JP2003225089A - ブタｒａｇ−１遺伝子およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNA
を提供することを課題とする。さらに、本発明は、ブタ
RAG-1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを
課題とする。 【解決手段】 ブタゲノムDNAライブラリーのスクリー
ニングを行い、ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローンを得
た。このBACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブ
クローニングし、3つのクローンを得た。これらのクロ
ーンのシークエンスによる塩基配列決定、制限酵素消化
によるマッピングを行い、遺伝子地図を作製した。この
情報をもとにRAG-1遺伝子をノックアウトするターゲテ
ィングベクターを作製した。該ベクターを利用して内因
性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制することにより、獲
得免疫の無いブタを作製することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ブタRAG-1遺伝子
およびその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊椎動物において、外来の病原体と戦う
主戦力は、獲得免疫系である。獲得免疫系は、生後に外
来の異物（抗原）の刺激の結果、生体の免疫系が後天的
に得るその抗原特異的な免疫状態であり、T細胞の抗原
受容体又はB細胞が生産する免疫グロブリンが抗原を識
別することが引き金となって開始される。T細胞抗原受
容体と免疫グロブリンは、胎性細胞のゲノム遺伝子がT
細胞乃至B細胞に分化する過程で遺伝子再構成して、そ
の結果機能遺伝子になり、獲得免疫能を発揮する。この
獲得免疫系発生での遺伝子再構成の発見により、利根川
進博士が1987年ノーベル生理学・医学賞を受賞した。

【０００３】遺伝子再構成は、ゲノム遺伝子上の再構成
シグナル配列を、RAG-1蛋白質（再構成活性化遺伝子（R
ecombination Activating Gene）の1型産物）とRAG-2蛋
白質との複合体が切断することで開始される。RAG-1遺
伝子が無いと、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出
来ないことが判明しており、獲得免疫の無い重症複合免
疫不全症になることが知られている。実際、ノックアウ
ト法により作出したRAG-1遺伝子欠損マウスでは、T細胞
抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが知られて
いる（Mombaerts, P. et al., Cell, 1992, 68(5), 869
-77.）。

【０００４】このような獲得免疫が無いマウスを、異種
移植用、再生医学用などに用いることが考えられるが、
マウスはヒトと比べて臓器のサイズが小さく、さらに、
マウスは生理学的にヒトとは大きく違う（例えば、マウ
スの寿命は約2年であり、細胞の老化速度がヒト細胞に
比べて速い）ので、異種移植用、再生医学用などに適さ
ないという問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、体液組
成や生理機能がヒトに似ており、霊長類に比べ世代時間
が短い動物であるブタは、異種移植用、再生医学用など
に適するサイズの動物としても好適であると考えた。し
かしながら、現在までに、RAG-1遺伝子ノックアウトブ
タに関する報告は皆無である。また、ノックアウトブタ
を作製するためにはブタRAG-1遺伝子の同定が前提とな
るが、いまだブタRAG-1蛋白質をコードするDNAが単離さ
れたという報告もない。

【０００６】本発明は、このような状況に鑑みてなされ
たものであり、その第一の目的は、ブタRAG-1蛋白質を
コードするDNAを提供することにある。さらに、本発明
は、該DNAを発現するベクター、該ベクターが導入され
た形質転換体、ブタRAG-1蛋白質およびその製法、並び
に該蛋白質に結合する抗体を提供することを目的とす
る。

【０００７】また、本発明は、ブタRAG-1遺伝子の機能
が抑制されたブタを作製することを目的とする。さら
に、該ブタの作製に利用されるベクターおよび細胞を提
供することも本発明の目的である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、ブ
タゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行い、ブ
タRAG-1遺伝子を含むBACクローンを得た。このBACクロ
ーンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニング
し、3つのクローンを得た。これらのクローンのシーク
エンスによる塩基配列決定、制限酵素消化によるマッピ
ングを行い、遺伝子地図を作製した。この情報をもとに
RAG-1遺伝子をノックアウトするターゲティングベクタ
ーを作製した。

【０００９】具体的には、RAG-1遺伝子開始コドンの5’
側直前にあるKpnI認識部位からその下流約1.4kbの位置
にあるHincII認識部位までをピューロマイシン耐性遺伝
子に置換した。このピューロマイシン耐性遺伝子は、遺
伝子導入の際の陽性選択に用いる。この置換によりRAG-
1遺伝子は発現することが出来ない。相同組換え領域と
しては開始コドンの上流約9.0kbに存在するXhoI認識部
位から開始コドンの下流約2.5kbの位置に存在するXhoI
認識部位までとした。また、遺伝子導入の際の陰性選択
用にDT-A遺伝子を結合した。作製したターゲティングベ
クターを用いて、ブタの内因性RAG-1遺伝子の機能を抑
制することにより、獲得免疫系の無いブタを作製するこ
とが可能である。

【００１０】従って、本発明は、ブタ由来のRAG-1蛋白
質をコードするDNAおよびその利用、特に獲得免疫系の
無いブタの作製のための利用に関し、より具体的には、
〔１〕以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のブタ
由来のＤＮＡ、（ａ）配列番号：１または２に記載の塩
基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号：３に記載のア
ミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｃ）
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1若しくは
複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、および／または挿
入されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡ組み換え誘導活
性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、〔２〕〔１〕に
記載のＤＮＡを含むベクター、〔３〕〔１〕に記載のＤ
ＮＡまたは〔２〕に記載のベクターを保持する形質転換
細胞、〔４〕〔１〕に記載のＤＮＡによりコードされる
蛋白質、〔５〕〔３〕に記載の形質転換細胞を培養し、
その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を含
む、〔４〕に記載の蛋白質の製造方法、〔６〕〔４〕に
記載の蛋白質に結合する抗体、〔７〕相同組み換えによ
り内因性のブタＲＡＧ−１遺伝子の機能を抑制するＤＮ
Ａ配列を含むベクター、〔８〕〔７〕に記載のベクター
が導入されたブタ細胞、

〔９〕以下の（ａ）および
（ｂ）の工程を含む、内因性ＲＡＧ−１遺伝子の機能が
抑制されたブタの製造方法、 （ａ）〔８〕に記載の細胞の核を除核卵子に移植する工
程 （ｂ）工程（ａ）で得られた除核卵子をブタに移植する
工程 〔１０〕〔８〕に記載の細胞をブタに移植する工程を含
む、内因性ＲＡＧ−１遺伝子の機能が抑制されたブタの
製造方法を、提供するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、ブタRAG-1蛋白質をコ
ードするDNAを提供する。本発明において「RAG-1蛋白
質」とは、遺伝子再構成を開始するために必須なRAG蛋
白質複合体のうち1型産物を意味する。本発明におい
て、RAG-1蛋白質の活性は、DNA組み換え誘導活性として
測定することが可能である。DNA組み換え誘導活性の測
定は、公知の手法で行うことができる（AgawalA., East
manq.M. and Schatz D.G., 1998, Nature, 394, 744-75
1.）。本発明において明らかにされた、ブタRAG-1の遺
伝子配列を配列番号：１、cDNA配列を配列番号：２、こ
れらDNAがコードするRAG-1蛋白質のアミノ酸配列を配列
番号：３に示す。

【００１２】本発明は、また、ブタRAG-1蛋白質の変異
体をコードするDNAを包含する。このような蛋白質を調
製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋
白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当
業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Goto
h, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ,
and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-50
0、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12,
9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods.
Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl A
cad Sci USA. 82,488-492、Kunkel (1988) Methods Enz
ymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ブタRAG-1蛋白質
（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）
のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質
と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。ま
た、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。この
ように、ブタRAG-1蛋白質のアミノ酸配列において1もし
くは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該
蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に
含まれる。このような変異体における、変異するアミノ
酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30ア
ミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内
（例えば、5アミノ酸以内）であると考えられる。

【００１３】変異するアミノ酸残基においては、アミノ
酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異され
ることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質として
は、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、
T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、
P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫
黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸
及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含
有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることが
できる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表
す）。

【００１４】あるアミノ酸配列に対する１又は複数個の
アミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸によ
る置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質が
その生物学的活性を維持することはすでに知られている
（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M.Nu
cleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang,
A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFar
land, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982)
79, 6409-6413 ）。

【００１５】ブタRAG-1蛋白質のアミノ酸配列に複数個
のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、融合蛋白質が
含まれる。融合蛋白質は、ブタRAG-1蛋白質と他のペプ
チド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明に含ま
れる。融合蛋白質を作製する方法は、ブタRAG-1蛋白質
（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）
をコードするDNAと他のペプチド又は蛋白質をコードす
るDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現
ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に
公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との
融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に
限定されない。

【００１６】ブタRAG-1蛋白質との融合に付される他の
ペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et a
l., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis
（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフ
ルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断
片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T
抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Pr
otein C の断片等の公知のペプチドを使用することがで
きる。また、ブタ由来のRAG-1蛋白質との融合に付され
る他の蛋白質としては、例えば、GST（グルタチオン−S
−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集
素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダー
ゼ、MBP（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市
販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードする
DNAを本発明の蛋白質をコードするDNAと融合させ、これ
により調製された融合DNAを発現させることにより、融
合蛋白質を調製することができる。

【００１７】また、本発明は、上記DNAを含むベクタ
ー、該ベクターが導入された形質転換体、上記DNAによ
りコードされる蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質
に結合する抗体を提供する。

【００１８】本発明のベクターとしては、当業者におい
て一般的に使用されるものを用いることができる。例え
ば、形質転換における宿主として大腸菌を用いる場合に
は、例えば、大腸菌内で複製させるための「ori」、お
よび形質転換された大腸菌を選抜するための遺伝子（例
えば薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイ
シン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子）をベクタ
ー上に有することが望ましく、このようなベクターとし
て具体的には、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR32
2、pBluescript、pCR-Script、pGEM-T、pDIRECT、pT7等
を挙げることができる。

【００１９】RAG-1蛋白質を生産する目的においてベク
ターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用で
ある。発現ベクターとしては、例えば大腸菌での発現を
目的とした場合は、lacZプロモーター（Ward et. al.,
Nature, 1989, 341, 544-546.）、araBプロモーター（B
etter et. al., Science, 1988, 240, 1041-1043.）、
またはT7プロモーター等を有するベクターを例示するこ
とができる。このようなベクターとしては、上記ベクタ
ーの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpres
s system」（キアゲン社製）、pEGFP、およびpET(この
場合、宿主はT7RNAポリメラーゼを発現するBL21が好ま
しい)等が挙げられる。また、発現ベクターには、ポリ
ペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよ
い。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、例えば
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル
配列（Lei, S. P. et. al., J. Bacteriol., 1987, 16
9, 4379.）等を使用すればよい。

【００２０】RAG-1蛋白質を製造するための他のベクタ
ーとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター（例え
ばpcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic
Acids. Res., 1990, 18(17), 5322.、pEF、pCDM8)、昆
虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC bacul
ovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBac
PAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH
2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えばpHSV、p
MV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター
（例えばpZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば
「Pichia ExpressionKit」（インビトロゲン社製）、pN
V11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えばpP
L608、pKTH50）等が挙げられる。

【００２１】CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細
胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させる
ために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター
（Mulligan et. al., Nature, 1979, 277, 108.）、MML
V-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushima e
t. al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322.）、CMV
プロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞
への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば薬剤（ネ
オマイシン、G418等）耐性遺伝子）を有すればさらに好
ましい。このような特性を有するベクターとしては、例
えばpMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等
が挙げられる。

【００２２】さらに、遺伝子を安定的に発現させ、か
つ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場
合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補
するDHFR遺伝子を有するベクター（例えばpCHOI等）を
導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方
法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とす
る場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に
持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（p
cD等）で形質転換する方法が挙げられる。

【００２３】また、複製開始点としては、ポリオーマウ
ィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BP
V）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿
主細胞系で遺伝子コピー数増幅のために、発現ベクター
は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェ
ラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝
子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素
（dhfr）遺伝子等を含むことができる。

【００２４】ベクターが導入される宿主としては特に制
限はなく、例えば大腸菌や種々の真核細胞等を用いるこ
とが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物
細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができ
る。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、
3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeL
a、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母
細胞（Valle, et. al., Nature 291： 358-340, 198
1）、あるいは昆虫細胞、例えばSf9、Sf21、Tn5が知ら
れている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損
したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1980, 77, 4216-4220.）やCHO K-1（Proc.Natl.
Acad. Sci. USA, 1968, 60, 1275.）を好適に使用する
ことができる。動物細胞において、大量発現を目的とす
る場合には特にCHO細胞が好ましい。植物細胞として
は、例えばニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacu
m）由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、酵
母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、例え
ばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillu
s）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus n
iger）が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌
細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えばJM109、DH5
α、HB101、XL1Blue、BL21等が挙げられ、その他、枯草
菌が知られている。

【００２５】また、宿主として動物を使用する場合、哺
乳類動物、植物、昆虫が挙げられる。哺乳類動物として
は、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることが
できる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appli
cations, 1993）。また、植物を使用する場合、例えば
タバコを用いることができる。さらに、昆虫としては、
例えばカイコを用いることができる。

【００２６】本発明の形質転換体を作製するためには、
上記宿主に上記ベクターを導入する。そのための方法と
しては、大腸菌等の宿主細胞へのベクターの導入の場
合、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション
法 (Chu, G. et. al., Nucl. Acid. Res., 1987, 15, 1
311-1326.)を用いることができる。また、培養細胞等の
宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えばリン酸カル
シウム法 (Chen, C. andOkayama, H. Mol. Cell. Bio
l., 1987, 7, 2745-2752.)、DEAEデキストラン法(Lopat
a, M. A. et. al., Nucl. Acid. Res., 1984, 12, 5707
-5717.、Sussman,D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Bi
ol., 1985, 4, 1642-1643.)、カチオニックリボソームD
OTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、リ
ポフェクチン法 (Derijard, B. Cell, 1994, 7, 1025-1
037.、Lamb, B. T. et. al., Nature Genetics, 1993,
5, 22-30.、Rabindran, S. K. et. al., Science, 199
3,259, 230-234.)等の方法を用いることが可能である。

【００２７】さらに、動物にDNAを導入する場合、該DNA
を適当なベクター（例えばアデノウイルスベクター（例
えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPn
eo)等が挙げられるが、これらに制限されない。）に組
み込み、例えばレトロウイルス法、リポソーム法、カチ
オニックリポソーム法、アデノウィルス法等により生体
内に導入することが可能である。また、昆虫にベクター
を導入する場合、例えば目的の蛋白質をコードするDNA
を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させること
により行うことができる（Susumu, M. et. al., Natur
e, 1985, 315, 592-594.）。また植物にDNAを導入する
場合、例えば目的とする蛋白質をコードするDNAを植物
発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクタ
ーをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact
erium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。
このバクテリアをタバコ、例えばニコチアナ・タバカム
に感染させることでベクターを導入することができる
（Julian K.-C. Ma et. al., Eur. J. Immunol., 1994,
24, 131-138.）。

【００２８】本発明のRAG-1蛋白質は、例えば本発明の
形質転換体を培養することにより生産させることが可能
である。培養は公知の方法に従い行うことができる。例
えば、動物細胞の培養であれば、一般的に、培養液とし
ては、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDM等を使用することが
できる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併
用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時
のpHは、通常、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通
常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培
地の交換、通気、攪拌を加える。

【００２９】本発明のRAG-1蛋白質は、宿主細胞内また
は細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一な
蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精
製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製
方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾
過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、
透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分
離、精製することができる。または、さらにこれらのカ
ラムを複数組み合わせることにより精製することが可能
である。

【００３０】クロマトグラフィーとしては、例えば後述
する本発明のRAG-1蛋白質に対する抗体をカラムに固定
したアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる（Strategies for Protein Purificatio
n and Characterization: A Laboratory Course Manua
l. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフ
ィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等
の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
これらの精製方法を用い、本発明のRAG-1蛋白質を高度
に精製することもできる。

【００３１】なお、蛋白質を精製前または精製後に適当
な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾
を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。
蛋白質修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリ
プシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナー
ゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。

【００３２】また、本発明のRAG-1蛋白質をグルタチオ
ン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質とし
て、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換え蛋白質
として宿主細胞（例えば動物細胞や大腸菌等）内で発現
させた場合には、発現させた組換え蛋白質はグルタチオ
ンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製すること
ができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白
質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまた
はファクターXa等により切断し、除去することも可能で
ある。

【００３３】さらに、個体で蛋白質を産生させる系から
蛋白質を回収することも可能である。個体で蛋白質を産
生させる系としては、例えば動物を使用する産生系や植
物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または
植物に目的とするDNAを導入し、動物または植物の体内
で蛋白質を産生させた後に、蛋白質を回収する。

【００３４】例えば目的とするDNAを、ヤギβカゼイン
のような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする
遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融
合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を
雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるト
ランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁か
ら、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニ
ックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させ
るために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使
用してもよい（Ebert, K. M. et. al., Bio/Technolog
y, 1994, 12, 699-702.）。

【００３５】また、昆虫を使用する場合は、例えば目的
の蛋白質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルス
を感染させたカイコの体液から目的の蛋白質を得ること
ができる（Susumu, M. et. al., Nature, 1985, 315, 5
92-594.）。

【００３６】さらに、植物を使用する場合、例えば上記
方法でベクターを導入したニコチアナ・タバカム由来の
細胞から当業者に周知の方法（Toki et. al., Plant Ph
ysiol, 1995, 100, 1503-1507.）で再生させたタバコ
（タバコの葉）より所望の蛋白質を得ることができる
（Julian K.-C. Ma et. al., Eur. J. Immunol., 1994,
24, 131-138.）。

【００３７】本発明のRAG-1蛋白質に結合する抗体は、R
AG-1蛋白質の精製や検出に使用することが可能である。
本発明のRAG-1蛋白質の精製や検出に用いる抗体は、公
知の方法により作製することができる。抗体の形態には
特に制限はない。ウサギ等の免疫動物に抗原蛋白質を免
疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子
組換えによるヒト型化抗体も含まれる。さらに、抗体
は、RAG-1蛋白質に結合する限り、抗体断片や抗体修飾
物であってよい。

【００３８】抗体は、RAG-1蛋白質を感作抗原として使
用し、取得することができる。感作抗原として使用され
るRAG-1蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、ま
た、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、蛋白
質を発現する細胞またはその溶解物あるいは化学的に合
成したRAG-1蛋白質を感作抗原として使用してもよい。
短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、
ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン等のキャリア蛋白
質と適宜結合させて抗原とすることができる。

【００３９】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、モノクローナル抗体の
作製においては細胞融合に使用する親細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス等
のげっ歯目、ウサギ等のウサギ目、アカゲザル等の霊長
目の動物が使用される。感作抗原を動物に免疫する方法
は、当業者にとっては周知である。

【００４０】ポリクローナル抗体を得る例としては、血
清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、
抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液か
ら公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗
体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用して
もよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体
を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。

【００４１】モノクローナル抗体を得る例としては、上
記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベル
が上昇するのを確認した後に、免疫細胞を取り出し、細
胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好
ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記
免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましく
は哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤に
よる融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細
胞が挙げられる。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞
融合は基本的には公知の方法、例えばミルステインらの
方法(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymo
l., 1981, 73, 3-46.) 等に準じて行うことができる。

【００４２】次いで、周知の方法で細胞融合により得ら
れたハイブリドーマから目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマのクローニングを行い、クローニングされた
ハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより
腹水を回収する。

【００４３】得られた抗体は、均一にまで精製すること
ができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用され
ている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィ
ニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカ
ラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選
択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができ
る(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and
David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)
が、これらに限定されるものではない。アフィニティー
クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイ
ンAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えばプ
ロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D, PORO
S, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

【００４４】抗体の抗原結合活性を測定する方法として
は、例えば吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法(Enz
yme-linked immunosorbent assay；ELISA)、EIA（酵素
免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗
体法を用いることができる。ELISAを用いる場合、抗体
を固相化したプレートにRAG-1蛋白質を添加し、次いで
目的の抗体を含む試料、例えば抗体産生細胞の培養上清
や精製抗体を加える。酵素、例えばアルカリフォスファ
ターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、
プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、
p-ニトロフェニル燐酸等の酵素基質を加えて吸光度を測
定することで抗原結合活性を評価することができる。プ
レートに添加する蛋白質としては、RAG-1蛋白質の断片
等を使用してもよい。

【００４５】また、本発明は、相同組み換えにより内因
性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベ
クター（ターゲティングベクター）を提供する。該ベク
ターを用いることで、内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑
制された（RAG-1遺伝子がノックアウトされた）ブタ個
体を作出することが可能である。該ベクターによるRAG-
1遺伝子の機能の抑制は、RAG-1遺伝子の発現制御領域に
変異を導入することにより、RAG-1遺伝子の発現を抑制
することにより行うことができる。また、RAG-1遺伝子
のエキソン領域に変異を導入することにより、野生型の
RAG-1蛋白質に比べ活性が抑制されたRAG-1蛋白質変異体
を発現させることによって行ってもよい。RAG-1遺伝子
の機能の「抑制」には、完全に抑制する場合および部分
的に抑制する場合の双方が含まれる。

【００４６】相同組み換えにより内因性のブタRAG-1遺
伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベクターは、相同
組み換えにより、内因性のブタRAG-1遺伝子に該遺伝子
の機能を抑制する変異を導入可能なベクターであれば特
に制限はない。このようなベクターとしては、例えば、
変異を有するブタRAG-1遺伝子の発現制御領域もしくは
エキソン領域、および／または、相同組換え領域を含む
ベクターが挙げられる。また、陽性選択（DNAが導入さ
れた細胞のみを選び出すための選択）に用いる遺伝子、
または、陰性選択（非相同組換え体を取り除くための選
択）に用いる遺伝子をさらに含むベクターであってもよ
い。また、RAG-1遺伝子部位の組換えを促進する酵素、
例えば、Cre-loxにおけるCreをコードする配列をさらに
含むベクターであってもよい。

【００４７】変異の導入には、例えば、実施例に記載し
たように陽性選択に用いる遺伝子を使用することができ
るが、内因性RAG-1遺伝子の機能を抑制しうる限り、こ
れに制限されない。陽性選択に用いる遺伝子としては、
特に制限はなく、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝
子、および、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられ
る。また、陰性選択に用いる遺伝子としては、チミジン
キナーゼ遺伝子、および、ジフテリア毒素遺伝子などが
挙げられる。

【００４８】また、本発明において、相同組換え領域と
は、ゲノムDNAに、変異を有するブタRAG-1遺伝子の発現
制御領域またはエキソン領域を導入する際の相同組換え
を媒介するDNA配列を意味する。よって、本発明におけ
る相同組換え領域は、相同組換えの媒介が可能なDNA配
列であれば、特に制限はない。このようなDNA配列の選
択は、当業者であれば通常行いうることである。

【００４９】また、本発明は、本発明のターゲティング
ベクターが導入されたブタ細胞を提供する。該ブタ細胞
としては、体細胞、受精卵などが挙げられるが、これら
に制限されない。

【００５０】本発明において、ターゲティングベクター
の上記細胞への導入方法としては、当業者に公知の方法
によって行うことができる。具体的には、電気穿孔法
（エレクトロポーレーション法）を挙げることができ
る。例えば、1×10⁷個の細胞と50nMのターゲティングベ
クターを500μlのHEPESバッファーに懸濁し、4.0mmギャ
ップのエレクトロポーレーション用キュベットに入れ
る。エレクトロポーレーターを用いて250V、960μF、抵
抗無限大の設定（由来細胞により値変化あり）で１パル
ス与えて細胞内に遺伝子を導入する。

【００５１】さらに、本発明は、RAG-1遺伝子がノック
アウトされた（内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑制され
た）ブタの製造方法を提供する。該方法としては、特に
制限はなく、例えば、内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑
制された体細胞の核を除核卵子に移植して、得られた除
核卵子をブタに移植することで、ブタ個体を出産させる
方法が挙げられる。また、別の態様としては、受精卵に
本発明のターゲティングベクターを直接注入し、得られ
た受精卵をブタに移植することで、ブタ個体を出産させ
る方法が挙げられる。

【００５２】

【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。

【００５３】[実施例１] ブタRAG-1遺伝子ノックア
ウト用ターゲティングベクターの作製 まず、ブタRAG-1のcDNAの単離を試みた。その際、既知
の遺伝子を入手できなかった。また、既知のマウスとヒ
トのヌクレオチド配列情報を子細に検討したが、ブタRA
G-1のcDNAの検索に他動物種のプローブでは、クロスハ
イブリダイゼーションが出来ない可能性があると判断さ
れた。従って、ブタmRNAより逆転写PCRを行った。最
初、ヒトRAG-1遺伝子で用いられている既報のPCRプライ
マー（Chunet al., Cell 64:189-200(1991)）4本を用い
たが、PCR産物はブタからは得られなかった。そこで、
マウスとヒトのヌクレオチド配列の共通領域を手がかり
に多数のプライマーを作成して試行錯誤した結果、1161
bp（9.1kbpの添付ヌクレオチド配列の7010bpから8171b
p）のヒトRAG-1のcDNAとヌクレオチド配列で88%相同性
のあるcDNA断片がクローン化された。これをプローブと
して、ブタの胸腺のcDNAライブラリーを検索して、全長
の約80%をカバーするcDNAクローンを得た。尚、残りのc
DNAヌクレオチド配列は、５’RACE法と３’RACE法を用
いた。このように、ブタRAG-1のcDNA領域を部分的にク
ローニングするのは非常に困難であった。

【００５４】次に、このcDNAの情報をもとに、PCRプラ
イマーを設計した。作成したPCRプライマーを用いて、
ブタゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行い、
ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローン578B12を得た。この
BACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニ
ングし、3つのクローン（Rag1-BAC-SacI約6.1kb、Rag1-
Clawn-genome-BamHI約6.0kb、pBKS-RagKp約12.6kb）を
得た（図１）。これらのクローンのシークエンスによる
塩基配列決定（約9.1kb）（配列番号：１）、制限酵素
消化によるマッピングを行い、約16kbの遺伝子地図を作
製した（図１および２）。この情報をもとにRAG-1遺伝
子をノックアウトするターゲティングベクターを作製し
た。

【００５５】このターゲティングベクターでは、RAG-1
遺伝子開始コドンの5’側直前にあるKpnI認識部位から
その下流約1.4kbの位置にあるHincII認識部位までをピ
ューロマイシン耐性遺伝子に置換してある（図３）。こ
のピューロマイシン耐性遺伝子は、遺伝子導入の際の陽
性選択に用いる。この置換によりRAG-1遺伝子は発現す
ることが出来ない。相同組換え領域としては開始コドン
の上流約9.0kbに存在するXhoI認識部位から開始コドン
の下流約2.5kbの位置に存在するXhoI認識部位までとし
た。また、遺伝子導入の際の陰性選択用にDT-A遺伝子を
結合してある（図３）。

【００５６】まず5’側の相同組換え領域を含むpBKS-Ra
gKpをXhoI消化後自己連結し、pBKS-RagXKを得た。ま
た、3’側の相同組換え領域を含むRag1-Clawn-genome-B
amHIをHincIIとNotIで消化して得られた約2.2kbの断片
を、同じくHincIIとNotIで消化したpBleuscriptKS(-)に
連結し、pBKS-RagHNとした。このベクターをXhoIで部分
消化して自己連結し、終止コドンを含む約1.2kbを除い
たpBKS-RagHXを得た。このpBKS-RagHXをXhoIで部分消化
した約4.0kbの断片と、ピューロマイシン耐性遺伝子を
持つpPGK-puroをSalIで消化した約1.7kbの断片を連結し
た。これによりピューロマイシン耐性遺伝子の向きが異
なる2種類のベクター、pBKS-PuroF-RagHXとpBKS-PuroR-
RagHXを得た。この2つのベクターをKpnIとNotIで消化し
た約2.7kbの断片と、先に得たpBKS-RagXKをSalIとKpnI
で消化して得た約9.0kbの断片を、DT-A遺伝子を持つベ
クターpMC1DTpAMCSをNotIとSalIで消化して得た約4.3kb
の断片とともに連結し、2種類のターゲティングベクタ
ー、pTV-Rag1puroFとpTV-Rag1puroRを得た（図４）。

【００５７】

【発明の効果】本発明のターゲティングベクターを用い
ることにより、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンの無
いブタが出来る。このことは、獲得免疫が無いブタが得
られることであり、幾つかの重要な応用が可能となる。

【００５８】（１）異種移植用ミニブタ 現在、脳死個体からの臓器移植は、技術の進歩により需
要が臓器の供給の5倍以上あり、ヒトの臓器の闇市場ま
で出来ている程、深刻な供給不足である。ヒトへの臓器
移植用のヒト遺伝子を導入した改良ミニブタが既に欧米
のベンチャー企業数社で開発され、ヒヒ等の霊長類への
移植で数ヶ月の移植状態持続に成功している。これらの
異種移植用ミニブタでは、超急性血管性拒絶反応等比較
的早期に生じる拒絶反応は無くなっているが、徐々に出
てくる細胞性拒絶反応がまだ長期の移植持続で解明され
なければならない。この細胞性拒絶反応は、移植を受け
たレシピエントの獲得免疫系がどう移植臓器に反応する
かと云う問題と、移植臓器に付着したブタT細胞とB細胞
が移植を受けたレシピエントの体内で増殖し、レシピエ
ントを異物と認識したブタの免疫機能の暴走の問題との
二つの側面を検討する必要がある。異種移植用ミニブタ
のRAG-1をノックアウトして、T細胞とB細胞を無くした
ブタでは、移植後のブタ獲得免疫系のレシピエントへの
持ち込みが無くなる。このため、異種移植の成功率は飛
躍的に向上すると期待される。

【００５９】（２）再生医学用、ヒト臓器培養器として
のRAG-1ノックアウト・ブタ 胸腺の無いヌードマウスは、T細胞抗原受容体が無いの
で獲得免疫能が無く、ヒトの細胞や臓器に対する拒絶反
応が失われている。そこで、現在、ヒトの鼻や耳介など
形成外科の移植用器官の生育が、ヌードマウスで行われ
ている。しかし、マウスでは、動物のサイズに限界があ
り、より大きな再生医学用臓器の作製は可能で無い。

【００６０】家畜の中では、他の草食動物に比べ、雑食
であるブタがより体液組成や生理機能がヒトに似てお
り、更に、霊長類に比べて動物の世代時間が短いので、
再生医学用ヒト臓器培養母体として最も適切な動物であ
る。RAG-1ノックアウト・ブタは、獲得免疫を失ってい
るので、ヌードマウスの様に、ヒトの臓器を拒絶するこ
とはなく、栄養を補給して、臓器を培養作製できる。

【００６１】（３）ブタを用いたヒト獲得免疫能の開発 RAG-1ノックアウト・ブタにヒトの骨髄を導入すれば、
自身の獲得免疫能がないので、ヒト獲得免疫能をブタ体
内に構築できると予想される。獲得免疫能についてヒト
-ブタ・骨髄キメラ動物が出来れば、現在行われている
組換えDNA手法によりマウスの抗体をヒト化する等の必
要もなくなり、直接、ヒト抗体を産生するブタが作出可
能となる。T細胞についても、T細胞抗原認識に主要な役
割をするMHC（主要組織適合性抗原複合体）のクラスII
分子が、ヒトとブタとで酷似しているので、ヒト体内で
機能するヒト・ヘルパーT細胞を産生出来る。例えば、
エイズ感染患者は、エイズウイルスがヘルパーT細胞のC
D4分子を介して感染してヘルパーT細胞を死滅させ、そ
の結果獲得免疫能が失われて日和見感染で死亡する。
が、ヒトのエイズウイルス耐性CD4分子が既に作製され
ており、自己のヘルパーT細胞をエイズウイルス耐性化
後RAG-1ノックアウト・ブタ体内で増殖させ、エイズ患
者に戻せば、獲得免疫能力が回復できる。免疫不全患者
や、老化による免疫能の低下は、RAG-1ノックアウト・
ブタ体内で増殖させた自己の獲得免疫系細胞を注入する
事により、免疫能や活力を回復できる。

【００６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Sciences <120> Pig RAG-1 gene and use thereof <130> MOA-A0111 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9098 <212> DNA <213> Sus.scrofa <220> <221> exon <222> (827)..(924) <220> <221> intron <222> (925)..(5364) <220> <221> exon <222> (5365)..(9098) <400> 1 gagctcctgt tgtggctcag taggttaaga acccagcaca gggtctgtga ggattcgggt 60 tcaatccttg gtctcgatca gtgggttaag gatccgtcat tgccgtgagc tgtggtgtag 120 gttgcggatg caagtggatc cggtgtggct gtggtgcagg ctggcagatg caactccaat 180 tccaccccta acccaggaac ttccatatgc cgcaggtgca gtcctgaaaa gaaaagaaag 240 gaatggaaaa gcaaggaaag gaaaggaaaa gaaaagaact ccagtaatgt aaacatggtg 300 ttgttgcaag gagcacagaa ttccctgact gagaactgac cagggaggag aattctgcgg 360 gtggtttggt taccatttca aaattataat aaaaagtgct cagatagtta gcatttgatg 420 agtatctgct aaaggtaaac actgtcccaa gtcttctcct ataacaagtc tcactataac 480 ctcattgact ctcagaaatg actcttcaga tttccagctt gcaggtgggg aaactaaggc 540 acagagctgc gggagcttag cacaagcccg 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tacagcagga tcattgaaat 1440 gcttgttaaa aaatatgatc tctggagttc ccgtcgtggc gcagtggtta acgaatccga 1500 ctaggaacca tgaggttgcg ggttcggtcc ctgcccttgc tcagtgggtt aacgatccgg 1560 cgttgccgtg agctgtggtg taggttgcag acgtggctcg gatcccgcgt tgctgtggct 1620 ctggcgtagg ccggtggcta cagctccgat tcgaccccta gcctgggaac ctccatatgc 1680 cgcgggagcg gcccaagaaa tagcaacaac aacaacaaca acaaaagaca aaagacaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaatatga tctctggact ccaccccaga taaattgaat cagattctct 1800 gggacctgac gatctgcctt atttttttaa acccaagttc cctagtgatt ctgatacaga 1860 gcaattttga gaatgccacg gtagagccct acacagaggt tatgttcttg aacagggttc 1920 ctgaccaggg gctgaagtgc ttcaagcaag aagttgcctg gaggaagcgt aagaatcttc 1980 aggtcatctt gtagatgcct gagacttata aaaggctttt gatactatca ttttttgatg 2040 atggtgtttg gcaaagagta gacaataata tttgcggagt gaatgaatga gggattaagt 2100 gggacaggtg tgacaataaa ggatcacacc tgggcacact gcagtcactc aaactttgtg 2160 tgtggaccaa gtggaatatg ttaagaggag agatgactga ccaagggcca gctcggaggt 2220 gtgtgtaagg tgtgtgtgtc gggggagctt ggcagggagg 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aataaaaaag aataattttt 4800 ataaaagaaa tgattgtaca tatatacgta aaatagacca tggtgatgat gcgtgaacgc 4860 agaaacatgt aaatggacaa tgccactgaa agaacaggaa atgactctgt tttctgtata 4920 tgatcagccc taacatagta tattaacata ggaagccaaa caattaactt tctgaatgct 4980 ttaataaatg aataggcgtt cccattgtgg cgcagtggtt aacgaatcca actaggaacc 5040 atgaggttgt gggttcgatc cctgcctttg ctcagtgggt taaggagccg gtattgccat 5100 gatctgtggt gtaggtcgca gatgcggctc aggtcccaag cagctgtggc tctggcgtag 5160 gccagcggct gcagctcccc tagcctggga acctccgtgt gctggttctg aaaaaaggca 5220 aaaagacaaa aaaataaaat aaataataaa ataaaataaa aaataaatga ataattgaat 5280 gtactaattg gtattccttc caagttgcat cagtgggtta tttacatttt ttttcctaac 5340 ctgacttgtc cttattgctc ccaggtacct cagccagcat ggctgtctct ttgccaccca 5400 ctctgggact cagttccgcc ccagatgaaa tccagcaccc ccacattaaa ttttcagaat 5460 ggaaatttaa gctattcagg gtgagatcct ttgaaaaggc acctgaaaag gctcaaacgg 5520 aaaagcagga ttcctccgag gggaaaccct cgctggagca atctccagca gtcctggaca 5580 agcctggtgg tcagaagtca gccctgcctc aaccagcatt caagccccat ccaaagtttt 5640 taaaggaatc ccacgaagat gggaaagcaa gagacaaagc catccaccaa gccaacctga 5700 gacgtctctg ccgcatctgt gggaattctt tcaacaccac tgggcacaag agaaggtatc 5760 cagtccacgg gcctgtggat ggtaaaaccc aagtcctttt acggaagaag gaaaagaggg 5820 ccacgtcctg gccagacctc attgccaaag ttttccggat cgatgtgaag gcagatgttg 5880 actcgatcca ccccactgag ttctgccata actgctggag cttcatgcac aggaagttta 5940 gcagcacccc atgtgaggtt tactccccaa ggaatgcagc catggagtgg cacccccaca 6000 ccctaaactg tgacatctgc cacattgcac gtcggggact caagaggaag agtcagcagc 6060 caaacatgca gctcagcaaa aaactcaaaa ctgtgattga ccgagcgaga caagcccgtc 6120 agcgcaagag gagagctcag gccaggatca gcagcaagga actgatgaag aagatcgcca 6180 actgcggtca gatacatctt agccccaagc tcctggcagt ggacttcccg gcgcactttg 6240 tgaaatctat ctcctgccag atttgtgaac acatcctggc cgacccggtg gagaccagct 6300 gcaagcatgt gttttgcagg atctgcattc tcaggtgcct caaagtcatg ggcagcagtt 6360 gtccctcttg ccactatccc tgttttccta ctgacctgga gagtccagtg aagtcttttc 6420 tgagcatctt gaataccctg atggtgaaat gcccagcaaa ggagtgcaac gaggagatca 6480 gcttggaaaa atataatcac catatctcaa gccacaagga gtcgaaggag acatttgtgc 6540 atattaataa agggggccgg ccccgccagc atctcctgtc cctgacgcgg agggctcaga 6600 aacaccgtct gagggagctc aagctgcaag tcaaggcctt cgccgacaaa gaagaaggtg 6660 gcgatgtgaa gtcagtgtgc ctgaccttgt tcctgctagt gctgagggcg aggaatgagc 6720 acagacaagc tgacgagctg gaggccatca tgcgaggcca gggctccggc ctgcagcctg 6780 ctgtttgctt ggccatccgc gtcaacacct tcctcagctg cagccagtac cacaagatgt 6840 acaggactgt gaaggccatc acgggcaggc agattttcca gcctttgcat gcccttcgga 6900 atgcggagaa ggtccttctg cccggctacc accccttcga gtggcagcca cctctgaaga 6960 atgtgtcttc cagcacagac gtgggcatta ttgatgggct gtctggactc tcctcctctg 7020 tggacgatta cccagtggac accattgcca agcgcttccg ctatgactcg gctctggtgt 7080 ccgctctcat ggacatggaa gaagacatcc tggagggtat gagagcccaa gaccttgacg 7140 actacctgaa tggccccttc actgtggtgg tgaaggagtc ttgtgatggg atgggagacg 7200 tgagtgagaa gcacggcagt gggccggtcg tgccggaaaa ggccgttcgg ttttccttca 7260 cagtcatgaa aatcaccatc gcacacgggt cacagaacgt gaaggtgttt gaggaagcca 7320 agcctaactc tgaactatgc tgcaagccct tgtgcctcat gctggccgac gaatccgacc 7380 atgagaccct gacggccatc ctgagccctc tcattgccga gagggaggcc atgaagagca 7440 gccagctaat gctggagatg ggaggcatcc tccggacttt caagttcatc ttcaggggca 7500 ccggatatga tgagaaactg gtccgggaag tggaaggcct tgaggcttct ggctctgtct 7560 acatctgtac cctctgtgat gccacccgcc tggaagcctc tcaaaatctg gtcttccact 7620 ccataaccag aagccacgcg gagaatttgg agcgctatga ggtctggcgt tccaacccat 7680 accatgagac ggtggatgaa cttcgggacc gggtgaaagg ggtctcggcc aaacccttca 7740 ttgagacggt gccttccata gatgccctcc actgtgacat tggcaatgca gccgagtttt 7800 acaagatttt ccagctcgag ataggggagg cgtataagaa cccccatgcc tccaaggagg 7860 aaaggaagag atggcaggcg accttggaca agcacctccg caagaagatg aatctgaagc 7920 ccatcatgag aatgaatggc aactttgcca ggaagctcat gaccaaagag actgtggaag 7980 cagtctgtga gttaattccc tccgaggaga ggcatgaagc tctgagggaa ctgatggacc 8040 tttacctgaa gatgaagccc gtctggcgat catcatgccc tgctaaagag tgcccggaat 8100 ccctctgcca gtatagtttc aattcacagc gttttgctga gctcctctcc accaagttca 8160 agtacagata tgagggcaaa atcaccaatt attttcacaa gacactggcc cacgtcccgg 8220 aaattatcga gagggacggc tccattgggg catgggctag cgagggaaat gagtctggga 8280 acaagctgtt caggcgcttc cgaaaaatga atgccaggca gtccaagtac tatgaaatgg 8340 aagatgtttt gaaacatcac tggttgtaca cctccaaata cctgcagaag tttatgaatg 8400 ctcataaagc atttaaaaac tcagggttta ccataaactt gcagagaagc tcaggggaca 8460 cattagacct agagaactct ccagaatctc aagatttgat ggaattttaa gcagggaagt 8520 tgcctaggca ttggttttgc aaatgggttt tctctgggtt gcatggagag cttctcctgg 8580 cacccttaac tcctgggtgt ggggcttcac cacccaagtg gtggtaggtt gatgaggcca 8640 gagatggtga acccatgtcg ggaataggta actggtgagc cgattgcttg agctgtttag 8700 ggagttcaga aaagcaatag gagaaaccag ttatttgaaa gctccatagc tgagaacagg 8760 ggtaactgca ggggaccaga ggtgaacaaa gatgtgtgga gaggattgag tgatgccaaa 8820 gtcaaagcca aggttgtcaa aggacagcca gtgaagccag aaaaggaatt tgacttgtgg 8880 tttccattcc ccctgcccaa gttattctag tttatactga gaggtgtttt tcatatcact 8940 tttgtagaat tttttatttt ataaatttca catattttgg cttattttac aagatttaaa 9000 aaaggttttc aagaattccc gctgtggcac aatgtggcat cttgggagtg ctgggacaca 9060 ggttccatcc ccagcctggc gtggtgggtt aaggatcc 9098 <210> 2 <211> 3831 <212> DNA <213> Sus.scrofa <220> <221> CDS <222> (113)..(3244) <400> 2 gggatgggag agcacatttt gccttctctt tggtagcgag taatatcaac cgaagtgcag 60 acatcctaac actttgccca ggcagcctgc tgagcaaggt acctcagcca gc atg gct 118 Met Ala 1 gtc tct ttg cca ccc act ctg gga ctc agt tcc gcc cca gat gaa atc 166 Val Ser Leu Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp Glu Ile 5 10 15 cag cac ccc cac att aaa ttt tca gaa tgg aaa ttt aag cta ttc agg 214 Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu Phe Arg 20 25 30 gtg aga tcc ttt gaa aag gca cct gaa aag gct caa acg gaa aag cag 262 Val Arg Ser Phe Glu Lys Ala Pro Glu Lys Ala Gln Thr Glu Lys Gln 35 40 45 50 gat tcc tcc gag ggg aaa ccc tcg ctg gag caa tct cca gca gtc ctg 310 Asp Ser Ser Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala Val Leu 55 60 65 gac aag cct ggt ggt cag aag tca gcc ctg cct caa cca gca ttc aag 358 Asp Lys Pro Gly Gly Gln Lys Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala Phe Lys 70 75 80 ccc cat cca aag ttt tta aag gaa tcc cac gaa gat ggg aaa gca aga 406 Pro His Pro Lys Phe Leu Lys Glu Ser His Glu Asp Gly Lys Ala Arg 85 90 95 gac aaa gcc atc cac caa gcc aac ctg aga cgt ctc tgc cgc atc tgt 454 Asp Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg Arg Leu Cys Arg Ile Cys 100 105 110 ggg aat tct ttc aac acc act ggg cac aag aga agg tat cca gtc cac 502 Gly Asn Ser Phe Asn Thr Thr Gly His Lys Arg Arg Tyr Pro Val His 115 120 125 130 ggg cct gtg gat ggt aaa acc caa gtc ctt tta cgg aag aag gaa aag 550 Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Gln Val Leu Leu Arg Lys Lys Glu Lys 135 140 145 agg gcc acg tcc tgg cca gac ctc att gcc aaa gtt ttc cgg atc gat 598 Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg Ile Asp 150 155 160 gtg aag gca gat gtt gac tcg atc cac ccc act gag ttc tgc cat aac 646 Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys His Asn 165 170 175 tgc tgg agc ttc atg cac agg aag ttt agc agc acc cca tgt gag gtt 694 Cys Trp Ser Phe Met His Arg Lys Phe Ser Ser Thr Pro Cys Glu Val 180 185 190 tac tcc cca agg aat gca gcc atg gag tgg cac ccc cac acc cta aac 742 Tyr Ser Pro Arg Asn Ala Ala Met Glu Trp His Pro His Thr Leu Asn 195 200 205 210 tgt gac atc tgc cac att gca cgt cgg gga ctc aag agg aag agt cag 790 Cys Asp Ile Cys His Ile Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys Ser Gln 215 220 225 cag cca aac atg cag ctc agc aaa aaa ctc aaa act gtg att gac cga 838 Gln Pro Asn Met Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Ile Asp Arg 230 235 240 gcg aga caa gcc cgt cag cgc aag agg aga gct cag gcc agg atc agc 886 Ala Arg Gln Ala Arg Gln Arg Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg Ile Ser 245 250 255 agc aag gaa ctg atg aag aag atc gcc aac tgc ggt cag ata cat ctt 934 Ser Lys Glu Leu Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Gly Gln Ile His Leu 260 265 270 agc ccc aag ctc ctg gca gtg gac ttc ccg gcg cac ttt gtg aaa tct 982 Ser Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Ala His Phe Val Lys Ser 275 280 285 290 atc tcc tgc cag att tgt gaa cac atc ctg gcc gac ccg gtg gag acc 1030 Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val Glu Thr 295 300 305 agc tgc aag cat gtg ttt tgc agg atc tgc att ctc agg tgc ctc aaa 1078 Ser Cys Lys His Val Phe Cys Arg Ile Cys Ile Leu Arg Cys Leu Lys 310 315 320 gtc atg ggc agc agt tgt ccc tct tgc cac tat ccc tgt ttt cct act 1126 Val Met Gly Ser Ser Cys Pro Ser Cys His Tyr Pro Cys Phe Pro Thr 325 330 335 gac ctg gag agt cca gtg aag tct ttt ctg agc atc ttg aat acc ctg 1174 Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Ile Leu Asn Thr Leu 340 345 350 atg gtg aaa tgc cca gca aag gag tgc aac gag gag atc agc ttg gaa 1222 Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Ile Ser Leu Glu 355 360 365 370 aaa tat aat cac cat atc tca agc cac aag gag tcg aag gag aca ttt 1270 Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu Thr Phe 375 380 385 gtg cat att aat aaa ggg ggc cgg ccc cgc cag cat ctc ctg tcc ctg 1318 Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu Ser Leu 390 395 400 acg cgg agg gct cag aaa cac cgt ctg agg gag ctc aag ctg caa gtc 1366 Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu Gln Val 405 410 415 aag gcc ttc gcc gac aaa gaa gaa ggt ggc gat gtg aag tca gtg tgc 1414 Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser Val Cys 420 425 430 ctg acc ttg ttc ctg cta gtg ctg agg gcg agg aat gag cac aga caa 1462 Leu Thr Leu Phe Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Asn Glu His Arg Gln 435 440 445 450 gct gac gag ctg gag gcc atc atg cga ggc cag ggc tcc ggc ctg cag 1510 Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Arg Gly Gln Gly Ser Gly Leu Gln 455 460 465 cct gct gtt tgc ttg gcc atc cgc gtc aac acc ttc ctc agc tgc agc 1558 Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser Cys Ser 470 475 480 cag tac cac aag atg tac agg act gtg aag gcc atc acg ggc agg cag 1606 Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly Arg Gln 485 490 495 att ttc cag cct ttg cat gcc ctt cgg aat gcg gag aag gtc ctt ctg 1654 Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val Leu 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2662 Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro Ile Met 835 840 845 850 aga atg aat ggc aac ttt gcc agg aag ctc atg acc aaa gag act gtg 2710 Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu Thr Val 855 860 865 gaa gca gtc tgt gag tta att ccc tcc gag gag agg cat gaa gct ctg 2758 Glu Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu Ala Leu 870 875 880 agg gaa ctg atg gac ctt tac ctg aag atg aag ccc gtc tgg cga tca 2806 Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp Arg Ser 885 890 895 tca tgc cct gct aaa gag tgc ccg gaa tcc ctc tgc cag tat agt ttc 2854 Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr Ser Phe 900 905 910 aat tca cag cgt ttt gct gag ctc ctc tcc acc aag ttc aag tac aga 2902 Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys Tyr Arg 915 920 925 930 tat gag ggc aaa atc acc aat tat ttt cac aag aca ctg gcc cac gtc 2950 Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala His Val 935 940 945 ccg gaa att atc gag agg gac ggc tcc att ggg gca tgg gct agc gag 2998 Pro Glu Ile Ile Glu Arg Asp Gly Ser Ile Gly Ala Trp Ala Ser Glu 950 955 960 gga aat gag tct ggg aac aag ctg ttc agg cgc ttc cga aaa atg aat 3046 Gly Asn Glu Ser Gly Asn Lys Leu Phe Arg Arg Phe Arg Lys Met Asn 965 970 975 gcc agg cag tcc aag tac tat gaa atg gaa gat gtt ttg aaa cat cac 3094 Ala Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Glu Met Glu Asp Val Leu Lys His His 980 985 990 tgg ttg tac acc tcc aaa tac ctg cag aag ttt atg aat gct cat aaa 3142 Trp Leu Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gln Lys Phe Met Asn Ala His Lys 995 1000 1005 1010 gca ttt aaa aac tca ggg ttt acc ata aac ttg cag aga agc tca ggg 3190 Ala Phe Lys Asn Ser Gly Phe Thr Ile Asn Leu Gln Arg Ser Ser Gly 1015 1020 1025 gac aca tta gac cta gag aac tct cca gaa tct caa gat ttg atg gaa 3238 Asp Thr Leu Asp Leu Glu Asn Ser Pro Glu Ser Gln Asp Leu Met Glu 1030 1035 1040 ttt taa gcaggga agttgcctag gcattggttt tgcaaatggg ttttctctgg 3291 Phe gttgcatgga gagcttctcc tggcaccctt aactcctggg tgtggggctt caccacccaa 3351 gtggtggtag gttgatgagg ccagagatgg tgaacccatg tcgggaatag gtaactggtg 3411 agccgattgc ttgagctgtt tagggagttc agaaaagcaa taggagaaac cagttatttg 3471 aaagctccat agctgagaac aggggtaact gcaggggacc agaggtgaac aaagatgtgt 3531 ggagaggatt gagtgatgcc aaagtcaaag ccaaggttgt caaaggacag ccagtgaagc 3591 cagaaaggaa tttgacttgt ggtttccatt ccccctgccc aagttattct agtttatact 3651 gagaggtgtt tttcatatca cttttgtaga attttttatt ttataaattt cacatatttt 3711 ggcttatttt acaagattta aaaaaggttt tcaagaattc ccgctgtggc acaatgtggc 3771 atcttgggag tgctgggaca caggttccat ccccagcctg gcgtggtggg ttaaggatcc 3831 <210> 3 <211> 1043 <212> PRT <213> Sus.scrofa <400> 3 Met Ala Val Ser Leu Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp 1 5 10 15 Glu Ile Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu 20 25 30 Phe Arg Val Arg Ser Phe Glu Lys Ala Pro Glu Lys Ala Gln Thr Glu 35 40 45 Lys Gln Asp Ser Ser Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala 50 55 60 Val Leu Asp Lys Pro Gly Gly Gln Lys Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala 65 70 75 80 Phe Lys Pro His Pro Lys Phe Leu Lys Glu Ser His Glu Asp Gly Lys 85 90 95 Ala Arg Asp Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg Arg Leu Cys Arg 100 105 110 Ile Cys Gly Asn Ser Phe Asn Thr Thr Gly His Lys Arg Arg Tyr Pro 115 120 125 Val His Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Gln Val Leu Leu Arg Lys Lys 130 135 140 Glu Lys Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg 145 150 155 160 Ile Asp Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys 165 170 175 His Asn Cys Trp Ser Phe Met His Arg Lys Phe Ser Ser Thr Pro Cys 180 185 190 Glu Val Tyr Ser Pro Arg Asn Ala Ala Met Glu Trp His Pro His Thr 195 200 205 Leu Asn Cys Asp Ile Cys His Ile Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys 210 215 220 Ser Gln Gln Pro Asn Met Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Ile 225 230 235 240 Asp Arg Ala Arg Gln Ala Arg Gln Arg Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg 245 250 255 Ile Ser Ser Lys Glu Leu Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Gly Gln Ile 260 265 270 His Leu Ser Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Ala His Phe Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val 290 295 300 Glu Thr Ser Cys Lys His Val Phe Cys Arg Ile Cys Ile Leu Arg Cys 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Gly Ser Ser Cys Pro Ser Cys His Tyr Pro Cys Phe 325 330 335 Pro Thr Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Ile Leu Asn 340 345 350 Thr Leu Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Ile Ser 355 360 365 Leu Glu Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu 370 375 380 Thr Phe Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu 385 390 395 400 Ser Leu Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu 405 410 415 Gln Val Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser 420 425 430 Val Cys Leu Thr Leu Phe Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Asn Glu His 435 440 445 Arg Gln Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Arg Gly Gln Gly Ser Gly 450 455 460 Leu Gln Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser 465 470 475 480 Cys Ser Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly 485 490 495 Arg Gln Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val 500 505 510 Leu Leu Pro Gly Tyr His Pro Phe Glu Trp Gln Pro Pro Leu Lys Asn 515 520 525 Val Ser Ser Ser Thr Asp Val Gly Ile Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu 530 535 540 Ser Ser Ser Val Asp Asp Tyr Pro Val Asp Thr Ile Ala Lys Arg Phe 545 550 555 560 Arg Tyr Asp Ser Ala Leu Val Ser Ala Leu Met Asp Met Glu Glu Asp 565 570 575 Ile Leu Glu Gly Met Arg Ala Gln Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly 580 585 590 Pro Phe Thr Val Val Val Lys Glu Ser Cys Asp Gly Met Gly Asp Val 595 600 605 Ser Glu Lys His Gly Ser Gly Pro Val Val Pro Glu Lys Ala Val Arg 610 615 620 Phe Ser Phe Thr Val Met Lys Ile Thr Ile Ala His Gly Ser Gln Asn 625 630 635 640 Val Lys Val Phe Glu Glu Ala Lys Pro Asn Ser Glu Leu Cys Cys Lys 645 650 655 Pro Leu Cys Leu Met Leu Ala Asp Glu Ser Asp His Glu Thr Leu Thr 660 665 670 Ala Ile Leu Ser Pro Leu Ile Ala Glu Arg Glu Ala Met Lys Ser Ser 675 680 685 Gln Leu Met Leu Glu Met Gly Gly Ile Leu Arg Thr Phe Lys Phe Ile 690 695 700 Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Glu Lys Leu Val Arg Glu Val Glu Gly 705 710 715 720 Leu Glu Ala Ser Gly Ser Val Tyr Ile Cys Thr Leu Cys Asp Ala Thr 725 730 735 Arg Leu Glu Ala Ser Gln Asn Leu Val Phe His Ser Ile Thr Arg Ser 740 745 750 His Ala Glu Asn Leu Glu Arg Tyr Glu Val Trp Arg Ser Asn Pro Tyr 755 760 765 His Glu Thr Val Asp Glu Leu Arg Asp Arg Val Lys Gly Val Ser Ala 770 775 780 Lys Pro Phe Ile Glu Thr Val Pro Ser Ile Asp Ala Leu His Cys Asp 785 790 795 800 Ile Gly Asn Ala Ala Glu Phe Tyr Lys Ile Phe Gln Leu Glu Ile Gly 805 810 815 Glu Ala Tyr Lys Asn Pro His Ala Ser Lys Glu Glu Arg Lys Arg Trp 820 825 830 Gln Ala Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro 835 840 845 Ile Met Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu 850 855 860 Thr Val Glu Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu 865 870 875 880 Ala Leu Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp 885 890 895 Arg Ser Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr 900 905 910 Ser Phe Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys 915 920 925 Tyr Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala 930 935 940 Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ ９４５ ９５０
９５５ ９６０ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ ９６５
９７０ ９７５ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ９８０ ９８５
９９０ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｌａ ９９５ １０００
１００５ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ １０１０ １０１５
１０２０ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ １０２５ １０３０
１０３５ １０４０ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ

【図面の簡単な説明】

【図１】 RAG-1遺伝子がサブクローンされたベクター
を示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、HはHinc
II、BはBamHI、NはNotIを示す。

【図２】 RAG-1遺伝子領域の遺伝子地図を示す図であ
る。（１）の斜線で示したボックスは第一エキソン、
（２）の斜線で示したボックスは第二エキソン、（１）
と（２）の間の領域がイントロンを示す。（３）の太線
はクローニングのために新規考案作製したプローブ（RA
G-1小板橋プローブ）として用いた領域、（４）の太線
はBACからサブクローニングのためにプローブ（イント
ロン5’上流プローブ）として用いた領域を示す。ま
た、（Ａ）（Ｂ）間の領域はClawn-genome-BamHIサブク
ローン部分、（Ｃ）（Ｄ）間の領域はBAC-SacIサブクロ
ーン部分を示す。

【図３】 ターゲティングベクター、および、RAG-1遺
伝子のターゲティング前後のRAG-1遺伝子領域の遺伝子
地図を示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、Hは
HincII、BはBamHI、SalはSalI、NはNotIを示す。

【図４】 RAG-1遺伝子ターゲティングベクターの構築
過程を示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、Hは
HincII、BはBamHI、SalはSalI、NはNotIを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｂ (72)発明者 本間 大輔 茨城県牛久市上柏田４丁目38−４サンライ ズ103号室 (72)発明者 高垣 洋太郎 神奈川県鎌倉市由比ガ浜２−１−12 (72)発明者 初瀬 洋美 神奈川県横浜市旭区若葉台２−17−310 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 DA02 GA11 HA17 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC20 BA02 CA25 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 EA22 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記
   載のブタ由来のＤＮＡ。 （ａ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなる
   ＤＮＡ。 （ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
   質をコードするＤＮＡ。 （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1若
   しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、および／ま
   たは挿入されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡ組み換え
   誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含むベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のＤＮＡまたは請求項２
   に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡによりコードさ
   れる蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の形質転換細胞を培養
   し、その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を
   含む、請求項４に記載の蛋白質の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の蛋白質に結合する抗
   体。
7. 【請求項７】 相同組み換えにより内因性のブタＲＡＧ
   −１遺伝子の機能を抑制するＤＮＡ配列を含むベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターが導入された
   ブタ細胞。
9. 【請求項９】 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含
   む、内因性ＲＡＧ−１遺伝子の機能が抑制されたブタの
   製造方法。 （ａ）請求項８に記載の細胞の核を除核卵子に移植する
   工程 （ｂ）工程（ａ）で得られた除核卵子をブタに移植する
   工程
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の細胞をブタに移植す
    る工程を含む、内因性ＲＡＧ−１遺伝子の機能が抑制さ
    れたブタの製造方法。