KR100905709B1 - ｈＧＭ―ＣＳＦ를 생산하는 형질전환된 복제 산양 및 이의제조방법 - Google Patents
ｈＧＭ―ＣＳＦ를 생산하는 형질전환된 복제 산양 및 이의제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자), 바람직하게는 사람의 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(hGM-CSF)를 유선에서 생산하는 형질전환 복제 산양 및 그의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 1) 산양 의 태아 또는 암컷 산양으로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자)유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 어미 산양으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 생산하는 형질전환 복제 산양 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 형질전환 복제 산양은 기존 방법의 후-번역수정(post-translational modification) 또는 대량 생산 등의 문제점을 극복할 수 있으며, CSF 단백질을 유선에서 생산함으로써 쉽게 획득할 수 있는 이점과 함께 이를 백혈병 치료 보조제 및 면역 강화제 등으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
hGM-CSF, 형질전환된 복제 산양
Description
도 1은 본 발명에서 이용된 pBC1 유 발현 벡터(Milk Expression Vector)의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 2는 인간 GM-CSF의 유선(mammary grand) 특이적 발현을 하는 재조합 발현 벡터 pBC/neo-hGM-CSF의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 3은 형질전환된 HC11 세포주에서 도입된 hGM-CSF 유전자(transgene)의 RT-PCR 결과이고,
M: 마커(Marker);
1: RT-PCR 양성 대조군;
2 : 비형질전환 HC11 세포주에서의 G3PDH;
3~6 : 형질전환 HC11 세포주에서의 G3PDH;
7 : 비형질전환 HC11 세포주에서의 hGM-CSF;
8~11 : 형질전환 HC11 세포주에서의 hGM-CSF,
도 4는 마우스 HC11 세포주에서 hGM-CSF의 유선 특이적 발현을 나타내는 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 나타낸 것이고,
Mock : 비-형질전환 대조군(non-transgenic control) HC11 세포;
GM-CSF : 형질전환 HC11 세포,
도 5는 hGM-CSF 및 NEO의 PCR 스크린 결과이고,
M : 마커;
1 : 양성 대조군;
2 : 음성 대조군;
3~10 : 샘플,
도 6은 공여세포가 산양의 태아 세포인 경우, hGM-CSF의 서던 블랏(Southern blot) 결과이며,
M : 마커;
P : 양성 대조군;
N : 음성 대조군;
1: 클론번호 1-1;
2 : 클론번호 1-3;
3 : 클론번호 1-5;
4: 클론번호 1-6;
5 : 클론번호 1-24;
6 : 클론번호 1-31;
7 : 클론번호 1-47;
8 : 클론번호 1-64,
도 7은 공여세포가 암컷 산양의 귀세포인 경우, hGM-CSF의 서던 블랏(Southern blot) 결과이며,
M : 마커;
P : 양성 대조군;
N : 음성 대조군;
1: 클론번호 4-24;
2 : 클론번호 4-25;
3 : 클론번호 4-57;
4: 클론번호 4-58;
5 : 클론번호 4-59;
6 : 클론번호 4-70;
7 : 클론번호 4-79;
8 : 클론번호 4-83;
9 : 클론번호 4-84;
10 : 클론번호 4-85
도 8은 본 발명에 따른 형질전환 복제 산양의 조직에서 hGM-CSF유전자가 도입되었음을 확인하는 PCR 결과이고,
M ; 마커(Marker);
1 : 플라즈미드 DNA;
2 : 핵이식에 사용된 체세포;
3 : 대리모(surrogate mother);
4 : 정상의 낙농 산양;
5 : D.W;
6 : 형질 전환 산양,
도 9는 본 발명에 따른 형질전환 복제 산양과 핵 이식에 사용된 체세포가 동일한 개체인지를 확인하는 PCR-SSCP 분석 결과이고,
도 10은 hGM-CSF를 유선에서 생산하는 형질전환된 복제 산양의 사진이다.
본 발명은 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자), 바람직하게는 사람의 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(hGM-CSF)를 유선에서 생산하는 형질전환된 복제 산양 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) 산양의 태아 또는 암컷 산양으로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor , 세포집락 자극 인자)유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 어미 산양으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 수정란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 산자를 출산 하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 생산하는 형질전환 복제 산양 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
생물 형질전환 기술은 동식물의 개량, 생산성 향상 및 산업 의학적으로 유용한 산물을 얻기 위하여 외래 유전자를 인위적인 방법으로 생물의 염색체상에 전이시켜 발현시키는 기술과 내인성 유전자의 과발현을 유도, 조작하는 기술 및 염색체상의 특정 유전자의 기능을 삭제함으로써 그 유전자의 발현에 따른 표현형의 변화와 유전자의 기능을 규명하는 등의 일련의 기술을 총칭한다. 생물체에 외래유전자를 전이하는 기술은 형질전환 동물의 경우, 수정란에 미세주입기를 통한 미세주입방법, 여러 가지 형태의 바이러스를 이용하는 방법, 전자기장을 이용하는 방법, 지질 등의 화합물을 이용하는 방법 등 추구하는 목적에 따라 이용방법이 다양하다. 외래유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 따라 특정 조직, 즉 유선, 간, 혈액 등에 국한되게 발현시키거나 생물체의 발달 단계에 따라 외래유전자의 발현 유도가 가능하다. 동물에서의 형질전환 이용분야는 많은 연구결과에 의해 실용화 단계에 있으며, 특히 형질전환된 복제 동물은 가축의 개량 및 신품종 창출, 가축에 있어 다발하는 질병에 대한 내병성 향상, 가축에서 얻을 수 있는 부산물의 질 향상, 질환 모델 동물 생산, 사람의 질병 또는 재해로 인한 장기의 손실을 대체해 줄 수 있는 장기생산동물 개발, 생체 반응기(bioreactor) 시스템을 통한 유용물질 생산 등에 이용되고 있다.
복제(cloning)는 유전적으로 동일한 개체를 만드는 것을 말하는데, 핵이식( nuclear transfer)은 진핵생물에 있어서의 복제의 한 방법으로 최근 분자생물학의급격한 발달로 새로이 주목받게 된 기술이다. 초기의 핵이식은 핵의 공급원으로 수정란의 할구를 이용하였으나(Prather, et al., Biol. Reprod., 1987, 37:856-866; Prather, et al., Biol. Reprod., 1989, 41:414-418), 최근에는 체세포의 핵을 이용하게 되었다. 체세포 복제는 분화된 체세포를 핵이 제거된 난자에 넣어 활성화시킨 다음에 일반 수정란과 동일한 방법으로 발생시키는 기술이다. 이와 같은 복제기술은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야의 연구에 널리 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등 다양한 의학 및 의약 분야에 크게 기여할 것으로 예상되어 그 산업적 유용성이 매우 크다고 할 수 있다. 즉, 상기와 같은 기술을 이용한 생산 시스템은 경제성이 매우 높아, 현재 고가로 판매되는 생리활성 물질을 저렴하게 공급할 수 있을 뿐만 아니라, 인체와 생리학적으로 가장 가까운 동물 자체를 생리활성물질 생산 시스템으로 활용하기 때문에 고품질의 생리활성물질을 생산할 수 있고, 동물의 생체 내 단백질 생산 시스템을 활용하기 때문에 대량 생산이 가능하고, 특히 섭취 백신과 같은 의약품 개발은 별도의 정제과정이 필요하지않는 등의 이점이 있다. 그러나, 이를 실현하기 위해서는 먼저 목적으로 하는 유전자의 확보가 선행되어야 하며, 발현의 정도와 부위를 결정하기 위해 조직 특이적 프로모터의 확보가 필요하다. 또한 동물의 경우에서는 배발생 단계에서 유전자를 이식해야 하므로 수정란의 배양 및 외래 유전자 핵내 미세 주입기술이 필수적이다. 그리고 외래 유전자가 주입된 수정란을 대리모에게 이식하는 기술이 요구되며, 여기서 태어난 산자에 대해서 염색체상에 외래 유전자 삽입 여부와 발현 정도를 검정하는 기술이 필요하다.
유산양은 유전자 이식기술 확립이 필요한 중요한 형질전환동물이다. 수많은 종류의 동물들이 제조합 단백질을 생산하기 위하여 형질전환 연구에 사용되고 있다. 외래 유전자의 발현을 위하여 사용되는 동물의 선택은 필요한 단백질의 양뿐만 아니라 번식적 효율 등의 특징들에 의하여 결정된다. 생쥐의 경우 형질전환군(founder)을 형성하기 전 재조합 벡터의 효율적인 발현을 위한 최적화가 가능하나, 매우 한정된 생쥐의 우유 생산량은 ㎎ 수준의 재조합 단백질의 생산에 부적합하다. 표 1에서와 같이 젖소가 우유생산량에서는 최고이지만 성성숙일령, 임신기간, 산자수, 형질전환율 및 사양관리 측면을 고려하면 동물 생체반응기(Animal Bioreactor)로서 적합하지만은 않다. 유산양의 평균 착유 기간은 300일이며, 평균 유량은 소 다음으로 많은 약 600-800리터이다. 소의 경우 최초 착유 시까지 약 3년의 시간이 필요하나, 유산양의 경우 약 16-18개월로 상당히 짧은 장점이 있다. 또한 연간 2회 번식이 가능하고 작은 체구로 사양관리가 용이하다. 이러한 유산양의 장점은 형질전환 방법에 의하여 생산되는 치료용 단백질의 수요에 따른 형질전환 동물군의 조절이 용이함을 의미한다. 또한, 유산양에서 광우병(scrapie)의 발생율이 상당히 낮은 장점도 있다.
| 종류 | 성성숙 기간 (월) | 임신기간 (월) | 평균 산자수 | 총 산자수당 형질전환비율 (%) | 연간 산유량 (ℓ) |
| 생쥐 | 1 | 0.75 | 10 | 10-25 | 0.0015 |
| 토끼 | 6 | 1 | 8 | 5-15 | 1.5 |
| 돼지 | 8 | 4 | 9 | 5-15 | 120 |
| 면양 | 8 | 5 | 2 | 3-5 | 300-400 |
| 유산양 | 8 | 5 | 2 | 3-5 | 600-800 |
| 젖 소 | 15 | 9 | 1 | 0-3 | 10,000 |
산양의 경우도 기타 다른 동물과 형질전환하는 방법은 유사하지만 핵 이식 및 복제수정란의 이식에서 다른 동물과 다소 다른 점이 있다. 돼지, 소등의 경우 체외성숙, 체외 배양 등의 연구가 상당히 발달 되어있어 비교적 쉽게 이루어지지만 산양의 경우 핵 이식에 필요한 성숙난자를 얻기 위한 체외배양이 완전하지 않다. 따라서 생체내 난자를 사용할 수 밖에 없으므로 한번 실험을 하려면 반드시 호르몬을 통해 수란 산양의 발정을 동기화하고 외과적인 수술을 통하여 체내에서 성숙한 난자를 얻어야만 한다. 또한, 산양의 경우 위란강과 세포질 간격이 밀접하게 접해 있어 레이저 등에 의하여 천공을 하고 핵을 제거하는 어려움이 있다.
CSF(Colony stimulating factors, 세포집락 자극 인자)는 조혈모세포의 생존, 증식, 분화를 위해 필요한 당단백질이다. 혈구생성과정(hematopoiesis)을 촉진하는 사이토카인들은 골수의 전구세포에 작용하여, 특정한 세포의 분화 및 성장을 촉진하는 단백질 인자로서 발견되었다. 골수의 전구세포를 소프트 아가(soft agar)가 들어있는 배지에서 키우면서, 단백질 인자를 넣어주게 되면, 아가 위에 특정한 세포의 집단이 콜로니(colony)를 이루어 자라게 된다. 이러한 콜로니 중에 있는 세포를 조사하게 되면 넣어준 단백질이 그러한 세포 타입의 분화에 관여하는 것을 알 수 있다. 이와 같이 전구세포에 작용하여 특정한 세포 집단의 분화를 촉진하는 사이토카인을 CSF라고 부른다. 이러한 콜로니 자극 인자에는 과립구 CSF(G-CSF), 과립구-대식세포 CSF(GM-CSF), 대식세포 CSF(M-CSF), 인터루킨(IL-3 또는 multi-CSF) 등이 있다. 하지만, 전 세계적으로 G-CSF와 GM-CSF만이 재조합 치료용 단백질로 사용되고 있을 뿐이다. G-CSF와 GM-CSF는 내인(endogenous) 상태에서 다양한 당쇄화 양상을 보여주고 있다. 특히, GM-CSF의 염색체상의 위치는 IL-3과 나란히 연결되어 있으며, IL-4, IL-5 및 M-CSF와는 가깝게 존재한다.
상기의 CSF 중에 사람의 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(hGM-CSF)는 조혈모세포, 과립구, 대식세포, 적혈구 및 거대핵세포의 전구체 등의 증식, 분화 및 생존을 조절하는 중요한 조절자이다. hGM-CSF는 사이토카인, 면역 또는 감염 등으로 자극 받은 T 세포, B 세포, 대식세포, 비만세포, 내피세포 및 섬유아세포 등 다양한 세포에 의하여 생산된다.
G-CSF가 호중구와 이것들의 전구세포에 대하여 제한적인 작용을 하는 반면에 GM-CSF는 단핵구와 대식세포에 대한 많은 작용을 보여준다. 그러한 작용 중에는 파고사이토시스나 세포내 병원체를 죽이는 식균작용 등이 일부 관여한다. 또한, 직접적으로는 내독소나 다른 염증반응에 의해 발현되는 조혈성장인자(hematopoieti c growth factor(M-CSF & G-CSF))나 IL-6, IL-1, TNF 등의 유전자 발현을 항진시키거나, 이러한 것들을 발현하는 세포들의 염증 및 면역반응에 대한 참여를 촉진한다. 특히, GM-CSF의 여러 가지 작용들은 염증성 사이토카인(인터페론-γ)이나 조혈성장인자(M-CSF) 등과 함께 동반상승작용(synergy) 효과를 보인다.
최근에는 hGM-CSF를 치료의 목적으로 한 재조합 DNA 기술을 이용한 다양한 방법에 의하여 생산되고 있다. 효모와 조직세포배양(tissue culture system)방법은 현재까지도 가장 폭넓게 사용되고 있는 방법이다. 하지만, 효모에서의 적절한 해독 후 변형 과정(post-translational modification machinery)의 결여와 동물세포에 의한 대량 생산의 어려움 때문에 수요량을 충분히 충족시킬 수 없는 상황이다. 그래서 많은 연구자들이 형질전환동물을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 많은 노력을 기울여 왔으나 특히, 1980년 Gordon등에 의해 DNA 미세주입(micro injection) 방법이 개발되면서 동물의 형질전환 기술이 주목을 받았지만 많은 시간과 노력이 필요하고 특히 낮은 효율성이 문제가 되었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 저조한 수율에 대한 문제점들을 극복하고자 hGM-CSF 유전자를 포함하는 발현 벡터로 산양의 태아세포와 암컷 산양의 귀세포를 형질전환시킨 후 상기 형질 전환된 세포와 탈핵 난자를 융합시켜 복제란을 제조하고 상기 복제란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 hGM-CSF를 유선에서 생산할 수 있는 형질전환 복제 산양을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유선에서 hGM-CSF를 생산하는 형질전환된 복제 산양의 제 조 방법 및 상기 방법의 의하여 형질전환 복제 산양을 제공하는 것이다.
본 발명은
1) 산양의 태아 또는 암컷 산양으로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor , 세포집락 자극 인자)유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 어미 산양으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 산자을 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 생산하는 형질전환 복제 산양의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 유선조직에서 특이적으로 hGM-CSF를 발현하는 형질전환 복제 산양을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질 전환 복제 산양의 클론 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, "클론 세포주"는 유전체에 도입된 벡터의 위치가 동일한 세포주를 가리킨다.
또한, "위란강"은 난자의 투명대와 난세포질 사이의 공간을 가리킨다.
또한, "복제란"은 전기적 자극에 의하여 난자와 체세포가 융합된 단계를 가리킨다.
또한,“핵 이식”은 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하는 과정을 의미하며 , 이러한 과정에 의해서 수득된 세포를 “핵 이식란 또는 복제 수정란”이라고 한다.
또한,“산양의 유선 조직에서 기능한 조절 서열”은 산양의 유선 조직에서 조절 서열로서의 기능을 발휘할 수 있는 조절 서열을 의미하는데, 조절 서열에는 분비 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열, 프로모터, 인핸서 또는 업스트림 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자 등이 포함된다.
또한,“작동가능하게 연결된”한 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 상태를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 산양의 태아 또는 암컷 산양으로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자)유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 어미 산양으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 산자을 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 생산하는 형질전환 복제 산양의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 1)에 있어서, 산양의 태아는 임신 40-80일령의 태아인 것이 바람직하며, 임신 50-70일령의 태아인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 60일령의 태아를 사용하여 산양 체세포를 분리하였다.
상기 단계 1)에 있어서, 암컷 산양의 체세포는 귀세포인 것을 특징으로 한다. 상기 암컷 산양은 모든 연령대가 가능하며, 본 발명의 실시예에서는 3 산차 암컷 산양의 귀세포를 분리하였다.
상기 단계 1)에 있어서, 체세포를 분리하기 위한 방법은 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 면도날을 이용하여 유산양 태아의 조직과 암컷 산양의 귀조직을 잘게 자른 후 트립신을 처리하여 계대 배양함으로써 체세포를 분리하였다.
상기 단계 2)에 있어서, 유선 특이적 프로모터는 염소의 β-카제인 프로모터 (β-casein promoter)인 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터는 이에 한정하지 않으며, 소 αs1-카제인, β-락토글로불린 및 유청 산성단백질(whey acidic protei n) 등의 조절 서열과 같은 유선에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 프로모터는 모두 사용할 수 있다.
상기 단계 2)에 있어서, CSF는 사람의 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(hGM- CSF)인 것을 특징으로 한다. hGM-CSF(적어도 GM-CSF 유전자의 코딩 서열을 포함함 ) 유전자는 사람의 게놈 DNA를 주형으로, 공지된 사람 GM-CSF 유전자의 염기 서열을 참조하여 이들의 양 말단에 일정 염기 서열을 가진 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머를 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조하거나, 공지된 사람 GM-CSF 유전자의 염기 서열을 참조하여 화학적으로 합성하여 제조하는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)에 있어서, 발현벡터는 도 2의 개열지도로 표시되는 pBC/neo-hGM- CSF인 것을 특징으로 한다. 상업적으로 입수 가능한 벡터로서 pBC1 유 발현 벡터( Milk Expression Vector(Invitrogen))를 이용하여 재조합 발현 벡터로서 pBC/neo-h GM-CSF 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 발현 벡터는 hGM-CSF 유전자와 산양의 유선조직에서 기능하는 조절 서열을 작동 가능하게 연결하여 제조하거나, 상업적으로 입수 가능한 산양의 유선 조직에서 기능하는 조절 서열을 포함한 벡터를 이용하여, 그 벡터에 포함된 조절 서열에 hGM-CSF 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3)에 있어서, 클론 체세포는 상기 발현벡터를 체세포에 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated trans fection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid -mediated transfection), 총알식 도입(ballistic introduction) 방법으로 도입하는 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 형질도입 방법을 이용하였다.
상기 단계 3)에 있어서, 선별은 선별마커가 도입된 발현 벡터를 사용함으로써 용이하게 할 수 있다. 이러한 선별마커로는 항생제 내성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 항생제 내성 유전자에는 neor, pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 neor을 사용하였다. 본 발명의 실시예에서는 G418을 처리하여 hGM-CSF 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 체세포를 선별하였다. 상기 방법에 의하여 최종 확인된 클론 체세포주를 한국 세포주 연구 재단에 2007년 6월 1일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCLRF-BP-00159, KCLRF-BP-00160).
상기 단계 4)에 있어서, 난자는 통상의 방법에 따라 산양의 과배란을 유도하여 채취하는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 산양에게 프로게스테론을 일정기간(약 8일 동안) 투여한 후 수일 동안 프로스타글란딘 F2α(PGF2α, Prostaglandin F2α)와 여포자극호르몬(FSH, Follicle Stimulating Hormone)을 투여하고, 이어서 그 투여 기간이 완료되기 전에 인간 만성 성선자극호르몬(hCG, Human Chronic Gonadotropin)를 투여하는 방식으로 과배란을 유도하였으며, 과배란된 난자들 중 체내 성숙 난자는 난관 관류 방법에 따라, 즉 카테터(catheter)를 난관 누두부로 삽입하여 M2 배양액을 난관-자궁 접합부 쪽에서 주입하여 관류하여 회수하고, 배란이 되지 않은 난포란은 난소의 난포란으로부터 주사기 등을 이용하여 난포액과 난포란을 흡입하여 회수하였다. 회수된 난포란은 M2 배양액으로 세척하며, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 충실한 것을 선별하여 수핵 난자로서 이용하였다. 미 배란 난포란은 TCM-199, Ham's F-10 또는 M2 체외 성숙용 배 양액을 이용하여 체외 성숙시켰으며, TCM-199를 이용하고, 여기에 Hepes를 첨가하였다. 추가로 염소혈청(GS, goat serum), 황체형성호르몬(LH, Luteinizing Horm one), 에스트라디올 17-β, 여포자극호르몬(FSH) 등을 필요에 따라 첨가하는 것이 바람직하며, 실시예에서는 5%의 염소혈청(GS)을 첨가하였다. 체외 성숙용 배양액을 이용하여 약 5%의 CO2, 95% 이상의 습도, 37 내지 40℃의 배양기 내에서 11 내지 13 시간 정도 전 배양한 후 20 내지 22시간 동안 배양하여 체외 성숙시키는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 회수되고 필요에 따라 체외 성숙된 수핵 난자는 히알루로니다제로 처리하여 난구 세포를 제거한 후 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 후속되는 핵 이식에 이용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 4)에 있어서, 난자의 핵은 다음과 같은 방법으로 제거하는 것이 바람직하다. 상기 채취한 난자를 세포골격 저해제(cytoskeletal inhibitor)인 사이토칼라신 B(cytochalasin B)를 첨가한 M2 배양액으로 옮기고, 이어서 체세포를 주입용 피펫으로 흡입하고, 채취한 난자를 탈핵 및 주입용 피펫의 삽입을 용이하게 하기 위하여 레이저 등에 의하여 투명대를 천공(Park et al. Therio genology, 2001, vol.55, p.352)한 후 탈핵용 피펫을 위란강내로 진입시켜 극체와 세포질을 흡입하여 제거한 후 탈핵한 난자의 세포질이 제거된 공간에 체세포의 세포질을 부착되게 주입하는 것이 바람직하다.
상기 단계 4)에 있어서, 융합은 전기 세포 융합 장치를 이용하여 실시하는 것이 바람직하며, 융합 배지로는 만니톨 용액을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발 명의 실시예에서는 핵 이식란을 전기 세포 융합 장치의 챔버로 옮겨서 양 전극 사이에 일렬로 정렬하여 핵은 전극의 “+”극 쪽으로 향하게 하고 세포질은 “-”극 쪽으로 향하게 한 후 직류 전류를 2.2 내지 2.6 kV/cm의 세기로 10 내지 40㎲ 동안 통전하여 융합을 유도하였다. 이 과정을 추가로 2차례 더 반복하였으며, 약 1시간 후에 동일한 전기 자극을 가하고, 약 30분 후에 동일한 전기 자극을 가하여 핵과 세포질의 융합을 완료하였다. 상기 융합된 핵 이식란은 핵 이식 조작 후 M16 배양액에서 1 내지 10시간 동안 배양하는 것이 바람직하며, 1 내지 5시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다. 핵 이식란을 활성화시키기 위해서는 이오노마이신(iono mycin), 에탄올, 타이로드 용액(Tyrode's solution), 6-DMAP 및 퓨로마이신(purom ycin)과 같은 화합물을 이용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 이오노마이신으로 3 내지 7분 동안 처리하고, 이어서 6-DMAP로 3 내지 5 시간 동안 처리하였다.
상기 단계 5)에 있어서, 복제란은 변형된 합성 난관 액(mSOF, Modified synthetic oviduct fluid) 배양액을 이용하여 배 발달을 유도하는 것을 특징으로 한다. 상기 복제란은 변형된 합성 난관 액(mSOF, Modified synthetic oviduct flu id) 배양액에서 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 95% 이상의 습도, 35 내지 40℃에서 10 내지 24시간 동안 배양하면서 2~4 세포기로 발달을 유도하는 것이 바람직하다. 변형된 합성 난관 액(mSOF, Modified synthetic oviduct fluid) 배양액은 NaCl, KCl, NaHCO3, NaH2PO4, CaCl2, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 글루타민 등으로 이루어지나 이에 한정하는 것은 아니 다.
상기 단계 5)에 있어서, 수란 산양(대리모)은 프로게스테론을 일정기간(약 8일간) 투여하고, 이어서 임마혈청성성선자극호르몬(PMSG, Pregnant Mare Serum Gonadotropin)와 프로스타글란딘 F2α(PGF2α, Prosta glandin F2α)를 병용 투여한 후 사람융모성성선자극호르몬(hCG, Human Chronic Gonadotropin)를 투여하여 발정을 유도하는 것을 특징으로 한다. 그 외 hCG만을 투여하여 발정을 유도하거나, 자연 발정이 온 개체를 수란 산양으로 이용할 수도 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 단계 5)에 있어서, 이식은 외과적인 방법으로 실시하는 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 상기 발정된 산양을 통상의 방법에 따라 마취시키고 복정중선을 절개한 후 카테터(catheter)를 이용하여 2~4 세포기 단계의 복제 수정란 2~16개를 난관 누두부로 주입함으로써 수정란의 이식을 완료하였다. 임신 진단은 발정일로부터 60일째에 초음파 임신 진단기로 임신진단을 실시하고, 발정 제 60일에 각각 혈중 프로게스테론 농도를 측정하여 3ng/ml 이상인 경우에 임신으로 확증하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 유선조직에서 특이적으로 CSF를 발현하는 형질전환 복제 산양을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질 전환 복제 산양을 생산하기 위한 클론 세포주를 제공한다.
본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 산양 체세포에 CSF 유전자로서 hGM-CSF 유전자를 효율적으로 주입하여 hGM-CSF를 발현하는 산양 클론 체세포주를 선별하고, 이를 핵이 제거된 산양 난자에 이식하여 hGM-CSF를 유선 특이적으로 발현하는 형질전환 복제 산양를 제조하였다.
따라서, 본 발명에 의하여 hGM-CSF를 산양의 유선을 통하여 대량생산하고 산양을 이용하여 인간과 유사한 당화 형태의 단백질을 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 이를 위하여, pBC1 유발현 벡터 키트(Milk Expression Vector kit, Invitroge n , USA)을 이용하여 산양의 유선에서 hGM-CSF를 발현할 수 있도록 유도하였다. h GM-CSF를 발현하는 형질전환 세포주 개발을 위하여 pBC1 벡터를 변형하여 pBC1/ne o-hGM-CSF를 제작하였고, 이를 선형화(linearlization)하여 체세포에 트랜스펙션 하였다. 이때, 인간 게놈에서 PCR을 통하여 얻은 hGM-CSF 유전자의 ORF(Open read ing frame)를 증폭하였고, 염기서열 분석(sequencing)을 통하여 염기서열이 게놈 유전자와 100% 일치하는 것을 사용하였다. 또한, 완성된 pBC1/neo-hGM-CSF 벡터가 효율적으로 발현하는지 확인하기 위하여 생쥐의 유선 세포에 트랜스펙션 하였고, R T-PCR과 웨스턴 블랏을 통하여 RNA와 단백질의 발현을 확인하였다. 산양의 태아 섬유아세포(Fetal fibroblast cell)와 암컷 산양의 귀세포(Ear fibroblast cell)를 이용하여 hGM-CSF 유전자의 형질전환(transfec tion)하고, G418로 선별된 체세포는 우선 PCR을 통하여 hGM-CSF와 neo 유전자을 확인하였다. PCR을 통하여 확인된 세포는 서던블랏을 통하여 hGM-CSF가 삽입된 것을 재확인하였다. 형질전환이 확인된 체세포를 이용하여 체세포 복제 방법을 이용하여 hGM-CSF를 갖는 형질전환 복제 산양을 생산하였다.
본 발명에서는 산양을 이용하여 인간 치료 단백질(therapeutic protein)을 생산하기 위하여 산양의 체세포에 hGM-CSF를 효율적으로 주입하여 형질전환된 세포주를 확립하고 형질 전환 복제 산양을 생산하였다. 이를 위하여, 염소 β-카제인 프로모터를 이용하여 산양의 유선에서 hGM-CSF를 발현하도록 하는 형질전환산양을 생산하였다. 따라서, 인간 조혈 성장인자(hematopoietic growth factor)와 유사한 재조합 hGM-CSF의 생산이 가능할 것으로 여겨진다. 그러므로, 산양에 의하여 발현되는 hGM-CSF 양이 규모화(scaling up) 된다면 본래의 인간 단백질과 유사한 특징을 갖고, 치료용으로 사용가능한 재조합 인간 GM-CSF의 좋은 원천이 될 것으로 여겨진다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
유산양
체세포의 분리
임신 60일령의 유산양 태아의 조직과 3산차 암컷 산양의 귀조직을 면도날로 잘게 자른 후 각각의 체세포를 트립신-EDTA(Gibco. Inc)가 첨가된 DMEM(bio-whittaka. Inc)에서 5분간 배양하였다. 상층액을 원심분리(1000rpm, 5분)한 후 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하고 세포가 90% 콘플루언시에 이르면 트립신 처리 한 후 계대 배양하여 일부는 핵이식에 이용하고 나머지는 동결보존 하였다.
<
실시예
2>
hGM
-
CSF
발현 벡터의 제조
hGM-CSF 발현 벡터로는 pBC1 유발현 벡터(Invitrogen, 도 1 참조)에 neo를 붙인 pBC1-neo를 이용하였다. Neo 저항성 유전자는 pPNT 벡터를 NotⅠ이 포함된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, pGEM-T-easy 벡터에 클로닝하였다. 이 때 사용한 프라이머는 Neo-포워드-5'-ATG CGG CCG CGA GGG CCC CTG CAG GTC AAT-3'(서열번호: 1)이며, Neo-리버스-5'-GAG CGG CCG CTC GGT ACC CGG GGA TCC TCT-3'(서열번호: 2)이다. pGEM-T-Neo 벡터와 pBC1 벡터를 NotⅠ으로 잘라 클로닝하여 pBC1-neo 벡터를 제조하였다. 한편, hGM-CSF는 사람의 게놈 DNA에서 hGM-CSF 유전자의 ORF부분을 PCR로 증폭하고 이를 pGEM-T-easy 벡터에 클로닝하여 서열분석하여 확인하였다. 이때 사용한 프라이머에는 XhoⅠ이 포함되었다. 프라이머의 서열은 hGM-CSF-포워드-5'-GAC TCG AGA GGA TGT GGC TGC AGA GCC-3'(서열번호: 3) 이며, hGM-CSF-리버스-5'-GAC TCG AGC ATC TGG CCG GTC TCA CT-3'(서열번호: 4)이다. pGEM-T-hGM-CSF와 pBC1-neo를 각각 XhoⅠ으로 잘라 클로닝하여 pBC/neo-hGM-CSF 벡터를 제조하였다(도 2 참조).
<
실시예
3>
hGM
-
CSF
재조합 단백질의 확인
pBC/neo-hGM-CSF 벡터가 유선조직에서 효율적으로 hGM-CSF를 발현하는지 확인하기 위하여 생쥐의 유선암 세포주인 HC11에서 일시 발현(transient expression)을 확인하였다. 형질전환 시약(LipofectamineTM 2000, Invitrogen)을 이용하여 DNA와 10㎕:4㎍의 비율로 6구(well)에서 20시간 동안 형질감염을 실시하였다. 트리졸(Gibco)을 이용하여 총 RNA를 추출하고, One Step RNA PCR Kit(TaKaRa, Japan)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 포워드-5'-GAC TCG AGA GGA TGT GGC TGC AGA GCC-3'(서열번호: 5)과 리버스-5'-ATC TGG GTT GCA CAG GAA GT-3'(서열번호: 6)이다. 상기 RT-PCR 산물을 대상으로 전기영동을 실시하였다. 동시에, hGM-CSF 항체(N-19, sc-1321, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. RT-PCR 분석과 웨스턴 블롯 분석을 통하여 hGM-CSF의 RNA와 단백질이 모두 발현됨을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 보다 구체적으로 도 3에서 M은 마커, 레인 1은 RT-PCR의 양성 대조군, 레인 2-6은 G3PDH, 레인 7-11은 hGM-CSF을 각각 나타내며, 특히 레인 2 및 7은 hGM-CSF로 형질전환되지 않은 HC11세포를 대상으로 한 것이다. 아울러, 도 4의 Mock은 hGM-CSF로 형질전환되지 않은 HC11세포를 대상으로 한 것이다.
<
실시예
4>
hGM
-
CSF
발현하는 클론 세포주의 제조
hGM-CSF 발현을 위해 제작된 pBC1/neo-hGM-CSF 벡터를 AatⅡ로 잘라 선형화하였다. 이렇게 준비된 DNA를 체세포 내에 주입하기 위하여 형질전환 시약(Lipofect amineTM 2000, Invitrogen)을 사용하였다. 형질감염 후 24시간 배양하고, G418(Gen ecitin, Gibco.Inc)을 300㎍/㎖로 약 3주간 처리하여 콜로니가 형성된 것을 채취하 여 클론 세포주를 제조하였다.
제조된 클론 체세포주는 hGM-CSF가 발현되는지 확인하기 위하여 하기 실시예 5와 같이 PCR과 서던블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 공여세포가 태아세포인 경우에는 1-1, 1-3, 1-5, 1-6, 1-24, 1-31, 1-47, 1-64번의 클론 체세포주 중 1-1, 1-3, 1-5, 1-6, 1-47, 1-64번의 클론 세포주에서 hGM-CSF가 형질전환 되었음을 확인할 수 있었으며, 귀세포인 경우에는 4-24, 4-25, 4-57, 4-58, 4-59, 4-70, 4-79, 4-83, 4-84, 4-85번의 클론 체세포 중 4-24, 4-25, 4-59, 4-79, 4-83, 4-84, 4-85번의 클론 체세포주에서 hGM-CSF가 형질전환 되었음을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7참조). 본 발명자들은 태아세포인 경우에는 1-1번(수탁번호 : KCLRF-BP-00159), 귀세포인 경우에는 4-85번(수탁번호 : KCLRF-BP-00160) 클론 체세포주를 한국 세포주 연구 재단에 2007년 6월 1일자로 기탁하였다.
<
실시예
5> 클론
체세포주에서
hGM
-
CSF
유전자의 도입 확인
<5-1>
PCR
분석에 의한 1차 확인
선별된 체세포 중 일부는 게놈 DNA를 분리하여 hGM-CSF 유전자의 유무를 확인하였다. 체세포에 프로테이나제(Proteinase) K(Gibco. Inc)를 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. PCR의 프라이머는 hGM-CSF의 경우 pBC1-포워드-5'-GAT TGA CAA GTA ATA CGC TGT TTC CTC-3'(서열번호: 7)과 pBC1-리버스-5'-CAT CAG AAG TTA AAC AGC ACA GTT AG-3'(서열번호: 8)이다. Neo 유전자에 대한 프라이머는 포워드-5'-GGA TTG CAC GCA GGT TCT CCG-3'(서 열번호: 9)과 리버스-5'-ATT CGG CAA GCA GGC ATC GCC-3'(서열번호: 10)이다. hGM-CSF PCR 조건은 94℃, 4분과 94℃, 1분, 59℃ 1분, 72℃ 1분 30 c회 그리고 72℃ 10분, 4℃이고, Neo PCR조건은 94℃, 4분과 94℃, 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 30회 그리고 72℃ 10분, 4℃이었다. 상기 PCR 산물을 대상으로 전기영동을 실시하였다. 상기 PCR 분석을 통하여 도 5에 나타낸 바와 같이 hGM-CSF와 neo 유전자를 확인할 수 있었다. 도 5에서 M은 마커, 레인 1은 양성 대조군, 레인 2는 음성 대조군, 레인 3-10은 앞서 선별된 체세포를 각각 나타내는 것이다.
<5-2> 서던
블랏
(
Southern
blot
) 분석에 의한 2차 확인
선별된 세포를 프로테이나제(Proteinase) K(Gibco. Inc)로 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 EcoRI으로 잘라 서던 블롯을 시행하였다. 프로브는 hGM-CSF 유전자(2kb)를 pBC1/neo-hGM-CSF에서 XhoⅠ으로 잘라 사용하였고, 표지(labeling) 키트(Gene Image Random Prime Labelling Module, Amersham, INC)을 사용하였다. 상기 서던 블롯 분석을 통하여 도 6에 나타낸 바와 같이 hGM-CSF가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 도 6에서 M은 마커, P는 양성 대조군, N은 음성 대조군, 레인 1-8은 앞서 선별된 체세포를 각각 나타내며, 도 7에서는 M은 마커, P는 양성 대조군, N은 음성 대조군, 레인 1-10은 앞서 선별된 체세포를 각각 나타내는 것이다.
<
실시예
6> 체세포 복제 방법을 이용한
hGM
-
CSF
를 갖는 형질전환 복제 산양 생산
<6-1> 배양액
성숙 배양액은 TCM199(31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM D-글루코스(glucose, Gibco), 0.91 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate, Gibco), 0.57 mM 시스테인(cysteine, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 0.5 g/ml 황체형성호르몬(LH)(Sigma), 0.5 g/ml 여포자극호르몬(FSH)(Sigma), 10 ng/ml 내피 성장 인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 g/ml 페니실린 G(Sigma) 및 50 g/ml 스트렙토마이신(Sigma)을 첨가했다.
미세 조작용 배양액은 TCM199에 0.3% BSA(Sigma)와 7.5 ㎍/ml CB(cytochala sin B, Sigma)를 첨가하였다.
활성화 배양액은 0.3 M 만니톨(mannitol, Sigma)에 1.0 mM CaCl2ㆍH2O(Sigm a), 0.1 mM MgCl2ㆍ6H2O(Sigma), 0.5 mM HEPES(Sigma)를 첨가하였다.
복제란의 발생 배양액은 변형된 합성 난관 액(mSOF, Modified synthetic oviduct fluid) 배양액배지에 0.8 % BSA를 첨가하였다.
<6-2> 공시 동물
공시 동물은 체중 15~25kg 전후의 성숙한 미경산 재래 산양(Capra hircus )으로서 진주 근교의 사육 농가로부터 임상적으로 건강하다고 인정되는 것을 구입하여 진주산업대학교 종합 농장에서 사육하면서 내ㆍ외부 기생충 구제와 일정 기간 동안 적응시킨 다음 본 실시예에서 사용하였다. 사양 관리는 일반 관행법을 사용하였 다. 농후 사료를 추가 급여하였으며, 식염과 물은 자유 섭취토록 하였다.
<6-3>
과배란
유기
과배란 유기는 먼저 발정 동기화 처리를 위해 프로게스테론 제제인 CIDR (Progesterone 0.3 g, Eazi Breed, InterAg, New Zealand)를 8일간 질 내에 삽입한 후, FSH(Folltropin-V, Vetrepharm, Canada)를 CIDR 삽입 8, 9, 10, 11일째에 12시간 간격으로 70mg을 감량법으로 투여하였으며, PGF2α(Lutalyse, Upjohn, U.S.A.)는 8일째에 FSH와 함께 10mg 투여하고 hCG(Chorulon, Intervet, Netherland)는 400~800 IU를 10일째에 투여하여 과배란을 유도하였다.
<6-4> 난자의 회수
난관으로부터 체내 성숙 난자(in vivo)의 회수는 외과적인 방법으로 난관 관류 방법으로 실시하였다. 먼저 과배란 처리한 산양을 약 24시간 절식시킨 다음 2% 자일리진(Rompun, Bayer, Korea)을 0.2mg/kg 근육 주사하여 진정 마취시키고, HCl 케타민(Ketamine, Yuhan, Korea)을 11mg/kg 근육 주사하여 마취를 유도하였다. 마취 후 복정중선을 절개하여 난관과 난소를 체외로 노출시킨 다음 배란점을 확인한 후, 카테터(Tom Cat, Kendall Co. USA)를 난관 누두부로 삽입하여 5~10㎖의 M2(Sig ma, USA) 배양액을 난관-자궁 접합부 쪽에서 주입하여 관류하였다. 배란이 되지 않은 난포란(in vitro)의 회수는 성숙 난자를 회수한 다음 난소의 난포로부터 22G needle이 부착된 5ml 주사기로 난포액과 난포란을 흡입하여 회수하였다. 회수란은 5% GS(goat serum, Sigma, USA)가 첨가된 신선한 M2 배양액으로 4~5회 세척한 후 난구 세포의 부착 정도와 세포질이 충실한 것만 선별하여 사용하였다.
<6-5> 수핵 난자의 체외 성숙
회수한 미 배란 난포란의 체외 성숙은 25mM의 Hepes가 첨가된 TCM-199 체외 성숙용 기본 배양액에 10% GS, 10㎍/㎖ 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 1㎍/㎖ 에스트라디올 17-β 및 5㎍/㎖ 여포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone)을 첨가하여 5% CO2, 98~99% 습도, 39℃ 배양기 내에서 약 12시간 전배양한 후 4구-디쉬(NUNC, Denmark)에 구당 15~20개의 미성숙 난포란을 적하하여 20~22시간 동안 배양함으로써 체외 성숙을 유도하였다.
<6-6>
핵이식
핵이식용 피펫은 직경이 1mm인 모세관(Narishige, Japan)을 이용하여 고정용 피펫(holding pipette)은 외경이 160~180㎛, 주입용 피펫(injection pipette)은 외경이 20~30㎛가 되게 제조하여 멸균시켜 사용하였다.
수핵 난자는 0.3% 히알루로니다제(Sigma, U.S.A)가 첨가된 D-PBS로 3~5분간 처리하여 난구 세포를 제거한 다음 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식 조작시 수핵 난자는 M2 배양액에 7.5㎍/㎖의 사이클로칼라신 B(Sigma, U.S.A)를 첨가하여 탈핵을 실시하였으며, 공핵 세포는 먼저 주입용 피펫으로 흡입하였다. 산양의 경우 수핵난자가 위란강과 세포질 간격이 밀접하게 접해 있기 때문에, 탈핵 및 주입용 피펫의 삽입을 용이하게 하기 위하여 레이저에 의하여 투명대 천공(zona drilling)한 다음 탈핵용 피펫을 위란강내로 진입시켜 극체와 세포질을 흡입하여 제거하였다. 탈핵한 난자는 곧바로 세포질이 제거된 공간에 공핵 세포를 세포질과 부착되게 주입함으로써 미세 조작 과정을 완료하였다.
레이저 시스템(MTM, Switzerland)을 이용한 투명대 천공은 Park 등(Park et al. Theriogenology, 2001, vol.55, p.352)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉, 레이저 시스템이 부착된 도립현미경하에서 레이저 전용 렌즈(× 400)로 천공할 수핵 난자의 투명대에 초점을 맞춘 다음 40~60μsec의 강도로 레이저를 1~2회 투과시킴으로써 투명대 천공을 실시하였으며, 이 때 천공은 핵이식 조작시 불필요한 배양액의 침투 등을 막기 위하여 투명대 두께의 약 60~80% 정도의 부분적 천공을 하였다.
<6-7> 핵과 세포질의 융합 및 활성화 처리
핵이식이 완료된 난자의 공핵 세포와 수핵 난자의 세포질 융합은 전기 세포 융합 장치(BTX, U.S.A)로 실시하였다. 이때 융합 배지는 0.05mM CaCl2(Sigma, U.S.A), 0.1mM MgSO4(Sigma, U.S.A) 및 0.5mM Hepes(Sigma, U.S.A.)가 첨가된 0.3M 만니톨(Sigma, U.S.A) 용액을 사용하였으며, 핵이식란을 챔버로 옮겨 양 전극 사이에 일렬로 정렬하여 핵은 전극의 “＋” 극 쪽으로 향하게 하고 세포질은 “－” 극 쪽으로 향하게 하여 직류 전류(DC)로 2.4 kV/cm, 15～30 μs, 1회 통전하여 융합을 유도하였다. 두 번째 융합을 위한 전기 자극은 동일한 방법으로 1시간 후에 자극을 가하였고, 세 번째도 같은 방법으로 30분 후에 통전하였다. 핵이식란은 10% GS가 첨가된 M16 배양액으로 배양을 실시하였으며, 융합 여부는 배양 후 30분 후에 판단하였다.
융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리는 핵 이식 조작 후 약 3시간 동안 전배양을 실시한 다음 5μM의 이오노마이신(Sigma, U.S.A.) 용액에서 5분, 2 mM 6-DMAP(Sigma, U.S.A.) 용액에서 4시간 동안 처리하여 활성화를 유도하였다.
<6-8>
복제란의
체외 배양
융합된 복제란의 배양은 0.8% BSA가 첨가된 변형된 합성 난관 액(mSOF, Modified synthetic oviduct fluid) 배양액(5% CO2, 5% O2, 90% N2, 96~98% 습도, 39℃)에서 약 12~20 시간 동안 배양을 실시하면서 2~4 세포기로의 발달을 유도하였다.
<6-9> 수란 산양(대리모)의 발정 동기화, 이식 및 임신 진단
수란 산양(대리모)의 발정 동기화는 공란 산양의 과배란 처리 방법과 동일한 방법으로 실시하였다. CIDR를 8일간 질에 삽입하고 먼저 PMSG 500 IU와 PGF2α 10mg을 병용 투여하고 10일과 11일째에 hCG 400-800 IU를 투여하여 발정을 유도하였다.
복제 수정란의 이식은 외과적인 방법으로 실시하였는데 수란 산양의 절식, 마취, 복부 절개 및 봉합은 난자 회수 시와 동일한 방법으로 실시하였다. 공여세 포가 태아세포인 복제 수정란의 경우에는, 마취된 10두의 수란 산양의 복정중선을 절개하여 실험실에서 개조하여 만든 카테터를 이용하여 2~4세포기 단계의 상기 복제 수정란 76개를 각각 2~16개를 난관 누두부로 주입함으로서 이식을 완료하였다. 그리고 공여세포가 귀세포인 복제 수정란의 경우에는, 마취된 16두의 수란 산양의 복정중선을 절개하여 실험실에서 개조하여 만든 카테터를 이용하여 2~4세포기 단계의 상기 복제 수정란 150개를 각각 2~16개를 난관 누두부로 주입함으로서 이식을 완료하였다.
임신 진단은 발정일로부터 제 60일째에 초음파 임신 진단기(6.5 MHz CONVEX Scanner; Medison, Co. 한국)로 임신진단을 실시함과 동시에 발정 제 60일에 혈중 프로게스테론 농도를 측정하여 3ng/ml 이상을 임신으로 판단하였다.
공여세포가 태아세포인 경우, 10두의 수란 산양을 이식해서 1두의 수란 산양이 임신하는 것을 성공하였다. 임신한 수란 산양은 임신 150일 만에 정상 분만함으로써 국내에서 처음으로(2007년 3월 28일) 유선에서 hGM-CSF를 분비하는 유산양 생산에 성공하였다. 1두의 수란 산양으로부터 1두의 형질전환 복제 산자를 생산하였다(표 2참조). 도 10에서 보는 바와 같이 형질전환 복제 산양은 생시 체중이 2.4kg으로서 매우 건강한 상태로 태어났다.
공여세포가 귀세포인 경우, 16두의 수란 산양을 이식해서 2두의 수란 산양이 임신하는 것을 성공하였지만 분만을 성공하지는 못했다(표 2참조).
| 공여세포 | 핵이식란 수 | 융합란 수 | 이식한 복제수정란 수 | 이식한 수란산양 수 | 임신한 수란산양 수 | 형질전환 복제산자 수 |
| 태아세포 | 108 | 83 (76.85%) | 76 | 10 | 1 (10.00%) | 1 |
| 귀세포 | 206 | 161 (78.15%) | 150 | 16 | 2 (12.50%) | 0 |
<
실시예
7> 형질전환 복제 산양의 조직에서
hGM
-
CSF
유전자의 도입 확인
체세포 복제에 의하여 생산된 형질전환 복제 산양의 조직중 일부에서 게놈 DNA를 분리하여 hGM-CSF 유전자의 유무를 확인하였다. 조직에 프로테이아제(Proteinase) K(Gibco. Inc)를 처리하여 단백질을 분해시킨 후 phenol로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. PCR의 프라이머는 hGM-CSF의 경우 pBC1-포워드-5'-GAT TGA CAA GTA ATA CGC TGT TTC CTC-3'(서열번호: 11)와 pBC1-리버스-5'-CAT CAG AAG TTA AAC AGC ACA GTT AG-3'(서열번호: 12)이다. hGM-CSF PCR조건은 94℃, 4 min과 94℃, 1 min, 59℃ 1 min, 72℃ 1 min 30 cycle 그리고 72℃ 10 min, 4℃이었다. 상기 PCR 분석을 통하여 도 8에 나타낸 바와 같이 hGM-CSF 유전자를 확인할 수 있었다. 도 8에서 M은 마커, 레인 1은 플라즈미드 DNA, 레인 2는 핵 이식에 사용된 체세포, 레인 3은 대리모, 레인 4는 정상의 낙농 산양, 레인 5는 D.W., 레인 6은 형질전환 복제 산양을 각각 나타내는 것이다.
<
실시예
8> 형질전환 복제 산양과 핵 이식에 사용된 체세포가 동일한 개체인지를 확인
형질전환 복제 산양과 핵이식에 사용된 체세포가 동일한 개체인지를 확인하기 위하여 PCR-SSCP 분석을 실시하였다. 우선 핵이식에 사용된 체세포, 대리모(재래산양), 복제된 유산양 및 일반 유산양의 혈액 등으로부터 게놈 DNA를 추출(Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega) 하였다. PCR-SSCP를 위하여 Keefer등(2001)이 제시한 방법을 이용하여 산양의 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC, major histocompatibility complex) classⅡ DRB 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이 유전자의 엑손2 부분인 286bp를 PCR 프라이머인 포워드-5'-TAT CCC GTC TCT GCA GCA TTT C-3'(서열번호: 13)과 리버스-5'-ATC GCC GCT GCA CAC TGA AAC TC-3'(서열번호: 14)으로 증폭하였다. PCR 용액 5㎕와 포름아마이드 염료(formamide dye) 20㎕를 혼합하여 80℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음에 2분간 정치하였다. 이것을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동 후 에시디움 브로마이드(EtBr, ethidium bromide)로 염색하여 분석하였다. 그 결과 상기 PCR 분석을 통하여 도 9에 나타낸 바와 같이 형질전환 복제된 산양과 핵 이식에 사용된 체세포가 동일한 개체임을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 의한 형질전환된 복제 산양을 이용하여 유선으로부터 hGM-CSF를 대량 생산할 수 있다. 인간 GM-CSF는 조혈모세포 및 과립세포, 대식세포, 적혈구, 거대핵세포(megakaryocytes) 및 조혈모 세포의 전구체 등의 증식, 분화 및 생존을 조절하는 중요한 조절자이다. 형질전환 복제 산양에서 hGM-CSF가 발현된다면, 이러한 hGM-CSF의 기작은 암이나 장기이식 등의 치료에 의하여 백혈병 치료 보조제 및 면역 강화제 등 면역력이 약화된 환자들에게 보조치료제로써 큰 역할을 할 것이며, 세포주의 핵이식을 통한 hGM-CSF 형질전환 산양 개발은 발생공학 분야의 연구 및 산업적 이용성이 매우 클 것으로 기대된다.
<110> mgen, inc.
<120> Clonal Transgenic Goat Producing hGM-CSF and Preparation Method
of the same
<130> 7p-04-38
<160> 14
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neo-forward primer
<400> 1
atgcggccgc gagggcccct gcaggtcaat 30
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<211> 30
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gagcggccgc tcggtacccg gggatcctct 30
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> hGM-CSF-reverse
<400> 4
gactcgagca tctggccggt ctcact 26
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
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gactcgagag gatgtggctg cagagcc 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
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<220>
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<400> 7
gattgacaag taatacgctg tttcctc 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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ggattgcacg caggttctcc g 21
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gattgacaag taatacgctg tttcctc 27
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catcagaagt taaacagcac agttag 26
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<220>
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<400> 14
atcgccgctg cacactgaaa ctc 23
Claims (14)
- 수탁번호 KCLRF-BP-00159로 기탁된 인간 과립구 대식세포 세포집락 자극 인자(hGM-CSF) 단백질을 발현하는 형질전환 산양 클론 세포주.
- 제 1항의 클론세포주로 체세포 복제된 유선조직에서 특이적으로 인간 과립구 대식세포 세포집락 자극 인자(hGM-CSF)를 발현하는 형질전환 복제 산양.
- 1) 제1항의 클론 세포주를 배양하는 단계;2) 어미 산양으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및3) 상기 융합된 복제란을 수란 산양(대리모)에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 hGM-CSF 단백질을 생산하는 형질전환 복제 산양 제조 방법.
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Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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