約９２０００、約９３０００、約９４０００、約９５０００、約９６０００、約９７０００、約９８０００、約９９０００、約１０００００、約１０１０００、約１０２０００、約１０３０００、約１０４０００、約１０５０００、約１０６０００、約１０７０００、約１０８０００、約１０９０００、約１１００００、約１１１０００、約１１２０００、約１１３０００、約１１４０００、約１１５０００、約１１６０００、約１１７０００、約１１８０００、約１１９０００、約１２００００、約１２１０００、約１２２０００、約１２３０００、約１２４０００、約１２５０００、約１２６０００、約１２７０００、約１２８０００、約１２９０００、約１３００００、約１３１０００、約１３２０００、約１３３０００、約１３４０００、約１３５０００、約１３６０００、約１３７０００、約１３８０００、約１３９０００、約１４００００、約１４１０００、約１４２０００、約１４３０００、約１４４０００、約１４５０００、約１４６０００、約１４７０００、約１４８０００、約１４９０００、約１５００００、約１５１０００、約１５２０００、約１５３０００、約１５４０００、約１５５０００、約１５６０００、約１５７０００、約１５８０００、約１５９０００、約１６００００、約１６１０００、約１６２０００、約１６３０００、約１６４０００、約１６５０００、約１６６０００、約１６７０００、約１６８０００、約１６９０００、約１７００００、約１７１０００、約１７２０００、約１７３０００、約１７４０００、約１７５０００、約１７６０００、約１７７０００、約１７８０００、約１７９０００、約１８００００、約１８１０００、約１８２０００、約１８３０００、約１８４０００、約１８５０００、約１８６０００、約１８７０００、約１８８０００、約１８９０００、約１９００００、約１９１０００、約１９２０００、約１９３０００、約１９４０００、約１９５０００、約１９６０００、約１９７０００、約１９８０００、約１９９０００、約２０００００、約２０１０００、約２０２０００、約２０３０００、約２０４０００、約２０５０００、約２０６０００、約２０７０００、約２０８０００、約２０９０００、約２１００００、約２１１０００、約２１２０００、約２１３０００、約２１４０００、約２１５０００、約２１６０００、約２１７０００、約２１８０００、約２１９０００、約２２００００、約２２１０００、約２２２０００、約２２３０００、約２２４０００、約２２５０００、約２２６０００、約２２７０００、約２２８０００、約２２９０００、約２３００００、約２３１０００、約２３２０００、約２３３０００、約２３４０００、約２３５０００、約２３６０００、約２３７０００、約２３８０００、約２３９０００、約２４００００、約２４１０００、約２４２０００、約２４３０００、約２４４０００、約２４５０００、約２４６０００、約２４７０００、約２４８０００、約２４９０００、約２５００００、約２５１０００、約２５２０００、約２５３０００、約２５４０００、約２５５０００、約２５６０００、約２５７０００、約２５８０００、約２５９０００、約２６００００、約２６１０００、約２６２０００、約２６３０００、約２６４０００、約２６５０００、約２６６０００、約２６７０００、約２６８０００、約２６９０００、約２７００００、約２７１０００、約２７２０００、約２７３０００、約２７４０００、約２７５０００、約２７６０００、約２７７０００、約２７８０００、約２７９０００、約２８００００、約２８１０００、約２８２０００、約２８３０００、約２８４０００、約２８５０００、約２８６０００、約２８７０００、約２８８０００、約２８９０００、約２９００００、約２９１０００、約２９２０００、約２９３０００、約２９４０００、約２９５０００、約２９６０００、約２９７０００、約２９８０００、約２９９０００、約３０００００、約３０１０００、約３０２０００、約３０３０００、約３０４０００、約３０５０００、約３０６０００、約３０７０００、約３０８０００、約３０９０００、約３１００００、約３１１０００、約３１２０００、約３１３０００、約３１４０００、約３１５０００、約３１６０００、約３１７０００、約３１８０００、約３１９０００、約３２００００、約３２１０００、約３２２０００、約３２３０００、約３２４０００、約３２５０００、約３２６０００、約３２７０００、約３２８０００、約３２９０００、約３３００００、約３３１０００、約３３２０００、約３３３０００、約３３４０００、約３３５０００、約３３６０００、約３３７０００、約３３８０００、約３３９０００、約３４００００、約３４１０００、約３４２０００、約３４３０００、約３４４０００、約３４５０００、約３４６０００、約３４７０００、約３４８０００、約３４９０００、約３５００００、約３５１０００、約３５２０００、約３５３０００、約３５４０００、約３５５０００、約３５６０００、約３５７０００、約３５８０００、約３５９０００、約３６００００、約３６１０００、約３６２０００、約３６３０００、約３６４０００、約３６５０００、約３６６０００、約３６７０００、約３６８０００、約３６９０００、約３７００００、約３７１０００、約３７２０００、約３７３０００、約３７４０００、約３７５０００、約３７６０００、約３７７０００、約３７８０００、約３７９０００、約３８００００、約３８１０００、約３８２０００、約３８３０００、約３８４０００、約３８５０００、約３８６０００、約３８７０００、約３８８０００、約３８９０００、約３９００００、約３９１０００、約３９２０００、約３９３０００、約３９４０００、約３９５０００、約３９６０００、約３９７０００、約３９８０００、約３９９０００、約４０００００、約４０１０００、約４０２０００、約４０３０００、約４０４０００、約４０５０００、約４０６０００、約４０７０００、約４０８０００、約４０９０００、約４１００００、約４１１０００、約４１２０００、約４１３０００、約４１４０００、約４１５０００、約４１６０００、約４１７０００、約４１８０００、約４１９０００、約４２００００、約４２１０００、約４２２０００、約４２３０００、約４２４０００、約４２５０００、約４２６０００、約４２７０００、約４２８０００、約４２９０００、約４３００００、約４３１０００、約４３２０００、約４３３０００、約４３４０００、約４３５０００、約４３６０００、約４３７０００、約４３８０００、約４３９０００、約４４００００、約４４１０００、約４４２０００、約４４３０００、約４４４０００、約４４５０００、約４４６０００、約４４７０００、約４４８０００、約４４９０００、約４５００００、約４５１０００、約４５２０００、約４５３０００、約４５４０００、約４５５０００、約４５６０００、約４５７０００、約４５８０００、約４５９０００、約４６００００、約４６１０００、約４６２０００、約４６３０００、約４６４０００、約４６５０００、約４６６０００、約４６７０００、約４６８０００、約４６９０００、約４７００００、約４７１０００、約４７２０００、約４７３０００、約４７４０００、約４７５０００、約４７６０００、約４７７０００、約４７８０００、約４７９０００、約４８００００、約４８１０００、約４８２０００、約４８３０００、約４８４０００、約４８５０００、約４８６０００、約４８７０００、約４８８０００、約４８９０００、約４９００００、約４９１０００、約４９２０００、約４９３０００、約４９４０００、約４９５０００、約４９６０００、約４９７０００、約４９８０００、約４９９０００、約５０００００、約５０１０００、約５０２０００、約５０３０００、約５０４０００、約５０５０００、約５０６０００、約５０７０００、約５０８０００、約５０９０００、約５１００００、約５１１０００、約５１２０００、約５１３０００、約５１４０００、約５１５０００、約５１６０００、約５１７０００、約５１８０００、約５１９０００、約５２００００、約５２１０００、約５２２０００、約５２３０００、約５２４０００、約５２５０００、約５２６０００、約５２７０００、約５２８０００、約５２９０００、約５３００００、約５３１０００、約５３２０００、約５３３０００、約５３４０００、約５３５０００、約５３６０００、約５３７０００、約５３８０００、約５３９０００、約５４００００、約５４１０００、約５４２０００、約５４３０００、約５４４０００、約５４５０００、約５４６０００、約５４７０００、約５４８０００、約５４９０００、約５５００００、約５５１０００、約５５２０００、約５５３０００、約５５４０００、約５５５０００、約５５６０００、約５５７０００、約５５８０００、約５５９０００、約５６００００、約５６１０００、約５６２０００、約５６３０００、約５６４０００、約５６５０００、約５６６０００、約５６７０００、約５６８０００、約５６９０００、約５７００００、約５７１０００、約５７２０００、約５７３０００、約５７４０００、約５７５０００、約５７６０００、約５７７０００、約５７８０００、約５７９０００、約５８００００、約５８１０００、約５８２０００、約５８３０００、約５８４０００、約５８５０００、約５８６０００、約５８７０００、約５８８０００、約５８９０００、約５９００００、約５９１０００、約５９２０００、約５９３０００、約５９４０００、約５９５０００、約５９６０００、約５９７０００、約５９８０００、約５９９０００、約６０００００、約６０１０００、約６０２０００、約６０３０００、約６０４０００、約６０５０００、約６０６０００、約６０７０００、約６０８０００、約６０９０００、約６１００００、約６１１０００、約６１２０００、約６１３０００、約６１４０００、約６１５０００、約６１６０００、約６１７０００、約６１８０００、約６１９０００、約６２００００、約６２１０００、約６２２０００、約６２３０００、約６２４０００、約６２５０００、約６２６０００、約６２７０００、約６２８０００、約６２９０００、約６３００００、約６３１０００、約６３２０００、約６３３０００、約６３４０００、約６３５０００、約６３６０００、約６３７００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（ｃ）特定のタンパク質－核酸複合体
特定の実施形態において、タンパク質－核酸複合体は、（ｉ）ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ変異体、および（ｉｉ）シチジンデアミナーゼまたはアデノシンなどの塩基編集因子を含む、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系を含むことができる。デアミナーゼ（またはその触媒ドメイン）は、バクテロイデス染色体に結合または関連している。いくつかの実施形態において、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（またはその触媒ドメイン）に連結されたヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ変異体を含む。
（ＩＩ）タンパク質－核酸複合体の生成方法
本開示のさらなる態様は、セクション（Ｉ）に上述したように、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系およびＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする細菌染色体を含む複合体を生成するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）細菌染色体中の特定の遺伝子座を標的とするように核酸塩基修飾系のＣＲＩＳＰＲ系を操作すること、および（ｂ）操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系をバクテロイデス種／株に導入することを含む。
核酸塩基修飾系のＣＲＩＳＰＲ系を操作することは、そのｃｒＲＮＡガイド配列が、ＰＡＭ配列（によって認識される）に隣接する細菌染色体中の特定の（－約１９－２２ｎｔ）配列または遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを設計することを含む。そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、セクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記載したように、目的のＣＲＩＳＰＲタンパク質によって認識される。
操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系は、少なくとも１つのコード核酸として細菌細胞に導入することができる。例えば、コード核酸は、１つまたは複数のベクターの一部であることができる。操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子融合および１つまたは複数のｇＲＮＡ）をコードするベクターは、プラスミドベクター、ファージミドベクター、ウイルスベクター、バクテリオファージベクター、バクテリオファージ－プラスミドハイブリッドベクター、または他の適切なベクターであることができる。ベクターは、組み込みベクター、コンジュゲーションベクター、シャトルベクター、発現ベクター、染色体外ベクターなどであることができる。種々のベクターをバクテロイデスに送達または導入するための手段は、当技術分野で周知である。
ＣＲＩＳＰＲ－塩基編集因子融合をコードする核酸配列は、目的の細菌における発現のためにプロモーターに作動可能に連結することができる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子融合をコードする配列は、調節プロモーターに作動可能に連結することができる。いくつかの局面において、調節プロモーターは、プロモーター誘導化学物質によって調節されることができる。かかる実施形態において、プロモーターはｐＴｅｔＯであり、これは大腸菌Ｔｎ１０由来のｔｅｔ調節系に基づいており、強力なｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）含有マイコバクテリアプロモーターおよびリプレッサーＴｅｔＲについての発現カセットで構成されており、プロモーター誘導化学物質は無水テトラサイクリン（ａＴｃ）であることができる。他の実施形態において、プロモーターはｐＢＡＤまたはａｒａＣ－ＰａｒａＢＡＤであることができ、プロモーター誘導化学物質はアラビノースであることができる。さらなる実施形態において、プロモーターはｐＬａｃまたはｔａｃ（ｔｒｐ－ｌａｃ）であることができ、プロモーター誘導化学物質はラクトース／ＩＰＴＧであることができる。他の実施形態において、プロモーターはｐＰｒｐＢであることができ、プロモーター誘導化学物質はプロピオン酸であることができる。
少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、目的の細菌における発現のためにプロモーターに作動可能に連結されることができる。一般に、少なくとも１つのガイドＲＮＡの発現は、構成的プロモーターによって調節することができる。目的の細菌がバクテロイデス属である実施形態において、構成的プロモーターは、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ＢＴ＿ｒ０９の上流にあるＰ１プロモーターであることができる(Wegmann et al., Applied Environ. Microbiol., 2013, 79:1980-1989)。他の適切なバクテロイデスプロモーターは、P2、P1TD、P1TP、P1TDP（Lim et al., Cell, 2017, 169:547-558）、PAM、PcfiA、PcepA、PBT1311 (Mimee et al., Cell Systems, 2015, 1:62-71)または前述のプロモーターのいずれかの変異体を含む。他の実施形態において、構成的プロモーターは、大腸菌σ７０プロモーターまたはその誘導体、枯草菌σＡプロモーターまたはその誘導体、またはサルモネラＰｓｐｖ２プロモーターまたはその誘導体であることができる。当業者は、目的の細菌に適した追加の構成的プロモーターに精通している。
いくつかの実施形態において、ベクターは組み込みベクターであることができ、リコンビナーゼをコードする配列、ならびに１つまたは複数のリコンビナーゼ認識部位をさらに含むことができる。一般に、リコンビナーゼは不可逆的なリコンビナーゼである。適切なリコンビナーゼの非限定的な例は、バクテロイデスのｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼ（ＮＢＵ２遺伝子によってコードされる）、ストレプトマイセスファージｐｈｉＣ３１（ΦＣ３１）リコンビナーゼ、コリファージＰ４リコンビナーゼ、コリファージラムダインテグラーゼ、リステリアＡ１１８ファージリコンビナーゼ、およびアクチノファージＲ４Ｓｒｅリコンビナーゼを含む。リコンビナーゼ／インテグラーゼは、２つの配列特異的認識（または付着）部位（例えば、ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位）間の組換えを媒介する。いくつかの実施形態において、ベクターは、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ａｔｔＰ）の１つを含むことができ、他のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ａｔｔＢ）は、細菌の染色体中（例えば、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子の近く）に位置することができる。かかる状況において、ベクター全体を細菌染色体に組み込むことができる。他の実施形態において、操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系をコードする配列は、操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系をコードする配列のみが細菌染色体に組み込まれるように、２つのリコンビナーゼ認識部位に隣接することができる。
上記のベクターのいずれも、少なくとも１つの転写終結配列、ならびに少なくとも１つの複製起点および／または目的のバクテロイデス細胞における増殖および選択のための少なくとも１つの選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をさらに含むことができる。
ベクターおよびその使用に関する追加情報は、「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 または「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001に記載されている。
操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系をコードするベクターが組み込みベクターである実施形態において、操作された系をコードする核酸（またはベクター全体）は、生物へのベクターの送達(およびリコンビナーゼ/インテグラーゼの発現)後にバクテロイデス染色体に安定して組み込まれることができる。 操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系をコードするベクターが組み込みベクターではない実施形態において、ベクターは、ベクターの菌への送達後、染色体外に留まることができる。
ＣＲＩＳＰＲ－塩基編集因子融合体をコードする核酸配列が誘導性プロモーターに作動可能に連結されている実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系の発現は、プロモーター誘導化学物質を細菌に導入することによって誘導することができる。 特定の実施形態において、プロモーター誘導化学物質は、無水テトラサイクリンであることができる。 誘導されると、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子融合物が合成され、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系を細菌染色体中の標的遺伝子座に標的化し、それによって本明細書に開示されるタンパク質－核酸複合体を形成する。
（ＩＩＩ）細菌における核酸塩基を修飾する方法
本開示のさらなる態様は、バクテロイデスの標的メンバーの染色体中の少なくとも１つの核酸塩基を修飾するための方法を包含する。この方法は、標的種／株において操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系を発現させることを含み、ここで、操作されたＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系は、標的細菌染色体中の特定の遺伝子座を標的とし、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、特定の遺伝子座内の少なくとも１つの核酸塩基を修飾して、特定の遺伝子座を含む遺伝子が修飾および／または不活性化されるようにし、ここで標的細菌種／株の染色体はＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性（例えば、配列番号１に対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。核酸塩基修飾（例えば、シトシンからチミンへの変換、またはアデニンからグアニンへの変換）は、特定の遺伝子座内に一塩基多型（ＳＮＰ）および／または停止コドンを導入することができる。少なくとも１つの核酸塩基修飾の結果として、標的細菌は、特定の遺伝子座を含む少なくとも１つの遺伝子の発現を変更、低減、または排除することができる。
セクション（Ｉ）（ａ）に上述したＲＮＡ誘導型（ＣＲＩＳＰＲ）核酸塩基修飾系のいずれかを、セクション（ＩＩ）に上述したように操作して、上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に記載されている、目的のバクテロイデスの系統発生的系統における細菌種／株の染色体中の特定の遺伝子座を標的とすることができる。操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系は、上記のセクション（ＩＩ）に記載したように、ベクターの一部として細菌に導入できる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ－核酸塩基修飾系は誘導性である（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－塩基編集因子融合をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される）。そのため、ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系は、定義された時点で発現させることができる。化学物質を誘導するプロモーターが存在しない場合、ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系を生成することはできない。セクション（ＩＩ）に上述したように、ＣＲＩＳＰＲ－塩基編集因子融合タンパク質が染色体に組み込まれたコード配列または染色体外コード配列から発現されるように、細菌をプロモーター誘導化学物質に曝露することによって、ＣＲＩＳＰＲ－塩基編集因子融合を生成することができる。ＣＲＩＳＰＲ塩基編集因子融合体は、染色体に組み込まれたコード配列または染色体外コード配列から構成的に発現される少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成し、それによって活性なＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系を形成する。ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系は、細菌染色体の特定の遺伝子座を標的とし、そこで少なくとも１つの核酸塩基を修飾して、特定の遺伝子座を含む遺伝子の発現が変化、減少、または排除されるようにする。
いくつかの実施形態において、標的生物は、上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に詳述したように、バクテロイデス種または株レベル変異体であることができる。
他の実施形態において、生物は哺乳動物の消化管（または腸）に収容されることができ、プロモーター誘導化学物質の投与は、腸内微生物叢の標的細菌のレベルを低下または排除してもよい核酸塩基修飾（例えば、シトシンからチミンへの変換またはアデニンからグアニンへの変換）をもたらすことができる。プロモーター誘導化学物質は、経口投与することができる（例えば、食品、飲料、または薬学的製剤を介して）。哺乳動物は、マウス、ラット、または他の研究動物であることができる。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトであることができる。例えば、標的細菌生物（例えば、バクテロイデス属のメンバー）の減少または排除は、改善された腸の健康につながることができる。
（細胞培養または消化管中の）細菌の混合集団は、多種多様な分類群を含むことができる。たとえば、ヒトの腸内微生物叢は、何百もの異なる種の細菌を含み、相当な株レベルの多様性を伴う。
特定の実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）は、癌免疫療法を受けている可能性があり、免疫療法応答者は、非応答者と比較して、腸内細菌叢におけるバクテロイデス種のレベルが低いことが示されている(Gopalakrishnan et al., Science, 2018, 359:97-103)。したがって、腸内微生物叢におけるバクテロイデス種のレベルの低下は、より良いヒト癌免疫療法の結果につながることができる。
特定の実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、またはウシ）は、炎症性腸疾患、クローン病、憩室炎、腸閉塞、ポリープ除去、癌組織除去、潰瘍性大腸炎、腸切除、直腸切除、結腸全摘、または結腸部分切除を含むさまざまな理由で腸の手術を受けることができ、ここで、誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系による哺乳類の腸内の手術前のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ種の弱毒化は、腸の外側であるが哺乳類の体内の場所でのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓによる手術後の感染のリスクを減らすことができる。腸の外側の場所は、腸の外面を含む。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ内の誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系は、病原性島、毒素（すなわち、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ毒素またはＢＦＴ）、またはＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓまたは術後感染症を引き起こすことが知られている他の天然の腸内細菌の感染株に関連する他のユニークな配列に限定されないが似ている場所を修飾するように標的化されることができる。例えば、非毒素原性Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＮＴＢＦ）および腸毒素原性Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＥＴＢＦ）のレベルは、ＮＴＢＦ株ではなくＥＴＢＦ株内に配置された操作された誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系を使用して選択的に調節されることができる。腸の手術後に感染症を引き起こすリスクのあるその他の腸内細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｇａｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｓａｎ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉを含んでもよい。誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系の腸内微生物叢への送達は、手術前、手術中、または手術後のプロバイオティクス治療の一部として発生することができる。標的細菌への誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系の送達は、哺乳動物の体外または哺乳動物の体内で発生することができる。標的細菌への誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系の送達は、プラスミドまたはバクテリオファージなどの核酸ベクターを介して発生することができる。プラスミドの送達は、エレクトロポレーション、化学的形質転換、または細菌から細菌へのコンジュゲーションを介して発生することができる。
（ＩＶ）プロバイオティクスとしてのＣＲＩＳＰＲ組み込み細菌種／株
本開示のさらに別の態様は、例えばプロバイオティクスとして使用するための操作された細菌株を包含する。操作された株は、セクション（Ｉ）（ａ）に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系のいずれかを含み、細菌染色体に組み込まれるか、対象の生物内でエピソームベクターとして維持される。いくつかの実施形態において、操作された細菌は、誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系を含む操作されたバクテロイデスである。操作されたバクテロイデスの哺乳動物対象への投与およびそれに続くＣＲＩＳＰＲ系の誘導を使用して、細菌染色体の特定の遺伝子座を標的とすることができる。このＣＲＩＳＰＲ系による少なくとも１つの核酸塩基の修飾は、特定の遺伝子座を含む遺伝子の発現が変化、減少、または排除され、それによって哺乳動物対象に治療的利益を提供する。他の実施形態において、バクテロイデス株は、腸内細菌叢においてバクテロイデスの野生型株を打ち負かすように操作することができる。これらおよび他の実施形態において、哺乳動物対象に治療上の利益を提供する操作されたバクテロイデス株は、その後、誘導性ＣＲＩＳＰＲ核酸塩基修飾系の誘導によって哺乳動物対象から除去することができる。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術語および科学語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの語の一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
本開示またはその好ましい実施形態の要素を紹介する時、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「その(the)」および「前記」は、１つまたは複数の要素があることを意味することを意図している。「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する」なる語は包括的であることを意図しており、列挙された要素以外の追加の要素が存在することができることを意味する。
数値ｘに関して使用される場合、語「約」は、例えば、ｘ±５％を意味する。
本明細書で使用される場合、語「相補的」または「相補性」は、特定の水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の結合を指す。塩基ペアリングは、標準的なワトソン・クリック塩基ペアリング（例えば、相補配列３’－ＴＣＡＧ－５’との５’－ＡＧＴＣ－３’ペア）であってもよい。塩基対はまた、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。相補性は通常、二重鎖領域に関して測定されるため、例えばオーバーハングは除外される。二重鎖領域の２つの鎖間の相補性は部分的であり、塩基の一部（例えば、７０％）のみが相補的である場合、パーセンテージ（例えば、７０％）として表されることができる。相補的でない塩基は「ミスマッチ」である。二重鎖領域内のすべての塩基が相補的である場合、相補性も完全（すなわち、１００％）であることができる。
遺伝子またはポリヌクレオチドに関する「発現」なる語は、遺伝子またはポリヌクレオチドの転写、および必要に応じて、ｍＲＮＡ転写物のタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指す。したがって、文脈から明らかなように、タンパク質またはポリペプチドの発現は、オープンリーディングフレームの転写および／または翻訳から生じる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソンおよびイントロンを含む）、ならびに、かかる調節配列がコードおよび/または転写配列に隣接しているかどうかに関わらず遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座を含むが、必ずしもこれらに限定されない領域を制御する。
「異種」なる語は、目的の細胞に対して内因性でもネイティブでもない実体を指す。例えば、異種タンパク質は、外因的に導入された核酸配列などの外因性供給源に由来する、または元々由来したタンパク質を指す。場合によっては、異種タンパク質は、目的の細胞によって正常に産生されない。
「ニッカーゼ」なる語は、二本鎖核酸配列の一方の鎖を切断する酵素を指す。
「エンドヌクレアーゼ」なる語と交換可能に使用される「ヌクレアーゼ」なる語は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断するか、または一本鎖核酸配列を切断する酵素を指す。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる語は、線状または環状コンフォメーション、および一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対特異性を有する、つまり、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。
「ヌクレオチド」なる語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であることができる。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、イノシン、プソイドウリジンなど）または非天然に存在するヌクレオチドであることができる。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分に対する修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子での置換（例えば７－デアザプリン）を含む。ヌクレオチド類似体は、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。
「標的配列」、「標的部位」および「特定の遺伝子座」なる語は、ＣＲＩＳＰＲ系が標的とする目的の核酸（例えば、染色体ＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ）の特定の配列、およびＣＲＩＳＰＲ系が核酸または核酸に関連するタンパク質を修飾する部位を指すのに交換可能に使用される。
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で既知である。典型的には、かかる技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も、この方法で決定および比較することができる。一般に、同一性とは、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較できる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つのアラインメントされた配列間の正確な一致の数を短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発されたスコアリング行列、およびGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することによりアミノ酸配列に適用できる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用出願においてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって提供される。配列間の同一性または類似性のパーセントを計算するための他の適切なプログラムは、当技術分野で一般的に知られており、例えば、別のアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータと共に使用される。たとえば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用できる：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウェブサイト上に見出すことができる。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法に様々な変更を加えることができるため、上記の説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、限定的な意味でなく、例示として解釈されるべきであることが意図されている。
実施例
以下の実施例は、本開示のある態様を例示する。
実施例１．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎにおけるＣＲＩＳＰＲ塩基編集
バクテロイデスにおけるデアミナーゼ媒介標的塩基編集を、ＤＮＡ切断または鋳型ドナーＤＮＡなしで、ガイドＲＮＡによって特定される標的遺伝子座でヌクレオチドを直接編集するために行った（図１）。細胞死を誘導することなく、ほぼ１００％の編集効率が達成され、ゆえにバクテロイデスのゲノム操作に適する。
バクテロイデスのｄＣａｓ９－ＡｌＤベクターｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡを、構築した。このベクターは、（ｉ）無水テトラサイクリン誘導性プロモーターの下のＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓのシトシンデアミナーゼＰｍＣＤＡ１（ＣＤＡ）に融合した触媒的に不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ：Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、および（ｉｉ）構成プロモーターＰＩの下の２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的配列－ｇＲＮＡ足場ハイブリッド（ｓｇＲＮＡ）を発現する。このプラスミドは、大腸菌におけるアンピシリン選択のためのＲ６Ｋ複製起点およびｂｌａ配列、コンジュゲーションのためのＲＰ４－ｏｒｉＴ配列、およびバクテロイデスにおけるエリスロマイシン（Ｅｍ）選択のためのｅｒｍＧ配列を含む。ＮＢＵ２は、ｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス細胞の染色体上に位置するａｔｔＢ部位の１つとの間の配列特異的組換えを媒介するｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードする(Wang et al., J. Bacteriology, 2000, 182( 12):3559-3571)。ＮＢＵ２インテグラーゼ認識配列（ａｔｔＮ２／ａｔｔＢ）は、５’－ＣＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＧＣ－３’（配列番号：２）である。ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡユニットは、Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓシトシンデアミナーゼ（ＰｍＣＤＡ１）と融合したＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有する、誘導可能なヌクレアーゼ欠損ＳｐＣａｓ９で構成される。ｄＣａｓ９－ＣＤＡ１融合を、無水テトラサイクリン（ａＴｃ）の制御下でＴｅｔＲレギュレーター（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＨ０２３－ｄＳｐＣａｓ９－ＰｍＣＤＡ１）によって制御し、ガイドＲＮＡを構成的Ｐ１プロモーター（Ｐ１－Ｎ２０ｓｇＲＮＡ足場）によって制御した。プロモーターおよびリボソーム結合部位は、Lim et al., Cell, 2017, 169:547-558 に記載されるように、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（Ｂｔ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の調節配列に由来し、操作される。ガイドＲＮＡは、コードまたは非コードＤＮＡ配列に相同なヌクレオチド配列であるか、または非標的化スクランブルヌクレオチド配列である。この配列は、異なるＣａｓ９ホモログのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要件と互換性がある限り、変更できる。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの別々の転写ユニットに存在するか、ハイブリッドキメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）中に融合される。プラスミドｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＳＴＯＰ．ｔｄｋｆｉｔＤＮＡ配列（１１、３８３ｂｐ）のマップを図２に示し、配列番号３として記載する：
GGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATATTCGTTTAATATCATAAATAATTTATTTTATTTTAAAATGCGCGGGTGCAAAGGTAAGAGGTTTTATTTTAACTACCAAATGTTTTCGGAAGTTTTTTCGCTTTTCTTTTTCTATCGTTTCTCAGACTCTCTTAGCGAAAGGGAAAGAAGGTAAAGAAGAAAAACAAAACGCCTTTTCTTTTTTGCACCCGCTTTCCAAGAGAAGAAAGCCTTGTTAAATTGACTTAGTGTAAAAGCGCAGTACTGCTTGACCATAAGAACAAAAAAATCTCTATCACTGATAGGGATAAAGTTTGGAAGATAAAGCTAAAAGTTCTTATCTTTGCAGTCTCCCTATCAGTGATAGAGACGAAATAAAGACATATAAAAGAAAAGACACCATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATGCCATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGT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TGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCT
GTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATAACGCGTCAATTCGAGGGGGATCAATTCCGTGATAGGTGGGCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGAAAAAATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGCGGAAAACGGAATTGATCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCTGAAGATCAGCAGTTCAACCTGTTGATAGTACGTACTAAGCTCTCATGTTTCACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGAACTAAACCCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTCACGTACTAAGCTCTCATGTTTGAACAATAAAATTAATATAAATCAGCAACTTAAATAGCCTCTAAGGTTTTAAGTTTTATAAGAAAAAAAAGAATATATAAGGCTTTTAAAGCTTTTAAGGTTTAACGGTTGTGGACAACAAGCCAGGGATGTAACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCCTCTCAAAGCAATTTTGAGTGACACAGGAACACTTAACGGCTGACATGGGAATTCCCCTCCACCGCGGTGG
この特定の実施例において、非標的化対照ガイドＲＮＡ（５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’、「ＮＴ」と呼ばれる、配列番号：４）、またはＢｔゲノム上にｔｄｋ＿Ｂｔ（ＢＴ＿２２７５）またはｓｕｓＣ＿Ｂｔ（ＢＴ＿３７０２）コード配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する３つのプラスミドを、構築した。ｔｄｋ遺伝子はチミジンキナーゼをコードし、ｓｕｓＣ遺伝子はデンプン結合に関与するＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎの外膜タンパク質をコードする。ｔｄｋ＿Ｂｔのプロトスペーサー配列は、５’－ＡＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧ－３’（配列番号５）であり、ｓｕｓＣ＿Ｂｔのプロトスペーサー配列は、５’－ＧＣＴＣＡＡＡＴＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＧ－３’（配列番号６）である。バクテロイデスゲノムに対する非標的化対照プロトスペーサー配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析において、有意な配列一致は得られず、「オフターゲット」活性がないことが示された。ｔｄｋ＿ＢｔおよびｓｕｓＣ＿Ｂｔの標的化配列を、ＣからＴへの変異がＰＡＭの約１５～２０塩基上流に位置するシトシンヌクレオチド（Ｃ）で発生した場合に停止コドンを導入するように選択した (Nishida et al., Science, 2016, 353 ( 6305), doi: 10.1126/science.aaf8729; 12016, Banno et al., Nature Microbiology, 2018, 3. 10.1038/s41564-017-0102-6)。得られたプラスミドを、ｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ＮＴ、ｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ｔｄｋ＿Ｂｔ、およびｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ｓｕｓＣ＿Ｂｔと名付ける。
ｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡプラスミドを、エリスロマイシン選択によりＢｔ細胞に結合させ、コンジュゲーション当たり５００－１０００個のコロニーを得た。バクテロイデスの複製起点がないため、これらのプラスミドは維持できない。エリスロマイシン耐性コロニーは、おそらく染色体の組込み体であった。Ｂｔ染色体上の２つのａｔｔＢＴ遺伝子座のいずれかにおけるＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ組込みのコロニーＰＣＲスクリーニングのために、各コンジュゲーションからのコロニーを採取した。各ａｔｔＢＴ遺伝子座の染色体配列を標的とするプライマーを使用したＰＣＲを使用して組み込み遺伝子座を推定し、続いてさらにジャンクションＰＣＲおよび染色体と組み込みベクター配列間のＤＮＡ配列決定を確認した。ＮＴ（非標的化）、Ｔ（ｔｄｋ＿Ｂｔ）、およびＳ（ｓｕｓＣ＿Ｂｔ）と標識されたａｔｔＢＴ２－１遺伝子座に組み込まれた誘導ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡカセットを含む３つのＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ組み込み株を、次の誘導ＣＲＩＳＰＲベース編集実験のために取得した。ＮＴ、Ｔ、およびＳＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ組込み体の単一コロニーを、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）および２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）を補充した５ｍｌＴＹＧ液体培地(Holdeman et al., Anaerobe Laboratory Manual, 1977; Blacksburg, Va., Virginia Polytechnic Institute and State University Anaerobe Laboratory)を含むファルコンチューブ培養において一晩、ｃｏｙチャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）において一晩嫌気的に増殖させた。培養物を希釈し（１０－６または１０－８）、１００μＬを、それぞれ０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のａＴｃを補充した脳心臓注入（ＢＨＩ；Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃｏ．）血液寒天プレート（Ｇｍ２００μｇ／ｍＬおよびＥｍ２５μｇ／ｍＬ）に広げた。寒天プレートを嫌気的に３７℃で２－３日間インキュベートした。３株すべてについて、各血液寒天プレートで約１０２－１０３ＣＦＵ（コロニー形成単位）が得られた。
ｔｄｋ＿Ｂｔ塩基編集のために、８個のコロニーをａＴｃ０およびａＴｃ１００寒天プレートから採取した。これらのコロニーを、２００μｇ／ｍＬのＧｍおよび２００μｇ／ｍＬの５－フルオロ－２０－デオキシウリジン（ＦＵｄＲ）を補充したＢＨＩ血液寒天プレートに画線し、３７°Ｃで２－３日間嫌気的にインキュベートした。Ｔｃ１００寒天プレートからのコロニーはすべて成長したが、Ｔｃ０寒天プレートからのコロニーについては成長が観察されなかった。ｔｄｋ＿Ｂｔ領域のコロニーＰＣＲを実行した後、ＤＮＡ配列決定を行った。配列決定の結果は、ａＴｃ１００寒天プレートからの８つのコロニーのうち８つが、ＰＡＭに対して－１７位に予想されるＣからＴへの置換を有し、その結果、早期停止コドンが導入されることを示す（図３Ａ）。このｔｄｋ不活化変異は、有毒なヌクレオチドアナログＦＵｄＲに対する耐性を付与する。ＮＴ－ａＴｃ０、ＮＴ－ａＴｃ１００、Ｔ－ａＴｃ０、およびＴ－ａＴｃ１００寒天プレートからそれぞれ最大５０個のコロニーを、２００μｇ／ｍＬのＧｍおよび２００μｇ／ｍＬのＦＵｄＲを補充したＢＨＩ血液寒天プレートにさらにストリークした。Ｔ－ａＴｃ１００寒天プレートからのすべてのコロニーが成長したことが観察されたが、他のコロニーについては成長が観察されなかった。このことは、Ｂｔ細胞における誘導性の、ＲＮＡ誘導性の、非常に効率的なヌクレオチド突然変異誘発を示唆している。
ｓｕｓＣ＿［００９５］Ｂｔ塩基編集のために、８個のコロニーをａＴｃ０およびａＴｃ１００寒天プレートから採取した。ｓｕｓＣ＿Ｂｔ領域のコロニーＰＣＲを実行した後、ＤＮＡ配列決定を行った。配列決定の結果は、ａＴｃ１００寒天プレートからの８つのコロニーのうち８つが、ＰＡＭに対して－１７および－１９位で予想されるＣからＴへの置換を有することを示し、これはアミノ酸置換（位置４９１のＡからＶ）および初期停止コドン導入（３，０１２ｂｐ ｓｕｓＣコード配列の４９３位）をもたらす（図３Ｂ）。ａＴｃ０寒天プレートからの８つのコロニーすべてが、野生型のｓｕｓＣ＿Ｂｔ配列を保持している。このことは、Ｂｔ細胞における誘導性で効率の高いＲＮＡ誘導塩基編集を示す。
実施例２.Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ－５４８２において安定に維持されたＣＲＩＳＰＲ塩基編集
バクテロイデスのｄＣａｓ９－ＡＩＤベクターｐｍｏｂＡ.ｒｅｐＡ.ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ.ＮＴを構築した。このベクターは、（ｉ）無水テトラサイクリン誘導性プロモーターの下でＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓシトシンデアミナーゼＰｍＣＤＡ１（ＣＤＡ）に融合した触媒的に不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ：Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、および（ｉｉ）構成的プロモーターＰ１の下で２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的配列－ｇＲＮＡ足場ハイブリッド（ｓｇＲＮＡ）を発現する。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン選択のためのｂｌａ配列を含有する。動員についてｍｏｂＡ配列、複製についてｒｅｐＡ配列、およびバクテロイデスにおけるエリスロマイシン（Ｅｍ）選択についてｅｒｍＦ配列が必要とされる（Smith, C. J., et al., Plasmid, 1995, 34, 211－222）。ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡユニットは、Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓシトシンデアミナーゼ（ＰｍＣＤＡ１）と融合したＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を持つ、誘導可能なヌクレアーゼ欠損ＳｐＣａｓ９で構成されている。ｄＣａｓ９－ＣＤＡ１融合は、無水テトラサイクリン（ａＴｃ）の制御下でＴｅｔＲレギュレーター（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＨ０２３－ｄＳｐＣａｓ９－ＰｍＣＤＡ１）によって制御され、ガイドＲＮＡは構成的Ｐ１プロモーター（Ｐ１－Ｎ２０ｓｇＲＮＡ足場）によって制御された。プロモーターおよびリボソーム結合部位は、Lim et al., Cell, 2017, 169: 547-558に記載されているように、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（Ｂｔ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の調節配列に由来し、操作されている。ガイドＲＮＡは、コードまたは非コードＤＮＡ配列に相同なヌクレオチド配列であるか、または非標的スクランブルヌクレオチド配列である。この配列は、異なるＣａｓ９ホモログのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要件と互換性がある限り、変更できる。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの別々の転写ユニットに存在するか、ハイブリッドキメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）に融合される。プラスミドｐｍｏｂＡ．４および配列番号７として記載されている：
TCGGGACGCTCATCAATATCCACCCTGCCTGGGATAAATCCTCGCCCTGCATTTTTAGAACCACGTTTGGCATACCTGCGACCTTGTCTGCGAAGATATTTGTGCAGTTTGCCACCCCGCCGCTTATCCTCCCAAATCCAGCGATATATCGTTTCGTGAGATACCATCGCAATTCCCTCCAAGCGGCTCCTGCCGACAATCTGCTCCGGGCTGAATCCTTTCTTCAACAGCTTTATTATCCGTTTTCTCATTGCCGGTGTAAGCACTTCCTTGCGATGTTTTTGCTGCTTGCGCCTGTCTGCTTTTCGCTGGGCAAGCTCCATGCTATAGCTACCACTTCGGGCGTCGCAATTGCGCTTTATCTCCCTGTAAACAGTGCTTTTATCTACTCCGATAGCTTCCGCTATTGCTTTTTTGCTCATCGGTATTTGCAACATCATAGAAATTGCATACCTTTGTTCCTCGGTTATATGTTTGCTCATCTGCAACTTTTTTTTCTTTGGACGGACAATTAAAGCAAAGATAGCAAACTTTATCCATTCAGAGTGAGAGAAAGGGGGACATTGTCTCTCTTTCCTCTCTGAAAAATAAATGTTTTTATTGCTTATTATCCGCACCCAAAAAGTTGCATTTATAAGTTGAACTCAAGAAGTATTCACCTGTAAGAAGTTACTAATGACAAAAAAGAAATTGCCCGTTCGTTTTACGGGTCAGCACTTTACTATTGATAAAGTGCTAATAAAAGATGCAATAAGACAAGCAAATATAAGTAATCAGGATACGGTTTTAGATATTGGGGCAGGCAAGGGGTTTCTTACTGTTCATTTATTAAAAATCGCCAACAATGTTGTTGCTATTGAAAACGACACAGCTTTGGTTGAACATTTACGAAAATTATTTTCTGATGCCCGAAATGTTCAAGTTGTCGGTTGTGATTTTAGGAATTTTGCAGTTCCGAAATTTCCTTTCAAAGTGGTGTCAAATATTCCTTATGGCATTACTTCCGATATTTTCAAAATCCTGATGTTTGAGAGTCTTGGAAATTTTCTGGGAGGTTCCATTGTCCTTCAATTAGAACCTACACAAAAGTTATTTTCGAGGAAGCTTTACAATCCATATACCGTTTTCTATCATACTTTTTTTGATTTGAAACTTGTCTATGAGGTAGGTCCTGAAAGTTTCTTGCCACCGCCAACTGTCAAATCAGCCCTGTTAAACATTAAAAGAAAACACTTATTTTTTGATTTTAAGTTTAAAGCCAAATACTTAGCATTTATTTCCTGTCTGTTAGAGAAACCTGATTTATCTGTAAAAACAGCTTTAAAGTCGATTTTCAGGAAAAGTCAGGTCAGGTCAATTTCGGAAAAATTCGGTTTAAACCTTAATGCTCAAATTGTTTGTTTGTCTCCAAGTCAATGGTTAAACTGTTTTTTGGAAATGCTGGAAGTTGTCCCTGAAAAATTTCATCCTTCGTAGTTCAAAGTCGGGTGGTTGTCAAGATGATTTTTTTGGTTTGGTGTCGTCTTTTTTTAAGCTGCCGCATAACGGCTGGCAAATTGGCGATGGAGCCGACTTTGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATATTCGTTTAATATCATAAATAATTTATTTTATTTTAAAATGCGCGGGTGCAAAGGTAAGAGGTTTTATTTTAACTACCAAATGTTTTCGGAAGTTTTTTCGCTTTTCTTTTTCTATCGTTTCTCAGACTCTCTTAGCGAAAGGGAAAGAAGGTAAAGAAGAAAAACAAAACGCCTTTTCTTTTTTGCACCCGCTTTCCAAGAGAAGAAAGCCTTGTTAAATTGACTTAGTGTAAAAGCGCAGTACTGCTTGACCATAAGAACAAAAAAATCTCTATCACTGATAGGGATAAAGTTTGGAAGATAAAGCTAAAAGTTCTTATCTTTGCAGTCTCCCTATCAGTGATAGAGACGAAATAAAGACATATAAAAGAAAAGACACCATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTT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CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACACACCATAAACTTTTTTTAGAATAAGCACACAACCGTTTTCCGAACCCTGCAAAATGTTTTCTGAATCCGAACGGTGTAACACTCCATTGAGAGAGGCTGCCGTTTGGTCGCTCCCCCTTTGGGGGCGGGGGGGGGTTACATACCCATGCCGAAACCTCTGCTTCTGGTGATTTGCTTGAATAGGTCTTTCCCCTCTTCCATAGCTTTTGATATGTTTGGGAAATGATGCCTTAAAGCCTCCAGTTGTTCGGAATTGAACAAGTCTTTCATCTTACCAAGTTCTTTTTTCAACTCCTTGGTTTCGGCTTTTAGTTTTTGGTTCTCCGTCCTTAATAGGTTACTGGTTGTCCTTGCGTTGTCCATTTGTTGTCTATAATACTCCTTGTCATTCTCGGCTTTGAATGCCTTTGTGCTGTTTCGCTCTTTTTCAAGTATAGCCTTTCCCAGTCTATCGGATAGTTGTTCATTTTCCCCCTCTAAAGTCTTTACTTTGGCTTTTAAGGCATCCTTTTCCCTATCGTTGACTGTTTTTCCAATCAAGCCGTAAAACTTCTCTGAAGCCTTAGAAATGAGTTTTTGGACGTTCTTCTTTGTTTCAATGGAACGTAGTTCCTTCTGAAGCTGAAGAAGCTGGTTTTGTGCGTCCTTGTATTTGTCTAATGCACTGGATATATCGTTGGATAGTTCCTGAAGCTGTTCTTTCGCACATTCGGTCTTGTACTGCATAGCCGATAAGTGTTTGCGGTCAGAAGAAACGCCACGTTCCATGCCCAGTGTTTCAGATGCTATGGTTTGGAGTTCTGCCATGTCATCACGCGATAAACGCACACTTTTCCCATTCGGCTGCGTCCAATCGAAAACTACATGGGCATGAAGGTTAGGTGTCCACTGCTTTGCGTTCATGTATCCTTCGTCCTTGTGTATATGGATTTGAAACGCTTCGATACCGAAACGTTCTTTGCAGACCGTGGCAAACTGCTGGAGTTCCTGCATAGTGGTTTCTTGTTTGATTACTATTACTCCCTCTCGTATGGGTGCGGCTTTAGCCTGCATCTTCTGCCCAACCGTATCGAGATATCTTTGTTTTGCACTCTCCAGCCGATGGGAAATGCTATCTCCAACCCAGCTTTCATTCAAATGACTAAGTTCGGGACGAACATAGTCCAACTCTTTTTCCCTAAAGTTGTGAATCTCGCTCCCCGGCTTCACTGCTTGTACATGAATACTTGTTGCTCCCATAAGTTAACATTTTTGTGACAATCGATAACAGCCGGTGACAGCCGGCTGACAGGGGGTTAAGGGGGCTTGTCCCCTTACACACGCACTCTTTAGGGTGCTAGTGTGCTATCACCATACTGCATAGGTGCGAAGTTAGTGAATGTTTTGTAAATGCACAAATAAAGGGAAAAACATTTGGATTTGCGATAATAAAGTACTACCTTTGTTGCTGACCAAACGGTAGCTGACCGATACGGGAGAGTTACCAAAATACAAGCCGCTGGAGTTAATTGACGGACATCCGACATCTCCAGCGGCTTTATTTTTGCCTATCTGCTTCGCCTAGGCACACCAGTACCTCTACTAAAAATGTACTTCAAAGATACTTATTTTCTACCGACTTGATAGTTTTTACCCCATATTCTTGGACATTTTTCCCCCATGAGGTTATCTTTGTAGGGTGAAAGAGAAACCCATAAACGGGGATAGATTGAATGCTGGGAAGCATAAACAATCGGGGTAAGGTTAGCGAACCTTGCCTTTCATCCCCCATTATAACTTTACATAGAGGAACTTTATCTATCCCCCCCCGCCCCCAAAGGGGGAGCGACCAAACGGCAGCTTCACTCAATGGAGTGTTACTGTTCATCAAAGCCAAGTGATAATTGTCGTTTCTCTGCTTCTTCTTTCTTTTGGGCAGCTAAAGTCTTTTTCCGAACGTATGTTTTAGCAAATGTCACTCGGTCACCATTGAATACTATCAGAGGATTAATAAACCAAAGATTATCGGCTGGTCCTCGGGCTATGATTTCAGCTTTTACAAGTTCTGCAAGTCCTTTATAAACGGCTTTGTCTGTTTTGTATTTGGTATATTCTAGGCATTTTTTTCTATTGAAAATGATTAAATCATTTTTGGGTTTCATGCAGGTCATAAAGTAACCAAAAACCCGAATAGCTGCTTGTGATAGGTCAAAGAATGCAGCAAAGTTAGAAAGATACAATTTAGTGAATTGTTCTTCATCTACTTCTATTTGACGGATAAACGAAGTCTTAAACACTTCTCCAGTTTCAGTGTCGGCTAAAGCTACTACAGCTCTCTTATCGCCACCACTATTACTCTTATACTTTTTAACAACATGATTTTCAATACCTTCTATAGCTTGTTTCATAAAAGGATTTTCTTCGTTCTTTTGAAAATCGGTTAACTTAACTGCTTTTTTATTTTCCATTTTGATATGTTTTTGGGAAATATTATTCTCCACAAAGTAAACTATTATTTTCCATAAAAACAATATTAAGGGAAATATTATTTTCCTATTTAGTATCATATTAGGAAATCGGTATTTTCTAGATTGGAAAATGAGAATTTCCAATATGGAAAATGCCCTATATTGTGTATCAAGTACTTAACTTATTCTATTTCTTTTATTCTTAATATACCCCCAAAACAGCACAAAATCAGTCACTTAAAAATCATCGGTCGGGGAATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGCTAAATTTAAATATAAACAA
この特定の実施例において、非標的化対照ガイドＲＮＡ（「ＮＴ」と呼ばれる５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’、配列番号４）、またはＢｔゲノム上にＢＴ＿０３６２またはＢＴ＿０３６４コード配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する３つのプラスミドを構築した。ＢＴ＿０３６２のプロトスペーサー配列は５’－ＧＧＡＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＣＡＧＡ－３’（配列番号８）であり、ＢＴ＿０３６４のプロトスペーサー配列は５’－ＣＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＣＧ－３’（配列番号９）である。バクテロイデスゲノムに対する非標的化対照プロトスペーサー配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析において、有意な配列一致は得られず、「オフターゲット」活性がないことが示された。ＢＴ＿０３６２およびＢＴ＿０３６４の標的化配列は、ＣからＴへの変異がＰＡＭの約１５－２０塩基上流に位置するシトシンヌクレオチド（Ｃ）で発生した場合に停止コドンを導入するように選択された(Nishida et al., Science, 2016, 353 ( 6305), doi:10.1126/science.aaf8729; 12016, Banno et al., Nature Microbiology, 2018, 3.10.1038/s41564-017-0102-6)。得られたプラスミドは、ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ＮＴ、ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ＢＴ＿０３６２、およびｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ．ＢＴ＿０３６４と名付けられる。
ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡプラスミドを、好気条件下で、脳－心臓注入（ＢＨＩ；Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃｏ．）血液寒天プレート上で最初に選択または誘導なしでＢｔ細胞に結合させた。このコンジュゲーションスメアをかき取り、１ｍｌのＴＹＧ液体培地で再構成した(Holdeman et al., Anaerobe Laboratory Manual, 1977; Blacksburg, Va., Virginia Polytechnic Institute and State University Anaerobe Laboratory)。ＴＹＧ培地中の各コンジュゲートプラスミド試料について、ＴＹＧ培地で１：１０に希釈した１００μｌを、２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）および２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）ＢＨＩ１０％血液寒天プレートに播種し、コンジュゲーションあたり数百のコロニーを得た（図５Ａ）。バクテロイデスのｒｅｐＡ複製起点により、これらのプラスミドを維持することができる。各コンジュゲーションからの単一コロニーを、２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）および２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）選択下での継続的なＴＹＧ培地液体培養増殖のために採取し、続いてプラスミド精製を行って正しいプラスミド維持を検証した。ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡガイド領域のＰＣＲ増幅およびサンガー配列決定により、各プラスミドの正しいガイド配列が確認された。３つのｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡが安定に維持され、ＮＴ（非標的化）、ＢＴ＿０３６２、およびＢＴ＿０３６４と標識されたプラスミド株が、次の誘導性ＣＲＩＳＰＲ塩基編集実験のために取得された。ＮＴ、ＢＴ＿０３６２、およびＢＴ＿０３６４ ｐｍｏｂＡ．ｒｅｐＡ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡプラスミド株の単一コロニーを、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）、２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）および１００ｎｇ／ｍｌａＴｃを補充した５ｍｌＴＹＧ液体培地を含むファルコンチューブ培養で一晩、ｃｏｙチャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）で嫌気的に増殖させた。次に、これらの培養物からの試料を、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを補充したＢＨＩ１０％血液寒天プレート（Ｇｍ２００μｇ／ｍＬおよびＥｍ２５μｇ／ｍＬ）にプラスチックループでストリークした。寒天プレートを嫌気的に３７℃で２－３日間インキュベートした。３株すべてについて、各血液寒天プレート上のループストリーク領域に沿って個々のコロニーを得た（図５Ｂ）。
これら３枚のａＴｃ１００寒天プレートからコロニーを採取した。ＢＴ＿０３６２およびＢＴ＿０３６４領域のコロニーＰＣＲを実行した後、サンガー配列決定を行った。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社内で開発されたソフトウェアを使用した定量的突然変異分析は、ＢＴ＿０３６２およびＢＴ＿０３６４塩基編集試料ａＴｃ１００寒天プレートが、ＢＴ＿０３６２試料についてのＰＡＭに対して－１７位置に、ＢＴ＿０３６４試料におけるＰＡＭに対して－１８、－１９、および－２０位置に予想されるＣからＴへの置換を含むことを示す。代表的なＢＴ＿０３６２およびＢＴ＿０３６４試料を（図６ＡおよびＢ）に示す。これらのＣ－Ｔ置換により、ＢＴ＿０３６２およびＢＴ＿０３６４ベース編集試料の両方で早期停止コドンが導入される。ＮＴ株は、ａＴＣ誘導後、標的のＢＴ＿０３６２またはＢＴ＿０３６４領域でＣ－Ｔ置換を示さなかった。
この解析ソフトウェアは「ＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅ」と呼ばれる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の形式（ＡＢＩ）ファイルをもとに各塩基シグナルのピーク値を抽出し、サンガー配列決定データの「対照」および「試料」を比較することにより変異率を算出する。
実施例３．他のバクテロイデス株におけるＣＲＩＳＰＲ塩基編集
ＮＢＵ２インテグラーゼ組換えｔＲＮＡ－ｓｅｒ部位（５’－ＣＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＧＣ－３’（配列番号２））は保存されており、公開されたゲノム配列に基づく、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓを含む多くのバクテロイデス株に存在する。標的化ガイドＲＮＡを発現する誘導可能なＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡカセットは、これらのバクテロイデス株の染色体に組み込むことができ、標的化ガイドＲＮＡを発現する株における特定の遺伝子の標的ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ ＣからＴへの塩基編集は、ａＴｃ誘導剤による処置により達成可能である。標的化ガイドＲＮＡを発現する株における特定の遺伝子の編集は、Ｔｃインデューサーで処理することによって達成することができる（実施例１に記載されているように）。特定の種の染色体上にＮＢＵ２インテグラーゼ部位がない場合、これらの１３塩基対ＤＮＡ配列は、組換え（例えば、Ｃｒｅ／／ｏｘＰ）または当技術分野で記載されているように対立遺伝子交換を介して染色体上に容易に挿入され、染色体のＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ組込みおよび標的化遺伝子ベース編集を可能にすることができる。
実施例４．マウス腸におけるバクテロイデスのＣＲＩＳＰＲ塩基編集
特定のバクテロイデス種のマウス腸のインサイチュでの標的化された誘導性ＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡ ＣからＴの塩基編集は、種特異的なプロトスペーサー配列を標的とするガイドＲＮＡを発現するＣＲＩＳＰＲ－ＣＤＡカセットを細菌コンジュゲーションを介したＮＢＵ２インテグラーゼによって媒介されるゲノムの染色体上に組み込むことによって実施することができる。例示的な場合において、マウスは、ヒトを含む哺乳動物の腸内微生物叢に由来する１つまたは複数のバクテロイデスが定着したノトバイオート動物である。ａＴｃインデューサーを特定の時点でマウスの腸に適用することができ、このことは腸内細菌叢の種における特定の遺伝子の標的化された変異または不活性化をもたらす。

Claims (37)

  1. 細菌細胞の染色体に関連する操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系を含むタンパク質－核酸複合体であって、ここで操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系は、細菌細胞の染色体中の特定の遺伝子座を標的とし、細菌細胞の染色体は、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする、タンパク質－核酸複合体。
  2. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系、および（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインを含み、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ヌクレアーゼ欠損変異体またはニッカーゼである、請求項１に記載のタンパク質－核酸複合体。
  3. ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ系、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である、請求項２に記載のタンパク質－核酸複合体。
  4. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓＸである、請求項２または３に記載のタンパク質－核酸複合体。
  5. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重分子ｇＲＮＡである、請求項２－４のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  6. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合ハイブリッドを含む単一分子ｇＲＮＡである、請求項２－４のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  7. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、シチジンデアミナーゼ２（ＣＤＡ２）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーシチジンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ１相補因子／ＡＰＯＢＥＣ１刺激因子（ＡＣＦ１／ＡＳＦ）シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、ｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、またはｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）から選択される、請求項２－６のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  8. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、シチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインであり、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、少なくとも１つのウラシルグリコシラーゼ阻害剤ドメインをさらに含む、請求項２－７のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  9. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインに直接またはリンカーを介して連結されている、請求項２－８のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  10. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に直接またはリンカーを介して連結され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｇＲＮＡが、アダプタータンパク質に結合することができるアプタマー配列を含む、請求項２－８のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  11. アプタマー配列が、ＭＳ２／ＭＳＰ、ＰＰ７／ＰＣＰ、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、Ｆ１、Ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＧＡ、ＩＤ２、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＪＰ５０１、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＲＲ１、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、または７ｓから選択される、請求項１０に記載のタンパク質－核酸複合体。
  12. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、シチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結されたヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ変異体を含む、請求項２－１１のいずれか一項記載のタンパク質－核酸複合体。
  13. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系をコードする核酸から発現され、細菌染色体に組み込まれる、請求項１－１２のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  14. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系をコードする核酸から発現され、染色体外ベクター上に担持される、請求項１－１２のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  15. 細菌細胞の染色体上にコードされるＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１－１４のいずれか一項に記載のタンパク質－核酸複合体。
  16. 細菌が、バクテロイデス種またはその株レベル変異体である、請求項１－１５のいずれか一項記載のタンパク質－核酸複合体。
  17. バクテロイデス種またはその株レベル変異体が、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ、Ｂ．ｏｖａｔｕｓ、Ｂ．ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ、Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、またはＢ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓから選択される、請求項１６に記載のタンパク質－核酸複合体。
  18. 標的細菌細胞の染色体中の少なくとも１つの核酸塩基を修飾する方法であって、該方法は、標的細菌細胞において操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系を発現させることを含み、ここで、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、標的細菌細胞の染色体内の特定の遺伝子座を標的とし、該操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、該特定の遺伝子座内の少なくとも１つの核酸塩基を修飾して、特定の遺伝子座を含む遺伝子の発現が変化、修飾、および／または不活性化されるようにし、ここで、標的細菌細胞の染色体は、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする、方法。
  19. 少なくとも１つの核酸塩基の修飾が、標的細菌細胞の染色体中の特定の遺伝子座内に少なくとも１つの一塩基多型および／または少なくとも１つの停止コドンの導入をもたらす、請求項１８に記載の方法。
  20. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系、および（ｉｉ）核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインを含み、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ変異体またはＣＲＩＳＰＲニッカーゼである、請求項１８から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ系、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である、請求項２０に記載の方法。
  22. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓＸである、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重分子ｇＲＮＡである、請求項２０－２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合ハイブリッドを含む単一分子ｇＲＮＡである、請求項２０－２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、シチジンデアミナーゼ２（ＣＤＡ２）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーシチジンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ１相補因子／ＡＰＯＢＥＣ１刺激因子（ＡＣＦ１／ＡＳＦ）シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、ｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、またはｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）から選択される、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、シチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインであり、操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、少なくとも１つのウラシルグリコシラーゼ阻害剤ドメインをさらに含む、請求項２０－２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインに直接またはリンカーを介して連結されている、請求項２０－２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に直接またはリンカーを介して連結され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｇＲＮＡが、アダプタータンパク質に結合することができるアプタマー配列を含む、請求項２０－２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. アプタマー配列が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、Ｆ１、Ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＧＡ、ＩＤ２、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＪＰ５０１、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＲＲ１、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、または７ｓから選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 操作されたＲＮＡ誘導核酸塩基修飾系が、シチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結されたヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ変異体を含む、請求項２０－２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメイン、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、およびｇＲＮＡが、標的細菌細胞の染色体中に組み込まれた少なくとも１つの核酸から発現される、請求項２０－３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 核酸塩基修飾酵素またはその触媒ドメイン、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、およびｇＲＮＡが、染色体外ベクター上に担持された少なくとも１つの核酸から発現される、請求項２０－３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする核酸が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. プロモーター誘導化学物質が、無水テトラサイクリンである、請求項３３に記載の方法。
  35. 標的細菌細胞の染色体においてコードされるＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１８－３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 標的細菌細胞が、バクテロイデス種またはその株レベル変異体である、請求項１８－３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. バクテロイデス種または株レベル変異体が、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ、Ｂ．ｏｖａｔｕｓ、Ｂ．ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ、Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、またはＢ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓとして定義される系統群に属する、請求項３６に記載の方法。
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