KR101552595B1 - 피기백 전위를 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피기백 전위를 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 유전자 전달 시스템인 피기백 전위를 적용하여 ubiquitous 유전자 발현 또는 목적 유전자 on/off 조절이 가능한 소 형질전환 배아를 제조할 경우, 모든 배아에서 균일하게 목적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 나아가 항생제 조절에 의해 목적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 안정적인 소 형질전환 배아를 제조할 수 있어 여러 배아 관련 분야의 연구에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

피기백 전위를 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법 {Method of transgenic bovine cloned embryos using Piggybac transposition}

본 발명은 피기백 전위를 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법에 관한 것이다.

최초 복제 소의 출생 이래로, 여러 나라에서 많은 복제 동물들이 생산되었으며, 형질전환 소의 발달에 대한 중요성이 고무되었다. 특히, 형질전환 소를 제조하기 위하여 DNA를 전핵 (pronuclear) 단계의 난모세포로 미세 주입하는 방법이 이용되었으며, 체세포 핵전이(somatic cell nuclear transfer, SCNT)를 수행한 후 표적 유적자를 함유하는 공여 세포를 핵이 없는 난모세포에 재프로그램하는 방법이 이용되었다. SCNT를 이용한 형질전환 동물의 연구에서 세포의 추적 및 발현을 관찰하기 위하여 녹색 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)과 같은 리포터 유전자가 이용되었다. 현재까지 소 배아의 형질전환 연구는 바이러스 또는 플라스미드 DNA 전달 시스템을 이용하여 발달되어 왔다.

SCNT 배아를 포함하는 체외 생산된 소 배아에 대한 연구는 수 많은 배아 관련 분야, 즉 체외 수정 배아, 체외 배아 발달, 배아 유전자 발현 및 배아 줄기세포와 같은 분야에서 기초적인 정보를 제공할 수 있다. 또한 소 형질전환 배아는 엘리트 소를 번식시키고, 질환 내성 소를 생산하거나 포유동물 유선 생체 반응기 (mammary gland bioreactor)에서 유전자 발현을 위해 사용된다. 그러나 상기와 같은 바이러스 또는 플라스미드를 이용하여 형질전환 배아를 제조할 경우, 염색체 이상 등 부작용이 나타나는 문제점이 발생하였다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구를 계속한 결과, 피기백 전위 (piggybac transposition)을 이용하여 목적 유전자를 ubiqutious하게 또는 항생제 조절에 의한 유전자 발현이 가능한 소 형질전환 배아를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 유전자 전달 시스템을 이용하여 소 형질전환 배아의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 피기백 전위를 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 신규한 유전자 전달 시스템인 피기백 전위를 이용하여 소 형질전환 배아를 제조할 경우, 목적 유전자를 효과적으로 ubiqutious하게 또는 항생제 조절에 의한 유전자 발현이 가능하며, 나아가 목적 유전자가 엑손보다는 인트론에 삽입되어 안전성이 증가된 소 형질전환 배아를 제조할 수 있어 여러 배아 관련 분야의 연구에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 GFP 발현 벡터 지도이다.
도 2는 유도 RFP 발현 벡터 지도이다.
도 3은 소 공여 섬유아세포 (c-c') 및 소 복제 착상 전 배아(d-d')에서 GFP의 발현을 관찰한 것이다 (c-d는 가시광선 하에서의 관찰 결과이며, c'-d'는 형광 하에서의 관찰 결과이다).
도 4는 2μg/mL의 독시사이클린 및 800 μg/mL의 네오마이신을 처리한 세포에서 RFP의 발현을 관찰한 결과 (a-a') 및 독시사이클린을 제거하고 8 일 뒤 RFP 발현이 사라진 것을 확인한 결과이다 (b-b').
도 5는 형질전환 세포를 재프로그램하고 독시사이클린 없이 배반포로 발달시킨 후, 7일째 되는 날 독시사이클린과 함께 2일 이상 배양하고 RFP 의 발현 여부를 관찰한 결과이다. 형질전환세포로부터의 배반포는 RFP를 발현하였으며 (오른쪽 세포), 대조군 배반포는 RFP를 발현하지 않았다 (왼쪽 세포).
도 6은 독시사이클린 처리 여부에 따라 영양세포 상에서 배양된 형질전환 배반포에서 RFP 발현을 확인한 결과이다.
도 7은 피기백 형질전환 배반포 및 형질 전환되지 않은 세포로부터의 SCNT 배반포 (control)로부터 RT-PCR 및 게놈 PCR을 통해 GFP 또는 RFP를 확인한 결과이다 (A: 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 결과, B: cDNA를 주형으로 한 PCR 결과, C: RT-PCR을 통한 GAPDH mRNA 발현, M: 분자 마커).

하나의 양태로서, 본 발명은 피기백 전위 (piggybac transposition)을 이용한 소 형질전환 배아의 제조방법을 제공한다.

상기 피기백 전위는 도 1 또는 도 2의 벡터를 이용하여 이루어질 수 있다.

상기 피기백 전위는 서열번호 1 내지 2의 프라이머를 이용하어 이루어질 수 있다.

상기 형질전환 배아는 SCNT (somatic cell nuclear transfer)를 통해 제조될 수 있으며, 공여세포로 섬유아세포를 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 피기백 (PB)은 전위인자 (transposon)로 잘라 붙이기(cut-and-paste) 메커니즘에 의해 하나의 게놈 부위로부터 절단되어 또 다른 부위로 통합되는 기능을 한다. 피기백은 13-bp의 역위 말단 반복부 (ITRs) 및 594개-아미노산 트랜스포사제를 갖는 2472-bp 트랜스포존이다 (Cary et al, 1989, Virology 172:156-169; Fraser et al, 1995, Virology 211:397-407; Fraser et al, 1996, Insect Molecular Biology 5:141-151). 본 발명에서는 피기백 전위를 위해 바람직하게는 서열번호 1 내지 2의 프라이머를 이용한다.

본 발명의 피기백 전위를 위한 재조합 벡터는 바람직하게는 도 1 또는 2일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커 및 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명에 의한 피기백 전위에 의한 소 형질전환 배아를 제조할 경우, 기존의 방법에 비하여 효과적인 유전자 전달 (모든 배아 세포에서 균일하게 유전자 발현)이 가능하며, 항생제에 의한 목적 유전자의 on/off 조절이 가능한 소 형질전환 배아를 제조할 수 있다. 특히 목적 유전자의 발현이 항생제 조절에 의해 on/off되는 시스템은 기존의 목적 유전자를 항상 발현시킬 경우 부작용이 발생할 수 있는 부분을 최소화하였기 때문에, 이 항생제 조절 유전자 발현 시스템을 통한 목적 유전자 단백질 생산 시스템은 추후 형질 전환 소 생산에 있어 동물에 부작용을 최소화 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 공여세포의 제조

임신 45일째의 소의 태아로부터 섬유아세포를 분리하였다. 태아 조직을 외과용 칼로 다진 후, 0.25%(w/v) 트립신 및 1mM EDTA로 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37°C에서 1시간 동안 분리하였다. 상기 처리된 세포를 1500rpm에서 2분동안 원심분리하여 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 DPBS로 1회 세척한 후, 100mm 배양접시에 접종하였다. 접종된 세포를 10% (v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO3, 1% (v/v) MEM이 포함된 DMEM 배지에서 6~8일간 39°C, 5% CO2 배양기 (incubator)에서 배양하였다. 미부착세포 및 절편체 덩어리를 제거한 후, 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA를 이용하여 5분간 처리하여 4~6일 간격으로 계대배양하고, 196 °C의 액체질소에서 동결하여 세포를 저장하였다. SCNT 전, 세포를 해동시킨 후, 3~4일간 배양한 후, 트립신을 이용하여 단일층으로부터 세포를 회수하였으며, 이를 하기 실험에 공여세포 (donor cell)로 이용하였다.

실시예 2. 유전자 구축 및 트랜스펙션 ( Transfection )

GFP 및 RFP를 PCR을 통해 증폭시켰다. Gateway PCR system (invitrogen)을 이용하였으며, 이를 위한 Gateway PCR Primer는 다음과 같다 (표 1).

GFP-Forward	ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcACCATGGCCAGCAAAGGAGAAGAACTT
GFP-Reverse	ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC
RFP-Forward	ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcACCATGGATAGCACTGAGAACGTCAT
RFP-Reverse	ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCTACTGGAACAGGTGGTGGC

GFP- 또는 RFP-PCR 단편을 BP 및 LP clonase (Invitrogen)을 이용하여 재조합하였다. Entry vector로 pDonor (Invitrogen)가 이용되었으며, Destination vector로 p-CCAGG 프로모터가 있는 PB-CA 및 테트라사이클린(tetracycline) 유도 프로모터가 있는 PB-TET 벡터를 이용하여 최종 발현 벡터를 제조하였다. 본 실시예에 이용된 피기백 (piggybac, PB)서열은 다음과 같다 (표 2).

5' PB	TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATC (서열번호 1)
3' PB	TTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTTAA (서열번호 2)

Transposase expression vector (pCy43, Sanger Institute, Hinxton, UK)가 PB-CA-GFP 또는 PB-TET-RFP의 전위(Transpose)를 위해 이용되었다.

Fugene HD (Roche)를 이용하여 트랜스펙션을 하기 약 18~24시간 전에 공여 섬유아세포를 6 웰 플레이트에 분주하였다. 세포가 약 50~60% confluency를 이루면 공지된 제조사의 방법에 따라 트랜스펙션을 수행하였다. GFP를 발현시키기 위하여 PB-CA-GFP 및 pCy43 벡터를 이용하였으며, RFP를 발현시키기 위하여 PB-TET-RFP 및 PB-rtTA 및 pCy43 벡터를 이용하였다 (도 1 내지 도 2).

실시예 3. SCNT 및 in vitro 세포 배양

실시예 2에서 제조한 형질전환 공여 섬유아세포의 핵을 핵이 없는 난자 (enucleated oocyte)로 전이(transfer)하였다. 재구축된 배아를 전기적으로 융합시킨 후, 4분 간 이오노마이신(ionomycin)으로 활성화시킨 후, 6-DMAP에서 4시간 동안 배양하였다. 복제 배아를 미네랄 오일 (mineral oil)로 도포된 화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium)의 25μL microdrop에서 7~8일 동안 39°C, 5% CO2 배양기 (incubator)에서 배양하였다. 상기 화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium)는 종래 알려진 방법에 따라 제조하였다. 쪼개진 (cleved) 배아를 배양 24시간 및 8일 후 관찰하고, 추가 배양을 위해 SCNT 배반포 (blastocyst)를 미토마이신 (mitomycin) C로 유사분열 불활성화시킨 CF1 섬유아세포로 이루어진 영양층 세포 위로 옮겼다. 유도성 RFP 발현을 위해 2μg/ml 독시사이클린(doxycycline)을 배양 배지에 첨가하였다.

실시예 4. 소 형질전환 배아에서 GFP 또는 RFP 의 발현 확인

실시예 3을 통해 제조한 소 형질전환 배아에서 GFP 및 RFP의 발현을 확인하기 위하여 PCR 및 RT-PCR을 수행하였다 (도 7). PCR 프라이머는 다음과 같다 (표 3).

GFP-Forward	CACATGAAGCAGCACGACTT
GFP-Reverse	AGTTCACCTTGATGCCGTTC
RFP-Forward	CCCCGTAATGCAGAAGAAGA
RFP-Reverse	GGTGATGTCCAGCTTGGAGT
GAPDH-F	GGCGTGAACCACGAGAAGTA
GAPDH-R	CCCTCCACGATGCCAAAGT

실험 결과, GFP 및 RFP 유전자는 피기백 전위에 의해 어떠한 염색체 이상 (mosaicism) 없이 소 태아 섬유아세포에서 뿐만 아니라 형질전환 복제 착상 전 배아에서 발현되는 것을 확인하였다 (도 3).

또한, 독시사이클린에 의해 동일한 소 섬유아세포에서 RFP 유전자가 유도되었다 (도 4). GFP (n=70) 또는 RFP (n=255) 발현이 유도된 형질전환 배아의 2-세포 및 배반포로의 발달은 GFP에서는 각각 57 (81.4%) 및 27 (38.6%)였으며, RFP에서는 각각 193 (75.5%) 및 68 (26.7%)로 확인되었다. 또한, 1-세포 복제 배아를 독시사이클린 없이 배반포로 배양 및 발달하였을 때에는 착상 전 배아에서 RFP가 검출되지 않았다. RFP 발현을 다시 활성화하기 위하여, 착상 전 배아를 미토마이신 C로 처리한 마우스 배아 섬유아세포 상에서 며칠간 독시사이클린 존배 유무와 함께 배양하였다. 그 결과 독시사이클린을 처리하였을 때, 처리 시간에 따라 RFP 발현이 점점 증가함을 확인하였다 (도 5 내지 도 6).

상기 실시예를 통하여 신규한 유전자 전달 시스템인 피기백 전위를 통하여 소 형질전환 배아를 제조할 수 있으며, 형질전환 배아에서 GFP 및 RFP가 모든 배아 세포에서 균일하게 발현됨을 확인하였다. 특히, RFP 유전자는 공여 섬유아세포뿐만 아니라 배아 단계에서 독시사이클린에 의해 유도됨을 확인하였다.

Claims (6)

1. 피기백 트랜스포존(piggybac transposon) 유전자를 포함하는 벡터로 공여세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 공여세포의 핵을 소의 탈핵 난자에 이식하여 소 형질전환 배아를 제조하는 단계를 포함하는 소 형질전환 배아의 제조방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 피기백 트랜스포존(PB) 유전자 사이에 외부 목적 유전자를 포함하며, 하기 벡터맵으로 표시되는 것을 특징으로 하는 소 형질전환 배아의 제조방법.
   

   

   
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 피기백 트랜스포존 유전자는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 소 형질전환 배아의 제조방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 소 형질전환 배아는 SCNT (somatic cell nuclear transfer)를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 소 형질전환 배아의 제조방법.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 공여세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 소 형질전환 배아의 제조방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 제조방법은 외부 목적 유전자 (target gene)의 균일한 발현 또는 항생제에 의해 외부 목적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 소 형질전환 배아의 제조방법.

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