JP2002528117A - トランスジェニックおよびクローン哺乳動物 - Google Patents

トランスジェニックおよびクローン哺乳動物

Info

Publication number
JP2002528117A
JP2002528117A JP2000579729A JP2000579729A JP2002528117A JP 2002528117 A JP2002528117 A JP 2002528117A JP 2000579729 A JP2000579729 A JP 2000579729A JP 2000579729 A JP2000579729 A JP 2000579729A JP 2002528117 A JP2002528117 A JP 2002528117A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
goat
oocyte
cells
cell
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000579729A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4523165B2 (ja
JP2002528117A5 (ja
Inventor
エチェラード，ヤン
ベボディ，エスメイル
ジオメック，キャロル
ギャヴィン，ウィリアム
メリカン，デイヴィッド
Original Assignee
ジェンジム トランスジェニックス コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/298,971 external-priority patent/US6580017B1/en
Application filed by ジェンジム トランスジェニックス コーポレイション filed Critical ジェンジム トランスジェニックス コーポレイション
Publication of JP2002528117A publication Critical patent/JP2002528117A/ja
Publication of JP2002528117A5 publication Critical patent/JP2002528117A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4523165B2 publication Critical patent/JP4523165B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8772—Caprine embryos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0273—Cloned vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/102—Caprine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、クローン化されたトランスジェニック哺乳動物（例えばヤギ）を作成する方法に関する。本方法は、例えばドナー細胞として用い得る遺伝子導入体細胞株のような体細胞株を作成し、除核卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期卵母細胞に体細胞のゲノムを導入して再構成胚を形成させることによってクローン化されたトランスジェニック哺乳動物を作成し、および再構成胚を移植することを含む。また、本発明は、細胞株、再構成胚、およびクローン化されたトランスジェニック哺乳動物を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1998年11月２日出願の仮特許出願第60/106,728号、1999年４月26日
出願の仮特許出願第60/131,328号、1999年４月23日出願の米国特許出願第09/298
,971号、および1999年４月22日出願の米国特許出願第09/298,508号に基づく優先
権の利益を主張しており、それら全てが参照によってここに組み込まれている。
【０００２】発明の背景 遺伝子導入技術によって動物ゲノムを改変し得ることは、医学的用途に新たな
道を開いた。大型の家畜の乳腺に生物医学的タンパク質を発現させることによっ
て、大量の有用な医療用タンパク質を低コストで作成することが現在可能である
(Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35: 609-617; Maga et al. (1995) Bio
/Technology, 13: 1452-1457; Echelard (1996) Curr. Op. Biotechnol. 7: 536
-540; Young et al. (1977) BioPharm. 10: 34-38)。1996年における生物系薬剤
の上位１５の総売上は７５億ドルに達したが、この数字は将来更に伸びるものと
予測される（Med. Ad News 16:30）。
【０００３】 遺伝子導入技術は、高単位の必要用量、高い投与頻度、または多くの患者数の
為、大量に必要な蛋白質、あるいは伝統的な細胞培養法では商業的に有意義な量
産が難しい複雑な蛋白質に応用可能で魅力的である。更にトランスジェニック家
畜のミルク中におけるヒト用の薬剤生産は、例えば翻訳後修飾の不在、不完全な
折りたたみ、高い精製コストのような微生物バイオリアクターに関連する多くの
問題、あるいは、例えば高額な初期投資、高価な培養液、および低い収率のよう
な動物細胞バイオリアクターに関連する多くの問題を解決する。
【０００４】 酪農用のヤギは、医薬用組み換えタンパク質の遺伝子導入生産にとって理想的
である。その平均ミルク生産量は授乳当たり６００−８００リッターである。扱
いやすい群れの規模と種々の動物モデルで反復達成された１−５g／リッターの
濃度に基づき、１年に１−３００kgの精製産物を得るための導入遺伝子タンパク
質の生産が可能である(Gordon et al. (1987) Bio/Technology 5:1183-1187; Me
ade et al. (1990) Bio/Technology 8:443-446; Ebert et al. (1991) Bio/Tech
nology 9:835-838;Simons et al. (1987) Nature 328:530-532; Wright et al.
(1991) Bio/Technology 9:801-834; Velander et al. (1992) Proc Natl Acad S
ci USA 89:12003-120007; Hansson et al. (1994) J Biol Chem. 269:5358-5363
; Hurwitz et al. (1994) Transgenic Res. 3:365-375.)。このことは、現在開
発されつつある生物系薬剤の大部分に必要な大量生産タンパク質の種類と量の面
で、小規模から中規模に相当する。更にヤギの世代間隔、つまり妊娠から、性的
成熟、そして妊娠までは、ウシの３年に対して、１８ケ月である。この期間は、
遺伝子導入技術によって生産された医療用タンパク質の規制認可のために必要な
期間内において、生産動物群の拡大を可能とする。さらに、同じ繁殖能力を有し
、かつ乳生産量の低いヒツジに比べて、遥かにスクレイピーの頻度が低いため（
米国において現在まで７例報告されている）、ヤギは医療用タンパク質生産のよ
り良い系となっている。現時点では、トランスジェニックヤギを作成する信頼で
きる手法が非常に少ない。そのような方法の１つが、前核マイクロインジェクシ
ョン(pronuclear microinjection)である。前核マイクロインジェクションを使
用した場合、導入遺伝子の遺伝子構造への組込みは、マイクロインジェクション
された胚全体の１−３％に達する（Ebert et al. (1993) Theriogenology, 39:1
21-135）。
【０００５】 マウスの胚幹細胞を分離し、in vivoで増殖させ、遺伝子組み換えして、最終
的にレシピエント胚の生殖細胞系に寄与させ得ることが1981に発表された（Evan
s et al. (1981) Nature 292:154-156; Martin (1981) Proc Natl Acad Sci USA
78:7634-7638; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-256）。それ以来、マ
ウス胚幹細胞は、発生学および遺伝学の研究において、単一の標的遺伝子の改変
、すなわち、削除、置換、変異等に広く利用されてきた（Mansour et al. (1988
) Nature 336:348-352; McMahon et al. (1990) Cell 62:1073-1085; recently
reviewed in: Bronson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:27155-27158; Rossa
nt, et al. (1995) Nat. Med. 6:592-594）。マウスにおける広範囲の研究がこ
の強力かつ見事な技術の有用性を明らかに示したが、胚幹細胞技術の成功した応
用は、結果的にマウスにおいてのみ報告がなされている。しかしながら、クロー
ン化されたトランスジェニック動物を得る方法が必要とされている。
【０００６】発明の概要 本発明は、少なくとも部分的に、体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞
に導入し、同時に活性化させることによって、クローン化されたトランスジェニ
ック動物を（例えばクローン化されたトランスジェニックヤギ）得ることができ
るという発見に基づく。機能的除核卵母細胞は活性化されても活性化されなくて
も差し支えない。１つの実施形態において、非活性化状態の機能的除核卵母細胞
（例えば中期第二段階のヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）
と融合させると（例えば電気融合(electrofusion)によって）、融合と同時に活
性化される。他の実施形態において、活性化された機能的除核卵母細胞（例えば
自然に成熟した終期のヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）と
融合させると（例えば電気融合によって）、融合と同時に活性化される。
【０００７】 導入遺伝子核の核移植における体細胞系（例えば組み換え一次体細胞株）の使
用は、トランスジェニック動物の作成効率を劇的に向上させる（例えばここで説
明される方法によって動物を作成する場合、１００％まで向上する。）また、発
生途上の胚の各細胞が導入遺伝子を包含するため、初期のモザイク現象の問題も
解決する。更に遺伝子導入細胞株からの核移植によるトランスジェニック動物（
例えばトランスジェニックヤギ）の作成は、特定のトランスジェニック系統の加
速された拡大を可能とする。例えば動物群の拡大を１繁殖シ−ズンで達成できる
。
【０００８】 体細胞からの核移植によるトランスジェニック動物の作成 （例えばトランス
ジェニックヤギ）は伝統的なマイクロインジェクション法では不可能な遺伝子操
作を可能とする利点を持つ。例えば体細胞からの核移植は特定の変異の導入を可
能とし、あるいはゲノムの特定部位に対する外来遺伝子の標的化は、組込み位置
効果の問題を解決する。ドナー体細胞における相同組み換えは、内因性タンパク
質(例えばヤギの内因性タンパク質)を「ノックアウト」するか、あるいは置換し
て、ミルク中に発現された異種タンパク質の精製コストを下げ、さらに動物バイ
オリアクターの正確な調節に役立つ。
【０００９】 全体的に、本発明は、クローン化されたヒト以外の哺乳動物（例えばクローン
ヤギ）を作成する方法に関する。以下の方法はヤギを対象として説明されるが、
他のいかなるヒト以外の哺乳動物にも適用できる。この方法は：ヤギ体細胞由来
のヤギゲノムをヤギ卵母細胞（特に望ましいのは自然に成熟した終期卵母細胞）
に移植して再構成胚を作成し；例えば再構成胚をレシピエントの牝ヤギに移植す
ることによって、再構成胚をヤギに発生させてヤギを提供する。1つの実施形態
において、例えば、直接注入または体細胞と卵母細胞の融合（例えば電気融合）
によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する：ことを含む。
【００１０】 好ましい実施形態において、再構成胚からヤギが発生する。別の実施形態では
、ヤギは再構成胚から発生したヤギの子孫である。好ましい実施形態において、
体細胞は非静止状態にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は
G１段階にある。別の実施形態では体細胞は静止状態にあり（例えば細胞は抑制
されている）、例えば体細胞はG０段階にある。好ましい実施形態において、体
細胞は胚体細胞であり、例えば体細胞は胚線維芽細胞である。体細胞は、線維芽
細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞
、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施形態において、卵母細胞
は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。好ましい実施形態において
：卵母細胞は中期第二段階にあり；卵母細胞は終期にあり；細胞周期中の望まし
い段階（中期、終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用い
て卵母細胞を得て；ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化さ
せる。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞は同期化する（例えば卵母細胞と体
細胞が同時に活性化されるか、卵母細胞と体細胞が同時に抑制される）。
【００１１】 好ましい実施形態において、本方法は、再構成胚から発生したヤギと第二のヤ
ギとの交配をふくむ。第二のヤギは、正常なヤギ、再構成胚から発生したまたは
再構成胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ、あるいは、第一のヤギの遺
伝子物質を供給したのと同じ動物由来の遺伝子物質、同じ遺伝子型の動物、また
は同じ細胞株から作成した、再構成胚から発生したまたは再構成胚から発生した
ヤギの子孫である第二のヤギであって差し支えない。好ましい実施形態では、再
構成胚から発生した第一のヤギを第一のヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構
成胚から発生した第二のヤギと交配させて差し支えない。
【００１２】 好ましい実施形態において、ヤギは牡ヤギである。他の好ましい実施形態にお
いて、ヤギは牝ヤギである。牝ヤギから乳酸塩およびミルクを得ることができる
。好ましい実施形態において：生産物（例えば、タンパク質、組み換えタンパク
質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；生産物（例えばヒトタンパク質）を
ヤギのミルク、尿、毛、血液、皮、または肉から回収できる。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月２９日（２００１．８．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 トランスジェニックおよびクローン哺乳動物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1998年11月２日出願の仮特許出願第60/106,728号、1999年4月26日
出願の仮特許出願第60/131,328号、1999年4月23日出願の米国特許出願第09/298,
971号、および1999年4月22日出願の米国特許出願第09/298,508号に基づく優先権
の利益を主張しており、それら全てが参照によってここに組み込まれる。
【０００２】発明の背景 遺伝子導入技術によって動物ゲノムを改変し得ることは、医学的用途に新たな
道を開いた。大型の家畜の乳腺に生物医学的タンパク質を発現させることによっ
て、大量の有用な医療用タンパク質を低コストで作成することが現在可能である
(Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35: 609-617; Maga et al. (1995) Bio
/Technology, 13: 1452-1457; Echelard (1996) Curr. Op. Biotechnol. 7: 536
-540; Young et al. (1977) BioPharm. 10: 34-38)。1996年における生物系薬剤
の上位１５の総売上は７５億ドルに達したが、この数字は将来更に伸びるものと
予測される（Med. Ad News 16:30）。遺伝子導入技術は、高単位用量の必要性、
高い投与頻度、または大きな患者人口のために大量に必要な蛋白質、あるいは伝
統的な細胞培養法では商業的に有意義な量産が難しい複雑な蛋白質に応用可能で
魅力的である。更にトランスジェニック家畜の乳中におけるヒト用薬剤の生産は
、例えば翻訳後修飾の不在、不完全な折りたたみ、高い精製コストのような微生
物バイオリアクターに関連する多くの問題、あるいは、例えば高額な初期投資、
高価な培養液、および低い収率のような動物細胞バイオリアクターに関連する多
くの問題を解決する。
【０００３】 酪農用のヤギは、医薬用組み換えタンパク質の遺伝子導入生産にとって理想的
である。その平均の乳産出量は搾乳当たり６００−８００リッターである。扱い
やすい群れの規模を用い、種々の動物モデルで反復達成された１−５g／リッタ
ーの濃度に基づき、１年に１−３００kgの精製産物を得るためのトランスジェニ
ックタンパク質の生産が可能である(Gordon et al. (1987) Bio/Technology 5:1
183-1187; Meade et al. (1990) Bio/Technology 8:443-446; Ebert et al. (19
91) Bio/Technology 9:835-838;Simons et al. (1987) Nature 328:530-532; Wr
ight et al. (1991) Bio/Technology 9:801-834; Velander et al. (1992) Proc
Natl Acad Sci USA 89:12003-120007; Hansson et al. (1994) J Biol Chem. 2
69:5358-5363; Hurwitz et al. (1994) Transgenic Res. 3:365-375.)。それは
大容量タンパク質のカテゴリーの小から中規模であり、現在開発されつつある生
物系薬剤の大部分において必要とされるであろう量を意味する。更にヤギの世代
間隔、つまり妊娠から、性的成熟、そして妊娠までは、ウシの３年に対して、１
８ケ月である。この期間は、遺伝子導入技術によって生産された医療用タンパク
質の規制認可のために必要な期間内において、生産動物群の拡大を可能とする。
さらに、同じ繁殖能力を有し、かつ乳産出量の低いヒツジに比べて、遥かにスク
レイピーの頻度が低いため（米国において現在まで７例報告されている）、ヤギ
は医療用タンパク質生産のより良い系となっている。現時点では、トランスジェ
ニックヤギを作る信頼できる手法が非常に少ない。そのような方法の１つが、前
核マイクロインジェクション(pronuclear microinjection)である。前核マイク
ロインジェクションを使用した場合、導入遺伝子の遺伝子構造への組込みは、マ
イクロインジェクションされた胚全体の１−３％に達する（Ebert et al. (1993
) Theriogenology, 39:121-135）。
【０００４】 マウスの胚性幹細胞を分離し、in vivoで増殖させ、遺伝子組み換えして、最
終的にレシピエント胚の生殖細胞系に寄与させ得ることが1981に発表された（Ev
ans et al. (1981) Nature 292:154-156; Martin (1981) Proc Natl Acad Sci U
SA 78:7634-7638; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-256）。それ以来、
マウス胚性幹細胞は、発生学および遺伝学の研究において、単一の標的遺伝子の
改変、すなわち、欠失、置換、変異等に広く利用されてきた（Mansour et al. (
1988) Nature 336:348-352; McMahon et al. (1990) Cell 62:1073-1085; recen
tly reviewed in: Bronson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:27155-27158; R
ossant, et al. (1995) Nat. Med. 6:592-594）。マウスにおける広範囲の研究
はこの強力かつ見事な技術の有用性を明らかに示したが、胚性幹細胞技術の成功
した応用は、結果的にマウスにおいてのみ報告がなされている。しかしながら、
クローンおよびトランスジェニック動物（例えばヤギ）を得る方法が必要とされ
ている。
【０００５】発明の概要 本発明は、少なくとも部分的に、体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞
に導入し、同時に活性化させることによって、クローンおよびトランスジェニッ
ク動物（例えばクローンおよびトランスジェニックヤギ）を得ることができると
いう発見に基づく。機能的除核卵母細胞は活性化されても活性化されなくても差
し支えない。１つの実施形態において、非活性化状態の機能的除核卵母細胞（例
えば中期IIのヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）と融合させ
（例えば電気融合(electrofusion)によって）、かつ融合と同時に活性化する。
他の実施形態において、活性化された機能的除核卵母細胞（例えば自然に成熟し
た終期のヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）と融合させ（例
えば電気融合によって）、かつ融合と同時に活性化する。
【０００６】 トランスジェニック核の核移植のための体細胞株（例えば組み換え一次線維芽
細胞体細胞株）の使用は、トランスジェニック動物を作る効率を劇的に向上させ
る（例えばここで説明される方法によって動物を作る場合、１００％まで向上す
る。）また、発生途上の胚の各細胞が導入遺伝子を包含するため、初期のモザイ
ク現象の問題も解決する。更にトランスジェニック細胞株からの核移植によるト
ランスジェニック動物（例えばトランスジェニックヤギ）の作出は、特定のトラ
ンスジェニック系統の加速された規模の拡大を可能とする。例えば動物群の拡大
を１繁殖シ−ズンで達成できる。
【０００７】 体細胞からの核移植によるトランスジェニック動物の作出 （例えばトランス
ジェニックヤギ）は伝統的なマイクロインジェクション法では不可能な遺伝子操
作を可能とする利点を持つ。例えば体細胞からの核移植は特定の変異の導入を可
能とし、あるいはゲノムの特定部位に対する外来遺伝子の標的化は、組込み位置
効果の問題を解決する。ドナー体細胞における相同組み換えは、内因性タンパク
質(例えばヤギの内因性タンパク質)を「ノックアウト」するか、あるいは置換し
て、乳中に発現された異種タンパク質の精製コストを下げ、さらに動物バイオリ
アクターの正確な調節に役立つ。
【０００８】 全体的に、本発明は、ヒト以外のクローン哺乳動物（例えばクローンヤギ）を
作る方法に関する。以下の方法はヤギを対象として説明されるが、他のいかなる
ヒト以外の哺乳動物にも適用できる。その方法は：ヤギ体細胞由来のヤギゲノム
をヤギ卵母細胞（特に望ましいのは自然に成熟した終期の卵母細胞）に移植して
再構築胚を作り；例えばその再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することに
よって、再構築胚をヤギに発生させてヤギを提供する。1つの実施形態において
、例えば、直接注入または体細胞と卵母細胞との融合（例えば電気融合）によっ
て、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する：ことを含む。
【０００９】 好ましい実施形態において、再構築胚からヤギが発生する。別の実施形態では
、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。好ましい実施形態において、
体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞はG1 期にある。別の実施形態では体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している
）、例えば体細胞はG0期にある。好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細
胞であり、例えば体細胞は胚性線維芽細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例え
ば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳
腺細胞(mammary cell)であって差し支えない。好ましい実施形態において、卵母
細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。好ましい実施形態にお
いて：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；細胞周期の望ましい期
（中期、終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母
細胞を得て；ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる。
別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共
に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００１０】 好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤ
ギとの交配をふくむ。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは
再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺
伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来
する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生し
たヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では
、再構築胚から発生した第一のヤギを第一のヤギとは異なる導入遺伝子を有する
再構築胚から発生した第二のヤギと交配させて差し支えない。
【００１１】 好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態にお
いて、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤ
ギから乳を得ることができる。好ましい実施形態において：産物（例えば、タン
パク質、組み換えタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例
えばヒトタンパク質）をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収でき
る。
【００１２】 別の態様において、本発明は、例えばトランスジェニックヤギのようなヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物を提供する方法に関する。以下にヤギについて
の方法を記載するが、本方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用することができ
る。本方法は：ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、
遺伝子組換えヤギ体細胞のゲノムを導入して再構築胚を形成し；さらに、例えば
再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって再構築胚をヤギに発生
させ、それによってトランスジェニックヤギを提供する：ことを含む。
【００１３】 １つの実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合（
例えば電気融合）によって、遺伝子組換えヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入
する。
【００１４】 好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態にお
いて、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【００１５】 好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞は活性化さ
れている）、例えば体細胞はG1期にある。別の実施形態では、体細胞は休止期に
あり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。好ましい実施
形態において、体細胞は胚性体細胞であり、例えば体細胞は胚性線維芽細胞であ
る。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）
、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞のいずれかであって差し支えない。
【００１６】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；体細
胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しかつ導
入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【００１７】 好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母
細胞である。好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は
終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい
期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコ
ルを用いて卵母細胞を得て；遺伝子組換えゲノムの導入前または導入と同時に卵
母細胞を活性化させる。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例え
ば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる
）。
【００１８】 好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤ
ギとの交配を含む。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは再
構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺伝
子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来す
る遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生した
ヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では、
再構築胚から発生した第一のヤギを第一のヤギとは異なる導入遺伝子を有する再
構築胚から発生した第二のヤギと交配させて差し支えない。
【００１９】 好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態にお
いて、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤ
ギから乳を得ることができる。好ましい実施形態において：産物（例えば、タン
パク質、組み換えタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例
えばタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉
から回収できる。
【００２０】 好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を含む。導
入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の
導入遺伝子；ノックアウト、ノックイン(knockin)またはヤギ遺伝子の発現を破
壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列
；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下に
ある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク
質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し
支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質および酵
素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギ
における発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定
はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギ
オジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレ
ブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリ
ン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクト
グロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン
、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００２１】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００２２】 好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下
にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーター
であって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血
液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮
膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：
のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモー
ター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパク(whey acid protein)
プロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し
支えない。
【００２３】 別の態様において、本発明は、例えばクローンまたはトランスジェニックヤギ
のようなヒト以外の哺乳動物を作る方法に関する。以下にヤギについての方法を
記載するが、本方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用することができる。本方
法は：例えば電気融合によって、導入タンパク質を発現し得るヤギ体細胞のよう
な体細胞を除核ヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）と融
合させて、再構築胚を得て；その再構築胚を活性化させ；その胚をレシピエント
の雌ヤギに移植し；さらにその胚をヤギに発生させる：ことを含む。
【００２４】 好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態にお
いて、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【００２５】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。体細胞は、線維芽細
胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、
または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施形態において、体細胞は非
休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点(S
TART)前のG1期のようなG1期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり
（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。
【００２６】 好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにある。あるいは、卵母細胞は
終期にある。いずれかの実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に
卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態において：in vivoプロトコルを用
いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母
細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい
実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活
性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００２７】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；体細
胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しかつ導
入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【００２８】 好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤ
ギとの交配をふくむ。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは
再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺
伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来
する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生し
たヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では
、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニ
ックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジ
ェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００２９】 好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態にお
いて、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤ
ギから乳を得ることができる。
【００３０】 好ましい実施形態において：産物（例えば、タンパク質、組み換えタンパク質
、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例えばヒトタンパク質）をヤギ
の乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【００３１】 好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を含む。導
入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の
導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他
の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロ
モーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配
列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペ
プチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れ
であっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける
発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされな
いが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニ
ン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダ
ーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性
タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリ
ン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲン
アクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラ
クチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００３２】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００３３】 好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下
にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーター
であって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血
液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮
膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：
のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモー
ター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およ
びラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００３４】 また、本発明は、この中に記載の任意の方法によって作られたヒト以外の動物
を包含する。ヤギのために記載された方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用で
きる。従って、別の態様において、本発明は、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然
に成熟した後期卵母細胞に、ヤギ体細胞のゲノムを導入し、再構築胚を得て、さ
らにその再構築胚をヤギに発生させることによって得られるクローンヤギまたは
それらの子孫に関する。
【００３５】 好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支え
ない。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト
）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施
形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、
例えば体細胞は、臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の実施形態では体細胞
は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。
【００３６】 好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母
細胞である。
【００３７】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば
中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて
卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。
好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞
を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００３８】 好ましい実施形態において、例えば電気融合によって、体細胞と機能的除核卵
母細胞を融合させることによってヤギゲノムを導入することができる。
【００３９】 別の態様において、本発明は、例えば1匹以上の雄および１匹の雌から成る集
団のような、クローンヤギに関するものであり、その各細胞がヤギ体細胞に由来
する染色体ゲノムを有しており、そのヤギ体細胞はクローンヤギ以外のヤギに由
来する。
【００４０】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支
えない。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイ
ト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実
施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）
、例えば体細胞はG1期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例え
ば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。
【００４１】 別の態様において、本発明は、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終
期の卵母細胞に、遺伝子組換えヤギ体細胞のゲノムを導入して再構築胚を形成し
、さらに、再構築胚をヤギに発生させることによって得られたトランスジェニッ
クヤギまたはその子孫に関する。
【００４２】 好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支え
ない。別の好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性線維芽細胞のようなヤ
ギ線維芽細胞であって差し支えない。
【００４３】 好ましい実施形態において、ヤギ卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核
卵母細胞である。
【００４４】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；細胞周期の望ましい期（中期、終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivo
プロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵
母細胞を活性化させる。好ましい実施形態において、卵母細胞と体細胞を同調す
る（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停
止させる）。
【００４５】 好ましい実施形態において、例えば電気融合によって体細胞と機能的除核卵母
細胞を融合させることによってヤギゲノムを導入することができる。
【００４６】 好ましい実施形態において、体細胞のヤギゲノムは導入遺伝子配列を含む。導
入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の
導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他
の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロ
モーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配
列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロ
ブリン、血清タンパク質、酵素の何れかであるタンパク質、およびおよびペプチ
ドをコードしていて差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチ
ドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。トラ
ンスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質として、限定はさ
れないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジ
ェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロ
シダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩
基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロ
ブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プ
ロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００４７】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００４８】 好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下
にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーター
であって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血
液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮
膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：
のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモー
ター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およ
びラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００４９】 別の態様において、本発明はトランスジェニックヤギに関するものであり、そ
の各細胞は遺伝子組換えヤギ体細胞由来の染色体ゲノムを有し、ヤギ体細胞はそ
のトランスジェニックヤギ以外に由来する。
【００５０】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支
えない。別の好ましい実施形態において、染色体ゲノムは例えば胚性線維芽細胞
のようなヤギ線維芽細胞に由来していて差し支えない。
【００５１】 好ましい実施形態において、体細胞の染色体ゲノムは導入遺伝子配列を含む。
導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種
の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる
他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プ
ロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種
配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリ
ペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない
。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、酵素、およびペ
プチドの何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニック
ヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、
限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、ア
ンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコ
セレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミ
エリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラ
クトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラ
スミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュ
リン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００５２】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００５３】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御
下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモータ
ーであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；
血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；
皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター
：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモ
ーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；お
よびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００５４】 別の形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギ（この中に記載のよ
うに作る）を第二のヤギと交配させることによって作ったヤギに関する。
【００５５】 好ましい実施形態において：第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚
から発生したヤギの子孫であり；第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給し
たのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質か
ら形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である
。好ましい実施形態において、再構築胚から発生した第一のトランスジェニック
ヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚か
ら発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００５６】 別の形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤギと交配
させることによって得られた複数のトランスジェニックヤギに関する。
【００５７】 好ましい実施形態において：第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚
から発生したヤギの子孫であり；第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給し
たのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質か
ら形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である
。好ましい実施形態において、再構築胚から発生した第一のトランスジェニック
ヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚か
ら発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００５８】 さらに別の態様において、本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合型のトランス
ジェニックヤギを提供する方法に関する。本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合
型である体細胞を提供し；導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞を作るために体
細胞組換えを生じさせ；導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞に由来するゲノム
をヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して再構築
胚を形成し；さらに例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによ
って再構築胚をヤギに発生させ、それによって導入遺伝子配列とホモ接合型のト
ランスジェニックヤギを提供することを含む。
【００５９】 別の態様において、本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合型のトランスジェニ
ックヤギに関する。
【００６０】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞に由来する
ゲノムをヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して
再構築胚を形成し；さらにその再構築胚をヤギに発生させることによってトラン
スジェニックヤギを作った。
【００６１】 別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ
、ラクダのようなヒト以外のクローン哺乳動物を作る方法に関する。本方法は、
例えば、終期の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞のような活
性化された卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；体細胞の染色体ゲノ
ムを機能的除核卵母細胞に導入して再構築胚を得て；さらに例えば再構築胚をレ
シピエントの雌に移植することによって再構築胚を発生させ、それによってクロ
ーン哺乳動物を作ることを含む。
【００６２】 好ましい実施形態において、例えばヤギのような哺乳動物が再構築胚から発生
する。別の実施形態において、例えばヤギのような哺乳動物は、再構築胚から発
生した例えばヤギのような哺乳動物の子孫である。
【００６３】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。好ましい実施形態に
おいて、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい
実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている
）、例えば体細胞は、臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の実施形態では体
細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にあ
る。
【００６４】 好ましい実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活
性化させる。好ましい実施形態においてin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を
得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取
り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい実施形態
では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させ
るか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００６５】 好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは
例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、
体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００６６】 別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞のような活性化された卵
母細胞を機能的に除核し、体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞（好ましくは自
然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して再構築胚を形成し；さらに例えば再構
築胚をレシピエントの哺乳動物に移植することによって再構築胚を発生させるこ
とによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのよ
うなヒト以外のクローン哺乳動物に関する。
【００６７】 好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例
えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るために、in vivoプ
ロトコルを用いて卵母細胞を得る。
【００６８】 別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ
、ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作る方法に関する。
本方法は、例えば、終期の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞
のような活性化された卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；遺伝子組
換え体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞に導入して再構築胚を得て；さ
らに例えば再構築胚をレシピエントの雌に移植することによって再構築胚を発生
させ、それによってトランスジェニック哺乳動物を得ることを含む。
【００６９】 好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態
において、哺乳動物動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００７０】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。好ましい実施形態に
おいて、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい
実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている
）、例えば体細胞は、臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の実施形態では体
細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にあ
る。
【００７１】 好ましい実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活
性化させる。好ましい実施形態においてin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を
得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るために、in
vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい実施形態では、卵母細胞と
体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と
体細胞を共に停止させる）。
【００７２】 好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは
例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、
体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００７３】 好ましい実施形態において、体細胞の核は導入遺伝子配列を包含する。導入遺
伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入
遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事
象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモー
ター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：
のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチ
ドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タン
パク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであ
っても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現
が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが
、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ
、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タン
パク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、
リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチ
ン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００７４】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００７５】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーター等の哺
乳動物特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子
配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない
。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター
；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター
；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差
し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロ
ブリンプロモーター；乳漿酸タンパクタンパクプロモーター；およびラクトアル
ブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００７６】 別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞（好ましくは自然に成熟
した終期の卵母細胞）のような活性化された卵母細胞を機能的に除核し、遺伝子
組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入して再構築胚を形成し；さら
に例えば再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植して再構築胚を発生させるこ
とによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのよ
うなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。
【００７７】 好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例
えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るためにin vivoプロ
トコルを用いて卵母細胞を得る。
【００７８】 別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞（好ましくは自然に成熟
した終期の卵母細胞）のような活性化された卵母細胞を機能的に除核し、遺伝子
組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入することによって得られた例
えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダの胚のようなヒト以外の哺
乳動物の再構築胚に関する。好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを
用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞
を得るためにin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。
【００７９】 さらに別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ
、ラマ、ラクダのようなヒト以外のクローン哺乳動物を作る方法に関する。本方
法は、卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を提供し；卵母細胞
を機能的に除核し；体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞（ゲノム導入前
またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる）に導入して再構築胚を得て
；再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植し；再構築胚を発生させ、それによ
ってクローン哺乳動物を作ることを含む。
【００８０】 好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態
において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００８１】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性細胞である。別の好ましい実施形態
において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好まし
い実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されてい
る）、例えば体細胞は、臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の好ましい実施
形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞
はG0期にある。別の好ましい実施形態において、卵母細胞は除核卵母細胞である
。
【００８２】 好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る（例えば細胞周期の望ましい期（
例えば終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細
胞を得る）。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞
と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００８３】 好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは
例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、
体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００８４】 別の態様において、本発明は例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、
ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作る方法に関する。本
方法は、卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を提供し；卵母細
胞を機能的に除核し；遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞
（ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる）に導入して
再構築胚を得て；再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植することによって再
構築胚を発生させ、それによってトランスジェニック哺乳動物を作ることを含む
。
【００８５】 好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態
において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００８６】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。別の好ましい実施形
態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ま
しい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されて
いる）、例えば体細胞は、臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の好ましい実
施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細
胞はG0期にある。別の好ましい実施形態において、卵母細胞は除核卵母細胞であ
る。
【００８７】 好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；例えば細胞周期の望ましい期（
例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを
用いて卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化さ
せる。好ましい実施形態において、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細
胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００８８】 好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは
例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、
体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００８９】 好ましい実施形態において、体細胞の核は導入遺伝子配列を包含する。導入遺
伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入
遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事
象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモー
ター；例えば組織特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種
配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリ
ペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない
。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何
れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニック哺乳動物に
おける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定は
されないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオ
ジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブ
ロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン
塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグ
ロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、
プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００９０】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００９１】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーター等の哺
乳動物特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子
配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない
。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター
；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター
；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差
し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロ
ブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプ
ロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００９２】 別の態様において、本発明は、哺乳動物の卵母細胞、好ましくは自然に成熟し
た終期の卵母細胞を機能的に除核し、さらに遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノム
を除核卵母細胞に導入する前または導入と同時に卵母細胞を活性化させることに
よって作られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのような
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。
【００９３】 さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の卵母細胞、好ましくは自然に
成熟した終期の卵母細胞を機能的に除核し、さらに遺伝子組換え体細胞の染色体
ゲノムを除核卵母細胞に導入する前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる
ことによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダの
胚のようなヒト以外の哺乳動物の再構築胚に関する。
【００９４】 また、本発明は例えばクローンまたはトランスジェニック哺乳動物（例えばこ
の中に記載のクローンまたはトランスジェニックヤギ）のようなヒト以外の哺乳
動物から得られたタンパク質（例えばこの中に記載の異種タンパク質）のような
産物を含む。
【００９５】 好ましい実施形態において、産物は乳または乳中に分泌されたタンパク質であ
る。
【００９６】 別の態様において、本発明は例えばヒトタンパク質のようなタンパク質を提供
する方法に関する。本方法は：例えばトランスジェニック哺乳動物（例えばこの
中に記載のトランスジェニックヤギ）のようなヒト以外の哺乳動物を提供し；さ
らにその哺乳動物から、または例えば乳のようなその哺乳動物の産物から、産物
を回収する：ことを含む。
【００９７】 別の態様において、本発明は異種ポリペプチドを提供する方法に関する。本方
法は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入することによって、ヤギの卵母
細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）にヤギゲノムを導入して再構
築胚を形成し；例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって
再構築胚をヤギに発生させ；さらにそのヤギまたはそのヤギの子孫からポリペプ
チドを回収する：ことを含む。
【００９８】 好ましい実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合
（例えば電気融合）によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する。
【００９９】 好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化さ
れている）、例えば体細胞は臨界点前のG1期のようなG1期にある。別の好ましい
実施形態では、体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体
細胞はG0期にある。好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞であり、例
えば胚性線維芽細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、
筋肉細胞（例えばミオサイト）、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差
し支えない。
【０１００】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；その
体細胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しか
つ導入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【０１０１】 好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母
細胞である。
【０１０２】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば
中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて
卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。
好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞
を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１０３】 好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する
。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異
種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させ
る他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種
プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異
種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えな
い。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の
何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにお
ける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はさ
れないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジ
ェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロ
シダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩
基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロ
ブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プ
ロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１０４】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１０５】 好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、哺乳動物特異的プロモーター（
例えばヤギプロモーター）のようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子
配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない
。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター
；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター
；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差
し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロ
ブリンプロモーター；乳漿酸タンパクタンパクプロモーター；およびラクトアル
ブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１０６】 好ましい実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合
（例えば電気融合）によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する。
【０１０７】 好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。別の好ましい実施形
態において、体細胞は例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。
【０１０８】 好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母
細胞である。
【０１０９】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば
中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて
卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。
好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞
を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１１０】 好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する
。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異
種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させ
る他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種
プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異
種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えな
い。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の
何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにお
ける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はさ
れないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジ
ェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロ
シダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩
基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロ
ブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プ
ロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１１１】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１１２】 好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギの乳から異種ポリペプチ
ドを精製する。
【０１１３】 好ましい実施形態において、本方法は、トランスジェニックヤギから搾乳する
ことも含む。
【０１１４】 別の態様において、本発明は、異種ポリペプチドを提供する方法に関する。本
方法は：ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した後期卵母細胞に、遺伝子組
換えヤギ体細胞のゲノムを導入し、再構築胚を得て、例えば再構築胚をレシピエ
ントの雌ヤギに移植して再構築胚をヤギに発生させることによってヤギを作り；
さらに、そのヤギ（例えばそのヤギまたはそのヤギの子孫の乳から）ポリペプチ
ドを回収する：ことを含む。
【０１１５】 好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する
。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異
種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させ
る他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種
プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異
種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えな
い。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の
何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにお
ける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はさ
れないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジ
ェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロ
シダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩
基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロ
ブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プ
ロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１１６】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１１７】 好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギの乳から異種ポリペプチ
ドを精製する。
【０１１８】 別の態様において、本発明は、ヤギの再構築胚を作る方法に関する。本方法は
、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞から
のヤギゲノムを導入し、それによって再構築胚を形成することを含む。
【０１１９】 好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化さ
れている）、例えば体細胞はG1期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休
止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。好まし
い実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような胚性体細胞であ
る。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）
、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差し支えない。
【０１２０】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば
中期または終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵
母細胞を得て；卵母細胞を除核する。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞
を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞
を共に停止させる）。
【０１２１】 別の態様において、本発明は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期
の卵母細胞にヤギ体細胞からのゲノムを導入することによって得られたヤギの再
構築胚に関する。
【０１２２】 別の態様において、本発明は、ヤギの再構築されたトランスジェニック胚を作
る方法に関する。本方法は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入すること
によって、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞にヤギゲ
ノムを導入し、それによって再構築されたトランスジェニック胚を形成しること
を含む。
【０１２３】 好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化さ
れている）、例えば体細胞はG1期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休
止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG0期にある。好まし
い実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような胚性体細胞であ
る。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）
、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差し支えない。
【０１２４】 好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり
；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば
中期または終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵
母細胞を得て；卵母細胞を除核する。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞
を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞
を共に停止させる）。
【０１２５】 別の態様において、本発明は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入する
ことによって、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞にヤ
ギゲノムを導入することによって得られたヤギの再構築されたトランスジェニッ
ク胚に関する。
【０１２６】 別の態様において、本発明は、ヤギの群れを提供する方法に関する。本方法は
、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞から
のヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し
、さらにその再構築胚を第一のヤギに発生させることによって第一のヤギを作り
；ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞から
のヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し
、さらにその再構築胚を第二のヤギに発生させることによって第二のヤギを作り
；その際に第一および第二のヤギのゲノムが同じ動物、同じ遺伝子型または同じ
細胞株に由来し、従ってヤギの群れを提供することを含む。
【０１２７】 好ましい実施形態において、第一のヤギまたはその子孫を第二のヤギまたはそ
の子孫と交配させる。
【０１２８】 別の態様において、本発明は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期
の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入するこ
とによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第一のヤギに発生させる
ことによって第一のヤギを作り；ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期
の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入するこ
とによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第二のヤギに発生させる
ことによって第二のヤギを作り；その際に第一および第二のヤギのゲノムが同じ
動物、同じ遺伝子型または同じ細胞株に由来することによって得られたヤギの群
れに関する。
【０１２９】 好ましい実施形態において、ヤギの群れは、この中に記載の任意の方法によっ
て得られる。
【０１３０】 別の態様において、本発明は、胚性または胎仔性の体細胞に関する。
【０１３１】 好ましい実施形態において、その細胞は精製された胚性または胎仔性の体細胞
である。
【０１３２】 好ましい実施形態において、その細胞は胚性または胎仔性の体細胞の調製物中
にある。
【０１３３】 好ましい実施形態において、胚性または胎仔性の体細胞株を作るのにその細胞
を用いて差し支えない。
【０１３４】 好ましい実施形態において、その細胞は、導入遺伝子（例えばポリペプチドを
コードする導入遺伝子）を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され
；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックイン
またはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のような
タンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのよ
うなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。
導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関
心産物をコードしていて差し支えない。好ましい実施形態において、導入遺伝子
は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコード
する。導入遺伝子は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファ
ターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲ
ン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アル
ブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフ
ェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン
、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII
、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンをコードする。
【０１３５】 好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えば異種のまた
はヤギのプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモータ
ーであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；
血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；
皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター
：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモ
ーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；お
よびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１３６】 好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線
維芽細胞または一次派生線維芽細胞(primary derived fibroblast)であって差し
支えない。
【０１３７】 好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物から得られた生殖細
胞に由来するヤギ（例えば胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトランスジ
ェニックヤギからの精子であって差し支えない。
【０１３８】 好ましい実施形態において、その細胞は、例えば精製された胚性または胎仔性
の遺伝子組換えヤギ体細胞のような、胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体細
胞である。
【０１３９】 好ましい実施形態において、細胞は、胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体
細胞の調製物の一部である。別の好ましい実施形態において、胚性または胎仔性
の遺伝子組換えヤギ体細胞株を作るためにその細胞を用いる。
【０１４０】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例え
ばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に
一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、
ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク
質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモ
ーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し
支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意
の関心産物をコードしていて差し支えない。好ましい実施形態において、核酸は
、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードす
る。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、
アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グル
コセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、
ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、
ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシ
ュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支え
ない。
【０１４１】 好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種
のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであ
って差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特
異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特
異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のい
ずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター
；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラ
クトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１４２】 好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線
維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１４３】 好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギから得られた生殖細胞に
由来するヤギ（例えば胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトランスジェニ
ックヤギからの精子または卵母細胞であって差し支えない。
【０１４４】 好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細
胞を用いる。
【０１４５】 別の態様において、本発明は、容器（例えば気体または液体密閉容器）中に入
れられた、例えばこの中に記載のような、胚性または胎仔性のヤギ体細胞、細胞
の調製物、胚性または胎仔性のヤギ体細胞株に関する。
【０１４６】 別の態様において、本発明は、凍結された（例えば低温保存された）、例えば
この中に記載のような、胚性または胎仔性のヤギ体細胞、細胞の調製物、胚性ま
たは胎仔性のヤギ体細胞株に関する。
【０１４７】 別の態様において、本発明はキットに関する。そのキットは、この中に記載さ
れているような細胞容器を含む。好ましい実施形態において、そのキットは、ト
ランスジェニック動物を調製するのに必要な使用説明書をさらに含む。
【０１４８】 好ましい実施形態において、そのキットは、レシピエントの卵母細胞（例えば
除核卵母細胞）をさらに含む。
【０１４９】 別の態様において、本発明はクローンまたはトランスジェニックヤギを作るた
めの構成要素を提供するための方法に関する。本方法は、例えばこの中に記載の
ような細胞の凍結試料を得て、さらにその試料を解凍することを含む。
【０１５０】 別の態様において、本発明は胚性または胎仔性のヤギ体細胞株を調製する方法
に関する。本方法は、胚性または胎仔性のヤギから体細胞を得て；さらに体細胞
株が得られるように、例えば適切な培地中において細胞を培養することを含む。
【０１５１】 好ましい実施形態において、細胞株は、遺伝子組換え細胞株であり、例えばそ
の細胞は導入遺伝子を包含する。導入遺伝子は：体細胞ゲノム中に一体化され；
例えばヒト導入遺伝子を含む異種導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックア
ウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタ
ンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギ
プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであって
も差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド
のような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１５２】 好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ホルモン、免疫グロブリン、血清
タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、例えば、α-１
プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外ス
ーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、
プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチー
ム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およ
びα-抗トリプシンをコードする。
【０１５３】 好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えばヤギのまた
は異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモータ
ーであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；
血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；
皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター
：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモ
ーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；お
よびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１５４】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例え
ばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に
一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、
ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク
質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモ
ーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し
支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意
の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１５５】 好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパ
ク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナー
ゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシ
ドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリ
ン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトア
ルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長
因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプ
シンの何れをコードしても差し支えない。
【０１５６】 好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種
のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであ
って差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特
異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特
異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のい
ずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター
；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラ
クトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１５７】 好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線
維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１５８】 好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギから得られた生殖細胞に
由来するヤギ（例えば胚のまたは胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトラ
ンスジェニックヤギからの精子または卵母細胞であって差し支えない。
【０１５９】 好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細
胞を用いる。
【０１６０】 別の態様において、本発明は、胚性または胎仔性のヤギ体細胞株を調製する方
法に関する。本方法は、ヤギの精液で雌のレシピエントを受精させ；そのレシピ
エントからトランスジェニック胚を得て；その胚から体細胞を得て；さらに体細
胞株が得られるように例えば適切な培地中においてその細胞を培養することを含
む。
【０１６１】 好ましい実施形態において、精液はトランスジェニックヤギに由来する。
【０１６２】 好ましい実施形態において、その細胞株は遺伝子組換え細胞株であり、例えば
その細胞は導入遺伝子を包含する。導入遺伝子は：体細胞ゲノム中に一体化され
；例えばヒト導入遺伝子を含む異種導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノック
アウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒト
タンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤ
ギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっ
ても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチ
ドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１６３】 好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ホルモン、免疫グロブリン、血清
タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、例えば、α-１
プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外ス
ーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、
プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチー
ム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およ
びα-抗トリプシンをコードする。
【０１６４】 好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えばヤギのまた
は異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモータ
ーであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；
血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；
皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター
：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモ
ーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；お
よびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１６５】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例え
ばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に
一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、
ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク
質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモ
ーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し
支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意
の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１６６】 好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパ
ク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナー
ゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシ
ドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリ
ン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトア
ルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長
因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプ
シンの何れをコードしても差し支えない。
【０１６７】 好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種
のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであ
って差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特
異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特
異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のい
ずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター
；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラ
クトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１６８】 好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線
維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１６９】 好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細
胞を用いる。
【０１７０】 また、本発明は、胚形成の２から４細胞期においてレシピエントの哺乳動物に
移植された再構築胚がクローン哺乳動物に発生し得ることの発見に一部分基づく
。哺乳動物は、胚、胎仔または出生後の哺乳動物（例えば成体の哺乳動物）であ
って差し支えない。
【０１７１】 従って、ある態様において、本発明は、例えばクローン哺乳動物（例えばヤギ
、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダ）のようなヒト以外の哺乳動物を提
供する方法に関する。本方法は、例えばそのゲノムが体細胞に由来する再構築胚
のような哺乳動物の再構築胚を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から
８細胞期の胚をレシピエントの哺乳動物に移植し、さらにその再構築胚を哺乳動
物に発生させて哺乳動物を作ることを含む。
【０１７２】 好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態
において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【０１７３】 好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞
期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１７４】 好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上
皮細胞のような体細胞；例えば導入遺伝子配列を包含する体細胞のような遺伝子
組換え体細胞：に由来する。
【０１７５】 好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生した哺乳動物を第二
の哺乳動物（第二の哺乳動物は再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生した
ヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したの
と同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形
成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と
交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第
一のトランスジェニック哺乳動物を第一のトランスジェニック哺乳動物とは異な
る導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニック哺乳動物
と交配させて差し支えない。
【０１７６】 好ましい実施形態において、哺乳動物は雄の哺乳動物である。他の好ましい実
施形態において、哺乳動物は雌の哺乳動物である。乳分泌するように雌ヤギを誘
導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０１７７】 好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のよう
な組換えタンパク質）のような産物を哺乳動物から回収し；例えばタンパク質（
例えばヒトタンパク質）のような産物を哺乳動物の乳、尿、毛、血液、皮膚、ま
たは肉から回収できる。
【０１７８】 好ましい実施形態において、哺乳動物は胚、胎仔または出生後（例えば成体）
である。
【０１７９】 好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは、例えばトランスジェニック
細胞または核酸が導入された細胞のような遺伝子組換え体細胞に由来する。
【０１８０】 別の態様において、本発明は、本発明は、例えばトランスジェニック哺乳動物
（例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダ）のようなヒト以外の
哺乳動物を提供する方法に関する。本方法は、哺乳動物の再構築胚（例えばその
ゲノムが遺伝子組換え体細胞に由来する再構築胚）を２から８細胞期になるまで
培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントの哺乳動物に移植し、さらに
その再構築胚を哺乳動物に発生させて哺乳動物を作ることを含む。
【０１８１】 好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態
において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【０１８２】 好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞
期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１８３】 好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生した哺乳動物を第二
の哺乳動物（第二の哺乳動物は再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生した
ヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したの
と同じ動物、同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から
形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）
と交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した
第一のトランスジェニック哺乳動物を第一のトランスジェニック哺乳動物とは異
なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニック哺乳動
物と交配させて差し支えない。
【０１８４】 好ましい実施形態において、哺乳動物は雄の哺乳動物である。他の好ましい実
施形態において、哺乳動物は雌の哺乳動物である。乳分泌するように雌ヤギを誘
導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０１８５】 好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のよう
な組換えタンパク質）のような産物を哺乳動物から回収し；例えばタンパク質（
例えばヒトタンパク質）のような産物を哺乳動物の乳、尿、毛、血液、皮膚、ま
たは肉から回収できる。
【０１８６】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞は導入遺伝子配列を包含する
。導入遺伝子配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックア
ウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えば
ヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例え
ばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれで
あっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１８７】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロブリン、
血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、トランスジ
ェニック動物における発現が望まれる任意のタンパク質、例えば、α-１プロテ
イナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパー
オキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸
デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロイ
ンスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラ
クトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒ
ト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗
トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１８８】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１８９】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えばヤギの
または異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモ
ーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモータ
ー；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモータ
ー；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモー
ター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプ
ロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター
；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１９０】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞のゲノム中に核酸が導入され
ていて差し支えない。核酸は：例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸
；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事
象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモー
ター；例えばヤギのまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下に
ある異種配列：のいずれであっても差し支えない。核酸配列は、タンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えな
い。
【０１９１】 好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパ
ク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナー
ゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシ
ドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリ
ン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトア
ルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長
因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプ
シンの何れをコードしても差し支えない。
【０１９２】 好ましい実施形態において、核酸配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１９３】 好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種
のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであ
って差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特
異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特
異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のい
ずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター
；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラ
クトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１９４】 別の態様において、本発明はクローンヤギを作る方法に関する。本方法はヤギ
の再構築胚（例えばそのゲノムがヤギ体細胞に由来する再構築胚）を２から８細
胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントのヤギに移植
し、さらにその再構築胚をヤギに発生させてヤギを作ることを含む。
【０１９５】 好ましい実施形態において、ヤギは、胚、胎仔または出生後（例えば成体）で
ある。
【０１９６】 好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態にお
いて、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【０１９７】 好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞
期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１９８】 好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上
皮細胞のようなヤギの体細胞；遺伝子組換えヤギ体細胞：に由来し、ヤギ体細胞
のゲノムは、その体細胞のゲノムに導入された導入遺伝子配列または核酸を包含
する。
【０１９９】 好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤ
ギ（第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫で
あり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、
同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再
構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させる
ことをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトラン
スジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有す
る再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えな
い。
【０２００】 好ましい実施形態において、ヤギは雄のヤギである。他の好ましい実施形態に
おいて、ヤギは雌のヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその
雌ヤギから乳を得ることができる。
【０２０１】 好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のよう
な組換えタンパク質）のような産物をヤギから回収し；例えばタンパク質（例え
ばヒトタンパク質）のような産物をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉か
ら回収できる。
【０２０２】 別の態様において、本発明はトランスジェニックヤギを作る方法に関する。本
方法はヤギの再構築胚（例えばそのゲノムが遺伝子組換えヤギ体細胞に由来する
再構築胚）を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレ
シピエントのヤギに移植し、さらにその再構築胚をヤギに発生させてトランスジ
ェニックヤギを作ることを含む。
【０２０３】 好ましい実施形態において、ヤギは、胚、胎仔または出生後（例えば成体）で
ある。
【０２０４】 好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態にお
いて、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【０２０５】 好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞
期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０２０６】 好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上
皮細胞のような体細胞に由来する。
【０２０７】 好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤ
ギ（第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫で
あり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、
同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再
構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させる
ことをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトラン
スジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有す
る再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えな
い。
【０２０８】 好ましい実施形態において、ヤギは雄のヤギである。他の好ましい実施形態に
おいて、ヤギは雌のヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその
雌ヤギから乳を得ることができる。
【０２０９】 好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のよう
な組換えタンパク質）のような産物をヤギから回収し；例えばタンパク質（例え
ばヒトタンパク質）のような産物をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉か
ら回収できる。
【０２１０】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞は導入遺伝子配列を包含する
。導入遺伝子配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックア
ウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えば
ヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例え
ばヤギまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列
：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０２１１】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロブリン、
血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、トランスジ
ェニック動物における発現が望まれる任意のタンパク質、例えば、α-１プロテ
イナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパー
オキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸
デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロイ
ンスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラ
クトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒ
ト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗
トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０２１２】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０２１３】 好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えばヤギの
または異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモ
ーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモータ
ー；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモータ
ー；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモー
ター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプ
ロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター
；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０２１４】 好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞のゲノム中に核酸が導入され
ていて差し支えない。核酸配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝
子；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の
事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモ
ーター；例えばヤギのまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下
にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパ
ク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差
し支えない。
【０２１５】 好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパ
ク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナー
ゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシ
ドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリ
ン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトア
ルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長
因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプ
シンの何れかをコードする。
【０２１６】 好ましい実施形態において、核酸配列はヒトタンパク質をコードする。
【０２１７】 好ましい実施形態において、核酸配列は、プロモーター（例えばヤギのまたは
異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーター
であって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血
液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮
膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：
のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモー
ター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およ
びラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０２１８】 別の態様において、本発明はキットに関する。キットは、２から８細胞期にあ
る再構築胚を含む。好ましい実施形態において、キットは、例えば胚、胎仔また
は出生後の哺乳動物のような哺乳動物を作るための使用説明書をさらに含む。
【０２１９】 別の態様において、本発明は、例えばこの中に記載の方法によって得られた例
えば８細胞期より後の胚または胎仔のような後期の胚を含むキットに関する。
【０２２０】 この中で用いられている「機能的除核」の用語は、例えば卵母細胞のような細
胞の内因性ゲノムを機能できなくする（例えば複製および／またはＤＮＡ合成で
きなくする）工程を称する。そのような卵母細胞をこの中で「機能的除核卵母細
胞」と称する。
【０２２１】 タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの用語は、この中で互換的に用いら
れている。
【０２２２】 この中で用いられている「導入遺伝子配列」の用語は、技術によって細胞に導
入された核酸配列（例えば１つ以上のヒトタンパク質をコードする）を称する。
また、導入遺伝子配列は、この中で導入遺伝子としても称されているが、その細
胞から全部または一部が発生する動物のゲノムの一部となる。本発明の実施形態
において、導入遺伝子配列は染色体ゲノム中に一体化されている。導入遺伝子配
列がゲノム中に一体化されている場合、単にその挿入の効果によって、結果とし
てその配列が挿入されているゲノムの核酸配列に変化をもたらす。導入遺伝子配
列は、部分的にまたは完全に、種が異なっていて差し支えなく、すなわち、導入
遺伝子配列またはその一部は、それが導入される細胞と異なる種に由来していて
差し支えない。導入遺伝子配列が、それが導入される細胞の内因性遺伝子と同種
（配列の意味においてまたは種が同じであるという意味において）である場合、
好ましくは、導入遺伝子配列は１つ以上の以下の特徴を有する：それが挿入され
る細胞ゲノムの配列を変化させるように（例えば内因性遺伝子の位置と異なる位
置に挿入され、またはその挿入が結果として内因性遺伝子の配列に変化をもたら
すように）、細胞ゲノム中への挿入用に設計され、または細胞ゲノム中に挿入さ
れ；例えば導入遺伝子配列の異常発現(misexpression)をもたらす変異のような
変異を含み；その挿入の効果として、それが挿入されている遺伝子の異常発現を
もたらすことができ、例えば、その挿入が結果として、それが挿入されている遺
伝子のノックアウトをもたらす。導入遺伝子配列は、1つ以上の転写調節配列、
および例えばイントロンのような、選択された核酸の所望のレベルまたはパター
ンの発現のために必要でありかつその選択された核酸に作動可能に連結された任
意の他の核酸配列を含む。導入遺伝子配列は、エンハンサー配列および／または
分泌を可能とする配列を含んでいて差し支えない。
【０２２３】 「再構築胚」、「再構成胚」「核移植単位」および「核移植胚」の用語はこの
中で互換的に用いられている。
【０２２４】 この中で用いられている「正常のヤギ」の用語は、再構築胚から発生したもの
でないヤギを称する。
【０２２５】 「自然に派生した卵母細胞」は、例えばin vivoのような自然条件下で培養す
ることによって、選択された細胞期（例えば中期IIまたはより好ましくは終期）
に達することができる卵母細胞を称する。
【０２２６】 本発明の他の特徴および利点は、以下の説明および請求項から明らかであろう
。
【０２２７】 発明の詳細な説明体細胞ゲノムの供給源 体細胞 体細胞は、この中に記載の方法において、再構築胚を作るためのゲノムを供給
し得る。この中で用いられている「体細胞」の用語は、分化細胞を称する。その
細胞は、体細胞または体細胞系統に関連する細胞であって差し支えない。あるい
は、この中に記載の任意の方法および動物は、再構築胚を作るためのゲノムを供
給する目的で、生殖細胞のもとである二倍体幹細胞を利用して差し支えない。
【０２２８】 体細胞は、動物または培養細胞に由来して差し支えない。体細胞を動物から得
た場合は、その動物は、任意の発生期（例えば胚、胎仔または成体）であって差
し支えない。胚性細胞が好ましい。胚性細胞は、胚性幹細胞ならびに体細胞系統
に関連する胚性細胞であって差し支えない。そのような細胞は、胚の内胚葉、中
胚葉または外胚葉から得られる。好ましくは、胚性細胞は体細胞系統に関連する
。体細胞系統に関連する胚性細胞は、胚形成の１０日目以降に単離された細胞を
称する。しかしながら、胚形成の１０日目より前に細胞を得ても差し支えない。
染色体ゲノムの供給源として細胞株を用いる場合、一次細胞が好ましい。この中
で用いられている「一次細胞株」の用語は、一次細胞株ならびに一次派生細胞株
を含む。
【０２２９】 適切な体細胞として、線維芽細胞（例えば胚性一次線維芽細胞）、筋肉細胞（
例えばミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞および乳腺細胞が挙げられる。他の適
切な細胞として、肝細胞および膵臓ランゲルハンス島が挙げられる。好ましくは
、体細胞は、例えば胚形成の１０日目以降に単離された胚性体細胞である。例え
ばクローン哺乳動物を作るために、体細胞のゲノムは天然のゲノムであって差し
支えなく、あるいは、例えばトランスジェニッククローン哺乳動物を作るために
、ゲノムは導入遺伝子配列を含むように遺伝子操作されていて差し支えない。
【０２３０】 例えば機械的（例えば切断、細断）または酵素的手段（例えばトリプシン処理
）によって組織を分離して細胞懸濁液を得て、さらにコンフルエントな単層にな
るまでその細胞を培養することによって、体細胞を得ることができる。その後、
低温保存のために体細胞を回収および調製し、あるいはストック培養として体細
胞を維持して差し支えない。ヤギ体細胞（例えば線維芽細胞）の単離についてこ
の中に記載する。
【０２３１】 体細胞は休止体細胞であっても非休止体細胞であっても差し支えない。この中
に記載の「非休止」は、細胞が細胞分裂周期にあることを称する。細胞分裂周期
は４つの異なる期G1、Ｓ、G2およびＭを有する。臨界点と呼ばれる細胞周期にお
ける最初の事象はG1期の間に生じる。この中で用いられている「臨界点」は、細
胞周期を細胞が進むことを確実にする前の細胞周期の初期のG1期を称する。例え
ば、細胞がG1期に入った後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１時
間まで、細胞は臨界点前であると考えられる。細胞が次の細胞周期に入るか否か
の決定が臨界点でなされる。細胞が臨界点を過ぎると、細胞はG1期の残り（すな
わちＤＮＡ合成期前）を通過する。S期はＤＮＡ合成期であり、その後ＤＮＡ合
成と分裂の間の期であるG2期が続く。分裂はＭ期の間に生じる。臨界点で細胞が
次の細胞周期に入らない場合は、細胞は休止期になる。さらに、細胞は細胞周期
から出て休止期になる。「休止」細胞は、G0期の細胞としても称され、細胞周期
の４つの期の何れにも属さない細胞を称する。好ましくは、体細胞はG0期にあり
、または細胞分裂周期のG1期にある。
【０２３２】 細胞周期の特定の期（例えばG0またはG1期）にあるドナー体細胞は、卵母細胞
と体細胞ゲノムとの同調を可能とする。G0またはG1期にある体細胞の核の導入に
よる（例えば、同時の活性化および融合による）中期IIにある卵母細胞の再構築
は、受精の間に生じる事象を模倣し得る。別の例示として、例えば同時の活性化
および融合によって、臨界点前のG1期にある体細胞のゲノムと融合させた終期II
にある卵母細胞は、卵母細胞とドナーの核との間の細胞周期の同調をもたらす。
【０２３３】 細胞が細胞周期のどの期にあるかを決定する方法は公知である。例えば、以下
の実施例において記載のように、細胞周期の異なる期における種々のマーカーが
存在する。そのようなマーカーとして、G1期のためにシクリンＤ1、2、3および
増殖細胞核抗原(ＰＣＮＡ)、ならびにＤＮＡ合成活性を検出するためのＢｒＤｕ
が挙げられる。さらには、低血清培地(serum-deprived medium)中で細胞を培養
することによって、G0期に入るように細胞を誘導できる。あるいは、血清活性化
によって、G0期にある細胞を細胞周期（すなわちG1期）に入るように誘導できる
。
【０２３４】 例えば胚、胎仔または成体の哺乳動物から、あるいは例えば同調培養系のよう
な培養系から、ドナー細胞を得ることができる。例えば、細胞分裂周期の特定の
期にある少なくとも過半数の（例えば５０％、５５％、６０％、７０％、８０％
、８５％、９０％またはそれ以上）ドナー細胞を含む培養系からドナー細胞を選
択して差し支えない。
【０２３５】 遺伝子組換え体細胞の供給源： トランスジェニック哺乳動物 本発明において体細胞の供給源として用い得るヒト以外のトランスジェニック
哺乳動物を作る方法は当業界で公知である。そのような方法は、哺乳動物の生殖
細胞系にＤＮＡ構成物を導入してトランスジェニック動物を作ることを含む。例
えば、標準的なトランスジェニック技術によって、ＤＮＡ構成物の1以上のコピ
ーを哺乳動物の胚のゲノムに組み込んで差し支えない。
【０２３６】 ヤギは遺伝子組換え体細胞の好ましい供給源であるが、他のヒト以外の哺乳動
物を用いても差し支えない。好ましいヒト以外の哺乳動物は、例えばウシ、ヒツ
ジ、ラクダまたはヤギのような反芻動物である。例えば、アルプス、ザーネンお
よびトゥゲンブルグ(Toggenburg)系統のヤギのようなスイス起源のヤギがこの中
で記載の方法において有用である。好ましいヒト以外の動物の別の例示として、
雄ウシ、ウマ、ラマおよびブタが挙げられる。遺伝子組換え細胞の供給源として
用いられる哺乳動物は、本発明の方法（例えば、ヤギゲノムをヤギの機能的除核
卵母細胞に導入するような）によって得られるべきトランスジェニック哺乳動物
に依存するであろう。
【０２３７】 好ましくは、本発明において用いられる体細胞は、トランスジェニックヤギか
ら得られる。トランスジェニックヤギを作る方法は当業界で公知である。例えば
、マイクロインジェクションによってヤギの生殖細胞に導入遺伝子を導入して差
し支えない（例えば、参照によってこの中に組み込まれるEbert et al. (1994)
Bio/Technology 12: 699を参照）。
【０２３８】 導入遺伝子をヒト以外の動物の生殖細胞に導入することによって、遺伝子組換
え体細胞の供給源として用い得る他のヒト以外のトランスジェニック動物を作っ
て差し支えない。導入遺伝子を導入するために、種々の発生期にある標的の胚細
胞を用いて差し支えない。標的の胚細胞の発生期に依存して異なる方法を用いる
。本発明を実施するために用いられる任意の動物の特定の系統は、全身的な健康
状態が良いこと、胚の収率が良いこと、胚における前核の視認性が良いこと、お
よび生殖適応性がよいことに基づいて選択される。さらには、ハプロタイプが重
要な因子である。
【０２３９】 核酸導入された細胞株 例えばあるタンパク質をコードする核酸のような関心のある核酸が導入された
細胞株から、本発明において用いるための遺伝子組換え体細胞を得て差し支えな
い。
【０２４０】 従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって細胞に核酸構成
物を導入して差し支えない、この中で用いられている「トランスフェクション」
および「形質転換」の用語は、宿主細胞に導入遺伝子配列を導入するための種々
の技術を含み、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ-デキ
ストラン法、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーション等が挙げられ
る。さらには、以下に記載のように、例えばウィルスベクターのような生物ベク
ターを用いて差し支えない。宿主を形質転換しまたはトランスフェクションする
ための適切な方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、および他の適切な実験マニュアル
に記載されている。
【０２４１】 ２つの有用な方法は、エレクトロポレーションとリポフェクションである。各
方法の簡単な例示を以下に記載する。
【０２４２】 以下のプロトコルを用いて、エレクトロポレーションによってドナー体細胞株
に、ＤＮＡ構成物を安定に導入することができる：例えば線維芽細胞（例えば胚
性線維芽細胞）のような体細胞を約4x106細胞／mlの濃度でＰＢＳ中に再懸濁液
させる；線状ＤＮＡ(５０μg)を細胞懸濁液(０．５ml)に添加し、その懸濁液を
０．４cmの電極間隙キュベット(Biorad)に設置する；Biorad Gene Pulserエレク
トロポレーター(２５mA、１０００マイクロファラッドおよび無限抵抗で３３０
ボルトパルス)を用いてエレクトロポレーションを実施する；選択のためにＤＮ
Ａ構成物がネオマイシン耐性遺伝子を包含する場合は、３５０μg／mlのＧ４１
８(GibcoBRL)と共に１５日間インキュベートした後、ネオマイシン耐性クローン
を選択する。
【０２４３】 以下のようなプロトコルを用いて、リポフェクションによってドナー体細胞に
ＤＮＡ構成物を安定に導入することができる：約2ｘ105の細胞を3.5シミアメー
ター(cmiameter)に設置し、さらにLipfectAMINETM(GibcoBRL)を用いて線状ＤＮ
Ａ(2μg)をトランスフェクションする；トランスフェクションの４８時間後、細
胞を1：1000および1：5000に希釈し、選択のためにＤＮＡ構成物がネオマイシン
耐性遺伝子を包含する場合は、Ｇ４１８を最終濃度０．３５mg/mlとなるように
添加する；ネオマイシン耐性クローンを単離し、さらに低温保存ならびに核移植
のために増殖させる。
【０２４４】 タンパク質の組織特異的発現 例えば異種タンパク質のようなタンパク質をトランスジェニック哺乳動物の特
定組織または体液（例えば乳）中に発現させることが望ましい場合が多い。異種
タンパク質が発現されている組織または体液からそれらタンパク質を回収するこ
とができる。例えば、乳中に異種タンパク質を発現させるのが望ましい場合が多
い。乳特異的プロモーターの制御下において、異種タンパク質を産生させる方法
が以下に記載されている。さらには、他の組織特異的プロモーターならびに他の
制御要素（例えばシグナル配列および非分泌タンパク質の分泌を高める配列）を
以下に記載する。
【０２４５】 乳特異的プロモーター 有用な転写プロモーターは、好ましくは哺乳類の上皮細胞において活性化され
るプロモーターであり、カゼイン、βラクトグロブリン(Clark et al., (1989)
Bio/Technology 7: 487-492)、乳漿酸タンパク質(Gordonet al. (1987) Bio/Tec
hnology 5: 1183-1187)およびラクトアルブミン(Soulier et al., (1992) FEBS
Letts. 297: 13) のような乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するようなプ
ロモーターが挙げられる。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類のα、β、γ
またはκカゼイン遺伝子に由来していて差し支えなく；好ましいプロモーターは
ヤギβカゼイン遺伝子に由来する(DiTullio, (1992) Bio/Technology 10: 74-77
)。乳特異的タンパク質プロモーターまたは乳腺組織において特異的に活性化さ
れるプロモーターは、ｃＤＮＡに由来していてもまたはゲノム配列に由来してい
ても差し支えない。好ましくは、ゲノムに由来する。
【０２４６】 1つ以上、およびしばしばいくつかの生物における上に挙げた乳腺特異的遺伝
子のＤＮＡ配列情報を利用できる。例えば、Richards et al., J. Biol. Chem.
256, 526-532 (1981)(ラットα-ラクトアルブミン)；Campbell et al., Nucleic
Acids Res. 12, 8685-8697 (1984)（ラットWAP）；Junes et al., J. Biol. Ch
em. 260, 7042-7050 (1985)（ラットβ-カゼイン）；Yu-Lee ＆ Rosen, J. Biol
. Chem. 258, 10794-10804 (1983)（ラットγ-カゼイン）；Hall, Biochem. J.
242, 735-742 (1987)（ヒトα-ラクトアルブミン）；Stewart, Nucleic Acids R
es. 12, 389 (1984)（ウシαs1およびκカゼインｃＤＮＡ）；Gorodetsky et al
., Gene 66, 87-96 (1988)（ウシβカゼイン）；Alexander et al., Eur. J. Bi
ochem. 178, 395-401 (1988)（ウシκカゼイン）；Brignon et al., FEBS Lett.
188, 48-55 (1977)（ウシαS2カゼイン）；Jamieson et al., Gene 61, 85-90
(1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Ale
xander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989)（ウシβラクトグロブリ
ン）；Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987)（ウシαラクトアルブ
ミン）を参照。種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能がMercier ＆ Vilot
te, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993)（全ての目的のために参照によってそ
の全てが組み込まれる）。追加のフランキング配列が異種タンパク質の発現を最
適化するのに有用である場合、既存の配列をプローブとして用いて、そのような
配列をクローン化することができる。プローブとして公知の同起源のヌクレオチ
ド配列または同起源のタンパク質に対する抗体を用いてそのような生物からのラ
イブラリーをスクリーニングすることによって、異なる生物由来の乳腺特異的制
御配列を得ることができる。
【０２４７】 シグナル配列 有用なシグナル配列は乳特異的シグナル配列、あるいは真核生物または原核生
物のタンパク質の分泌をもたらすような他のシグナル配列である。好ましくは、
シグナル配列は、乳特異的シグナル配列から選択され、すなわち、乳中に分泌さ
れる産物をコードする遺伝子に由来する。最も好ましくは、乳特異的シグナル配
列はそのＤＮＡ構成物において用いられている乳特異的プロモーター（以下に記
載されている）に関連する。シグナル配列のサイズは重要でない。要求されるこ
とは、その配列が、例えば乳腺組織に所望の組換えタンパク質の分泌をもたらす
のに充分なサイズであることでのみである。例えば、例えばα、β、γまたはκ
カゼインのようなカゼイン、βラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質およびラク
トアルブミンをコードする遺伝子からのシグナル配列を用いて差し支えない。好
ましいシグナル配列は、ヤギのβ―カゼインシグナル配列である。
【０２４８】 例えば腎細胞、膵細胞または肝細胞によって分泌されるタンパク質のような他
の分泌タンパク質からのシグナル配列を用いても差し支えない。好ましくは、シ
グナル配列は、例えば尿または血液中にタンパク質の分泌をもたらす。
【０２４９】 分泌タンパク質のアミノ末端領域 非分泌タンパク質が分泌されるようなやり方で（例えば、分泌されるべきタン
パク質中に、通常分泌されるタンパク質のコード配列の全てまたは一部を挿入す
ることによって）、非分泌タンパク質を改変させて差し支えない。好ましくは、
通常分泌されるタンパク質の全配列がそのタンパク質の配列中に含まれるのでは
なく、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端のタンパク質の分泌をもたらすの
に充分な部分のみが含まれる。例えば、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端
部分に、通常分泌されないタンパク質を融合させる（通常そのアミノ末端におい
て）。
【０２５０】 １つの態様において、通常分泌されるタンパク質は、通常乳中に分泌されるタ
ンパク質である。そのようなタンパク質として、乳腺上皮細胞によって分泌され
るタンパク質、カゼイン、ラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質、およびラクト
アルブミンのような乳タンパク質が挙げられる。カゼインタンパク質は、任意の
哺乳類のα、β、γまたはκカゼイン遺伝子を含む。好ましいタンパク質は例え
ばヤギβカゼインのようなβカゼインである。分泌タンパク質をコードする配列
は、ｃＤＮＡまたはゲノム配列の何れに由来しても差し支えない。好ましくは、
その配列はゲノムに由来し、1つ以上のイントロンを包含する。
【０２５１】 他の組織特異的プロモーター 特定組織における発現をもたらす他の組織特異的プロモーターを用いても差し
支えない。組織特異的プロモーターは、他の組織におけるよりも特定組織におい
てより強く発現されるプロモーターである。組織特異的プロモーターは実質的に
特定組織においてのみ発現されることが多い。
【０２５２】 用い得る組織特異的プロモーターとして：神経特異的プロモーター（例えばネ
スティン、Wnt-1、Pax-1、Engrailed-1、Engrailed-2、Sonic hedgehog）；肝特
異的プロモーター（例えばアルブミン、α-1抗トリプシン）；筋肉特異的プロモ
ーター（例えばミオゲニン、アクチン、MyoD、ミオシン）；卵母細胞特異的プロ
モーター（例えばZP1、ZP2、ZP3）；精巣特異的プロモーター（例えばプロタミ
ン、ファーチリン、対合複合体タンパク質-1）血液特異的プロモーター（例えば
グロブリン、GATA-1、ポルホビリノゲンデアミナーゼ）；肺特異的プロモーター
（例えば界面活性剤プロテインC）；皮膚または毛特異的プロモーター（例えば
ケラチン、エラスチン）；内皮特異的プロモーター（例えばTie-1、Tie-2）；お
よび骨特異的プロモーター（例えばBMP）が挙げられる。
【０２５３】 さらには、いくつかの組織における発現のために一般的プロモーターを用いて
も差し支えない。一般的プロモーターとして、β-アクチン、ROSA-21、PGK、FOS
、c-myc、Jun-A、およびJun-Bが挙げられる。
【０２５４】 ＤＮＡ構成物 例えば乳腺上皮細胞のような特定組織のためのプロモーター（例えばカゼイン
プロモーター、例えばヤギβカゼインプロモーター）、乳特異的シグナル配列（
例えばカゼインシグナル配列、例えばβカゼインシグナル配列）、および異種タ
ンパク質をコードするＤＮＡを包含する構成物として、異種タンパク質をコード
するカセットを組み立てることができる。
【０２５５】 また、その構成物は非分泌タンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流にある３
’非翻訳領域を含んでいて差し支えない。そのような領域は、発現系のRNA転写
を安定化させ、従ってその発現系からの所望のタンパク質の収率を高める。本発
明で用いるための構成物において有用な３’非翻訳領域はポリＡシグナルをもた
らす配列である。そのような配列は、例えばSV40スモールｔ抗原、カゼイン３’
非翻訳領域または当業界で周知の他の非翻訳領域に由来していて差し支えない。
１つの態様において、３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質に由来する。３’非
翻訳領域の長さは重要ではないが、そのポリＡ転写の安定化効果は発現配列のRN
Aを安定化させるのに重要であろう。
【０２５６】 必要に応じて、構成物は、プロモーターとシグナル配列をコードするＤＮＡ配
列との間に５’非翻訳領域を包含する。そのような非翻訳領域は、プロモーター
と同じ制御領域に由来して差し支えなく、あるいは例えば他の合成の、半合成の
または天然の供給源に由来する等、異なる遺伝子に由来していて差し支えない。
この場合も、その特定の長さは重要でないが、それら非翻訳領域は発現のレベル
を改善するのに重要であろう。
【０２５７】 また、構成物は、好ましくは乳腺上皮細胞において発現される遺伝子のＮ末端
コード領域の約１０％、２０％、３０％またはそれ以上を包含する。例えば、Ｎ
末端コード領域は、用いられるプロモーターに対応させることができ、例えばヤ
ギβカゼインＮ末端コード領域である。
【０２５８】 当業界で公知の方法を用いて構成物を調製できる。大きなプラスミドの一部と
して構成物を調製できる。そのような調製物は、効率的な方法で正確な構成物の
クローニングおよび選択を可能とする。所望の哺乳動物に組み込むために残りの
プラスミド配列から容易に単離できるように、プラスミド上の都合のよい制限酵
素部位の間に構成物を位置させて差し支えない。
【０２５９】 異種タンパク質 異種タンパク質をコードする導入遺伝子配列をヒト以外の哺乳動物の生殖細胞
に導入し、あるいは細胞株にトランスフェクションして、上記のような遺伝子組
換え体細胞の供給源を提供することができる。
【０２６０】 タンパク質は、複合または多重結合タンパク質（例えば、ホモ-またはヘテロ-
多重結合体、例えばホモ-またはヘテロ-多重結合体として自然に生じたタンパク
質、例えばホモ-またはヘテロ-ニ量体、三量体または四量体）であって差し支え
ない。タンパク質は、例えばＮ末端、Ｃ末端または内部断片の切断等の除去によ
って処理されたタンパク質であって差し支えない。複合タンパク質でも活性形態
で発現され得る。例えばヤギのような哺乳動物のゲノムに導入され得る配列によ
ってコードされるタンパク質として、糖タンパク質、神経ペプチド、イムノグロ
ブリン、酵素、ペプチドおよびホルモンが挙げられる。タンパク質は、天然のタ
ンパク質であっても組換えタンパク質（例えば断片、例えばイムノグロブリン融
合タンパク質のような融合タンパク質、または変異体）であっても差し支えない
。タンパク質はヒトに由来していてもヒト以外に由来していても差し支えない。
異種タンパク質は、限定はされないが、以下のような可能性のある治療薬または
診断薬であって差し支えない：α-１プロテイナーゼ阻害剤、α-1抗トリプシン
、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、アンチトロンビンIII、任意の
血液凝固因子（VIII因子、IX因子およびX因子等）、キチナーゼ、エリスロポイ
エチン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロ
シダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長因子、ヒト血清アルブミ
ン、イムノグロブリン、インスリン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリ
ン、プロラクチン、可溶性ＣＤ４またはその成分又は複合体、ラクトフェリン、
ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、あるいはそれらの変異体。
【０２６１】 イムノグロブリンは特に好ましい異種タンパク質である。イムノグロブリンの
例示として、IgA、IgG、IgE、IgM、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、単鎖
抗体および抗体-タンパク質融合体が挙げられる。
【０２６２】 1つ以上、およびしばしばいくつかの生物における上に挙げた異種タンパク質
をコードする遺伝子のいくつかの配列情報を利用できる。例えば、Long et al.
(1984) Biochem. 23(21): 4828-4837（α-1抗トリプシン）；Mitchell et al. (
1986) Prot. Natl. Acad. Sci USA 83: 7182-7186（アルカリホスファターゼ）
；Schneider et al. (1988) EMBO J. 7(13): 4151-4156（アンギオジェニン）；
Bock et al. (1988) Biochem. 27(16): 6171-6178（アンチトロンビンIII）；Ol
ds et al. (1991) Br. J. Haematol. 78(3): 408-413（アンチトロンビンIII）
；Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(22): 7580-7584（エリス
ロポイエチン）；米国特許第5,614,184号（エリスロポイエチン）；Horowitz et
al. (1989) Genomics 4(1): 87-96（グルコセレブロシダーゼ）；Kelly et al.
(1992) Ann. Hum. Genet. 56(3): 255-265（グルタミン酸デカルボキシラーゼ
）；米国特許第5,707,828号（ヒト血清アルブミン）；米国特許第5,652,352号（
ヒト血清アルブミン）；Lawn et al. (1981) Nucleic Acid Res. 9(22): 6103-6
114（ヒト血清アルブミン）；Kamholz et al. (1986) Prot. Natl. Acad. Sci.
USA 83(13): 4962-4966（ミエリン塩基性タンパク質）；Hiraoka et al. (1991)
Mol. Cell Endocrinol. 75(1): 71-80（プロラクチン）；米国特許第5,571,896
号（ラクトフェリン）；Pennica et al. (1983) Nature 301 (5897): 214-221（
組織プラスミノーゲンアクチベーター）；Sarafanov et al. (1995) Mol. Biol.
29: 161-165を参照（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）。
【０２６３】 卵母細胞 本発明において用いるための卵母細胞として、減数細胞分裂の中期IIにある卵
母細胞（例えば中期IIにおいて停止している卵母細胞）、および減数分裂の終期
（例えば終期Iまたは終期II）にある卵母細胞が挙げられる。中期IIにある卵母
細胞は１つの極体を有するが、一方終期にある卵母細胞は、第二極体の形成まで
の、第二極体の細胞膜の突出が存在することに基づいて同定される。さらには、
生化学的および／または発生の特徴に基づいて、中期IIにある卵母細胞は、終期
IIにある卵母細胞から区別され得る。例えば、中期IIの卵母細胞は停止状態にあ
るが、一方、終期の卵母細胞は活性化状態にある。好ましくは、卵母細胞はヤギ
卵母細胞である。
【０２６４】 ヤギの生殖周期の種々の時期において卵母細胞を得ることができる。例えば、
生殖周期の所定の時期に、卵母細胞の多くの割合（例えば、約５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上）が終期にある。それら卵母細
胞は自然に成熟した卵母細胞である。さらには、細胞周期の種々の期の卵母細胞
を得て、さらに減数分裂の特定期に入るようにin vitroで誘導することができる
。例えば、低血清培地中で培養した卵母細胞は、中期において停止するようにな
る。さらには、血清活性化によって、停止卵母細胞を終期に入るように誘導でき
る。従って、本発明で用いるために終期の卵母細胞を容易に得ることができる。
【０２６５】 再構築胚を形成するために用いる前に、in vitroで卵母細胞を成熟化させるこ
とができる。その工程は、通常、哺乳動物の卵母細胞（例えばヤギの卵母細胞）
から得た未成熟卵母細胞を採取し、さらにその卵母細胞が所望の減数分裂期（例
えば中期または終期）に達するまで、除核前に培地中において卵母細胞を成熟化
させることを必要とする。さらには、再構築胚を形成するために、in vivoで成
熟化させた卵母細胞を用いても差し支えない。
【０２６６】 過剰排卵の間に雌の哺乳動物から卵母細胞を採取する。簡単に説明すると、雌
のドナーの卵管から卵母細胞をフラッシングすることによって卵母細胞（例えば
ヤギ卵母細胞）を外科的に回収することができる。ヤギにおいて過剰排卵を誘発
する方法およびヤギ卵母細胞を採取する方法はこの中に記載されている。
【０２６７】 好ましくは、卵母細胞の減数分裂期（例えば中期IIまたは終期II）はドナー体
細胞の細胞周期の期と互いに関連する。卵母細胞の分裂期とドナー体細胞の細胞
周期の分裂期の間の相関は、この中で「同調」と称されている。G0またはG1期に
ある体細胞の核の導入による（例えば、同時の活性化および融合による）中期II
の卵母細胞の再構築は、受精の間に生じる事象を模倣する。別の例示として、同
時の活性化および融合によって臨界点前のG1期にある体細胞のゲノムと融合させ
た終期の卵母細胞は、卵母細胞とドナー核との間の同調をもたらす。
【０２６８】 機能的除核 卵母細胞の内因性ゲノムが機能（例えば複製またはＤＮＡ合成）できなくなる
ように、例えばヤギ卵母細胞のようなドナー卵母細胞を機能的に除核する。卵母
細胞を機能的に除核する方法として：例えば卵母細胞が核ゲノムを欠くように、
卵母細胞からゲノムを除去する（すなわち除核する）こと；例えば照射によって
（例えばX線照射またはレーザー照射によって）、卵母細胞内のＤＮＡを不活性
化すること；化学的に不活性化すること等が挙げられる。
【０２６９】 除核 卵母細胞のゲノムを機能できなくする１つの方法は、卵母細胞からゲノムを除
去することである（すなわち除核）。卵母細胞から核物質を除去するために、マ
イクロピペットまたは針を透明帯に挿入して差し支えない。例えば、第一極体お
よびその極体の周りの隣接細胞質（例えば、細胞質の約２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％であり、おそらく中期プレートを包含する）を吸引することに
よって、マイクロピペットを用いて１つの極体を有する中期IIの卵母細胞を除核
することができる。マイクロピペットまたは針を用いて第二極体および周りの細
胞質（例えば細胞質の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０
％）を除去することによって、２つの極体を有する終期の卵母細胞を除核するこ
とができる。特に、第二極体からの細胞膜に突出が存在する時期から第二極体の
形成までの任意の時点で、終期の卵母細胞を除核することができる。従って、こ
の中で用いられるように、第二極体を放出するまでの、細胞膜における突出と通
常それに隣接する紡錐体とを共に示す卵母細胞は終期の卵母細胞と考えられる。
あるいは、突出の証拠無しに明白なおよび区別可能な１つの極体を有する卵母細
胞は中期の卵母細胞と考えられる。卵母細胞（例えばヤギ卵母細胞）の除核の方
法は、実施例にさらに詳細に記載されている。
【０２７０】 照射 照射を用いて卵母細胞の内因性ＤＮＡを不活性化することによって卵母細胞を
機能的に除核することができる。照射を用いる方法は当業界で公知であり、例え
ばBradshaw et al. (1995) Molecul. Reprod. Dev. 41: 503-512（参照によって
その内容がこの中に組み込まれる）に記載されている。
【０２７１】 化学的不活性化 卵母細胞の内因性ＤＮＡを化学的に不活性化することによって卵母細胞を機能
的に除核することができる。化学的にＤＮＡを不活性化する方法は当業界で公知
である。例えば、Fulkaj and Moore (1993) Molecul. Reprod. Dev. 34: 427-43
0（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）に記載のようなエトプソイ
ド-シクロヘキシミド法を用いて化学的不活性化を実施できる。
【０２７２】 機能的染色体ゲノムの卵母細胞への導入 この中に記載の方法は、機能的染色体ゲノムを卵母細胞（例えば除核細胞のよ
うな機能的除核卵母細胞）に導入して再構築胚を形成することを含む。機能的染
色体ゲノムは、再構築胚から生じるクローンまたはトランスジェニック動物の発
生を導く。実質的に無傷の染色体ゲノムの卵母細胞への移植をもたらす方法を用
いることができる。例示として、機能的染色体ゲノムを包含する細胞を卵母細胞
と融合させる方法、および核注入、すなわち卵母細胞に核を直接移植する方法が
挙げられる。
【０２７３】 融合 例えば電気融合、ウィルス融合、生化学試薬融合（例えばHAタンパク質）、ま
たは化学融合（例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはエタノール）によ
って、体細胞と卵母細胞との融合を実施できる。
【０２７４】 体細胞と卵母細胞との融合および活性化を同時に実施して差し支えない。例え
ば、卵母細胞の透明帯内に体細胞の核を挿入して差し支えない。例えば電界を与
えることによって、その核を卵母細胞と融合させる工程を同時に実施して差し支
えない。体細胞と卵母細胞の同時の融合および活性化はこの中に記載されている
。
【０２７５】 再構築胚の活性化 活性化とは、例えば複製およびＤＮＡ合成のような胚の発生の開始を称する。
例えば電気ショック（例えば電気融合において）、イオノフォアの使用、エタノ
ール活性化によって活性化を誘導することができ、あるいは、自然に活性化され
ている期の間に卵母細胞（例えば終期の卵母細胞）を得て差し支えない。
【０２７６】 電気融合 電気ショック（すなわち電気融合）を用いて再構築胚を活性化させることがで
きる。電気融合の使用は、体細胞と卵母細胞の融合および同時に成されるべき活
性化を可能とする。
【０２７７】 電気融合を実施するためのBTX200 Embryomanipulation Systemのようなチャン
バーは、例えばBTX San Diegoから市販されている。体細胞（例えばヤギ体細胞
）と卵母細胞（例えば除核ヤギ卵母細胞のような除核卵母細胞）とを融合させる
ために電気融合を実施する方法はこの中に記載されている。
【０２７８】 イオノフォア さらには、イオノフォア活性化によって再構築胚を活性化させることができる
。例えばカルシウムイオノフォアのようなイオノフォアを用いて、再構築胚の膜
を越えてカルシウム濃度を変化させる。細胞内のフリーカルシウムの濃度が上昇
すると、細胞内タンパク質のリン酸化が減少して卵母細胞が活性化される。その
ような活性化方法は例えば米国特許第5,496,720号（参照によってその内容がこ
の中に組み込まれる）に記載されている。
【０２７９】 エタノール活性化 Presicce and Yang(1994) Mol. Reprod. Dev. 37: 61-68およびBordignon and
Smith (1998) Mol. Reprod Dev. 49: 29-36(参照によってこの中に組み込まれ
る)に記載のエタノール活性化処理に基づいて、除核前に、エタノールで卵母細
胞（例えば中期IIの卵母細胞）を活性化させることができる。
【０２８０】 終期の卵母細胞 終期の卵母細胞は、通常、すでに活性化されている。従って、それら細胞は受
精を妨げ胚の発生を可能とするカルシウム濃度の低下を自然に示すことが多い。
【０２８１】 再構築胚の移植 本発明の再構築胚をレシピエントの雌に移植して、例えばクローンまたはトラ
ンスジェニックヤギのようなクローンまたはトランスジェニック哺乳動物に発生
させることができる。例えば、以下の実施例に記載のように、線毛を介して、各
レシピエントの雌の卵管に再構築胚を移植することができる。さらには、レシピ
エント哺乳動物に胚を移植する方法は当業界で公知であり、かつ例えばEbert et al. (1994) Bio/Technology 12: 699に記載されている。
【０２８２】 胚盤胞期までの少なくとも最初の分裂（２細胞期）まで再構築胚を培養し続け
て差し支えなく、好ましくは２細胞または４細胞期の胚を移植する。胚発生のた
めの種々の培地が当業界で公知である。例えば、本発明によって提供されるべき
哺乳動物のタイプに由来する卵管上皮細胞の単層と共に、再構築胚を共存培養し
て差し支えない。ヤギ卵管上皮細胞(ＧＯＥＣ)を得る方法、およびその細胞を共
存培養する方法は以下の実施例に記載されている。
【０２８３】 乳からのタンパク質の精製 比較的高濃度で、かつ大容量で、乳中にトランスジェニックタンパク質を産生
させることができ、再生され得る資源から容易に採取される正常に加工されたペ
プチドの連続的かつ高レベルの産出をもたらす。乳からタンパク質を単離するた
めのいくつかの異なる方法が当業界で公知である。
【０２８４】 乳タンパク質は、通常、工程の組合せによって単離される。例えばスキミング
、遠心、沈殿(H.E.Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistr
y of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982)、酸沈殿（米国特
許第4,644,056号）、またはレニンまたはキモトリプシンを用いた酵素的凝集(Sw
aisgood, idid)によって、まず脂肪を除去するために生乳を分画する。次に、主
な乳タンパク質を透明な溶液または大量の沈殿物に分画し、沈殿物から関心の特
定タンパク質を容易に精製できる。
【０２８５】 フランス特許第2487642号は、膜限外濾過と排除クロマトグラフィーまたはイ
オン交換クロマトグラフィーとを組み合わせて、スキムミルクまたは乳漿から乳
タンパク質を単離することについて記載している。乳漿はレンネット(rennet)ま
たは乳酸で凝集させてカゼインを除去することによって最初に得られる。米国特
許第4,485,040号は、２つの連続した限外濾過工程によって、αラクトグロブリ
ンを豊富に含む産物を乳漿から単離することについて記載している。米国特許第
4,644,056号は、ｐＨ４．０−５．５での酸沈殿乳、および連続したクロスフロ
ー濾過（最初は０．１−１．２５マイクロメーター孔径の膜によって産物プール
を浄化し、さらに５−８０kdの分離限界を有する膜によって濃縮する）によって
乳または初乳からイムノグロブリンを精製する方法を提供する。
【０２８６】 同様に、米国特許第4,897,465号は、ｐＨシフトを有する酸化金属膜(metallic
oxide membrane)上での連続した限外濾過によって、血清、卵黄または乳漿から
イムノグロブリンのようなタンパク質を濃縮することを教示する。タンパク質か
ら大量の混在物を除去するためにまず選択されたタンパク質の等電点(ｐＩ)より
低いｐＨで濾過を実施し、次に選択されたタンパク質のｐＩより高いｐＨで濾過
を実施して、不純物を保持しかつ選択されたタンパク質を透過液中に通過させる
。異なる濾過濃縮法が欧州特許第EP467 482 B1に教示されており、その中で、脱
脂されたスキムミルクを乳タンパク質のｐＨをｐＩより低いｐＨ３−４まで下げ
て、カゼインおよび乳漿タンパク質の両方を可溶化させる。３連続の限外濾過ま
たはダイアフィルトレーション(diafiltration)によってタンパク質を濃縮して
、その９０％がタンパク質である１５-２０％の固形物を含む残物を形成する。
あるいは、英国特許出願第2179947号は、限外濾過して試料を濃縮し、さらに適
切な中性ｐＨにおける弱陽イオン交換クロマトグラフィーを行って乳漿からラク
トフェリンを単離することについて開示している。純度測定については報告され
ていない。国際特許公開第WO95/22258号において、濃縮塩の添加によって乳を高
いイオン強度に調整し、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーを実施して、乳
からラクトフェリンのようなタンパク質を回収している。
【０２８７】 それら方法の全てにおいて、最初に、脂肪、脂質、および濾過膜またはクロマ
トグラフィー媒体を汚す他の特定の物質を除去するために乳またはその画分を処
理する。その様にして作成した最初の画分は、カゼイン、乳漿、または全乳タン
パク質（それから関心タンパク質が単離される）から成るであろう。
【０２８８】 国際特許公開第WO94/19935号は、アルギニン、イミダゾールまたはBis-Trisの
ような正電荷を持つ物質で全乳タンパク質の溶解性を安定化させることによって
全乳から生物活性タンパク質を単離する方法について開示している。その処置に
よって浄化された溶液が形成され、その溶液から例えば膜を介した濾過によって
タンパク質を単離でき、その処置がなければ沈殿タンパク質によって膜が詰まっ
てしまうであろう。
【０２８９】 米国特許出願第08/648,235号は、タンジェンシャルフローフィルトレーション
(tangential flow filtration)によって全乳または乳画分から、生物活性形態の
ペプチドのような可溶性乳成分を単離する方法について開示する。以前の単離方
法と異なり、その方法は、脂肪およびカゼインミセルを除くために全乳を最初に
分画する必要性が無く、従って工程を簡素化しかつ回収率および生物活性の損失
を避けることができる。さらに混在物を除去しかつ例えばタンパク質のような関
心産物を精製するために、追加の精製工程と組み合わせてその方法を用いても差
し支えない。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されているが、それら
実施例は本発明を何ら限定するものではない。本出願の全体において挙げられて
いる全ての引例（文献引例、発行済み特許、公開特許出願、および継続中の特許
出願を含む）の内容は、参照によって組み込まれる。
【０２９０】 実施例 以下の実施例において用いられるドナーおよびレシピエントは、以下の系統：
アルプス、ザーネンおよびトゥゲンブルグ：（混合または単独）の乳ヤギであっ
た。全てのヤギをマサチューセッツ、チャールトンのGenzyme Transgenics農場
で飼育した。春および初夏（オフシーズン）に採取および移植を実施した。
【０２９１】 ヤギ体細胞の単離 核質ドナーとして用いられるヤギ胎仔性線維芽細胞は、トランスジェニック抗
トロンビンIII(ＡＴIII)初代雄から新鮮に採取した精液で、非トランスジェニッ
ク雌を人工受精させることによって作った６匹の３５-４０日の胎仔に由来した
。ＡＴIII細胞株は、特徴付けがよく成されている遺伝子マーカーを体細胞株に
提供し、さらに乳分泌する雌の乳中への複合グリコシル化タンパク質(ＡＴIII)
の高レベル発現を可能とするため、ＡＴIII細胞株が選択された。性交の４０日
後、トランスジェニックＡＴIII雄の精液に由来する３匹の胎仔を外科的に取り
出し、平衡Ca2+/Mg2+リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に置いた。0.025％トリプ
シン／0.5mM ＥＤＴＡ中、３７℃で１０分間、胎仔組織を細かく切断しかつ消化
することによって、細胞懸濁液を調製した。ヌクレオシド、0.１mM ２-メルカプ
トエタノール、２mM L-グルタミン、1％ペニシリン／ストレプトマイシン(それ
ぞれ10,000 I.U./ml)を補充した１０％胎仔牛血清(ＦＢＳ)含有平衡１９９TM培
地(Ｍ１９９)(Gibco) (胎仔性細胞培地)で細胞を洗浄し、さらに２５cm2フラス
コ中で培養した。２４時間後、培養細胞に平衡胎仔性細胞培地を再供給した。４
日目に、Ca2+/Mg2+を含まないＰＢＳで2回細胞の単層を洗浄し、続いて0.025％
トリプシン／0.5mM ＥＤＴＡと共に３８℃で７分間インキュベートしてトリプシ
ン処理することによって、一次胎仔性細胞のコンフルエントな単層を採取した。
【０２９２】 ＡＴIIIを発現する可能性のある細胞を低温保存用に調製し、またはストック
培養として維持した。
【０２９３】 ドナー細胞株の性別判断および遺伝子型の特定 プロテイナーゼKでの消化、続いてイソプロパノールでの沈降（Laird et al.
(1991) Nucleic Acid Res. 19: 4293に記載）によって、ＡＴIIIドナー核質用に
胎仔頭組織からゲノムＤＮＡを単離し、さらにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によって、ヒトアンチトロンビンIII（ＡＴIII）配列の存在ならびに性別判断に
ついて分析を行った。ＡＴIII配列は、ＡＴIIIトランスジェニック系統を作るの
に用いられたＢＣ６構成物(ヤギβカゼイン−ヒトＡＴIII ｃＤＮＡ)(Edmunds e
t al. (1998) Blood 91: 4561-4571に記載)の一部である。オリゴヌクレオチド
ＧＴＣ１１およびＧＴＣ１２を用いて３６７bp配列を増幅させることによって、
ヒトＡＴIII配列を検出した（以下を参照）。性別決定のために、４４５bp(ｚｆ
Ｘ)/４４７bp(ｚｆＹ)ダブレットを生じさせるｚｆＸ/ｚｆＹプライマー対を用
いた（以下を参照）。制限酵素SacI(New England Biolabs)を用いた消化によっ
て、ｚｆＸバンドを２つの小さな断片（２７２および１７３bp）に切断した。切
断されない４４７bpｚｆＹバンドの存在によって雄を同定した。
【０２９４】 ＰＣＲ反応のために、Taqポリメラーゼ(２．５ units)含有ＰＣＲバッファー(
２０mM Tris、ｐＨ８．３、５０mM KCl、１．５mM MgCl2、０．２５mM デオキ
シヌクレオチド３リン酸、および６００mMの各プライマー)(５０ml)でゲノムＤ
ＮＡ(約２５０ng)を希釈し、以下の温度プログラムを用いて反応を進めた： １サイクル ９４℃ ６０秒 ５サイクル ９４℃ ３０秒 ５８℃ ４５秒 ７４℃ ４５秒 ３０サイクル ９４℃ ３０秒 ５５℃ ３０秒 ７４℃ ３０秒 ヒトＡＴIII配列を検出するために以下のプライマーセットを用いた： ＧＴＣ１１: CTCCATCAGTTGCTGGAGGGTGTCATTA（配列番号１） ＧＴＣ１２: GAAGGTTTATCTTTTGTCCTTGCTGCTCA（配列番号２） 性別判断のために以下のプライマーを用いた： ｚｆＸ: ATAATCACATGGAGAGCCACAAGC（配列番号３） ｚｆＹ: GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAG（配列番号４） ２匹の胎仔は雄であることが同定され、２匹ともＡＴIII配列陰性であった。別
の胎仔はメスであることが同定され、かつＡＴIII配列陽性であることが確かめ
られた。
【０２９５】 胚再構築のためのＡＴIII発現ドナー細胞の調製 ４０日目の胎仔に由来するトランスジェニックメス系統(CFF155-92-6)を上記
のようにＰＣＲ分析によって同定し、さらに全ての核移植操作に用いた。トラン
スジェニック胎仔性線維芽細胞を胎仔性細胞培地と共に２５cm2フラスコ中にお
いて維持し、各継代の４日目に培地交換し、7日目にトリプシン処理して細胞を
採取した。ストック培養を維持するために、各継代から別の２５cm2フラスコに
細胞を移した。簡単に説明すると、胎仔性細胞培地を入れた４穴プレートに胎仔
性細胞を蒔き、培養した(５％ＣＯ2中、３９℃)。
【０２９６】 ４８時間後、新鮮な０．５％ＦＢＳ含有胎仔性細胞培地で培地交換した。その
後７日間、４８-７２時間ごとに新鮮な0.5％ＦＢＳ含有胎仔性細胞培地で培地交
換した。最初に胎仔性細胞培地(０．５％ＦＢＳ)を添加した後７日目に、以前記
載したようにトリプシン処理によって、核質ドナーとして用いられる体細胞を採
取した。除核卵母細胞と融合させる１から３時間前に、2mM L-グルタミン、１％
ペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10,000 I.U.／ml)を補充した１０％
ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中に細胞を再懸濁させた。
【０２９７】 細胞株の核型分析 細胞株における総染色体異常を特定するために、核型分析によってクローン細
胞株をさらに評価した。デメコルシン(Demecolcine, Sigma)(０．０２μg/ml)と
共に１２時間インキュベートすることによって、中期で停止するように細胞を誘
導した。トリプシン処置後、得られたペレットを75mM KCl水溶液の低張液中に懸
濁させ、３７℃で２０分間インキュベートした。予め洗浄した顕微鏡スライドに
少量の細胞懸濁液をのせる前に、氷酢酸−メタノール(１：３)溶液の３回の交換
ごとに５分間細胞を固定した。風乾後、ＰＢＳ中の３％ギムザ染色(Sigma)で、
染色体調製物を１０分間染色した。油浸の下、1000ｘの倍率で各細胞株について
、染色体の広がりを計測した。
【０２９８】 免疫組織学的分析 ビメンチン(Sigma)および汎サイトケラチン(pan-cytokeratin)(Sigma)に特異
的な抗体を用いて、細胞株の形態を特徴付けしかつ確認した。７５％コンフルエ
ントになるように滅菌ゼラチンコートカバースリップに細胞をのせ、さらに0.05
％サポニン含有２％パラホルムアルデヒド中において1時間固定した。1次抗体を
含むＰＢＳ中の0.5％ＰＶＰ(ＰＢＳ/ＰＶＰ)中において細胞を３７℃で２時間イ
ンキュベートし、１０分間隔で３回、ＰＢＳ/ＰＶＰで洗浄し、さらに、それぞ
れＣｙｓ３およびＦＩＴＣと結合させた第２抗体中、１時間インキュベートした
。細胞のアルカリホスファターゼ(Sigma)活性を測定し、未分化細胞の存在また
は不在を特定した。カバースリップを洗浄し、続いて１０μg/mlビスベンジミド
(H-33342, Sigma)含有ＰＢＳ/ＰＶＰ中の５０％グリセロールと共にガラススラ
イド上にのせ、蛍光顕微鏡下において観察した。
【０２９９】 汎サイトケラチン陽性でアルカリホスファターゼ活性陰性の上皮細胞株および
ビメンチン陽性でアルカリホスファターセ陰性の線維芽細胞株がＡＴIII初代培
養から作られた。細胞培養において、形態学的に区別可能な２つの細胞型が観察
された。大きな「線維芽細胞様」細胞はビメンチン陽性に染まり、小さな「上皮
様」細胞は汎サイトケラチン陽性に染まり、それらは初代細胞培養において共存
した。ＡＴIIIから単離された繊維芽細胞株は、コンフルエントになった後３日
間培養すると上皮様細胞に分化する傾向を示した。続いて継代すると、ビメンチ
ン陽性染色の欠損によって確認されるように、線維芽細胞以外の選択をもたらし
、純粋な上皮細胞を生じさせた。老化または潜在的な細胞周期の停止は、２８継
代で最初に観察された。それら細胞は正常に成長している細胞(１５−２５μm)
に比べてサイズが大きく見え(＞３０μm)、生存能を失うこと無く、数ヶ月間、
明らかな分裂活性の無い状態で培養し続けることができる。停止細胞からの核を
用いた胚再構築は双実胚を作り、分裂活性の再取得を暗示する。
【０３００】 ドナー核質細胞周期の同調および特徴付け 選択された二倍体トランスジェニック雌細胞株を増殖させ、連続的に継代し、
さらに将来の核質ストックとして低温保存した。核移植のためのドナー核質を４
穴プレートに蒔き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、４８時間まで、または細胞が
７０−８０％コンフルエントになるまで培養した。続いて、0.5％ＦＢＳを補充
したＤＭＥＭを用いて7日間血清欠乏状態にすることによって、成長期を出て休
止期(G0)に入るように細胞を誘導し、細胞を同調した。G0期に同調した後、10％
ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中に細胞を再懸濁させることによって、核質-サイトプ
ラスト融合の３時間前までに再度細胞周期に細胞群を入れて臨界点前の初期のG1 期に同調した。また、第２群の細胞を休止期から開放して、１０％ＦＢＳ含有Ｍ
１９９培地中で１２または３６時間培養し、細胞をS期に同調した。標準のトリ
プシン処理によって細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中に再懸濁さ
せ、さらに核質ドナーとして１時間内に電気融合させた。
【０３０１】 ５継代のＡＴIII構成を運ぶトランスジェニック細胞株由来の中期核は、８１
％二倍体であり、その割合は１５継代で有意には変わらず、７８％の核が二倍体
であった。
【０３０２】 シクリンＤ1、2、3およびＰＣＮＡ(Oncogene Research Products)に対する抗
体を用いた免疫組織学的分析によって、細胞周期同調を特定した（そのタンパク
質複合体が不在であればG0期を示唆し、またそのタンパク質複合体が存在すれば
G1期に入ったことを示唆する）。チミジンアナログ５-ブロモ２’-デオキシウリ
ジン-５’-３リン酸(ＢｒＤｕ, Sigma)およびストレプトアビジン-ビオチンＢｒ
Ｄｕ染色キット(Oncogene Research Products)を用いて、ＤＮＡ合成活性の存在
によって細胞周期の推定のS期にある細胞を同定した。
【０３０３】 同調を受けた細胞の免疫蛍光分析は、血清欠乏の７日後、９０％の細胞がG1期
マーカーのシクリンＤ1、2、3、およびPNCA陰性であり、従って、G0停止期にあ
った。その細胞株において血清含有量を１０％に回復させると、細胞周期への再
突入を誘導し、シクリンＤ1、2、3およびＰＣＮＡ陽性染色によると、血清添加
後３時間以内に約７４％の細胞が早期のG1期に達した。１２から３６時間の血清
回復によって、８９％の細胞がBrDu陽性となり、ＤＮＡ合成活性を示唆した。本
研究において、クローン細胞株は、通常、血清による同調に対してそれぞれ異な
った応答を示した。継代数が増えると共に細胞同調の割合が低下するという間接
的な関連性が観察された。さらには、継代数が増えると倍増期間が短くなり、各
クローン細胞株は細胞周期の血清による同調に対する感度の低下を示した。
【０３０４】 ドナーヤギの過剰排卵および卵母細胞の採取 皮下用のノルゲストメット耳埋込み物(Norgestomet ear implant)(６mg)(Sync
hro-mate B)によって０日目に発情を合わせた。７日目に、プロスタグランジン(
ＰＧＦ２α)(Upjohn US)を単回注射した。１２日目から、FSH(Folltropin-V, Ve
trepharm, St Laurent, Quebec, Canada)を4日連続で、1日２回投与した。１４
日目に耳埋め込み物を除去した。埋め込み物を除去した２４時間後、４８時間間
隔で、精管切除した雄とドナー動物を数回性交させた。最後のFSH注射後、GnRH(
Rhone-Merieux US)を単回筋肉内に注射した。最後の性交の約１８および２４時
間後、予め３７℃に暖めたCa2+/Mg2+を含まないＰＢＳで卵管をフラッシングし
、中腹部の開腹によって動物から卵母細胞を外科的に回収した。次に卵母細胞を
回収し、２mM L-グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10
,000 I.U./ml)を補充した１０％ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中において培養し
た。
【０３０５】 卵母細胞除核 ドナーヤギからin vivoで成熟した卵母細胞を採取した。卵丘細胞を含む卵母
細胞または極体を欠く卵母細胞を除去した。卵丘細胞を含まない卵母細胞を２つ
の群に分けた：１つの極体のみを有する卵母細胞(中期II)プロトコル、および活
性化終期IIプロトコル(１つの極体を有し、かつ第二極体を排除した証拠を有す
る卵母細胞)。１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中において、２から４時間、終期I
Iにある卵母細胞を培養した。その間に活性化された卵母細胞（第一極体および
部分的に排除された第二極体によって証明される）を培養によって誘導されたカ
ルシウム活性化終期II卵母細胞（終期II-Ca2+）として分類し、さらに除核した
。活性化されなかった卵母細胞を、７％エタノール含有ＰＢＳ中において、除核
前に5分間インキュベートした。２５−３０μmのガラスピペットを用いて、第一
極体およびおそらく中期プレートを含むその極体の周りの隣接細胞質（細胞質の
約３０％）を吸引することによって、終期IIの卵母細胞（１つの極体）を除核し
た。
【０３０６】 上記のように、２つの方法によって終期卵母細胞を調製した。まず、５％ＦＢ
Ｓを補充したリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+/Mg2+を含まないＰＢＳ)中において卵
母細胞を１５分間インキュベートし、さらに終期紡錐体構成または第二極体の排
除が達成されるまで、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中、３８℃で、約３時間卵
母細胞を培養した。異なる細胞外カルシウム濃度における処理下での連続培養に
応答した全ての卵母細胞を分離し、終期II-Ca2+細胞として分類した。応答しな
かった他の卵母細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中の７％エタノール中にお
いて５−７分間さらにインキュベートし(終期II−ETOH)、終期II紡錐体構成が達
成されるまで、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中において、３８℃でさらに３時
間培養した。その後、サイトカラシン-B(５μg/ml)を含む１０％ＦＢＳ含有Ｍ１
９９培地(３０−５０μl)中において、３８℃で１０−１５分間卵母細胞を培養
した。３０μm(ＯＤ)のガラスピペットを用いて、第一極体、および中期プレー
トまたは中期II紡錐体を含む細胞質の約１０％を含むその極体の周りの隣接細胞
質の約３０％を吸引することによって、卵母細胞を除核した。除核後、卵母細胞
をすぐに再構築させた。
【０３０７】 胚再構築 7日目に、7分間のトリプシン処理(０．０２５％トリプシン／０．５mM ＥＤＴ
Ａ)(Sigma)によって、核質ドナーとして用いる体細胞CFF155-92-6を採取した。L
−グルタミン(２mM)およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した１０％Ｆ
ＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中に単細胞を再懸濁させた。除核用と同じ培地中にお
いて、ドナー細胞の注入を実施した。除核サイトプラストへの注入用に選択する
前に、ドナー細胞を小、中、大に分類した。２０−３０μm径のガラスピペット
を用いて、小単細胞(１０−１５μm)を選択した。除核の間に作られた透明帯の
同じ細孔を介してピペットを導入し、透明帯と卵細胞質膜との間にドナー細胞を
注入した。融合および活性化させる３０-６０分前に、Ｍ１９９培地中において
再構築胚をインキュベートした。
【０３０８】 融合および活性化 電気融合の前、全ての再構築胚（エタノール前処理したまたはしていない）を
融合バッファー(蒸留水中、０．３Mマンニトール、０．０５mM CaCl2、０．１mM
MgSO4、１mM K2HPO4、０．１mMグルタチオン、０．１mg/ml ＢＳＡ)中において
２分間洗浄した。融合バッファーで満たした、２００μm離間した２つのステン
レス鋼電極を有するチャンバー(BTX 200 Embryomanipulation System, BTX-Gene
tronics, San Diego, CA)中において、室温で融合および活性化を実施した。ピ
ペットを用いて３-４群に再構築胚を置き、レシピエントの卵母細胞およびドナ
ーのCFF155-92-6細胞の細胞膜が電極に対して平行になるように手動で整列させ
た。Electrocell Manipulator and Enhancer 400 (BTX-Genetronics)を用いて、
まず整列／保持パルス5-10V ACで7秒間、続いて融合パルス1.4-1.8KV/cm DCで70
マイクロ秒処理することによって、GnRH注入後３２-４２時間の間に細胞融合お
よび活性化を同時に誘導した。融合培地で３分間胚を洗浄し、次にサイトカラシ
ン-B(Sigma)(５μg/ml)および１０％ＦＣＳ含有Ｍ１９９培地に細胞を移し、1時
間インキュベートした。Ｍ１９９／サイトカラシン-Ｂ培地から胚を取り出し、
パラフィン油を用いて重積したヤギ卵管上皮細胞と共に、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１
９９培地５０μl中において培養した。５％ＣＯ２、３９℃の加湿インキュベー
ター中において、レシピエントの雌に移植する前４８時間、胚を培養し続けた。
【０３０９】 G0、G1、およびＳ期の核質を用いた同時活性化および融合の1時間後の再構築
胚全てが、サイトプラストが停止した中期IIになった時に、核膜破壊(ＭＥＢＤ)
および未成熟染色体凝縮(ＰＣＣ)を示した。続いて核膜形成が観察され、活性化
の４時間後には約３５％に達した。終期IIで再構築された卵母細胞では、G0、G1 およびＳ期の核質と融合させた１時間後に観察される平均２２％の卵母細胞がＭ
ＥＢＤおよびＰＣＣを受けるが、残りの卵母細胞は非凝縮核の周りの無傷の核ラ
ミナを有することが示された。ＭＥＢＤおよびＰＣＣが生じないことを除いて、
用いられた中期および２つの終期再構築プロトコルとの間で一致した核の形態は
観察されなかった。３６から４８時間in vitroで培養した後のG0またはG1期の核
質を用いた場合(２から８割球)と比べて、Ｓ期のドナー核を用いて胚を再構築し
た場合にクローン胚が進んだ分裂期(８から３２割球)の高い発生を有することが
観察された点において違いが明白となった。蛍光顕微鏡分析は、迅速に分裂する
胚が断片化されるのを示した。他の胚は、卵割発生が阻止される前の培養の3日
以内に３２から６４細胞期に発生する。それら胚の割球および核数の分析は、細
胞質分裂および核分裂の同調の失敗を示し、割球が対応する核を欠きまたは複数
の核を包含していた。一方、形態学的に正常に見える胚は、同調した細胞質分裂
および核分裂を示した。
【０３１０】 ヤギ卵管上皮細胞(ＧＯＥＣ)/再構築胚の共存培養 ＧＯＥＣは、同調および過剰排卵させた雌に基づいて実施された外科的卵管フ
ラッシングの間に採取された卵管組織に由来する。１０％ＦＢＳ、L-グルタミン
(２mM)、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する平衡Ｍ１９９培地(５ml)を
有する１５mlの滅菌ポリプロピレン培養チューブに、単一の雌由来の卵管組織を
移した。1分間ボルテックスで攪拌し、続いて、５％ＣＯ2、３８℃の加湿インキ
ュベーター中において最大1時間まで培養することによって単細胞懸濁液を調製
した。再度1分間チューブをボルテックスで攪拌し、その後さらに5分間培養して
破片を沈殿させた。単細胞と思われる部分を含む上層部の４μlを新しい１５ml
チューブに移し、室温で7分間600ｘgで遠心した。上清を除去し、平衡ＧＯＥＣ
培地(８ml)中に細胞ペレットを再懸濁液させた。２５cm2フラスコ中においてＧ
ＯＥＣを培養し、3日目に培地交換し、６日目に上記のようにトリプシン処理に
よって細胞を採取した。核実験のために、初代ＧＯＥＣ培養から単層を毎週調製
した。ＧＯＥＣ培地中に細胞を5x105/mlで再懸濁液させ、５０μ/wellずつ４穴
プレートに蒔いた。培地に軽パラフィン油(light paraffin oil)(０．５ml)を重
ね、５％ＣＯ2、３８℃の加湿インキュベーター中においてプレートを培養した
。２日目に８０％の新鮮な平衡培地で培地交換した。ＧＴＣ農場でレシピエント
に移植する前に、ＧＯＥＣ単層と共に、５％ＣＯ2、３８℃の加湿インキュベー
ター中においてin vitroで全ての再構築胚を培養した。
【０３１１】 ＡＴIIIのための全ての実験の反復において、同調したレシピエントに移植可
能な卵割期の胚が２日目にもたらされた。ドナー核質として線維芽細胞および上
皮細胞の表現形質を用いた胚は、培養中に卵割および発生を示した。ＡＴIII核
質と共に用いる場合に、停止した中期IIにおいて用いられたサイトプラスト（３
５％）と比較して、予め活性化された終期IIのサイトプラスト（４５％）および
終期II-エタノール活性化サイトプラスト（５６％）を用いた再構築胚において
、卵割発生の割合（％）が高かった。ドナー核質がＳ期にある場合と比較してG0 またはG1期にある場合に胚の形態学的特性が良好であるが、細胞周期のG0、G1ま
たはＳ期にあるドナー核質を用いて再構築された胚の卵割の割合に違いは観察さ
れなかった。移植の時に胚は通常２から８細胞期にあり、大部分の胚が３-４割
球を有する。正常な卵割発生は、時期的に、融合および活性化の約３６から４８
時間後に相当する。in vitroで３６から４８時間発生させた後、２から８細胞期
において、形態学的に正常に見える胚を選択した。
【０３１２】 レシピエントの雌の発情期の同調 レシピエントにおいて、（ドナーと比較して）１日遅れでホルモン処置して
ドナー／レシピエント同調を確実にした。皮下用ノルゲストメット耳埋め込み物
(６mg)によって、１日目に発情期を同調した。８日目にプロスタグランジンを単
回注射した。１４日目に、ＰＭＳＧ(CalBiochem US)の単回の筋肉内投与を開始
した。１５日目に耳埋め込み物を除去した。埋め込み物を除去した２４時間後、
３日連続で、精管切除した雄とドナー動物を数回性交させた。
【０３１３】 レシピエントの雌への胚移植 同調したレシピエントに移植する約４８時間前に、再構築胚をＧＯＥＣ単層と
共に共存培養した。移植直前に、１０％ＦＢＳ含有平衡Ham’s F-12培地中に再
構築胚を入れた。線毛を介して各レシピエントの卵管ルーメン(oviductal lumen
)に２から４の再構築胚を移植した。火造りの(fire-polished) 滅菌ガラスマイ
クロピペットを用いて、最少容量の１０％ＦＢＳ含有Ham’s F-12培地中で移植
を実施した。
【０３１４】 トランスジェニックヤギ胎仔性線維芽細胞およびin vivoで誘導した卵母細胞
を用いた核移植によって再構築された胚の発生を表１に要約した。採取のために
準備された４匹のドナーと４８時間後の移植のために準備された５-６匹のレシ
ピエントの雌を用いて、全部で１４ラウンドの採取および移植を行った。３つの
異なる除核／活性化プロトコル：中期II、終期、およびエタノールで前処置され
た中期II：を用いた。融合-活性化に続いて、少なくとも卵割(２細胞期)まで、
長くても早期１６細胞期まで、ヤギ一次上皮細胞と共に再構築胚を共存培養し；
時期的に正確な２−４細胞期にほとんどの胚を移植した。ホルモン的に同調した
（時期的に）レシピエントにおいて、全ての移植を外科的に卵管に実施した。中
期IIプロトコルと比較して、終期プロトコルおよびエタノールプロトコルを用い
た場合に発生の割合がわずかに良好であった。これは、部分的には第二極体の除
核が卵母細胞にとってほとんど外傷性でないと思われるため、および部分的には
エタノールで全処置された卵母細胞の活性化の割合が高いと思われるためである
。
【０３１５】
【表１】 胚移植に続いて、２５日目に超音波でレシピエントの雌を調べた。ＡＴIIIレ
シピエントの雌において５５-７８％の範囲の高い妊娠率が診断された。３つの
除核／活性化プロトコルの全てにおいて、高い割合の雌（６５％）が３０日目に
陽性を示すことが観察された。しかしながら、ほとんどの場合、そのような早期
に、胎仔の心拍が検出されないことに注目しなければならない。さらには、３０
日目に検出された陽性の超音波シグナルは、正常な胚の発生の特徴ではなく、正
常な胚の形成とは関連しない小嚢発生(vesicular development)により近いよう
に思われた。その種の胚の発生は、他のヤギ胚移植プログラム（例えば、マイク
ロインジェクションした胚）においては通常観察されない。２５日目から４０日
目の間における隔週でのそれら小嚢発生の検査は、それら妊娠が異常であり、４
０日目にはほとんどの胎仔が再吸収されて正常な超音波画像が見られなかった。
【０３１６】 しかしながら、２件の妊娠において、４０日目までに心拍が検出された。それ
ら２件の場合、２５日目から４０日目の間での超音波検査は心拍を検出したのみ
でなく、認識可能な胚構造の発生を示した。それら妊娠の一方は、中期II除核／
活性化プロトコルを用いて、６継代培養したCFF155-92-6線維芽細胞株に由来す
る休止期の核質とその除核サイトプラストとを融合させて確立された。その例示
において、４個の４細胞期の再構築胚をレシピエントの雌の卵管に移植した。も
う一方の妊娠（双胎）は、事前に活性化した終期Ca2+卵母細胞に由来する除核細
胞と５継代培養したCFF155-92-6上皮細胞株に由来するG1核質とを融合させる終
期除核／活性化プロトコルに基づいて再構築された胚から得られた。その場合、
３個の再構築胚（1個の２細胞期および２個の４細胞期）をレシピエントの雌に
移植した。
【０３１７】 エタノール除核／活性化プロトコルによって作られた胚を用いた場合、全く妊
娠は観察されなかった。しかしながら、本研究において用いられた３つの除核／
活性化プロトコルの相対的効果に基づいて結論付けるには数が充分ではなかった
。
【０３１８】
【表２】 レシピエント胚の周産期ケア 妊娠を通じて、健康の表面的な兆候（例えば食欲、敏捷性、外観）について、
雌ヤギを毎日観察した。継続した発情期の初日から２５-２８日目の超音波検査
によって妊娠を決定した。胎仔の生存をモニターおよび確認するために、約７５
日目まで隔週で、およびその後一ヶ月に１回雌ヤギを超音波検査した。さらには
、血清妊娠分析のため、連続した発情期の約２１日後に、レシピエントの雌ヤギ
から血清試料を採取した。これは、機能性の黄体が存在するか否か、およびそれ
がどのように動物の生殖状態（すなわち妊娠）に対照するかを決定するために行
った。約１３０日目に、妊娠したヤギに破傷風毒素およびクロストリジウムＣ＆
Ｄをワクチン接種した。セレニウム＆ビタミンＥ（Bo-Se）ならびにビタミンＡ
、ＤおよびＢ複合物を筋肉内または皮下に投与し、さらに駆虫剤を投与した。約
１４３日目に、雌ヤギを清潔な分娩用の区画に移し、分娩前にその新しい環境に
慣れさせた。分娩にはいった兆候をモニターするために、妊娠した雌ヤギの観察
を増やした。規則正しい収縮が始まった後、出産まで、雌ヤギを断続的に観察し
続けた。約１５分間の強い収縮の後陣痛が進行しなかった場合、膣触診で胎仔の
位置を調べた。胎仔の位置が正常である場合は、補助下での膣分娩を開始する前
に、（雌ヤギに依存して）さらに５-３０分陣痛を進行させた。望ましい場合に
は、帝王切開を実施した。望ましい場合には、ＰＧＦ２α(例えばLutalyse)(約
５−１０mg)を用いて分娩を誘導した。妊娠の約１４５-１５５日の間に、その誘
導が生じ得る。通常、最初の注射から３０から４０時間後に分娩が起きる。モニ
タリング方法は上記と同じである。
【０３１９】 仔ヤギが生まれると直ぐに、その仔ヤギを急いでタオルで乾かし、さらに全体
の異常および正常な呼吸をチェックした。仔ヤギを直ぐに雌ヤギから連れ去った
。仔ヤギが健康であることを確認すると直ぐに、７％ヨードチンキ中にその臍を
浸した。誕生後最初の1時間内に、仔ヤギは熱処理した初乳の最初の供給を受け
た。出生時に、能力および健康を高めるためにセレニウム＆ビタミンＥ(Bo-Se)
ならびにビタミンＡ、ＤおよびＢ複合物を仔ヤギに注射した。
【０３２０】 核移植によって作られた最初のトランスジェニック雌ヤギの子孫は、分娩およ
び帝王切開出産の誘導後、妊娠期間の１５４日後に生まれた。その子孫の出生時
体重は２．３５kgであり、アルプス系統の中間的体重の範囲内であった。雌の双
仔は、１ヶ月後、妊娠期間１５１日で、最小限の補助で自然に生まれた。その双
仔の出生時体重は共に３．５kgであり、その系統の双仔の中間的体重の範囲内で
あった。３匹全ての仔ヤギは正常でかつ健康に見え、さらに、毛色およびアルプ
ス系統に典型的なシンボルマークを発現する点において表現形質が類似していた
。
【０３２１】 さらには、3匹の子孫は、初代のトランスジェニック雄ヤギに外観において類
似していた。ドナー卵母細胞の系統または胎仔性遺伝子型の異種発現からの区別
できる表現形質の影響は全く観察されなかった。
【０３２２】 トランスジェニッククローンヤギ 3匹の仔ヤギがヤギβカゼインプロモーターおよびヒトＡＴIII遺伝子配列を包
含するＢＣ６構成物の遺伝子移植を受けていることを確認するため、導入遺伝子
の断片のＰＣＲ増幅およびサザン分析を実施した。
【０３２３】 出生後すぐに、クローンメスヤギおよび代理母ヤギから血液試料および耳皮膚
組織を得た。その試料においてゲノムＤＮＡの単離を実施した(Laird et al. (1
991) Nucleic Acids Res. 19: 4293)。各試料について、まずＡＴIII特異的プラ
イマーを用いてＰＣＲによる分析を行い、次に、ＡＴIII ｃＤＮＡを用いてサザ
ンブロット分析を実施した(Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571)。各
試料について、ゲノムＤＮＡ(５μg)をEcoRIで消化し(New England Biolabs, Be
verly, MA)、０．７％アガロースゲル(Seakem○R, ME)中において電気泳動を実
施し、さらに標準的方法に続いてキャピラリートランスファーによってナイロン
膜(MagnaGraph, MSI, Westboro, MA)上に固定化した(Laird et al. (1991) Nucl
eic Acids Res. 19: 4293)。Prime-It○Rキット(Stratagene, La Jolla, CA)を
用いてα-32PdCTPで標識した１．５kbのXho I-Sal I ＡＴIII ｃＤＮＡ断片を用
いて膜を分析した。６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した(Church et
al. (1984) Prot. Natl Acad. Sci. USA 81: 1991-1995)。0.2xSSC(0.1% SDS)
でブロットを洗浄し、X-OMATTM ARフィルムを４８時間感光させた。
【０３２４】 ＰＣＲ分析は、全ての仔ヤギがヤギβカゼインプロモーターおよびヒトＡＴII
I遺伝子配列を包含するＢＣ６構成物の遺伝子移植を受けていることを支持した
。サザンブロット分析は、完全なＢＣ６導入遺伝子を示した。３匹全てのクロー
ン動物、細胞株およびトランスジェニック陽性対照において、診断用の４．１kb
EcoRI断片に対するハイブリダイゼーションが検出されたが、2匹のレシピエン
トの雌では検出されなかった。内因性ヤギＡＴ遺伝子座に対するＡＴIII ｃＤＮ
Ａプローブの交差ハイブリダイゼーションのため、１４kbのバンドが全ての試料
において予測通り検出された。
【０３２５】 さらには、ＢＣ６構成物の一体化部位を特定するためにin situハイブリダイ
ゼーションでの蛍光分析(ＦＩＳＨ)を実施した。クローンヤギのタイピングのた
めに、リンパ球採取用に全血を培養した(Ponce de Leon et al. (1992) J. Here
d. 83: 36-42)。線維芽細胞およびリンパ球を調製し、さらに以前記載のように
ハイブリダイズさせた(van de Corput et al. (1998) Histochem Cell Biol. 11
0: 431-437, and Klinger et al. (1992) Am. J. Human. Genet. 51: 55-65)。
完全な１４．７kb ＢＣ６導入遺伝子を包含するジゴキシゲン標識プローブを本
方法において用いた。シグナルを増幅させるために、TSATM-Directシステム(NEN
TM Life Science Products, Boston, MA)を用いた。ＤＡＰＩ対比染色を用いて
Ｒ-バンドを可視化しかつ同定した(Di Berardino et al. (1987) J. Hered. 78:
225-230)。画像を捕獲および加工するためのImage-Pro○R Plusソフトウェア(M
edia Cybernetics, Silver Spring, MD)と共に、浜松デジタルカメラを搭載した
Zeiss Axioskop顕微鏡を用いた。ＢＣ６導入遺伝子に対するプローブを用いた、
各トランスジェニック仔ヤギからの血液培養のＦＩＳＨ分析は、３匹全てがＣＦ
Ｆ６細胞株由来の中期プレートにおいて認められるのと同じ第５染色体への導入
遺伝子の一体化を有することを示した。さらには、各クローン仔ヤギにおける７
５以上の中期プレートの分析は、第５染色体への導入遺伝子の一体化がモザイク
でないことを支持した。
【０３２６】 3匹全ての仔ヤギがトランスジェニックＣＦＦ６細胞株に由来することの最終
的な確認として、非常に多型性のＭＨＣクラスII ＤＲＢ遺伝子のためのＰＣＲ
−ＲＦＬＰ分析を実施した。ＰＣＲ−ＲＦＬＰタイピングを用いて、ヤギＭＨＣ
クラスII ＤＲＢ遺伝子の第二エキソンのためのタイピングを実施した(Amills e
t al. (1996) Immunopathol. 55: 255-260)。nested PCRの産物(１５μl)をRsal
(New England Biolabs, Beverly, MA)(２０ units)で消化した。消化後、臭化エ
チジウムの存在下において４-２０％非変性ポリアクリルアミドゲル(MVPTM prec
ast gel, Stratagene, La Jolla, CA)において制限酵素断片を分離した。
【０３２７】 DRB遺伝子第二エキソンのRsal消化によって説明したように、３匹のクローン
仔ヤギはお互いに全く同じであり、かつＣＦＦ６ドナー細胞株と同一であるが、
レシピエントの雌は異なる対立遺伝子を有する。
【０３２８】 乳分泌および乳中への導入遺伝子のタンパク質発現の誘導 標的とされた乳腺特異的ヒトＡＴIIIタンパク質の発現が乳中に存在するか否
かを特定するために、性成熟前のクローントランスジェニックヤギを一時的に乳
分泌するように誘導した。生後２ヶ月で、２週間のホルモン投与による乳分泌誘
導プロトコルをクローン仔ヤギに与えた。Ryot et al. (1989) Indian J. Anim.
Res. 10: 49-51に記載のように、ＣＦＦ６−１雌においてホルモン乳分泌誘導
を実施した。１日１回、手でＣＦＦ６−１仔ヤギを搾乳し、ＡＴIII発現分析の
ための乳試料を採取した。全てのタンパク質分析法は、Edmunds et al. (1998)
Blood 91: 4561-4571に記載されている。２１４nmで検出するHewlett Packard 1
050 HPLC(Wilmington, DE)を用いた高速逆相ＨＰＬＣ法によって、乳中の組換え
ＡＴIIIの濃度を特定した。二段階比色端点測定法(two-stage colorimetric end
point assay)を用いて、トロンビン阻害を測定することによってＡＴIII活性を
評価した。アフィニティー精製したヒツジ抗ＡＴIII−ＨＲＰ結合ポリクロナー
ル抗体(SeroTec, Oxford, UK)を用いて、ウェスタンブロット分析を実施した。
１０-２０％グラジエントゲル(Owl Scientific)上に試料をのせる前に、還元試
料バッファー中において試料を３０秒間煮沸した。色素の先端がゲルから流れ出
るまで１６４ボルトで(一定)電気泳動を操作した。
【０３２９】 ２０日間毎日、処置の終わりに、少量の乳試料(０．５−１０ml)を採取した。
少量の最初の乳(０．５から１ml)は、ホルモンによって乳分泌を誘導された性成
熟前の雌ヤギにおいて見られる一般的な量である。その量は、開始後２５日目に
雌ヤギが出し切るまでに、1日当たり１０mlに増加した。いくつかの試料中のＡ
ＴIIIの濃度および活性を評価した。特異的ＢＣ６トランスジェニック細胞株由
来の雌を用いて以前言及したように、高レベルの組換えＡＴIIIがウェスタンブ
ロット分析によって検出された(Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571)
。クローン仔ヤギの乳中の組換えＡＴIIIの濃度は、5日目に５．８g/l(２０．５
U/ml)であり、9日目には３．７g/l(１４．６ U/ml)であった。それらは、そのＢ
Ｃ６細胞株からの雌の最初の自然の乳分泌の初期の間に記録されたレベル(３．
７から４．０g/l)に一致した。
【０３３０】 結論： 停止した中期IIまたは活性化された終期IIのいずれかにおいて除核された卵母
細胞に対して体細胞の核を移植することによって、健康なトランスジェニックヤ
ギを得た。それら研究は、妊娠をもたらすのに用いられた血清欠乏細胞が、おそ
らく１０％血清回復に続くG0/ G1過渡期にあることを示す。
【０３３１】 免疫蛍光スクリーニングは、7日間の血清欠乏の後、胎仔性体細胞はG1期のサ
イクリンＤ1、Ｄ2、Ｄ3およびＰＣＮＡ陰性であるが；１０％ＦＢＳ血清活性化
の３時間以内に、大部分（例えば約７０％）がそれらマーカーを発現することを
示した。
【０３３２】 同時融合および活性化に続いて細胞周期のG0またはG1期において同調したドナ
ー核質由来の核の移植による除核中期II停止卵母細胞の再構築は、受精の間に生
じる時間的事象を模倣する。同時融合および活性化プロトコルに続く出産直前ま
での成功した発生および正常かつ健康なトランスジェニック仔ヤギの誕生は、染
色質のリモデリングおよびリプログラミングを支持するために上昇した細胞質Ｍ
ＰＦ活性にドナー核を長期間暴露することを必要とすることを報告している他の
研究において用いられている方法と著しく異なっている(Campbell et al. (1996
) Nature 380: 64-66; Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813; Schnieke
et al. (1997) Science 278: 2130-2133; Cibelli et al. (1998) Science 280:
1256-1258を参照)。われわれの結果は、活性化前における上昇したＭＰＦ活性
の条件下での体細胞核の長期のリモデリングが胚および胎仔の発生に重要である
とする論点に挑戦する。また、その結果は、再構築胚がＭＰＦに対するドナー核
の長期の暴露を必要とせず、また、ＭＥＢＤおよびＰＣＣが完全な必須事象でも
ないことを示す。ＭＥＢＤおよびＰＣＣに関する染色質レモデリング事象はむし
ろＭＰＦ活性の随意的効果と思われ、従って、発生の能力または全能性の獲得に
は必要ないであろう。その代わりに、それら事象はサイトプラストと核質との間
の同調の獲得を容易にする役割を果たすであろう。ドナー核がＰＣＣを受け、そ
の結果、ＭＰＦ活性による異常な紡錐体機構のせいで染色体分散を受けるように
誘導された時に正常な二倍体が維持されない場合は、それら事象はむしろ有害と
成り得る。従って、細胞周期における核質およびサイトプラストの同調が、第一
に正常な倍数性の維持のため、第二にゲノムの再活性化およびそれに続く再構築
胚の発生能力の獲得の適切な誘導のため重要である。
【０３３３】 染色質が無傷である中期IIの停止卵母細胞を活性化させてＭＰＦ活性を低下さ
せかつM期から出て最初の減数分裂に入るように卵母細胞を誘導する第２の方法
において、さらに支持が得られた。活性化の約３時間後、G1期の開始前の終期に
おいて卵母細胞を除核し、さらに細胞周期の臨界点前のG1期にあるドナー核質を
用いて融合および同時の活性化を行った。さらには、同時活性化および融合は、
成熟していない(non-aged)卵母細胞が停止期に戻る傾向を回避するのを確実にし
た。その実例を用いて、正常かつ健康な双仔のクローントランスジェニック仔ヤ
ギを作った。その方法は、本質的に、サイトプラストを臨界点前のG1期にあるド
ナー核に合わせる同質同調方式を提供する。さらに卵母細胞の事前の活性化は、
細胞質のＭＰＦ活性の低下を誘導し、従ってＭＥＢＤおよびＰＣＣの発生を阻害
する。それら結果は、ＭＥＢＤおよびＰＣＣがサイトプラストおよび核質の同調
の誘導のために単に任意的であり、適切なゲノムの再活性化およびそれに続く体
細胞核を用いた核移植胚の発生の獲得のために必要ではないことを示唆する。
【０３３４】 それら観察はさらに、G0またはG1期での分化細胞が、停止または活性化レシピ
エントサイトプラストと組み合わせて用いた場合に、全能性を獲得する能力に関
して、胚の卵割に類似した機能を有することを示唆する。中期II停止サイトプラ
ストおよび終期IIサイトプラストの両方の使用によって、サイトプラストを調製
するためのより長期間の機会を提供することに加えて、サイトプラスト調製のた
めに二重の選択肢を提供する。終期IIサイトプラストの使用は、いくつかの実用
的および生物学的利点を有するであろう。終期アプローチは、染色質染色および
紫外線局部限定(ultraviolet localization)の必要性無しに、効率的な除核を容
易にする。さらには、終期における除核は、最少の細胞質物質の除去および活性
化ドナーサイトプラストの同調群の選択を可能とする。また、本方法は、サイト
プラストの細胞周期と同調すべきドナー核の同質性の高い群の調製を可能とする
。胚再構築に用いられる場合、それら集団は、in vitroでの高い胚発生率を示し
た。従って、同期的に活性化されたサイトプラストおよび核質から成る再構築胚
は発生的に有能である。
【０３３５】 トランスジェニック初代を作ることの成功に加えて、体細胞の核移植は、クロ
ーントランスジェニック胚を作る前に適切なトランスジェニック細胞株を選択す
ることを可能とする。このことは、トランスジェニック乳腺によっていくつかの
タンパク質を同時発現させるべき場合に特に重要である。例えば、乳中での組換
えモノクロナール抗体のトランスジェニック産生において、重鎖および軽鎖の導
入遺伝子は、理想的には、完全抗体の効率的な産生のために、同じレベルで乳腺
上皮の同じ分泌細胞において発現される必要がある。さらには、同等の発現を助
けかつ群れの繁殖の間に重鎖と軽鎖の導入遺伝子が分離するのを避けるために、
各タンパク質を発現させる導入遺伝子が同じ遺伝子座に共に一体化される必要が
ある。
【０３３６】 また、完全に同じ遺伝子的背景を有するトランスジェニック動物の産生は、乳
腺による組換えタンパク質の発現および分泌特性を研究する可能性を高める。例
えば、組換えヒトＡＴIIIを産生する何匹かの完全に同じトランスジェニック雌
を利用できることは、乳腺によって産生されたそのタンパク質の糖鎖構造におけ
る変化の程度を特定するのを助けるであろう。従って、環境因子（例えば食物）
を代えることによってトランスジェニック動物系において産生される組換えタン
パク質の特性を改善し、あるいは前臨床または臨床プログラムのために適切な量
の組換えタンパク質を得るのに必要な時間をさらに減らすために乳産生量を増や
すことが適切であろう。
【０３３７】 ＣＦＦ６−１クローンヤギの乳中に検出された組換えヒトＡＴIIIの高レベル
での発現は、本技術の最も重要な態様の１つを例示する。核移植と性成熟前のヤ
ギにおける乳分泌誘導を組み合わせることによって、トランスジェニック動物お
よび乳発現用の細胞株のトランスフェクション時から８から９ヶ月中にそれが分
泌するタンパク質を特徴付けすることができる。乳分泌誘導において採取された
乳の量は、組換えタンパク質収率を評価するのに充分であるのみならず、mg/ml
の発現レベルが得られた場合には、より定性的な分析(グリコシル化、予備的薬
物動力学、生物学的および薬理学的活性)に充分である。また、核酸導入された
ドナー細胞株を継続的に利用できることは、臨床試験用に治療的タンパク質（予
測できる特性と共に）を迅速に供給するために遺伝子的に同じ動物を迅速に作り
得ることを確実にする。
【０３３８】 この中で挙げられている全ての特許および他の引例は参照によって組み込まれ
る。
【０３３９】 他の実施形態も請求の範囲内に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／２９８，９７１ (32)優先日 平成11年４月23日(1999．4．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３１，３２８ (32)優先日 平成11年４月26日(1999．4．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベボディ，エスメイル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01545 シュリューズバリー ナンバー48 シュリューズバリー コモン ドライヴ 45 (72)発明者 ジオメック，キャロル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01757 ミルフォード シャドーブルック レーン 17 ナンバー６ (72)発明者 ギャヴィン，ウィリアム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01571 ダッドリー ダッドリー オック スフォード ロード 86 (72)発明者 メリカン，デイヴィッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01518 フィスクデイル ブルックフィー ルド ロード 296 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 CA03 DA02 GA03 HA03 4B065 AA90 AB04 AC14 BA08 CA44

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 クローン哺乳動物を作成する方法であって：ゲノムが体細胞
    由来である哺乳類の再構成胚を２から８細胞期になるまで培養し；該２から８細
    胞期胚をレシピエント哺乳動物に移植し；さらに該再構成胚を哺乳動物に発生さ
    せ、それによって哺乳動物を作成する：ことを含むことを特徴とするクローン哺
    乳動物を作成する方法。
  2. 【請求項２】 前記哺乳動物がヤギであることを特徴とする請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 前記胚が２から６細胞期胚であることを特徴とする請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記胚が２から４細胞期胚であることを特徴とする請求項３
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記体細胞が線維芽細胞であることを特徴とする請求項１記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 前記体細胞が上皮細胞であることを特徴とする請求項１記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 前記体細胞が、遺伝子操作された体細胞であることを特徴と
    する請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 遺伝子操作された体細胞が、導入遺伝子配列を含むことを特
    徴とする請求項７記載の方法。
JP2000579729A 1998-11-02 1999-11-02 トランスジェニックおよびクローン哺乳動物 Expired - Fee Related JP4523165B2 (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10672898P 1998-11-02 1998-11-02
US60/106,728 1998-11-02
US29850899A 1999-04-22 1999-04-22
US09/298,508 1999-04-22
US09/298,971 US6580017B1 (en) 1998-11-02 1999-04-23 Methods of reconstructed goat embryo transfer
US09/298,971 1999-04-23
US13132899P 1999-04-26 1999-04-26
US60/131,328 1999-04-26
PCT/US1999/025710 WO2000026357A2 (en) 1998-11-02 1999-11-02 Transgenic and cloned mammals

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003182181A Division JP4068516B2 (ja) 1998-11-02 2003-06-26 トランスジェニック哺乳動物およびクローン哺乳動物

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2002528117A true JP2002528117A (ja) 2002-09-03
JP2002528117A5 JP2002528117A5 (ja) 2006-12-21
JP4523165B2 JP4523165B2 (ja) 2010-08-11

Family

ID=27493534

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000579729A Expired - Fee Related JP4523165B2 (ja) 1998-11-02 1999-11-02 トランスジェニックおよびクローン哺乳動物
JP2003182181A Expired - Fee Related JP4068516B2 (ja) 1998-11-02 2003-06-26 トランスジェニック哺乳動物およびクローン哺乳動物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003182181A Expired - Fee Related JP4068516B2 (ja) 1998-11-02 2003-06-26 トランスジェニック哺乳動物およびクローン哺乳動物

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1127113A2 (ja)
JP (2) JP4523165B2 (ja)
AU (1) AU1462200A (ja)
CA (1) CA2350233A1 (ja)
WO (1) WO2000026357A2 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6781030B1 (en) 1998-11-02 2004-08-24 Trustee Of Tufts College, Ballou Hall Methods for cloning mammals using telophase oocytes
EP1303183A1 (de) * 2000-07-27 2003-04-23 Apogene GmbH & Co. KG Somatischer klonierungs-gentransfer zur produktion von rekombinanten proteinen, zellen und organen
WO2003040359A1 (fr) * 2001-11-06 2003-05-15 Shanghai Second Medical University Preparation d'un embryon somatique au moyen d'un ovocyte de lapin
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
AU2003249049A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-23 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method of selecting cells for somatic cell nuclear transfer
WO2011060489A1 (en) * 2009-11-18 2011-05-26 Murray Goulburn Co-Operative Co. Limited Transgenic non-human animals
CN104082239B (zh) * 2014-06-10 2016-01-20 张海员 一种原生态生猪专用菌种养殖方法
FR3025515B1 (fr) 2014-09-05 2016-09-09 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'un anticorps monoclonal
JP6929527B2 (ja) 2015-03-04 2021-09-01 株式会社ポル・メド・テック 安定した表現型を示す疾患モデルブタおよびその作製方法
FR3034420A1 (fr) 2015-03-31 2016-10-07 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-cd303
EP3497230A1 (en) 2016-08-15 2019-06-19 Danmarks Tekniske Universitet Method for reducing ammonium and lactate production in cho cells
FR3060394B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii
FR3060395B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-her2
FR3076294B1 (fr) 2017-12-29 2022-01-28 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'anticorps a partir de lait brut
CN109315355A (zh) * 2018-11-21 2019-02-12 江西和乐园生态农业科技发展有限公司 一种山羊养殖方法
CA3223956A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vetoquinol Sa Anti-canine interleukine-31-receptor a (il-31ra) antibodies and the uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843705A (en) * 1995-02-21 1998-12-01 Genzyme Transgenic Corporation Transgenically produced antithrombin III
GB9517780D0 (en) * 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5907080A (en) * 1995-11-30 1999-05-25 Nexia Biotechnologies, Inc. Method for development of transgenic dwarf goats

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6007011078, Ｓｃｉｅｎｃｅ, 1997, ｖｏｌ． ２７８, ２１３０−２１３３ *
JPN6007011082, Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ, 1967, ｖｏｌ． ６, ４３６−４５０ *
JPN6007011086, Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ， Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．, 1994, ｖｏｌ． ３０Ａ, ２２６−２３５ *
JPN6007011090, Ｉｎｄ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ．, 199805, ｖｏｌ． ３６, ４４７−４５５ *
JPN6007011092, Ａｍ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ．, 1997, ｖｏｌ． ５８, ５７９−５８４ *
JPN6009046890, Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．, 199801, ｖｏｌ． ５８, ２６６−２６９ *
JPN6009046893, Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．, 1997, ｖｏｌ． ５７, ３８５−３９３ *
JPN6009046895, Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ．, 199801, ｖｏｌ． ４９, ２９−３６ *
JPN6009046897, Ｓｃｉｅｎｃｅ, 199805, ｖｏｌ． ２８０, １２５６−１２５８ *
JPN6009046899, Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ．, 1992, ｖｏｌ． ９４, ４８１−４８７ *
JPN6009046901, Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．, 1994, ｖｏｌ． １２, ６９９−７０２ *
JPN6009046903, Ｎａｔｕｒｅ, 1996, ｖｏｌ． ３８０, ６４−６６ *
JPN6009046905, Ｎａｔｕｒｅ, 1997, ｖｏｌ． ３８５, ８１０−８１３ *
JPN6009046908, Ｒｅｐｒｏｄ． Ｎｕｔｒ． Ｄｅｖ．, 1996, ｖｏｌ． ３６, ６６１−６６６ *

Also Published As

Publication number Publication date
JP4523165B2 (ja) 2010-08-11
WO2000026357A2 (en) 2000-05-11
JP2004073189A (ja) 2004-03-11
CA2350233A1 (en) 2000-05-11
AU1462200A (en) 2000-05-22
EP1127113A2 (en) 2001-08-29
WO2000026357A3 (en) 2000-11-23
JP4068516B2 (ja) 2008-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7612250B2 (en) Nuclear transfer embryo formation method
US7592503B2 (en) Mammalian telophase oocyte enucleation
JP4523165B2 (ja) トランスジェニックおよびクローン哺乳動物
US6580017B1 (en) Methods of reconstructed goat embryo transfer
AU721132B2 (en) Method for development of transgenic goats
US20030177513A1 (en) Transgenic and cloned mammals
EP1375654A2 (en) Transgenic and cloned mammals
WO2000025578A2 (en) Methods for cloning animals
EP1216298B1 (en) Methods of producing non-human cloned and transgenic mammals
Wilmut et al. Methods of gene transfer and their potential use to modify milk composition
EP1818397A1 (en) Methods for cloning animals
AU2003204830B2 (en) Transgenic and cloned mammals
CA2431859C (en) Transgenic and cloned mammals
EP1127112B1 (en) Methods for cloning animals
CA2525148A1 (en) Transgenic and cloned mammals
AU2004210607A1 (en) Transgenic and cloned mammals
AU2008202456A1 (en) Transgenic and cloned mammals

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20050301

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20050301

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061102

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20061102

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20071204

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080303

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080310

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080402

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080409

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080507

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080514

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080604

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090908

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091204

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091211

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091222

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100105

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100203

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100210

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100308

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100427

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100527

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4523165

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130604

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees