KR101590247B1 - 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용한, Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용하여 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포 및 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 돼지를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지 Sal-like 1(SLL1) 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용하여, Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포 및 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 돼지를 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재 국립장기이식센터에 따르면 한해 국내에서 약 2만 명에 달하는 환자가 장기이식을 기다리고 있으며 이러한 이식대기 환자는 급격히 증가하고 있으나, 장기기증 건수는 수요의 10%에도 마치지 못하고 있어, 이러한 장기 수급 불균형에 따라 불법 장기 매매를 비롯한 여러 가지 사회적, 경제적 문제가 야기되고 있는 실정이다. 이러한 장기부족현상을 해결하기 위해 바이오 이종장기, 인공장기, 줄기세포 분화, 생체조직공학을 이용한 조직 재생법 등의 연구가 전 임상 및 임상단계에서 진행되고 있다. 그 중 이종장기이식은 부족한 장기를 무한정 공급할 수 있을 뿐 아니라 유전공학적 기법을 이용한 환자 맞춤형 형질전환 장기의 생산이 가능하다는 점에서 상기 방법 중에서도 큰 장점을 가진다(Proc (Bayl Univ Med Cent). 2012 January; 25(1): 49-57.).
한편, Sal-like 1(SLL1) 유전자는 신장 발생에 관여하는 유전자로, 상기 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 생쥐에서는 신장 발달이 이루어지지 않으며 생후 24시간 안에 사망하는 것으로 보고되어 있다. 그러나 Sal-1ike 1 유전자의 1개 대립 유전자가 넉-아웃된 돼지를 생산하고 사람의 줄기세포를 신장을 생성할 수 있는 위치에 이식하면 돼지의 체내에서 인간 줄기세포로부터 인간의 신장을 발생시킬 수 있다. 이러한 장기를 인간 맞춤형 장기라고 하며 유전자 조작된 돼지의 장기를 이종 간 이식에 이용하는 것보다 보다 인간에 근접한 장기를 생산할 수 있는 미래 대체 장기 개발 기술이다. 그러나, 이를 위해서는 Sal-like 1 유전자를 돼지 세포에서 효과적으로 넉-아웃시킬 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, Sal-like 1 유전자를 효과적으로 넉-아웃시킨 세포를 제조하는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, Sal-like 1 유전자의 일부 부위를 이용하여 Sal-like 1 유전자를 효과적으로 타겟팅하는 벡터와 Sal-like 1의 엑손 2 부위에 특이적인 TALEN을 제작하였고, 이들을 세포에 도입하는 경우, Sal-like 1 유전자의 넉-아웃 효율이 높아 효과적으로 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포를 제조하여 이를 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지의 생산에 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 이용하여 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용하여 제조한 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포로, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 이용하여 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (ⅰ) Sal-like 1 유전자의 인트론 1 및 엑손 2의 일부분을 포함하는 1 내지 6kb 길이를 가지는 제1 핵산 영역; (ⅱ) 양성선별마커(positive selection marker) 유전자 카세트; 및 (ⅲ) Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 포함하는 1.5 내지 2.5kb 길이를 가지는 제2 핵산 영역을 포함하고, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 5' 말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는, Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터; 및 Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 타겟팅하는 TALEN을 분리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN를 분리된 세포에 도입하여 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 세포를 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "Sal-like 1 유전자"는 기관 발생에 관여하는 전사 억제 인자(transcription repressor)이다. 상기 Sal-like 1 유전자는 신장에서 가장 높은 발현 수준을 나타내는 것으로 알려져 있을 뿐, 이를 형질전환 돼지의 제조에 이용한 예는 알려진바 없다. 본 발명의 목적상 상기 Sal-like 1 유전자는 체세포에서 넉-아웃되기 위한 대상으로서, 상기 Sal-like 1 유전자의 유래는 넉-아웃하고자 하는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 미니돼지 또는 돼지 유래일 수 있다. 상기 Sal-like 1 유전자의 정보는 미국국립보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NC_010448.3인 돼지(Sus scrofa)의 염색체 정보로부터 얻을 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 돼지(Sus scrofa) 유래의 Sal-like 1 유전자 정보(NC_010448.3)를 이용하여 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하였다.
본 발명에서 용어, "Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터"는 (ⅰ) Sal-like 1 유전자의 인트론 1 및 엑손 2의 일부분을 포함하는 1 내지 6kb 길이를 가지는 제1 핵산 영역; (ⅱ) 양성 선별마커(positive selection marker) 유전자 카세트; 및 (ⅲ) Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 포함하는 1.5 내지 2.5kb 길이를 가지는 제2 핵산 영역을 포함하고, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 5' 말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 벡터이다. 상기 유전자 타겟팅 벡터는 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)에 추가로 음성 선별마커를 포함할 수 있다.
상기 용어 "유전자 타겟팅 벡터"는 게놈의 특정 유전자 위치에서 상동 유전자 재조합이 일어나도록 넉-아웃하고자 하는 특정 유전자의 상동 염기서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 유전자 타겟팅 벡터는 본 발명에서 "넉-아웃 벡터"와 혼용되어 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 타겟팅 벡터는 돼지 Sal-like 1 유전자의 엑손 2 위치에 변이 유전자, 즉 양성 선별마커 유전자가 삽입될 수 있도록 고안된 벡터를 의미한다. 이러한 벡터는 원형(circular) 또는 선형(linear) 형태일 수 있다.
상기 제1 핵산 영역은 상기 유전자 타겟팅 벡터에서 왼쪽 상동성 팔(left homology arm)에 해당하는 부위로서, Sal-like 1 유전자의 인트론 1 및 엑손 2의 일부분을 포함한다. 상기 제1 핵산 영역의 길이는 유전자 타겟팅 효율을 결정하는 중요한 요소로서, 1 내지 6kb의 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 돼지 Sal-like 1 유전자 엑손 2의 1664bp 위치로부터 업스트림 1.7 내지 6kb, 더욱 바람직하게는 약 5.5kb 길이를 가질 수 있다. 다만, 상기 왼쪽 상동성 팔에 대한 엑손 2의 기준점(1664bp)은, 엑손 2에 대하여 상동 재조합 효과를 가지고 올 수 있는 한, 상·하류로 ±1kb 내외로 이동된 경우도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 핵산 영역은 상기 유전자 타겟팅 벡터에서 오른쪽 상동성 팔(right homology arm)에 해당하는 부위로서, Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 포함한다. 상기 제2 핵산 영역은 1.5 내지 2.5kb 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 돼지 Sal-like 1 유전자 엑손 2의 2738bp에서부터 다운스트림의 1.5 내지 2.5kb, 더욱 바람직하게는 약 1.89kb의 길이를 가질 수 있다. 다만, 상기 오른쪽 상동성 팔에 대한 엑손 2의 기준점(2738bp)은, 엑손 2에 대하여 상동 재조합 효과를 가지고 올 수 있는 한, 상·하류로 ±1kb 내외로 이동된 경우도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역은 타겟팅 대상이 되는 유전자의 서열과 동일한 서열뿐만 아니라, 이와 상동 재조합이 가능한 서열이라면 유사성을 가지는 서열도 포함하며, 바람직하게는 타겟팅 대상이 되는 유전자의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열도, 상동 재조합이 가능한 서열이라면 본 발명의 범주에 포함된다.
또한, 상기 선별마커 유전자 카세트는 상기 타겟팅 벡터가 도입된 세포를 선별하기 위한 부위로서, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커를 포함하며, 상기 마커에는 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
상기 양성 선별마커란 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 양성 선택을 가능하게 하는 마커로, 그 예로 네오마이신(Neomycin; Neo), 하이그로마이신(hygromycin; Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene; hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase; Gpt)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 양성 선별마커는 상기 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역의 사이에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 양성 선별마커가 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역의 사이에 위치하는 경우, 목적하는 세포의 유전자와 상동 재조합이 일어날 때 상기 세포의 게놈 내로 삽입되므로 선택제의 사용을 통하여 넉-아웃 여부를 식별할 수 있으며, 또한 넉-아웃된 세포를 선별할 수 있다.
한편, 음성 선별마커란, 무작위적 삽입(random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커로서, 그 예로 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin), 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; Hprt) 및 사이토신 디아미네즈(cytosine deaminase)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 음성 선별마커는 제1 영역의 5' 말단의 상위(upstream) 또는 제2 영역의 3' 말단의 하위(downstream)에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 제2 영역의 3' 말단 하위에 음성 선별마커가 위치하도록 벡터를 제작하였다.
또한, 상기 선별마커 발현 카세트는 상기 선별마커를 발현할 수 있도록 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 선별마커 전사를 위해 사용할 수 있는 프로모터로는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터，원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터， 몰로니 바이러스， 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터， 엠스티인 바 바이러스(EBV) 프로모터，로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터，RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터，β-액틴 프로모터，사람 헤로글로빈 프로모터 빛 사람 근육 크레아틴 프로모터 등이 있으나，이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 양성 선별마커를 전사시키기 위한 프로모터로서, 포스포글리세레이트 카나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터를 이용하여 양성 선별마커의 상부(upstream)에 이를 연결시켜 벡터를 제조하였다.
본 발명의 방법에서는 상기 벡터와 함께 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN을, Sal-like 1 유전자를 넉-아웃시키고자 하는 세포에 도입시킨다. 이때, 상기 벡터와 TALEN을 동시 또는 순차적으로 세포 내에 도입할 수 있다.
본 발명에서 용어, "TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)"은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 서로 융합하여 제조한 인공의 제한효소를 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인이 링커를 통하여 연결된 형태도 포함한다. 여기서, TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 어떠한 원하는 DNA 서열에도 빠르게 결합하도록 엔지니어링된 것으로, 이를 DNA 절단 도메인과 결합시키는 경우, 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 원하는 DNA 부위를 절단하는 효과를 가져온다.
본 발명에서 용어, "Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN"은 Sal-like 1 유전자의 특정 서열에 결합하여 Sal-like 1 유전자의 절단을 가져오는 TALEN을 의미한다. 상기 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN은 바람직하게는 Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 특이적으로 절단하는 것이며, 더욱 바람직하게는 Sal-like 1 유전자의 엑손 2에 위치한 서열번호 9의 코딩 가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 10의 주형 가닥(template strand) 부위에 결합하는 TALEN일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 4에 도시된 것과 같은 서열번호 9의 핵산 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 가지는 TALEN 및 서열번호 10의 핵산 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 가지는 TALEN을 모두 이용하였다.
상기 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN은, 바람직하게는 돼지 또는 미니어쳐 돼지 유래의 체세포에 도입될 수 있으며, 상기 세포를 분리하거나 활성화할 수 있는 유용한 조직에는 간，신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 골수, 귀, 피부, 뼈, 쓸개 조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등이 있으나，이로 제한되지 않는다. 세포 타입으로는 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 배아세포, 간 세포, 및 여포세포, 줄기세포, 전핵기 수정란 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 세포의 분리는, 미니어쳐 돼지 귀 조직에서 분리할 수 있는데, 귀 조직은 분만 10 일령의 귀 조직을 사용하고 이들 조직을 1 내지 3mm 정도로 절단하여 배양할 수 있다. 본 발명에서는 귀 조직을 돼지로부터 절단한 후 무균적으로 소독하고 곁 피부 조직과 연골 조직을 제거한 다음에 세로와 가로가 각각 2mm 되도록 메스로 절단하여 조직을 배양하였다. 이들의 조직 배양시에는 귀 조직이 배양액 안으로 완전히 잠기지 않도록 하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 체세포 분리 및 배양을 위한 배지는 고농도의 글루코오스 및 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 배지를 이용하여 귀 조직으로부터 체세포를 분리하고, FBS, 비필수 아미노산 및 항생제를 포함한 배지에서 계대 배양하는 것을 통해 체세포를 생산할 수 있으며，바람직하게는 돼지의 귀 조직을 고농도의 글루코오스 및 15% FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 배양하여 체세포를 분리하고，15% FBS, 비필수 아미노산， 피루브산나트륨， 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양할 수 있다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터 또는 TALEN을 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있으며，당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술， 예컨대 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE 텍스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome)법 등을 이용할 수 있으며，이로 제한되지 않는다. 이때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.
이러한 도입 과정은 인체로부터 분리된 세포를 대상으로 체외(in vitro)에서 수행함이 바람직하다.
또한, 상기 방법은 추가로 돼지 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 선별 과정은 양성 선별마커 또는/및 음성 선별마커를 사용함으로써 수행될 수 있으며, PCR 및 염색체 분석과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 분석할 수 있다.
구체적으로, 상기 체세포 선별은 벡터 내에 삽입되었던 선별마커 유전자를 이용할 수 있는데, 특히, 벡터 상에 존재하던 양성 선별마커가 돼지 체세포 게놈 상으로 도입되어 발현되면, 이들 양성 선별마커 발현을 인식할 수 있는 처리제를 이용하여 타켓팅 여부를 식별할 수 있게 된다. 본 발명의 선별마커로는 바람직하게는 네오마이신 마커를 이용할 수 있으며, 선별을 위한 처리제로는 항생제, G418을 이용할 수 있다. 선별을 위해 사용하는 G418의 농도는 200 내지 400㎍/㎖이 바람직하며，더욱 바람직하게는 300㎍/㎖이다.
또한, 유전자 타켓팅 벡터가 도입된 클론 세포의 선별에 이용할 수 있는 배양은 15%의 FBS, 비필수 아미노산， 피루브산나트륨， 베타-멀캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있다. 이러한 선별 과정은 벡터 및 TALEN 도입으로 상동 재조합을 유도하여 수일간 내지 수십일 간 배양한 다음, 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터가 세포 내의 Sal-like 1 유전자에 타켓팅되었는지를 분석하기 위해 PCR을 이용할 수 있다.
상기 PCR 분석은 1차 및 2차 PCR을 통해 효율적으로 타켓팅된 세포를 분석해낼 수 있는데 먼저，1차적인 PCR은 Sal-like 1 유전자의 3' 상동 영역(제2 핵산 영역에 해당) 바깥 쪽에 있는 프라이머와 양성 선별마커 유전자상에 있는 프라이머를 이용함으로써, 벡터가 세포 내로 유입이 되었는지를 분석할 수 있다. 1차 PCR에 의해 선별된 세포를 대상으로 2차 PCR을 수행할 수 있다. 2차 PCR은 게놈 DNA을 제조한 후 1 차 PCR과 동일한 프라이머를 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는， 돼지 Sal-like 1 유전자 상동 영역，양성 선별마커 및 음성 선별마커를 이용하여 벡터를 구축하였다. 본 발명에서는 돼지 Sal-like 1 유전자 인트론 1 일부분과 엑손 2의 일부분을 포함하는 약 5.5 kb를 5' 부분의 상동 영역(제1 핵산 부위; left homology arm)으로 연결하고, PGK(phosphoglycerine kinase) 프로모터에 의하여 발현할 수 있는 양성 선별마커인 네오마이신 유전자를 연결하고 그 다음에 엑손 2의 일부분와 인트론 2의 일부분을 포함하는 약 1.89 kb(제2 핵산 부위; right homology arm)를 연결한 후, pMCDT-A(A+T/pau) 벡터에 연결하여 완성하였다. 이렇게 구축된 본 발명의 벡터는 5' 말단부터 돼지 Sal-like 1 유전자에 상동인 제1 핵산 영역，양성 선별마커 영역，돼지 Sal-like 1 유전자에 상동인 제2 핵산 영역 및 음성 선별마커 영역의 순서로 구성되었다(실시예 1). 이러한 벡터는 세포에 도입 전에 NotI 제한효소로 선형화시키고, 전기천공법을 이용하여 돼지 섬유아세포에 도입하여 엑손 2의 1074bp가 결손되고 양성 선별마커로 재조합되도록 하였다(실시예 4). 그 다음, 상기 벡터가 도입된 돼지 섬유아세포에서 Sal-like 1 유전자의 넉-아웃 효율을 확인하였고(실시예 5 및 실험예), 그 결과, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 세포를 제조할 수 있는 결과를 나타내었다. 한편, 돼지 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN은 돼지 Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 특이적으로 절단하도록 제조하였으며(실시예 2), 이와 같이 제조한 TALEN을 상기 벡터와 함께 미니돼지 섬유아세포에 도입한 다음, Sal-like 1 유전자의 넉-아웃 효율을 확인하였고(실시예 4), 이 결과를 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터만을 도입한 경우와 서로 비교하였다. 그 결과, 상기 벡터 및 TALEN을 모두 이용하는 경우, 벡터만을 이용하여 Sal-like 1 유전자를 넉-아웃한 경우에 비하여 넉-아웃 효율이 현저히 우수한 결과를 나타내었으며, 최대 67.04%의 넉-아웃 세포 제조 효율을 나타내었다(실험예).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용하여 제조한, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 이용하여 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 (a)(ⅰ) Sal-like 1 유전자의 인트론 1 및 엑손 2의 일부분을 포함하는 1 내지 6Kb 길이를 가지는 제1 핵산 영역; (ⅱ) 양성 선별마커 유전자 카세트; 및 (ⅲ) Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 포함하는 1.5 내지 2.5kb 길이를 가지는 제2 핵산 영역을 포함하고, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 5' 말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는, Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터; 및 Sal-like 1 유전자를 타겟팅하는 TALEN으로 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 제조하는 단계; (b) 핵이 제거된 돼지 난자에 (a) 단계에서 제조한 체세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 수정란을 돼지에 착상시키는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계의 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 (b) 단계는 핵이 제거된 돼지의 난자에 (a) 단계에서 제조한 체세포를 도입하는 단계이다.
상기 핵이 제거된 난자는, 물리적인 방법, 화학적인 방법 및 사이토칼라신(cytochalasin) B를 사용한 원심분리법 등을 사용하여 난자로부터 제조할 수 있으며, 바람직하게는 유리 마이크로피펫을 사용하는 물리적인 방법이 사용될 수 있다.
상기 유전자 타겟팅된 체세포를 핵이 제거된 난자 내로 도입하는 방법은, 세포막 융합법, 세포질 내 미세주입법 등을 이용할 수 있는데, 세포막 융합법은 간단하며 대규모의 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질 내 미세주입법은 핵과 난자 내 물질과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다.
체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합할 수 있으며， 이때， 미세전류· 전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기융합기를 이용할 수 있다.
핵이식된 수정란은 활성화시켜 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모로 착상시키는 것이 바람직하다. 여기서 복제 수정란의 활성화는 수정란이 분열할 수 있도록 성숙과정에서 일시적으로 정지된 세포주기를 다시 가동시키는 것을 의미한다. 복제 수정란 활성화를 위하여서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하며, 이를 위해 복제 수정란 내 칼슘 이온을 증가시키기 위해 세포막 투과도를 변형시키거나, 세포 외로부터 칼슘 유입을 급격히 증가시키거나, 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등을 이용할 수 있다.
이러한 방법을 통해 생산된 돼지는 인간 맞춤형 장기를 생산하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 개발된 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 벡터 및 TALEN은 대상 세포에서 Sal-like 1 유전자를 효과적으로 넉-아웃시키므로, 이를 사용하여 효과적으로 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포 및 인간 맞춤형 장기 생산용 형질전환 돼지를 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 돼지 Sal-like 1 유전자를 넉-아웃하기 위한 벡터의 개략도이다.
도 2는 돼지 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 벡터을 제조하기 위하여 5' arm, 3'arm과 PGK-neo 유전자를 동정한 사진과 넉-아웃 벡터를 제작한 다음 제한효소 절단에 의하여 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 벡터의 원형 플라스미드 구조와 이의 직선화시의 구조를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명에서 개발한 Sal-like 1 유전자의 엑손 2 부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위와 절단 부위의 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 효율을 정리한 표이다.
도 6은 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 PCR 사진이다.
도 7은 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 도입하여 제조한 돼지 체세포의 염색체를 확인한 도이다.
도 2는 돼지 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 벡터을 제조하기 위하여 5' arm, 3'arm과 PGK-neo 유전자를 동정한 사진과 넉-아웃 벡터를 제작한 다음 제한효소 절단에 의하여 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 Sal-like 1 유전자 넉-아웃 벡터의 원형 플라스미드 구조와 이의 직선화시의 구조를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명에서 개발한 Sal-like 1 유전자의 엑손 2 부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위와 절단 부위의 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 효율을 정리한 표이다.
도 6은 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 PCR 사진이다.
도 7은 본 발명에서 제작한 넉-아웃 벡터와 TALEN을 동시에 도입하여 제조한 돼지 체세포의 염색체를 확인한 도이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 돼지 Sal-like 1 유천자 타겟팅 벡터의 구축
본 실시예에서, 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터는, 돼지 SALL1 게놈의 상위(upstream) 5.5kb 단편으로, Sal-like 1 유전자의 인트론 1 및 엑손 2 부위를 포함하는 부분을 가지는 Left arm(서열번호 1); 양성선별마커인 네오마이신; 돼지 SALL1 게놈의 3' 부위의 약 1.8kb 단편으로, Sal-like 1 유전자의 엑손 2 일부와 인트론 2 일부를 포함하는 부분을 가지는 Right arm(서열번호 2); 및 음성선별마커인 디프테리아 톡신 유전자를 순차적으로 포함하는 형태로서, 도 1에 이러한 벡터의 개략도를 나타내었고, 하기와 같은 과정으로 구체적으로 수행되었다.
먼저, 돼지의 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터를 구축하기 위하여 다음과 같이 미네소타 미니돼지 게놈 DNA를 이용하여 Sal-like 1 유전자 5' arm과 3' arm을 PCR 증폭하였다. 5' arm은 NotI 제한효소 사이트를 포함하고 있는 5'arm S 프라이머(gcggccgcAATTGGCCTACGAAAGAGGAGCAGCCTGTG, 서열번호 3)와 BamHI 제한효소 사이트가 첨가되어 있는 5'arm AS 프라이머(ggatccGATGGGGGCTGGCTCTTCGGTCTTGATGAA, 서열번호 4)를 이용하여 Phusion DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 은 100ng의 게놈 DNA를 이용하여 98℃ 30초，68℃ 30초，72℃ 6분 30초에서 30 사이클 조건으로 실시하였다. 증폭된 단편은 pGEM T-easy 벡터에 라이게이션(ligation)하여 pGEM-Salll 5'arm 플라스미드를 확보하였으며 이의 염기배열을 결정하였다.
3' arm은 SmaI 제한효소 사이트가 첨가된 3'arm S 프라이머(cccgggATTCCACAAGTCACCCAGCGCCGAGGAGAA, 서열번호 5)와 SalI 제한효소 사이트를 포함하고 있는 3 'arm AS 프라이머(gtcgacGGAATCTGTCTCAGCTCATATCCCAACACA, 서열번호 6)을 이용하여 ExTaq DNA 중합효소로 PCR 증폭하였다. PCR은 100ng의 게놈 DNA를 이용하여 98℃ 30초， 68℃ 30초，72℃ 2분 30초에서 30 사이클 조건으로 실시하였다. 증폭된 3' arm은 pGEM T-easy 벡터에 라이게이션하여 pGEM-Sall1 3'arm 플라스미드를 확보하였으며 이의 염기배열을 결정하였다
양성마커로 이용할 PGK-neo 유전자는 pKJ2 neo 플라스미드를 주형으로 이용하고 BamHI 사이트가 부가된 S 프라이머(GGA TCC TAC CGG GTA GGG GAG GCG CTT TTC, 서열번호 7)와 SmaI 사이트가 부가된 AS 프라이머(CCC GGG CCT CAG AAG AAC TCG TCA AGA AGG, 서열번호 8)를 사용하여 Takara ExTaq DNA 중합효소로 증폭하였다. PCR 조건은 98℃ 30초， 68℃ 30초，72℃ 2분에서 30 사이클 조건으로 실시하였다. 증폭된 3' arm은 pGEM T-easy 벡터에 라이게이션하여 pGEM-PGK-neo 플라스미드를 확보하였으며 이의 염기배열을 결정하였다.
상기 5'arm, 3'arm, 및 PGK-neo 유전자를 동정한 전기영동 사진은 도 2에 나타내었다.
또한, 타겟팅 벡터의 구축을 위하여 먼저 pGEM-Salll 5'arm 플라스미드를 NotI과 BamHI 제한효소로 절단하여 insert를 제조한 다음, pBSK의 NotI과 BamHI 사이트에 라이게이션하여 pBSK-Salll 5'arm 플라스미드를 확보하였다. 이 플라스미드를 BamHI과 SmaI으로 절단하여 벡터를 제조한 다음, pGEM-PGK-neo plasmid을 BamHI과 SmaI으로 절단한 약 l.3 kb의 insert(PGK-neo)을 라이게이션하여 pBSK-Sall1 5'arm-neo 플라스미드를 확보하였다. 그 다음에 pBSK-Sall1 5'arm-neo 플라스미드를 SmaI과 SalI으로 절단한 벡터에 pGEM-Sall1 3'arm 플라스미드를 SamI과 SalI으로 절단한 후 확보한 insert(3'arm) 1.8kb을 라이게이션하여 pBSK-Sall1 5'-neo-3' arm 플라스미드를 확보하였다.
최종 타겟팅 벡터를 구축하기위하여 pBSK-Sall1 5'-neo-3'arm 플라스미드를 NotI과 SalI으로 절단한 후 분리한 전체 약 8.6kb의 insert를 pMCDT-A 플라스미드를 NotI과 SalI으로 절단한 벡터에 라이게이션하였다 이렇게 확보된 pMCDT-Sall1 5'-neo-3' arm 타겟팅 벡터는 형질감염시 NotI 제한효소로 절단하여 직선화하였다. 이러한 pMCDT-Sall1 5'-neo-3' arm 타겟팅 벡터의 지도와 직선화시의 구조를 도 3의 위쪽 및 아래쪽에 각각 나타내었다. 또한, 상기 제조한 벡터에 NotI, SalI 및 BamHI 제한효소를 처리하여 벡터의 구축 여부를 확인한 전기 영동 결과를 도 2 오른쪽에 함께 나타내었다.
실시예 2: 돼지의 Sal-like 1 유전자의 엑손 2에 특이적인 TALEN 제작
돼지 Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 특이적으로 절단하는 TALEN은 툴젠으로부터 구입하였으며, 하기 염기에 특이적으로 결합하는 TALEN을 구입하였다. 본 실험에 사용한 TALEN은 왼쪽 결합 부위로, 5'-TTTCCCTTCGGGGGACTCT-3'(서열번호 9)과 오른쪽 결합부위로 5'-AACCTGCAGAGACTCCGGA-3'(서열번호 10)의 염기배열을 가졌다. 또한, 이러한 TALEN의 결합 부위와 절단 부위를 나타낸 모식도를 도 4에 나타내었다.
실시예 3: 미니돼지 섬유아세포의 제조 및 배양
미네소타(Minnesota) 미니돼지 섬유아세포를 제조하기 위해 생후 10일된 돼지의 귀를 이용하였다. 먼저 외과용 메스를 사용하여 귀 양쪽변의 털을 제거하고 2% 크레졸 솜으로 귀 양쪽을 문질러 깨끗하게 소독하였다. 크레졸 솜으로 소독 후 70% 알콜솜으로 다시 한 번 소독하고 소독이 끝난 귀 조직을 2x2cm의 크기로 멸균 가위를 이용하여 채취하였다. 채취된 조직은 항생제를 포함하는 PBS로 2-3회 세척 후 DMEM(WelGENE), 15% FBS, 100 unit/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 15ml의 배지가 들어 있는 50ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣고 4℃로 유지하여 실험실로 운반하였다. 운반된 조직은 이를 페트리 접시로 옮기고 남아있는 털을 제거한 후 70% 알콜에 1-2초간 침지하고 항생제가 포함된 PBS로 세척하였다. 이러한 과정이 끝나면 실제 현미경 하에서 다음과 같은 조작을 수행하였다.
구체적으로, 세척이 끝난 조직은 2ml의 배지가 있는 페트리 접시로 옮겨 메스와 핀셋을 이용해 표피，연골 등을 제거하고 기저표피를 노출시키고 얻어진 조직은 안과용 가위를 이용하여 1mm 이하의 크기로 매우 작게 자르고 25ml의 PBS로 3번 세척하였다. PBS를 제거한 후 조직을 0.1% 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 PBS-EDTA 25ml과 함께 100ml 병에 넣어 2시간 동안 3 내지 4℃ 온도 하에서 배양하였다. 배양이 끝나면 25ml의 배지를 넣어 트립신을 불활성화시키고 4㎕ mesh를 이용하여 세포 덩어리를 걸렀다. 회수된 세포액은 15ml 팔콘 튜브로 옮기고 900rpm에서 10분간 원심하여 상층을 제거한 다음 lOml의 배지로 세포를 현탁하였다. 회수한 세포는 6 5×105 세포수로 l0cm 접시에 접종하고 37℃, 5%, CO2 배양기에서 배양하였다. 접종한 세포가 어느 정도 자라면(Confluent) 계대배양하였고 한 번의 계대배양을 거친 세포는 10% DMSO를 포함한 DMEM(WelGENE), 15% FBS, 100unit/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 동결보존액을 이용하여 동결하고, 그 다음 이를 액체 질소에 보관하였다.
미니돼지 섬유아세포의 배양은 15% defined FBS, 1 X 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 1 X 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 0.lmM 베타-멀캅토에탄올, 100 unit/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하고 있는 DMEM을 기본배지로 하여 배양하였다. 세포는 10cm 접시에 8X105 세포를 접종하였으며 3-4일 간격으로 계대하여 실험에 이용하였다. 또한 배양 접시는 젤라틴 피복된 접시 또는 플레이트를 이용하였다.
실시예 4: 타겟팅 벡터의 형질감염 및 선별
미니돼지 섬유아세포에 타겟팅 벡터와 TALEN 도입은 전기 천공법(electroporation)을 이용하였다. Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터와 TALEN 도입은 아래와 같이 실시하였다.
구체적으로, 90% 정도의 밀도를 가지도록 배양한 세포를 EDTA-PBS로 1회 세척한 다음, 0.25% 트립신-EDTA를 처리하였다. 트립신-EDTA를 처리한 세포를 배양액으로 현탁한 다음, 800rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였고, 회수된 세 포를 다시 F10 배양액으로 현탁하였다. 그 다음, 이 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 세척하였다. 이렇게 회수된 세포는 1.25X107 세포/ml가 되도록 현탁한 다음, 천기천공법에 이용하였다.
Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터의 단독 도입에 있어서는 NotI으로 절단하여 직선화된 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 10㎍을 100㎕ F10 배지에 융해한 후 세포 현닥액 400㎕(5X106 세포)와 혼합한 다음, 4mm 갭 큐벳(gap cuvette)에 세포 벡터 혼합액을 넣었다. Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터와 TALEN의 동시 도입은 NotI으로 절단하여 직선화된 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 5㎍, 원형 left TALEN 플라스미드 2.5㎍, 원형 right TALEN 플라스미드 2.5㎍을 100㎕ Fl0 배지에 융해한 후 세포 현탁액 400㎕(5X106 세포)와 혼합한 다음 4mm 갭 큐벳에 상기 세포 벡터 혼합액을 넣었다.
형질감염을 위하여 상기에서 준비된 큐벳을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001)에 장착한 다음 450V, 4 pulses, 1 ms 조건에서 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후 큐벳(cuvette)을 얼음 위에 10분간 방치한 다음, 이를 배양액으로 현탁하였고, 그 다음 48 웰에 800cell의 세포가 되도록 48 웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 벡터를 세포에 도업한 다음 48시간 후 300㎍/ml의 G418로 12일간 선별하였다. 특히 본 선별 과정 중에는 20% FBS, 1mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 1x 비필수 아마노산(non-essential amino acid), 1x베타-mercaptoethanol, 100 Unit/ml 페닐실린(penicillin)，100㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM을 배지로 이용하였다. 선별된 콜로니는 트립신(trypsin)을 처리하고, 24 웰에서 계대 배양하였으며 3 내지 4일 후 세포의 밀도가 높아지면 12 웰로 계대 배양하였으며 동일한 방법에 의하여 6 웰, 60mm 접시, 및 100mm 접시 순으로 계대 배양하여 동결 보존하였다.
실시예 5: 타겟팅된 세포의 PCR 분석
타겟팅이 일어난 세포의 동정은 2단계로 실시하였다.
먼저 PCR에 의한 1 단계 동정은 G418에 내성을 가지는 콜로니(colony)를 선별한 다음 24 웰에서 12 웰로 계대할 때 0.5ml 튜브에 계대시 떼어낸 세포의 1/5 가량의 세포를 취하여 PCR을 수행하였다. 0.5ml 튜브에 있는 1/5의 세포 현탁액으로부터 10000rpm, 4℃, 10 분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포만 회수하였다. 회수된 세포는 분석 전까지 -20℃에 보관하였다. PCR에 이용하기 위하여 각 튜브에 50mM NaOH 36㎕를 넣고 잘 혼합한 다음 95℃에서 10분간 처리한 후 1M Tris-HCl 4㎕를 넣고, DNA를 중화시켰다. 이렇게 처리된 튜브 내의 시료는 10,000rpm, 4℃, 10 분의 조건에서 원심분리하였고, 상층액을 회수하였다. 1차 PCR에서는 상기에서 준비한 세포 용해액 2㎕를 이용하여 PCR을 수행하였다.
Sal-like 1 유전자가 타겟팅된 세포의 PCR은 1차 PCR과 2차 nested PCR로 수행하였다. 1차 PCR은 Neo 3-2 프라이머(GCC TGC TTG CCG AAT ATC ATG GTG GAA AAT, 서열번호 11), Sall1 Sc AS5-2 프라이머(GGG GAG AGG AAG GGA GAA GCT TAA TAG TGG, 서열번호 12)와 TOYOBO KOD SYBR qPCR Mix을 이용하여 Agilent Technologies 의 Stratagene Mx3000P real-time PCR 기계에서 실시하였다. PCR 조건은 95℃ 10초，62℃ 10초，68℃ 2분 30초에서 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 후 DNA의 증폭 여부는 CT값과 전기영동 후 DNA 밴드로 확인하였다.
2차 PCR은 1차 PCR에서 양성(postive)으로 확인된 콜로니를 계대 배양하여 10cm 접시에 있는 세포로부터 게놈 DNA를 회수한 다음 실시하였다. 게놈 DNA는 페놀/클로로포름을 이용하여 제조하였다. 게놈 DNA를 이용한 2차 PCR은 게놈 DNA 100ng을 이용하여 1차 PCR과 통일한 조건에서 실시하였다.
실험예
: 돼지
Sal
-
like
1 유전자
타겟팅
벡터 단독, 또는 돼지
Sal
-
like
1 유전자
타겟팅
벡터 및
Sal
-
like
1 유전자의 엑손 2에 특이적인
TALEN
을 함께 이용하여 제조한
Sal
-
like
1 유전자 넉-아웃 세포의 제조 및 효율 확인
실시예 1의 타겟팅 벡터 단독 또는 실시예 2의 TALEN을 함께 도입한 실시예 4의 미니돼지 섬유아세포의 넉-아웃 효율을 실시예 5의 방법으로 분석하였고, 그 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다.
도 5는 본 발명에서 제작된 넉-아웃 벡터 단독 또는 TALEN을 함께 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 효율을 정리한 표로서, 도 5에 나타낸 바와 같이, 벡터가 도입된 것으로 확인된 세포 중에서도 넉-아웃된 것으로 확인된 세포는 최대 5.45% 가량에 불과한 것으로 나타난 반면, 본 발명에서 제조한 넉-아웃 벡터 및 TALEN을 모두 이용한 경우, 넉-아웃 효율이 56.3%(37℃) 및 67.04%(30℃)로, 넉-아웃 벡터 단독에 비하여 그 효율이 매우 우수한 것으로 나타났다. 대표적인 넉-아웃 세포의 PCR 동정 사진을 도 6에 나타내었고, 넉-아웃 세포의 염색체는 도 7에 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> A method for preparing a Sal-like 1 gene knock-out cell using
porcine Sal-like 1 gene targeting vector and TALEN targeting
Sal-like 1 gene
<130> PA131101KR
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 5548
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' arm of SALL1 Knock-out vector
<400> 1
gcggccgcaa ttggcctacg aaagaggagc agcctgtgaa tactgcaggt tccaacatca 60
caatcttgag aggttttatg aaaaatgtta atgtgctcgg aaggtgatgg gaagcaacac 120
cacgaggggt cttgccgagg aactccaaaa aagaacccta aacgtggtac agtggggctg 180
ttgttttgtt ttggtttgtt tctttctttc tttttttttt ttcccctggc tggtgaaacc 240
tttccgtgtg ggacatagtt ttatttttgt tttctcagca gacagacaga ctggcacact 300
ttaattttct gcctcctgtt ccgcagtgtt gagttcagag gatgaaaaac tgacacattt 360
gaattgggca tcaagtacct aaatagcacc caaagaaccc aaacatctgg gattttcata 420
taaataggat ggagctgcaa gttcaccacc tccttccctg actcagaggt ggggggggga 480
gaaccccaga aaattctgca tatatctctt tgtgtgtaca tagttagaaa accactactt 540
ctgaaatttt cctgtatgac cacagttaca aaattacttt tcatttgcat gcaaaatcca 600
tagaagagac tctggaatat tattttcccc atagtacagg gaacgaggca actgtatttt 660
atttactata atggggtcac cggttgcaat cctgtgtaac agattcttga gagagataga 720
agataccaga cggtcagaaa aatgaattag aacgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtctt 780
ttcacaactt aaaatatttc ctttggtagt taaagattca aactagtcct ggtgtttggt 840
cttttttttt tttttttttt tataaccctg tttcactgga attctgttca gaatgcagat 900
agatttaaag ttaagaacta taatagtgga gccacacctg cttttgaaat aaatcaaaat 960
acatatcaag tttttttttc ttggtgttca taaacatcga gaaattaaat tagttgactc 1020
tacagtgaga ccgaatgtca gcttattaaa atgttgtgaa aattgaagct aaaacatggg 1080
cagctcttgt aacacagtct ctttcttaga agcaagcaga cttttttttt ttttaagtgt 1140
ctatattttc catccagtta gcacaatcct aaatataaaa atgttcaggt tgaaaaactt 1200
aaaaattctc aagtgagtct tgaagcagca caaatggaga attcgagccc aggaaagtaa 1260
taatcagcta actcctgcaa agtaaccttc cttttatttt ctctatatat tatgagaata 1320
tcagatgttt gcacgttata aagaattaaa atgcccttta atcgtgagca cagatgtgct 1380
aaatatttga agcaactaca ttgtaatgtg tacaattgat gaagtcagtt ttctgatttc 1440
ccttgctagt tatttagttc tgaatctgtc attatttgtc taagcccagc tgaccaagca 1500
aaactgtgtt ttaaagtggc tttatgtttt gataaatgtg agctggttga aaagtatttt 1560
ccactgaatg cagagcttaa tagaacatgc tgacataata gttttaatgc attttgttga 1620
aaatgtgtga acaaacagaa tagcttttgt tccttcataa ttggctgtaa aagtagatgg 1680
aaacataacc attacatatg gaaatgtgca aagagaaaga aataacattt ctgttgaata 1740
tattaggaat tgcatttcct agtttaaaat aagcgtctga aatggatgca tcatttaaaa 1800
ttggttgtca aaatacgaag ctttcaacag aatttttgtc acattatttt tgtcccgagt 1860
taagcaacat aactttagca aatttcattt aatattttgt ttatattatt ttaaggcaga 1920
gagagagaga cagaaagggt ttcaaacagc accttgaatg tgcataggaa tcctgtgcca 1980
gttaggatga ttaaacattc aattaaaacg gaatcattat tggtattttc tgccacaact 2040
taagatttgt ttggtattgt taatgcattt tgcactatac ccttgcggag attaaaagat 2100
gggtattagg aaagctagct tgttaagtat aacttagctg cccaaataac actcccagtg 2160
tgcacacatt tggcgtactt taccagggct tctaatcagc ttcagcatca ctcaaggcaa 2220
agagagttaa ggaattttca gaagttagta tcagggtatt aattatattt tctggaaggc 2280
aaaactactc aggctttttc tttaaaaaaa aaaagatgtt tactacaaag aggcaaatgc 2340
tggctctttt gagttgactc ttaagtgtct tggaaaagca gcattttgag attgcattta 2400
ttcatatttg caattagttt ttttttttct ccccctgcaa gttttctggg agattcaatt 2460
tggaagtcat ggaaactaac tattatctga ttcagttctg cagaaaagca tgcagggagg 2520
taatccttga attaaacagt tttttttttt tttttttttc ctccacagcc ttcagagatg 2580
accacacacc atttgtacaa cagaagttgg tgttccccat gctgggcaaa caatgggacg 2640
ccatcctgtc tttgaatagg atgttagctt ggagttggag atttttatgt ttaatttaca 2700
aatggatctt agtgagaaga aatctgagca accagtggaa acaaacatga aataaaggga 2760
ttttataatg aaaagttcag gacaatctgt taaacaattg ataacagtta agagcaaact 2820
gtttttaaag acattcagac caggagaatt gcaaagcatt tccaaactgg aaaccaagaa 2880
ttatttcttt gcttcccctt aactgcacat ccttctttaa gttgatgtgt aatcagaaac 2940
gtaaatctca tgccagtttt tacagataga gcacttttaa tgaaacattt agaggcataa 3000
cgttgccatt tggagcatag tggcatatag tcctcagtta gtagaatggt agccatgatt 3060
gcattaattt taaaaatgaa catgccatgg gatgatgtat aggtgccagg caggccttga 3120
aacggattat gatcgctgtg tttctcgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3180
gcacgcacgc acgcacgcac gcacgcacgc atgttgcttt ctcctttgta ttcagctgag 3240
tcctgagagg tctggaggat ttgttactga tgtggctgaa gtgtgtttgt cacggatcag 3300
aaggagctca ggttctaggt aggggctgga ggtgatttcc aagttgtcag tcttcagctt 3360
ggtgatatgc attttttttt tttctccctt gtcaaccact gattggaacc tgaatgacta 3420
caaattagtt tagtgacaga acaaactgtc acagatatct ttgaatcagt tgaaaatgaa 3480
taaggttgac agaaactcaa gagcctaata agtcctcaga atggtggccg gaccctctct 3540
ggatgagtgg agaatacggt gtataaaata ttggaaatca atattttgct atggaatttc 3600
attaggcacc aatgtcggca gtttatagta ttttatattt tgatggataa cctggaggcc 3660
ggggctcccg gagataccag attgatagga agtcctccaa cagccttaag atttaattct 3720
gaacgttctt agggaatatt gattggtctt caggggccat agttttgagt tttgccggca 3780
aaaaagaatt gaccaccttc tttctccttt ttcgaagtca caggtggctc caggtgtcct 3840
ggctccctcg ctaaccccgc tccttttgac gtttgcagga gacgcggaga agggtcaacc 3900
caaccgcacc actaagagca aggatgccca cgtctgcggc cggtgctgtg ccgagttctt 3960
tgaattgtca gatcttctgc tccacaagaa gagctgcacg aaaaaccaac tcgttttaat 4020
cgtaaatgag agtccagcct ctccccctga acccttctcc cccagtccct ctccccatca 4080
tcccgatgaa caaatgaatg acacggttaa caaaacagag caaggagact gcagcgacct 4140
tccagaacac cacgggccgg acagggaaga gtccatggag gtggaggccc cggtggctaa 4200
caaaggcggc agtggccccc tgggtggcag cagcgatggc agtgggcccc ccagctgcag 4260
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc tcctgcacag gtacctcagc 4320
gatcacaacc tctctacctc aactcgggga cctgacaaca ctgggcaact tctcggtgat 4380
caacagcaac gtcatcatcg agaacctcca gagcaccaag gtggcggtgg cccagttctc 4440
ccaggaagcg aggtgcagtg gggcctccgg aggcaagctg gccgtcccag ccctgatgga 4500
gcagctctta gctctgcagc agcagcagat ccaccagctg caactgatcg aacagattcg 4560
tcaccaaata ctgctgttgg cgtctcagaa cgcagacttg ccagcatctt ctagtccttc 4620
tcaaggtact ttacgaacat ctgccaaccc tttgtccacc ctaagttccc atttatctca 4680
gcagctggcg gcagcagctg ggttagcaca gagcctcgct agccagtctg ccagcatcag 4740
cggtgtgaaa cagctccccc caatccagct acctcagagc agttctggca acaccatcct 4800
tccatcccac agcggctctt cccccagtgt taacatcttg gcggcagcag tgaccacccc 4860
ggcctccgag aaagcggctt cgagtgcggg ggccgcccag gccggcaacc cggccgtctc 4920
agcagcctcc tcaccagctt tcgcaataag cagtttattg agtcctgcat ctaatccact 4980
tctacctcag ccggcccctg ctaactcggt tttccccacc cctttgccca acatcggaac 5040
gacggcagag gatttaaact ccttgtccgc cttggcccag caaagaaaga gcaagccacc 5100
aaatgtcacc gccttcgacg cgaaaagcgc ttccgacgag gcgttcttca aacacaagtg 5160
caggttctgc gcgaaggtct tcggaagcga cagtgccttg cagatccacc tccgttccca 5220
cacaggagag aggcccttca agtgtaacat ctgtgggaac aggttctcca ccaaggggaa 5280
cctcaaggtc cactttcagc gccacaaaga gaagtaccct cacatccaga tgaaccccta 5340
cccggtgcct gagcacttgg acaacatccc caccagtacc ggcatcccct acggcatgtc 5400
catccctccg gaaaagcccg tcaccagctg gctggacacc aaacccgtcc tgcccaccct 5460
gaccacctcc gtcggcctcc cgttgccccc caccctcccg agcctccccc ccttcatcaa 5520
gaccgaagag ccagccccca tcggatcc 5548
<210> 2
<211> 1815
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' arm of SALL1 Knock-out vector
<400> 2
cccgggattc cacaagtcac ccagcgccga ggagaagcca cagagagccg gagccagtga 60
ctttgccaat ggcttgtcgc ccacccccgt gaatggtggg gctttggact tgacatccag 120
tcacacggag aaaatcatca aggaagattc tttagggatc ctcttcccgt tcagagaccg 180
gggtaaattt aaaaacactg cttgcgacat ttgtggcaag acctttgctt gtcagagtgc 240
cttggacatt cactacagaa gtcataccaa agagagacca tttatttgca cagtctgcaa 300
tcgtggcttt tccaccaagg gtaatttgaa gcaacacatg ttgacacatc agatgcgaga 360
tctaccatca cagctctttg agcccagttc caaccttggc cccaatcaga actcggcggt 420
gattcccgcc aactcgttgg catctctcat taagacagag gtcaacggct tcgtgcatgt 480
gactcctcag gacagtaagg acacccccac ggggcacgtt ccttcggggc ctctgtcctc 540
ctccgccgcc acgtccccag ttctgctccc agctctgccc aggagaaccc ccaaacagca 600
ctactgcaac acgtgtggca agaccttctc ctcgtcgagt gccctgcaga tccacgagag 660
aactcacact ggagagaagc cctttgcttg cactatttgt ggaagagcat tcacaacaaa 720
aggcaatctt aaggtatctc tccatctgca cctcacccag acccaccccg gcagccccct 780
ctctctcccc ctcggccacc gacggtttgt aatgcatgct cccagagtcc tcggcccaga 840
gggtcaggga gagcgttcct ggagggaacc tgctgtgtgg ggctgatccg gagccacgcg 900
ggtgcccgtg caggtcagga tcccggcagg gaccggggcg ggctgtgccg cctggagaag 960
gtcagagcgc attgaataat ctggtaccta agcggagcag cggcccagct ccgttgtctc 1020
cgctaagtgc accaaatgaa ttgctttacc taccaaggca gacagcccgg cgttgccatg 1080
gggtattgat taaagacctc catgcggcct gtgtgctgcc cgtatcactt aataattaca 1140
gttctccgcg gcgtgggcct ctatttcttc ataactctgc agtccagcct ggtttgtctt 1200
tctaaaaatg gtaacgtcac cgctctgcta atgggtatta tgataattga ttatacaaca 1260
ggtcctcctg atctgtgttg gagagaaagc aaatatgctt aagttctaga gcaacagagg 1320
agccctctca ctgtgtacat ttttctgttg acagagtatt tctccagaga tcgctgccag 1380
taatgtgaga tgaataatta ctttctggct ctttctctcc acgcacgggc cctccaatgg 1440
gcaatcagtg aggggcactt gcttcccatc tgagaaggac atttataggc taaagggtgt 1500
cagatacaat acttaccagg gcaatgagag tggacataac aattctaacc ctgaaaggag 1560
ctatctgcga cggactgact tgcttgaggc cattataagc taaatacagg taataaaaat 1620
ggagtaagta aggcatcctt gcccaggcag aggagaggcg gcccagggct gcagagagca 1680
gacaccttat tacccgcaga ctggagtgga cggtgcttgt tccccttccc actgtcgggc 1740
ccataataag aacagacatc acagcccctc gccttgtcat gtgttgggat atgagctgag 1800
acagattccg tcgac 1815
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'arm S Primer
<400> 3
gcggccgcaa ttggcctacg aaagaggagc agcctgtg 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'arm AS Primer
<400> 4
ggatccgatg ggggctggct cttcggtctt gatgaa 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'arm S primer
<400> 5
cccgggattc cacaagtcac ccagcgccga ggagaa 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'arm AS primer
<400> 6
gtcgacggaa tctgtctcag ctcatatccc aacaca 36
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S primer with BamHI site
<400> 7
ggatcctacc gggtagggga ggcgcttttc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS primer with SmaI site
<400> 8
cccgggcctc agaagaactc gtcaagaagg 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Left binding site of TALEN targeting Sal-like 1
<400> 9
tttcccttcg ggggactct 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Right binding site of TALEN targeting Sal-like 1
<400> 10
aacctgcaga gactccgga 19
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neo 3-2 primer
<400> 11
gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sall1 Sc AS5-2 primer
<400> 12
ggggagagga agggagaagc ttaatagtgg 30
Claims (10)
- (ⅰ) Sal-like 1 유전자의 인트론 1의 일부분 및 엑손 2의 일부분을 1 내지 6kb 길이로 포함하는 제1 핵산 영역; (ⅱ) 양성 선별마커(positive selection marker) 유전자 카세트; 및 (ⅲ) Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 1.5 내지 2.5kb 길이로 포함하는 제2 핵산 영역을 포함하고, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 5' 말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는, Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터; 및
Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 타겟팅하는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 분리된 돼지 세포에 도입하는 단계를 포함하는, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 돼지 세포의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 추가로 돼지 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 Sal-like 1은 돼지 유래인 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 벡터의 제1 핵산 영역은 돼지 Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 1664bp의 업스트림(upstream) 방향으로 1.7 내지 6kb를 가지는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 벡터의 제2 핵산 영역은 돼지 Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 2738bp로부터 다운스트림(downstream) 방향으로 1.5 내지 2.5kb를 가지는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 양성 선별마커는 네오마이신(Neomycin; Neo), 하이그로마이신(hygromycin; Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene; hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase; Gpt)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 벡터는 추가로 음성 선별마커 유전자 카세트를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 음성 선별마커는 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin), 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; Hprt) 및 사이토신 디아미네즈(cytosine deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 Sal-like 1 유전자의 엑손 2에 위치한 서열번호 9의 코딩 가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 10의 주형 가닥(template strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하는 것인 제조 방법.
- (a)(ⅰ) Sal-like 1 유전자의 인트론 1의 일부분 및 엑손 2의 일부분을 1 내지 6kb 길이로 포함하는 제1 핵산 영역; (ⅱ) 양성 선별마커(positive selection marker) 유전자 카세트; 및 (ⅲ) Sal-like 1 유전자의 엑손 2의 일부분 및 인트론 2의 일부분을 1.5 내지 2.5kb 길이로 포함하는 제2 핵산 영역을 포함하고, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 5' 말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는, Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터; 및 Sal-like 1 유전자의 엑손 2를 타겟팅하는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 Sal-like 1 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 제조하는 단계;
(b) 핵이 제거된 돼지 난자에 (a) 단계에서 제조한 체세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 돼지에 착상시키는 단계를 포함하는, Sal-like 1 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 형질전환 돼지의 제조 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140016781A KR101590247B1 (ko) | 2014-02-13 | 2014-02-13 | 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용한, Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140016781A KR101590247B1 (ko) | 2014-02-13 | 2014-02-13 | 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용한, Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포의 제조 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150096017A KR20150096017A (ko) | 2015-08-24 |
| KR101590247B1 true KR101590247B1 (ko) | 2016-02-02 |
Family
ID=54058607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140016781A Active KR101590247B1 (ko) | 2014-02-13 | 2014-02-13 | 돼지 Sal-like 1 유전자 타겟팅 벡터 및 Sal-like 1 유전자 타겟팅 TALEN을 이용한, Sal-like 1 유전자 넉-아웃 세포의 제조 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101590247B1 (ko) |
-
2014
- 2014-02-13 KR KR1020140016781A patent/KR101590247B1/ko active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 이민정 외 3인, 제12회 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 초록집, 201쪽 (2012.10.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20150096017A (ko) | 2015-08-24 |
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Legal Events
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