KR20160001781A - 돼지 ｈｎｆ6 유전자 타겟팅 벡터 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지로부터 유래된 HNF6(hepatocyte nuclease factor 6) 유전자 타겟팅 벡터, HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 이용하여 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란, 상기 수정란을 이용하여 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조되어 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지에 관한 것이다. 본 발명에서 개발된 HNF6 유전자 넉-아웃 벡터를 이용할 경우, 대상 세포에서 HNF6 유전자를 효과적으로 넉-아웃 시킬 수 있으므로, 이를 사용하면, HNF6 유전자가 넉-아웃된 세포를 이용한 인간 맞춤형 장기 생산용 형질전환 돼지를 생산하기 위한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

돼지 ＨＮＦ6 유전자 타겟팅 벡터 및 그의 용도{Porcine HNF6 gene targeting vector and uses thereof}

본 발명은 돼지 HNF6 유전자 타겟팅 벡터 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 돼지로부터 유래된 HNF6(hepatocyte nuclease factor 6) 유전자 타겟팅 벡터, HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 이용하여 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란, 상기 수정란을 이용하여 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조되어 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지에 관한 것이다.

현재 국립장기이식센터에 따르면 한해 국내에서 약 2만 명에 달하는 환자가 장기이식을 기다리고 있으며 이러한 이식대기 환자는 급격히 증가하고 있으나, 장기기증 건수는 수요의 10%에도 마치지 못하고 있어, 이러한 장기 수급 불균형에 따라 불법 장기 매매를 비롯한 여러 가지 사회적, 경제적 문제가 야기되고 있는 실정이다. 이러한 장기부족현상을 해결하기 위해 바이오 이종장기, 인공장기, 줄기세포 분화, 생체조직공학을 이용한 조직 재생법 등의 연구가 전 임상 및 임상단계에서 진행되고 있다. 그 중 이종장기이식은 부족한 장기를 무한정 공급할 수 있을 뿐 아니라 유전공학적 기법을 이용한 환자 맞춤형 형질전환 장기의 생산이 가능하다는 점에서 상기 방법 중에서도 큰 장점을 가진다(Proc (Bayl Univ Med Cent). 2012 January; 25(1): 49-57.).

한편, HNF6(hepatocyte nuclear factor 6) 유전자는 췌장 내분비 세포의 발생에 관여하는 유전자로 알려져 있다 이들 유전자가 넉-아웃(kncok-out)된 생쥐의 75%는 생후 1 일에서 10 일 사이에 사망하는 것으로 알려져 있으며, 생후 4 일째 넉-아웃된 생쥐의 췌장에서는 α세포, β세포 및 δ세포가 현저하게 감소되고, 글루카곤과 인술린의 발현이 감소되었다고 알려져 있다.

그러나, HNF6 유전자의 1개 대립 유전자가 넉-아웃된 돼지를 생산하고 사람의 줄기세포를 췌장을 생성할 수 있는 위치에 이식하면 돼지의 체내에서 인간 줄기세포로부터 인간의 췌장을 발생시킬 수 있다. 이러한 장기를 인간 맞춤형 장기라고 하며 유전자 조작된 돼지의 장기를 이종 간 이식에 이용하는 것보다 보다 인간에 근접한 장기를 생산할 수 있는 미래 대체 장기 개발 기술이다. 그러나, 이를 위해서는 HNF6 유전자를 돼지 세포에서 효과적으로 넉-아웃시킬 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은, HNF6 유전자를 효과적으로 넉-아웃시킨 세포를 제조하는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, HNF6 유전자의 일부 부위를 이용하여 제조된 HNF6 유전자를 효과적으로 타겟팅하는 벡터를 이용할 경우, HNF6 유전자를 돼지 세포에서 효과적으로 넉-아웃시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 이용하여 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 세포를 이용하여 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수정란을 이용하여 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어 HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 HNF6 유전자 타겟팅 벡터는 (a) 돼지 HNF6 유전자 엑손 1의 일부를 1 내지 6kb 의 길이로 포함하는 제1 핵산영역; (b) 선별마커(selection marker) 유전자 카세트; 및 (c) 상기 HNF6 유전자의 엑손 1의 일부분 및 인트론 1의 일부분을 2 내지 3kb 길이로 포함하는 제2 핵산 영역을 포함한다.

본 발명의 용어 "HNF6(hepatocyte nuclear factor 6) 유전자"란, 췌장 내분비 세포의 발생에 관여하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자가 넉-아웃(kncok-out)된 생쥐의 75%는 생후 1 일에서 10 일 사이에 사망하는 것으로 알려져 있으며, 생후 4 일째 넉-아웃된 생쥐의 췌장에서는 α세포, β세포 및 δ세포가 현저하게 감소되고, 글루카곤과 인술린의 발현이 감소되었다고 알려져 있다.

상기 HNF6 유전자의 정보는 미국국립보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NP_004489.1 등이 될 수 있다.

상기 용어 "유전자 타겟팅 벡터"는 게놈의 특정 유전자 위치에서 상동 유전자 재조합이 일어나도록 넉-아웃하고자 하는 특정 유전자의 상동 염기서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 유전자 타겟팅 벡터는 본 발명에서 "넉-아웃 벡터"와 혼용되어 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 타겟팅 벡터는 돼지 HNF6 유전자의 엑손 1 위치에 변이 유전자, 즉 양성 선별마커 유전자가 삽입될 수 있도록 고안된 벡터를 의미한다. 이러한 벡터는 원형(circular) 또는 선형(linear) 형태일 수 있다.

상기 제1 핵산 영역은 상기 유전자 타겟팅 벡터에서 왼쪽 상동성 팔(left homology arm)에 해당하는 부위로서, HNF6 유전자의 엑손 1의 일부분을 포함한다. 상기 제1 핵산 영역의 길이는 유전자 타겟팅 효율을 결정하는 중요한 요소로서, 1 내지 6kb의 길이를 가질 수 있고, 바람직하게는 돼지 HNF6 유전자 엑손 l의 메치오닌 사이트인 ATG 위치에서 상류 lO03bp를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 5'arm에 해당하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제1 핵산영역으로 사용하였다.

상기 제2 핵산 영역은 상기 유전자 타겟팅 벡터에서 오른쪽 상동성 팔(right homology arm)에 해당하는 부위로서, HNF6 유전자의 엑손 1의 일부분 및 인트론 1의 일부분을 포함한다. 상기 제2 핵산 영역은 2 내지 3kb 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 돼지 HNF6 유전자 엑손 1의 ATG 위치에서 하류 475bp에 위치에서부터 다운스트림의 2.43kb를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 3'arm에 해당하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 제2 핵산영역으로 사용하였다.

또한, 상기 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역은 타겟팅 대상이 되는 유전자의 서열과 동일한 서열뿐만 아니라, 이와 상동 재조합이 가능한 서열이라면 유사성을 가지는 서열도 포함하며, 바람직하게는 타겟팅 대상이 되는 유전자의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열도, 상동 재조합이 가능한 서열이라면 본 발명의 범주에 포함된다.

상기 선별마커 유전자 카세트는 상기 타겟팅 벡터가 도입된 세포를 선별하기 위한 부위로서, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커를 포함하며, 상기 마커에는 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.

상기 양성 선별마커란 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 양성 선택을 가능하게 하는 마커로, 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 네오마이신(Neomycin; Neo), 하이그로마이신(hygromycin; Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene; hisD), 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase; Gpt) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 양성 선별마커는 상기 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역의 사이에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 양성 선별마커가 제1 핵산 영역 및 제2 핵산 영역의 사이에 위치하는 경우, 목적하는 세포의 유전자와 상동 재조합이 일어날 때 상기 세포의 게놈 내로 삽입되므로 선택제의 사용을 통하여 넉-아웃 여부를 식별할 수 있으며, 또한 넉-아웃된 세포를 선별할 수 있다.

한편, 음성 선별마커란, 무작위적 삽입(random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin), 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; Hprt), 사이토신 디아미네즈(cytosine deaminase) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이러한 음성 선별마커는 제1 영역의 5' 말단의 상위(upstream) 또는 제2 영역의 3' 말단의 하위(downstream)에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 제2 영역의 3' 말단 하위에 음성 선별마커가 위치하도록 벡터를 제작하였다.

또한, 상기 선별마커 발현 카세트는 상기 선별마커를 발현할 수 있도록 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 선별마커 전사를 위해 사용할 수 있는 프로모터로는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터，원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터， 몰로니 바이러스， 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터， 엠스티인 바 바이러스(EBV) 프로모터，로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터，RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터，β-액틴 프로모터，사람 헤로글로빈 프로모터 빛 사람 근육 크레아틴 프로모터 등이 있으나，이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 양성 선별마커를 전사시키기 위한 프로모터로서, 포스포글리세레이트 카나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터를 이용하여 양성 선별마커의 상부(upstream)에 이를 연결시켜 벡터를 제조하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 분리된 돼지의 체세포에 도입하여, 상동재조합을 유도하는 단계를 포함하는, HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포의 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, HNF6 유전자 넉-아웃 효율을 향상시키기 위하여, HNF6 유전자 타겟팅 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease) 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이처럼 HNF6 유전자 타겟팅 벡터와 TALEN을 함께 도입할 경우에는, 상기 벡터와 TALEN을 동시 또는 순차적으로 세포 내에 도입할 수 있다.

본 발명에서 용어, "TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)"은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 서로 융합하여 제조한 인공의 제한효소를 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인이 링커를 통하여 연결된 형태도 포함한다. 여기서, TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 어떠한 원하는 DNA 서열에도 빠르게 결합하도록 엔지니어링된 것으로, 이를 DNA 절단 도메인과 결합시키는 경우, 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 원하는 DNA 부위를 절단하는 효과를 가져온다.

본 발명에서 용어, "HNF6 유전자를 타겟팅하는 TALEN"은 HNF6 유전자의 특정 서열에 결합하여 HNF6 유전자의 절단을 가져오는 TALEN을 의미한다. 상기 HNF6 유전자를 타겟팅하는 TALEN은 바람직하게는 HNF6 유전자의 엑손 1을 특이적으로 절단하는 것이며, 더욱 바람직하게는 HNF6 유전자의 엑손 1에 위치한 서열번호 3의 코딩 가닥(coding strand) 부위에 결합하여 절단하는 TALEN 및 서열번호 4의 주형 가닥(template strand) 부위에 결합하여 절단하는 TALEN일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 3에 도시된 것과 같은 서열번호 3의 핵산 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 가지는 TALEN 및 서열번호 4의 핵산 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 가지는 TALEN을 모두 이용하였다.

상기 HNF6 유전자 타겟팅 벡터 및 HNF6 유전자 타겟팅 TALEN은, 바람직하게는 돼지 또는 미니어쳐 돼지 유래의 체세포에 도입될 수 있으며, 상기 세포를 분리하거나 활성화할 수 있는 유용한 조직에는 간，췌장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 골수, 귀, 피부, 뼈, 쓸개 조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등이 있으나，이로 제한되지 않는다. 세포 타입으로는 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 배아세포, 간 세포, 및 여포세포, 줄기세포, 전핵기 수정란 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

상기 세포의 분리는, 미니어쳐 돼지 귀 조직에서 분리할 수 있는데, 귀 조직은 분만 10 일령의 귀 조직을 사용하고 이들 조직을 1 내지 3mm 정도로 절단하여 배양할 수 있다. 본 발명에서는 귀 조직을 돼지로부터 절단한 후 무균적으로 소독하고 곁 피부 조직과 연골 조직을 제거한 다음에 세로와 가로가 각각 2mm 되도록 메스로 절단하여 조직을 배양하였다. 이들의 조직 배양시에는 귀 조직이 배양액 안으로 완전히 잠기지 않도록 하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 체세포 분리 및 배양을 위한 배지는 고농도의 글루코오스 및 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 배지를 이용하여 귀 조직으로부터 체세포를 분리하고, FBS, 비필수 아미노산 및 항생제를 포함한 배지에서 계대 배양하는 것을 통해 체세포를 생산할 수 있으며，바람직하게는 돼지의 귀 조직을 고농도의 글루코오스 및 15% FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 배양하여 체세포를 분리하고，15% FBS, 비필수 아미노산， 피루브산나트륨， 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양할 수 있다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터 또는 TALEN을 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있으며，당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술， 예컨대 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE 텍스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome)법 등을 이용할 수 있으며，이로 제한되지 않는다. 이때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

이러한 도입 과정은 인체로부터 분리된 세포를 대상으로 체외(in vitro)에서 수행함이 바람직하다.

또한, 상기 방법은 추가로 돼지 HNF6 유전자가 넉-아웃된 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 선별 과정은 양성 선별마커 또는/및 음성 선별마커를 사용함으로써 수행될 수 있으며, PCR 및 염색체 분석과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 분석할 수 있다.

구체적으로, 상기 체세포 선별은 벡터 내에 삽입되었던 선별마커 유전자를 이용할 수 있는데, 특히, 벡터 상에 존재하던 양성 선별마커가 돼지 체세포 게놈 상으로 도입되어 발현되면, 이들 양성 선별마커 발현을 인식할 수 있는 처리제를 이용하여 타켓팅 여부를 식별할 수 있게 된다. 본 발명의 선별마커로는 바람직하게는 네오마이신 마커를 이용할 수 있으며, 선별을 위한 처리제로는 항생제, G418을 이용할 수 있다. 선별을 위해 사용하는 G418의 농도는 200 내지 400㎍/㎖이 바람직하며，더욱 바람직하게는 300㎍/㎖이다.

또한, 유전자 타켓팅 벡터가 도입된 클론 세포의 선별에 이용할 수 있는 배양은 15%의 FBS, 비필수 아미노산， 피루브산나트륨， 베타-멀캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있다. 이러한 선별 과정은 벡터 및 TALEN 도입으로 상동 재조합을 유도하여 수일간 내지 수십일 간 배양한 다음, 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 벡터가 세포 내의 HNF6 유전자에 타켓팅되었는지를 분석하기 위해 PCR을 이용할 수 있다.

상기 PCR 분석은 1차 및 2차 PCR을 통해 효율적으로 타켓팅된 세포를 분석해낼 수 있는데 먼저，1차적인 PCR은 HNF6 유전자의 3' 상동 영역(제2 핵산 영역에 해당) 바깥 쪽에 있는 프라이머와 양성 선별마커 유전자상에 있는 프라이머를 이용함으로써, 벡터가 세포 내로 유입이 되었는지를 분석할 수 있다. 1차 PCR에 의해 선별된 세포를 대상으로 2차 PCR을 수행할 수 있다. 2차 PCR은 게놈 DNA을 제조한 후 1 차 PCR과 동일한 프라이머를 사용하여 실시할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 핵이 제거된 돼지 난자에 도입하여 제조된 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란; 상기 돼지 수정란을 돼지에 착상시키는 단계를 포함하는 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 형질전환 돼지의 제조 방법; 및 상기 방법으로 제조되어 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 형질전환 돼지를 제공한다.

이때, 핵이 제거된 돼지의 난자는, 물리적인 방법, 화학적인 방법 및 사이토칼라신(cytochalasin) B를 사용한 원심분리법 등을 사용하여 난자로부터 제조할 수 있으며, 바람직하게는 유리 마이크로피펫을 사용하는 물리적인 방법이 사용될 수 있다.

상기 유전자 타겟팅된 체세포를 핵이 제거된 난자 내로 도입하는 방법은, 세포막 융합법, 세포질 내 미세주입법 등을 이용할 수 있는데, 세포막 융합법은 간단하며 대규모의 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질 내 미세주입법은 핵과 난자 내 물질과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다.

체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합할 수 있으며， 이때， 미세전류· 전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기융합기를 이용할 수 있다.

핵이식된 수정란은 활성화시켜 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모로 착상시키는 것이 바람직하다. 여기서 복제 수정란의 활성화는 수정란이 분열할 수 있도록 성숙과정에서 일시적으로 정지된 세포주기를 다시 가동시키는 것을 의미한다. 복제 수정란 활성화를 위하여서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하며, 이를 위해 복제 수정란 내 칼슘 이온을 증가시키기 위해 세포막 투과도를 변형시키거나, 세포 외로부터 칼슘 유입을 급격히 증가시키거나, 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등을 이용할 수 있다.

상기 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 형질전환 돼지는 사람의 맞춤형 췌장을 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 개발된 HNF6 유전자 넉-아웃 벡터를 이용할 경우, 대상 세포에서 HNF6 유전자를 효과적으로 넉-아웃 시킬 수 있으므로, 이를 사용하면, HNF6 유전자가 넉-아웃된 세포를 이용한 인간 맞춤형 장기 생산용 형질전환 돼지를 생산하기 위한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 돼지 pHNF6 유전자를 넉-아웃하기 위한 타겟팅 벡터의 제조방법을 개괄적으로 나타내는 개략도이다.
도 2는 돼지 pHNF6 유전자 넉 아웃 벡터을 제조하기 위하여 5'arm 및 3'arm 유전자를 동정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 pMCDT-A 벡터를 이용하여 본 발명에서 개발된 pHNF6 유전자 넉 아웃 벡터를 제작하는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명에서 개발된 돼지 pHNF6 넉 아웃 벡터를 제작 후 제한효소 NotI 또는 Notl 과 HindIII 이중절단에 의하여 삽입 단편을 확인한 사진이다.
도 5의 A는 본 발명에서 개발된 pHNF6 유전자의 엑손 1부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위와 절단 부위를 나타내는 개략도이고, B는 TALEN 활성을 T7 endonuclease 분석에 의하여 실시한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동사진이다.
도 6은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포의 3'arm PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C)이다.
도 7은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포의 5'arm PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C)이다.
도 8은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포에서 넉-아웃된 대립유전자와 넉-아웃 되지 않은 대립 유전자를 PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C 및 D)이다.
도 9는 본 발명의 방법으로 제조된 넉-아웃 체세포의 염색체를 확인한 사진이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 돼지 DHNF6 유전자 타겟팅 벡터( pMCDT - HNF6 KO vector )의 제작

돼지의 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 제작하였다(도 1). 도 1은 본 발명에 따른 돼지 HNF6 유전자를 넉-아웃하기 위한 타겟팅 벡터의 제조방법을 개괄적으로 나타내는 개략도이다.

먼저, 5' 영역은 미네소타 미니돼지 게놈 DNA를 주형으로 하고, NotI 제한효소 절단부위를 포함하는 HNF6 TALEN 5' NotI S 프라이머와 EcoRI 제한효소 절단부위를 포함하는 HNF6 TALEN 5' EcoRI AS 프라이머를 이용하여 95℃ 30초，66℃ 30 초 및 72℃ 1분30초의 조건으로 35cycle 동안 수행하였다.

HNF6 TALEN 5' NotI S primer: 5'-gcggccgcGGTTGTCCGGTCAACAGTGGCAAGATTGAC-3'(서열번호 5)

HNF6 TALEN 5' EcoRI AS primer: 5'-gaattcATCGTGATCCCGGCGAGCGGGCTGCGGACA-3'(서열번호 6)

증폭된 단편은 pGEM T-easy 벡터에 도입하여 pGEM-HNF6 5'arm 플라스미드를 제작하였다(도 2의 좌측). 도 2는 돼지 HNF6 유전자 넉 아웃 벡터을 제조하기 위하여 5'arm 및 3'arm 유전자를 동정한 결과를 나타내는 사진이다.

다음으로, 3' 영역은 미네소타 미니돼지 게놈 DNA를 주형으로 하고, HindIII 제한효소 절단부위를 포함하는 HNF6 HindIII 3'arm S2 프라이머와 XhoI 제한효소 절단부위를 포함하는 HNF6 TALEN 3'arm AS 프라이머를 이용하여 94℃ 30초，66℃ 30 초 및 72℃ 3분의 조건으로 35cycle 동안 수행하였다.

HNF6 HindIII 3'arm S2 primer: 5'-aagcttCCTCCATGAATAACCTCTATACCCCCTACC-3'(서열번호 7)

HNF6 XhoI 3'arm AS primer: 5'-ctcgagGCTTCAGCTGTTTTCGGGTCTTAGTCAACC-3'(서열번호 8)

증폭된 단편은 pGEM T-easy 벡터에 도입하여 pGEM-HNF6 3'arm 플라스미드를 제작하였다(도 2의 우측).

한편, 양성마커로 이용할 PGK-neo 유전자는 pKJ2 neo 플라스미드를 주형으로 이용하고 BamHI 사이트가 부가된 S 프라이머와 SmaI 사이트가 부가된 AS 프라이머를 이용하여 98℃ 30초，68℃ 30 초 및 72℃ 2분의 조건으로 30cycle 동안 수행하였다.

S primer: 5'-GGATCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC-3'(서열번호 9)

AS priemr: 5'-CCCGGGCCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG-3'(서열번호 10)

증폭된 단편은 pGEM T-easy 벡터에 도입하여 pGEM-PGK-neo 플라스미드를 제작하였다.

아울러, pGEM-HNF6 5'arm 플라스미드를 NotI과 EcoRI으로 절단하고, 이를 pBSK의 Notl과 EcoRI 위치에 삽입시켜 pBSK-HNF6 5'arm 플라스미드를 제작하였다. 상기 pBSK-HNF6 5'arm 플라스미드를 EcoRI과 HindlIl로 절단하고, EcoRI과 HindlIl로 절단된 pGEM-PGK-neo 플라스미드를 도입하여 pBSK-HNF6 5'arm+ PGK-noe 플라스미드를 제조하였다.

최종 적으로, HnidIII와 XhoI으로 절단된 pGEM-HNF6 3'arm 플라스미드를 동일한 제한효소로 절단된 pMCDT-A 플라스미드에 도입하여 pMCDT-HNF6 3'arm 플라스미드를 제작하였다(도 3). 도 3은 pMCDT-A 벡터를 이용하여 본 발명에서 개발된 HNF6 유전자 넉 아웃 벡터를 제작하는 방법을 나타내는 개략도이다.

이어, 상기 제조된 pBSK-HNF6 5'arm+ PGK-noe 플라스미드를 NotI과 HindlIl로 절단하여 단편을 수득하고, 상기 단편을 NotI과 HindlIl로 절단된 pMCDT-HNF6 3'arm 플라스미드에 도입하여, pMCDT-HNF6 KO vector를 제작하였다. 이어 제작된 pMCDT-HNF6 KO vector를 NotI 또는 Notl 과 HindIII 이중절단하여 목적하는 단편이 정상적으로 삽입되었는지의 여부를 확인하였다(도 4). 도 4는 본 발명에서 개발된 돼지 HNF6 넉 아웃 벡터를 제작 후 제한효소 NotI 또는 Notl 과 HindIII 이중절단에 의하여 삽입 단편을 확인한 사진이다.

실시예 2: 돼지의 HNF6 유전자의 엑손 1을 특이적으로 절단하는 TALEN(Transcription activator - like effector nuclease )

상기 실시예 1에서 제작한 돼지 DHNF6 유전자 타겟팅 벡터(pMCDT-HNF6 KO vector)와 돼지 HNF6 유전자의 엑손 1을 특이적으로 절단하는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 미니돼지 섬유아세포에 도입하여 그의 활성을 측정하였다.

실시예 2-1: 미니돼지 섬유아세포의 배양

미네소타(Minnesota) 미니돼지 섬유아세포를 제조하기 위해 생후 10일된 돼지의 귀를 이용하였다. 먼저 외과용 메스를 사용하여 귀 양쪽변의 털을 제거하고 2% 크레졸 솜으로 귀 양쪽을 문질러 깨끗하게 소독하였다. 크레졸 솜으로 소독 후 70% 알콜솜으로 다시 한 번 소독하고 소독이 끝난 귀 조직을 2 x 2cm의 크기로 멸균 가위를 이용하여 채취하였다. 채취된 조직은 항생제를 포함하는 PBS로 2-3회 세척 후 DMEM(WelGENE), 15% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 15㎖의 배지가 들어 있는 50㎖ 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣고 4℃로 유지하여 실험실로 운반하였다. 운반된 조직은 이를 페트리 접시로 옮기고 남아있는 털을 제거한 후 70% 알콜에 1-2초간 침지하고 항생제가 포함된 PBS로 세척하였다. 이러한 과정이 끝나면 실제 현미경 하에서 다음과 같은 조작을 수행하였다.

구체적으로, 세척이 끝난 조직은 2㎖의 배지가 있는 페트리 접시로 옮겨 메스와 핀셋을 이용해 표피，연골 등을 제거하고 기저표피를 노출시키고 얻어진 조직은 안과용 가위를 이용하여 1mm 이하의 크기로 매우 작게 자르고 25㎖의 PBS로 3번 세척하였다. PBS를 제거한 후 조직을 0.1% 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 PBS-EDTA 25㎖과 함께 100㎖ 병에 넣어 2시간 동안 3 내지 4℃ 온도 하에서 배양하였다. 배양이 끝나면 25㎖의 배지를 넣어 트립신을 불활성화시키고 4㎛ 메쉬를 이용하여 세포 덩어리를 여과하였다. 회수된 세포액은 15㎖ 팔콘 튜브로 옮기고 900rpm에서 10분간 원심분리하여 상층을 제거한 다음 lO㎖의 배지로 세포를 현탁하였다. 회수한 세포는 6.5×10⁵ 세포수로 l0cm 접시에 접종하고 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 접종한 세포가 포화배양되면 계대배양하고 한 번의 계대배양을 거친 세포는 10% DMSO를 포함한 DMEM(WelGENE), 15% FBS, 100unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 동결보존액을 이용하여 동결하고, 그 다음 이를 액체 질소에 보관하였다.

미니돼지 섬유아세포의 배양은 15% defined FBS, 1 X 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 1 X 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 0.lmM 베타-멀캅토에탄올, 100 unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하고 있는 DMEM을 기본배지로 하여 배양하였다. 세포는 10cm 접시에 8 X 10⁵ 세포를 접종하였으며 3-4일 간격으로 계대하여 실험에 이용하였다. 또한 배양 접시는 젤라틴 피복된 접시 또는 플레이트를 이용하였다.

실시예 2-2: TALEN 활성 측정

돼지 HNF6 유전자의 엑손 1을 특이적으로 절단하는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 상업적으로 입수하였다(툴젠, 한국). 상기 TALEN은 각각 하기의 좌측 결합부위와 우측 결합부위를 포함하도록 구성되었다(도 5의 A). 도 5의 A는 본 발명에서 개발된 HNF6 유전자의 엑손 1부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위와 절단 부위를 나타내는 개략도이다.

좌측 결합부위: 5'-TGGCCTGCGAGACTCCCCCA-3'(서열번호 3)

우측 결합부위: 5'-TAAGGTGGTGTAGGTGGTGG-3'(서열번호 4)

상기 입수한 TALEN 활성을 T7 엔도뉴클레아제 분석으로 확인하였다.

먼저, 상기 실시예 2-1에서 배양된 미니돼지 섬유아세포를 90% 정도의 밀도를 가지도록 배양하고, EDTA-PBS로 1회 세척한 다음, 0.25% 트립신-EDTA를 처리하였다. 트립신-EDTA를 처리한 세포를 배양액으로 현탁한 다음, 800rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였고, 회수된 세포를 다시 F10 배양액으로 현탁하였다. 그 다음, 이 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 세척하였다. 이렇게 회수된 세포는 1.25 X 10⁷ 세포/㎖가 되도록 현탁한 다음, 천기천공법에 이용하였다.

이어, 원형 left TALEN 플라스미드 5㎍ 및 원형 right TALEN 플라스미드 5㎍을 100㎕ FlO 배지에 융해한 후 세포 현탁액 400㎕(5 X 10⁶ 세포)와 혼합한 다음 4mm 갭 큐빗에 세포 벡터 혼합액을 넣었다. Transfection을 위하여 위에서 준비된 큐빗을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 200 1)에 장착한 다음 450V, 4 pulses, 1ms 조건에서 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후 큐빗을 얼음 위에 10분 동안 방치한 다음 배양액으로 현탁한 다음 10cm dish 에 분주하여 배양하였다. 24 시간 후 일부를 30℃ 배양기로 옮겨 24시간 배양하였다. Transfection 48 시간 후 10cm dish에 있는 세포로부터 genome DNA를 회수한 후， 돼지 HNF6 유전자의 엑손 1 의 TALEN 이 특이적으로 결합하는 부분을 PCR 수행하여 확보하였다. TALEN 절단부위 왼쪽으로 235bp 떨어진 부분의 HNF6 Toolgen TALEN S 프라이머, TALEN 절단부위 오른쪽으로 362bp 떨어진 부분의 HNF6 Toolgen TALEN AS 프라이머와 PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC buffer를 이용하여 95℃ 30초, 64℃, 66℃, 68℃ 30초 및 72℃ 1분의 조건으로 33cycle 동안 수행하였다. PCR 수행 후 DNA의 증폭 여부는 전기영풍 후 DNA band로 확인하였다.

HNF6 Toolgen TALEN S primer: 5'-CCATGAGCCGGTGCCTGCCCCAGCCGACTT-3'(서열번호 11)

HNF6 Toolgen TALEN AS primer: 5'-GCTTCGAAGCCGTTGGGGGTGAGCATCTTG-3'(서열번호 12)

PCR 산물은 QIAquick PCR Purificatio kit 및 QIAquick Gel Extraction kit를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 1M Tris-HCl(pH8.0), 2M KCL, 1M MgCl₂을 이용하여 제조된 Hybridization buffer에 혼합한 후, Biooner의 MyGenie96 Thermal Block 기계에서 다음과 같이 혼성화를 실시하였다. 혼성화의 온도 조건은 95℃ 10분, 85℃ 1분, 75℃ 1분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분, 25℃ 1분으로 실시하였다. 혼성화 실시 후 T7 Endonuclease 2unit을 넣은 후 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. PCR 수행 후 DNA 절단 여부는 전기영동 후 DNA band로 확인하였다(도 5의 B).

도 5의 B는 TALEN 활성을 T7 endonuclease 분석에 의하여 실시한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동사진이다.

도 5의 B의 좌측그래프는 mRFP, TALEN target DNA, eGFP가 eGFP 앞에서 stop 될 수 있는 out frame으로 연결된 유전자가 CMV 프로모터에 의하여 발현될 수 있는 벡터를 TALEN과 같이 293T 세포에 도입한후 eGFP와 mRFP을 Flow cytometry로 분석한 결과를 나타낸다. TALEN에 의하여 target DNA가 절단되지 않으면 mRFP+, eGFP- 세포로 확인되며, target DNA가 절단되면 indel 현상에 의하여 inframe 상태가 되어 mRFP+, eGFP+ 세포로 확인되어 target DNA가 절단되었음을 나타내므로, 17.8%의 세포에서 indel 현상이 발생하였다고 분석되었다.

도 5의 B의 우측 사진은, 37℃와 30℃에서 배양한 세포에서는 T7 endonuclease에 의하여 절단된 362bp와 235bp가 확인되었으며 NC(normal control)에서는 TALEN이 처리되지 않았으므로 T7 endonuclease에 의하여 절단되지 않았음을 나타내는 전기영동사진이다. TALEN을 돼지 섬유아세포에 도입한 후 TALEN target 부위를 PCR로 증폭한 다음 DNA 변성 후 재생을 유도하면 TALEN 절단 후 indel 현상이 일어난 부위와 그렇지 못한 부위(정상 염기배열)들이 완전한 상보적 결합을 유도하지 못하여 쉽게 T7 endonuclease에 의하여 절단 될 수 있다.

실시예 2-3: Targeting vector 의 transfection 및 선별

먼저, pMCDT-HNF6 KO vector의 단독 도입시에는 Notl으로 절단하여 직선화된 pMCDT-HNF6 KO vector lO ㎍을 100㎕ F10 배지에 현탁시키고, 세포 현탁액 400㎕(5 X 10⁶ 세포)와 혼합한 다음 4mm 갭 큐빗에 세포 벡터 혼합액을 넣었다.

한편, pMCDT-HNF6 KO vector와 TALEN 의 동시 도입은 Not1으로 절단하여 직선화된 pMCDT-HNF6 KO vector 5㎍, 원형 left TALEN 플라스미드 2.5㎍, 원형 right TALEN 플라스미드 2.5㎍을 100㎕ FlO 배지에 현탁시키고, 세포 현탁액 400㎕(5 x 10^6 세포)와 혼합한 다음, 4mm 갭 큐빗에 세포-벡터 혼합액을 넣었다.

상기 준비된 각 큐빗을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001) 에 장착한 다음 450V, 4 pulses 및 1 ms 조건에서 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후, 큐빗을 얼음 위에 10분 동안 방치하고, 배양액으로 현탁한 다음 48웰 플레이트에 800 세포수가 되도록 분주하여 배양하였다. 벡터를 세포에 도입한 다음 48시간 후 300㎍/㎖의 G418로 12 일간 선별하였다. 특히, 본 선별 과정 중에는 15% FBS, 1X 비필수아미노산(non-essential amino acid), 1x β-mercaptoethanol, 100Unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 배지로 이용하였다. 선별된 콜로니는 트립신 처리에 의하여 24웰 플레이트에서 계대 배양하고, 3 내지 4 일후 세포가 포화배양되면, 12웰 플레이트에서 계대배양하였으며, 동일한 방법으로 6웰 플레이트, 60mm 배양접시 및 100mm 배양접시 순으로 계대 배양하고, 이를 동결 보존하였다.

실시예 2-4: 도입된 세포의 PCR 분석

Targeting 이 일어난 세포의 동정은 2단계로 실시하였다.

먼저, PCR에 의한 1 단계 동정은 G418 에 내성을 가지는 콜로니를 선별한 다음 24웰 플레이트에서 12웰 플레이트로 계대할 때 0.5㎖ 튜브에 1/5 의 세포를 취하여 PCR을 수행하였다. 0.5㎖ 튜브에 있는 1/5 의 세포 현탁액으로부터 10000rpm 및 4℃에서 lO분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 분석 전까지 -20℃에 보관하였다. PCR에 이용하기 위하여 각 튜브에 50mM NaOH 36㎕를 넣고 잘 혼합한 다음, 95℃에서 10분간 처리한 후, 1M Tris-HCI 4㎕을 넣고 DNA을 중화 시켰다. 이렇게 처리된 튜브는 10000rpm 및 4℃에서 1O분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 회수한 상층액 2㎕을 이용하여 1차 PCR을 수행하였다. HNF6 유전자가 targetmg 된 세포의 검증을 위한 1차 PCR은 Neo 3-1 프라이머와 HNF6 Sc AS3 프라이머와 TOYOBO KOD SYBR qPCR Mix를 이용하여 Agilent Technologies 의 Stratagene Mx3000P real-time PCR 기계를 사용하여 실시하였다. 이때, PCR 조건은 98℃ 10, 63℃ 10초 및 68℃ 4분의 조건으로 40cycle 동안 수행하였다.

Neo 3-1 primer: 5'-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT-3'(서열번호 13)

HNF6 Sc AS3 primer: 5'-TCAGTCTGTCTTTCCAGGGGTTGATAGGCC-3'(서열번호 14)

PCR 수행 후 DNA 의 증폭 여부는 CT 값과 전기영통 후 DNA band로 확인하였다.

2차 PCR은 1차 PCR에서 양성으로 확인된 콜로니를 계대배양하여, 10cm 디쉬에 있는 세포로부터 게놈 DNA을 회수한 다음 실시하였다. 게놈 DNA는 페놀/클로로포름을 이용하여 회수하고, 회수된 게놈 DNA를 이용한 2차 PCR은 3'arm PCR, 5'arm PCR과 상동유전자 재조합이 일어난 대립유전자와 그렇지 않은 대립 유전자를 구별하기 위한 Long PCR을 실시하여 상통유전자 재조합이 일어난 세포를 검증하였다.

3'arm PCR은 50ng의 게놈 DNA을 이용하여 l차 PCR과 동일하게 실시하였다.

5'arm PCR은 lOng의 게놈 DNA을 이용하고 5' 상동영역 밖에 있는 HNF6 5' Sc Sl 프라이머와 Neo 5'-2 AS 프라이머를 이용하여 실시하였다. 이때, PCR 조건은 FX Neo polymerase 을 이용하여 98℃ 10초, 65℃ 30초 및 68℃ 1분의 조건으로 33cycle 동안 수행하였다. PCR 수행 후 DNA의 증폭여부는 전기영동을 통해 확인하였다.

HNF6 5' Sc Sl primer: 5'-TGATTTTCAAATCTGGAGGCTTCTCACAGG-3'(서열번호 15)

Neo 5'-2 AS primer: 5'-TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGG-3'(서열번호 16)

Long PCR은 lO ng의 게놈 DNA을 이용하고 5' 상동영역 밖에 있는 HNF65' Sc Sl 프라이머와 3' 상동영 역 밖에 있는 HNF6 Sc AS2 프라이머를 이용하여 실시하였다. 이때, PCR 조건은 FX Neo polymerase을 이용하여 98℃ 10초 및 68℃ 3분의 2단계 조건으로 33cycle 동안 수행하였다. PCR 수행 후 DNA의 증폭여부는 전기영동을 통해 확인하였다.

HNF65' Sc Sl primer: 5'-TGATTTTCAAATCTGGAGGCTTCTCACAGG-3'(서열번호 17)

HNF6 Sc AS2 primer: 5'-ATTTGCACCTCTTCCTTGCATCCCCCTAGC-3'(서열번호 18)

본 발명에서 제작된 넉-아웃 벡터 단독 또는 TALEN을 함께 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 효율을 측정하였다(표 1).

넉-아웃 벡터를 돼지 체세포에 도입하고 넉-아웃된 세포를 동정한 효율

TALEN	전이세포수	G418 저항 콜로니의 수	PCR로 분석한 G418 저항 콜로니의 수	1차 PCR에서 양성을 나타내는 콜로니의 수
-	5 X 106	93	85	31(36.4%)
+	5 X 106	166	150	75(50%)

상기 표 1에서 보듯이, 넉-아웃 벡터만 단독으로 도입된 세포 중에서 넉-아웃된 것으로 확인된 세포는 약 36.4% 정도인 반면, 넉-아웃 벡터 및 TALEN이 함께 도입된 세포 중에서 넉-아웃된 것으로 확인된 세포는 약 50% 정도임을 확인하였으므로, 넉-아웃 세포를 제조할 경우에는, 넉-아웃 벡터와 TALEN을 함께 도입함이 바람직함을 알 수 있었다.

상기 넉-아웃 여부를 확인하기 위하여, 넉-아웃된 세포에서 3'arm 영역을 PCR 방법으로 확인하였다(도 6). 도 6은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포의 3'arm PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C)이다. 도 6에서 보듯이 3'arm 영역이 넉-아웃 세포에서 상동 재조합 되었음(2.8kb)을 알 수 있었다.

또한, 동일한 방법으로, 넉-아웃된 세포에서 5'arm 영역을 PCR 방법으로 확인하였다(도 7). 도 7은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포의 5'arm PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C)이다. 도 7에서 보듯이 5'arm 영역이 넉-아웃 세포에서 상동 재조합 되었음(1.4kb)을 알 수 있었다.

또한, 동일한 방법으로, 넉-아웃된 세포에서 넉-아웃된 대립유전자와 넉-아웃 되지 않은 대립 유전자를 PCR 방법으로 확인하였다(도 8). 도 8은 본 발명에서 제작된 넉-아웃세포에서 넉-아웃된 대립유전자와 넉-아웃 되지 않은 대립 유전자를 PCR 동정하는 방법을 나타내는 개략도(A 및 B) 및 결과를 나타내는 전기영동 사진(C 및 D)이다. 도 8에서 보듯이, 상동 유전자 재조합이 일어난 대립유전자는 5.39kb를 나타내고, 상동 유전자 재조합이 열어나지 않은 대립유전자는 4.52kb을 나타냄을 알 수 있었다.

끝으로, 대표적인 넉-아웃 세포의 염색체를 분석하였다(도 9). 도 9는 본 발명의 방법으로 제조된 넉-아웃 체세포의 염색체를 확인한 사진이다. 도 9에서 보듯이, 상기 넉-아웃 세포는 모두 정상적인 염색체를 포함하고 있으므로, 상기 넉-아웃 세포는 HNF6 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 형질전환 돼지 및 인간 맞춤형 장기 생산용 돼지의 제작에 사용할 수 있는 것으로 분석되었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Porcine HNF6 gene targeting vector and uses thereof <130> KPA140395-KR <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1019 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'arm <400> 1 gcggccgcgg ttgtccggtc aacagtggca agattgacca aggcctttga gatatttgct 60 cccctccccc cgcaaaaggc caaacatctg aagatgggga gagcgtggac tcctagaagc 120 cctcccatga aataggccag ggtgcaaaga gtgatgacac aagctgaggc tccccaggca 180 accccaaccg ggagacagcg actggtaaga ggggcgatgg ctctctaggc atagtgcgcc 240 accagggatg ctagcccagc aagtgcgggc gggggctggg aggagagccc acacaggcga 300 gggatcctag agtaatccaa gtttcccggg gttgcggtgg cagtcccagg tcgcgctcta 360 cgttaggcac tcgcacgtgc gcgtcgctcc ctccgccccc ggctgggcac ctctggtaag 420 gccccccccc ccgcccaact tcatttgtta ggggacgtca ccggttgttg gctctgggac 480 tgagggggcg gggccgatcc gtgcgcctgc gcgctgcgcc cagctggcgg gagggcgggc 540 cgcggcggct gtggcggcgg cggcggcggc ggcggcggaa cagcggccac agagtctgca 600 acagtaaccg agccatggct ggagctggcc agcggtgcgg gcaggcagca gccgcggaag 660 gcgcgcgggc tgcgtcaggg gagccggggg cttcacaatt ctaagaagga gaggggtgag 720 agggggccgg ggcgggtggg ctgggggcac tgagctcgcc caactgcgcg gatccttttt 780 ggaaattaat atttttttaa aaaaataaaa aaaaccgcgg aggacgcaga ggggaaggtg 840 ggggcaagag ggacggcgag actcactgag agggaaacag ccccacagtg agaggaaaga 900 aggaaggcaa cagtcgctag cagccgatgt gaagaccgga ctgcgtgccc cttcgccgcc 960 tctgcccggc ctcatcgatg ttgtgtccgc agcccgctcg ccgggatcac gatgaattc 1019 <210> 2 <211> 2443 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'arm <400> 2 aagcttcctc catgaataac ctctataccc cctaccacaa ggacgtggcc ggcatgggtc 60 agagcctctc gcccctctct gggtctggtc tgggtggcat ccacaactcc cagcaagggc 120 tcccgcacta tgcccaccca ggcgccgcca tgcccaccga caagatgctc acccccaacg 180 gcttcgaagc ccaccacccg gccatgctcg gccgtcacgg ggagcagcac ctcacgccca 240 cctcggccgg catggttccc atcaacggcc ttcctccaca ccacccccac gcccacctga 300 acgcccaggg ccacgggcaa ctcttgggca ccgcccggga gcccaaccct tcggtaaccg 360 gtgcgcaggt cagcaatgga agtaattcag ggcaaatgga agagatcaat accaaagagg 420 tggcgcagcg tatcaccacc gagctcaagc gctacagcat cccacaggcc atcttcgcgc 480 agagggtgct ctgccgctcc caagggaccc tctcagacct gctgcgcaac cccaaaccct 540 ggagcaaact caagtctggc cgtgagacct ttcggagaat gtggaagtgg ctgcaggagc 600 cggagttcca gcgcatgtct gcgctccgct tagcaggtga gctggccaag gagctgggca 660 catgggggga taaggtattg gggaagctga aggcacctaa ggaggcaggg aaagagagag 720 atctgtgcat gcttcactcc ccgagagggg gtccctgggg ctggaagagc cagagcatgg 780 cttctgggag cagacatctt cttccagatt tcagtgcatt ggggtgtaga agggtccagg 840 agctgagtgg cactacgtgt ctgattctgg gggcgcattt gtgctggaga tagcgcagga 900 agctctctca cgacaggcga gaaatccccg cacctggcta gtcacggtct gtgtatccct 960 tctgggttga gcactccagg tttggggaga gggaggcgat gcttgcgtgg aaatgtgcat 1020 aggtgctact aatcagtatt cctggcaaat aaccgggcgc tgggttgaag cgcgcaggag 1080 ctgcccgcaa atatttggct gaactcgctg cagtgaccgc caccccctcc cggggtcact 1140 ttagcggcgc cgggttagag ttggaggagc tggcggtggg tactctggga gttccagcaa 1200 aatattccaa agccgcgcgg ctgtgggtgt atggagcgga cgctttgtaa gggttagaac 1260 acactctgcg tttgtgaccc gctgtagaga gcgaggcgga ccgtgtcaag gtccaggtga 1320 gggcggcgaa gcaacaaggg aacttccagc tgagcccagg gaccgccttc gctaccgact 1380 cgcctagcac gtcgcatctt gttttatttc tctgcatgaa ttcttgtctg aatccccatg 1440 cagggggtag agtgtgggga aagaaaaaag tctgcgaacc gaagtctcca gtgccccaaa 1500 ctccgaggcc ctgacatttc cgagttgggc gggaaggtaa cggcggcgct gcatagacac 1560 agcgctcagc tcccccagcc tctctggtac tgggaagctc ccagactaag gtactggaaa 1620 ggttctggcc cgccgactga cggaggggac aaatgagccc agcctgaatc acactgggga 1680 ttttaagcag attcggcgac tccctagagt ggaggacaag cggaaaggta gagccaaggg 1740 caacccaggt gtactcggtt tgatgatatc cgagctgagt tgattgactc ctgaatacat 1800 gcagccgcct tcccgccact gtcgtccacc ccccaccctc gccccagccc caacccaatc 1860 tcaactcggc gccctagact gagtcctggc aaagagaaag gtaaaagccg gaatgagggt 1920 ttgttaatta actgatcgtt ctccattaat tcgtccctag agaacgagag acagtcaatc 1980 cgctcagagc cgggggcact gagccgtttc acagtctaaa atcaaagcga gagtccaggg 2040 tcccctcccc cacctcgtgc tggccaatga gaaaccagag ggaggcaggt gccggcgtgc 2100 ctgcgagcct gcgactccaa gcccgctaag acccaaacca ctcctggggt ctgggttcct 2160 gtggcctccc tgcccaagcg ccgcactcgc tgaatctctt cctcgccagg ttttctagcc 2220 cagccccgag cttgatggct ccaagcgaag tctccatgcg gactcttgca gcctgcgcct 2280 agaagccagg agaagcaggg ataaggagac agcaggggaa aggaagaggt taacggtgta 2340 ccctctgggg ctcccgcaat tccactctag ctctgtgcac ggccaccaga tcgtgcccta 2400 ccctaagggt tgactaagac ccgaaaacag ctgaagcctc gag 2443 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> left binding site <400> 3 tggcctgcga gactccccca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> right binding site <400> 4 taaggtggtg taggtggtgg 20 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 TALEN 5' NotI S primer <400> 5 gcggccgcgg ttgtccggtc aacagtggca agattgac 38 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 TALEN 5' EcoRI AS primer <400> 6 gaattcatcg tgatcccggc gagcgggctg cggaca 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 HindIII 3'arm S2 primer <400> 7 aagcttcctc catgaataac ctctataccc cctacc 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 XhoI 3'arm AS primer <400> 8 ctcgaggctt cagctgtttt cgggtcttag tcaacc 36 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S primer <400> 9 ggatcctacc gggtagggga ggcgcttttc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS priemr <400> 10 cccgggcctc agaagaactc gtcaagaagg 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 Toolgen TALEN S primer <400> 11 ccatgagccg gtgcctgccc cagccgactt 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 Toolgen TALEN AS primer <400> 12 gcttcgaagc cgttgggggt gagcatcttg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo 3-1 primer <400> 13 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 Sc AS3 primer <400> 14 tcagtctgtc tttccagggg ttgataggcc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 5' Sc Sl primer <400> 15 tgattttcaa atctggaggc ttctcacagg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo 5'-2 AS primer <400> 16 tgctaaagcg catgctccag actgccttgg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF65' Sc Sl primer <400> 17 tgattttcaa atctggaggc ttctcacagg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF6 Sc AS2 primer <400> 18 atttgcacct cttccttgca tccccctagc 30

Claims (13)

1. (a) 돼지 HNF6 유전자 엑손 1의 일부를 1 내지 6kb 의 길이로 포함하는 제1 핵산영역;
   (b) 선별마커(selection marker) 유전자 카세트; 및
   (c) 상기 HNF6 유전자의 엑손 1의 일부분 및 인트론 1의 일부분을 2 내지 3kb 길이로 포함하는 제2 핵산 영역을 포함하는, 돼지 HNF6 유전자 타켓팅 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1 핵산영역은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 선별마커 유전자 카세트는 양성 선별마커, 음성 선별마커 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 벡터.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 양성 선별마커는 네오마이신(Neomycin: Neo), 하이그로마이신(hygromycin : Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinoI dehydrogenase gene: hisD), 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphoribosyltransferase: Gpt) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 음성 선별마커는 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin) , 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase: Hprtl), 사이토신 디아미네즈(cytosine deaminase) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 제2 핵산영역은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 HNF6 유전자 타겟팅 벡터를 분리된 돼지의 체세포에 도입하여, 상동재조합을 유도하는 단계를 포함하는, HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 돼지의 체세포에 HNF6 유전자 엑손 1을 타겟팅하는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 TALEN은 돼지 HNF6 유전자 엑손 1에 존재하는 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오티드에 결합하여 절단하는 것인 방법.
   
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 체세포를 핵이 제거된 돼지 난자에 도입하여 제조된, HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란.
    
11. 제10항의 HNF6 유전자가 넉-아웃된 돼지 수정란을 돼지에 착상시키는 단계를 포함하는, HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지의 제조 방법.
    
12. 제11항의 방법으로 제조되어, HNF6 유전자가 넉-아웃된 형질전환 돼지.
    
13. 제12항에 있어서,
    사람 맞춤형 췌장 생산에 사용되는 것인 돼지.
    

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