BR112013001685A2 - edição de genoma usando endonucleases alvos e ácidos nucleicos de fita única - Google Patents

Abstract

  EDIÇÃO DE GENOMA USANDO ENDONUCLEASES-ALVOS E ÁCIDOS NUCLEICOS DE FITA ÚNICA. A presente invenção fornece métodos e kits para editar sequências cromossômicas específicas em células. Em particular, endonucleases alvos e ácidos nucleicos de fita única são usados para editar a sequência cromossômica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "EDIÇÃO DE GENOMA USANDO ENDONUCLEASES-ALVOS E ÁCIDOS NUCLEICOS - DE FITA ÚNICA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS 5 Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US Nú- mero 61/410.124, depositado em 4 de Novembro, 2010, Pedido Provisório US Número 61/382-965, depositado em 15 de Setembro, 2010, e Pedido Provisório US Número 61/367.022, depositado em 23 de julho, 2010, cada um estando por este meio incorporado por referência em sua totalidade. 10 CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção geralmente se refere ao uso de endonucle- . . - ases-alvo e ácidos nucleicos de fita única para editar sequências cromossô-

Ç micas específicas. "" : ANTECEDENTCS DA INVENÇÃO 15 A engenharia de genoma lógica tem um enorme potencial em pesquisa básica, descoberta de drogas, e medicamentos baseados em célu- las. Muitos métodos existentes para o nocaute, mutagênese, ou integração do gene-alvo dependem da recombinação de homólogos. A baixa taxa de recombinação espontãnea em muitas células, bem como a escala de esforço 20 e tempo necessário para isolar o evento-alvo, no entanto, tem impedido o progresso neste campo de triagem. Desse modo, existe uma necessidade de uma tecnologia que pode rapidamente atingir a edição de genoma-alvo com precisão, eficiência e alta velocidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 25 Entre os diversos aspectos da presente descrição está o forne- cimento de um método para edição de pelo menos uma sequência cromos- sômica endógena em Llma célula. O método compreende introduzir na célula (i) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, em que a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma 30 ruptura de fita dupla em um sÍtio de clivagem-alvo na sequência cromossô- mica, e (ii) pelo menos um ácido nucleico de fita única que compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substanciai para a sequência m cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo, O método adicionalmente compreende manter a célula em condições de modo que a . ruptura de fita dupla introduzida por endonucleases-alvo seja reparada por um processo conduzido por homologia de modo que a sequência cromos- 5 sômica seja trocada com a sequência do ácido nucleico de fita única, editan- do desse modo a sequência cromossômica. Outro aspecto fornece um kit para editar uma sequência cro- mossômica em uma célula, O kit compreende (a) pelo menos uma endonu- clease--alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, em que a 10 endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sitio de clivagem-alvo na sequência cromossõmica, e (b) pelo menos um "- ácido nucleico de fita única que compreende uma primeira porção tendo i- . dentidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em -' .» pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo. 15 Outros aspectos e caracteristicas da descrição são descritos mais detalhadamente abaixo.

REFERÊNCIA ÀS FIGURAS COLORIDAS O depósito do pedido contém pelo menos uma fotografia execu- tada em cores. Cópias desta Publicação do Pedido de Patente com fotogra- 20 fias coloridas serâo fornecidas pelo Escritório, mediante sdicitação e paga- mento da taxa necessária.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 apresenta o projeto de oligonudeotídeos utilizados pa- ra modificar o locus de quinase RSK2. A sequência genômica de quinase 25 RSK2 tipo selvagem é apresentada na parte superior, com os sítios de liga- ção ZFN identificados. A sequência do oligonucleotídeo que abriga muta- ções específicas é apresentada na parte in'ferior. A figura 2 documenta a integração do sitio BamHl para o locus de quinase RSK2- "Poois" de células foram digeridos com BamHl e os frag- 30 mentos foram ressolvidos por eletroforese em gel. A figura 3 mostra clones de célula isolada única abrigando o sÍtio BamHI no locus de quinase RSK2. O locus RSK2 em clones individuais era

PCR amplificado e digerido com BamHL A figura 4 esquematiza o projeto dos oligonucleotideos usado

V para modificar o locus de AAVSI. A sequência genômica tipo selvagem é apresentada na parte superior, com os sÍtios de ligação ZFN AAVSI indica- 5 dos. As sequências de oligonucleotídeos de senso e antissenso que com- preendem um sÍtio são mostradas abaixo. A figura 5 ilustra a integração do sitio Hjnd||| para o locus A- AVSl. O painel superior mostra células entrando em contato com ZFN e oli- gonucleotídeo, e o painel inferior mostra células em contato com o oligonu- lO cleotídeo sozinho. Pools de células foram digeridos com Hindlll e os frag- mentos foram ressolvidos por eletroforese em gel. A figura 6 mostra clones de célula isolada única, abrigando o sÍ- . b tio da Hindlll no locus de AAVSI. O locus de AAVSI em clones individuais b -' . era PCR ampiificado e digerido com Hndlll. 15 A figura 7 ilustra a integração do sitio Hindlll para o Iocus AAVSI usando oligonucleotídeos de senso de comprimentos diferentes. O DNA ge- nômico dos pools de células foi PCR amplificado e digerido com Hindlll. Os números na parte superior referem-se à duração em nucleotídeos de cada do oKgonucleotídeos. M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, 20 sem controle ZFN), e Z representa o ZFN. A figura 8 mostra a integração do sítio Hindlll no locus de A- AVSl usando oligonucleotídeos antissense de comprimentos diferentes- O DNA genômico dos pools de células foi PCR amplificado e digerido com Hindlll. Os números na parte superior referem-se à duração em nucleotídeos 25 de cada oligonucleotÍdeo. M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN. A figura 9 mostra a integração do sÍtio Hindlll no locus de A- AVSl quando ZFNs foram liberados como mRNA ou DNA, em combinação com oligonucleotideos de comprimentos diferentes. O DNA genômico dos 30 pools de células foi PCR ampiificado e digerido com Hndlll. Os números na parte superior referem-se à duraçâo em nucleotídeos de cada oligonucleoti- deo. R significa o RNA, D significa DNA, M significa marcadores, G repre-

b senta o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.

A figura 10 mostra um ensaio de Cel-l de células que inclui o si- . tio de Hindlll no locus de AAVSI.

Os números ao longo da parte superior referem-se ao comprimento em nucleotídeos de cada oligonucleotÍdeo.

M

5 significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.

A figura 11 ilustra o uso de oIigonucleotideos homólogos versus não homólogos para a integração do sitio Hindlll no locus de AAVSI. 1, 8 senso, de fita única; 2, 9, antissenso, fita única; 3, 10, senso mais antissen-

lO so; 4 senso, fita única (2 x); 5, 11 fita dupla (pré-recozida); 6, 12 oIigonucleo- tídeo sozinho (sem ZFN), e 7 tipo selvagem. , "- A figura 12 ilustra a exclusão-alvo de DNA genômico de 0,1 a 100 kb em um locus especifico com ohgonucleotideos de DNA de fita única » P

"' . (SsODN) e ZFNS. 15 A figura 12A ilustra uma exclusão que é 5' para o sitio de cliva- gem ZFN.

A figura 12B ilustra uma exclusão que é 3 para o sÍtio de clivagem ZFN.

A região de ponto de extremidade distante da exclusão na sequência cromossômica é designada como I, e o sÍtio de ligação do ZFN perto do sÍtio de clivagem-alvo é designado como ll, O doador de ssODN compreende 20 uma região (designada como 1') que tem identidade de sequência para a re- gião do ponto de extremidade distante da exclusão e de uma região (desig- nada como ll) que tem identidade de sequência para o sÍtio de ligação do ZFN perto do sítio de clivagem-alvo.

A figura 13 retrata a confirmação do PCR da exclusão de DNA 25 genômico-alvo no locus de AAVSI em K562 com oligonucleotideos de fita única e ZFNs.

As rotas rotuladas como "1" usaram células K562 expostas para oligonucleotÍdeos e ZFN, e assim, os fragmentos PCR foram derivados do aleio de exclusão.

As rotas rotuladas como "2" usaram células K562 ex- postas apenas ao oligonucleotideo, mas sem ZFN e fragmentos de PCR re- 30 sultantes são do alelo tipo selvagem (sem exclusão). As rotas rotuladas co- mo "3" usaram células K562 expostas para ZFN apenas, e assim os produ- tos PCR indicaram os fragmentos dD alelo tipo seivagem também.

O tama-

W nho esperado dos fragmentos de PCR de alelo tipo seivagem e os fragmen- tos de PCR de alelo de exclusão apresentaram-se acima de cada grupo das rotas na figura 13 e que a exclusão de DNA genômico-alvo de cerca de 0,1 kb,0,5kb,1,Okb,1,5kb,2kb,2,5kb,3,Okb,3,5kb,4,Okb,4,5kb,5,Okb, 5 10,0 kb, 10,2 kb, 20,0 kb, 20,2 kb, 50 kb e 100 kb usando oligonucleotideos de fita única e ZFN foi apresentada e verificada. Entre os grupos de rotas, os grupos com um "*" indicaram a exclusão de "3" do sítio de corte ZFN; os grupos sem "*" indicaram a exclusão de 5' do sítio de corte de ZFN; o único grupo com duplo asterisco "**" indicou tanto a exclusão de 5' quanto de 3' do 10 sítio de corte ZFN. M significa marcador de DNA. A figura 14 apresenta a confirmação de PCR de exclusão de DNA genômico-alvo 5 kb no locus de AAVSI em diferentes tipos de células com oligonucleotídeos de fita dupla e fragmentos PCR de alelo ZFNS- A ex- . W " clusão em todas as amostras de células, incluindo células K562, HCT116, 15 U2OS, A549, HEK293, HepG2 e MCF7 têm o tamanho esperado de 303 bp. "1" representa "oligonucleotídeo + ZFN"; "2" representa "oligonucleotídeo apenas"; "3" representa "ZFN apenas"; e M significa marcador de DNA. O fragmento de PCR de alelo tipo selvagem esperado é 5303 bp e o fragmento de PCR de alelo esperado exclusão é 303, bp.

20 A figura 15 mostra a confirmação de PCR de exclusão de DNA genômico-alvo no locus IRK4, RSK2 e RSK4 em K562 com oligonucleotí- deos de fita única e ZFNS. Os fragmentos de PCR de alelo de exclusão em todas as amostras de células tem o tamanho esperado de 334 bp para o lo- cus IRAK4, 281 bp para o locus RSK2 e 190 bp para o locus RSK4, respec- 25 tivamente. "1" representa o "oligonucleotideo de + ZFN"; "2" representa o "oligonucleotÍdeo apenas"; "3" representa "ZFN apenas"; e M significa mar- cador de DNA A figura 16 ilustra um esquema exemplar para obter exclusões e inserções genômicas-alvo simultâneas em células com oligonucleotideos 30 SSDNA e ZFNS. A região do ponto de extremidade distante de exclusão é designada como |, e o sítio de ligação de ZFN perto do sítio de cIivagem-alvo é designado como ll- O doador de ssODN compreende uma região (desig-

nada como I') que tem identidade de sequência para a região do ponto de extrem idade distante de exclusão, uma região (designada como ll) que tem uma identidade de sequência para o ZFN ligando o sÍtio perto do sitio de cIivagem-alvo, e a sequência loxP (designada lil). O iniciador frontal (A) e o 5 iniciador reverso (B) flanqueiam as regiões I e || e podem ser usados para verificar a exclusão-alvo. O iniciador C compreende nucleotídeos no sítio de junção para o braço de ligação direito ZFN e o DNA genômico vizinho, de modo que o iniciador para o iniciador frontal (A) e o iniciador reverso C po- dem ser usados para verificar a inserção-alvo 10 A figura 17 mostra a verificação de PCR da exclusão-alvo da se- quência genômica de 5 kb que gerou um fragmento de PCR de 303 bp espe- rado do alelo de exclusão (Rota 6: AAVSI - ZFN e AAVSI - 5 kb SSODN) - utilizando os iniciadores A e B indicados na figura 16. A verificação do PCR

P "" da inserção-alvo de sitios loxP foi mostrada pelo fragmento de PCR com 15 tamanho esperado na rota 10 utilizando os iniciadores A e C. As rotas 1 e 2 representam marcadores de DNA: a rota 3 representa GFP; a rota 4 repre- senta AAVSI ZFN (mRNA) apenas; a rota 5 representa o doador do oligonu- cleotídeo apenas; a rota 6 representa o doador de oligonucleotídeo AAVSI ZFN +; a rota 7 representa GFP: a rota 8 representa AAVSI ZFN (mRNA); a 20 rota 9 representa o doador do oligonucleotídeo apenas; a rota 10 representa o doador de oligonucleotídeo AAVSI ZFN +. A figura 18 apresenta a sequência de junção 5' (SEQ ID NO: 29) e análise de sequências, confirmando a integração da sequência do doador na junção 5'. A sequência verde em destaque representa os iniciadores utili- 25 zados para amplificação por PCR (o menor caso não foi de resultados de sequenciamento), a sequência de letras negras representa a sequência de plasmideo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotideo; a se- quência em letras azuis representa a sequência de plasmídeo de camun- dongo Rosa26 no doador de oligonucleotideo; a sequência em letras verme- 30 lhas representa a sequência de AAVSI no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras cor de rosa representa a sequência de AAVSI no doa- dor de oligonudeotideo.

e

A figura 19 apresenta a sequência de junção 3' (SEQ ID NO: 30) e análise de sequências, confirmando a integração da sequência dos doado- . res na junção 3'. A sequência verde em destaque representa os iniciadores utilizados para amplificação por PCR (o menor caso não foi de resultados de

5 sequenciamento), as sequências de letras pretas representa a sequência de plasmídeo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotÍdeo; a se- quência em letras azuis representa a sequência de plasmídeo de camun- dongo Rosa26 no doador de oligonucleotideo; a sequência em letras verme- lhas representa a sequência de AAVSI no doador de oligonucleotídeo; a

10 sequência em letras cor de rosa representa a sequência de AAVSI no doa- dor de oligonucleotideo.

A figura 20 mostra que somente os clones (Z+O+D) expostos a dois ZFNS (Z), dois doadores de oIigonucleotideos (O), e um doador de . 0

" pIasmídeo (D) compreendiam o fragmento de PCR do sítio de junção 5' de 15 tamanho de 390 bp (figura 20A) e fragmento de PCR do sÍtio de junção 3' de tamanho de 309 bp (figura 20B) indicativo de integração de sequência do doador- A figura 21 mostra a relação da identidade de sequência do oli- gonucleotídeo (com a sequênciaalvo) e a eficiência da exclusão oligomedi-

20 ada-alvo de uma sequência genômica de 10 kb.

A eficiência da exclusão 10 kb foi medida por SYBR Green de PCR em tempo real. 1 = identidade 100%; 2 = identidade 98°/o; 3 = identidade 9Õ°/o; 4 = identidade 5O°/j; 5 = controle negativo, A figura 22 apresenta o esquema dos métodos de inserção de

25 plasmideo universal, mediados por oligonucleotÍdeos SSDNA e ZFNS.

Os ZFNS fazem rupturas de fita dupla (DSB). Os dois doadores de oligonucleo- tídeo então se iigam às extremidades de DSB usando as seções que são complementares ao sítio de corte ZFN.

A homologia nas extremidades 5' dos dois doadores do oligonucleotÍdeo para a sequência de estrutura principal do

30 plasmideo (universal ou não) em cada extremidade a sequência do plasmí- deo desejada provoca invasão em doadores de plasmideo- Quando DSB é ressolvido usando o plasmídeo do doador, a sequência desejada do pIasmi-

+ deo do doador é introduzida e inserida no sÍtio de corte de ZFN.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente descrição fornece métodos para edição de sequên- ãas cromossômicas endógenas usando endonucleases-alvo e ácidos nucle- 5 icos de fita única. Em particular, a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma mptura de fita dupla no sitio pretendido na sequência cromossômica, e o ácido nucleico de fita única compreende uma região tendo uma identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de ciivagem-alvo. A ruptura de fita dupla introduzida por en- lO donucleases-alvo é reparada por um processo de reparação conduzido por homologia usando o ácido nucleico de fita única, de modo que a sequência cromossômica é trocada com a sequência do ácido nucleico de fita única, editando desse modo a sequência cromossômica. A sequência cromossômi- . ca editada pode incluir uma inserção de pelo menos um nucleotideo, uma 15 exclusão de pelo menos um nucleotídeo, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo, ou combinações das mesmas- Além disso, são apresenta- dos kits com os reagentes apropriados para a edição de sequências cro- mossômicas usando os métodos divulgados neste documento. (I) Métodos para a edição de sequências cromossômicas 20 Um aspecto da presente descrição fornece um método para edi- tar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula. O método compreende introduzir na céiula (a) pelo menos uma endonuclease- alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, a endonuclease- alvo, sendo capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sítio de cli- 25 vagem-alvo na sequência cromossômica e (b) pelo menos um ácido nucleico de fita dupla que compreende uma sequência com uma identidade de se- quência para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sÍtio de clivagem-aívo de ácidos nucieicos. O método adicionalmente compreende manter a célula em condições de modo que a ruptura de fita dupla introduzi- 30 da por endonucleases-alvo seja reparada por um processo de reparação conduzido por homologia de modo que a sequência cromossômica seja tro- cada com a sequência de pelo menos um dos ácidos nucleicos de fita única,

editando desse modo a sequência cromossômica.

Os componentes do mé- todo são detalhados abaixo- . (a) Endonuclease-alvo O método compreende introduzir na célula pelo menos uma en- 5 donuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo.

Uma endonuclease-alvo é uma entidade que reconhece e liga uma sequência de DNA cromossômica de fita dupla específica e introduz uma ruptura de fita dupla em um sitio de clivagem-alvo na sequência cromossômica.

A endonu- clease-alvo pode ser uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína

10 projetada.

Como alternativa, a endonuclease-alvo não pode conter nenhuma proteína (por exemplo, uma ruptura de fita dupla de DNA-alvo induzindo um agente). O tipo de endonuclease-alvo pode e irá variar.

Em algumas mo- . " dalidades, as endonucleases-alvo podem ser uma nuclease de dedo de zin- 15 co.

Em outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser um meganuclea- se ou endonuclease homing.

Em ainda outras modalidades, a endonuclease- alvo pode ser uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALE). Em outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser uma nuclease especifica do sítio.

Cm ainda outras modalidades, a endonL|c1ease-a|vo pode ser uma

20 ruptura de fita dupla de DNA alvo artificial induzindo o agente- (i) Nuclease do dedo de zinco Em uma modalidade, a endonuclease-alvo introduzida na célula pode ser uma nuclease do dedo de zinco (ZFN). Normalmente, uma nuclea- se do dedo de zinco compreende um domínio de ligação de DNA (isto é, o

25 dedo de zinco) e um dominio de clivagem (ou seja, nuclease), os quais são descritos abaixo.

Dom/nio da liqação do dedo de zinco.

Os domínios de ligação do dedo de zinco podem ser projetados para reconhecer e associar-se a qualquer sequência de ácido nucleico de 30 escolha.

Vide, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nat.

Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann.

Rev.

Biochem. 70:313-340; lsalan et al. (2001) Nat.

Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr.

Opin.

Biotechnol. 12:632-

.b

637; Choo et al. (2000) Curr- Opin.

Struct.

Biol 10:411-416; Zhang et al-

. . (2000) J.

Biol Chem. 275 (43): 33850-33860; Doyon et'al. (2008) Nat.

Biote- chnol. 26:702-708; e Santiago et al. (2008) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 105:5809-5814. Um dominio de ligação do dedo de zinco engenheirado po- 5 de ter uma nova especificidade de Iigação comparada a uma proteina do dedo de zinco que ocorre naturalmente.

Métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a, projeto lógico e diversos tipos de seleção.

O pro- jeto lógico inclui, por exemplo, utilizar bancos de dados compreendendo se- quências de nucleotídeos duplas, triplas, e/ou quádruplas e sequências de 10 aminoácidos de dedo de zinco individuais, em que cada sequência dupla, tripla ou quádrupla está associada a uma ou mais sequências de aminoáci- dos de dedos de zinco, que se liga a uma sequência tripla ou quádrupla es- pecífica.

Vide, por exemplo, as Patentes US 6.453.242 e 6-534-261, as di- "." vulgações que são incorporadas por referência neste documento em sua

15 totalidade- Como um exemplo, o algoritmo descrito na Patente US 6.453.242 pode ser utilizado para criar um domínio de ligação do dedo de zinco para direcionar uma sequência pré-selecionada.

Métodos alternativos, tais como o projeto lógico, utilizando urna Tabela de códigos de reconhecimento não degenerada também podem ser usados para criar um dominio de Iigaçâo do 20 dedo de zinco para uma sequência-alvo especifica (Sera et al. (2002) Bio- chemistry 41:7074-7081). Ferramentas baseadas na web para identificar sÍtios-alvo potenciais em sequências de DNA e a criação de domínios de ligação de dedo de zinco podem ser encontradas em http://www.zincfingedools.org e http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/, respecti- 25 vamente (Mandell et al. (2006). Nuc.

Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007), Acid Res. 35:W599-W605). Um domínio de ligação de dedo de zinco pode ser criado para reconhecer e Iigar uma sequência de DNA que varia de cerca de 3 nucleotí- deos a cerca de 21 nucleotideos de comprimento, ou, preferencialmente, de 30 cerca de 9 a cerca de 18 nucieotideos de comprimento.

Em geral, os domi- nios de ligação de dedo de zinco de nucleases de dedo de zinco divulgados neste documento compreendem pelo menos três regiões de reconhecimento

: de dedo de zinco (isto é, os dedos de zinco). Em uma modalidade, o domínio

W de ligação de dedo de zinco pode incluir quatro regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em outra modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco pode incluir cinco regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em 5 outra modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco pode incluir seis regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Um domínio de ligação de de- do de zinco pode ser projetado para ligar a qualquer sequência de DNA-alvo adequada. Vide, por exemplo, Patentes US 6.607.882; 6-534.261 e

6.453.242, as divulgações que são incorporadas por referência neste docu- lO mento em sua totalidade. Métodos exemplares de selecionar uma região de reconheci- mento de dedo de zinco podem incluir imagem de fago e dois sistemas hí- bridos e são divulgados nas Patentes US 5.789,538; 5.925.523; 6.007.988; m " 6.013.453: 6,410.248; 6.140,466; 6.200.759, e 6.242.568; bem como WO 15 98/37186; WO 98/53057: WO 00/27878: WO 01/88197 e GB 2.338.237, ca- da um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua tota- iidade. Além disso, o aprimoramento de especificidade de ligação para do- minios de ligação de dedo de zinco tem sido descrito, por exemplo, no WO 02/077227. 20 Os domínios e métodos de ligação de dedo de zinco para o pro- jeto e construção de proteinas de fusão (e polinucleotÍdeos codificando as mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos em detalhes nas Publicações de Pedidos de Patentes US 20050064474 e 20060188987, cada qual incorporada por referência neste documento em 25 sua totalidade- Regiões de reconhecimento de dedo de zinco e/ou proteinas de dedo de zinco de múltiplos dedos podem ser ligadas usando sequências de ligante apropriadas, incluindo, por exemplo, ligantes de cinco ou mais aminoácidos de comprirnento. Vide, Patentes US 6-479-626; 6-903-185; e

7.153.949, as divulgações que sáo incorporadas por referência neste docu- 30 mento em sua totalidade, para exemplos não limitantes de sequências de ligante de seis ou mais aminoácidos de comprimento. O dominio de iigação de dedo de zinco aqui descrito pode incluir uma combinação de ligantes a-

: dequada entre os dedos de zinco individuais da proteína, Em algumas modalidades, a nuclease de dedo de zinco pode a- . dicionalmente incluir um sinal de localização nuclear ou sequência (NLS). Uma NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita o direcionamento da 5 proteína de nuclease de dedo de zinco no núcleo para introduzir uma ruptura de fita dupla na sequência-alvo no cromossomo. Os sinais de localização nuclear são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027. Don:únio de c/ivaqem. 10 Uma nuclease de dedo de zinco inclui também urn domínio de clivagem. Uma porção de dominio de clivagem de nuclease de dedo de zin- co pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. E- xemplos não limitantes de endonucleases a partir das quais um domínio de

W " cIivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitados a, as endonu- 15 cleases de restrição e endonucleases homing. Vide, por exemplo, 2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass: e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388 ou www.neb.com. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease Sl; nuclease mung bean; DNase I pancreática; nuclease micrococcal; endonuclease de levedura HO). 20 Vide também Linn et al. (eds-) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993- Uma ou mais desfas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem. Um domínio de clivagem também pode ser derivado de uma en- zima ou parte da mesma, como descrito acima, que requer dimerização para 25 atividade de chvagem. Duas nucleases de dedo de zinco podem ser neces- sárias para a clivagem, quando cada nuclease compreende um monômero " do dimero de enzima ativo. Alternativamente, uma nuclease de dedo de zin- cq única pode incluir dois monômeros para criar um dímero de enzima ativo. Como usado neste documento, um "dimero de enzima ativo" é um dímero de 30 enzima capaz de realizar clivagem de uma molécula de ácido nucleico. Os dois monômeros de cIivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos dos mesmos), ou cada monômero pode ser derivado de uma

: endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais respectivos). Quando dois monômeros de clivagem são usados para formar um dímero de enzima ativo, os sítios de reconhecimento para as duas nu- cleases de dedo de zinco de preferência são descartados de modo que a 5 ligação de duas nucleases de dedo de zinco para seus respectivos sÍtios de reconhecimento coloque os monômeros de cIivagem em uma orientação espacial entre si que permite que os monômeros de clivagem formem um dimero de enzima ativo, por exemplo, por dimerização- Como resultado, as extremidades perto dos sitios de reconhecimento podem ser separadas por 10 cerca de 5 a cerca de 18 nucleotídeos. Por exemplo, as extremidades pró- ximas podem ser separadas por cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 de nucleotideos. No entanto, será entendido que qualquer nú- mero inteiro de pares de nucleotídeos ou nucteotídeos pode intervir entre os r " dois sitios de reconhecimento (por exemplo, de aproximadamente 2 a cerca 15 de 50 pares de nucleotídeos ou mais). As extremidades perto dos sítios de reconhecimento de nucleases de dedo de zinco, como por exemplo, aquelas descritos em detalhes neste documento, podem ser separadas por 6 nucleo- tídeos. Em geral, o sitio de clivagem situa-se entre os sÍtios de reconheci- mento. 20 As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão pre- sentes em muitas espécies e são capazes de ligar a sequência específica ao DNA (em um sitio de reconhecimento) e clivagem de DNA em ou perto do sÍtio da Iigação- Determinadas enzimas de restrição (por exemplo, tipo llS) clivam o DNA em sÍtios retirados do sítio de reconhecimento e tem dominios 25 de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima do tipo ns Fokl catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotideos do seu sitio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu sítio de reconheci- mento do outro. Vide, por exemplo, Patentes US 5.356.802; 5.436.150 e

5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275- 30 4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol Chem. 269:31, 978-31, 982. Desse modo, uma nuclease do dedo de zinco

: pode compreender o domínio de clivagem de pelo menos uma enzima de restrição do tipo llS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que . podem ou não podem ser projetados.

As enzimas de restrição do tipo llS exemplares são descritas, por exemplo, na Publicação lnternacional WO

5 07/014.275, cuja descrição é incorporada por referência neste documento em sua totalidade.

As enzimas de restrição adicionais também contêm a li- gação separável e dominios de clivagem, e estas também são contempladas pela presente descrição.

Vide, por exemplo, os ácidos nucleicos de Roberts et al. (2003) Res. 31:418-420. 10 Uma enzima de restrição do tipo llS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fokl.

Esta enzima especifica é ativa como um dímero (Bitinaite et al. (1998) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 95:10, 570-10, 575). Desse modo, para efeitos da presente descrição, a por- . e . ção da enzima Fokl usada em uma nuclease de dedo de zinco é considera-

15 da um monôrnero de clivagem.

Assim, para a clivagem de fita dupla-alvo usando um dominio de clivagem de Fokl, duas nucleases de dedo de zinco, cada uma contendo um monômero de clivagem de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um dimero de enzima ativo.

Alternativamente, uma molécu- la de polipeptídeo único que contém um domínio de ligação de dedo de zin-

20 co e dois monômeros de clivagem de Fokl também pode ser Llti|izada.

Em determinadas modalidades, o domínio de clivagem pode compreender um ou mais monômeros de clivagem engenheirados que mi- nimiza ou previne a homodimerização, conforme descrito, por exemplo, nas Publicações de Patentes US 20050064474, 20060188987, e 20080131962,

25 cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

Por meio de exemplo não limitante, resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484. 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fokl são todos os destinos para influenciar a dimeri- zação de dominios de meia clivagem de Fokl.

Monômeros de clivagem en-

30 genheirados exemplares de Fokl que formam heterodimeros obrigatórios incluem um par no qual um primeiro monômero de cIivagem inclui as muta- ções nas posições de resíduo de aminoácido 490 e 538 de Fokl e um se-

.

gundo monômero de clivagem que inclui as mutações nas posições de resí- duo do aminoácido 486 e 499. . Desse modo, em uma modalidade, uma mutação na posição do aminoácido 490 substitui Glu (E) por Lys (K); uma mutação no resíduo de 5 aminoácido 538 substitui Iso (!) por Lys (K): uma mutação no resíduo de a- minoácido 486 substitui Gln (Q) por Glu (E): e uma mutação na posição 499 substitL1i lso (I) por Lys (K). Especificamente, os monômeros de clivagem engenheirados podem ser preparados por posições mutantes 490 de E a K e 538 de I a K em um monõmero de clivagem para produzir um monômero de 10 clivagem engenheirado designado "E490K:I538K" e por posições mutantes 486 de Q a E e 499 de ) a L em outro monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagern engenheirado designado "Q486E:1499L". Monô- meros de cIivagem engenheirados acima descritos são mutantes de hetero- . " dímero obrigatórios em que clivagem aberrante é minimizada ou abolida. 15 Monômeros de clivagem engenheiros podem ser preparados utilizando um método apropriado, por exemplo, por mutagênese conduzida por sÍtio de monômeros de clivagem do tipo selvagem (Fokl), conforme descrito na Pu- blicação de Patente US 20050064474. (ii) Outras endonucleases-alvos 20 Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma me- ganuclease. Meganucleases são endodesoxirribonucleases, caracterizadas por um sítio de reconhecimento grande, isto é, o sÍtio de reconhecimento geralmente varia de aproximadamente 12 pares de bases a cerca de 40 pa- res de bases. Como uma consequência deste requisito, o sítio de recorihe- 25 cimento geralmente ocorre apenas uma vez em qualquer genoma determi- nado. Entre meganucleases, a família LAGLIDADG de endonucleases ho- ming tornou-se uma ferramenta valiosa para o estudo de genomas e enge- nharia do genoma. Meganucleases podem ser direcionadas para a sequên- cia cromossômica específica, modificando sua sequência de reconhecimento 30 usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma nucle- ase efetora tipo ativador de transcrição (TALE). TALEs são fatores de trans-

crição de patógeno vegetal Xanthomonas que podem ser facilmente projeta- dos para Iigar novos-alvos de DNA TALES ou versões truncadas das mes- mas podem estar ligados ao domínio catalitico de endonucleases como Fokl para criar a endonuclease-alvo denominada nucleases TALE ou TALENS. 5 Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma nucle- ase especifica por sítio.

Em particular, uma nuclease especifica por sÍtio po- de ser uma endonuclease "raro cortador" cuja sequência de reconhecimento ocorre raramente em um genoma.

De preferência, a sequência de reconhe- cimento, da nuclease específica por sítio ocorre somente uma vez em um 10 genoma.

Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma ruptu- ra de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente (também denomina- da cortante de DNA de restrição artificial). Por exemplo, a ruptura de fita du- . F

" pla-alvo artificial em DNA induzindo agente pode incluir um complexo de me- 15 tal/quelante complexo que cliva o DNA de pelo menos um oligonucleotideo complementar para o sÍtio de clivagem-alvo.

A ruptura de fita dupla-alvo arti- ficial em DNA induzindo agente, portanto, não contém qualquer proteína, o metal do complexo de metal/quelante pode ser cério, cádmio, cobalto, cro- mo, cobre, ferro, magnésio, manganês, zinco e similares.

O quelante do 20 complexo de metal/quelante pode ser EDTA, EGTA, BAPTA e similares.

Em uma modaíidade preferida, o complexo de metal/quelante pode ser Ce(lV)/EGTA.

Em outra modalidade preferida, a ruptura de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente pode incluir um complexo de Ce(lV)/EGTA e duas vertentes de ácidos nucleicos de peptídeo pseudo- 25 complementar (PNAs) (Katada et al., Current Gene Therapy, 2011, 11(1): 38-45). (iii) Ãcidos nucleicos codificando a endonudease-alvo Em algumas modalidades, a endonuclease-alvo pode ser intro- duzida na célula como um ácido nucleico, em que a célula então exprime e 30 produz a endonudease-alvo- O ácido nucleico codificando a endonudease- alvo pode ser DNA ou RNA.

O RNA pode ser RNA mensageiro, e o mRNA pode ser 5' capeado, poliadenilado, ou ambos.

Em geral, o ácido nucleico codificando a endonudease-alvo será operavelmente associado a uma regi- .

ão de controle do promotor. A região de controle pode ser constitutiva ou induzivel. O ácido nucleico codificando a endonudease-alvo (e sua região de controle ligada) pode ser introduzido na célula como um vetor tal como um 5 plasmídeo ou sirnilares. Alternativamente, o ácido nucleico codificando a en- donuclease-alvo (e sua região de controle ligada) pode ser introduzido na célula como uma molécula linear. (b) Ácidos nucleicos de fita única i Propriedades qerais 10 O método adicionalmente compreende a introdução de pelo me- nos um ácido nucleico de fita única conipreendendo uma região tendo iden- tidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sÍtio de clivagem-alvo na célula. Em algumas modalida- . " des, um ácido nucleico de cadeia dupla é introduzido na célula. Em outras 15 modalidades, dois ácidos nucleicos de fita única são introduzidos na célula. Em outras modalidades, três ou mais ácidos nucleicos de fita única são in- troduzidos na célula. A frase "identidade de sequência substancial" significa que o oli- gonucleotideo tem pelo menos cerca de 75% de identidade de sequências- 20 alvo para a sequência cromossômica. Em algumas modalidades, o oIigonu- cleotideo possa ter cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80°6, 81°/,, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87°6, 88°/õ, 89%, 90°/o, 91 °/), 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97°/o, 98°/o ou 99% de identidade de sequência com a sequênda-alvo cromossômica- Além disso, o ácido nucleico de fita única geralmente tem 25 identidade de sequência substancial de pelo menos cerca de 10 nucleotí- deos em pelo menos um Iado do sitio de ciivagem-alvo. Em alguma modali- dade, o ácido nucleico de fita única pode ter identidade de sequência subs- tancial de cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nudeotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotideos, cerca de 30 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou mais de 100 nudeotídeos em pelo menos um lado do sÍtio de clivagem-alvo. O comprimento dos ácidos nucleicos de fita única que são intro-

.

' duzidos na célula pode e irá variar. Por exemplo, os ácidos nucleicos de fita única podem variar de cerca de 20 nucleotídeos de comprimento até cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento. Em diversas modalidades, o ácido nucleico de fita única pode variar de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 5 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 1000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 100.000 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 100.000 nu- cleotídeos a cerca de 200,000 nucleotídeos de comprimento. 10 Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de fita única po- dem ser lineares- Em outras modahdades, os âcidos nucleicos de fita única podem ser circulares (por exemplo, preparados pelos métodos de fagos co- . nhecidos por aqueles versados na técnica). O ácido nucleico de fita única . W " pode ser senso ou antissenso em relação à sequência cromossômica de 15 interesse. . A composição dos ácidos nucleicos de fita única pode e irá vari- ar. Os nucleotídeos do ácido nucleico podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos Os nucleotideos podem ser nucleotídeos padrão (ou seja, adenosina, guanosina citidina, timidina e uridi- 20 na) ou análogos de nucleotideo. Um análogo de nucleotídeo refere-se a um nucleotídeo tendo uma base de purina ou pirimidina ou uma porção de ribo- se modificada. Um análogo de nucleotídeo pode ser um nucleotideo de ocor- rência natural (por exemplo, inosina) ou um nucleotídeo de ocorrência não natural. Exemplos não limitantes de modificações nas porções de açücar ou 25 base de um nucleotídeo incluem a adição (ou remoção) de grupos acetila, grupos amino, grupos carboxila, grupos carboximetila, grupos hidroxila, gru- pos metila, grupos fosforila e grupos tiol, bem como a substituição dos áto- mos de carbono e nitrogênio dessas bases com outros átomos (por exemplo, deaza-7 purinas)- Análogos de nucleotideo também incluem dideóxi nucleo- 30 tídeos, 2'-O-metil nucleotídeos, ácidos nucleicos travados (LNA), ácidos nu- cIeicos de peptídeo (PNA), e morfolinos. Os nucleotídeos dos ácidos nuclei- cos de fita única podem estar ligados por ligações de fosfodiéster, fosfotioa-

.

" to, fosforamidita, fosforodiamidato ou combinações das mesmas- Em modalidades preferenciais, o ácido nucleico de fita única compreende desoxirribonucleotideos. (ii) Ácidos nucleicos de fita única preferidos 5 Em uma modalidade, o ácido nucleico de fita única pode incluir uma primeira região com a identidade de sequência substancial para a se- quência cromossômica no lado a montante do sitio de clivagem-alvo e uma segunda região com a identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica no lado a jusante do sÍtio de clivagem-alvo (por exemplo, vide 10 figura 1 e figura 4). Em diversas iterações desta modalidade, o ácido nuclei- co de fita única adicionalmente pode compreender uma alteração de pelo menos um nucleotideo em relação à sequência cromossômica. Por exemplo, o ácido nucleico de fita única incluirá, geralmente, uma substituição de pelo . a menos um nucleotídeo, uma exclusão de pelo menos um nucleotídeo, uma 15 inserção de pelo menos um nucleotideo, ou combinações das mesmas. Em diversas iterações, o ácido nucleico de fita única pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais alterações de nucleotídeos. Como conse- quência dessas alterações de nucleotídeos, a sequência cromossômica edi- tada pode compreender uma sequência alterada ou uma pequena mutação 20 de modo que um produto do gene modificado seja produzido, nenhum pro duto de gene seja produzido, etc. Em uma modalidade altemativa, o ácido nucleico de fita única pode incluir uma sequência exógena que é flanqueada pelas primeira e se- gunda regiões que têm identidade de sequência substancial para o outro 25 iado do sítio de clivagem-alvo (como detalhado acima). Consequentemente, a sequência cromossômica editada pode compreender uma sequência de ácido nucleico exógena integrada. Como usado neste documento, o termo "exógena" se refere a qualquer sequência que não é normalmente localizada na localização cromossômica. Por exemplo, a sequência exógena pode ser 30 um "gene" de outro organismo, uma cópia adicional de um "gene" do mesmo organismo, uma sequência artificial, uma sequência de codificação de uma molécula repórter, e assim por diante.

- . Em outra modalidade, o ácido nucleico de fita única pode incluir uma primeira região com identidade de sequência substancial para a se- quência cromossômica em um lado do sÍtio de clivagem-alvo e uma segunda região com identidade de sequência substancial para uma sequência cro- 5 mossômica que é distal ao sÍtio de clivagern-alvo (vide figura 12). A sequên- cia cromossômica distal pode estar a montante ou a jusante do sÍtio de cli- vagem-alvo; e a sequência cromossômica distal pode ser localizada por cer- ca de 20 pares de bases, cerca de 1.000.000 de pares de bases fora do sÍtio de clivagem-alvo. Por exemplo, a sequência cromossômica distal pode ser 10 de cerca de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 ou 1.000 pares kilobase (a mon- tante ou a jusante) do sÍtio de clivagem-alvo. Consequentemente, a sequên- cia cromossômica editada pode incluir uma exclusão de até cerca de

1.000.000 pares de bases- Em uma iteração desta modalidade, o ácido nu- . cleico de fita única podem incluir uma primeira região com identidade de se- 15 quência substancial para o Iado de jusante do sitio de clivagem-alvo e uma 0 segunda região com identidade de sequências substancial para uma se- quência cromossômica distal que está localizada a montante do sitio de cli- vagem-alvo, em que editado maio cromossômico compõem uma exclusão a montante (ou 5') em relação ao sítio de clivagem-alvo. Em outra iteração 20 desta modalidade, o ácido nucleico de fita única podem incluir uma primeira região com identidade de sequência substancial para o lado a montante do sÍtio de clivagem-alvo e uma segunda região corn substancial de sequências de identidade para uma sequência cromossômica distal que está localizada a jusante do sÍtio de clivagem-alvo, em que a sequência cromossômica edi- 25 tada pode compreender uma exclusão a jusante (ou 3') em relação ao sitio de clivagem-alvo. Em outra modalidade, o ácido nucleico de fita única pode incluir uma sequência exógena que é flanqueada por uma primeira região com i- dentidade de sequência substancial para a sequência cromossôm ica em um 30 lado do sÍtio de clivagem-aivo e uma segunda região com identidade de se- quência substancial para uma sequência cromossômica que é distal ao sitio de clivagem-alvo (como detalhado acima). Na presente modalidade, a se-

.

quência cromossôniica editada pode compreender uma exclusão, bem como a integração da sequência exógena no sítio de clivagem-alvo (vide figura 16). A identidade da sequência exógena pode e irá variar. Por exemplo, a sequência exógena pode ser um "gene" de outro organismo, uma cópia adi- 5 cional de um "gene" do mesmo organismo, uma molécula repórter, e assim por diante. (c) Polinucleotideo doador opcional Em determinadas modalidades, o método adicionalmente com- preende a introdução de pelo menos um polinucleotideo doador para a célu- lO la. O polinucleotideo doador compreende uma sequência para a integração na sequência cromossômica no sitio de clivagem-alvo, onde a sequência para integração é flanqueada por uma primeira sequência e uma segunda sequência, cada um dos quais tem uma identidade de sequência substancial "." para uma porção de um ácido nucfeico de fita única. Desse modo, o polinu- 15 cIeotídeo dador é introduzido juntamente com um primeiro ácido nucleico de . fita única e um segundo ácido nucleico de fita única (e pelo menos uma en- donuciease-alvo). O primeiro ácido nucleico de fita única compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para o Iado a montante do sÍtio de clivagem-alvo e uma segunda porção com identidade 20 de sequência substancial para a primeira sequência no polinucleotideo doa dor. O segundo ácido nucleico de fita única compreende uma primeira por- ção tendo identidade de sequência substancial para o Iado de jusante do sÍtio de clivagem-alvo e uma segunda porção com identidade de sequência substancial para a segunda sequência no polinucleotídeo doador.

25 O poIinucleotídeo doador pode incluir desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotideos modificados, análogos de nucleotídeos, e similares. Além disso, o polinucleotideo doador pode ser circular ou linear. Normalmente, o polinucleotídeo doador será o DNA- Por exemplo, o polinu- cleotideo doador pode ser um plasmídeo de DNA, um cromossomo bacteri- 30 ano artificial (BAC), um cromossomo de levedura artificial (YAC), um vetor viral, e assim por diante. O polinucleotídeo doador adicionalmente pode compreender uma origem de replicação, um marcador de seleção, um sítio

' de clonagem múltipla, e assim por diante. O tamanho do polinucleotideo do- r ador pode e irá variar. Por exemplo, o nucleotídeo doador pode variar de cerca de 1 kilobase (kb) a cerca de 200 kb. Em uma modafidade, o pohnu- cleotídeo doador pode compreender cerca de 100 kb de sequências exôni- 5 cas e intrônicas de uma sequência de DNA humana codificando uma proteí- na de interesse- (d) Células O método compreende a introdução de moléculas e ácidos nu- cleicos de endonuclease-alvo descritos acima em uma célula. Uma varieda- lO de de células é adequada para uso no método. Em geral, a célula será uma célula eucariótica ou um organismo de uma única célula eucariótica- Em al- guns casos, a célula pode ser uma célula cultivada, uma célula primária ou uma célula imortal. Células adequadas incluem fungos ou Ieveduras tais co- . . mo Pichia, Saccharomyces, ou Schizosaccharomyces; células de msetos, - 15 tais como células SF9 de Spodoptera frugiperda ou células S2 de Drosophi/a me/anogasteg e células animais, tais como camundongo, rato, hamster, pri-

W matas não humanos, ou células humanas, Células exemplares são de mamí- feros. As células de marníferos podem ser células primárias. Em geral, pode ser usada qualquer célula primária que é sensível a rupturas de fita dupla.

20 As células podem ser de uma variedade de tipos de células, por exemplo, fibroblasto, mioblasto, células T ou B, macrófagos, células epiteliais, e assim por diante. Quando linhagens de células de mamíferos são usadas, a Iinha- gem de célula pode ser qualquer linhagem de célula estabelecida ou uma 25 linhagem de células primárias ainda não descrita. A linhagem de célula pode estar aderente ou não aderente, ou a linhagem de célula pode ser cultivada sob condições que incentivam o crescimento aderente, não aderente ou or- ganotípico usando técnicas padrão conhecidas para as pessoas versadas na técn ica. Exemplos não limitantes de linhagens celulares de mam íferos ade- 30 quadas incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), linhagem de CVl de rim de macaco transformado pelo SV40 (COS7), linhagem de rim embrionário humano 293, células de rim de hamster bebê (BHK), células de sertoli de camundongo (TM4), células de rim de macaco (CVl-76), células de 0 rim de macaco verde africano (VERO), células de carcinoma cervical huma- no (HeLa), células de rim canino (MDCK), células do fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de figado humanas 5 (Hep G2), células de tumor mamário de rato (MMT), células de hepatoma de rato (HTC), células HIH/3T3, células humanas de osteossarcoma de U2-OS, células A549, células K562, células humanas HEK293, células humanas HEK293T, células humanas HCT116, céiulas MCF-7 e células TRI.

Para uma extensa Iista de linhagens de células de mamíferos, os versados na 10 técnica podem referir-se ao catálogo American Type Culture Collection (ATCC®, Mamassas, VA). Em ainda outras modalidades, a célula pode ser uma célula- tronco.

Células-tronco apropriadas incluem, sem limite, células-tronco embri- . " onárias, células-tronco embrionárias tipo ES, células-tronco fetais, células- 15 tronco adultas, células-tronco pluripotentes, células-tronco pluripotentes in- . duzidas, células tronco multipotentes, células-tronco oligopotentes e células- tronco unipotentes.

Em outras modalidades, a célula pode ser um embrião de uma célula.

O embrião pode ser um vertebrado ou um invertebrado.

Vertebrados 20 adequados incluem mamiferos, aves, répteis, anfíbios e peixes- Exempios de mamíferos adequados, sem Iimite, roedores, animais domésticos, animais e não primatas.

Exemplos não limitantes de roedores incluem camundongos, ratos, hamsters, gerbils e cobaias.

Animais domésticos apropriados incluem, mas não estão limitados a, gatos, cães, coelhos, ouriços e furões.

Exemplos 25 não limitantes de gado incluem cavalos, caprinos, ovinos, suinos, bovinos, lhamas e alpacas.

Não primatas adequados incluem, mas não estão limita- dos aos macacos-prego, os chimpanzés, lêmures, macacos, saguis, micos, macacos-aranha, macacos-esquilo e macacos vervet.

Exemplos não limtan- tes de aves de galinhas, perus, patos e gansos.

Alternativamente, o animal 30 pode ser um invertebrado como um inseto, um nematódeo, e similares.

E- xemplos não limitantes de insetos incluem Drosophi/a e mosquitos. (e) Liberação para a célula

As moléculas e ácidos nucleicos de endonuclease-alvo descritos acima podem ser introduzidos na célula por diversos rneios.

A liberação a- dequada significa incluir a microinjeção, eletroporação, sonoporação, bioba- lística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiônica,

5 transfecção de lipossomas, transfecção de dendrímeros, transfecção de choque térmico, transfecção de nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção óptica, absorção aprimorada pelo próprio agente de ácidos nucleicos e liberação através de Iipossomas, imunolipossomas, virossomas ou vÍrions artificiais.

Em uma rnodalidade, a endonuclease-alvo

10 pode ser introduzida em uma célula, por nucleofecção, moléculas e ácidos nucleicos.

Em outra modalidade, as moléculas e ácidos nucleicos de endo- nuclease-alvo podem ser introduzidos na célula (por exemplo, um embrião de uma célula) por microinjeção.

As moléculas e ácidos nucleicos de endo- . . nudease-alvo podem ser injetados no núcleo ou no citoplasma da célula. . 15 Em modalidades em que mais do que uma moiécula de endonu- dease-alvo e mais um ácido nucleico de fita única são introduzidos em uma célula, as moléculas podem ser introduzidas simultaneamente ou sequenci- almente.

Por exemplo, as moléculas de endonudease-alvo, cada específico para um sitio de cIivagem-alvo, bem como o ácido nucleico de fita única cor-

20 respondente, pode ser introduzido ao mesmo tempo- Alternativamente, cada molécula de endonudease-alvo, assim como o ácido nucleico de fita única correspondente, pode ser introdLlzida sequencialmente.

Os polinucleotídeos doadores opcionais podem ser introduzidos da mesma forma.

A relação entre as moléculas de endonudease-alvo para um áci- 25 do nucleico de fita única pode e irá variar.

Em geral, a razão das moléculas de endonudease-alvo para ácidos nucleicos pode variar de cerca de 1:10 a cerca de 10:1. Em diversas modalidades, a razão entre as moléculas de en- donudease-alvo para ácidos nucleicos pode ser de aproximadamente 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou

30 10:1. Em uma modalidade, a razão pode ser de cerca de 1:1. (f) Cultivo de céiula O método adicionalmente compreende manter a célula em con-

' dições adequadas, de modo que a ruptura de fita dupla introduzida por en- donudease-aivo possa ser reparada por um processo conduzido por homo- logia usando o ácido nucleico de fita única, de modo que a sequência cro- mossômica seja editada. Em modalidades em que o ácido nucleico codifi- 5 cando endonuclease-alvo de codificação é introduzido na célula, o método compreende manter a célula em condições adequadas, de modo que a célu- la exprima a endonudease-alvo. Em geral, a célula será mantida em condições adequadas para a célula. Condições de cultivo de célula adequadas são bem conhecidas na 10 técnica e são descritas, por exemplo, em Santiago et al. (2008) 105:5809- 5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; e Lombardo et al- (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. Os versados na técnica apreciam que os métodos de cultivo de células são co- . . r nhecidos na técnica e podem e irão variar dependendo do tipo de celula. A 15 otimização de rotina pode ser usada em todos os casos, para determinar as

P melhores técnicas para um tipo específico de célula- As modalidades em que a célula é um embrião de uma célula, o embrião pode ser cultivado in vitro (por exemplo, em cultivo de células). Normalmente, o embrião é cultivado em uma temperatura adequada e nos 20 meios de comunicação adequados com a razão necessária O2/CO2 para permitir o reparo da ruptura de fita dupla e permitir o desenvolvimento do embrião. Exemplos não limitantes adequados de meio incluem meio M2, M16, KSOM, BMOC e HTF. Um versado na técnica apreciará que condições de cultivo podem e irão variar dependendo da espécie do embrião, A otimi- 25 zação de rotina pode ser usada em todos os casos, para determinar as me- Ihores condições de cuitivo de uma determinada espécie de embrião. Em alguns casos, o embrião também pode ser cultivado in vivo através da trans- ferência do embrião no útero de um hospedeiro feminino. De um modo geral o hospedeiro feminino é da mesma espécie ou similar tal como o embrião.

30 De preferência, o hospedeiro feminino está com pseudogravidez. Métodos de preparação de hospedeiro feminino com pseudogravidez são conhecidos na técnica. Além disso, métodos de transferência de um embrião em um

' hospedeiro feminino são conhecidos. O cultivo de um embrião in vivo permi- te que o embrião se desenvolva e pode resultar em um nascimento de vida

W de um animal derivado do embrião. Durante esta etapa do processo, a endonuclease-alvo (que, em 5 alguns casos, é expressa a partir do ácido nucleico introduzido codificando a endonuclease-alvo) reconhece, liga e cria uma ruptura de fita dupla no sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica. A ruptura de fita dupla na sequência cromossômica é reparada, através de recombinação homóloga com o ácido nucleico de fita única, tal que a sequência de ácido nucleico 10 seja trocada para a sequência cromossômica. A sequência do ácido nucleico pode ser fisicamente integrada ou, alternativamente, a sequência do ácido nucleico pode ser usada como um modeio para o reparo da ruptura, resul- tando na edição da sequência cromossômica. A frequência da edição-alvo da sequência cromossômica pode e 15 irá variar dependendo de diversos fatores. Em algumas modalidades, a fre- . quência de edição pode ser maior do que cerca de 0,01%, 0,03'/o, 0,1%, 0,3°/,, 1°/,, 3°/,, 1O°/o ou 3Õ°/o. Clones de célula única que incluem a sequên- cia cromossômica editada podem ser isolados usando técnicas bem conhe- cidas na técnica. As pessoas versadas na técnica estão familiarizadas com 20 métodos para gerar células de homozigotos para a sequência cromossômica editada. Em outras palavras, as células podem ser homozigotos ou heterozi- gotos para a sequência cromossômica editada. A sequência cromossômica editada pode incluir uma (ju mais mutações pontuais (ou seja, em que um nucleotídeo é substituído por outro 25 nucleotídeo), deleções de um ou mais, e/ou inserções de um ou mais. As mutações de ponto podem ser mutações missense, mutações não senso ou mutações silenciosas. As exclusões podem variar de cerca de um par de base a cerca de 500 pares kilobase, e as inserções podem variar de cerca de um par de base a cerca de 200 pares kilobase. 30 A sequência cromossômica editada, portanto, pode dar origem a um produto de gene modificado (isto é, proteína ou RNA não-codificante). Por exemplo, nas modalidades em que a sequência cromossômica editada

P encontra-se dentro de uma região de codificação de proteina, a proteina re- sultante pode incluir pelo menos uma alteração de aminoácido. Em outras - . modalidades, a sequência cromossômica modificada pode dar origem a um RNA não-codificante modificado, ou a sequência cromossômica modificada 5 pode ter uma alteração da função regulamentar. Alternativamente, a sequência cromossômica editada pode ser inativada de tal modo que nenhum produto do gene funcional seja produzido (ou a função de uma região reguladora seja eliminada). Por exemplo, em modalidades em que a sequência cromossômica editada se encontra dentro 10 de uma região de cod ificação de proteínas, as mutações, deleções, ou in- serções de ponto podem estabelecer códons de batente pré-maturas, muta- ções de junção de sitio de encaixe e/ou mutação de deslocamento de estru- tura tal que nenhuma proteína funcional seja produzida.

- Em modalidades nas quais a sequência cromossômica editada 15 compreende uma inserção, a sequência inserida pode codificar um peptídeo, uma proteína, um domínio da proteina, um fragmento de proteína, uma su- bunidade de proteina, uma marca de proteina e similares. Alternativamente, a sequência inserida pode fornecer um lado de reconhecimento da endonu- clease de restrição, codificar um RNA não-codificante, compreender um sítio 20 de ligação de microRNA ou funcioriar como um elemento de controle trans- cricional. (ll) Células compreendendo editar peio menos uma sequência cromossômi- ca Outro aspecto da descrição fornece células compreendendo edi- 25 tar pelo menos uma sequência croniossômica, ení que a sequência cromos- sômica foi editada pelo rnétodo descrito acima no ponto (I). Células adequa- das são detalhadas acima na seção (l)(d). (ill) Kits Um aspecto adicional engloba kits para a edição de sequências 30 cromossômicas em uma céiula. Um kit é composto por (a) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, em que a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sÍtio de clivagem-alvo na sequência cromossõmica, e (b) peb menos

W

W um ácido nucleico de fita única que compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sÍtio de clivagem-alvo. Desse modo, o kit fornece 5 meios para a edição de uma sequência cromossômica, usando o método detalhado acima na seção (I). O kit adicionalmente pode incluir um ou mais reagentes adicio- nais úteis para praticar o método divulgado para edição de genoma utilizan- do a endonuclease-alvo e ácidos nucleicos de fita única. Um kit inclui geral- lO mente um pacote com um ou mais recipientes conservando os reagentes, como unia ou mais composições separadas ou, opcionalmente, como adição onde permitirá a compatibilidade dos reagentes. O kit também pode incluir outro(s) material(is), que podem ser desejáveis de um ponto de vista do u- . . suário, tal como um tampão, um diluente, meio de cultura/meio, neste mate- 15 rial, ou qualquer outro material útil para tratamento ou realização de qualquer . etapa do método de edição de genoma. Os kits fornecidos neste documento preferencialmente incluem instruções para a edição de sequências cromossômicas como detalhado acima no ponto (I). As instruções incluidas nos kits podem ser fixadas nos 20 materiais de embalagem ou podem ser incluídas como um folheto informati- vo- Embora as instruções sejam normalmente escritas ou impressas, estas não estão limitadas a tal. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicar as mesmas a um usuário final é contemplado por esta descri- ção. Esses meios incluem, mas não são meios de armazenamento limitado 25 a, eletrônicos (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mí- dias ópticas (por exemplo, CD-ROM) e similares. Como usado neste docu- mento, o termo "instruções" pode incluir o endereço de um local na internet que fornece as instruções. (lV) Aplicações 30 O método de edição de sequências cromossômicas divulgados neste documento pode ter uma variedade de aplicações. Em algumas moda- lidades, o método pode ser utilizado para fins de pesquisa para introduzir

^ mutações específicas em uma proteina de interesse, tal que a função da _. proteína modificada possa ser examinada. O método também pode ser usa- do para desativar uma proteína codificando a sequência de modo que ne- nhuma proteína seja produzida, em que o fenótipo da célula ou organismo 5 que compreende as células pode ser examinado- Além disso, o método pode ser usado para modificar ou desativar a codificação de regiões ou para fins de pesquisa, as regiões de controle transcricional do RNA. Em ainda outras modalidades, o método pode ser usado para excluir grandes regiões de se- quência cromossômica e/ou integrar sequências de ácido nucleico exóge- lO nas. Em outras modalidades, o método divulgado neste documento pode ser utilizado para fins clinicos ou terapêuticos. Ou seja, o método pode ser usado para reparar ou corrigir genes causadores de doenças ou sequên- . cias cromossômicas. Por exemplo, a doença falciforme pode ser causada 15 por uma alteração de nucleotídeo único (ou seja, uma alteração A para T nos resultados do gene da [3-globina em uma mudança glutamato para vaii- na na proteína j3-globina). Nesse sentido, o método desta descrição pode ser usado para corrigir o SNP no gene da j3-globina em células de um indiví- duo tendo doença ou traço falciforme. De forma similar, o método pode ser 20 usado para corrigir mutações, deleções, inserções e similares de junção de encaixe em outros genes ou sequências cromossômicas que desempenham um papel em um estado de doença ou doença específica.

DEFINIÇÕES A menos que definido de outra forrna, todos os termos técnicos e 25 científicos neste documento têm o significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica a que pertence esta invenção. As seguintes referências fornecem uma das habilidades com uma definição geral de mui- tos dos termos utilizados nesta invenção: Singleton et al. Dictionary of Mi- crobiology e Molecular Biology (2"' ed. 1994); The Cambridge Dictionary os 30 Science and Technology (Walker Ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5'h Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biobgy (1991). Como usado neste documento,

k os seguintes termos têm o significado atribuído a menos que especificado de outra forma.

Quando se apresentam elementos da presente descrição ou a(s) modalidade(s) preferida(s), os artigos "o", "um", "uma" e "referido" destinam- 5 se a dizer que há um ou mais elementos- Os termos "compreendendo", "in- cluindo" e "tendo" se destinam a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais que não sejam os elementos listados.

Os termos "edição" ou "edição de genoma" referem-se a um processo pelo qual uma sequência cromossômica específica é alterada.

A 10 sequência cromossômica editada pode incluir uma inserção de peb menos um nucleotideo, uma exclusão de pelo menos um nucleotídeo, e/ou substitu- . "" ição de pelo menos um nucleotideo.

A sequência cromossômica modificada editada pode codificar um produto do gene niodificado (por exemplo, uma . proteína com uma sequência de aminoácido alterada, um RNA nâo-- . 15 codificante com uma sequência de nucleotídeos alterada, etc.), fornece uma . função modificada (por exemplo, função de promotor alterada, função de realçador alterada, etc.) pode deixar de dar origem a um produto do gene (ou seja, a sequência não é transcrita ou nenhum produto funcional produzi- do), deixar de fornecer uma função reguladora, codificar uma sequência e- 20 xógena ou fornecer uma nova função (isto é, como um promotor regulável, promotor induzível, ligação de microRNA, sítio, etc.). Neste documento, o termo "endógeno" se refere a uma sequên- cia cromossômica que é nativa para a célula.

O termo "exógeno" como usado aqui se refere a uma sequência 25 de ácido nucleico que não é normalmente localizado em uma determinada localização cromossômica.

Uma sequência exógena pode ser de outro orga- nismo, pode ser artificial ou pode ser uma cópia de uma sequência de ácido nucleico presente em outra localização cromossômica.

Um "gene", neste documento, refere-se a uma região de DNA 30 (incluindo exóns e íntrons) codificando um produto de gene, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto de gene, se são ou não tais sequências reguladoras adjacentes à codificação e/ou sequências à transcritas. Desse modo, um gene inclui, mas não está necessariamente

P limitado a, sequências de promotor, terminadores, sequências reguladoras de translação, tais como sÍtios de ligação de ribossomo e sitios de entrada de ribossoma interno, potenciadores, silenciadores, isoladores, elementos de 5 contorno, origens de replicação, sitios de fixação de matriz e regiões de con- trole do locus. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotideo" se referem a um pollmero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleótido de polimero, em con- formação Iinear ou circular. Para efeitos da presente descrição, estes termos 10 não estão sendo interpretados como limitação no que diz respeito ao com- primento de um polimero. Os termos podem englobar análogos de nucleotí- deos naturais conhecidos, bem como nucleotideos modificados nas porções - de base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, estrutura principal de fosforotioa- . tO). Em geral, um análogo de nucleotideo específico tem a mesma especifi- . 15 cidade de emparelhamento de base: ou seja, um análogo de A será um par de base com T. Os termos "polinucleotídeos" e "proteina" são usados indistinta- mente para se referir a um poIímero de residuos de aminoácidos. Neste documento, os termos "sitio-alvo" ou "sequência-alvo" se 20 referem a uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de uma sequência cromossômica a ser editada e que uma nuclease do dedo de zin- co é projetada para reconhecer e ligar-se, desde que existam condições su- ficientes para ligação. Os termos "a montante" e "a jusante" referem-se à Iocalização 25 em uma sequência de ácido nucleico em relação a uma posição fixa. A mon- tante refere-se à região que é 5' (ou seja, perto da extremidade 5' da fita) para a posição e a jusante, refere-se à região que é 3' (ou seja, perto da ex- tremidade 3' da fita) para a posição. As técnicas para a determinação de identidade de sequência de 30 ácidos nucleicos e aminoácidos são conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, normalmente, determinando a sequência de nucleotídeos de mRNA de um gene e/ou determinação da sequência de ácido amino codificada as-

Q sim e comparando estas sequências a uma segunda sequência de nucleotí- deos ou aminoácidos. As sequências genômicas também podem ser deter- minadas e comparadas com essa moda. Em geral, a identidade remete a uma correspondência exata de nucleotideo-para-nucleotideo ou aminoácido- 5 para-aminoácido de dois polinucleotideos ou sequências de polipeptídeo, respectivamente. Duas ou mais sequências (de poHnucleotídeos ou aminoá- cidos) podem ser comparadas determinando sua identidade por cento. A identidade de porcentagem de duas sequências, sequências de ácido nucle- ico ou aminoácidos, se o número de correspondências exatas entre duas 10 sequências alinhadas divididas pelo comprimento das sequências mais cur- tas for multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências

A de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Esse ·q ¶ algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos usando a matriz 15 de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and S- tructure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Resear- ch Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Uma implementação exemplar desse algoritmo para determinar a identidade por cento de uma seqLlência é forne- 20 cida por Genetics Computer Group (Madison, Wis) no Pedido de utilidade de "BestFit". Outros programas apropriados para calcular a identidade de por- centagem ou similaridade entre sequências geralmente são conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados 25 utilizando os seguintes parâmetros de padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificação por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não-redundante, GenBank+EMBL+DDBj+PDB+Gen8ank traduções CDS"proteína Swiss+Spupdate+P1R. Detalhes destes programas podem ser 30 encontrados no website de Gen8ank. Com relação a sequências aqui descri- tas, o inteNa|o desejado com graus de identidade de sequência é aproxima- damente 8O°/j a 100°/o e qualquer valor inteiro dos mesmos- Normalmente as h identidades por cento entre sequências são de pelo menos 70 a 75°6, prefe- réncialmente 80 a 82°6, preferencialmente 85 a 90%, até mesmo preferenci- - . almente 92%, preferencialmente 95°/o e preferencialmente 98% de identida- de de sequência. 5 Alternativamente, o grau de similaridade da sequência entre po- linucleotídeos pode ser determinado por hibridação de polinucleotídeos sob condições que permitem a formação de duplex estável entre regiões que compartilham certo grau de identidade de sequência, seguido por digestão com nucleases de fita única específicas e determinação do tamanho dos 10 fragmentos digeridos.

Dois ácidos nucleicos ou duas sequências de polipep- tídeo são substancialmente similares uns aos outros quando as sequências exibem pelo menos cerca de 70°/o a 75%, preferencialmente 80 a 82%, pre- ferencialmente 85°/o a 90%, mesmo preferencialmente 92%, preferencial- - mente 95°/o, e preferencialmente 98% de identidade de sequência ao bngo

15 de um comprimento das moléculas, determinado usando os métodos acima. . Como usado r)este documento, substancialmente similar também se refere às sequências mostrando identidade completa para um DNA especificado ou sequência do polipeptideo.

Sequências de DNA que são substancialmente similares podem ser identificadas em um experimento de hibridação Sou-

20 thern sob, por exemplo, condições restritivas, conforme definido para esse determinado sistema.

A definição de condições adequadas de hibridização está dentro da habilidade da técnica.

Vide, por exemplo, Sambrook et al., supra; Nucleic Acids Hybridization: A Practical Method, editors B.

D.

Hames and S- J.

Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C-; IRL Press). 25 A hibridação seletiva de dois fragmeritos de ácidos nucleicos pode ser determinada da seguinte forma- O grau de identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficiência e a força dos even- tos de hibridação entre tais moléculas.

Uma sequência de ácidos nucleicos parcialmente idêntica, pelo menos parcialmente inibe a hibridação de uma 30 sequência completamente idêntica para uma molécula-alvo.

A inibição da hibridação da sequência completamente idêntica pode ser avaliada utilizan- do ensaios de hibridização que são bem conhecidos na técnica (por exem-

plo, Southern (DNA) blot, Northern (RNA) blot, solution hybridization, or the &

like, see Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratojy Manual, Second . Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tais ensaios podem ser realizados usando diversos graus de seletividade, por exemplo, usando condições vari- 5 ando de baixa a alta rigidez.

Se as condições de baixa rigidez forem empre- gadas, a ausência de (igação não específica pode ser avaliada usando uma sonda secundária que não tem mesmo um grau parcial de identidade de se- quência (por exemplo, uma sonda tendo menos do que cerca de 30°/o de identidade sequência com a molécula-alvo), tal que, na ausência de eventos 10 de ligação não específica, a sonda secundária não hibridize o-alvo- Quando utilizando um sistema de detecção baseado em hibridi- zação, uma sonda de ácido nucleico é selecionada que é complementar a uma sequência do ácido nucleico de referência e depois por seleção de con- . " dições adequadas para a sonda e a sequência de referência seletivamente 15 cruza, ou Iiga, uns aos outros para formar uma molécuia de frente e verso. - Uma rnolécula de ácido nucleico que é capaz de hibridizar seletivamente para uma sequência de referência sob circunstâncias de hibridação modera- damente severas normalmente cruza sob condições que permitem a detec- ção de uma sequência do ácido nucleico-alvo de pelo menos cerca de pelo 20 menos 10 a 14 nucleotídeos de comprimento, tendo uma identidade de se- quência de pelo menos cerca de 70% com a sequência da sonda de ácido nucleico seíecionada- Condições rigorosas de hibridação normalmente per- mitem a detecção de sequências de ácidos nucleicos-alvo de pelo menos cerca de 10 a 14 nL|c|eotÍdeos de comprimento, tendo uma identidade de 25 sequência de mais de cerca de 90 a 95% com a sequència da sonda de áci- do nucleico selecionada.

Condições de hibridação úteis para hibridação de sequência de sonda/referência, onde a sequência de teste e de referência tem um grau específico de identidade de sequência, pode ser determinada como conhecido na técnica (vide, por exemplo, Nucleic Acids Hybridization: 30 A Practical Approach, editors B.

D.

Hames and S.

J.

Higgins, (1985) Oxford; Washington, D-C.; IRL Press). Condições para a hibridação são conhecidas pelos versados na técnica.

- O rigor de hibridização refere-se ao grau no qual as condições de hibridização desqualificam a formação de híbridos contendo nucleotídeos incompatíveis, com maior rigor, correlacionado com uma menor tolerância para híbridos incompativeis. Os fatores que afetam o rigor da hibridaçâo são 5 conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, temperatura, pH, força iônica e concentração de soIventes orgânicos, tais como, por exemplo, formamida e dimetilsulfóxido. Como é conhecido por aqueles versados na técnica, o rigor de hibridização é aumentado por tem- peraturas elevadas, baixa força iônica e baixa concentração de solvente. No 10 que diz respeito a condições de rigor de hibridação, é bem conhecido na técnica que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para estabelecer um rigor particular variando, por exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e a natureza das sequências, composição de diversas se- . quências, concentrações de sais e outros componentes da solução de hibri- . 15 dação, a presença ou ausência de agentes de bloqueio das soiuções de hi- bridação de base (por exemplo, sulfato de dextrano e po|ieti|enog|jco|), tem- peratura de reação de hibridação, e parârnetros de tempo, bem como, con- dições variáveis de lavagem. Um conjunto específico de condições de hibri- dização pode ser escolhido seguindo métodos padrão na técnica (Vide, por 20 exemplo, Sapeka, et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

EXEMPLOS Os exemplos a seguir estão incluídos para ilustrar a invenção. Exemplo 1: Modificação de quinase RSK2 25 O exemplo a seguir detalha a modificação do locus de quinase RSK2. Um o!igonucleotídeo (125 nt) foi projetado para incorporar três muta- ções distintas na sequência cromossômica de quinase RSK2. O oligonucleo- tídeo compreendendo: (1) duas mutações pontuais em sitios de ligação de ZFN para prevenir subsequente junção de extremidade não homóloga 30 (NHEJ), (2) uma alteração TGC para GTT para converter uma Cys em uma Val, e (3) uma alteração silenciosa C para A para criar um sÍtio BamHl único para triagem de clone (figura 1)- O oligonucleotídeo foi produzido usando

» procedimentos de sÍntese padrão (por exemplo, nenhuma modificação quí- mica) e foi purificado por PAGE. Um par de nucleases de dedo de zinco . W (ZFNs) foi projetado para atingir o locus de quinase RSK2. Um ZFN foi proje- tado para ligar a sequência 5'—GTATACATAAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 6; 5 sÍtio de ligaMo esquerdo, indicado na figura 1), e o outro ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'-GGAGl I I GCAGTGAAGGTA-3' (SEQ ID NO: 7: sítio de Iigação direito indicado na figura 1). As células humanas K562 foram nucleofectadas com 8 µg de mRNA codificando ZFNs e 0,3 nmol de o1igonuc!eotÍdeo- Após dois dias de 10 incubação, pools de células foram analisados para a presença do sitio de BamH1. Como mostrado na figura 2, células expostas para o oligonucleotí- . "" deo e os ZFNS abrigaram o sítio de BamH1, ao passo que a introdução do oligonucleotídeo sozinho não teve efeito. A integração de frequência variou

M de cerca de 20 a 3Ô°/o. 15 Clones de céíula única foram isolados e exibidos usando um en- saio de qPCR para identificar aqueles abrigando o sÍtio de BamH1 (vide figu- ra 3). Aproximadamente 750 dones foram selecionados e identificaram cer- . ca de 40 clones positivos. Os clones positivos foram posteriormente amplifi- cados por PCR em torno da localização cromossômica alvo e digeridos com 20 BamHI para confirmar a edição do locus cromossômico de quinase RSK2. Os dados de sequenciamento revelaram que os clones positivos de BamHl também foram positivos para Cys desejado para mudança de códon Val. Exemplo 2: Modificação de Locus AAVSI. O exemplo a seguir detalha o uso de oligonucleotideos para in- 25 troduzir o locus de AAVSI de um sÍtio de Hindlll. A figura 4 apresenta a se- quência do tipo seivagem do Iocus de AAVSI e sequências de oIigonucleoti- deos senso e antissenso (108 nt) que incluem o sitio de Hindlll. Os digonu- cleotídeos foram produzidos utilizando procedimentos padrão (por exemplo, com nenhuma modificação química) e foram purificados por PAGE.

30 Um par de ZFNs foi projetado para atingir o locus de AAVSI- Um ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'-ACCCCACAGTGG-3' (SEQ ID NO: 8; sÍtio de ligação esquerdo, indicado na figura 4), e o outro ZFN foi pro-

N jetado para ligar a sequência 5'-TAGGGACAGGAT-3' (SEQ ID NO: 9; sitio de ligação direito indicado na figura 4). O mRNA poliadenilado, capeado co- . . dificando os ZFNs foi preparado usando procedimentos padrão.

O mRNA de ZFN e o oligonucleotideo compreendendo o sítio de Hindlll foram nucleofec- 5 tados em células K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 ou MSF7. Após um período de incubação, pools de células foram analisados para a presença do sÍtio de Hindlll.

As células expostas ao o|igonuc|eotjdeo e aos ZFNs continham fragmentos de Hindlll, em que aquelas tratadas com oIigo- nucleotídeo sozinho não tinham fragmentos de Hindlll (figura 5). 10 Clones de célula única A549 foram isolados e exibidos usando um ensaio de qPCR para identificar aqueles abrigando o sÍtio de Hindlll (fi- gura 6). Aproximadamente 933 clones foram selecionados, com 308 identifi- cados como positivo.

Desse modo, a frequência de liberação do sitio de Hin- . ' dlll foi de cerca de 33%. Os clones positivos foram posteriormente amplifica- 15 dos por PCR em torno da localização cromossômica-alvo e digeridos com Hjnd][| para confirmar a inserção da sequência de oligonucleotídeo.

Os clo- nes mostrando bandas fracas na posição do produto de PCR parental foram sequenciados e confirmados conter o sÍtio de Hindlll (vide figura 6). Os clo- nes mostrando diversas bandas fortes em torno da posição do produto de 20 PCR parental são hipóteses de conter pequenas inserções derivadas por NHEJ.

Exemplo 3: Modificaçâo de Locus AAVSI - Comprimento do Oliqonucleotí- deo Para determinar se os oligonucleotideos mais curtos podem ser 25 usados para liberar o sitio de Hindlll para o locus de AAVSI, os oIigonucleo- tídeos que variam em comprimento de 36 a 106 nt foram preparados.

Por exemplo, um oIigonucleotideo de 106 nt tinha uma identidade de sequência para 50 nt em ambos os lados do sítio de clivagem ZFN (ou seja, tinham braços de homologia de 50 nt), com um - sitio de Hindlll (6 nt) entre os bra- 30 ços de homologia.

As sequências dos oligonucleotídeos são apresentadas na Tabela 1 abaixo.

V nucleofecção.

O DNA genômico foi amplificado por PCR e digerido com H/n-

7 dlll.

Como mostrado na figura 9, a liberação de ZFNs como RNA resultou em melhor integração dos oligonucleotídeos tendo comprimentos diferentes.

Para detectar fragmentos de NHEJ putativos, as células tratadas

5 por oligonucleotídeo/ZFN foram submetidas a um ensaio de Cel-l.

O ensaio de Cel-l detecta alelos do locus-alvo que se desvie do tipo selvagem como resultado reparação imperfeita mediada por NHEJ de rupturas de fita dupla de DNA induzidas por ZFN e/ou inserção de nucleotídeos adicionais.

A am- plificação por PCR da região-aivo de um pool de células tratadas por ZFN

10 gera uma mistura de aplicons WT e mutantes.

A fusão e o recozimento des- sa mistura resultam em incompatibilidades de formação entre heteroduple- xes de alelos WT e mutantes- Uma "bolha" de DNA formada no sitio de in-

d compatibilidade é clivada pela nuclease principal Cel-l, e os produtos de d clivagem podem ser ressolvidos por eletroforese em gel.

A intensidade rela-

15 tiva dos produtos de cIivagem, em comparação com a banda parental é uma medida do nível de clivagem de Cel-l do heteroduplex.

Para isso, pools de células tratadas por ZFN/oligonucleotídeo foram amplificados por PCR e di- vididos em duas amostras.

Uma amostra foi deixada sem tratamento e a ou- tra amostra foi tratada com enzima de Cel 1 de 1 µ1 e potenciador de 1 µ1

20 durante 30 minutos a 42°C.

Os resuitados são apresentados na figura 10. Os fragmentos de Ce(-1 e fragmentos putativos derivados de NHEJ incompati- veis foram detectados nas células tratadas por Cel-l.

Exemplo 4: Homoloqia é Necessária para a lnteqração Mediada por Oliqo-

nucleotídeo 25 As células A549 foram nucleofectadas com 4 µg de mRNA codi- ficando ZFNs-alvo de AAVSI e um oligonucleotídeo de AAVS1-Hindlll ou um oÍigonucleotideo de CNR1-Hindlll.

Para cada tipo do oligonucl·eotideo, testa- ram-se as seguintes formas: a) senso, de fita única; b) antissenso de fita ú- nica; c) senso e antissenso; d) senso de fita única (2X): e) fita dupla (pré-

30 recozida). Após dois dias de incubação, as células foram colhidas, o DNA genômico foi amplificado por PCR e, em seguida, digerido com Hindlll.

Co- mo mostrado na figura 11, apenas células expostas para o oligonucleotideo mw ' de AAVS1-Hindlll homólogo tinham um sÍtio de Hindlll no locus de AAVSI. Exempb 5 Exclusão Genômica-alvo em células com Oliqonuc1eotídeos . . SSDNA e ZFNS Para determinar se os o|igonuc]eotídeos de DNA de fita única 5 (SSODN, de oligodesoxinucleotídeo de fita única) poderiam ser usados para excluir uma sequência genômica-alvo de 0,1 kb a 100 kb no locus de AAVSI nas células K562, foi preparada uma série de SSODNS. ssODNs projetados para excluir uma sequência genômica de Al\VS1-alvo de 5 kb, 10 kb e 100 kb são apresentados ria Tabela 2. Cada oligonucleotídeo continha uma regi- lO ão (designada I' na figura 12) com identidade de sequência para uma região genômica (ou seja, a fronteira de exclusão distal ou região de ponto de ex- ." tremidade de exclusão) localizada a uma distância especificada a partir do sÍtio de corte de ZFN e uma região (designada || na figura 12) corresponden- . te para o sitio de ligação apropriado ZFN perto do sítio de corte de ZFN. Os 15 oligonucleotÍdeos foram produzidos através de procedimentos de sÍntese . padrão (por exemplo, nenhuma modificação química) e foram purificados por PAGE. Tabela 2 SSODNdoador Sequência SEQ ID

NO I AAVS1-5kb l 5'A TAAGCAGGTGAAGTTAGAACA TCCACAAAAGTA 21

I TAAAATTGACTCTTCTGTCCTGTGTGCTAGGGACAG I GATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGG3' I AAVSI -lOkb I 5'AGGAGAATTTGTAGGCTTCAAGAGACCA TGTTGT 22

I AACAGGTGGGTGA TAACAGGCTTTAACTAGGGACA I GGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGG3' AMGAAGCTTCTTCCACTCTGA TAAAAGA 23

I AAGGAAAAA TAGGCAAAGCCA CAGACCTAGGGAC I AGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGG3' 20 As sequências de ssODN exemplares apresentadas na Tabela 2 acima, sublinhadas são ácidos nucleicos no Iocus que inclui o sítio de liga- ção de ZFN (a região designada como Il na figura 12A). Os ácidos nucleicos com ambos sublinhados e em negrito são os nucleotídeos de reconhecimen- to para o sÍtio de ligação direito de ZFNs de AAVSI. Os ácidos nucleicos em negrito-itálico, mas sem sublinhado são complementares para o ponto de extremidade de exclusão distante (a região designada como ] na figura 12A). A figura 12A ilustra as exclusões 5' no síitio de corte de ZFN.

A figura 12B ilustra a exclusão 3' para o sitio de corte de ZFN. 5 Exc/usão de DNA qe/7ôn7jco-a/vo de di/erentes tamanhos no locus de AA VSl em K562 com o/iqonuc/eotídeo de fita única e ZFN.

As células K562 foram nucleofectadas com 4 µg de mRNA codi- ficando ZFNs conduzidos por AAVSI (total de 8 µg) e 3 µ1 de doador de ssODN de 100 µM: AAVS1-O,1 kb, AAVS1-0,5 kb, AAVS1-1 kb, AAVS1-1,5

10 kb, AAVS1-2 kb, AAVS1-2,5 kb, AAVS1-3 kb, AAVS1-3,5 kb, AAVS1-4 kb, AAVS1-4,5 kb, AAVS1-5 kb, AAVS1-1O kb, AAVS1-10,2 kb, AAVS1-19,9 kb,

" AAVS1-20 kb, AAVS1-50 kb, AAVS1-1OO kb.

Células k562 nucleofectadas com apenas ssODN, ou com ZFN só foram utilizadas como controle.

Células 4

. k562 foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção.

O DNA genômico foi amplifi-

15 cado por PCR por um iniciador frontal a montante da extremidade 5' do pon- to de extrernidade distante da exclusão e um iniciador reverso a jusante da extremidade 3' do sitio de Iigação de ZFN direito, como mostrado na figura 12A.

De forma similar, usando o sÍtio de corte de ZFN como ponto de refe- rência, para o esquema de exclusão 3' fora do sítio de corte de ZFN 12B, o

20 iniciador frontal está a montante da extremidade 5' do sitio de ligação de ZFN e o iniciador reverso está a jusante da extremidade 3' do ponto de ex- tremidade de exclusão distante.

Na figura 13, as rotas rotuiadas como "2" usaram células K562 expostas apenas ao oligonucleotídeo, mas sem ZFN como um modelo para

25 amplificação por PCR.

Portanto, os fragmentos de PCR foram esperados ter um indicativo de comprimento sendo derivado do alelo do tipo selvagem (sem exclusão)- As rotas rotuladas como "3" usaram células K562 expostas a ZFN apenas, e assim os produtos de PCR foram esperados ter também o indicativo de comprimento sendo derivado do alelo do tipo selvagem (ou

30 NHEJ). As rotas rotuladas como "1" usaram células K562 expostas a ZFN e oligonucieotídeo, e assim, os fragmentos de PCR foram esperados ser am- plificados do alelo de exclusão e, portanto, menor em tamanho do que o ale-

¶

lo do tipo selvagem pelo número de pares de bases, projetado para ser ex- cluído.

Dependendo dos comprimentos de exclusão previstos na célula, a rota 1 também pode incluir fragmentos de PCR amplificados a partir do alelo do tipo selvagem.

O tamanho esperado dos fragmentos de PCR do alelo tipo 5 selvagem e dos fragmentos de PCR de alelo de exclusão é apresentado a- cima de cada grupo de pistas na figura 13. Os fragmentos de PCR eram to- dos do tamanho esperado, indicando que a exclusão de DNA genômico-alvo decercadeO,1kb,0,5kb,1,Okb,1,5kb,2kb,2,5kb.3,Okb,3,5kb,4,Okb, 4,5 kb, 5,Okb, 10,0 kb, 10,2 kb, 19,9 kb, 20 kb, 50 kbe 100 kb usandooligo- lO nucleotídeos de fita única e ZFN foram realizados com sucesso.

Usando o sítio de corte de ZFN como ponto de referência, de acordo com a seleção do sítio de corte de ZFN a montante (para exclusão 3') ou jusante (exclusão 5') em relação à região de exclusão genômica-alvo, d oIigonucleotídeos de fita única antissenso e/ou senso foram utilizados para 15 mediar a exclusão genômica orientada, especificamente a montante do sÍtio de corte de ZFN.

Na figura 13, entre os grupos de rotas, os grupos com um asterisco "*" indicaram exclusão 3' do sítio de corte de ZFN; grupos sem as- terisco "*" indicaram exclusão 5' do sitio de corte de ZFN: o único grupo com asterisco duplo "**" indicou exclusões 3' e 5' do sÍtio de corte de ZFN- Como 20 mostrado na figura 13, cada tipo dos grupos mostrou ter produtos de PCR com o tamanho esperado- Exclusão de DNA qenômico-alvo de 5 kb no locus de AAVSI em diferentes tipos de células com oligonucleotideo de fita única e ZFN.

Para testar a exclusão de DNA genôrnico-alvo no locus de A- 25 AVSl em células diferentes, cada um dos pooIs de células K562, HCT116, U2os, A549, HEK293, HepG2 e MCF7 foram nucleofectados com 4 µg de mRNA codificando os ZFNS conduzidos por AAVSI (total de 8 µg) e 3 µ1 de doador de ssODN de 100 µM:AAVS1-5 kb.

Cada urn dos pools de célula nu- cleofectados com apenas ssODN, ou com ZFN apenas toi usado como con- 30 trole.

As células foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção.

DNAS genômicos foram amplificados por PCR pelo iniciador frontal a montante da extremidade 5' da exclusão-alvo e iniciador reverso a jusante da extremidade 3' da exclu-

são-alvo.

As rotas rotuladas como "1" usaram o DNA das células expostas a oligonucleotídeo e ZFN como modelo de PCR, e os fragmentos de PCR fo- ram esperados ser amplificados a partir do alelo da exclusão, com um tama- nho menor de 5 kb do que o fragmento de PCR de alelo tipo selvagem (5303 5 bp). Como mostrado na figura 14, os fragmentos e PCR de alelo de exclusão em todas as amostras de célula tinham o tamanho esperado de 303 bp.

Exclusão qenômica de DNA-alvo em diferentes locais em K562 com oliqonu- cleotídeo de fita dupla e ZFN.

Para testar as exclusões de DNA genômico-alvo no locus dife- lO rente nas células K562, as células K562 foram nucleofectadas com cada um (1) mRNA (total de 8 µg) codificando ZFNS conduzidos por /RAK4 e um doa- - "' dor de SSODN (3 µ1 de 100 µM) para exclusão de 6 kb; (2)) mRNA (total de 8 µ µg) codificando ZFNS conduzidos por RSK2 e um doador de SSODN (3 µ1 de d

100 µM) para exclusão de 5,2 kb; e (3) mRNA (total de 8 µg) codificando 15 ZFNS conduzidos por RSK4 e um doador de SSODN (3 µ1 de 100 µM) para exclusão de 5,0 kb.

Cada um dos pools de célula nucleofectados de amos- tras com SSODN apenas, ou com ZFN apenas foi usado como controle- As cé|L|las foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção e isoladas do DNA genômi- co.

Os DNAS genômicos foram amplificados por PCR pelo iniciador frontal a 20 montante da extremidade 5' da exclusão-alvo e iniciador reverso a jusante da extremidade 3' da exclusão-alvo- As rotas rotuladas como "1" usaram o DNA de células expostas ao oligonucleotídeo e ao ZFN como modelo de PCR, e os fragmentos de PCR foram esperados ser amplificados a partir do alelo de exclusão.

Como mostrado na figura 15, os fragmentos de PCR de 25 alelo de exclusão em todas as amostras de célula tinham o tamanho espe- rado de 334 bp para o locus de IRAK4, 281 bp para o locus RSK2 e 190 bp para o locus RSK4, respectivamente. /\valiação de precisão de exclusão de DNA qenômico-alvo no locus AAVSI em K562 com o|içlonuc|eotÍdeo de fita única e ZFN. 30 Análises de sequência de DNA de cIones de pool de DNA ge- nômico foram conduzidas para avaliar o nivel de precisão da exclusão-alvo mediada por oligonucleotideos de fita única e ZFNS- O pool de DNA genômi-

W co foi isolado de células K562 expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita única projetados para eliminar 100 bp-alvo fora de 5' do sÍtio de corte de ZFN no locus de AAVSI.

Um pouco mais de 40°/o dos cÍones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo; superficialmente mais de 55% dos 5 clones tinham alelos do tipo selvagem (sem exclusão, interrupção ou repara- ção) ou alelos como um resultado de junção de extremidade não homóloga final (NHEj); e os clones tendo alelos com exclusão imprecisa (ou seja, ex- clusão adicional de 81 bp fora do limite da exclusão pretendida 5') foram menos de 5% (dados não mostrados). 10 Em outro evento, os clones de pool DNA genômico que foi isola- do após as células K562 serem expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita , "' única projetados para elirninar um 100 bp-alvo de 3' do sÍtio de corte de ZFN no locus de AAVSI foram submetidos à análise de sequenciamento de DNA. . 4

. Um pouco mais de 5Õ°/o dos clones tinham alelos com exclusão precisa de

15 100 bp-alvo; um pouco menos 5Ó°/o dos clones tinham alelos do tipo selva- gem (sem exclusão, interrupção ou reparação) ou alelos como resultado de junção de extremidade não hotnóloga final (NHEj); e não havia nenhum clo- ne tendo alelos com exclusão imprecisa (dados não mostrados). Em um evento adicional, os clones do pool de DNA genõmico

20 que foi isolado após as células K562 serem expostas a um par de ZFNs em toda a região-alvo para exclusão e dois conjuntos de oligonucleotideos de fita única projetados para eliminar 100 bp-alvo fora de 5' e 3' do sítio de corte de ZFN no locus de AAVSI foram submetidos à análise de sequências de DNA.

Mais de 20% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100

25 bp-alvo fora de 5' do sitio de corte de ZFN; um pouco menos de 30% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo de 3' do sítio de corte de ZFN; um pouco menos 50% dos clones tinham alelos do tipo selva- gem (sem exclusão, interrupçáo ou reparação) ou alelos como resultado de junção de extremidade não homóioga (NHEj); e nenhum cÍone tinha alelos

30 com exclusão imprecisa para exclusão 5' ou 3' fora dos sitios de corte de ZFN (dados não mostrados). Clonaqem de célula única de exclusão de DNA qenômico-alvo e análise do locus de AAVSI em K562. Clones de célula única isolados foram genotipados através de análise do gel para determinar a composição alélica no locus onde se reali- zou a exclusão de DNA genômico-alvo.

Os clones de célula única foram iso-

5 lados depois que as células K562 foram expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita única projetados para excluir sequência genômica de 5 kb, 10 kb e 100 kb, respectivamente.

Os clones de exclusão de homozigotos foram es- perados ter fragmerítos de PCR de um tamanho que foram derivados dos dois alelos de exclusão no clone.

Os clones de exclusão de heterozigotos

10 foram esperados ter o alelo de exclusão e o alelo não excíusão do tipo sel- vagem.

O alelo de não exclusão do tipo selvagem foi detectado pela junção

." de PCR com pares de iniciador flanqueando cada uma das duas extremida- des de exclusão.

A Tabela 3 resume os resultados da genotipagem de clone único- |Tabela 3:

Tamanho de Delação N°. de clones N°. de cIones N°. de cIones alvo rastreados Hoimzigotos Heterozigotos

5 kb 620 4 (0,6%) 19(3,1%) 10 kb ERT 1 (0,2%) 41 (6,5%) 'ÍÕO'kb 1180 0 2 (0,2°6) 15 ' Exemplo 6: Exclusões e Inserções Genômicas-alvo Simultâneas em Células com Oligonucleotídeos de DNA de fita única e ZFNs A figura 16 ilustra um esquema exemplar para obter exclusões e inserções genômicas-alvo simultâneas em células com DNA de oIigonucleo- 20 tideos de fita única (SSODN) e ZFNS.

As sequências de SSODN para exclu- são e inserção-alvo tem três reg iões: região r compreendendo sequências de nucleotideos complementares para o ponto de extremidade de exclusão distante (região designada como I na figura 16): regiâo || compreendendo a sequência de nucleotídeo do sitio de ligação de ZFN (região designada co- 25 mo ll na figura 16): e a região lll compreendendo a sequência de nucleotí- deos a ser inserida- Especificamente, o oligonucleotídeo de SM271 foi proje- tado para exclusão-alvo de 5 kb e inserção do sitio de loxP simultâneas: 5' ATCCACAAAAGTATAAAATTGACTCTTCTGTCCTGTGTGtaacttcgtatagcat acattatacg aaqüatCTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTA 3' (S'EQ )D NO: 24), com sitio de loxP representado pela sequência de nucleotídeos em letras minúsculas, sÍtio de Iigação de ZFN sublinhado, nucleotideos de reconhecimento para o sítio de ligação de ZFN direito sublinhado e em negri- to e sequência complementar para o ponto de extremidade de exclusão dis- tante em negrito-itálico mas sem sublinhado.

Como rnostrado na figura 16, um iniciador de PCR frontal A e i- niciador reverso B que flanqueiam as regiões I e ll foram usados para verifi- lO car a exclusão-alvo; e o iniciador de PCR frontal A e iniciador reverso C fo- ram utilizados para verificar a inserção-alvo, com o iniciador C compreen- dendo os nucleotídeos no sítio de junção para o braço de ligação de ZFN direito e o DNA genômico vizinho.

A figura 17 mostra a verificação de PCR da exclusâo-alvo da sequência de 5 kb, que gerou o fragmento de PCR de 303 bp esperado do alelo de exclusão (Rota 6: AAVSI-ZFN e AAVSI- 5 kb SSODN) utilizando os iniciadores A e B.

A inserção--alvo do sÍtio de loxP foi verificada pelo fragmento de PCR utilizando os iniciadores A e C (figura 17, vide rota 10). Exemplo 7: Métodos de lnserção de Plasmídeos Universais Mediados por ZFNs e oHqonucleotídeos de DNA de fita única.

O exemplo a seguir detalha o uso de oligonucleotídeos e ZFNS para introduzir uma sequência de interesse de um plasmídeo doador no lo- cus de AAVSI- Em geral, um ou dois ZFNs, dois doadores de oligonucieoti- deos e um doador de plasmideo estão envolvidos neste processo.

Os ZFNs fazem rupturas de fita dupla (DSB). Os dois doadores de oligonucleotideo então ligam as extremidades de DSB utilizando as seções que são comple- mentares para o sÍtio de corte de ZFN.

Cada extremidade 5' dos dois doado- res do oligonucleotídeo é homóioga a regiões no plasmídeo de doador (uni- versal Dü não). A homologia na extremidade 5' dos doadores de oligonucleo- tídeo provoca a invasão do doador de plasmídeo.

Quando DSB é ressolvido usando o plasmídeo doador, a sequência desejada do plasmídeo doador é introduzida e inserida no sítio de corte de ZFN (figura 22).

" Para confirmar o esquema, as células foram transfectadas com dois AAVSI ZFNs (Z), dois doadores de oligonucleotídeo (O) e o doador de plasmideo de camundongo Rosa26 (D) (Z " O + D). As células transfectadas com apenas ZFNs (Z), doadores de oligonucleotÍdeo apenas (O), doador de

5 plasmídeo apenas (D), ZFNS e doadores de oligonucleotideo apenas (Z + O), ZFNs e doador de plasmídeo apenas (Z " D), doadores de oligonucleoti- deo e doador de plasmídeo apenas (O " D) foram utilizadas como controles- As células transfectadas, em seguida, foram cultivadas, coIhidas e os clones de célula individuais foram analisados- A junção do pcr foi realizada para

10 confirmar que o doador de DNA do doador de plasmídeo foi incorporado no locus de AAVSI.

Os iniciadores AAVSI Cel-F2 (5' TTCGGGTCACCTCT- CACTCC 3'; SEQ ID NO: 25) e SM373.junc.R1 (5' ACCTCGA- GACCGGTGGATCCGA 3'; SEQ ID NO: 26) flanqueando a junção de 5' fo- . P

% ram utilizados para confirmação de junção 5'; e iniciadores SM373.Junc.F2 15 (5' GCGGTCTGAATTCGGATCCACCG 3'; SEQ ID NO: 27) e AAVSI Cel-R2 (5' GGCTCCATCGTAAGCAAACC 3'; SEQ ID NO: 28) flanqueando a junção 3' foram utilizados para confirmação de junção 3'- Análises de sequência na junção 5' e na junção 3' confirmaram que a sequência de doador do doador do plasmídeo foi incorporada no locus

20 de AAVSI nas células- A integração confirmada na junção 5' mostra a se- quência apresentada na figura 18 (SEQ ID NO: 29). A integração confirmada na junção 3' é mostrada pela sequência na figura 19 (SEQ ID NO: 30). A fi- gura 20 mostra que os clones expostos a dois ZFNS, dois doadores de oli- gonucleotídeos e um doador de plasmídeo (Z + O + D) compreendiam o 25 fragmento de PCR do sítio de junção 5' de tamanho 390 bp (figura 20A) e fragmento de PCR do sitio de junção 3' de tamanho 309 bp (figura 20B) indi- cativo da integração de sequência do doador.

Exemplo 8: Efeitos da ldentidade de Sequência de Ohqonucleotídeo na Mo- dificação de Genoma Mediada por OÍiqonucleotideo de uma Exclusão de 30 DNA ,qenômico de 10 kb-alvo Para investigar se a identidade de sequência do DNA no sÍtio homólogo da sequência genômica do o|igonuc|eotídeo afetaria a eficiência

" da exclusão da sequência genômica-alvo, uma sequência do oligonucleoti- deo foi alterada no segmento correspondente à extremidade de exclusão distal de 10 kb do sÍtio de corte de ZFN AAVSI, de modo que oligonucleotí- deos com 100°/o de identidade, 98% de identidade de sequência, 90% de 5 identidade de sequência, 50% de identidade de sequência estivessem pre- parados.

A eficiência da exclusão de 10 kb, em seguida, foi medida por PCR em tempo real de SYBR Green (figura 21). O ACt entre 100°6 de identidade e 98% de identidade foi 0,4; o ACt entre 100% de identidade e 9Õ°/o de iden- tidade foi 5; e o ACt entre 100% de identidade e 50°/o de identidade foi 7. A 10 eficiência de exclusão foi comparável entre os oligonucíeotídeos tendo 100% de identidade e os oligonucleotideos tendo 98% de identidade de sequência, A eficiência da exclusão diminuiu quando a identidade de sequência foi re- . duzida para 90%, e a eficiência foi significativamente inferior quando a iden- . . tidade de sequência foi de 5Ó°/o ou menos.

Claims (1)

1. .N

   REIVINDICAÇÕES

   1. Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula, o mêtodo caracterizado pelo fato de que compre- ende: 5 a) introduzir na célula (i) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico que codifica uma endonuclease-alvo, a endonuclease-alvo sendo capaz de introduzir uma quebra de fita dupla em um sÍtio de clivagem- alvo na sequência cromossômica, e (ii) pelo menos um ácido nucleico de fita única compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência 10 substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sÍtio de clivagem-alvo; e

   J b) manter a célula em condições tais que a quebra de fita dupla introduzida pela endonuclease-alvo seja reparada por um processo de ho- . mologia dirigida de tal modo que a sequência cromossômica seja trocada 15 com a sequência do ácido nL|c|eico de fita única, dessa forma editando a sequência cromossômica.

   2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única compreende uma segunda região tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica 20 no outro lado do sitio de clivagem-alvo-

   3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma alteração de pelo menos um nucleotideo em relação à sequência cromossômica de tal mo- do que a sequência cromossômica editada compreende uma inserção de pelo 25 menos um nucleotídeo, uma deleção de pelo menos um nucleotideo, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo, ou combinações das mesmas.

   4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma sequência exógena que é flanqueada pela primeira região e pela segunda regiâo, de tal 30 modo que a sequência cromossômica editada compreende uma sequência exógena integrada.

   5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   > fato de que o ácido nucieico de fita única compreende uma segunda região tendo identidade de sequência substancial para uma sequência cromossô- mica distal que está localizada a montante ou a jusante do sÍtio de clivagem- alvo, de tal modo que a sequência cromossômica editada compreende uma 5 deleção-

   6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma sequência exógena que é flanqueada pela primeira região e pela segunda região, de tal modo que a sequência cromossômica editada compreende ainda uma se- lO quência exógena integrada-

   7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo -" fato de que o ácido nucleico de fita única é linear ou circular.

   8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   W . fato de que o ácido nucleico de fita única tem um comprimento de cerca de 15 20 nucleotideos a cerca de 100.000 nucleotídeos.

   9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única compreende desoxirribonucleotí- deos, ribonucleotideos, miméticos de ribonucleotídeos, nucleotídeos modifi- cados, nucleotideos 2'-O-metila, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nuclei- 20 cos de peptideo ou combinações dos mesmos.

   10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única compreende ligações fosfodiéster, ligações fosforotioato, ligações fosforamidito, Iigações fosforodiamidato, ou combinações dos mesmos. 25 11 Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única é senso ou antissenso.

   12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fita única tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para pelo menos 10 nucleotideos em pelo menos 30 um lado do sÍtio de clivagem-alvo.

   13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco, uma

   'b meganuclease, uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE), uma nuclease sítio-específica ou um agente indutor de quebra de fita dupla de DNA-alvo artificial.

   14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 5 fato de que compreende ainda introduzir pelo rnenos um poIinucleotideo do- ador na célula.

   15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que uma endonuclease-alvo, um primeiro ácido nucleico de fita única compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência 10 substanciai para o lado a montante do sitio de clivagem-alvo, um segundo ácido nucleico de fita única compreendendo uma primeira porção tendo iden- tidade de sequência substancial para o lado a jusante do sÍtio de clivagem- alvo e um poIinucleotídeo doador são introduzidos na célula, o polinucleotí- . deo doador compreendendo uma primeira sequência tendo de identidade de - 15 sequência substancial para uma segunda porção do primeiro ácido nucleico de fita única e uma segunda sequência tendo identidade de sequência subs- tancial para uma segunda porção do segundo ácido nucleico de fita única, e em que a primeira e a segunda sequências do poIinucleotideo doador flan- queiam uma sequência para inserção na sequência cromossômica. 20 16- Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que uma primeira endonuclease-alvo, um primeiro ácido nucleico de fita única compreendendo uma primeira porção tendo identidade de se- quência substancial para o lado a montante do sÍtio de cIivagem-alvo da pri- meira endonuclease-alvo, uma segunda endonuclease-alvo, um segundo 25 ácido nucleico de fita única cornpreendendo uma primeira porção tendo iden- tidade de sequência substancial para o lado a jusante do sítio de clivagem- alvo da segunda endonuclease-alvo e um polinucleotideo doados são intro- duzidos na célula, o polinucleotídeo doador compreendendo uma primeira sequência tendo identidade de sequência substancial para uma segunda 30 porção do primeiro ácido nucleico de fita única e uma segunda sequência tendo identidade de sequência substancial para a segunda porção do se- gundo ácido nucleico de fita única, e em que a primeira e a segunda se-

   "% quências do polinucleotideo doador flanqueiam uma sequência para inser- ção na sequência cromossômica.

   17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada, uma célula primária, uma célula 5 imortal, uma célula-tronco, uma célula-tronco pIuripotente induzida (iPS) ou um embrião de célula única.

   18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula humana, uma célula de mamifero, uma célula de vertebrado, uma célula de invertebrado ou um eucariota unicelular. 10 19- Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco e o ácido nucleico de fita única é um ácido desoxirribonucleico compreendendo pelo menos 30 nucleotideos.

   20. Kit para editar uma sequência cromossômica endógena em 15 uma célula, o kit caracterizado peb fato de que compreende: a) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico que codifica uma endonuclease-alvo, a endonuclease-alvo sendo capaz de intro- duzir uma quebra de fita dupla em um sÍtio de clivagem-alvo na sequência cromossômica; e 20 b) pelo menos um ácido nucleico de fita única compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a se- quência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo.

   21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende uma segunda região 25 tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica no outro lado do sitio de clivagem-alvo.

   22. Kit, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma alteração de pelo menos um nucleotideo em relação à sequência cromossômica, de tal 30 modo que a sequência cromossômica editada compreende uma inserção de pelo menos um nucleotideo, uma deleção de pelo menos um nucleotideo, uma substituição de peio menos um nucleotídeo ou combinações dos mes-

   23. Kit, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fa- -. to de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma sequência exógena que é flanqueada pela primeira região e pela segunda região, de tal 5 modo que a sequência cromossômica editada compreende uma sequência exógena integrada.

   24. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende uma segunda região tendo identidade de sequência substancial para uma sequência cromossô- lO mica distal que está localizada a montante ou a jusante do sÍtio de clivagem- alvo, de tal modo que a sequência cromossômica editada compreende uma deleção. 25, Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fa- . to de que o ácido nucleico de fita única compreende ainda uma sequência 15 exógena que é flanqueada pela primeira região e pela segunda região, de tal modo que a sequência cromossômica editada compreende ainda uma se- quência exógena integrada.

   26. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única é linear ou circular. 20 27. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única tem um comprimento de cerca de 20 nucleotideos a cerca de 100.000 nucleotideos.

   28. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende desoxirribonucleotídeos, 25 ribonucleotideos, miméticos de ribonucleotideos, nucleotideos modificados, nucleotídeos 2'-O-metila, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de peptídeo ou combinações dos mesmos.

   29. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que o ácido nucleico de fita única compreende ligações fosfodiéster, 30 ligações fosforotioato, ligações fosforamidito, ligações fosforodiamidato ou combinações das mesmas.

   30. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa-

   to de que o ácido nucleico de fita única é senso ou antissenso.

   31. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- . to de que o ácido nucleico de fita única tem pelo menos cerca de 9O°/j de identidade de sequência para pelo menos 10 nucleotideos em pelo menos 5 um lado do sítio de clivagern-alvo.

   32. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco, uma me- ganuclease, uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE), uma nuclease sÍtio-especifica ou um agente indutor de quebra de dupla fita de 10 DNA-alvo artificial.

   33. Kit, de acordo com a reivindicaçâo 20, caracterizado pelo fa- to de que o kit compreende urn primeiro ácido nucleico de fita única compre- endendo uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial m . para o lado a montante do sítio de clivagem-alvo e um segundo ácido nuclei- 15 co de fita única compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para o lado a jusante do sÍtio de clivagem-alvo, e compreendendo ainda um polinucleotídeo doador, o polinucieotídeo doador compreendendo uma primeira sequência tendo identidade de sequência substancial para uma segunda porção do primeiro ácido nucleico de fita úni- 20 ca e uma segunda sequência tendo identidade de sequência substancial para uma segunda porção do segundo ácido nucleico de fita única, e em que a primeira e a segunda sequências do polinucleotídeo doador flanqueiam uma sequência para inserção na sequência cromossômica.

   34. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- 25 to de que compreende adicionalmente pelo menos um iniciador para PCR.

   35. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- to de que compreende ainda pelo menos um reagente escolhido entre um tampão, um diluente e um meio de cuitura.

   36. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fa- 30 to de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco e o ácido nucleico de fita única é um ácido desoxirribonucleico compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos.

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