CN117586383A - 特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用 - Google Patents

特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用。所述方法采用所述特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因，从而导致LTF基因在乳腺中的表达水平上调，在提高动物奶中乳铁蛋白含量上具有极大的应用潜力。

Description

特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用。
背景技术
一般来讲，生物体内一个完整的基因表达盒包括启动子、5’非编码区(5’UTR)、编码区(CDS)或非编码RNA区(Non-coding RNA)、3’非编码区(3’UTR)、终止子等多个元件。非编码RNA在RNA水平上就能行使其生物学功能，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA。CDS区域包含外显子和内含子，转录出来的RNA翻译成蛋白之后，不同区段的氨基酸通常会形成不同的结构域(domain)，特异的结构域决定了蛋白的细胞内定位和功能(如核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、DNA结合结构域、转录激活结构域、酶催化中心等)。对于非编码RNA来讲，不同的区段也具有不同的功能。当基因的一个或几个元件发生变化，就会形成一个新的基因，可能产生新的功能。
乳铁蛋白(LTF)是乳汁中一种重要的铁结合糖蛋白，相对分子质量为70～80kDa，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛分布于哺乳动物乳汁中，特别是初乳中，在其他多种组织分泌液(唾液、泪液或胆汁等)中也含有乳铁蛋白，为大量病原微生物入侵的粘膜系统提供了第一道最重要的防线，其不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具潜力的食品和饲料添加剂，国家食品安全标准GB14880也将其列为营养强化剂。目前市场上常见的乳铁蛋白主要是从牛乳中提取的牛乳铁蛋白，然后将其添加至配方乳粉、营养健康食品及膳食补充剂、免疫调节保健品等，乳铁蛋白的含量已经成为这些相关产品质量的主要指标。
发明简述
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用。
本发明提供一种特异性提高LTF基因在乳腺中的表达量的方法，采用所述特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因。
在一个具体实施方式中，所述特异性提高LTF基因在乳腺中的表达量的方法包括以下步骤：在动物细胞基因组中三个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是能够切割出所述特定基因的启动子片段的两个基因组位点和LTF基因的编码区和启动子之间的基因组位点；或者所述特定基因的启动子和编码区之间的基因组位点和能够切割出LTF基因的编码区片段的两个基因组位点；然后通过对上述位点的基因编辑产生所述特定基因的启动子片段插入LTF基因的编码区上游或LTF基因的编码区片段插入所述特定基因的启动子下游的易位编辑事件，最终产生所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区的新组合，即采用所述特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，从而提高LTF基因在乳腺中的表达量。
本发明还提供一种在动物细胞内创制新基因的方法，包括以下步骤：
(1)在动物细胞基因组中三个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是能够切割出所述特定基因的启动子片段的两个基因组位点和LTF基因的编码区和启动子之间的基因组位点；或者所述特定基因的启动子和编码区之间的基因组位点和能够切割出LTF基因的编码区片段的两个基因组位点；然后通过对上述位点的基因编辑产生所述特定基因的启动子片段插入LTF基因的编码区上游或LTF基因的编码区片段插入所述特定基因的启动子下游的易位编辑事件，最终产生所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区的新组合，形成新基因；所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因。
在一个具体实施方式中，所述在动物细胞内创制新基因的方法还包括(2)设计可特异区分上述新组合的引物对，通过PCR鉴定筛选出含有上述新基因的细胞或组织，测序确定新组合的特征序列；以及
(3)对上述筛选出的细胞或组织进行培养获得T0代动物，通过对T0、T1连续2代或3代以上的动物进行PCR鉴定和测序，筛选出在不同世代间稳定遗传包含上述新组合的特征序列的动物，即在动物体内创制出了可稳定遗传的新基因；
任选地，还包括(4)对新基因功能相关的生物学性状或表型进行测试，确定能带来有益性状的基因型，获得可稳定遗传的新功能基因。
在一具体实施方式中，所述的“三个不同的特定位置”，可以位于同一条染色体上，也可以位于不同染色体上。
在一具体实施方式中，所述的“三个不同的特定位置”，可以在三个不同基因上的特定位置，也可以在同一基因上的三个不同的特定位置。
在一具体实施方式中，所述的“三个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同(相反或相对)。
在一具体实施方式中，所述的“DNA断裂”，是通过将具有靶向特性的核酸酶递送到生物体细胞内与基因组DNA特定位置接触实现的。此种DNA断裂与通过传统技术手段(如辐射或化学诱变)产生的DNA断裂无本质差异。
在一具体实施方式中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”包括Meganuclease、Zincfinger nuclease(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas系统。
其中，CRISPR/Cas系统可通过三个靶向不同序列的引导RNA在基因组不同的位置上，同时产生三处DNA双链断裂；Zinc finger nuclease、TALEN系统可以通过针对三个特定位置序列分别设计ZFN蛋白或TALEN蛋白，同时产生三处DNA双链断裂。
在一具体实施方式中，所述CRISPR/Cas系统为Cas9核酸酶系统或Cas12核酸酶系统。
在一具体实施方式中，所述“具有靶向特性的核酸酶”以DNA形式存在。
在另一具体实施方式中，所述“具有靶向特性的核酸酶”以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。
在一具体实施方式中，将具有靶向特性的核酸酶递送到细胞内的方法选自1)PEG介导的细胞转染的方法；2)脂质体介导的细胞转染的方法；3)电击转化的方法；4)显微注射；5)基因枪轰击；6)农杆菌介导的转化方法；7)病毒载体介导的转化方法；或8)纳米磁珠转化法。
本发明另外提供一种所述在动物细胞内创制新基因的方法产生的新基因。
本发明另外提供一种所述基因在提高动物奶(优选牛奶)中乳铁蛋白含量上的应用。
本发明另外提供一种包含所述基因的DNA。
本发明另外提供一种利用包含所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。
本发明另外提供一种重组表达载体，其包含所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。
本发明另外提供一种包含所述基因的表达盒。
本发明另外提供一种动物细胞，其中包含有所述的表达盒。
本发明另外提供采用所述动物细胞再生成的动物。
本发明另外提供一种组合物，其包含所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区，其中，所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因，所述组合物是非天然存在的，且在动物染色体上直接连接并能稳定遗传；优选地，其在体内融合。
本发明具有如下优异效果：在目标基因的特定元件附近设计基因编辑靶点组合，引起DNA双链断裂与自发的修复连接，不需要提供外源DNA模板即可在基因组水平上实现所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区的定向组合，从而使所述特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，导致LTF基因在乳腺中的表达水平上调，在提高动物奶中乳铁蛋白含量上具有极大的应用潜力。
发明详述
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本文所用术语“基因组”是指存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中的遗传物质(基因和非编码序列)的全部互补物，和/或从一个亲本作为一个单位(单倍体)遗传的完整染色体组。
本发明所述“基因表达水平上调”是指新基因相对于相应生物内源野生型基因表达水平提高，优选表达水平提高至少0.5倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
术语“基因编辑”是指针对活体有机体的任何遗传信息或基因组的靶向特异性修饰的策略和技术。因此，基因编辑包括基因编码区的编辑，但也包括除基因组的基因编码区之外的区域的编辑。它还包括编辑或改造核(如果存在)以及细胞的其他遗传信息。
术语“转基因”在本文中被用来描述已经或者即将被人工引入宿主生物体的基因组中并且被传递到该宿主的后代的遗传物质。转基因通常将包含多核苷酸，所述多核苷酸包含通常但非必然影响或引起活性(例如，转录或翻译的调控、包含编码和/或非编码序列的核苷酸序列的产生，等)的非编码和/或编码序列。
术语“CRISPR/Cas核酸酶”可以是基于CRISPR的核酸酶或编码其的核酸序列，包括但不限于：1)Cas9，包括SpCas9，ScCas9，SaCas9，xCas9，VRER-Cas9，EQR-Cas9，SpG-Cas9，SpRY-Cas9，SpCas9-NG，NG-Cas9，NGA-Cas9(VQR)等，2)Cas12，包括LnCpf1，LbCpf1，FnCpf1，AsCpf1，MAD7等，或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物，优选其中所述至少一个基于CRISPR的核酸酶与相应的野生型序列相比包含突变，使得所获得的基于CRISPR的核酸酶识别不同的PAM序列。如本文所用，“基于CRISPR的核酸酶”是已经在天然存在的CRISPR系统中鉴定的任何核酸酶，其随后从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的重组构建体，适合作为靶向基因组工程的工具。只要最初的基于野生型CRISPR的核酸酶提供DNA识别，即结合特性，任何基于CRISPR的核酸酶都可以使用并任选重新编程或另外突变以适合本发明的各种实施方案。
术语“CRISPR”指代依赖于成簇规律间隔短回文重复序列途径的序列特异性遗传操纵技术，其不同于RNA干扰在转录水平下调节基因表达。
“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。
“Cas蛋白”或“Cas多肽”是指由Cas(CRISPR-相关的)基因编码的多肽。Cas蛋白包括Cas内切核酸酶。Cas蛋白可以是细菌或古细菌蛋白。例如，本文中的I-III型CRISPR Cas蛋白通常起源于原核生物；I型和III型Cas蛋白可以源自于细菌或古细菌物种，而II型Cas蛋白(即Cas9)可以源自于细菌种类。Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas5、Cas7、Cas8、Cas10、Cas12a、Cas12b或这些的组合或复合物。
“Cas9变体”或“Cas9内切核酸酶变体”是指亲本Cas9内切核酸酶的变体，其中当与crRNA和tracRNA或与sgRNA相缔合时，Cas9内切核酸酶变体保留以下能力：识别、结合DNA靶序列的全部或部分并任选地解旋DNA靶序列的全部或部分、使DNA靶序列的全部或部分产生切口、或切割DNA靶序列的全部或部分。Cas9内切核酸酶变体包括本文所述Cas9内切核酸酶变体，其中所述Cas9内切核酸酶变体不同于亲本Cas9内切核酸酶，其方式为：所述Cas9内切核酸酶变体(当与gRNA复合以形成能够修饰靶位点的、多核苷酸指导的内切核酸酶复合物时)与亲本Cas9内切核酸酶(与相同的gRNA复合以形成能够修饰相同靶位点的、多核苷酸指导的内切核酸酶复合物)相比时具有至少一种改善的特性，例如，但不限于，增加的转化效率、增加的DNA编辑效率、减少的脱靶切割、或其任意组合。
本文所述的Cas9内切核酸酶变体包括当与crRNA和tracrRNA或与sgRNA相缔合时可结合双链DNA靶位点并使双链DNA靶位点产生切口的变体，而亲本Cas内切核酸酶当与crRNA和tracrRNA或与sgRNA相缔合时可在靶位点处结合并使双链断裂(切割)。
“引导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，指代用于靶向特定基因从而采用CRISPR技术进行校正的引导RNA序列，通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单一引导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。
术语“单一引导RNA”和“sgRNA”在本文中可互换使用，并涉及两个RNA分子的合成融合，其中包含可变靶向结构域(与tracrRNA杂交的tracr配对序列连接)的crRNA(CRISPRRNA)与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)融合。sgRNA可以包含可与II型Cas核酸内切酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述引导RNA/Cas核酸内切酶复合物可以将Cas核酸内切酶引导至DNA靶位点，使得Cas核酸内切酶能够识别、任选地结合DNA靶位点、并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。
在某些实施方式中，引导RNA(一个或多个)和Cas9可以作为核糖核蛋白(RNP)复合物递送至细胞。RNP由与gRNA复合的纯化的Cas9蛋白组成，并且在本领域中众所周知RNP可以被有效地递送到多种类型的细胞中，包括但不限于干细胞和免疫细胞(Addgene，Cambridge，MA、Mirus Bio LLC，Madison，WI)。
本文中的原间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)是指与由gRNA/Cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间隔子)邻近的短核苷酸序列。如果靶DNA序列不邻近合适的PAM序列，则Cas内切核酸酶可能无法成功识别所述靶DNA序列。本文中的PAM的序列和长度可以取决于所使用的Cas蛋白或Cas蛋白复合物而不同。所述PAM序列可以是任何长度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度。
术语“动物”包括在各个发育阶段(包括新生儿、胚胎和胎儿阶段)的个体动物，例如，人类、非人哺乳动物[如灵长类动物(如狐猴、眼镜猴、猴、猿和猩猩)、猪、牛、羊、马、骆驼、兔、袋鼠、鹿、北极熊、犬科动物(如狗、狼、狐狸和豺)、猫科动物(如狮子、老虎、猎豹、猞猁和猫)和啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)]等。术语“非人”不包括人类。
术语“基因”包括表达功能性分子(诸如但不限于，特定蛋白质)的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。
“编码”具体RNA的DNA序列为转录成RNA的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或DNA多核苷酸可编码不翻译成蛋白质的RNA(例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；又称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“生物活性片段”是指从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性的片段。
术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“核苷酸序列”和“核酸序列”均是指DNA或RNA中碱基的排列顺序。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA片段进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的前述任一序列所示的DNA片段至少75％同一性的核苷酸，且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机序列比对软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。“部分序列”意味着给定序列的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
所述严谨条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
如本发明所用，“表达盒”“表达载体”和“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在植物中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
本发明的“高表达基因”是指在特定的组织中表达量高于普通基因的基因。
术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用，是指包含载体和至少一个插入物的DNA分子。通常出于表达和/或繁殖插入物的目的或出于构建其它重组核苷酸序列而产生重组表达载体。插入物可以可操作的或可以不可操作地连接至启动子序列并且可以可操作的或可以不可操作地连接至DNA调节序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。植物表达调控元件指的是能够在植物中控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。
调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
术语“强启动子”是本领域众所周知的并广泛使用的术语，许多强启动子是本领域已知的，或者可以通过常规实验来鉴定。所述启动子的活性高于与野生型生物中待过量表达的核酸分子有效连接的启动子的活性，例如活性比内源基因的启动子更高的启动子。优选地，强启动子的活性比与野生型生物中待过量表达的核酸分子有效连接的启动子的活性高约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或超过1000％。本领域技术人员知晓如何测定启动子活性，并比较不同的启动子的活性。
“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”植物是指用所述核酸或蛋白质转化植物细胞，使得所述核酸或蛋白质在植物细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。
“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入植物基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述植物和其任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入植物细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进植物基因组中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与通过本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然还可在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利以引用的方式并入本文如同每个单独的出版物或专利均确切地和单独地指出以引用的方式并入一样，并且以引用的方式并入本文以公开和描述与出版物所引用的相关的方法和/或材料。任何出版物的引用为其公开在申请日之前并且不应该解释为承认本发明没有资格先于现有发明的这种出版物。此外，所提供的出版日期可与实际出版日期不同，这可能需要独立证实。
除非具体说明或暗示，如本文中所用，术语“一”、“一个/一种”和“所述”表示“至少一个”。本文提到或引用的所有专利、专利申请和出版物整体引入本文作为参考，其引用程度如同单独地个别引用一样。
附图说明
图1为牛中CSN1S1基因启动子易位至LTF基因上游的示意图；
图2为牛中LTF基因易位至CSN1S1基因启动子下游的示意图。
图3为不同基因不同长度启动子示意图。
图4为不同基因不同长度启动子与牛LTF编码序列连接示意图。
图5为转基因所用质粒。
图6为转基因牛上皮细胞中乳铁蛋白mRNA检测。
图7为转基因牛上皮细胞中上清液中牛乳铁蛋白蛋白含量ELISA检测。
图8为转基因小鼠乳汁中乳铁蛋白的表达量。
图9为基因编辑CSN1S1、CSN2启动子与LTF基因的接口处测序图。
图10为乳腺上皮细胞CRISPR/Cas9基因编辑敲高乳铁蛋白表达鉴定。
图11为乳腺上皮细胞CRISPR/Cas12基因编辑敲高乳铁蛋白表达鉴定。
具体实施方式
以下结合实例，对本发明作进一步说明。下面的说明是采用举例的方式，但是本发明的保护范围不应局限于此。
实施例一借助其它基因启动子在乳腺上皮细胞基因敲高乳铁蛋白基因的表达
鉴于牛乳蛋白中β酪蛋白(CSN2，casein beta，NCBI Gene ID:281099)，αS1酪蛋白(CSN1S1，casein alpha-S1，NCBI Gene ID:282208)，αS2酪蛋白(CSN1S2，casein alpha-S2，NCBI Gene ID:282209)，K酪蛋白(CSN3，casein kappa，NCBI Gene ID:281728)，β乳球蛋白(PAEP，beta-lactoglobulin，NCBI Gene ID:280838)，α乳白蛋白基因(LALBA，alpha-lactalbumin，Gene ID:281894)等蛋白含量较高，我们在NCBI数据库里获取了泌乳期牛乳腺上皮细胞中CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA的转录本mRNA表达量，结果显示它们的表达量均高于乳铁蛋白LTF(NCBI Gene ID:280846)，故本发明利用上述基因的不同长度的启动子片段来敲高乳铁蛋白的表达量。
实施例二在牛乳腺上皮细胞中测试不同基因启动子驱动牛乳铁蛋白提高乳铁蛋白含量的效果
选择以下基因的启动子，β酪蛋白(CSN2，casein beta，NCBI Gene ID:281099)，αS1酪蛋白(CSN1S1，casein alpha-S1，NCBI Gene ID:282208)，αS2酪蛋白(CSN1S2，caseinalpha-S2，NCBI Gene ID:282209)，K酪蛋白(CSN3，casein kappa，NCBI Gene ID:281728)，β乳球蛋白(PAEP，beta-lactoglobulin，NCBI Gene ID:280838)，α乳白蛋白基因(LALBA，alpha-lactalbumin，Gene ID:281894)，来驱动牛乳铁蛋白基因并构建相关载体，转化牛乳腺上皮细胞。针对转基因的牛乳腺上皮细胞开展乳铁蛋白基因表达量分析及其蛋白含量测定。
1、奶牛乳腺上皮细胞的原代培养
无菌取泌乳期荷斯坦克隆奶牛乳腺组织，取材按常规手术消毒乳房中部，切取少量乳腺组织块，在超净工作台上分离修剪，用D-Hanks液洗组织块3-5次，直到洗净为止，尽量剥离脂肪组织和结缔组织，将呈白色颗粒状的腺泡组织尽量剪碎，组织块大约为1mm3，用吸管将组织块以适量的密度接种于铺有0.5％胶原活性蛋白的培养瓶中，加入3mL 15％DF12完全培养液，于5％ CO2培养箱中37℃培养。
2、奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化
原代细胞培养至第3天时，对细胞进行换液，以后每隔1d换液1次，培养至第6天左右时，少量成纤维细胞开始从组织块周围出现，10d左右时乳腺上皮细胞开始从组织块周围生长，单层细胞融合至培养底壁的90％左右，吸出原有培养液，根据上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同，在混合生长的原代或传代细胞培养物中，经过0.25％胰蛋白酶的D-Hanks液，37℃消化，在倒置显微镜下观察，待成纤维细胞质回缩，细胞间隙增大，脱离瓶壁时，加培养液终止消化，将酶液倾出，离心后得到的大部分是成纤维细胞。3-5次选择传代，弃掉组织块，可得到纯化的乳腺上皮细胞。
3.转基因质粒准备
分别获取牛LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA基因翻译起始位点向前4K、6K、8K和10K片段(图3)，分别与牛乳铁蛋白LTF编码序列连接(图4),连接入带有药物筛选标记的质粒中(图5-B)，连同CRISPR/Cas9基因编辑工具质粒(图5-A)一起使用,将目的片段插入牛基因组乳铁蛋白启动子与开放阅读框中间以阻断内源乳铁蛋白的表达。
4.转基因质粒转染与乳铁蛋白表达检测
将上述构建好的质粒分别转染已经构建好的泌乳期乳腺上皮细胞，转染48小时后通过药物及流式细胞术筛选转染成功的细胞，传代2次后分别收取细胞与细胞上清，进行细胞中乳铁蛋白mRNA检测以及上清液中牛乳铁蛋白蛋白含量ELISA检测。
如图6，7所示，检测结果显示，与牛乳铁蛋白LTF自身启动子相比，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP启动子可显著提升LTF的mRNA及蛋白表达量，其中CSN2启动子提升效果最明显，其余依次是CSN3、PAEP、CSN1S1和CSN1S2的启动子；出乎意料的是，LALBA在牛乳中的表达虽然高于LTF，但是LALBA的启动子启动乳铁蛋白的表达量却明显下降。另外，值得注意的是LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA 7个基因的不同长度的启动子均可有效启动乳铁蛋白的表达。
实施例三在小鼠中测试不同基因启动子驱动牛乳铁蛋白提高乳铁蛋白含量的效果
获取牛LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA基因翻译起始位点向前4K、6K、8K和10K片段(图3)，分别与牛乳铁蛋白LTF编码序列连接(图4),连接入带有药物筛选标记的质粒中(图5-B)，并构建CRISPR/Cas9基因编辑工具质粒(图5-A)，将目的片段插入到小鼠基因组乳铁蛋白启动子与开放阅读框中间，以阻断小鼠内源乳铁蛋白的表达并驱动转基因牛乳铁蛋白的表达，将质粒纤维注射入小鼠受精卵原核中获取转基因小鼠F0代。将F1代的雌性转基因老鼠配繁，怀孕后测定F1代转基因雌鼠乳汁中牛乳铁蛋白的含量。
结果显示，与牛乳铁蛋白LTF自身启动子相比，牛CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP启动子均可显著提升转基因雌鼠乳汁中牛乳铁蛋白的蛋白表达量，其中CSN2启动子提升效果最明显，其余依次是CSN3、CSN1S1、PAEP和CSN1S2的启动子；而LALBA的启动子启动乳铁蛋白的表达量明显下降(图8)。
以上转基因小鼠结果与细胞转染结果一致，均表明牛CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP基因的启动子片段可有效提高乳铁蛋白的表达。
实施例四基因编辑敲高靶点设计
选取CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA基因翻译起始位点向前4K的启动子片段进行基因编辑来敲高牛乳铁蛋白。
1、CRISPR/Cas9的靶点设计：
利用CRISPR靶点在线设计工具(crispor.tefor.net)，在牛LTF基因上下游分别设计CRISPR/Cas9靶点，并在牛LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA启动子4K片段上下游分别设计靶点，由金斯瑞公司基因合成，靶点序列如下所示：
sgRNA1：LTF基因上游5’cagtgctcggtgacctcacg 3’
sgRNA2：LTF基因下游5’aataattagcctccgtgaat 3’
sgRNA3：CSN1S1基因启动子上游5’acctctactgtgtaatcata 3’
sgRNA4：CSN1S1基因启动子下游5’gagaagtttcatggttgtca 3’
sgRNA5：CSN1S2基因启动子上游5’tactggtatggcagatgttg 3’
sgRNA6：CSN1S2基因启动子下游5’tagcttcttgtctatctcac 3’
sgRNA7：CSN2基因启动子上游5’cccatggactgcagcctaac 3’
sgRNA8：CSN2基因启动子下游5’ttctaatcatgcagatttct 3’
sgRNA9：CSN3基因启动子上游5’aattgatagttgcaagatta 3’
sgRNA10：CSN3基因启动子下游5’tttaattttaggtgcaatga 3’
sgRNA11：PAEP基因启动子上游5’aaagctacagatatagtcat 3’
sgRNA12：PAEP基因启动子下游5’aggcacttcatggctgcagc 3’
sgRNA13：LALBA基因启动子上游5’tatctcttcttgctattctt 3’
sgRNA14：LALBA基因启动子下游5’agagacaaaggacatcattt 3’
sgRNA15：LTF基因启动子上游5’tctgccactgtctcagcttc 3’
sgRNA16：LTF基因启动子下游5’cagtgctcggtgacctcacg 3’
2、CRISPR/Cas12的靶点设计：
使用氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的Cas12蛋白作为编辑器，分别在牛LTF基因上下游分别设计CRISPR/Cas12靶点，并在牛LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA启动子4K片段上下游分别设计靶点，由金斯瑞公司基因合成针对靶点的全长CrRNA，序列如下：
CrRNA1：LTF基因上游5’tccagtgctcggtgacctcac 3’
CrRNA2：LTF基因下游5’tgaggaattagtggtgtttga 3’
CrRNA3：CSN1S1基因启动子上游5’ggtcatagttgaattgtccattc 3’
CrRNA4：CSN1S1基因启动子下游5’ttacatagatcttgacaaccatg 3’
CrRNA5：CSN1S2基因启动子上游5’tgggaaaaccattaggagcttag 3’
CrRNA6：CSN1S2基因启动子下游5’ctttgtcctgtgagatagacaag 3’
CrRNA7：CSN2基因启动子上游5’caggcaagagtactggagtgggg 3’
CrRNA8：CSN2基因启动子下游5’atggcatgctaattttgtggttt 3’
CrRNA9：CSN3基因启动子上游5’agtctatggcatttgtgaattaa 3’
CrRNA10：CSN3基因启动子下游5’atttaattttaggtgcaatgatg 3’
CrRNA11：PAEP基因启动子上游5’cagattcaatgcaatccttatca 3’
CrRNA12：PAEP基因启动子下游5’atggctgcagctggggtcacgct 3’
CrRNA13：LALBA基因启动子上游5’gaactcagcattcagatgctcat 3’
CrRNA14：LALBA基因启动子下游5’gttaccccccaagattctgaaat 3’
CrRNA15：LTF基因启动子上游5’taccatagccagcttcattacgt 3’
CrRNA16：LTF基因启动子下游5’tccagtgctcggtgacctcacga 3’
以CSN1S1基因启动子为例，如图1所示，Cas9与3个sgRNA配合或者Cas12与3个CrRNA配合，在3个位置上形成双链断裂(DSB)，其中两个位于牛CSN1S1等基因启动子的两侧，目的是将其切割下来，第三个切口(DSB)位于牛LTF基因的上游。最终造成CSN1S1等基因的启动子插入LTF基因上游的插入易位事件。如图2所示，Cas9与3个sgRNA配合或者Cas12与3个CrRNA配合，在3个位置上形成双链断裂(DSB)，其中两个位于牛LTF基因的两侧，目的是将其切割下来，第三个切口(DSB)位于牛CSN1S1等基因启动子的下游。最终造成LTF基因插入到CSN1S1基因启动子的下游的插入易位事件，其中CSN1S1、CSN2启动子与LTF基因的接口处测序图见图9。
实施例五借助CSN1S1等基因4K启动子在乳腺上皮细胞基因敲高乳铁蛋白基因的表达
1.奶牛泌乳期乳腺上皮细胞的RNP转染
为了降低外源DNA整合到奶牛基因组的概率，采用核酸蛋白复合物RNP的方案转染实施例四中提到的RNA，即牛LTF、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、PAEP和LALBA启动子4K片段上下游靶点及牛LTF基因上下游靶点。同样的，也可以通过mRNA介导的瞬时表达或载体介导的瞬时或稳定表达的方式获得相似的基因编辑事件。
CRISPR/Cas9系统使用sgRNA 1+3+4、sgRNA 1+5+6、sgRNA 1+7+8、sgRNA 1+9+10、sgRNA 1+11+12、sgRNA 1+13+14和sgRNA 1+15+16的组合进行奶牛乳腺上皮细胞转染；CRISPR/Cas12系统使用CrRNA 1+3+4、CrRNA 1+5+6、CrRNA 1+7+8、CrRNA 1+9+10、CrRNA 1+11+12、CrRNA 1+13+14和CrRNA 1+15+16的组合进行奶牛乳腺上皮细胞转染。转染48小时后PCR鉴定到发生正确编辑基因型的细胞后挑单克隆，最终得到正确编辑基因型的单克隆细胞系用于后续检测。
2.乳腺上皮细胞基因编辑敲高乳铁蛋白表达鉴定
对不同正确编辑基因型的单克隆细胞系分别用催乳素诱导，检测细胞系中乳铁蛋白基因的表达量并测定乳铁蛋白的含量。
CRISPR/Cas9与CRISPR/Cas12(SEQ ID NO：1)基因编辑敲高结果均显示，未编辑对照细胞(Control)以及LTF自身启动子敲高细胞乳铁蛋白表达量无显著差异；CSN2启动子片段敲高显著提高了细胞中mRNA与细胞上清中乳铁蛋白的表达；CSN3、PAEP与CSN1S1启动子片段敲高也较明显提升了乳铁蛋白表达量；CSN1S2启动子敲高，也有一定的提升幅度；而LALBA启动子恰恰相反，降低了乳铁蛋白的表达量(图10，11)。
以上细胞结果表明，将牛CSN2、CSN3、PAEP、CSN1S1和CSN1S2启动子基因编辑敲高乳铁蛋白可有效提升乳铁蛋白的表达。
实施例六基因编辑牛所需牛体胎儿成纤维细胞系的建立
1、采集荷斯坦奶牛(公牛和母牛)胎儿成纤维细胞。取45日龄的荷斯坦奶牛胎儿，在75％乙醇中浸洗消毒后，剥去胎膜，在加入双抗的PBS溶液中洗2遍，除头、四肢以及内脏部分，将组织样品剪碎，胰酶消化，用DMEM/F12+10％ FBS的培养基，于38.5℃，5％ CO2的培养箱中培养。第二天在显微镜下观察细胞的贴壁状态及生长状态，更换新鲜培养基。细胞长满后，胰酶消化，于液氮中冻存。
2、细胞的复苏与传代。液氮中冻存细胞取出后，于37℃的水浴迅速复苏，加入无血清培养液离心后重悬细胞，接种于加有培养基的细胞培养皿，于38.5℃，5％ CO2的培养箱中培养。当细胞生长至约70％汇合后，传代扩大培养。以PBS洗去死细胞及培养液，加入少量胰酶对细胞进行消化，30-60s后，将胰酶吸出，以培养吹打细胞使之成为细胞悬液，按1：2或1：3将细胞分于各个培养皿中。
实施例七成纤维细胞的转染及单克隆的挑取
1、复苏奶牛胎儿成纤维细胞，传一代，细胞汇合度为70-80％的时候，进行RNP转染。
2、将sgRNA-Cas9与CrRNA-Cas12类型的RNP复合物分别加入到稀释的RNAiMax中，混合均匀，室温孵育20min，形成转染复合物，最后将转染复合物加入到细胞中。转染12小时后，更换新鲜的培养基。
3、48-72h后，待细胞长满24孔板，分鉴定基因型正确后铺单克隆。
4、待克隆在显微镜下基本长满一个视野，利用克隆环，挑取细胞克隆并进行培养。
5、鉴定，提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定。
实施例八体细胞克隆牛的制备
1、供体细胞的准备
以转染后被成功编辑且核型正常的成纤维细胞作为核移植的供核细胞。细胞生长至接触抑制后加0.5％ FBS饥饿2到7天或者接触抑制3天以上以诱导细胞进入G0期。核移植前3小时，倒去培养液，用DPBS洗3次，加入0.25％的胰酶37℃消化2-3分钟，加入2mL培养基终止消化，用微量移液器反复吹打以获得单个分散的细胞。
2、卵母细胞的成熟培养及去核
将牛卵母细胞体外成熟培养后，转移到0.1％透明质酸酶管中振荡2-3min，用微量移液器吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，收集卵母细胞，经成熟液清洗三遍，选择细胞质均匀，形态完整且具有第一极体的卵母细胞作为体细胞核受体。
然后将其转移到M199+10％ FBS+7.5μg/mL细胞松驰素B的工作液中，利用玻璃针在显微镜下将第一极体和卵母细胞内的染色体吸除，用M199+20％ FBS溶液洗涤3次，置于38.5℃、5％ CO2培养箱中。
3、移核与融合
血清饥饿处理供体细胞2-4天，用0.25％胰蛋白酶消化5min，挑选直径为10-12μm的体细胞转移到去核卵母细胞的透明带内，在Zimmerman液中平衡5min后，再转移到融合槽内，使供体细胞与卵母细的胞接触面与电场垂直，在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下进行融合，迅速将重构胚转移到M199+10％FBS溶液中，放置0.5h后观察融合情况。
4、重构胚的激活与培养
将融合情况良好的重构胚转移到5μM Ionomycin溶液中，处理4min后，将重构胚转移到1.9mM 6-DMAP溶液中处理4h，随后转移到CR1aa+5％ FBS溶液中，在38.5℃、5％ CO2培养箱中培养2天，观察分裂情况，统计分裂率，7天后观察囊胚发育情况，统计发育率。
5、胚胎移植与妊娠检测
将形态优良的第7天克隆囊胚移植于已同期的受体母牛子宫角内。移植后第60天进行直肠检测，确定妊娠率。
实施例九基因敲高母牛、基因敲高克隆公牛后代奶牛的催乳及牛乳成分鉴定
1、诱导泌乳
6-8月龄时连续7天皮下注射醋酸甲羟孕酮25mg/kg/d和7.5mg/kg/d的雌二醇本唑酯诱导泌乳。休息2天，随后进行地塞米松4mg/d肌肉注射3天。在地塞米松注射的第二天开始挤奶，每天挤两次奶。停止挤奶后，肌肉注射30mg/kg螺旋霉素，连续3天，以预防乳腺炎。
2、牛乳成分鉴定
将采集的牛奶样品，混合均匀后经纱布过滤，装入奶牛生产性能测定采样管，于4℃保存，后运送至奶牛生产性能测定中心对乳成分，特别是乳铁蛋白含量进行测定。通过本发明验证的上述相关启动子提高乳铁蛋白表达的效果，可以推测本实验中牛乳铁蛋白的含量显著提高。
说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每篇出版物或专利申请被单独、特别地通过引用并入本文一样。
尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改，这样的改变和修改均在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性提高LTF基因在乳腺中的表达量的方法，其特征在于，采用特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因；优选地，具体包括以下步骤：在动物细胞基因组中三个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是能够切割出所述特定基因的启动子片段的两个基因组位点和LTF基因的编码区和启动子之间的基因组位点；或者所述特定基因的启动子和编码区之间的基因组位点和能够切割出LTF基因的编码区片段的两个基因组位点；然后通过对上述位点的基因编辑产生所述特定基因的启动子片段插入LTF基因的编码区上游或LTF基因的编码区片段插入所述特定基因的启动子下游的易位编辑事件，最终产生所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区的新组合，即采用所述特定基因的启动子来驱动LTF基因的表达，从而提高LTF基因在乳腺中的表达量。
2.一种在动物细胞内创制新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在动物细胞基因组中三个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是能够切割出所述特定基因的启动子片段的两个基因组位点和LTF基因的编码区和启动子之间的基因组位点；或者所述特定基因的启动子和编码区之间的基因组位点和能够切割出LTF基因的编码区片段的两个基因组位点；然后通过对上述位点的基因编辑产生所述特定基因的启动子片段插入LTF基因的编码区上游或LTF基因的编码区片段插入所述特定基因的启动子下游的易位编辑事件，最终产生所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区的新组合，形成新基因；所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因；
优选地，还包括(2)设计可特异区分上述新组合的引物对，通过PCR鉴定筛选出含有上述新基因的细胞或组织，测序确定新组合的特征序列；以及
(3)对上述筛选出的细胞或组织进行培养获得T0代动物，通过对T0、T1连续2代或3代以上的动物进行PCR鉴定和测序，筛选出在不同世代间稳定遗传包含上述新组合的特征序列的动物，即在动物体内创制出了可稳定遗传的新基因；
任选地，还包括(4)对新基因功能相关的生物学性状或表型进行测试，确定能带来有益性状的基因型，获得可稳定遗传的新功能基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的“三个不同的特定位置”位于同一条染色体或不同染色体上；优选地，在三个不同基因上的特定位置或在同一基因上的三个不同的特定位置，所述的“三个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述的“DNA断裂”是通过将具有靶向特性的核酸酶递送到生物体细胞内与基因组DNA特定位置接触实现的；优选地，所述的“具有靶向特性的核酸酶”为Meganuclease、Zinc finger nuclease、TALEN或CRISPR/Cas系统(如Cas9核酸酶系统或Cas12核酸酶系统)；更优选地，所述“具有靶向特性的核酸酶”以DNA形式存在，或者以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将具有靶向特性的核酸酶递送到细胞内的方法选自1)PEG介导的细胞转染的方法；2)脂质体介导的细胞转染的方法；3)电击转化的方法；4)显微注射；5)基因枪轰击；6)农杆菌介导的转化方法；7)病毒载体介导的转化方法；或8)纳米磁珠转化法。
6.一种如权利要求2-5中任意一项所述方法产生的新基因及其在提高动物奶(优选牛奶)中乳铁蛋白含量上的应用。
7.一种包含权利要求6所述基因的DNA或表达盒。
8.一种利用包含权利要求6所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。
9.一种重组表达载体，其包含权利要求6所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。
10.一种组合物，其包含所述特定基因的启动子和LTF基因的编码区，其中，所述特定基因选自αS1酪蛋白基因、β酪蛋白、αS2酪蛋白、K酪蛋白、β乳球蛋白或α乳白蛋白基因，所述组合物是非天然存在的，且在动物染色体上直接连接并能稳定遗传；优选地，其在体内融合。
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