KR20230152608A - CRISPR-Cas12f1 시스템을 이용한 유전체의 단일 뉴클레오타이드 편집 방법 및 이의 용도 - Google Patents
CRISPR-Cas12f1 시스템을 이용한 유전체의 단일 뉴클레오타이드 편집 방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CRISPR-Cas12f1 시스템을 기반으로 한 단일 뉴클레오타이드 수준의 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 3'-말단 절단(truncated) sgRNA를 이용한 CRISPR 시스템은 표적 DNA에 유의적인 유전체 편집 효과를 달성하는 바, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 CRISPR-Cas12f1 시스템을 기반으로 유전체를 단일 뉴클레오타이드 수준에서 편집하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 표적 DNA에 이중 가닥 절단을 일으키는 특성은 유전체 편집 도구로 응용되었다. 표적 DNA와 guide RNA 간의 상보적인 결합에 기반한 CRISPR-Cas 시스템의 표적 절단 활성은 guide RNA 서열의 변경으로 표적 선정에 큰 확장성을 갖게 하여 현재 가장 활발히 사용되는 유전체 편집 도구가 되었다.
CRISPR-Cas 시스템이 인간 유전체 편집에 활용되면서, 표적 DNA 서열이 아닌 부위에 이중 가닥 절단을 유발하는 오프-타겟 효과(off-target effect)가 보고되었다. 그로 인해 Cas9, Cpf1 등의 편집 정확도를 높이는 여러 연구가 수행되었다. 편집 정확도와 별개로 뉴클레아제(nuclease) 유전자의 크기가 4 kb인 Cas9과 Cpf1는 바이러스 벡터(virus vector) 등을 이용한 전달(delivery)에 제한성이 있어 크기가 작은 Cas 뉴클레아제의 발굴이 계속해서 요구되어 왔다.
최근 유전자 크기가 1.2 내지 2 kb 정도로 Cas9이나 Cpf1에 비해 최대 1/3 수준인 Cas12f1가 Archaea 등에서 처음 발견되어 새롭게 보고된 바 있다. 분류상 Cpf1과 동일한 Type-V에 속하는 미니어처(miniature) Cas12f1는 dimer 형태로 작동하는데, Cas12a와 마찬가지로 5'-NTR의 PAM 서열을 인식하고 dimer 각 lobe의 single RuvC domain이 표적 DNA에서 해당 strand에 절단을 일으켜 인간 유전체 편집 도구로의 활용 가능성이 제시되었다. 일부 연구팀에서 Cas12f1의 구조와 특성을 분석한 결과를 발표하였으나, Cas9과 Cpf1에 비해 비교적 최근에 발견되어 아직 초기 단계에 연구가 머무르고 있다.
현재, Cas9과 Cpf1의 오프-타겟 효과 등의 문제점을 우회하고자 base editor, prime editor 등이 사용되고 있으나, 특정한 돌연변이 유형의 편집에 대해서는 여전히 뉴클레아제의 사용이 필요하다.
Wu Z, Zhang Y, Yu H, Pan D, Wang Y, Wang Y, Li F, Liu C, Nan H, Chen W et al. 2021. Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. Nat. Chem. Biol. 17(11):1132-1138.
Kim DY, Lee JM, Moon SB, Chin HJ, Park S, Lim Y, Kim D, Koo T, Ko JH, Kim YS. 2021. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nat. Biotechnol. 40(1):94-102.
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 CRISPR-Cas12f1 시스템을 기반으로 하여 미생물을 포함한 목적 대상의 유전체를 단일 뉴클레오타이드 수준에서 효율적으로 정교하고 용이하게 편집할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은, 표적 DNA와 상동성인 일부 뉴클레오타이드를 3′ 말단에서 5′ 말단 방향으로 일부 결실시킨 3′-절단(truncated) sgRNA(3′-절단 sgRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 시스템에, 표적 DNA와 상보적이지 않은 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이를 도입하였고, 그 결과, 상기 표적 DNA와 상동성인 sgRNA에서 이의 3′-말단의 4개 뉴클레오타이드가 결실(제거)되면 목적 대상(예컨대, 대장균)의 유전체를 단일 뉴클레오타이드 수준까지 정확하게 편집할 수 있을 뿐만 아니라, 점 돌연변이 도입 효율이 크게 향상됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated nuclease 12f1) 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하며, 상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 sgRNA (guide RNA, gRNA)의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "편집한다", "편집하는" 또는 "편집된"은 특정 게놈 표적을 선택적으로 결실시키거나, 외부로부터 공급된 DNA 주형을 사용하여 새로운 특정 서열을 포함시킴으로써 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열(예를 들면, 야생형 천연 생성 핵산 서열 또는 돌연변이된 천연 생성 서열)을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특정 게놈 표적은 염색체 영역, 미토콘드리아 DNA, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하나, 이들로 한정되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 용어 “유전체 교정(genome editing)”은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 DNA의 표적 부위에서의 Cas12f1 절단에 의한 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 편집, 회복, 수정, 상실 및/또는 변경시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "결실시킨다", "결실된", "결실시키는" 또는 "결실"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재(제거)하거나 부재하게 되는, 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로서 정의될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3'에서 5' 방향으로 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된(3'-절단(truncated)) 가이드 RNA는, 상기 표적 DNA에 상보적인 16 내지 20개의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하게 된다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 sgRNA의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된 sgRNA를 의미하는 3′-절단(truncated) sgRNA는, 상기 표적 DNA에 상보적인 16 내지 20개의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하며, 이러한 sgRNA를 포함하는 3'-절단 sgRNA가 오히려 CRISPR 시스템의 편집 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 결실된 뉴클레오타이드의 수는 제한되지 않으나, 바람직하게는, 결실된 뉴클레오타이드의 수는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개, 가장 바람직하게는 4개이다.
또한, sgRNA 상의 결실된 뉴클레오타이드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 가이드 RNA, 즉, 3′-절단(truncated) sgRNA 상의 결실되는 뉴클레오타이드의 위치는, sgRNA 상의 3′-말단으로부터 1 개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 이격된 바로 근접한 부위에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 3′-절단(truncated) sgRNA 상의 결실된 뉴클레오타이드 위치를 언급하면서 사용되는 용어“바로 근접한(immediately adjacent)”은, 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 sgRNA 상의 3′-말단 방향으로부터 인접(juxtaposition)한, 즉, 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에 위치하는 것을 의미한다.
용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas12f1 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas12f1 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 상기 가이드 RNA는 sgRNA, 즉, 3'-절단(truncated) sgRNA이다.
상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 사용될 수 있다.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
가이드 RNA는 RNA의 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "sgRNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas12f1 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas12f1 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다. 상기 sgRNA가 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 sgRNA라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 sgRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
sgRNA는 RNA의 형태 또는 sgRNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, sgRNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "3'-말단 절단(truncated) sgRNA" 또는 "3′-절단(truncated) sgRNA”는 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3′-말단으로부터 일부 뉴클레오타이드가 결실된 crRNA를 포함하는 sgRNA를 의미하며, 본 명세서에서 3'-절단(truncated) crRNA와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "공여 핵산 분자" 또는 “공여체 핵산 서열”은 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오티드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭한다.
이러한 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 바람직하게는, 상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본 발명에서 CRISPR-Cas12f1 시스템은 Class 2, Type V로 분류되는 CRISPR-Cas 시스템이다. 선행연구(Harrington et al., Science 362, 839-842 (2018))에서 최초로 고균 유래의 CRISPR-Cas 시스템인 CRISPR-Cas14 시스템에 대해 밝혀졌다. 그 후 후속 연구(Tautvydas Karvelis et al., Nucleic Acids Research 48, 5016-5023 (2020))에서 상기 CRISPR-Cas14 시스템을 CRISPR-Cas12f 시스템으로 분류하였다. CRISPR-Cas12f1 시스템은 상기 Class 2, Type V로 분류되는 CRISPR-Cas 시스템 중 하나의 올솔로그(ortholog)인 V-F1 시스템에 속하며, 이는 Cas14a를 이펙터 단백질로 가지는 CRISPR-Cas14a 시스템을 포함한다. 본 명세서에서 개시하는 CRISPR-Cas12f1 시스템은 CRISPR-Cas14a1 시스템에 관한 것으로, 명세서에 기재된 CRISPR-Cas12f1 시스템은 CRISPR-Cas14a1 시스템을 지칭하며, CRISPR-Cas12f1 시스템과 CRISPR-Cas14a1 시스템은 혼용되어 사용되며, 또한 CRISPR-Cas12f1 시스템은 CRISPR-Cas12f1(Cas14a1) 시스템 또는 CRISPR-Cas14a1 시스템으로도 지칭된다.
Cas12f1 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CRISPR-Cas12f1 시스템은 CRISPR-Cas9 시스템에 비하여 이펙터 단백질의 크기가 현저히 작다는 특징이 있다. 이러한 특징은 기존에 연구된 대부분의 Cas 뉴클레아제의 크기로 인한 AAV (아데노 관련 바이러스)에 탑재의 어려움 및 이로 인한 유전자 치료제로서 적용 어려움을 해결 가능하게 한다. 그러나, 이러한 장점에도 불구하고, 선행 연구들에서 밝혀진 바로는, 상기 CRISPR-Cas12f1 시스템은 세포 내에서 이중가닥 DNA에 대한 절단 활성을 보이지 않거나, 절단 활성을 보이더라도 그 효율이 매우 낮아 이를 적극적으로 유전자 편집에 활용하기 힘들다는 한계를 가지고 있다.
이에, 본 발명은 CRISPR-Cas12f1 시스템의 표적 핵산 또는 표적 유전자의 편집 또는 변형 효율을 증가시키기 위해 가이드 RNA(guide RNA)를 인위적으로 조작(절단)시킴으로써, 최적화된 guide RNA를 이용한 CRISPR- Cas12f1 시스템은 표적 핵산 또는 표적 유전자의 편집 또는 변형 효율을 증가시켰다.
본 발명의 CRISPR-Cas12f1 시스템에서 PAM(protospacer-adjacent motif)은 5′-TTN-3′ 염기(N은 임의의 뉴클레오타이드로서, A, T, G, 또는 C의 염기를 갖는 뉴클레오타이드임)이며, 상기 PAM 서열은 CRISPR-Cas12f1 시스템(또는 CRISPR-Cas14a1 시스템)의 Cas12f1(또는 Cas14a1) 단백질이 인식하는 서열이다.
본 발명에서, Cas12f1 단백질은 표적 핵산의 표적 부위 절단에 있어 우수한 활성을 나타내고 기존의 CRISPR-Cas9 시스템에 비하여 핵산분해 단백질의 크기가 1/3 정도로 현저히 작은 것을 특징으로 하는, 당업계에 공지된 Cas12f1 단백질 또는 이의 동족체 단백질 또는 이의 변이체 또는 이들을 포함하는 (소형) 엔도뉴클레아제, 즉, 자연계에서 발견되는 Cas12f1, 이의 변이체 또는 엔지니어링된 Cas12f1 변이체를 모두 포함한다.
상기 Cas12f1 변이체 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질과 동종의 기능을 가지거나, 상기 야생형의 Cas12f1 단백질과 비교할 때, 기능이 변경된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변경은 전부 또는 일부 기능의 변형, 전부 또는 일부 기능의 상실 및/또는 부가적인 기능의 추가를 포함한다. Cas12f1 변이체 단백질은 통상의 기술자가 초소형 유전자 편집 시스템의 핵산분해 단백질에 적용할 수 있는 변경이라면, 특별히 제한 없이 임의의 변경을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 Cas12f1 변이체 단백질은 DNA 이중가닥을 절단하는 활성뿐만 아니라, 단일가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA 및 RNA의 혼성 이중가닥을 절단하는 활성, 염기 교정 또는 프라임 교정을 수행하기 위한 것일 수 있다.
상기 표적 DNA는 상기 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면, DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입될 뿐이었다. 종래 CRISPR-Cas 시스템을 이용하는 경우에도 CRISPR- Cas의 불일치 허용으로 인해 단일 염기 점 돌연변이를 도입하는데 어려움이 있었다.
이에, 상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 3′-말단으로부터 일부 뉴클레오타이드를 결실시킨 3′-절단(truncated) sgRNA를 포함하는 CRISPR- Cas12f1 시스템에, 표적 DNA에서 단일 염기 불일치를 가지는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 위치 유도 돌연변이를 도입하였다.
그 결과, 상기 표적 DNA와 상동성을 갖는, 3′-말단으로부터 4 개 뉴클레오타이드를 결실시킨 3′-절단(truncated) sgRNA가 CRISPR-Cas12f1 시스템의 불일치 허용을 극복하여 이를 이용한 유전체의 단일 염기 편집(교정) 효율 및 정확도가 크게 향상되는 효과를 달성함을 규명하였다.
따라서, 본 발명의 방법에 따라 목적 대상체의 유전체를 효과적으로 단일 염기 단위로 정교하게 편집할 수 있음을 입증한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR- Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하며, 상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA는 이의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 CRISPR-Cas12f1 시스템에서 표적 유전자를 인식하나 선택된 표적 DNA 서열보다 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된 가이드 RNA인 3′-절단(truncated) sgRNA를 발현할 수 있는 구조물을 포함하며, 3′-절단(truncated) sgRNA 및 공여 DNA(예컨대, 올리고뉴클레오타이드)가 동시에 세포 내로 전달되고, Cas12f1 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 공여 DNA를 통해 표적 DNA 대신 돌연변이 서열을 포함하는 공여 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이 효율을 높일 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하며, 상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 상술한 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공한다:
(a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
(b) 상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜, 대상체의 표적 DNA를 편집하는 단계.
또한, 본 발명의 상기 CRISPR-Cas12f1 시스템은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 선별마커를 이용할 수 있다.
본 발명의 대상체는, 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드, 바이러스, 원핵 세포, 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체일 수 있다.
상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유 동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 Cas12f1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas12f1 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 것도 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 형질전환은 목적하는 유전자(핵산)를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공한다.
본 발명은 목적 대상의 유전체를 단일 염기 단위로 편집, 수선하는 방법에 관한 것으로서, 목표 유전자에 변이가 일어난 목적 대상, 예컨대, 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 코돈의 변화 등을 유발함으로써 유용 물질 등의 생산능을 최적화시킨 균주를 제작하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 3′-절단(truncated) sgRNA(single-molecular guide RNA)를 이용한 CRISPR-Cas12f1 시스템은 표적 DNA에 유의적인 유전체 단일염기 편집 효과를 달성하므로, 적용할 수 있는 CRISPR 시스템 선택의 폭을 넓혀주며, 이에 따른 유전자 교정으로 인해 생산성이 향상된 산업 균주로 상업적 이윤 창출, 장내 미생물 개량을 통한 공중보건의료분야 질 향상, GMO 이슈로부터 자유로운 농작물, 가축 품종 개량 등의 다양한 분야에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1A 내지 1C는 각각 CRISPR-Cas12f1 기반 유전체 편집을 위한 음성 선택(negative selection) 모식도(1A), 다양한 길이의 mutagenic oligonucleotide에 의한 편집 효율(1B) 및 실제 편집 후 서열 분석 결과(1C)를 나타낸 것이다.
도 2A 내지 2C는 CRISPR-Cas12f1의 sgRNA에 3'-절단을 도입한 모식도(2A), 3′-말단 절단 길이에 따른 단일 뉴클레오타이드 수준 편집 효율(2B) 및 실제 염기편집 후 서열분석 결과(2C)를 나타낸 것이다.
도 3A 및 3B는 대장균 유전체의 galK 유전자를 타겟으로 3'-절단 sgRNA를 사용한 단일 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실 편집 효율(3A) 및 편집 후 염기서열 분석 결과(3B)를 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 대장균 유전체의 xylB 유전자를 타겟으로 3'-절단 sgRNA를 사용한 단일 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실 편집 효율(4A) 및 편집 후 염기서열 분석 결과(4B)를 나타낸 것이다.
도 5A 및 5B는 단일 뉴클레오타이드 편집 시 mutagenic oligonucleotide 서열의 방향(5A)과 길이(5B)가 편집 효율에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2A 내지 2C는 CRISPR-Cas12f1의 sgRNA에 3'-절단을 도입한 모식도(2A), 3′-말단 절단 길이에 따른 단일 뉴클레오타이드 수준 편집 효율(2B) 및 실제 염기편집 후 서열분석 결과(2C)를 나타낸 것이다.
도 3A 및 3B는 대장균 유전체의 galK 유전자를 타겟으로 3'-절단 sgRNA를 사용한 단일 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실 편집 효율(3A) 및 편집 후 염기서열 분석 결과(3B)를 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 대장균 유전체의 xylB 유전자를 타겟으로 3'-절단 sgRNA를 사용한 단일 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실 편집 효율(4A) 및 편집 후 염기서열 분석 결과(4B)를 나타낸 것이다.
도 5A 및 5B는 단일 뉴클레오타이드 편집 시 mutagenic oligonucleotide 서열의 방향(5A)과 길이(5B)가 편집 효율에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. CRISPR-Cas12f1 음성 선택(negative selection) 및 oligonucleotide-directed mutagenesis 기반 유전체 편집
본 발명자들은 람다-레드 재조합 (lambda-red recombineering)을 통해 대장균 유전체에 Cas12f1 유전자를 삽입한 재조합 대장균 균주를 제작하였다 (E. coli MG1655 araBAD::P BAD -cas12f1-KmR)를 제작하였다. LB-Amp 고체배지에서 자라난 pKD46을 가지는 대장균 MG1655의 단일 콜로니를 Ampicillin이 50 ㎍㎖-1 농도로 첨가된 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, L-arabinose를 1 mM 농도가 되도록 첨가하여 3시간동안 pKD46 플라스미드의 람다-레드 재조합 효소를 과발현시켰다. 이후 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 및 10% glycerol 40 ㎖로 침전된 세포를 세척하는 작업을 두 번 반복하여 electrocompetent cell을 제작하였다.
p15a-AsCas12f-apmR (Addgene plasmid #171610)로부터 삽입할 cas12f1 유전자를 PCR로 증폭하고, 카나마이신 유전자와 함께 재조합을 위한 상동 서열을 갖도록 cas12f1-KmR 카세트를 PCR로 제작하였다. 상기의 람다-레드 재조합 효소가 과발현된 대장균 MG1655에 정제된 cas12f1-KmR 카세트를 삽입하여 L-arabinose에 유전자의 발현이 유도되는 프로모터의 뒷부분에 cas12f1-KmR 유전자가 위치한 HL061 균주를 제작하였다.
제작된 HL061 균주에 람다-레드 베타 단백질 발현 플라스미드를 삽입하고, 동일한 방법으로 람다-레드 베타 단백질과 Cas12f1 단백질이 과발현된 electrocompetent cell을 제조하였다.
제작된 Cas12f1 과발현 HL061 균주에 sgRNA plasmid를 삽입하면, 도 1A에 나타낸 바와 같이, sgRNA/Cas12f1 complex에 의해 sgRNA와 상보적인 표적 DNA 서열 타겟에 이중가닥 절단이 일어나고, 대장균의 경우 회복하는 시스템이 결여되어 세포가 사멸한다. 반면, 유전자 가위의 표적 DNA 서열에 올리고뉴클레오타이드에 의해 돌연변이가 도입된 경우, 돌연변이가 도입된 서열은 유전자 가위가 표적 DNA로 인식하지 못해 세포가 생존하는데 이를 음성선택(Negative selection)이라 하며, 목적 염기가 편집된 유전체를 선별할 수 있다.
본 발명자들은 MacConkey 선택 배지에서 자라난 콜로니의 표현형(white/red colonies)을 통해 목적 유전자의 편집을 확인할 수 있는 시스템을 구축하기 위해 Cas12f1 음성선택을 이용하여 mutagenic oligonucleotide를 이용한 단일 뉴클레오타이드 편집 가능 여부를 관찰하였다. Mutagenic oligonucleotide는 galK 유전자(NCBI accession no. 945358)의 504번 염기가 치환되도록 제작되었다. sgRNA 발현 플라스미드와 mutagenic oligonucleotide를 HL061에 전기 천공으로 삽입한 후 갈락토오스를 5 g/L로 첨가한 MacConkey 선택 배지에 도말한 후 30℃에서 배양하였다.
그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 2개 이상의 염기 편집의 경우에는 80% 이상의 높은 편집 효율을 보였으나, 단일 뉴클레오타이드 편집의 경우 12%의 편집 효율을 보였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, 선별한 흰색 콜로니를 Sanger 서열분석하여 실제 변이 결과를 관찰하였을 때, 2개 이상의 염기를 동시에 편집한 경우에는 대부분이 목적 염기만 정확하게 편집된 반면, 단일 뉴클레오타이드 편집에서는 10개의 흰색 콜로니 중 단 1개를 제외하고 90%의 흰색 콜로니에서 원치 않은 추가 변이가 관찰되었다. 추가적으로 mutagenic oligonucleotide를 넣지 않은 경우에도 표적 염기 외의 부정확한 돌연변이가 다수 발생하여 흰색 콜로니를 형성하였다. 결론적으로 Cas12f1을 이용한 음성선택은 2개 이상의 염기편집에는 효과적이나, 단일 뉴클레오타이드 편집의 효율 및 정확도가 매우 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 2. 3'-절단 sgRNA를 이용한 CRISPR-Cas12f1 기반 유전체 단일염기 편집
이전 연구들을 통해 Cas12f1 역시 Cas9, Cpf1과 마찬가지로 단일 뉴클레오타이드 편집 효율이 저조하여 유전자 편집 기술에 응용하는 데 한계가 있음이 밝혀졌다. 본 발명자들은, 이를 극복하기 위해, galK 유전자를 타겟으로 하는 sgRNA의 3'-말단을 1~5 nt만큼 제거함으로써, 단일 뉴클레오타이드 편집 효율을 향상시키고자 하였다(도 2A).
그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, sgRNA의 3'-말단을 3개 이하 nt 만큼 절단했을 때는 편집 효율이 40% 정도로 비교적 낮았으나, 절단시킨 nt가 4개 nt일 때는 80% 이상으로 크게 상승하였다. 3'--말단 절단 개수가 5개 nt 이상인 경우에는 CFU가 108/㎍DNA 수준으로 크게 상승하였는데, 이는 Cas12f1/3'-말단 5 nt 절단 sgRNA complex가 표적 DNA에 이중가닥 절단을 유발하지 못해 음성선택이 되지 않은 것으로 보인다.
또한, 도 2C에 나타낸 바와 같이, 염기 편집의 정확성을 확인하기 위해 편집 후 각각 4개씩의 흰색 콜로니에서 galK 유전자를 염기 서열 분석한 결과, sgRNA의 3'-말단 절단 개수가 3개 nt 이하일 때는 모두 표적 염기 이외의 추가적인 부정확한 변이가 관찰되었으나, 4개 nt일 때는 모든 흰색 콜로니에서 표적한 단일 뉴클레오타이드만 정확하게 바뀐 것을 확인하였다.
실시예 3. CRISPR-Cas12f1 3'-절단 sgRNA를 이용한 단일 뉴클레오타이드 InDel(insertion/deletion) 효율 확인
1~2개 뉴클레오타이드의 삽입/결실 변이는 유전자의 열린 번역틀이 어긋나는 frame shift를 일으켜서 세포의 표현형이나 physiology 등에 큰 영향을 미칠 수 있다. 이에, 본 발명자들은, 3'-절단 sgRNA/Cas12f1이 단일 뉴클레오타이드의 삽입/결실 편집 효율 향상에도 효과적인지 확인하였다. galK 유전자의 509번 뉴클레오타이드가 결실되거나 510번 위치에 단일 nucleotide의 삽입이 일어나면 galK 유전자의 frame shift가 일어나 각각 528, 639번 염기에서 stop codon이 발생하여 조기 번역 종료가 일어나 GalK 단백질이 정상적으로 합성되지 않으므로, 맥콘키 배지에서 흰색 콜로니를 형성한다.
상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 sgRNA의 3'-말단에 절단을 도입하여 음성선택한 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, 3개 nt 이하의 3'-말단 절단을 가지는 sgRNA 플라스미드를 사용하면 galK 유전자 510/509번 뉴클레오타이드의 삽입/결실 모두 30% 이하의 낮은 편집 효율을 보인 반면, 3'-말단 4 nt-절단 sgRNA 플라스미드를 사용한 경우, 편집 효율이 40% 이상으로 상승하였다.
또한, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 유전자 편집 후 생겨난 흰색 콜로니를 무작위로 골라 galK 유전자를 염기 서열 분석한 결과, 절반 이상의 콜로니에서 정확하게 목표한 위치에 구아닌만 삽입/결실된 것을 확인하였다.
실시예 4. 추가 타겟 유전자 편집을 통한 Cas12f1/3'-절단 sgRNA의 효과 검증
본 발명자들은, 3'-절단 sgRNA가 galK 유전자 외 다른 타겟에서도 효과적인지 확인하고자 xylB 유전자 (637-656th 염기)를 추가 타겟으로 설정하였다. 각각 643번 위치에 아데닌이 삽입되거나, 645번 아데닌이 결실되거나, 652번 아데닌이 티민으로 바뀌도록 편집하여 단일 뉴클레오타이드 수준의 삽입, 결실, 편집 효과를 모두 확인하였다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 세 가지 종류의 유전체 편집 모두 3'-말단 절단이 없는 sgRNA보다 3'-말단에 4 nt 절단을 도입한 sgRNA를 사용한 것이 더 높은 편집 효율을 보였다.
또한, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 유전자 편집 후 생겨난 흰색 콜로니의 xylB 타겟 서열 분석 결과에서도 정확하게 목표한 위치의 아데닌만 삽입/결실/편집된 것을 확인하였다.
이러한 결과들은, 본 발명의 CRISPR-Cas12f1 시스템에서 sgRNA의 3'-말단을 4 nt 절단했을 때, 단일 뉴클레오타이드 수준의 편집, 삽입 및 결실 등 음성선택을 이용한 유전체 편집에 가장 효과적이며, 타겟 유전자의 위치와 종류에 관계없이 공통적인 편집 효율 상승 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.
따라서, 본 발명의 CRISPR-Cas12f1 시스템을 기반으로 유전체를 단일 뉴클레오타이드 수준에서 편집하는 방법은 향후 의학, 농업 등 다양한 분야에 단일 뉴클레오타이드 편집이 적용되는 데 기초가 될 수 있는 중요한 정보를 제공한다.
Claims (11)
- 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated nuclease 12f1) 시스템 기반 유전체 편집 방법으로서,
상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3'-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 가이드 RNA는, 상기 표적 DNA에 상보적인 16 내지 20개의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)인 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 표적 DNA는 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
- 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물로서,
상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA는 이의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas12f1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물.
- 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법으로서,
상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함하는, CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법.
- 다음 단계를 포함하는, CRISPR-Cas12f1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법:
(a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
(b) 상기 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 3′-말단으로부터 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 결실된(truncated) 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜, 대상체의 표적 DNA를 편집하는 단계.
- 제10항의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체.
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