CN101979585A

CN101979585A - 转基因兔的生产方法

Info

Publication number: CN101979585A
Application number: CN2010102980398A
Authority: CN
Inventors: 刘庆友; 石德顺; 陆凤花; 刘玉兵
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2011-02-23

Abstract

本发明公开了一种转基因兔的生产方法，该方法包括以下步骤：(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fat1基因和PGK1调控元件用来构建Fat1基因真核表达载体；(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄兔与雌兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fat1基因的转基因兔。其中，Fat1基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，PGK1调控元件为序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。本发明通过导入线虫的n-3去饱和酶基因(Fat-1)，获得转Fat1基因兔新品系。

Description

转基因兔的生产方法

技术领域

本发明涉及家畜生产的基因工程技术，尤其是涉及一种转基因兔的生产方法。

背景技术

不饱和脂肪酸是细胞的基本组分之一，其摄入数量和类型直接影响到消费人群的健康，有报道称：高水平摄入n-6多聚不饱和脂肪酸(n-6 PUFAs)，尤其是同时伴有低水平摄入n-3多聚不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)，会明显增加患乳腺癌、大肠癌和前列腺癌的危险性。目前，大部分西方国家人民体内n-6/n-3 PUFAs的比例超过18∶1，由此引发多种细胞和机体功能障碍甚至癌症。这主要是由于哺乳动物体内缺乏合成n-3 PUFAs前体的酶，也缺乏能够将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs的酶。因此，增加n-3 PUFAs的摄入量对于人类健康具有极其重要的意义。

家兔是一种用途广泛的经济性动物，目前国内外市场兔肉需求量不断加大。一方面因为家兔具有繁殖速度快、生产周期短等优点；另一方面，兔肉蛋白质含量显著高于猪肉、牛肉和羊肉，同时其脂肪含量低且多为不饱和脂肪酸。因此，大力发展养兔业不仅可以增加农民收入，而且还能提高人们的健康和生活水平。

近年研究发现线虫Caenorhabditis elegans(C.elegans)的n-3脂肪酸去饱和酶能够以十八碳或二十碳的n-6 PUFAs为底物分别合成相应的n-3 PUFAs。此外，线虫C.elegans的n-3去饱和酶基因(Fat1)被转入哺乳动物细胞以及小鼠能使其n-3 PUFAs(从十八碳到二十二碳)的含量显著提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉且快速的转基因兔的生产方法，以改善家兔的肉质提高兔肉中不饱和脂肪酸含量，为人们的健康生活提供富含n-3PUFAs的肉类食品。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：转基因兔的生产方法，该方法包括以下步骤：

(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；

(2)将步骤(1)所得Fat1基因和PGK1调控元件用来构建Fat1基因真核表达载体；

(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；

(4)对步骤(3)所得雄性兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fat1基因的转基因兔。

Fat1基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

克隆Fat1基因中设计合成的特异引物为：

P1：5′CTTCCGACATTGATTATTGAC3′和P2：5′GATCCACATGATAAGATAC3′。

PGK1调控元件为序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。

Fat1基因真核表达载体为pMD-PGK1-Fat1-CMV-EGFP。

注射以DMSO或脂质体为转导试剂配制注射液。

本发明采用Fat1基因和PGK1调控元件构建了Fat1基因真核表达载体，通过睾丸注射向雄性家兔的精原细胞中导入Fat1外源基因，然后由PCR检测阳性的雄兔与正常雌兔交配，所产F1代仔兔即是整合Fat1外源基因的转基因兔。因为Fat1基因表达的n-3去饱和酶能使哺乳动物体内十八碳或二十碳的n-6 PUFAs转化成相应的n-3 PUFAs，所以本发明获得的转Fat1基因兔，其兔肉中不饱和脂肪酸的组成和含量应有明显改善。

附图说明

图1是转Fat1基因组成型真核表达载体构建示意图。

图2是Fat1基因真核表达载体的物理图谱。

具体实施方式

1.调控元件的克隆与验证

应用oligo6.0软件设计一对特异性扩增引物：

P1：5’GAATTC AATGTAGGAGAGTTCCAGTGGC 3’(5′含KpnI位点)

和P2：5’CTCGAG GATGAGACAGCGGCAGAGAC 3′(5′含Xho I位点)。以水牛基因组为模板，并以P1、P2为引物，按照以下程序进行扩增：94℃预变性2min；以94℃30sec，64℃3min，反应35个循环，64℃延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5～10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测获得PGK1基因调控元件DNA片段。应用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的片段与pMD-18T载体以摩尔比约2-10∶1混合，按说明书14～16℃水浴反应过夜，次日取5μL～10μL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10μL灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2×Cracking buffer；轻轻混匀后取15μL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，纯化后送上海捷瑞生物公司进行测序验证，获得质粒pMD18T-PGK1。测序结果表明，PGK1基因调控元件长2013bp(见序列表SEQ.ID.No.2)。

纯化质粒pMD18T-PGK1和pEGFP-N1，以Sal I和BamH I对两个质粒分别进行双酶切，得到含有水牛PGK1启动子的片段，将其连接到酶切去除CMV启动子的pEGFP-N1中，最终建成含有水牛PGK1基因启动子的真核表达载体：pPGK1-EGFP-N1，长达6.2Kb。采用PCR和酶切分析对构建载体进行全面验证，确认得到了设计的真核表达载体。用Omega无内毒素质粒小量提取试剂盒提取构建好的pPGK1-EGFP-N1，并以ApaL I酶切线性化后电泳胶回收；或以ApaL I酶切后用2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠沉淀DNA。12000rpm离心10分钟，收集沉淀，75％乙醇洗涤。真空抽干，溶解DNA于灭菌超纯水中。

兔胎儿成纤维细胞培养与转染：取预处理兔胎儿体部皮肤组织剪切成1mm³左右的小块。用0.25％胰蛋白酶消化后，用含15％FCS的DMEM培养液制备细胞悬液，最终以1×10⁶个/mL的密度接种于培养瓶，置37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中进行原代培养，每隔3～4天换一次液。当原代细胞生长至90％汇合时，按照1∶3比例进行传代培养。阳性脂质体法细胞转染外源DNA片段：将传至3代的细胞生长到80-90％汇合时开始转染。将2.0μg线性化pPGK1-EGFP-N1质粒DNA稀释在100μL无血清双抗的培养液DMEM中，轻轻混匀。脂质体使用前先轻轻摇匀，取15μL脂质体稀释在100μL无血清双抗的培养液DMEM中，混匀，室温放置5min。将含有质粒DNA的DMEM和含有脂质体的DMEM轻轻混匀，室温静置20min，使形成DNA-脂质体复合体。在DNA/脂质体混合液中继续加入800μL无血清双抗培养液DMEM，混匀。取欲转染的细胞，吸出培养液，再用无血清双抗培养液DMEM洗细胞2次。将DNA-脂质体混合液加入培养皿中，前后轻轻摇晃培养皿使之分布均匀，放入CO₂培养箱内，37℃培养8h。吸出转染液，加入2mL不含双抗的培养液DMEM+10％FCS，继续培养，转染后24h在荧光显微镜下观察，能够看到部分家兔胎儿成纤维细胞表达EGFP，证明水牛PGK1启动子可以启动目的基因在家兔细胞中转录。

2.转Fat1基因组成型真核表达载体的构建(见图1和图2)

(1)目的基因Fat1的获得：设计合成特异引物P1：5′CTTCCGACATTGATTATTGAC3′和P2：5′GATCCACATGATAAGATAC3′，以实验室保存的pMD-Fat1质粒DNA为模板，按照以下程序进行扩增：94℃预变性2min；以94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1min20sec，反应35个循环，72℃延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5～10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测获得Fat1基因编码片段。应用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的片段与pMD-18T载体以摩尔比约2-10∶1混合，按说明书14～16℃水浴反应过夜，次日取5μL～10μL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10μL灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2×Cracking buffer；轻轻混匀后取15μL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，纯化后送上海捷瑞生物公司进行测序验证，经PCR扩增获得长1209bp的Fat1基因编码序列DNA(见序列表SEQ.ID.No.1)，共编码403个氨基酸，密码子在线虫序列的基础上进行了优化，更加适合在哺乳动物中表达。

(2)真核表达载体骨架：用纯化质粒pcDNA3.1(-)和pMD18T-PGK1，分别用BamHI和NheI进行双酶切，胶回收获得PGK1片段和去除了CMV的pcDNA3.1(-)片段，以摩尔比约2-10∶1混合，按说明书14～16℃水浴反应过夜，次日取5μL～10μL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10μL灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2×Cracking buffer；轻轻混匀后取15μL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，获得重组质粒pPGK1-cDNA3.1作为真核表达的骨架。

(3)转Fat1基因组成型真核表达载体构建：用试剂盒纯化含有目的基因Fat1质粒pMD-Fat1和pPGK1-cDNA3.1，分别应用NheI加AflII双酶切，纯化获得线性pPGK1-cDNA3.1片段和Fat1编码片段，然后按上文所述的方法进行连接，转化和筛选，获得载体pcDNA3.1-PGK1-Fat1，经过酶切和PCR验证载体构建正确。设计特异性扩增引物：P1：5′CTTCCGACATTGATTATTGAC3′和P2：5′GATCCACATGATAAGATAC3′，引物两端带有BamHI和SacI酶切位点，以pcDNA3.1-PGK1-Fat1质粒DNA为模板进行PCR扩增，获得PGK1-Fat1基因片段，TA克隆到pMD-18T获得pMD-PGK1-Fat1。用BamHI加SacI双酶切pMD-PGK1-Fat1和实验室保存的载体pMD-CMV-EGFP，将酶切产物胶回收后，按照上述连接方法连接、转化和筛选，获得阳性重组质粒

pMD-PGK1-Fat1-CMV-EGFP，经酶切、PCR和测序验证载体构建正确。

3.睾丸注射法生产转基因兔

(1)两种研究方法：一种为DMSO与DNA共注射，雄性家兔4只，对照组1只，雌性家兔25只；另一种为脂质体与DNA共注射，雄性家兔4只，对照组1只，雌性家兔25只。

(2)注射液1：脂质体(LipefectaminTM-2000)∶质粒(pPGK1-Fat1-EGFP)＝3∶1，溶于DMEM。注射液2：DMSO：4％；质粒：40μg/ml(线性∶环状＝3∶1)。对照组注射液：4％DMSO和PBS。

(3)注射量和注射频率：孵育液每次注射500μl/侧，每周注射1次，共注射4次。

(4)雄兔麻醉：称重，速眠新II肌肉注射麻醉(0.1-0.2ml/kg)，待完全麻醉后，绑定在绑定架上。

(5)睾丸组织注射：①剪毛，用酒精棉球擦拭，使其睾丸血管明显，术者用拇指和食指将睾丸挤入阴囊并固定；②用一次性胰岛素注射器吸取500μl注射液，用酒精棉球擦拭，小心避开血管，进针深度15mm，每侧睾丸注射2-4点，尽量使注射液分布均匀且对睾丸损伤最小，针头进入机体后应缓慢移动，注射单点完毕后应缓慢移出针头，并将注射完毕的雄兔放于室温下苏醒；③注射完毕后小心按摩，使注射液尽快吸收，酒精棉球消毒。

(6)睾丸注射后的护理：精心饲养，防止撕咬睾丸，观察睾丸变化情况。注射后家兔睾丸会比正常睾丸膨胀和坚硬，一般3-5d后该现象自行消失。2周后，家兔的性欲变得正常。

(7)雄兔的人工采精：在进行第四次注射后，对雄兔进行人工采精，具体步骤如下：用于采精的假阴道由外壳、内胎和集精管(杯)三部分组成。外壳用硬制塑料管制成，其长约10厘米，直径约4厘米，在中段钻一直径0.5厘米的小孔，安上活塞，以便由此灌入热水和吹气调压。内胎由避孕套制成，用剪去盲端的避孕套翻套在管子两端，并用橡皮筋箍牢。集精管可以用玻璃试管代替。假阴道的温度要控制在45～47℃。注意：避孕套用前要经过高温处理，防止杀精物质影响精子质量。采精操作：用正常雌兔作为雄兔爬跨的台兔。采精者一手抓住雌兔两耳和颈皮，放入雄兔笼内，使雌兔后躯朝向笼内。雄兔爬跨雌兔时，采精者用另一手持假阴道伸入雌兔腹下，使假阴道开口紧贴在雌兔阴户下方，并使假阴道与水平面成30°左右的角度，即假阴道的开口端稍低，集精管一端稍高。当雄兔阴茎反复抽动时，采精者持假阴道的手指可感觉到雄兔阴茎挺出的方向，及时调整假阴道的位置和角度，以利雄兔阴茎顺利伸入假阴道射精。雄兔射精后即将假阴道开口端抬高，从雌兔腹下抽出，放掉假阴道内的水，用集精管收集精液。收集到精液后，要及时去除精清，将精液放在保温盒里保存。

(8)精子基因组的提取：将采集到的精子分装到1.5ml Eppendorf管中，并逐一编好序号；7200rpm离心5min，倒上清液，加入PBS液洗沉淀并用移液器吹打混匀；7200rpm离心5min，倒上清液，加精子抽提液并用移液器吹打至肉眼看不到沉淀；加入20μl蛋白酶K，用封口胶封住Eppendorf管，放入水浴锅55℃水浴过夜消化直至溶液澄清透明为佳。每管加入5～10μl RNA酶，加等体积PH8.0的Tris饱和酚，轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，用枪头将上层液相移到另一Eppendorf管中；加入1∶1酚仿(饱和酚/氯仿)轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，抽提上层液相；加入等体积的氯仿抽提，轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，抽提上层液相；加入10％体积醋酸钠，再加入2倍体积预冷过的无水乙醇，来回颠倒沉淀DNA；12000rpm离心20min将DNA沉入管底，小心倒去上清液；用75％乙醇洗两次DNA；用pH8.0的TE溶液或灭菌双蒸水溶解DNA。经紫外分光光度计检测后，将DNA稀释成相同的浓度。

(9)PCR扩增验证精子中外源基因的整合：设计合成一对转基因的验证引物为

5′-GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′和

5′-CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′，理论扩增产物大小为645bp，反应体系为20μl，按照以下程序进行扩增：94℃预变性5min；以94℃ 30sec，61℃ 30sec，72℃ 50sec，反应35个循环，72℃延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5～10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得清晰条带的雄兔，表明精子的阳性率较高，取对应雄兔进行下一步的与雌兔交配试验。

(10)雌兔的交配和仔兔的鉴定：对精子基因组PCR检测阳性的个体，选择外阴部潮红的雌兔进行交配试验，交配分两次进行中间间隔12小时。仔兔出生7-10d后，断其尾部约0.3-0.5cm，用作基因组DNA的提取。将断尾放入预冷的离心管，用剪刀将组织块在冰上剪得尽可能碎，加入200μl抽取液；加入蛋白酶K储存液震荡至彻底悬浮；每管加入5～10μl RNA酶；加等体积PH8.0的Tris饱和酚，轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，用枪头将上层液相移到另一Eppendorf管中；加入1∶1酚仿(饱和酚/氯仿)轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，抽提上层液相；加入等体积的氯仿抽提，轻倒混匀10min，12000rpm离心10min，抽提上层液相；加入10％体积醋酸钠，再加入2倍体积预冷过的无水乙醇，来回颠倒沉淀DNA；7000rpm离心4min将DNA沉入管底，小心倒去上清液；用75％乙醇洗两次DNA；用PH8.0TE溶液或灭菌双蒸水溶解DNA；测定浓度后4℃保存。

为增加检测的准确性，应用两对PCR引物进行检测，一对是：

5′-GAATTC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′

和5′-CTCGAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′，该对引物理论扩增EGFP片段长度为700bp。其反应体系为20ul，反应程序为：94℃预变性5min；以94℃ 30sec，61℃ 30sec，72℃ 50sec，反应35个循环，72℃延伸8min。另一对引物是：

5′-ATGGTCGCTCATTCCTCAGAAG-3′

和5′-TTACTTGGCCTTTGCCTTCTCC-3′，该对引物理论扩增Fat1基因片段长度为1200bp。反应体系为20ul，反应程序为：94℃预变性5min；以94℃ 30sec，66℃ 30sec，72℃ 80sec，反应35个循环，72℃延伸8min。PCR反应结束后，取反应液5～10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，对PCR反应阳性的仔兔进行统计分析。

试验例

试验先将质粒(pPGK1-Fat1-EGFP)cDNA完整序列按常规方法提取、纯化、酶切鉴定后，用于转基兔的研究。然后，配制注射液1：脂质体(LipefectaminTM-2000)∶质粒(pPGK1-Fat1-EGFP)＝3∶1，溶于DMEM。注射液2：DMSO：4％；质粒：40μg/ml(线性∶环状＝3∶1)。接着，将注射液多点注射到睾丸实质部，注射量为500μL/侧，每隔一周注射一次，共注射4次，从第一次注射日期始，一个月后对雄兔进行人工采精。通过对精子DNA的PCR阳性检测，筛选出精子呈阳性的雄兔4只，其中分别选择注射液1和注射液2的雄兔与正常雌兔交配。所产仔兔经PCR阳性检测，注射液1的F1代仔兔阳性率为61.5％(8/13)，注射液2的F1代仔兔阳性率为56.5％(13/23)。

Claims

1.一种转基因兔的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；

(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；

2.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，其特征在于：所述Fat1基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，其特征在于：所述克隆Fat1基因中设计合成的特异引物为：

P1：5′CTTCCGACATTGATTATTGAC3′和P2：5′GATCCACATGATAAGATAC3′。

4.根据权利要求1至3任一所述的转基因兔的生产方法，其特征在于：所述PGK1调控元件为序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。

5.根据权利要求4所述的转基因兔的生产方法，其特征在于：所述Fat1基因真核表达载体为pMD-PGK1-Fat1-CMV-EGFP。

6.根据权利要求5所述的转基因兔的生产方法，其特征在于：所述注射以DMSO或脂质体为转导试剂配制注射液。